WO2017198890A1 - Célula hospedadora myceliophthora thermophila con actividad celulolítica mejorada y composiciones enzimáticas obtenidas por la misma - Google Patents

Célula hospedadora myceliophthora thermophila con actividad celulolítica mejorada y composiciones enzimáticas obtenidas por la misma Download PDF

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Bruno Díez García
Noelia VALBUENA CRESPO
Francisco Manuel REYES SOSA
Antonio Javier MORENO PÉREZ
Dolores PÉREZ GÓMEZ
Ana Isabel PLATERO GÓMEZ
Lucía MARTÍN PÉREZ
Sandra GAVALDÁ MARTÍN
Laura VIÑAS DE LA CRUZ
Laura SÁNCHEZ ZAMORANO
Consolación ÁLVAREZ NÚÑEZ
María De Los Ángeles BERMÚDEZ ALCÁNTARA
Javier ROCHA MARTÍN
Laura LEDESMA GARCÍA
Ricardo ARJONA ANTOLÍN
Juan Luis RAMOS MARTÍN
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Abengoa Bioenergia Nuevas Technologias SA
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the field of bioproducts, preferably biofuels, and more particularly, to the improvement of cellulolytic cocktails produced by modified host cells that express and / or secrete a lower diversity of cellulolytic enzymes, to the enzyme cocktails obtained from said cells hosts, and the use of said host cells and said enzymatic cocktails in the production of bioproducts, preferably bioethanol, from biomass.
  • Biofuels are an attractive alternative to fossil fuels and can be obtained by fermenting monomeric sugars derived from starch or cellulose and hemicellulose.
  • Vegetable biomass provides a complete source of potential energy in the form of sugars that can be used for numerous industrial and agricultural processes, and is therefore a significant renewable resource for the generation of fermentable sugars that can result in commercially valuable end products, such Like biofuels.
  • the enormous potential energy of these carbohydrates is currently underutilized because sugars are forming part of complex polymers that are not easily accessible for fermentation.
  • Any plant biomass can be considered as raw material for the production of biofuels such as herbaceous crops, other agricultural remains or even urban solid waste.
  • These materials mainly comprise cellulose and hemicellulose. Once cellulose and hemicellulose are converted to glucose and xylose, respectively through an enzymatic hydrolysis process, these compounds are easily fermented by other organisms to ethanol.
  • an area of research aimed at reducing costs and enhancing the performance of biofuel production procedures focuses on improving the efficiency of cellulolytic enzymes, as well as enzymatic cocktails that comprise these enzymes and that can be use to generate fermentable sugars from biomass.
  • cellulose Due to the complexity of the biomass, its conversion into monomeric sugars implies the action of various types of enzymes with various enzymatic activities, which digest cellulose, hemicellulose, as well as other complex polymers present in the biomass. After cellulose, hemicellulose is the second most abundant fraction available in nature. Both cellulose and hemicellulose can be pretreated, mechanically, chemically, enzymatically or in other ways, to increase their susceptibility to hydrolysis. After this pretreatment process a saccharification stage takes place, which is an enzymatic process by which complex carbohydrates degrade into their monosaccharide components.
  • the objective of any saccharification technology is to alter or eliminate structural and compositional impediments to hydrolysis in order to improve the rate of enzymatic hydrolysis and increase the yields of fermentable sugars from biomass, which mainly comprises cellulose and hemicellulose.
  • biomass which mainly comprises cellulose and hemicellulose.
  • Cellulases (1,4-beta-D-glucan-4- glucanhydrolase, EC 3.2.1.4) comprise at least three enzymatic activities, endo ⁇ -glucanases (EC 3.2.1.4), exo ⁇ -glucanases or cellobiohydrolases (EC 3.2. 1.91) and ⁇ -glucosidases (EC 3.2.1.21), of which its synergistic performance in cellulose hydrolysis has been demonstrated (Woodward, J. 1991, Bioresource Technology Vol 36, p. 67-75).
  • xylanases EC 3.2.1.8
  • beta-xylosidases EC 3.2.1.37
  • mono-oxygenase polysaccharide also referred to as PMO, AA9, glycosyl hydrolase family 61 or GH61.
  • hydrolytic efficacy of a multienzyme complex formed by a wide diversity of cellulolytic enzymes, in the cellulosic saccharification process depends on both the properties of individual enzymes and the relationship of each enzyme in the complex.
  • This overexpression can be produced by any method known in the art, one of them being the expression under the control of strong expression signals, which results in a greater production of that or those enzymes within the enzyme cocktail (US20080194005A1).
  • Numerous host cells used for the expression of heterologous genes, such as the Escherichia coli bacteria, and their transformation procedures have been disclosed in the state of the art.
  • numerous fungal expression systems have also been developed, for example, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, among others.
  • many of these recombinant microorganisms have not found wide acceptance or use.
  • a host cell producing an ideal cellulolytic cocktail must meet a large number of criteria, such as using the medium efficiently, producing the polypeptide (s) or protein (s) of interest with high yield, in its In case of being able to secrete the protein (s) or the polypeptide (s) or the enzymatic compositions, in an efficient way, to be able to use a wide range of regulatory elements of the expression, thus ensuring easy application and versatility, allowing the use of easily detectable markers that are cheap to use, and produce stable transformants.
  • microorganisms that express an optimal enzyme cocktail that improves the performance and efficiency of the biomass degradation process. It would also be desirable, in order to improve the economy of the process, that the optimal or improved enzyme cocktail would allow the use of a smaller amount of enzymes within the cocktail, to obtain the same, or improved, yields of fermentable sugar production in said biomass degradation processes.
  • the present invention describes a modified host cell capable of secreting an optimized enzyme composition that has a greater cellulolytic capacity with respect to the composition obtained by the unmodified parental or wild cell.
  • the modification carried out in the host cell of the invention is aimed at decreasing the expression and / or secretion of at least one, or more than one, of the cellulolytic enzymes homologously expressed by said host cell and forming part of the enzymatic composition that expresses and secretes said cell, with the proviso that the cellulolytic enzyme (s) from which its expression and / or secretion are decreased are those cellulolytic enzymes that have a lower cellulolytic activity in relation to to the cellulolytic activity presented by other cellulolytic enzymes of the same family included in the cocktail.
  • the industrial conditions in which enzymatic cocktails are used are rather controlled and predefined, with respect to the environmental conditions in which the organisms that produce them are found.
  • This greater efficiency refers to the use of a lower diversity of enzymes in the enzyme cocktail, to obtain better yields (higher production of fermentable sugars, such as glucose) in said biomass degradation processes.
  • said composition allows to obtain better yields with a lower diversity of enzymes in the enzymatic cocktail, so that the efficiency of the biomass degradation process is increased, since there is a greater representation of contributory enzymes (Figure 1).
  • the objective of the present invention is to reduce said enzymatic diversity by reducing the expression and / or secretion of one or more cellulolytic enzyme (s) that has a lower cellulolytic efficiency compared to other cellulolytic enzymes. from the same family within the cocktail, in order to obtain an enzymatic composition that has a higher concentration of those cellulolytic enzymes that have greater efficiency and show an increase in the efficiency of the biomass degradation process.
  • s cellulolytic enzyme
  • compositions obtained from said host cells of the invention comprise the cellulolytic enzyme (s) exhibiting greater cellulolytic efficiency, a smaller diversity of enzyme (s) in the enzymatic composition of the invention is necessary, for obtaining better production yields of fermentable sugars compared to those obtained using other known compositions that have a wide enzymatic diversity and described in the state of the art for the same purpose.
  • the present invention represents a solution to the need to provide a microorganism that expresses an optimized mixture or cocktail of cellulolytic enzymes, capable of improving the efficiency of the cellulolytic process of biomass or saccharification, by decreasing the expression and / or secretion of non-contributory cellulolytic enzymes that have a lower efficiency compared to other contributory cellulolytic enzymes and, as a consequence, less enzymatic diversity or in the enzymatic cocktail comprising contributory enzymes is needed, to obtain better yields better yields (higher amounts of sugars fermentable released).
  • the enzymatic composition expressed and / or secreted by the modified host cells of the invention has a higher cellulolytic efficiency and a higher concentration of contributory cellulolytic enzymes that are selected from those that have a higher cellulolytic efficiency within the group of enzymes that are part of the enzymatic diversity of the cocktail.
  • This higher concentration of contributory cellulolytic enzymes in the enzyme composition of the invention is a consequence of the lower expression and / or secretion of non-contributory cellulolytic enzymes, since the contributory cellulolytic enzymes occupy the space left, in terms of the amount present in the composition. enzymatic, by the non-contributory enzymes eliminated ( Figure 1).
  • the present invention describes a modified host cell that produces a less diverse enzyme cocktail, by presenting a reduced expression and / or secretion of at least one non-contributory cellulolytic enzyme with respect to the expression of the same non-contributory cellulolytic enzyme in a host cell parental or wild (wild-type) or unmodified.
  • the modified host cell of the invention has a higher cellulolytic efficiency, of transforming the cellulosic material into fermentable sugars, than a parental or wild host cell, not genetically modified.
  • Said modified host cell may additionally have an increase in the expression of at least one contributory cellulolytic enzyme with respect to the expression of said contributory cellulolytic enzyme (s) in a wild host cell, not genetically modified.
  • the contributory cellulolytic enzyme (s) whose expression may be increased in the host cell of the invention may be selected, preferably from homologous contributive cellulolytic enzyme (s) (s) and / or heterologous contributory cellulolytic enzyme (s).
  • the inventors have shown that a lower expression and / or secretion of non-contributory cellulolytic enzymes in host cells, results in the expression and / or secretion of an enzymatic composition that presents an increase in the concentration (or a greater representation) of cellulolytic enzymes Contributory factors that have greater efficiency than non-contributory cellulolytic enzymes, which translates into the use of a lower diversity of cellulolytic enzymes in industrial biomass degradation processes and, therefore, also in an increase in process efficiency saccharification and, finally, in the overall performance of the bioproduct production processes, preferably biofuel, since, as previously mentioned, a lower enzymatic diversity is needed to obtain a higher production of fermentable sugars at the end of the hydrolysis process or saccharification.
  • a first aspect of the present invention is related to a modified host cell that has a reduced expression and / or secretion of at least 10% in at least one of the non-contributory cellulolytic enzymes with respect to the percentage of expression and / or secretion of said non-contributory cellulolytic enzyme in a wild-type parental or wild host cell. From this moment and throughout this document, this first aspect of the invention will be referred to as the "host cell of the invention".
  • the host cell of the invention has been genetically modified to reduce the expression and / or secretion of at least one non-contributory cellulolytic enzyme by approximately at least 1%, approximately at least 2%, approximately at least one 3%, to!
  • the host cell of the invention exhibits a 100% reduction in the expression and / or secretion of at least one non-contributory cellulolytic enzyme relative to a parental or wild host cell.
  • the terms "parental or wild host cell” or “wild-type host cell” may be used interchangeably and refer to that host cell that has not been modified to exhibit reduced expression and / or secretion of one or more of a non-contributory cellulolytic enzyme as described in the present invention.
  • the parental or wild cell of the present invention is Myceliophthora thermophila, more preferably M. thermophila C1.
  • the host cells are modified to completely or partially suppress, or totally or partially silence, coding sequences of non-contributory cellulolytic enzymes or, otherwise, totally or partially eliminate the expression of one or more cellulolytic enzymes.
  • the host cells of the invention in addition to presenting a reduced expression and / or secretion of at least one non-contributory cellulolytic enzyme, may undergo other genetic modifications in order to present characteristics that improve protein secretion, protein stability or other desirable properties for the expression and / or secretion of one or more contributory cellulolytic enzymes.
  • the expression and / or secretion of one or more non-contributory cellulases is reduced, reduced or totally or partially inhibited, which leads to a greater representation of the cellulases of interest, which in the present invention preferably refer , to contributory cellulolytic enzymes, in the enzymatic cocktail obtained from said cell.
  • the genetic modification of the cell of the invention can be achieved by genetic engineering techniques or by using classical microbiological techniques such as chemical or UV mutagenesis and subsequent selection.
  • a combination of recombinant modification and classical selection techniques can be used to produce the organism of interest.
  • nucleic acid molecules can be introduced, deleted, disrupted, silenced, inhibited or modified, in a way that produces a reduced or no expression of the non-contributory cellulolytic enzyme (s), which is associated with a high secretory yield of contributory cellulolytic enzymes within the organism or in the culture.
  • homologous recombination can be used to induce modifications of genes chosen as the target by specifically targeting an in vivo gene to suppress the expression of the encoded protein.
  • antisense RNAi can also be used to decrease or inhibit gene expression.
  • the host cells of the invention are modified to eliminate at least one gene encoding a non-contributory cellulase or alternatively, decrease or eliminate the expression of one or more non-contributory cellulases.
  • the expression of one or more non-contributory cellulases is decreased, inhibited, silenced or deleted to increase the production or presence in the enzyme cocktail secreted by the modified host cell, of other cellulases of interest, such as contributory cellulases .
  • the secretion of one or more non-contributory cellulases may be inhibited, decreased or canceled. Alterations in the secretion of cellulolytic enzymes in the host cell of the invention may affect both the secretion of the non-contributory cellulase (s) and the general enzyme secretion system that specifically inhibits, decreases or nullifies the secretion of the non-contributory cellulase (s).
  • nucleic acid molecules encoding the signal peptide or sequences that allow secretion of the non-contributory cellulolytic enzyme (s) can be introduced, deleted, disrupted, silenced, modified, inhibited, so that it occurs a diminished or zero secretion of the non-contributory cellulolytic enzymes or enzymes.
  • homologous recombination can be used to induce modifications in the secretion system of the non-contributory cellulolytic enzymes or enzymes.
  • the host cells of the invention are modified to decrease or cancel the secretion of at least one non-contributory cellulase.
  • expression refers to the transcription of a specific gene or specific genes or specific genetic construct in mRNA with the subsequent translation of the latter into a protein. Additionally it includes the secretion of the protein to the outside of the cell.
  • secretion refers to the transport of a protein from inside the cell to the outside.
  • secretion refers, preferably to the secretion of enzymes with cellulolytic activity, which by effect of this transport appear in the enzymatic cocktail produced by said cell.
  • increased expression or “overexpression” may be used interchangeably throughout this document and refer to any form of expression that is additional or greater than the original level of expression in a parental cell or wild Methods for increasing the expression of genes or gene products are well documented in the art and include, for example, overexpression driven by appropriate promoters, the use of transcription enhancers or translation enhancers.
  • the isolated nucleic acids can also serve as promoters or enhancers and can be introduced in an appropriate position in a non-heterologous form of a polynucleotide in order to regulate by increasing the expression of a nucleic acid encoding the polypeptide of interest.
  • endogenous promoters can be altered in vivo by mutation, deletion, and / or substitution, or isolated promoters can be introduced into a polynucleotide sequence encoding a gene of interest to control its expression.
  • these terms are intended to encompass the increase in the expression of both homologous and heterologous enzymes.
  • increasing in Expression includes a high transcription rate and / or an elevated gene level as compared to the homologous transcription rate of said gene.
  • a heterologous gene is introduced into a host cell to induce an increase in the expression of a gene encoding a homologous enzyme.
  • the heterologous gene is a gene that has been modified to increase the expression of the gene product.
  • the term also encompasses the secretion of the polypeptide from a cell.
  • the terms "endogenous" or “homologous” refer to both genes and proteins, which are found naturally in a host cell, that is, without any human intervention. Additionally, these terms also refer to those same genes or proteins that once isolated from the body can be reintroduced (transgenerated) by genetic engineering.
  • the term “decrease”, “reduction”, “deletion”, “inhibition”, “deletion”, “silencing”, “elimination” refers to a decrease in the level of expression of a gene and / or protein secretion with respect to the original level of expression of the same gene and / or protein secretion in the parental or wild genotype.
  • the decrease, elimination, reduction, suppression, inhibition, deletion, silencing or inhibition of the expression and / or secretion in increasing order of preference is at least 10%, 20%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, reduced compared to expression in parental or host cells wild.
  • gene silencing is preferred.
  • partial deletion or elimination of the gene is preferred.
  • complete or almost complete deletion of the gene sequence is preferred.
  • the term “recombinant” refers to a polynucleotide or polypeptide that does not occur naturally in a host cell.
  • the "recombinant cells” express genes that are not found identically within the native or wild (ie, non-recombinant) form of the cell and / or express native genes that would otherwise be increased in expression. , decreased or canceled due to deliberate human intervention.
  • Recombinant cells contain at least one recombinant polynucleotide or polypeptide.
  • a nucleic acid construct comprising the nucleic acid itself and the elements necessary for its expression, the nucleic acid (for example, a polynucleotide), cell or polypeptide is referred to herein as "recombinant" when it is of unnatural, artificial or processed origin. .
  • biomass refers in the present invention to the biodegradable fraction of products, residues and remains of biological origin from agriculture (including plant substances, such as crop residues, and animal substances), forest industries (such as timber resources) and related industries that include fisheries and aquaculture, as well as the biodegradable fraction of industrial and urban waste, such as solid urban waste or paper waste, and energy crops.
  • the biomass is straw or the organic fraction of urban solid waste.
  • the biomass is plant biomass, more preferably selected from the list consisting of: biomass rich in fermentable sugars, such as sugar cane, starch biomass, for example, cereal grains, corn straw, straw wheat, barley straw, sorghum straw, sugarcane straw, weeds, logs, branches and leaves.
  • biomass rich in fermentable sugars such as sugar cane
  • starch biomass for example, cereal grains, corn straw, straw wheat, barley straw, sorghum straw, sugarcane straw, weeds, logs, branches and leaves.
  • the predominant polysaccharide in the primary cell wall of biomass is cellulose, the second most abundant is hemicellulose, and the third is pectin.
  • the secondary cell wall produced after the cell has stopped its growth, also contains polysaccharides and is reinforced by polymeric lignin covalently crosslinked with hemicellulose.
  • Cellulose is a homopolymer of anhydrocellular and thus is a linear ⁇ - (1, 4) - ⁇ ⁇ ⁇ 8 ⁇ , while hemicellulose includes a variety of compounds, such as xylans, xyloglycans, arabinoxylans, and mannans in complex branched structures With a range of substituents.
  • cellulose is found in plant tissue primarily as an insoluble crystalline matrix of parallel glucan chains. Hemicelluloses normally bind by hydrogen bonds to cellulose, as well as to other hemicelluloses, which helps stabilize the cell wall matrix.
  • cellulose refers to a linear polysaccharide comprising hundreds to thousands of D-glucose units linked by ⁇ - bonds (1,4). This polysaccharide is also known as ⁇ - (1,4) glucan.
  • cellulolytic enzyme or cellulase refers to a category of enzymes that can degrade complex polymers, such as cellulose and / or hemicellulose ( ⁇ -1, 4- glucan or ⁇ -D-glucosidic bonds) to shorter oligosaccharides, such as cellobiose and / or glucose and xylobiose and / or xylose, respectively.
  • 1,4- ⁇ - ⁇ -glucan glucanhydrolase endoglucanase or "EG”
  • 1,4-D-glucan cellobiohydrolase exoglucanase
  • CBH cellobiohydrolase
  • ⁇ -D-glycosidoglucohydrolase ⁇ -glucosidase
  • Xyl endoxylanases or xylanases
  • beta-xylosidases beta-xylosidases
  • PMO mono-oxygenase polysaccharides
  • Endoglucanases break internal bonds and alter the crystalline structure of cellulose, exposing individual cellulose polysaccharide chains ("glucans").
  • Cellobiohydrolases shorten Gradually the glucan molecules, releasing mainly cellobiose units (a water-soluble glucose dimer linked to ⁇ -1,4), in addition to glucose, celotriose and celotetraose.
  • ⁇ -Glucosidases fraction cellobiose in glucose monomers.
  • Xylanases catalyze the random hydrolysis of polymeric xylan, polymeric pectin or hemicellulose containing xylose residues that results in the formation of sugar oligomers containing xylose and / or monomeric xylose residues.
  • Beta-xylosidases are enzymes with 4 ⁇ -D-xylan xylohydrolase activity catalyzing the reaction from xylose oligomers, including xylobiose, finally releasing D-xylose.
  • PMOs are metalloproteins with endocellulolytic activity that act with a different mechanism than endoglucanases, since they break cellulose chains by oxidation of their glucose monomers in carbons 1, 4 and / or 6.
  • efficiency of an enzyme, enzyme group or enzyme composition refers to the catalytic activity of the enzyme, enzyme group or enzyme composition, under appropriate conditions under which the enzyme converts specific polymeric or artificial substrates into oligomeric products. or specific monomers.
  • a "greater efficiency” or “better efficiency” of the enzymes of the invention or of the enzyme cocktail of the invention refers to obtaining an equal, or preferably greater amount of fermentable sugars obtained at the end of the hydrolytic process (it is ie, an equal or greater yield), with a lower diversity of cellulolytic enzymes present in the cocktail, with respect to an enzymatic cocktail obtained from a wild or parental host cell.
  • a contributory cellulolytic enzyme of any of the families or cellulolytic activities described in the present invention may be selected from a homologous or heterologous cellulase.
  • non-contributory cellulolytic enzyme refers to those cellulases within the diversity of cellulases present in enzyme cocktails, such as preferably, endoglucanases, cellobiohydrolases, ⁇ -glucosidases, ⁇ -xylosidases, xylanases, mono-oxygen polysaccharides, others, which have a cellulolytic activity such that being eliminated or reduced from an enzymatic cocktail improves its efficiency.
  • a non-contributory cellulolytic enzyme of any of the families or cellulolytic activities described in the present invention may preferably be selected from a homologous, or heterologous, cellulase.
  • the non-contributory cellulase of the invention is a homologous cellulase.
  • cellobiohydrolase refers to a protein of the class E.C. 3.2.1.91, which catalyzes the hydrolysis of polymeric cellulose to cellobiose through an exoglucanase activity, sequentially releasing cellobiose molecules from the reducing or non-reducing ends of cellulose.
  • EG EG
  • Eg glucosidic cellulose bonds
  • beta-glucosidase refers to a group of cellulase enzymes classified as EC 3.2.1.21. These enzymes catalyze the hydrolysis of sugar oligomers, including, but not limited to the glucose or cellobiose dimer, with the release of a corresponding sugar monomer, used, but not limited to, for the synthesis of ethanol.
  • the beta-glucosidase enzyme acts on the ⁇ - (1, 4) bonds that bind to two substituted glucose or glucose molecules (i.e., the cellobiose disaccharide). It is an exocellulase with specificity for a variety of beta-D-glycoside substrates. It catalyzes the hydrolysis of non-reducing terminal residues in beta-D-glycosides with glucose release.
  • endoxylanase or "xylanase” as used herein, refer to a group of enzymes (EC 3.2.1.8) that catalyze the endohydrolysis of 1,4,4-D-xyloid bonds in xylanes. This enzyme can also be referred to as endo-1,4-xylanase or 1,4-D-xylan xylanhydrolase.
  • enzymes EC 3.2.1.8
  • endo-1,4-xylanase or 1,4-D-xylan xylanhydrolase.
  • beta-xylosidase refers to a group of enzymes (EC 3.2.1.37) that catalyzes the hydrolysis of 1,4-D-xylanes, to eliminate residues of D- successive xylose of the non-reducing ends.
  • This enzyme can also be called xylan 1,4,4-xylosidase, 1,4 ⁇ -D-xylan xylohydrolase, exo-1,4,4-xylosidase or xylobiase.
  • polysaccharide monooxygenase PMO
  • Glycosyl hydrolase of the family 61 or "GH61” or “AA9” refer to a group of enzymes, originally classified within the GH61 family of proteins, since they have activity GH61 or PMO, and that when included in a saccharification reaction results in a greater amount (higher yield) of one or more soluble sugars (eg glucose) compared to the saccharification reaction carried out under the same conditions but in the absence of the GH61 protein.
  • soluble sugars eg glucose
  • the members of this family of enzymes act as copper monooxygenases that catalyze the breakage of cellulose chains through an oxidative mechanism at the level of several carbons (C1, C4 and / or C6), releasing celodextrins (Langston et al. Applied and Environmental Microbiology, 201 1, 77: 7007-7015).
  • nucleotide and peptide sequences described herein comprise at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, a!
  • the host cells of the invention as described herein may additionally have an increase of at least 1% in the expression and / or secretion of at least one contributory cellulolytic enzyme with respect to the percentage of expression and / or secretion of the same contributory cellulolytic enzyme (s) in a parental or wild host cell.
  • the host cells of the invention to present an increase in the expression of at least one of the contributory cellulolytic enzymes, may undergo genetic modifications in order to improve the expression and secretion of at least one of said enzymes, the stability of the same or other desirable properties for the induction of the increase in the expression and / or secretion of the contributory cellulolytic enzyme (s).
  • the host cells are additionally genetically modified to increase expression or insert more than one copy of the coding sequences of contributory cellulolytic enzymes that can be both homologous and heterologous.
  • the over-expression of one or more contributory cellulases is carried out to increase the production or proportion of the contributory cellulases.
  • the host cells of the invention are characterized in that in addition to presenting an increase in the expression of at least one of the contributory cellulolytic enzymes, said enzymes also have a greater cellulolytic activity.
  • the genetic modification to obtain said characteristics in the strains of the invention can be achieved by genetic engineering techniques or by using classical microbiological techniques such as chemical or UV mutagenesis and subsequent selection.
  • a combination of recombinant modification and classical selection techniques can be used to produce the organism of interest.
  • nucleic acid molecules can be introduced, over-expressed or modified, in a way that produces high yield of the secretion of contributory cellulolytic enzymes within the organism or in the culture.
  • homologous recombination can be used to induce modifications of genes chosen as the target, specifically targeting an in vivo gene to increase the expression of the encoded protein.
  • the host cell described in the present invention has been genetically modified to over-express at least one of the contributory cellulolytic enzymes 5 in about at least 1%, about at least 5%, about at least 10 %, about at least 20%, about at least 25%, about at least 30%, about at least 35%, about at least 40%, about at least 45%, about at least 50% , about at least 55%, about at least 60%, about at least 65%, about at least 70%, about at least 75%, about at least 80%, about at least 85%, about at least 90%, about at least 95%, about at least 98%, about at least 97%, about at least 98%, about at least 99%, about at least 100 % with respect to the expression of said contributory cellulolytic enzymes in a wild host cell.
  • the host cells of the invention are characterized by the overexpression of at least one of the contributory cellulolytic enzymes selected by the method described in the present invention.
  • the host cells of the invention are characterized in that the contributive cellulases can be derived from the host cell of the invention (homologues) or from other microorganisms producing cellulolytic enzymes other than the host cell of the invention (heterologous) . They can also be produced naturally or recombinantly.
  • the host cells of the invention are characterized in that the contributive cellulolytic enzyme that can increase its expression is preferably a cellobiohydrolase.
  • said cellobiohydrolase is preferably any cellobiohydrolase that has the highest efficiency within its family.
  • the host cells of the invention are characterized by the contributory cellulolytic enzyme that can increase its Expression is preferably an endoglucanase.
  • the endoglucanase is preferably any endoglucanase that has the highest efficiency within its own family.
  • the preferred endoglucanase is endoglucanase 2.
  • endoglucanase 2 preferably comprises a sequence that has at least 60% identity with SEQ ID NO: 6, and optionally encoded by a nucleotide sequence. comprising a sequence that has at least 60% identity with SEQ ID NO: 5. More preferably, endoglucanase 2 is endoglucanase 2 comprising SEQ ID NO: 6, optionally encoded by the nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 5.
  • the host cells of the invention are characterized in that the contributive cellulolytic enzyme that can increase its expression is preferably a beta-glucosidase.
  • the beta-glucosidase is preferably any beta-glucosidase that has the highest efficiency within its own family.
  • the host cells of the invention are characterized in that the contributive cellulolytic enzyme that can increase its expression is preferably an endoxylanase.
  • the endoxylanase is preferably any endoxylanase that has the highest efficiency within its own family.
  • the host cells of the invention are characterized in that the contributive cellulolytic enzyme that can increase its expression is preferably a beta-xylosidase. In a still more preferred embodiment, the beta-xylosidase is preferably any beta-xylosidase that has the highest efficiency within its own family. In another more preferred embodiment, the host cells of the invention are characterized in that the contributive cellulolytic enzyme that can increase its expression is preferably a mono-oxygenase polysaccharide. In a still more preferred embodiment, the mono-oxygenase polysaccharide is preferably any mono-oxygenase polysaccharide that has the highest efficiency within its own family.
  • the host cell of the invention is characterized in that it has a reduced expression of a homologous non-contributory endoglucanase that has at least 60% identity with endoglucanase 6 comprising SEQ ID NO: 2, optionally encoded by a nucleotide sequence that has at least 60% identity with endoglucanase 6 comprising SEQ ID NO: 1. More preferably, endoglucanase 6 is endoglucanase 6 comprising SEQ ID NO: 2, optionally encoded by the nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 1.
  • the term "reduced" refers to the deletion of the gene encoding endoglucanase 6.
  • the host cell of the invention is characterized in that it has a reduced expression of a homologous non-contributory mono-oxygenase polysaccharide having at least 60% identity with the 09768 mono-oxygenase polysaccharide comprising SEQ ID NO: 4, optionally encoded by a nucleotide sequence that has at least 60% identity with the 09768 mono-oxygenase polysaccharide comprising SEQ ID NO: 3. More preferably, the 09768 mono-oxygenase polysaccharide is the 09768 mono-oxygenase polysaccharide comprising SEQ ID NO: 4, optionally encoded by the nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 3.
  • the reduced expression refers to the deletion of the gene encoding the 09768 mono-oxygenase polysaccharide .
  • the host cell of the invention is characterized in that it exhibits a reduced expression of a homologous non-contributory endoglucanase that has at least 60% identity with endoglucanase 6 comprising SEQ ID NO: 2, optionally encoded by a nucleotide sequence that has at least 60% identity with endoglucanase 6 comprising SEQ ID NO: 1 and a reduced expression of a homologous non-contributory mono-oxygenase polysaccharide that has at least 60% identity with the mono polysaccharide - Oxygenase 09768 comprising SEQ ID NO: 4, optionally encoded by a nucleotide sequence that has at least 60% identity with the 09768 mono-oxygenase polysaccharide comprising SEQ ID NO: 3.
  • the host cell of the invention is characterized in that it has a reduced expression of endoglucanase 6 of SEQ ID NO: 2 and of the mono-oxygenase polysaccharide 09768 of SEQ ID NO: 4.
  • the reduced expression of endoglucanase 2 and 09768 mono-oxygenase polysaccharide refers to the deletion of the genes encoding said enzymes.
  • the "host cell” includes any type of cell that is susceptible to transformation, transfection, transduction, and the like with one or more nucleic acid constructs or expression vector comprising a polynucleotide that it codes for the cellulases described here, both contributory and non-contributory cellulases.
  • the host cell can be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
  • the host cell is a prokaryotic cell that is preferably selected from the group of bacteria of the genera Bacillus, Clostridium, Esherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Streptomyces, Thermoanaerobacterium or Zymomonas.
  • the host cell is a eukaryotic cell that is preferentially selected from the group of fungi of the genera Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospais, Ceripomyceris, Cerryomidaemia , Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora , Pa
  • the host cell of the invention is any strain of the Myceliophthora thermophila species. In an even more preferred embodiment, the host cell of the invention is strain C1 of Myceliophthora thermophila. It will be understood that for the aforementioned genera and species, the invention encompasses the perfect and imperfect states, and other taxonomic equivalents, for example, the anamorphs, with respect to the name of the species by which they are known. Those skilled in the art will readily recognize the identity of suitable equivalents. For example, Myceliophthora thermophila is equivalent to Chrysosporium lucknowense.
  • Another aspect of the present invention relates to an enzyme cocktail obtained by the host cells of the invention.
  • Said enzymatic cocktail comprises, at least, the contributory cellulolytic enzymes as defined above and which are secreted by the host cells of the invention, so that it will lack at least one of the non-contributory cellulolytic enzymes as defined above. From here and throughout this document, this cocktail will be referred to as "cocktail of the invention”.
  • the enzyme cocktail referred to in the present invention comprises the contributory cellulolytic enzymes as defined above and lacks the enzymatic activity of at least one cellulase with endoglucanase activity, preferably, endoglucanase 6 ( Eg6), and / or at least one cellulase with monooxygenase polysaccharide activity, preferably PMO-09768.
  • the cocktail of the invention can also be supplemented by adding other accessory or additional enzymes, which can be both homologous and heterologous, and which are also characterized in that their specific enzymatic activity cannot be replaced by any of the enzymatic activities presented by the contributory cellulolytic enzymes.
  • Said accessory or additional enzymes are selected from any of the following: aminopeptidases, amylases, carbohydrases, carboxypeptidases, catalases; chitinases, cutinases, cyclodextrin glucosyltransferases, deoxyribonucleases, esterases, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidases, haloperoxidases, invertases, lacases, lipases, mannosidases, oxidases, oxidoreductases, proteimasases, phylostasases, proteimasases, proteases polyphenoloxidases, proteolytic enzymes, ribonucleases, transglutamines, or any combination thereof, provided that it does not present non-contributory cellulolytic enzymes.
  • This accessory (s) or additional (s) enzyme (s) may come from both the host cell itself and other microorganisms capable of secreting cellulolytic enzymes that exhibit the activities indicated above, for example, by means of a microorganism belonging to the genus Aspergillus, such as Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, or Aspergillus oryzae; Fusarium, such as Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fu
  • the cocktail of the invention further comprises other accessory or additional cellulolytic enzymes as described in the preceding paragraphs, which can be produced naturally or recombinantly.
  • the cocktail of the invention is an enzymatic mixture obtained from the host cell of the invention.
  • the cocktail of the invention is an enzymatic mixture obtained by the host cell of the invention, preferably M. thermophila, which has a lower expression and / or secretion of homologous non-contributory cellulolytic enzymes in relation to a cell host, preferably M. thermophila parental or wild, which has a normal expression and / or secretion of all cellulolytic enzymes.
  • the cocktail of the invention can be prepared according to the procedures known in the art and can be in liquid form or be a dry composition.
  • the enzymes to be included in the cocktail can be stabilized according to the procedures known in the art.
  • the host cell of the invention is capable of secreting the contributory enzymes into the medium together with other enzymes. Additional cellulolytics produced naturally or recombinantly, thus being useful for the optimization of the biomass hydrolysis stage in fermentable sugars. Therefore, another aspect described in the invention relates to the use of the host cell of the invention or of the cocktail of the invention, for the degradation of biomass.
  • the host cell or the cocktail of the present invention can be used to produce, from biomass, preferably plant biomass, monosaccharides, disaccharides and polysaccharides as chemical or fermentation raw materials for the production of ethanol, plastics, or other products. or intermediate.
  • the host cell of the present invention can be used as a source of polypeptides having cellulase activity, said polypeptides being used in degradation or hydrolysis and fermentation processes of the biomass.
  • the degradation or hydrolysis of biomass, preferably plant biomass, to fermentable sugars, also known as “saccharification", by means of the host cell of the invention or the cocktail of the invention, can be followed by a fermentation process in the that the fermentable sugars obtained are used in order to finally obtain a bioproduct such as bioethanol.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the use of the host cell of the invention or the cocktail of the invention, for the degradation of biomass in a bioproduct production process.
  • bioproduct refers to products with high added value that can be obtained by chemical transformation of sugars or by fermentation of said sugars with different microorganisms.
  • a list of possible fermentative microorganisms is the following: Bacillus thermoglucosidaisus, Clostridium butyricum, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Geobacillus themoglucosidasius, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus sp.
  • alcohols such as ethanol, methanol, butanol, hexanol, octanol, decanol, dodecanol, 1,3-butanediol (1, 3-diol), 1- alcohol
  • organic acids such as citric acid, acetic acid, itaconic acid, lactic acid, glutamic acid, succinic acid, beta-keto acid, beta-ketoalcohol, beta-hydroxy acid
  • ketones such as acetone
  • gases such as hydrogen or carbon dioxide
  • hydrocarbons such as alkane alkynes or alkynes
  • nitrogenous substances such as amines, amide, nitro compounds or nitriles
  • halides amino acids such as glutamic acid
  • antibiotics such as penicillin or tetracyclines
  • vitamin like riboflavin vitamin B12 or beta-carotene
  • fatty acids such as
  • Ethanol can be produced by enzymatic degradation of biomass and the conversion of released saccharides into ethanol. This type of ethanol is often called bioethanol. It can be used as a fuel additive or extender in mixtures of less than 1% up to 100% (a fuel substitute).
  • the bioproduct is biofuel.
  • biofuel refers to a hydrocarbon, or one of its mixtures, which can be used as fuel and is obtained using fermentable biomass as a starting material. Examples of biofuels include, but are not limited to, ethanol or bioethanol and biodiesel. In a more preferred embodiment, the biofuel is bioethanol.
  • bioethanol refers to an alcohol prepared by fermentation, often from fermentable biomass such as carbohydrates produced in sugar or starch crops such as corn or sugarcane.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for producing fermentable sugars, referred to herein as the "first process of the invention” which comprises: a) Incubating biomass, preferably pretreated biomass, with the host cell of the invention, or with the cocktail of the invention, and
  • step (a) Recover the fermentable sugars obtained after the incubation of step (a).
  • Pretreatment uses various techniques, which include, but are not limited to chemical and / or mechanical treatments, such as the explosion of fiber with ammonium, treatment with diluted acid and steam explosion at elevated temperatures to alter the structure of the biomass cellulosic and make cellulose more accessible.
  • chemical and / or mechanical treatments such as the explosion of fiber with ammonium, treatment with diluted acid and steam explosion at elevated temperatures to alter the structure of the biomass cellulosic and make cellulose more accessible.
  • the use of the host cell of the invention or of the cocktail of the invention in the processes of the present invention is advantageous because high temperatures are not required in the biomass pretreatment process.
  • transfermentable sugar refers to simple sugars, such as glucose, xylose, arabinose, galactose, mannose, rhamnose, sucrose or fructose, among others.
  • second process of the invention relates to a process for producing a bioproduct from biomass, hereinafter referred to as "second process of the invention", comprising:
  • the biomass preferably pretreated biomass
  • the solids content during hydrolysis may be, but not limited to, between 5-40% of the total weight, preferably between 10-40% of the total weight, more preferably between 15-25% of the total weight.
  • Hydrolysis is carried out as a process in which biomass, preferably pretreated biomass, is incubated with the host cell of the invention or with the cocktail of the invention containing cellulolytic enzymes and thus forming the hydrolysis solution.
  • the appropriate process time, temperature and pH conditions can easily be determined by one skilled in the art.
  • said hydrolysis is carried out at a temperature between 25 ° C and 60 ° C, preferably between 40 ° C and 60 ° C, specifically around 50 ° C.
  • the process is preferably carried out at a pH in the range of 3-8, preferably pH 4-6, especially around pH 5.
  • the hydrolysis is carried out in a time between 12 and 144 hours, preferably between 16 and 120 hours , more preferably between 24 and 96 hours, even more preferably between 32 and 72 hours.
  • Hydrolysis (step (a)) and fermentation (step (b)) can be carried out simultaneously (SSF process) or sequentially (SHF process).
  • hydrolyzed, and preferably pretreated, biomass is fermented by at least one fermenting microorganism capable of fermenting fermentable sugars, such as glucose, xylose, mannose and galactose directly or indirectly in the desired fermentation product.
  • the fermentation is preferably carried out in a time between 8 and 96 hours, preferably between 12 and 72, more preferably between 24 and 48 hours.
  • the fermentation is carried out at a temperature between 20 ° C and 40 ° C, preferably from 26 ° C to 34 ° C, in particular around 32 ° C.
  • the pH is from 3 to 6 units, preferably from 4 to 5.
  • a yeast of the Saccharomyces cerevisiae species, both wild and genetically modified, is preferred for ethanolic fermentation. Strains that are resistant to high levels of ethanol are preferred, up to, for example, 5 or 7% in vol. of ethanol or more, such as 100% in vol. of ethanol.
  • the term "termentator or fermentation” as used herein, refers to a process of biological transformation produced by the activity of some microorganisms in which sugars such as glucose, fructose, and sucrose are converted into ethanol.
  • the microorganisms used in this way are fermenting microorganisms that have fermentation capacity, such as yeasts, preferably S. cerevisiae.
  • recovery refers to the collection of fermentable sugars obtained after the incubation of step (a) of the first process of the invention or of the bioproduct obtained after the fermentation of step (b) of the second process of the invention. Recovery can be performed by any procedure known in the art, including mechanics or manuals.
  • the bioproduct is biofuel, more preferably bioethanol.
  • FIG. 1 Representation of the composition and concentration (expressed as a relative percentage) of cellulase enzymes included in an enzymatic cocktail that could be obtained from a parental host cell not genetically modified.
  • B Representation of the composition and concentration (expressed as a relative percentage) of cellulase enzymes included in an enzyme cocktail that could be obtained from a modified host cell as described in the present invention.
  • said enzyme cocktail shows a lower enzyme diversity and a greater representation of the contributory enzymes, more efficient in the industrial conditions in which they will be used, to the detriment of their diversity.
  • FIG. 1 Scheme of vector pBASE7.
  • Base plasmid that allows cloning the flanking ends of the gene to be deleted. It includes as a selection marker the amdS gene that confers acetamide resistance.
  • the selection marker includes its promoter region (P amd s) and terminator (T amd s) - On both sides of the amdS gene there are two REP regions (repeated) that allow, once the vector is integrated into the genome and by homologous recombination among them, the removal of the amdS selection marker.
  • B Scheme of plasmid pBASE7-eg6 used to delete the eg6 gene.
  • Figure 4 Analysis of glucose release from ground biomass subjected to a cellulolytic enzyme composition obtained from a strain of M. thermophila that does not express the eg6 gene with respect to the parental strain of M. thermophila.
  • FIG. 1 Photograph of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 7.5%) showing the cellulases present in two enzymatic compositions, one containing the enzyme endoglucanase 6 (+ Eg6), which has been obtained from a control strain of M. thermophila unmodified, and one that lacks said enzyme (-Eg6).
  • Lane 1 Molecular weight marker
  • Lane 2 enzymatic composition without Eg6
  • Lane 3 enzymatic composition with Eg6.
  • the arrow indicates the protein band that corresponds to the enzyme endoglucanase 6.
  • Figure 6 Analysis of glucose release from ground biomass subjected to a cellulolytic enzymatic composition obtained from a strain of M. thermophila that does not express the 09768 mono-oxygenase polysaccharide gene with respect to the parental strain of M. thermophila
  • Figure 7. Photograph of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 7.5%) showing the cellulases present in two enzymatic compositions, one comprising the mono oxygenase polysaccharide enzyme (+ PMO 09768), which has been obtained from a strain control of unmodified M. thermophila, and another that lacks said enzyme (-PMO 09768).
  • Lane 1 Molecular weight marker
  • Lane 2 enzyme composition without PMO 09768
  • Lane 3 enzymatic composition with PMO 09768.
  • the arrow indicates the protein band corresponding to the enzyme PMO 09768.
  • Figure 8. Analysis of glucose release from ground biomass subjected to different enzyme compositions obtained from strains of M. thermophila that do not express the gene that codes for endoglucanase 6 with respect to the respective parental M. thermophila strains that do express said gene.
  • Example 1 Construction of a plasmid capable of deleting the eg6 gene. Transformation of the M. thermophila strain with said plasmid to obtain the Aeg6 strain.
  • the eg6 gene (SEQ ID NO: 1) of M. thermophila C1 was the candidate candidate gene given its potential for improvement in the enzyme composition lacking this activity.
  • a plasmid was constructed that allows deleting the eg6 gene in M. thermophila C1.
  • Said plasmid contains fragments upstream and downstream of the eg6 gene such that by homologous recombination with the genome of M. thermophila C1, the eg6 gene is replaced by the cloned selection marker between both fragments.
  • the upstream fragment of the eg6 gene was amplified from genomic DNA of M. thermophila C1 as a target (obtained using the Qiagen DNeasy Plant Mini Kit) with the Proof High-Fidelity DNA polymerase (BioRad) using oligonucleotides 1 ( direct primer) (ACCGAGCTCGTAGCACTCGCTGTGTATCCTC) (SEQ ID NO: 7) and 2 (reverse primer) (CCTGGATCCCTTATACCCAGGACATTCACAGTTC) (SEQ ID NO: 8). These oligos include the recognition sequences for the restriction enzymes Sad and f ⁇ amHI.
  • the fragment downstream of the eg6 gene was amplified with oligonucleotides 3 (direct primer) (ACCGAATTCATCAAATGGATAGGTCGGTAATG) (SEQ ID NO: 9) and 4 (reverse primer) (CACCTCGAGCAAGGAAGTCGAGTACGAGTCC) (SEQ ID NO: 10).
  • These oligonucleotides include the recognition sequences of the restriction enzymes EcoRI and Xho.
  • the amplification conditions for both fragments are one cycle at 95 ° C for 2 minutes and 30 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 90 seconds and 72 ° C for 10 minutes.
  • the upstream and downstream fragments of the eg6 gene of sizes corresponding to 2005 bp and 2018 bp respectively were amplified, they were cloned into the vector pBASE7 ( Figure 2A).
  • This vector contains as a selection marker the amdS gene that confers ability to use acetamide as a nitrogen source.
  • the amplified fragment corresponding to the 3 ' end of the gene (located downstream thereof) was digested with the restriction enzymes EcoRI and Xho ⁇ and cloned into the pBASE7 vector previously digested with the same restriction enzymes.
  • the ligation mixture was transformed into electrocompetent cells of Escherichia coli XLI Blue MRF following the protocol provided by the manufacturer (Stratagene).
  • Plasmid DNA to delegate the eg6 gene was linearized by digestion with the restriction enzymes Sad and f ⁇ amHI and was used to transform host cells of the strain M. thermophila C1 (Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol., 3 (1 )). This DNA was introduced into the host strain using a protoplast transformation method (US7399627B2). The transformants were seeded on agar plates containing 0.6 g / L acetamide (Merck). After 5 days of incubation at 35 ° C the resulting transformants were analyzed (expressing the amdS gene and are therefore able to grow in the presence of acetamide as the sole source of nitrogen).
  • the Transformants obtained were genetically analyzed to see if the eg6 gene had been replaced by the selection marker.
  • genomic DNA was obtained from the transformants obtained (obtained using the QNegen DNeasy Plant Mini Kit) with the Proof High-Fidelity DNA polymerase (BioRad) using oligonucleotides 5 (direct primer) (GGCTCGAGATCTACAAGACTG) (SEQ ID NO: 1 1) and 6 (reverse primer) (GTAGTTGGACACGTTGGTGA) (SEQ ID NO: 12) to amplify an internal fragment of eg6 of 350 bp.
  • the amplification conditions for both fragments are one cycle at 95 ° C for 2 minutes and 30 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 10 minutes.
  • Example 2 Evaluation of host strains of M. thermophila that lack non-contributory cellulase Eg6 (Aeg6) against parental strains that do (+ Eg6).
  • Figure 4 shows the results obtained in Figure 4, where it can be seen that the deletion of the non-contributory endoglucanase Eg6 causes an increase in saccharification capacity, that is, glucose production, with respect to the control that does express the endoglucanase Eg6.
  • Figure 5 shows the acrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions (SDS-PAGE) of the enzyme compositions with and without Eg6.
  • Example 4 Evaluation of the effect of the deletion of the eg6 gene (non-contributory endoglucanase) in different strains of M. thermophila.

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Abstract

La presente invención se refiere a una célula hospedadora, preferiblemente una célula de Myceliophthora thermophila, que muestra una menor expresión y/o secreción de enzimas celulolíticas no contributivas, preferiblemente donde la enzima celulolítica no contributiva es la endoglucanasa 6 que comprende la SEQ ID NO: 2,favoreciendo así la presencia de enzimas celulolíticas contributivas en el cóctel enzimático sintetizado por dicha célula hospedadora. La presente invención también se refiere al uso de dichas células hospedadoras y de los cócteles enzimáticos sintetizados por dichas células hospedadoras para la obtención de azúcares fermentables de la biomasa y un procedimiento para producir bioproductos, preferiblemente bioetanol, que comprende el uso de dicha célula hospedadora o de la composición de la invención.

Description

CÉLULA HOSPEDADORA MYCELIOPHTHORA THERMOPHILA CON ACTIVIDAD CELULOLÍTICA MEJORADA Y COMPOSICIONES ENZIMÁTICAS OBTENIDAS
POR LA MISMA DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere al campo de los bioproductos, preferiblemente biocombustibles, y más particularmente, a la mejora de cócteles celulolíticos producidos por células hospedadoras modificadas que expresen y/o secreten una menor diversidad de enzimas celulolíticas, a los cócteles enzimáticos obtenidos de dichas células hospedadoras, y al uso de dichas células hospedadoras y dichos cócteles enzimáticos en la producción de bioproductos, preferiblemente bioetanol, a partir de biomasa. ESTADO DE LA TÉCNICA
Los biocombustibles suponen una alternativa atractiva a los combustibles fósiles y se pueden obtener mediante la fermentación de azúcares monoméricos derivados del almidón o la celulosa y hemicelulosa.
La biomasa vegetal proporciona una fuente completa de energía potencial en forma de azúcares que se puede utilizar para numerosos procesos industriales y agrícolas, y es por tanto un recurso renovable significativo para la generación de azúcares fermentables que pueden dar como resultado productos finales comercialmente valiosos, tales como los biocombustibles. Sin embargo, la enorme energía potencial de estos hidratos de carbono está actualmente infrautilizada porque los azúcares están formando parte de polímeros complejos que no están fácilmente accesibles para la fermentación. Cualquier biomasa vegetal se puede considerar como materia prima para la producción de biocombustibles como pueden ser cultivos herbáceos, otros restos agrícolas o incluso residuos sólidos urbanos. Estos materiales comprenden principalmente celulosa y hemicelulosa. Una vez que la celulosa y la hemicelulosa se convierten en glucosa y xilosa, respectivamente por medio de un proceso de hidrólisis enzimática, éstos compuestos son fácilmente fermentados por otros organismos a etanol. De esta manera, cuánta más cantidad de azúcares complejos permanezca al final del proceso hidrolítico, menor será el rendimiento de la producción de etanol al final del proceso de la fermentación. Por tanto, un área de investigación destinada a disminuir los costes y a potenciar el rendimiento de los procedimientos de producción de biocombustible se centra en la mejora de la eficiencia de las enzimas celulolíticas, así como de los cócteles enzimáticos que comprenden dichas enzimas y que se pueden utilizar para generar azúcares fermentables a partir de biomasa.
Debido a la complejidad de la biomasa, su conversión en azúcares monoméricos implica la acción de diversos tipos de enzimas con diversas actividades enzimáticas, que digieren celulosa, hemicelulosa, así como otros polímeros complejos presentes en la biomasa. Después de la celulosa, la hemicelulosa es la segunda fracción más abundante disponible en la naturaleza. Tanto la celulosa como la hemicelulosa se pueden tratar previamente, de forma mecánica, química, enzimática o de otros modos, para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis. Tras este proceso de pretratamiento tiene lugar una etapa de sacarificación, que es un proceso enzimático por el cual los hidratos de carbono complejos se degradan en sus componentes monosacáridos. El objetivo de cualquier tecnología de sacarificación es alterar o eliminar los impedimentos estructurales y de composición para la hidrólisis con el fin de mejorar la tasa de hidrólisis enzimática y aumentar los rendimientos de azúcares fermentables a partir de la biomasa, que comprende principalmente, celulosa y hemicelulosa (N. Mosier y col., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686). Después de esta etapa de sacarificación se realiza un proceso de fermentación. Las enzimas individuales han demostrado digerir solo parcialmente la celulosa y la hemicelulosa y, por tanto, se necesita la acción concertada de todas o al menos varias de las enzimas denominadas "celulasas o enzimas celulolíticas" para completar la conversión de los diferentes polímeros complejos, específicamente, celulosa y hemicelulosa, a azúcares monoméricos. Las celulasas (1 ,4-beta-D-glucano-4- glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) comprenden al menos tres actividades enzimáticas, endo^-glucanasas (EC 3.2.1.4), exo^-glucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) y β-glucosidasas (EC 3.2.1.21), de las que se ha demostrado su actuación sinérgica en la hidrólisis de la celulosa (Woodward, J. 1991 , Bioresource Technology Vol 36, pág. 67-75). Además de estas tres actividades hoy en día se reconocen otras de igual relevancia tales como, xilanasas (E.C. 3.2.1.8), beta-xilosidasas (E.C. 3.2.1.37) y polisacárido mono-oxigenasas (también denominadas, PMO, AA9, glicosil-hidrolasa de la familia 61 o GH61).
La eficacia hidrolítica de un complejo multienzimático, formado por una amplia diversidad de enzimas celulolíticas, en el proceso de sacarificación celulósica depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la relación de cada enzima en el complejo.
Por consiguiente, las celulasas se han convertido en biocatalizadores debido a su naturaleza compleja y a sus extensas aplicaciones industriales. Hoy en día se presta una considerable atención a la producción de celulasas y a los avances en la investigación, especialmente en la dirección de la mejora de la economía del proceso de varias industrias, con el fin de obtener composiciones enzimáticas que presenten una mayor actividad y mejores propiedades celulolíticas. Así, la mayoría de los esfuerzos en el presente campo técnico han ido dirigidos a la generación de microorganismos que expresan cócteles enzimáticos mejorados gracias a la sobreexpresion de uno o más genes que codifican para enzimas celulolíticas específicas, pudiendo ser dichos genes tanto homólogos como heterólogos. Esta sobreexpresion se puede producir por cualquier método conocido en la técnica, siendo uno de ellos la expresión bajo el control de fuertes señales de expresión, lo que da lugar a una mayor producción de esa o esas enzimas dentro del cóctel enzimático (US20080194005A1). Se han dado a conocer en el estado de la técnica numerosas células hospedadoras utilizadas para la expresión de genes heterólogos, tales como la bacteria Escherichia coli, y sus procedimientos de transformación. En este contexto, se han desarrollado también numerosos sistemas fúngicos de expresión, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, entre otros. Sin embargo, por diversos motivos, muchos de estos microorganismos recombinantes no han encontrado amplia aceptación o uso. Entre los microorganismos recombinantes que se utilizan en la actualidad para la producción de proteínas o enzimas, destacan los de los géneros Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.
En términos generales, una célula hospedadora productora de un cóctel celulolítico ideal debe cumplir un gran número de criterios, tales como, utilizar el medio eficientemente, producir el polipéptido(s) o la proteína(s) de interés con un elevado rendimiento, en su caso ser capaz de secretar la(s) proteína(s) o el polipéptido(s) o las composiciones enzimáticas, de forma eficiente, poder utilizar una amplia gama de elementos reguladores de la expresión asegurando de esta manera una fácil aplicación y versatilidad, permitir el uso de marcadores fácilmente detectables que sean baratos de usar, y producir transformantes estables.
En definitiva, es deseable generar microorganismos que expresen un cóctel enzimático óptimo que mejore el rendimiento y eficiencia del proceso de degradación de la biomasa. Sería deseable además, de cara a mejorar la economía del proceso, que el cóctel enzimático óptimo o mejorado permitiera el uso de una menor cantidad de enzimas dentro del cóctel, para la obtención de los mismos, o mejorados, rendimientos de producción de azúcares fermentables en dichos procesos de degradación de la biomasa.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe una célula hospedadora modificada capaz de secretar una composición enzimática optimizada que presenta una mayor capacidad celulolítica respecto a la composición obtenida por la célula parental o silvestre no modificada.
La modificación llevada a cabo en la célula hospedadora de la invención va dirigida a disminuir la expresión y/o secreción de al menos una, o más de una, de las enzimas celulolíticas que expresa homólogamente dicha célula hospedadora y que forma(n) parte de la composición enzimática que expresa y secreta dicha célula, con la condición de que la(s) enzima(s) celulolítica(s) de las que se disminuye su expresión y/o secreción son aquéllas enzimas celulolíticas que presentan una menor actividad celulolítica en relación a la actividad celulolítica que presentan otras enzimas celulolíticas de su misma familia incluidas en el cóctel. Las condiciones industriales en las que se emplean los cócteles enzimáticos son más bien controladas y predefinidas, respecto a las condiciones ambientales en las que se encuentran los organismos que los producen. Por dicho motivo, para llevar a cabo la hidrólisis de biomasa a escala industrial no es necesaria la presencia de una amplia diversidad enzimática, que se traduzca en actividades enzimáticas redundantes, que no mejoran los rendimientos del proceso, ya que en las condiciones de reacción industrial sólo unas pocas de las enzimas celulolíticas van a ser capaces de contribuir a la eficiencia de la reacción. La expresión del resto de enzimas redundantes y con limitada actividad celulolítica en esas condiciones industriales es por tanto indeseable. Por este motivo, en la presente invención, con menor número de enzimas ineficientes (en adelante, enzimas o celulasas "no contributivas") y mayor proporción de las eficientes (en adelante, enzimas o celulasas "contributivas"), se consigue mejorar el rendimiento y la eficiencia del proceso de degradación de la biomasa en comparación de otros cócteles con mayor diversidad pero menor eficiencia. Esta mayor eficiencia se refiere al uso de una menor diversidad de enzimas en el cóctel enzimático, para la obtención de mejores rendimientos (mayor producción de azúcares fermentables, tales como glucosa) en dichos procesos de degradación de la biomasa.
Por tanto, desde un punto de vista económico de los procesos industriales de degradación de biomasa en los que se utiliza la composición enzimática descrita en la presente invención, dicha composición permite obtener mejores rendimientos con una menor diversidad de enzimas en el cóctel enzimático, de manera que se incrementa la eficiencia del proceso de degradación de la biomasa, ya que hay una mayor representación de las enzimas contributivas (Figura 1).
El objetivo de la presente invención es reducir dicha diversidad enzimática mediante la reducción de la expresión y/o secreción de una o varias enzima(s) celulolítica(s) que presenta(n) una menor eficiencia celulolítica respecto a la que muestran otras enzimas celulolíticas de su misma familia dentro del cóctel, para así obtener una composición enzimática que presente una mayor concentración de aquellas enzimas celulolíticas que tienen una mayor eficiencia y muestren un incremento en la eficiencia del proceso de degradación de biomasa.
Otra de las ventajas obtenidas con las células hospedadoras de la invención y con las composiciones enzimáticas obtenidas a partir de dichas células hospedadoras de la invención, es que, puesto que dichas composiciones comprenden la(s) enzima(s) celulolítica(s) que presenta(n) una mayor eficiencia celulolítica, es necesario una menor diversidad de enzima(s) en la composición enzimática de la invención, para la obtención de mejores rendimientos de producción de azúcares fermentables en comparación con los que se obtienen utilizando otras composiciones conocidas que presentan una amplia diversidad enzimática y descritas en el estado de la técnica para el mismo fin.
Por lo tanto, la presente invención representa una solución a la necesidad de proporcionar un microorganismo que exprese una mezcla o cóctel de enzimas celulolíticas optimizado, capaz de mejorar la eficiencia del proceso celulolítico de la biomasa o sacarificación, mediante la disminución de la expresión y/o secreción de enzimas celulolíticas no contributivas que tienen una menor eficiencia respecto a otras enzimas celulolíticas contributivas y, como consecuencia, se necesita una menor diversidad enzimática o en el cóctel enzimático que comprende enzimas contributivas, para obtener mejores rendimientos mejores rendimientos (mayores cantidades de azúcares fermentables liberados). Así, la composición enzimática expresada y/o secretada por las células hospedadoras modificadas de la invención presenta una mayor eficiencia celulolítica y una mayor concentración de enzimas celulolíticas contributivas que se seleccionan de aquellas que presentan una mayor eficiencia celulolítica dentro del grupo de enzimas que forman parte de la diversidad enzimática del cóctel. Esta mayor concentración de enzimas celulolíticas contributivas en la composición enzimática de la invención es consecuencia de la menor expresión y/o secreción de las enzimas celulolíticas no contributivas, ya que las enzimas celulolíticas contributivas ocupan el espacio dejado, en términos de cantidad presente en la composición enzimática, por las enzimas no contributivas eliminadas (Figura 1).
Así, la presente invención describe una célula hospedadora modificada que produce un cóctel enzimático menos diverso, al presentar una expresión y/o secreción reducida de al menos una enzima celulolítica no contributiva respecto a la expresión de la misma enzima celulolítica no contributiva en una célula hospedadora parental o silvestre (wild-type) o no modificada. Adicionalmente, la célula hospedadora modificada de la invención presenta una eficiencia celulolítica mayor, de transformación del material celulósico en azúcares fermentables, que una célula hospedadora parental o silvestre, no modificada genéticamente. Dicha célula hospedadora modificada, según se define en la presente invención, puede presentar adicionalmente un incremento en la expresión de al menos una enzima celulolítica contributiva respecto a la expresión de dicha(s) enzima(s) celulolítica(s) contributiva(s) en una célula hospedadora silvestre, no modificada genéticamente. La(s) enzima(s) celulolítica(s) contributiva(s) cuya expresión puede estar incrementada en la célula hospedadora de la invención, puede(n) seleccionarse, preferentemente entre enzima(s) celulolítica(s) contributva(s) homóloga(s) y/o enzima(s) celulolítica(s) contributiva(s) heteróloga(s).
Los inventores han demostrado que una menor expresión y/o secreción de enzimas celulolíticas no contributivas en células hospedadoras, da lugar a la expresión y/o secreción de una composición enzimática que presenta un incremento en la concentración (o una mayor representación) de enzimas celulolíticas contributivas que tienen una mayor eficiencia que las enzimas celulolíticas no contributivas, lo que se traduce en el uso de una menor diversidad de enzimas celulolíticas en los procesos industriales de degradación de biomasa y, por lo tanto, también en un incremento en la eficiencia del proceso de sacarificación y, finalmente, en el rendimiento global de los procesos de producción de bioproductos, preferiblemente biocombustible, ya que, como se ha mencionado previamente, se necesita una menor diversidad enzimática para obtener una mayor producción de azúcares fermentables al final del proceso de hidrólisis o sacarificación.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención está relacionado con una célula hospedadora modificada que presenta una expresión y/o secreción reducida de al menos un 10% en al menos una de las enzimas celulolíticas no contributivas respecto al porcentaje de expresión y/o secreción de dicha enzima celulolítica no contributiva en una célula hospedadora parental o silvestre (wild-type). A partir de este momento y a lo largo del presente documento, a este primer aspecto de la invención se le denominará "célula hospedadora de la invención".
En algunas realizaciones preferidas, la célula hospedadora de la invención ha sido genéticamente modificada para reducir la expresión y/o secreción de al menos una enzima celulolítica no contributiva en aproximadamente al menos un 1 %, aproximadamente al menos un 2%, aproximadamente al menos un 3%, a! menos un 4%, aproximadamente al menos un 5%, aproximadamente al menos un 10%, aproximadamente al menos un 15%, aproximadamente al menos un 20%, aproximadamente al menos un 25%, aproximadamente al menos un 30%, aproximadamente al menos un 35%, aproximadamente al menos un 40%, aproximadamente al menos un 45%, aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 55%, aproximadamente al menos un 60%, aproximadamente al menos un 65%, aproximadamente al menos un 70%, aproximadamente al menos un 75%, aproximadamente al menos un 80%, aproximadamente al menos un 85%, aproximadamente al menos un 90%, aproximadamente al menos un 95%, aproximadamente al menos un 100% respecto a la expresión de dichas enzimas celulolíticas no contributivas en una célula hospedadora parental o silvestre. En una realización más preferida, la célula hospedadora de la invención presenta una reducción de un 100% de la expresión y/o secreción de al menos una enzima celulolítica no contributiva respecto a una célula hospedadora parental o silvestre.
A efectos de la presente invención, los términos "célula hospedadora parental o silvestre" o "célula hospedadora wild-type", se pueden utilizar indistintamente y se refieren a aquélla célula hospedadora que no ha sido modificada para presentar una expresión y/o secreción reducida de una o más de una enzima celulolítica no contributiva según se describe en la presente invención. Preferiblemente, la célula parental o silvestre de la presente invención es Myceliophthora thermophila, más preferentemente M. thermophila C1.
En realizaciones particulares, las células hospedadoras se modifican para delecionar, inhibir total o parcialmente, o silenciar total o parcialmente, secuencias codificantes de enzimas celulolíticas no contributivas o, de otro modo, eliminar, total o parcialmente, la expresión de una o más enzimas celulolíticas no contributivas.
Adicionalmente, las células hospedadoras de la invención, además de presentar una expresión y/o secreción reducida de al menos una enzima celulolítica no contributiva, pueden sufrir otras modificaciones genéticas con la finalidad de presentar características que mejoran la secreción de proteínas, estabilidad de proteínas u otras propiedades deseables para la expresión y/o secreción de una o más enzimas celulolíticas contributivas. En una realización preferente, la expresión y/o secreción de una o más celulasas no contributivas se disminuye, reduce o inhibe total o parcialmente, lo que conduce a una mayor representación de las celulasas de interés, que en la presente invención se refieren, preferentemente, a las enzimas celulolíticas contributivas, en el cóctel enzimático obtenido a partir de dicha célula.
La modificación genética de la célula de la invención puede lograrse por técnicas de ingeniería genética o usando técnicas microbiológicas clásicas tales como mutagénesis química o UV y posterior selección. Puede usarse una combinación de modificación recombinante y técnicas de selección clásicas para producir el organismo de interés. Usando tecnología recombinante, las moléculas de ácidos nucleicos pueden introducirse, delecionarse, disrumpirse, silenciarse, inhibirse o modificarse, de un modo que se produce una expresión reducida o nula de la /s enzima/s celulolíticas no contributivas, lo que lleva asociado un elevado rendimiento de la secreción de las enzimas celulolíticas contributivas dentro del organismo o en el cultivo. En un enfoque de ingeniería genética, la recombinación homologa puede usarse para inducir modificaciones de genes elegidos como diana eligiendo específicamente como diana un gen in vivo para suprimir la expresión de la proteína codificada. En un enfoque alternativo también puede usarse ARNi antisentido para disminuir o inhibir la expresión génica. Así en una realización preferida, las células hospedadoras de la invención se modifican para eliminar al menos un gen que codifica una celulasa no contributiva o de manera alternativa, disminuir o eliminar la expresión de una o más celulasas no contributivas. En algunas realizaciones, la expresión de una o más celulasas no contributivas se disminuye, inhibe, silencia o deleciona para aumentar la producción o la presencia en el cóctel enzimático secretado por la célula hospedadora modificada, de otras celulasas de interés, tales como las celulasas contributivas.
En otra realización preferida, la secreción de una o más celulasas no contributivas puede verse inhibida, disminuida o anulada. Alteraciones en la secreción de las enzimas celulolíticas en la célula hospedadora de la invención, pueden afectar tanto a la secreción de la(s) celulasa(s) no contributiva(s) como al sistema de secreción enzimática general que de forma específica inhibe, disminuye o anula la secreción de la(s) celulasa(s) no contributiva(s). Usando tecnología recombinante, las moléculas de ácido nucleico que codifican para el péptido señal o secuencias que permiten la secreción de la o las enzimas celulolíticas no contributivas pueden introducirse, delecionarse, disrumpirse, silenciarse, modificarse, inhibirse, de modo que se produce una secreción disminuida o nula de la o las enzimas celulolíticas no contributivas. En un enfoque de ingeniería genética, la recombinación homologa puede usarse para inducir modificaciones en el sistema de secreción de la o las enzimas celulolíticas no contributivas. Así, en una realización preferida, las células hospedadoras de la invención se modifican para disminuir o anular la secreción de al menos una celulasa no contributiva.
A efectos de la presente invención, el término "expresión" o "expresión génica" se refiere a la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica en ARNm con la posterior traducción de este último en una proteína. Adicionalmente incluye la secreción de la proteína hasta el exterior de la célula.
A efectos de la presente invención, el término "secreción" se refiere al transporte de una proteína desde el interior de la célula al exterior. A efectos de la presente invención, el término secreción hace referencia, preferentemente a la secreción de enzimas con actividad celulolítica, que por efecto de este transporte aparecen en el cóctel enzimático producido por dicha célula. A efectos de la presente invención, los términos "aumento de la expresión" o "sobreexpresión" pueden utilizarse indistintamente a lo largo del presente documento y se refieren a cualquier forma de expresión que es adicional o mayor al nivel original de expresión en una célula parental o silvestre. Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados pueden servir también como promotores o potenciadores pudiendo introducirse en una posición apropiada de una forma no heteróloga de un polinucleótido con el fin de regular por incremento la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo por mutación, deleción, y/o sustitución, o promotores aislados pueden introducirse en una secuencia polinucleotídica que codifique para un gen de interés para controlar la expresión del mismo. A efectos de la presente invención, se pretende que estos términos, abarquen el incremento en la expresión de enzimas tanto homologas, como heterologas. En algunas realizaciones, en incremento en la expresión incluye una tasa de transcripción elevada y/o un nivel del gen también elevado en comparación con la tasa de transcripción homologa de dicho gen. En algunas otras realizaciones, un gen heterólogo se introduce en una célula hospedadora para inducir un incremento en la expresión de un gen que codifica una enzima homologa. En algunas realizaciones, el gen heterólogo es un gen que ha sido modificado para incrementar la expresión del producto del gen. En algunas realizaciones, el término también abarca la secreción del polipéptido a partir de una célula. A efectos de la presente invención, los términos "endógeno" u "homólogo" se refieren tanto a genes como a proteínas, que se encuentran de forma natural en una célula hospedadora, es decir, sin que exista ninguna intervención humana. Adicionalmente, dichos términos también hacen referencia a esos mismos genes o proteínas que una vez aislados del organismo pueden volver a reintroducirse (transgen) mediante ingeniería genética.
A efectos de la presente invención, el término "disminución", "reducción", "supresión", "inhibición", "deleción", "silenciamiento", "eliminación", se refieren a un descenso en el nivel de expresión de un gen y/o secreción de la proteína respecto al nivel original de expresión del mismo gen y/o secreción de la proteína en el genotipo parental o silvestre. A efectos de la presente invención, la disminución, eliminación, reducción, supresión, inhibición, deleción, silenciamiento o inhibición, de la expresión y/o secreción en orden creciente de preferencia es de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, reducida en comparación con la expresión en las células hospedadoras parentales o silvestres.
Una persona experta en la técnica conoce las diferentes herramientas y técnicas de rutina para la eliminación, reducción, supresión, deleción, silenciamiento o inhibición de la expresión de un gen o proteína. A efectos de la presente invención, sirvan como ejemplo, la clonación de un gen o genes diana en forma de repetición invertida (en parte o totalmente), pérdida, sustitución o bloqueo de material genético que resulta en una interrupción completa o parcial de la secuencia del ADN que compone el gen, alteraciones del promotor o cualquier otra reducción del nivel de transcripción, alteración de la expresión de proteínas reguladoras, silenciamiento génico (dsARN, siARN, etc.), modificación de la secuencia de iniciación de la traducción, alteración del marco de lectura, en su caso cambios en la secreción (alteraciones del péptido señal, etc.), mutagénesis, etc. En algunas realizaciones, el silenciamiento génico es preferido. En otras realizaciones, la supresión o eliminación parcial del gen es preferida. En otras realizaciones, la supresión completa o casi completa de la secuencia del gen es preferida.
Un experto en la materia conoce las diferentes herramientas y técnicas de rutina para la eliminación, reducción, supresión o inhibición de la secreción de una proteína. A efectos de la presente invención, sirvan como ejemplo la modificación genética dirigida o al azar de las secuencias señal (péptido señal) que permiten la secreción de una proteína o la modificación genética dirigida o al azar del sistema de secreción de la célula hospedadora en sí mismo. Las modificaciones genéticas pueden consistir en perdida de regiones, modificaciones, sustituciones, integraciones, alteraciones, silenciamiento, alteración del marco de lectura, etc.
Tal como se utiliza aquí, el término "recombinante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que no se produce naturalmente en una célula huésped. En algunas realizaciones, las "células recombinantes" expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa o silvestre (es decir, no recombinante) de la célula y/o expresan genes nativos que de otro modo su expresión se encontraría aumentada, disminuida o anulada debido a la intervención humana deliberada. Las células recombinantes contienen al menos un polinucleótido o polipéptido recombinante. Una construcción de ácido nucleico que comprende el propio ácido nucleico y los elementos necesarios para su expresión, el ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido), célula o polipéptido se denominan aquí como "recombinante" cuando es de origen no natural, artificial o procesado.
El término "biomasa" se refiere en la presente invención a la fracción biodegradable de los productos, residuos y restos de origen biológico procedentes de la agricultura (incluyendo sustancias vegetales, tales como residuos de cultivos, y sustancias animales), industrias forestales (tales como recursos madereros) e industrias relacionadas que incluyen pesquerías y acuicultura, así como la fracción biodegradable de los residuos industriales y urbanos, tales como residuos sólidos urbanos o residuos de papel, y cultivos energéticos. En una realización preferida, la biomasa es paja o la fracción orgánica de residuos sólidos urbanos. En una realización más preferida, la biomasa es biomasa vegetal, más preferiblemente seleccionada a partir de la lista que consiste en: biomasa rica en azúcares fermentables, tales como caña de azúcar, biomasa de almidón, por ejemplo, granos de cereal, paja de maíz, paja de trigo, paja de cebada, paja de sorgo, paja de caña de azúcar, maleza, troncos, rama y hojas.
El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa, y el tercero es la pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula haya detenido su crecimiento, contiene también polisacáridos y está reforzada mediante lignina polimérica covalentemente entrecruzada con hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y de esta manera es un β-(1 ,4)-Ο^Ιυο8ηο lineal, mientras que la hemicelulosa incluye una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos en estructuras ramificadas complejas con una gama de sustituyentes. Aunque generalmente polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz insoluble cristalina de cadenas paralelas de glucano. Las hemicelulosas se unen normalmente mediante enlaces de hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosas, lo que ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular.
A efectos de la presente invención el término "celulosa" se refiere a un polisacárido lineal que comprende de cientos a miles de unidades de D-glucosa unidas por enlaces β-(1 ,4). Este polisacárido se conoce también como β-(1 ,4) glucano. El término "enzima celulolítica o celulasa" se refiere a una categoría de enzimas que pueden degradar polímeros complejos, tales como, celulosa y/o hemicelulosa (β-1 ,4- glucano o enlaces β-D-glucosídicos) a oligosacáridos más cortos, tales como, celobiosa y/o glucosa y xilobiosa y/o xilosa, respectivamente. Dentro de dicha categoría de enzimas se encuentran preferentemente los siguientes grupos: 1 ,4-β-ϋ- glucano glucanohidrolasa ("endoglucanasa" o "EG"); 1 ,4^-D-glucano celobiohidrolasa ("exoglucanasa", "celobiohidrolasa", o "CBH"); β-D-glucósidoglucohidrolasa ("β- glucosidasa", "celobiasa" o "BGL"), endoxilanasas o xilanasas ("Xyl"), beta-xilosidasas ("beta-Xyl") y polisacárido mono-oxigenasas ("PMO"). Las endoglucanasas rompen enlaces internos y alteran la estructura cristalina de la celulosa, exponiendo cadenas de polisacárido de celulosa individuales ("glucanos"). Las celobiohidrolasas acortan gradualmente las moléculas de glucano, liberando principalmente unidades de celobiosa (un dímero de glucosa ligado en β-1 ,4 soluble en agua), además de glucosa, celotriosa y celotetraosa. Las β-glucosidasas fraccionan celobiosa en monómeros de glucosa. Las xilanasas catalizan la hidrólisis aleatoria de xilano polimérico, pectina polimérica o hemicelulosa que contiene residuos xilosa que da como resultado la formación de oligómeros de azúcar que contienen xilosa y/o residuos xilosa monoméricos. Las beta-xilosidasas son enzimas con actividad 4^-D-xilano xilohidrolasa catalizando la reacción desde los oligómeros de xilosa, incluso xilobiosa, liberando finalmente D-xilosa. Las PMO son metaloproteínas con actividad endocelulolítica que actúan con un mecanismo diferente al que realizan las endoglucanasas, ya que rompen las cadenas de celulosa por oxidación de sus monómeros de glucosa en los carbonos 1 , 4 y/o 6.
El término "eficiencia" de una enzima, grupo de enzimas o composición enzimática, se refiere a la actividad catalítica de la enzima, grupo de enzimas o composición enzimática, en condiciones apropiadas en las que la enzima convierte sustratos poliméricos o artificiales específicos en productos oligoméricos o monoméricos específicos. Preferiblemente, una "mayor eficiencia" o "mejor eficiencia" de las enzimas de la invención o del cóctel enzimático de la invención, se refiere a la obtención de una igual, o preferiblemente mayor cantidad de azúcares fermentables obtenidos al final del proceso hidrolítico (es decir, un igual o mayor rendimiento), con una menor diversidad de enzimas celulolíticas presentes en el cóctel, con respecto a un cóctel enzimático obtenido de una célula hospedadora silvestre o parental. El término "enzimas celulolíticas contributivas" se refiere a aquellas celulasas dentro de la diversidad de celulasas presentes en los cócteles enzimáticos, tales como preferentemente, endoglucanasas, celobiohidrolasas, β-glucosidasas, β-xilosidasas, xilanasas, polisacárido mono-oxigenasas, entre otros, que presentan una actividad celulolítica tal que al ser eliminada de un cóctel enzimático se reduce el rendimiento en términos de liberación de azúcares fermentable por unidad de masa. En una realización preferida, una enzima celulolítica contributiva de cualquiera de las familias o actividades celulolíticas descritas en la presente invención, puede seleccionarse de entre una celulasa homologa o heteróloga. El término "enzima celulolítica no contributiva" se refiere a aquellas celulasas dentro de la diversidad de las celulasas presentes en los cocteles enzimáticos, tales como preferentemente, endoglucanasas, celobiohidrolasas, β-glucosidasas, β-xilosidasas, xilanasas, polisacárido mono-oxigenasas, entre otros, que presentan una actividad celulolítica tal que al ser eliminada o reducida de un cóctel enzimático se mejora la eficiencia del mismo. En una realización preferida, una enzima celulolítica no contributiva de cualquiera de las familias o actividades celulolíticas descritas en la presente invención, puede seleccionarse preferentemente de entre una celulasa homologa, o heteróloga. En una realización preferida, la celulasa no contributiva de la invención es una celulasa homologa.
El término "celobiohidrolasa", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína de la clase E.C. 3.2.1.91 , que cataliza la hidrólisis de la celulosa polimérica a celobiosa mediante una actividad exoglucanasa, liberando secuencialmente moléculas de celobiosa desde los extremos reductores o no reductores de la celulosa.
El término "endoglucanasa", "EG" o "Eg", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificado como E.C. 3.2.1.4. Estas enzimas hidrolizan los enlaces β-1 ,4 glucosídicos internos de la celulosa.
El término "beta-glucosidasa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como EC 3.2.1.21. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de oligómeros de azúcar, incluyendo, pero sin limitarse al dímero de glucosa o celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente, utilizada, pero sin limitarse, para la síntesis de etanol. La enzima beta-glucosidasa actúa sobre los enlaces β-(1 ,4) que unen a dos moléculas de glucosa o glucosa sustituida (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad por una variedad de sustratos de beta-D-glucósido. Cataliza la hidrólisis de residuos no reductores terminales en beta-D-glucósidos con liberación de glucosa.
Los términos "endoxilanasa" o "xilanasa" tal y como se utilizan en el presente documento, se refieren a un grupo de enzimas (EC 3.2.1.8) que catalizan la endohidrólisis de enlaces 1 ,4^-D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también puede denominarse endo-1 ,4^-xilanasa o 1 ,4^-D-xilano xilanohidrolasa. El término "beta-xilosidasa" tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo de enzimas (EC 3.2.1.37) que cataliza la hidrólisis de 1 ,4^-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores. Esta enzima también puede denominarse xilano 1 ,4^-xilosidasa, 1 ,4^-D-xilano xilohidrolasa, exo- 1 ,4^-xilosidasa o xilobiasa.
Los términos "polisacárido monooxigenasa", "PMO", "Glicosil-hidrolasa de la familia 61" o "GH61" o "AA9" se refieren a un grupo de enzimas, originalmente clasificadas dentro de la familia de proteínas GH61 , ya que presentan actividad GH61 o PMO, y que al ser incluidas en una reacción de sacarificación resulta en una mayor cantidad (mayor rendimiento) de uno o más azúcares solubles (por ejemplo, glucosa) en comparación con la reacción de sacarificación llevada a cabo bajo las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína GH61. Los miembros de esta familia de enzimas actúan como monooxigenasas de cobre que catalizan la rotura de las cadenas de celulosa mediante un mecanismo oxidativo a nivel de varios carbonos (C1 , C4 y/o C6), liberando celodextrinas (Langston et al. Applied and Environmental Microbiology, 201 1 , 77:7007-7015).
El término "identidad" y "% identidad" se refieren a la proporción de residuos de ácidos nucleicos o aminoácidos que son idénticos entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que se están comparando. Se puede determinar el grado de identidad mediante el método de Clustal, el método de Wilbur-Lipman, el programa GAG, que incluye GAP, BLAST o BLASTN, EMBOSS Needle y FASTA. Además, se puede utilizar el algoritmo de Smith Waterman con el fin de determinar el grado de identidad entre dos secuencias. En realizaciones preferidas de la presente invención, las secuencias nucleotídicas y peptídidicas aquí descritas comprenden al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, a! menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 88% de identidad, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, ai menos aproximadamente 97%, a¡ menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o un 100% de identidad sobre una secuencia de referencia, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada según se mide usando los aigoritmos arriba descritos.
En otra realización preferida, las células hospedadoras de la invención según se describen aquí, pueden presentar, adicionalmente, un incremento de al menos un 1 % de la expresión y/o secreción de al menos una enzima celulolítica contributiva respecto al porcentaje de la expresión y/o secreción de la(s) misma(s) enzima(s) celulolítica(s) contributiva(s) en una célula hospedadora parental o silvestre. En una realización preferida, las células hospedadoras de la invención, para presentar un incremento en la expresión de al menos una de las enzimas celulolíticas contributivas, pueden sufrir modificaciones genéticas con el objetivo de mejorar la expresión y secreción de al menos una de dichas enzimas, la estabilidad de las mismas u otras propiedades deseables para la inducción del incremento en la expresión y/o secreción de la(s) enzima(s) celulolítica(s) contributiva(s). En realizaciones más particulares, las células hospedadoras, adicionalmente se modifican genéticamente para incrementar la expresión o insertar más de una copia de las secuencias codificantes de enzimas celulolíticas contributivas que pueden ser tanto homologas como heterólogas. En una realización preferida, la sobre-expresión de una o más celulasas contributivas se lleva a cabo para aumentar la producción o proporción de las celulasas contributivas. En otras realizaciones más particulares aún, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que además de presentar un incremento en la expresión de al menos una de las enzimas celulolíticas contributivas, dichas enzimas, presentan además una mayor actividad celulolítica. La modificación genética para la obtención de dichas características en las cepas de la invención, puede lograrse por técnicas de ingeniería genética o usando técnicas microbiológicas clásicas tales como mutagénesis química o UV y posterior selección. Puede usarse una combinación de modificación recombinante y técnicas de selección clásicas para producir el organismo de interés. Usando tecnología recombinante, las moléculas de ácidos nucleicos pueden introducirse, sobre-expresarse o modificarse, de un modo que se produce elevado rendimiento de la secreción de las enzimas celulolíticas contributivas dentro del organismo o en el cultivo. En un enfoque de ingeniería genética, la recombinación homologa puede usarse para inducir modificaciones de genes elegidos como diana, eligiendo específicamente como diana un gen in vivo para incrementar la expresión de la proteína codificada. En algunas realizaciones preferidas, la célula hospedadora descrita en la presente invención ha sido genéticamente modificada para sobre-expresar al menos una de las enzimas celulolíticas contributivas 5 en aproximadamente al menos un 1 %, aproximadamente al menos un 5%, aproximadamente al menos un 10%, aproximadamente ai menos un 20%, aproximadamente al menos un 25%, aproximadamente al menos un 30%, aproximadamente al menos un 35%, aproximadamente ai menos un 40%, aproximadamente al menos un 45%, aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 55%, aproximadamente ai menos un 60%, aproximadamente al menos un 65%, aproximadamente ai menos un 70%, aproximadamente al menos un 75%, aproximadamente al menos un 80%, aproximadamente al menos un 85%, aproximadamente al menos un 90%, aproximadamente al menos un 95%, aproximadamente ai menos un 98%, aproximadamente al menos un 97%, aproximadamente al menos un 98%, aproximadamente al menos un 99%, aproximadamente al menos un 100% respecto a la expresión de dichas enzimas celulolíticas contributivas en una célula hospedadora silvestre.
En otra realización preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que presentan sobre-expresión de al menos una de las enzimas celulolíticas contributivas seleccionadas mediante el método descrito en la presente invención.
En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que las celulasas contributivas pueden derivar de la célula hospedadora de la invención (homologas) o de otros microorganismos productores de enzimas celulolíticas diferentes de la célula hospedadora de la invención (heterólogas). Igualmente, se pueden producir de forma natural o recombinante.
En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que la enzima celulolítica contributiva que puede incrementar su expresión es preferentemente una celobiohidrolasa. En una realización más preferida, dicha celobiohidrolasa es preferentemente cualquier celobiohidrolasa que presente la mayor eficiencia dentro su familia.
En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que la enzima celulolítica contributiva que puede incrementar su expresión es preferentemente una endoglucanasa. En una realización más preferida aún, la endoglucanasa es preferentemente cualquier endoglucanasa que presente la mayor eficiencia dentro de su propia familia. En otra realización más preferida, la endoglucanasa preferida es la endoglucanasa 2. En otra realización más preferida, la endoglucanasa 2 comprende preferentemente una secuencia que tiene al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 6, y opcionalmente codificada por una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 5. De forma más preferida aún, la endoglucanasa 2 es la endoglucanasa 2 que comprende la SEQ ID NO: 6, opcionalmente codificada por la secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 5.
En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que la enzima celulolítica contributiva que puede incrementar su expresión es preferentemente una beta-glucosidasa. En una realización más preferida aún, la beta-glucosidasa es preferentemente cualquier beta-glucosidasa que presente la mayor eficiencia dentro de su propia familia.
En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que la enzima celulolítica contributiva que puede incrementar su expresión es preferentemente una endoxilanasa. En una realización más preferida aún, la endoxilanasa es preferentemente cualquier endoxilanasa que presente la mayor eficiencia dentro de su propia familia.
En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que la enzima celulolítica contributiva que puede incrementar su expresión es preferentemente una beta-xilosidasa. En una realización más preferida aún, la beta-xilosidasa es preferentemente cualquier beta-xilosidasa que presente la mayor eficiencia dentro de su propia familia. En otra realización más preferida, las células hospedadoras de la invención se caracterizan por que la enzima celulolítica contributiva que puede incrementar su expresión es preferentemente una polisacárido mono-oxigenasa. En una realización más preferida aún, la polisacárido mono-oxigenasa es preferentemente cualquier polisacárido mono-oxigenasa que presente la mayor eficiencia dentro de su propia familia. En una realización más preferida aún, la célula hospedadora de la invención se caracteriza por que presenta una expresión reducida de una endoglucanasa no contributiva homologa que tiene al menos un 60% de identidad con la endoglucanasa 6 que comprende la SEQ ID NO: 2, opcionalmente codificada por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 60% de identidad con la endoglucanasa 6 que comprende la SEQ ID NO: 1. De forma más preferida aún, la endoglucanasa 6 es la endoglucanasa 6 que comprende la SEQ ID NO: 2, opcionalmente codificada por la secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la expresión reducida se refiere a la deleción del gen que codifica para la endoglucanasa 6.
En una realización más preferida aún, la célula hospedadora de la invención se caracteriza por que presenta una expresión reducida de una polisacárido mono- oxigenasa no contributiva homologa que tiene al menos un 60% de identidad con la polisacárido mono-oxigenasa 09768 que comprende la SEQ ID NO: 4, opcionalmente codificada por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 60% de identidad con la polisacárido mono-oxigenasa 09768 que comprende la SEQ ID NO: 3. De forma más preferida aún, la polisacárido mono-oxigenasa 09768 es la polisacárido mono- oxigenasa 09768 que comprende la SEQ ID NO: 4, opcionalmente codificada por la secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, la expresión reducida se refiere a la deleción del gen que codifica para la polisacárido mono- oxigenasa 09768.
En otra realización preferida, la célula hospedadora de la invención se caracteriza por que presenta una expresión reducida de una endoglucanasa no contributiva homologa que tiene al menos un 60% de identidad con la endoglucanasa 6 que comprende la SEQ ID NO: 2, opcionalmente codificada por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 60% de identidad con la endoglucanasa 6 que comprende la SEQ ID NO: 1 y una expresión reducida de una polisacárido mono-oxigenasa no contributiva homologa que tiene al menos un 60% de identidad con la polisacárido mono- oxigenasa 09768 que comprende la SEQ ID NO: 4, opcionalmente codificada por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 60% de identidad con la polisacárido mono-oxigenasa 09768 que comprende la SEQ ID NO: 3.
En otra realización más preferida aún, la célula hospedadora de la invención se caracteriza por que presenta una expresión reducida de la endoglucanasa 6 de SEQ ID NO: 2 y de la polisacárido mono-oxigenasa 09768 de SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, la expresión reducida de la endoglucanasa 2 y de la polisacárido mono-oxigenasa 09768 se refiere a la deleción de los genes que codifican para dichas enzimas. Tal y como se describe en el presente documento, la "célula hospedadora", incluye cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares con una o varias construcciones de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para las celulasas descritas aquí, tanto celulasas contributivas como celulasas no contributivas. La célula huésped puede ser una célula eucariota o una célula procariota.
En una realización particular la célula huésped es una célula procariota que se selecciona preferiblemente del grupo de bacterias de los géneros Bacillus, Clostridium, Esherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Streptomyces, Thermoanaerobacterium o Zymomonas.
En otra realización particular, la célula huésped es una célula eucariota que se selecciona preferentemente del grupo de hongos de los géneros Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporíopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectría, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusaríum, Gibberella, Holomastigotoides, Humícola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotríchonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria. En una realización aún más preferida, la célula hospedadora de la invención es cualquier cepa de la especie Myceliophthora thermophila. En una realización aún más preferida, la célula hospedadora de la invención es la cepa C1 de Myceliophthora thermophila. Se entenderá que para los géneros y especies anteriormente mencionadas, la invención abarca los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, los anamorfos, con respecto al nombre de la especie por el cual son conocidos. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes adecuados. Por ejemplo, Myceliophthora thermophila es equivalente a Chrysosporium lucknowense.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un cóctel enzimático obtenido por las células hospedadoras de la invención. Dicho cóctel enzimático comprende, al menos, las enzimas celulolíticas contributivas según se han definido anteriormente y que son secretadas por las células hospedadoras de la invención, por lo que carecerá de al menos una de las enzimas celulolíticas no contributivas según se han definido anteriormente. A partir de aquí y a lo largo del presente documento, a este cóctel se le denominará "cóctel de la invención". Preferiblemente, en una realización particular, el cóctel enzimático al que se refiere la presente invención comprende las enzimas celulolíticas contributivas según se han definido anteriormente y carece de la actividad enzimática de, al menos, una celulasa con actividad endoglucanasa, preferentemente, la endoglucanasa 6 (Eg6), y/o de al menos una celulasa con actividad polisacárido monooxigenasa, preferiblemente la PMO-09768.
El cóctel de la invención puede suplementarse además adicionando otras enzimas accesorias o adicionales, que pueden ser tanto homologas como heterólogas, y que además se caracterizan por que su actividad enzimática específica no puede reemplazarse por ninguna de las actividades enzimáticas que presentan las enzimas celulolíticas contributivas. Dichas enzimas accesorias o adicionales se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: aminopeptidasas, amilasas, carbohidrasas, carboxipeptidasas, catalasas; quitinasas, cutinasas, ciclodextrina glucosiltransferasas, desoxirribonucleasas, esterasas, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasas, haloperoxidasas, invertasas, lacasas, lipasas, manosidasas, oxidasas, oxidoreductasas, enzimas pectinolíticas, peptidoglutaminasas, peroxidasas, proteasas, fitasas, polifenoloxidasas, enzimas proteolíticas, ribonucleasas, transglutaminasas, o cualquiera de sus combinaciones, siempre que no presente las enzimas celulolíticas no contributivas. Esta(s) enzima(s) accesorias(s) o adicional(es) puede(n) proceder, tanto de la propia célula hospedadora como de otros microorganismos capaces de secretar enzimas celulolíticas que presenten las actividades arriba indicadas, por ejemplo, mediante un microorganismo que pertenece al género Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae; Fusarium, tal como Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum; Gibberella, tal como Gibberella zeae; Humicola, tal como Humicola insolens o Humicola lanuginosa; Trichoderma, tal como Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride; o Myceliophthora, tal como Myceliophthora thermophila.
Por tanto, en una realización más preferida, el cóctel de la invención comprende además otras enzimas celulolíticas accesorias o adicionales según se describe en los párrafos anteriores, que se pueden producir de forma natural o recombinante.
En una realización más preferida, el cóctel de la invención es una mezcla enzimática obtenida de la célula hospedadora de la invención. En una realización aún más preferida, el cóctel de la invención es una mezcla enzimática obtenida mediante la célula hospedadora de la invención, preferiblemente M. thermophila, que presenta una menor expresión y/o secreción de enzimas celulolíticas no contributivas homologas en relación a una célula hospedadora, preferiblemente M. thermophila parental o silvestre, que presenta una expresión y/o secreción normal de todas las enzimas celulolíticas.
El cóctel de la invención se puede preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica y puede estar en forma líquida o tratarse de una composición seca. Las enzimas que se van a incluir en el cóctel pueden estabilizarse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica.
Tal como se ha indicado anteriormente, la célula hospedadora de la invención es capaz de secretar las enzimas contributivas al medio junto con otras enzimas celulolíticas adicionales producidas de forma natural o recombinante, siendo de esta manera útil para la optimización de la etapa de hidrólisis de la biomasa en azúcares fermentables. Por tanto, otro aspecto descrito en la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención o del cóctel de la invención, para la degradación de la biomasa.
La célula hospedadora o el cóctel de la presente invención, se pueden utilizar para producir, a partir de biomasa, preferentemente biomasa vegetal, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como materias primas químicas o de la fermentación para la producción de etanol, plásticos, u otros productos o intermedios.
La célula hospedadora de la presente invención se puede utilizar como una fuente de polipéptidos que tienen actividad celulasa, utilizándose dichos polipéptidos en procesos de degradación o hidrólisis y fermentación de la biomasa.
La degradación o hidrólisis de la biomasa, preferentemente biomasa vegetal, a azúcares fermentables, proceso conocido también como "sacarificación", por medio de la célula hospedadora de la invención o del cóctel de la invención, puede ir seguida de un proceso de fermentación en el que los azúcares fermentables obtenidos se utilizan con el fin de obtener finalmente un bioproducto tal como bioetanol.
De esta manera, otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora de la invención o del cóctel de la invención, para la degradación de la biomasa en un proceso de producción de un bioproducto.
El término "bioproducto" o "productos biobasados" se refiere a los productos de alto valor añadido que pueden obtenerse por transformación química de los azúcares o por fermentación de dichos azúcares con diferentes microorganismos. Sin pretender ser limitativa, una lista de posibles microorganismos fermentativos es la siguiente: Bacillus thermoglucosidaisus, Clostridium butyricum, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Geobacillus themoglucosidasius, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus sp. Leunoscoc mesenteroides, Thermoanaerobacter BG1L1, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter mathranii, Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum, Zymobacter palmae, Zymomonas mobilis Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensis, Candida fermentans, Chrysosporium lucknowense, Candida pastoris, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis, Hansenula anómala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces barnetti, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces uvarum o Schizosaccharomyces pombe o mezclas de estos. Estos y otros microorganismos pueden proporcionar por fermentación de diferentes azúcares, bioproductos entre los cuales se pueden citar de manera no limitativa los siguientes: alcoholes como etanol, metanol, butanol, hexanol, octanol, decanol, dodecanol, 1 ,3-butanediol(1 ,3-diol), 1- alcohol; ácidos orgánicos como ácido cítrico, ácido acético, ácido itaconico, ácido láctico, ácido glutámico, ácido succínico, beta-cetoácido, beta-cetoalcohol, beta- hidroxiácido; cetonas como la acetona; gases como hidrógeno o dióxido de carbono; hidrocarburos como alcanos alquenos o alquinos; sustancias nitrogenadas como aminas, amida, nitrocompuestos o nitrilos; haluros; aminoácidos como ácido glutámico; antibióticos como penicilina o tetraciclinas; vitamina como riboflavina, vitamina B12 o betacaroteno; ácidos grasos como ácido dodecanoico, ácidos grasos trans-A2 o ácido palmítico; y otros productos como etileno, glicerol, 1 ,3-propano-diol, betalactano, cefalosporinas, ácidos grasos trans o furano.
Se puede producir etanol mediante la degradación enzimática de la biomasa y la conversión de los sacáridos liberados en etanol. Este tipo de etanol se denomina a menudo bioetanol. Se puede usar como un aditivo de combustible o extensor en mezclas de menos del 1 % hasta un 100% (un sustituto del combustible).
En una realización más preferida, el bioproducto es biocombustible. El término "biocombustible", tal como se usa aquí, se refiere a un hidrocarburo, o a una de sus mezclas, que se puede utilizar como combustible y se obtiene utilizando la biomasa fermentable como material de partida. Ejemplos de biocombustibles incluyen, pero no se limitan a, etanol o bioetanol y biodiesel. En una realización más preferida, el biocombustible es bioetanol. El término "bioetanol" se refiere a un alcohol preparado mediante fermentación, a menudo a partir de biomasa fermentable tal como los hidratos de carbono producidos en cultivos de azúcar o de almidón tales como maíz o caña de azúcar. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir azúcares fermentables, denominado aquí "primer procedimiento de la invención" que comprende: a) Incubar biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, con la célula hospedadora de la invención, o con el cóctel de la invención, y
b) Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a).
Frecuentemente se requiere un procedimiento de pretratamiento de la biomasa para aumentar el acceso de las enzimas a sus sustratos y la hidrólisis eficaz consiguiente. El pretratamiento utiliza diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a tratamientos químicos y/o mecánicos, como por ejemplo la explosión de la fibra con amonio, tratamiento con ácido diluido y explosión con vapor a elevadas temperaturas para alterar la estructura de la biomasa celulósica y volver la celulosa más accesible. El uso de la célula hospedadora de la invención o del cóctel de la invención en los procedimientos de la presente invención es ventajoso debido a que no se requieren altas temperaturas en el proceso de pretratamiento de la biomasa.
El término "azúcar fermentable" tal como se usa aquí, se refiere a azúcares sencillos, tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, ramnosa, sacarosa o fructosa, entre otros.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa, denominado a partir de ahora "segundo procedimiento de la invención", que comprende:
a) Incubar biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, con la célula hospedadora de la invención o con el cóctel de la invención,
b) Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la etapa de incubación (a) con al menos un microorganismo fermentador, y
c) Recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación de la etapa (b).
Antes (es decir en la etapa (a)) y/o simultáneamente con la fermentación de la etapa (b), la biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, se hidroliza para degradar la celulosa y la hemicelulosa en azúcares y/o oligosacáridos. El contenido en sólidos durante la hidrólisis puede estar, pero sin limitación, comprendido entre el 5-40% del peso total, preferiblemente entre el 10-40% del peso total, más preferiblemente entre el 15-25% del peso total. La hidrólisis se realiza como un proceso en el que la biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, se incuba con la célula hospedadora de la invención o con el cóctel de la invención que contiene enzimas celulolíticas y forman así la solución de hidrólisis. El tiempo de proceso adecuado, la temperatura y las condiciones de pH pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Preferiblemente, dicha hidrólisis se realiza a una temperatura entre 25 °C y 60 °C, preferiblemente entre 40 °C y 60 °C, específicamente alrededor de 50 °C. El proceso se realiza preferiblemente a un pH en el intervalo de 3-8, preferiblemente pH 4-6, especialmente alrededor de pH 5. Preferiblemente, la hidrólisis se realiza en un tiempo comprendido entre 12 y 144 horas, preferiblemente entre 16 y 120 horas, más preferiblemente entre 24 y 96 horas, incluso más preferiblemente entre 32 y 72 horas. La hidrólisis (etapa (a)) y la fermentación (etapa (b)) pueden realizarse simultáneamente (proceso SSF) o secuencialmente (proceso SHF). De acuerdo con la invención, la biomasa hidrolizada, y preferiblemente pretratada, se fermenta por al menos un microorganismo fermentador capaz de fermentar azúcares fermentables, tales como glucosa, xilosa, mañosa y galactosa directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en un tiempo comprendido entre 8 y 96 horas, preferiblemente entre 12 y 72, más preferiblemente entre 24 y 48 horas. En otra realización preferida, la fermentación se realiza a una temperatura entre 20 °C y 40 °C, preferiblemente de 26 °C a 34 °C, en particular alrededor de 32 °C. En otra realización preferida, el pH es de 3 a 6 unidades, preferiblemente de 4 a 5. Se prefiere para la fermentación etanólica una levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, tanto silvestre como modificada genéticamente. Son preferidas las cepas que sean resistentes a altos niveles de etanol, hasta, por ejemplo, el 5 o el 7% en vol. de etanol o más, tal como el 100% en vol. de etanol. El término "termentador o fermentación" tal como se usa aquí, se refiere a un proceso de transformación biológica producido por la actividad de algunos microorganismos en los que los azúcares tales como glucosa, fructosa, y sacarosa se convierten en etanol. Los microorganismos usados de este modo son microorganismos fermentadores que tienen capacidad de fermentación, tales como levaduras, preferiblemente S. cerevisiae.
El término "recuperación" tal como se usa aquí, se refiere a la recogida de azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) del primer procedimiento de la invención o del bioproducto obtenido después de la fermentación de la etapa (b) del segundo procedimiento de la invención. Se puede realizar la recuperación mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo los mecánicos o los manuales. En una realización preferida del segundo procedimiento de la invención, el bioproducto es biocombustible, más preferiblemente bioetanol.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. (A). Respresentación de la composición y concentración (expresado en forma de porcentaje relativo) de enzimas celulasas incluidas en un cóctel enzimático que podría ser obtenido de una célula hospedadora parental no modificada genéticamente. (B). Representación de la composición y concentración (expresado en forma de porcentaje relativo) de enzimas celulasas incluidas en un cóctel enzimático que podría ser obtenido de una célula hospedadora modificada según se describe en la presente invención. Como se observa en la Figura 1 B, dicho cóctel enzimático muestra una una menor diversidad enzimática y una mayor representación de las enzimas contributivas, más eficientes en las condiciones industriales en las que se emplearán, en detrimento de la diversidad de las mismas.
Figura 2. (A) Esquema del vector pBASE7. Plásmido base que permite clonar los extremos flanqueantes del gen que se pretende delecionar. Incluye como marcador de selección el gen amdS que confiere resistencia a acetamida. El marcador de selección incluye su región promotora (Pamds) y terminadora (Tamds)- A ambos lados del gen amdS se encuentran dos regiones REP (repetidas) que permiten, una vez integrado el vector en el genoma y mediante recombinación homologa entre ellas, la eliminación del marcador de selección amdS. (B) Esquema del plásmido pBASE7-eg6 utilizado para delecionar el gen eg6. Las regiones aguas arriba (región 5') y aguas abajo (región 3') del gen eg6 se han clonado en el vector pBASE7. Este plásmido una vez linealizado se utilizará para delecionar el gen eg6. Figura 3. Comprobación genética de la deleción del gen eg6. Amplificación mediante PCR de un fragmento interno de 350pb del gen eg6. Esta amplificación es negativa en el caso de Aeg6, que es la cepa en la que se ha delecionado el gen eg6.
Figura 4. Análisis de la liberación de glucosa a partir de biomasa molida sometida a una composición enzimática celulolítica obtenida a partir de una cepa de M. thermophila que no expresa el gen eg6 respecto a la cepa parental de M. thermophila.
Figura 5. Fotografía de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 7,5%) donde se muestran las celulasas presentes en dos composiciones enzimáticas, una contiene la enzima endoglucanasa 6 (+Eg6), que ha sido obtenida de una cepa control de M. thermophila no modificada, y otra que carece de dicha enzima (-Eg6). Carril 1 : Marcador de peso molecular; Carril 2: composición enzimática sin Eg6; Carril 3: composición enzimática con Eg6. La flecha indica la banda de proteína que corresponde a la enzima endoglucanasa 6.
Figura 6. Análisis de la liberación de glucosa a partir de biomasa molida sometida a una composición enzimática celulolítica obtenida a partir de una cepa de M. thermophila que no expresa el gen de la polisacárido mono-oxigenasa 09768 respecto a la cepa parental de M. thermophila. Figura 7. Fotografía de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 7,5%) donde se muestran las celulasas presentes en dos composiciones enzimáticas, una comprende la enzima polisacárido mono oxigenasa (+PMO 09768), que ha sido obtenida de una cepa control de M. thermophila no modificada, y otra que carece de dicha enzima (-PMO 09768). Carril 1 : Marcador de peso molecular; Carril 2: composición enzimática sin PMO 09768; Carril 3: composición enzimática con PMO 09768. La flecha indica la banda de proteína que corresponde a la enzima PMO 09768. Figura 8. Análisis de la liberación de glucosa a partir de biomasa molida sometida a diferentes composiciones enzimáticas obtenidas de cepas de M. thermophila que no expresan el gen que codifica para la endoglucanasa 6 respecto a las respectivas cepas de M. thermophila parentales que sí expresan dicho gen. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante ensayos que pone de manifiesto la efectividad de los objetos de la invención. Ejemplo 1. Construcción de un plásmido capaz de delecionar el gen eg6. Transformación de la cepa M. thermophila con dicho plásmido para la obtención de la cepa Aeg6.
El gen eg6 (SEQ ID NO: 1) de M. thermophila C1 fue el gen candidato a delecionar dado su potencial de mejora en la composición enzimática carente de esta actividad.
Para ello, se construyó un plásmido que permite delecionar el gen eg6 en M. thermophila C1. Dicho plásmido contiene fragmentos aguas arriba y aguas abajo del gen eg6 de tal forma que mediante recombinación homologa con el genoma de M. thermophila C1 , se sustituya el gen eg6 por el marcador de selección clonado entre ambos fragmentos.
El fragmento aguas arriba del gen eg6 se amplificó a partir de ADN genómico de M. thermophila C1 como diana (obtenido usando el kit DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen) con la ADN polimerasa ¡Proof High-Fidelity (BioRad) usando los oligonucleótidos 1 (cebador directo) (ACCGAGCTCGTAGCACTCGCTGTGTATCCTC) (SEQ ID NO: 7) y 2 (cebador inverso) (CCTGGATCCCTTATACCCAGGACATTCACAGTTC) (SEQ ID NO: 8). Estos oligos incluyen las secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción Sad y fíamHI. De la misma forma se amplificó el fragmento aguas abajo del gen eg6 con los oligonucleótidos 3 (cebador directo) (ACCGAATTCATCAAATGGATAGGTCGGTAATG) (SEQ ID NO: 9) y 4 (cebador inverso) (CACCTCGAGCAAGGAAGTCGAGTACGAGTCC) (SEQ ID NO: 10). Estos oligonucleótidos incluyen las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción EcoRI y Xho\. Las condiciones de amplificación para ambos fragmentos son un ciclo a 95 °C durante 2 minutos y 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55°C durante 20 segundos, 72 °C durante 90 segundos y 72 °C durante 10 minutos.
Una vez amplificados los fragmentos aguas arriba y aguas abajo del gen eg6 de tamaños correspondientes a 2005pb y 2018pb respectivamente, se clonaron en el vector pBASE7 (Figura 2A). Este vector contiene como marcador de selección el gen amdS que confiere capacidad de utilizar la acetamida como fuente de nitrógeno. En primer lugar, el fragmento amplificado correspondiente al extremo 3' del gen (situado aguas abajo del mismo) se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y Xho\ y se clonó en el vector pBASE7 digerido previamente con las mismas enzimas de restricción. La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de Escherichia coli XLI Blue MRF siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Stratagene). Una vez obtenido este plásmido se continuó clonando el extremo situado aguas arriba del gen eg6. Para ello el fragmento correspondiente se digirió con las enzimas de restricción Sad y Kpn\ y se clonó en el plásmido donde previamente se había clonado el extremo aguas abajo. La mezcla de ligación se transformó en células electrocompetentes de Escherichia coli XLI Blue MRF siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Stratagene). El plásmido obtenido (pBASE7-eg6) se muestra en la Figura 2B.
El ADN plasmídico para delecionar el gen eg6 se linealizó mediante digestión con las enzimas de restricción Sad y fíamHI y se utilizó para transformar células huésped de la cepa M. thermophila C1 (Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol., 3 (1)). Este ADN se introdujo en la cepa huésped usando un método de transformación en protoplastos (US7399627B2). Los transformantes se sembraron en placas de agar conteniendo 0,6 g/L de acetamida (Merck). Tras 5 días de incubación a 35 °C se analizaron los transformantes resultantes (que expresan el gen amdS y por tanto son capaces de crecer en presencia de acetamida como única fuente de nitrógeno). Los transformantes obtenidos fueron analizados genéticamente para comprobar si el gen eg6 había sido sustituido por el marcador de selección. Para ello se obtuvo ADN genómico de los transformantes obtenidos (obtenido usando el kit DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen) con la ADN polimerasa ¡Proof High-Fidelity (BioRad) usando los oligonucleótidos 5 (cebador directo) (GGCTCGAGATCTACAAGACTG) (SEQ ID NO: 1 1) y 6 (cebador inverso) (GTAGTTGGACACGTTGGTGA) (SEQ ID NO: 12) para amplificar un fragmento interno de eg6 de 350pb . Las condiciones de amplificación para ambos fragmentos son un ciclo a 95 °C durante 2 minutos y 30 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 10 minutos.
En este ejemplo se identifican aquellas células huésped que han sido transformadas y que no expresan el gen eg6 (amplificación negativa) frente a aquellas células huésped que expresan dicho gen (amplificación positiva). De esta forma se identificó la cepa M. thermophila C1 Aeg6. La Figura 3 muestra la prueba genética tras la amplificación de un fragmento interno de eg6 de 350pb. Esta amplificación es negativa en el caso de la cepa Aeg6.
Ejemplo 2. Evaluación de cepas huésped de M. thermophila que carecen de la celulasa no contributiva Eg6 (Aeg6) frente a las cepas parentales que sí la contienen (+Eg6).
Se comparó la liberación de azúcares fermentables de la cepa de M. thermophila C1 Aeg6 con su cepa parental +Eg6. Como sustrato para la hidrólisis enzimática se empleó biomasa pretratada de maíz ("pretreated corn stover", o PCS). El pretratamiento se realizó mediante un sistema de explosión de vapor (Nguyen et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72), y su análisis composicional se efectuó de acuerdo los procedimientos descritos por NREL en "Standard Biomass Analytical Procedures" (http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.htmL). Con objeto de su uso en la hidrólisis, la biomasa fue previamente neutralizada ajustándose a un pH de 5,5. Para el proceso de hidrólisis enzimática se usaron botes ISO de 100 mi con 20 g de la mezcla de reacción al 20% (p/p) de sólidos totales y suplementada con 12 mg proteína por g de glucano del cóctel procedente de las cepas Aeg6 y +Eg6, respectivamente. Los frascos con la mezcla se incubaron durante 72 h a 50 °C con una agitación de 150 rpm en un incubador orbital de 25 mm de diámetro (Infors HT). Una vez realizado el proceso, el contenido de glucosa en las muestras resultantes del hidrolizado (slurry) se analizó mediante HPLC (Agilent Technologies, 1200 Series) usando un detector del índice de refracción (DIR) y una columna Aminex HPX-87 H). Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4, donde se puede apreciar que la delección de la endoglucanasa no contributiva Eg6 provoca un incremento en la capacidad de sacarificación, es decir, producción de glucosa, con respecto al control que sí expresa la endoglucanasa Eg6. En la Figura 5 se muestra la electroforesis en gel de acrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) de las composiciones enzimáticas con y sin Eg6.
Ejemplo 3. Evaluación de cepas M. thermophila que carecen de la enzima no contributiva PMO-09768 (APMO-09768) frente a las cepas parentales que sí la contienen.
De la misma forma que se ha descrito la obtención de una cepa delecionada para el gen eg6 (ver Ejemplo 1), se obtuvo una cepa que presentaba la deleción del gen PMO-09768 y a la que se le denominó APMO-09768. Se comparó la liberación de azúcares fermentables de la cepa de M. thermophila C1 ΔΡΜΟ-09768 con su cepa parental. Como sustrato para la hidrólisis enzimática se empleó biomasa pretratada de maíz ("pretreated corn stover", o PCS). El pretratamiento se realizó mediante un sistema de explosión de vapor (Nguyen et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70- 72), y su análisis composicional se efectuó de acuerdo los procedimientos descritos por NREL en "Standard Biomass Analytical Procedures" (http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.htmL). Con objeto de su uso en la hidrólisis, la biomasa fue previamente neutralizada ajustándose a un pH de 5,5. Para el proceso de hidrólisis enzimática se usaron botes ISO de 100 mi con 20 g de la mezcla de reacción al 20% (p/p) de sólidos totales y suplementada con 12 mg proteína por g de glucano del cóctel procedente de las cepas en cuestión. Los frascos con la mezcla se incubaron durante 72 h a 50 °C con una agitación de 150 rpm en un incubador orbital de 25 mm de diámetro (Infors HT). Una vez realizado el proceso, el contenido de glucosa en las muestras resultantes del hidrolizado (slurry) se analizó mediante HPLC (Agilent Technologies, 1200 Series) usando un detector del índice de refracción (DIR) y una columna Aminex HPX-87 H). Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 6, donde se puede apreciar que la delección de la PMO no contributiva 09768 provoca un incremento en la capacidad de sacarificación con respecto al control, esto es, en la producción de glucosa por la mezcla de las celulasas. En la Figura 7 se muestra la electroforesis en gel de acrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) de las composiciones enzimáticas con y sin PMO-09768.
Ejemplo 4. Evaluación del efecto de la deleción del gen eg6 (endoglucanasa no contributiva) en diferentes cepas de M. thermophila.
Se delecionó el gen que codifica para la endoglucanasa no contributiva Eg6 (SEQ ID NO: 1) en varias cepas de M. thermophila con el objeto de demostrar el efecto positivo que tiene dicha deleción sobre la composición enzimática producida por dichas cepas. Para la construcción de las cepas se empleó un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1.
Se obtuvieron dos cepas diferentes que presentaban una deleción en el gen de la eg6 respecto a las cepas parentales según se describe en el Ejemplo 1. Como se muestra la Figura 8, la composición enzimática producida por ambas cepas de M. thermophila que carecen de la endoglucanasa no contributiva Eg6, es capaz de liberar mayor concentración de glucosa que las composiciones enzimáticas secretadas por las cepas parentales que contienen la enzima Eg6.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Célula hospedadora modificada que presenta una expresión y/o secreción reducida de un 100% en una enzima celulolítica que comprende la SEQ ID NO: 2 respecto al porcentaje de expresión y/o secreción de la misma enzima celulolítica en una célula hospedadora parental o silvestre.
2. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 1 donde la célula hospedadora es Myceliophthora thermophila.
3. Cóctel enzimático obtenido a partir de la célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. El cóctel enzimático de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende además otras enzimas celulolíticas accesorias seleccionadas de entre cualquiera de las siguientes: aminopeptidasas, amilasas, carbohidrasas, carboxipeptidasas, catalasas; quitinasas, cutinasas, ciclodextrina glucosiltransferasas, desoxirribonucleasas, esterasas, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasas, haloperoxidasas, invertasas, lacasas, lipasas, manosidasas, oxidasas, oxidoreductasas, enzimas pectinolíticas, peptidoglutaminasas, peroxidasas, proteasas, fitasas, polifenoloxidasas, enzimas proteolíticas, ribonucleasas, transglutaminasas, o cualquiera de sus combinaciones siempre que dicho cóctel no presente las enzimas celulolíticas no contributivas.
5. Uso de la célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o del cóctel enzimático de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, para la degradación de la biomasa.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, para la degradación de la biomasa en un proceso de producción de un bioproducto.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde el bioproducto es biocombustible.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde el biocombustible es bioetanol.
9. Un procedimiento para producir azúcares fermentables que comprende: a. Incubar biomasa con la célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o con el cóctel enzimático de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, y
b. Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación en la etapa (a).
10. Un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa que comprende:
a. Incubar biomasa con la célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o con el cóctel enzimático de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4,
b. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) con al menos un microorganismo fermentador, y c. Recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación en la etapa (b).
1 1. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, donde el bioproducto es biocombustible.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 , donde el biocombustible es bioetanol.
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