WO2017200016A1 - Ｅｇｆｒ－ｔｋｉ耐性を獲得した肺癌の治療薬 - Google Patents

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量平 片山
健 内堀
直也 藤田
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca

Definitions

  • the present invention relates to the treatment of cancer that has acquired resistance to EGFR-TKI (EGFR tyrosine kinase inhibitor) in the treatment of lung cancer having an EGFR (Epidmal Growth Factor Receptor) gene mutation.
  • EGFR-TKI EGFR tyrosine kinase inhibitor
  • osimertinib is also used for osimertinib
  • the present invention relates to a therapeutic drug that is effective for cancer that has acquired resistance.
  • Non-Patent Document 1 The predicted number of new cases of lung cancer in Japan in 2020 reported by Ono, Nakamura et al. In 2004 was about 91,000 males and about 34,000 females. According to the announcement from the Center, the number of new patients of 90,700 men and 42,800 women has already been estimated as of 2015 (Non-Patent Document 1), and it is feared that this forecast will be further exceeded as of 2020. Therefore, the development of therapeutic methods has become a major issue. Worldwide, the number of deaths from lung cancer is increasing. According to statistics from the International Union for Cancer (UICC), the number of deaths due to lung cancer is the highest among cancers, and it is said that it corresponds to 1/5 of all cancer deaths.
  • UICC International Union for Cancer
  • Non-small cell lung cancer accounts for about 80-85% of all lung cancer, and small cell lung cancer accounts for about 10-15%.
  • chemoradiotherapy is standard when radical irradiation is possible, and chemotherapy is the standard treatment for stage IIIB and stage IV non-small cell lung cancer that cannot be radically irradiated.
  • CDDP cisplatin
  • BSC best support care
  • the survival-prolonging effect is about half a year to a little less than one year from about one year of the survival-prolonging effect of the cytotoxic anticancer agents shown in the above-mentioned ECOG test and FACS test due to the appearance of pemetrexed and bevacizumab.
  • further progress was scarce and was in a stepping state.
  • EGFR-TKI is an agent that binds to the ATP binding site of EGFR tyrosine kinase in cells and inhibits EGFR autophosphorylation to inhibit EGFR signal transduction.
  • EGFR-TKI product name: Iressa (registered trademark)
  • erlotinib product name: Tarceva (registered trademark)
  • afatinib product name: Giotrif (registered trademark)
  • exon 19 deletion mutations are the tyrosine kinase region exon 18-21, exon 19 deletion mutation is 48%, and L858R (858th leucine substitution with arginine.
  • the point mutation is the amino acid position below.
  • sequence before and after substitution account for 43%, and other G719X and rare mutations account for about 15%.
  • Exon 19 deletion mutations are most commonly simple deletion mutations centered on the 5 amino acids of ELREA 746-750, but there are many variations such as the number of deleted amino acids and those with amino acid substitutions. (Non-patent Document 8).
  • gefitinib and carboplatin (CBDCA) / paclitaxel (PTX) combination therapy is selected for patients with clinical background (non-smokers, Asians, adenocarcinoma) where EGFR-TKI is expected to be effective IPASS (Iresa Pan Asia Study), which is a phase III study comparing the two, showed that PFS (progression-free survival, progression-free survival) was significantly prolonged in the gefitinib group (Non-patent Document 9) ).
  • Non-Patent Document 10 which is a comparative phase III study of gefitinib and CBDCA + PTX conducted in Japan
  • WJTOG 3405 study which is a comparative phase III study of gefitinib and CDDP + docetaxel (docetaxel, DTX) combination therapy.
  • the subsequent reports showed that the median survival was 34.8 months for WJTOG3405 and 27.7 months for NEJ002, and the importance of administering EGFR-TKI to EGFR gene mutation-positive patients It became widespread.
  • pulmonary adenocarcinoma has been discovered one after another for proto-oncogenes that are therapeutic targets such as EML4-ALK translocation fusion, RET translocation fusion, ROS1 translocation fusion, HER2 mutation, BRAF mutation, etc. Therefore, the development of corresponding therapeutic drugs has brought great benefits to patients with each disease.
  • the benefits of accurately detecting the presence or absence of a proto-oncogene and the corresponding appropriate molecular targeted drug treatment were also reported by Kris et al. In 2014, and have now become an essential area for lung cancer treatment ( Non-patent document 12).
  • the acquired resistance due to the appearance of the C797S mutation should be subtracted from the fact that the total number of third-generation resistant cases is not sufficiently accumulated, but refer to the frequency reported in 2015 WCLC (World Conference on Lung Cancer). For example, it is estimated to correspond to 4-5% of all lung cancers. The frequency is about the same as that of ALK positive lung cancer cases, and it can be said that it occupies a certain clinical specific gravity. Therefore, establishing a treatment for this population is a clinically important issue.
  • EAI045 is effective as an allosteric inhibitor against EGFR mutants having mutations of L858R, T790M, and C797S.
  • EAI045 has been shown to have a significant inhibitory effect on tumor growth in a mouse model when administered in combination with cetuximab, an anti-EGFR antibody drug (Non-patent Document 21).
  • EAI045 is a developmental compound and cannot be used immediately in clinical practice.
  • it is not effective for the exon 19 deletion mutant that accounts for about half of EGFR mutation-positive lung cancers. Therefore, there is no change in the current situation that there is a need for an effective therapeutic agent for the EGFR mutant having the C797S mutation.
  • the present invention relates to the following medicines, methods for examining the effectiveness of medicines, and testing kits.
  • An EGFR gene mutation-positive non-small cell lung cancer therapeutic agent comprising a compound represented by formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is a group represented by the following formula (II) or (III):
  • R 2 is —N (CH 3 ) 2 , —NH 2, or a group represented by the following formula (IV).
  • R 1 is a group represented by the following formula (II) or (III):
  • R 2 is —N (CH 3 ) 2 , —NH 2, or a group represented by the following formula (IV).
  • (7) The method for examining the efficacy of a medicine according to (6), wherein the compound is brigatinib, an AP26113 analog, or AZD3463.
  • a pharmaceutical efficacy test kit comprising as an active ingredient a compound represented by general formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof, comprising a PCR primer for detecting a mutation at position 797 of EGFR, or an antibody.
  • R 1 is a group represented by the following formula (II) or (III):
  • R 2 is —N (CH 3 ) 2 , —NH 2, or a group represented by the following formula (IV).
  • (11) The pharmaceutical efficacy test kit according to (10), wherein the compound is brigatinib, an AP26113 analog, or AZD3463.
  • (12) The pharmaceutical efficacy test kit according to (10) or (11), further comprising a PCR primer or an antibody for detecting a deletion mutation in exon 19 of EGFR, a mutation in L858R, and a mutation in T790M.
  • the present invention also relates to the following non-small cell lung cancer treatment methods.
  • a therapeutic method comprising using a medicine as an active ingredient in combination with an anti-EGFR antibody.
  • R 1 is a group represented by the following formula (II) or (III):
  • R 2 is —N (CH 3 ) 2 , —NH 2, or a group represented by the following formula (IV).
  • the treatment method wherein the compound is brigatinib, AP26113 analog, or AZD3463.
  • EGFR gene mutation-positive non-small cell lung cancer is first treated with gefitinib, erlotinib, or afatinib. If treatment with these drugs renders refractory due to the T790M mutation in EGFR, treatment is performed with third-generation EGFR-TKI, such as osimertinib.
  • a useful therapeutic effect can be obtained by using the therapeutic agent of the present invention for non-small cell lung cancer expressing triple mutant EGFR that has acquired the mutation of C797S, which is a mutation. Furthermore, a stronger effect can be obtained by using in combination with an anti-EGFR antibody.
  • combined use with an anti-EGFR antibody is expected to be effective in treating lung cancer that has been shown to have a reduction effect on cancer in an in vivo test and has acquired resistance to a therapeutic agent.
  • medical agent which inhibits the proliferation of the cell strain which expresses the C797S variant of EGFR The figure which shows the effect with respect to the cell viability of gefitinib, afatinib, osmeltinib, and brigatinib (brigatinib) with respect to the exon 19 deletion mutant expression cell of EGFR which makes Ba / F3 a parent strain.
  • the figure which shows the effect with respect to the cell viability of the said compound with respect to the C797S / exon 19 deletion mutant expression cell of EGFR The figure which shows the effect with respect to the cell viability of the said compound with respect to the C797S / exon 19 deletion mutant expression cell of EGFR.
  • the figure which shows the effect with respect to the cell viability of the said compound with respect to the triple mutant C797S / T790M / L858R mutant expression cell of EGFR The figure which analyzed the phosphorylation of the EGFR signaling system of afatinib, osmeltinib, and brigatinib in the EGFR L858R mutant expression cell which makes Ba / F3 a parent strain. The figure which analyzed the phosphorylation of the EGFR signal transduction system by the said compound in the T790M / L858R mutant expression cell of EGFR.
  • mouth The figure which analyzed the phosphorylation of the EGFR signal transduction system of the brigatinib with respect to the said deletion mutant expression cell transplanted to the mouse
  • the figure which analyzed the effect of brigatinib and cetuximab with respect to the EGFR signaling system of the said triple mutant cell strain The figure which examined the combined use effect of the panitumumab and a tyrosine kinase inhibitor with respect to the cell viability of the triple mutant expression cell which makes Ba / F3 a parent strain.
  • non-small cell lung cancer having a point mutation of C797S the first generation EGFR-TKI represented by gefitinib
  • the third generation EGFR-TKI represented by osmeltinib A compound having an effect on cancer that has acquired resistance, a method for examining the effectiveness of the compound, and a treatment method will be described.
  • the present inventors have found that the ALK inhibitor brigatinib causes growth inhibition on cells having a C797S point mutation that appears after treatment with osimertinib.
  • the present inventors focused on the fact that cells that have acquired resistance to osimertinib have a C797S mutation, and screened a large number of compounds using a cell line having both C797S and T790M mutations. As a result, it was found that an ALK inhibitor represented by the following general formula suppresses cell proliferation.
  • R 1 is a group represented by the following formula (II) or (III):
  • R 2 is —N (CH 3 ) 2 , —NH 2, or a group represented by the following formula (IV).
  • the drug containing the above compound as an active ingredient is considered to be effective not only for the EGFR gene mutation-positive non-small cell lung cancer examined here but also for a tumor having the same mutation C797S in EGFR. .
  • any anti-EGFR antibody may be used as long as it inhibits EGFR activity.
  • examples of such antibodies include Nesitumumab approved as a treatment for non-small cell lung cancer (squamous cell lung cancer) by the US Food and Drug Administration (FDA), and Cetuximab and Panitumumab currently used for the treatment of colorectal cancer, etc.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • Cetuximab and Panitumumab currently used for the treatment of colorectal cancer, etc.
  • the present invention is not limited to this, and any antibody that inhibits EGFR activity may be used.
  • Currently used antibodies are thought to bind to the extracellular domain of EGFR and inhibit binding to the ligand EGF (Non-patent Documents 22-24).
  • the antibody used for the treatment may be an antibody having an epitope overlapping with these antibodies, or may recognize a different epitope.
  • a case where a therapeutic drug containing the above compound as an active ingredient is effective is a case where a point mutation from cysteine to serine occurs at position 797 of EGFR. Therefore, the test for confirming the effectiveness of these drugs may be performed by any method as long as the mutation of EGFR C797S can be detected.
  • any method for detecting a gene mutation can be used as long as it can confirm the sequence at position 797 of EGFR, such as a PCR-based test method or a direct sequencing method. If a mutation in the EGFR protein is to be detected, the mutation may be detected by a method such as tissue staining or ELISA using an antibody that specifically recognizes the C797S mutation.
  • tissue staining or ELISA using an antibody that specifically recognizes the C797S mutation.
  • any tumor tissue may be used as long as it contains tumor cells such as pleural effusion and other body cavity fluids, sputum, suction sputum, and blood.
  • the present invention will be described with reference to data.
  • EGFR gene mutation-positive non-small cell lung cancer is mostly exon 19 deletion or L858R mutation, and accounts for 80% or more of the total. Therefore, a cell line having a deletion mutation of exon 19 and an L858R point mutation was prepared and analyzed.
  • Wild type EGFR was obtained from cDNA of A549 cell line.
  • the EGFR mutant exon 19 deletion mutant is amplified by PCR from the HCC827 cell line
  • the L858R mutant is amplified from a lung cancer specimen by PCR
  • the pENTR vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific) contains the active full-length EGFR.
  • T790M and C797S were introduced into each EGFR by the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by Agilent) as a single mutation or a double mutation, respectively, using the following primers.
  • T790M F CCGTGCAGCTCATCATCCAGCTCATGCCCCTTC (SEQ ID NO: 1)
  • T790M R GAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGG
  • C797S F CATGCCCCTTCGGCTCCCTCCTGGAGCTA (SEQ ID NO: 3)
  • C797S R TAGTCCCAGGAGGAGCCGAAGGGCATG (SEQ ID NO: 4)
  • the obtained EGFR mutant was inserted into a lentiviral vector, pLenti6.3 / V5-DEST (manufactured by Life Technologies) to construct each EGFR mutant.
  • the EGFR mutant was introduced into mouse pro-B cell Ba / F3 by Vira-Power Lenticular Directional TOPO Expression System (manufactured by Life Technologies).
  • Mutant strain (BaF3 T790M / del19) introduced with T790M, which is a mutation from threonine at position 790, which is a point mutation, to methionine, and cysteine, position 797, which is a point mutation that appears as resistance of the third generation medicine
  • a mutant strain (BaF3 C797S / T790M / del19) further introduced with the C797S mutation mutated to, a drug that inhibits the growth of the cell line having the C797S mutation was screened.
  • tyrosine kinase inhibitors were added to the above 4 types of Ba / F3 cell mutant strains to a concentration of 100 nM, and the effects were analyzed. After 72 hours, cell viability was analyzed by CellTiter-Glo assay (registered trademark, manufactured by Promega). Table 1 shows the tyrosine kinase inhibitors used and their sources.
  • FIG. 1 shows the relative survival rate using DMSO added as a control.
  • brigatinib and ponatinib showed an inhibitory effect of about 50% at a concentration of 100 nM against the deletion mutant of C797S / T790M / exon 19.
  • ponatinib has a similar IC 50 to the parent strain Ba / F3, it is considered that ponatinib does not specifically have a growth inhibitory effect on the EGFR mutant having a mutation in C797S. It is done.
  • brigatinib has a growth inhibitory effect on C797S mutant-expressing cells, so that gefitinib, afatinib, osimertinib and the present inventors are effective against the C797S mutation.
  • the cell viability was determined by changing the concentration of brigatinib found.
  • 2A to 2D show the survival rate of each mutant cell line by drug treatment, and Table 2 shows the IC 50 .
  • Table 2 shows the IC 50 .
  • afatinib, osmeltinib, and gefitinib showed cytostatic effects (FIG. 2A).
  • Ba / F3 having a T790M mutation showed a high reactivity with oximertinib with an IC 50 of 6.7 nM, but with gefitinib an IC 50 of 5603 nM. Strong resistance was shown (Table 2).
  • gefitinib and afatinib showed cell growth suppression for the cell line (C797S / del19) having a C797S point mutation (FIG. 2C).
  • the triple mutant expressing cell line (C797S / T790M / del19) having point mutations at two positions 797 and 790, gefitinib, afatinib Neither osimertinib inhibited proliferation even when cells were treated at high concentrations, whereas brigatinib inhibited cell proliferation at low concentrations of IC 50 67.2 nM (FIG. 2D, Table 2). That is, brigatinib acts effectively on cells having a C797S mutation in addition to the exon 19 deletion mutation, the T790M mutation.
  • Anti-phospho-EGFR antibody (Tyr1068, manufactured by Abcam, ab5644), anti-EGFR antibody (Cell Signaling Technology, # 4267), anti-phospho-Akt antibody (Ser473, Cell Signaling Technology, Anti-antibody # 40, manufactured by Anti- # 40) (Cell Signaling Technology, # 4691), anti-phospho-ERK antibody (Thr202 / Tyr204, Cell Signaling Technology, # 9101), anti-ERK1 / 2 antibody (Cell Signaling Technology, # 9, manufactured by Phosphorus # 9-102) S6 antibody (Ser240 / 244, Cell Signaling Tec nology Inc., # 5364), anti-S6 antibody (Cell Signaling Technology, Inc., # 2217), anti- ⁇ - actin antibody (Sigma - Aldrich, A5228) was performed using detection of the protein.
  • aphatinib was found to suppress phosphorylation of EGFR when treated with 100 nM in T790M / del19 Ba / F3 cells, but was completely inhibited from phosphorylation in C797S / T790M / del19 Ba / F3 cells. I could't.
  • brigatinib suppresses phosphorylation of EGFR and downstream signals in any cell.
  • Akt, ERK, and S6 was observed only in brigatinib.
  • gefitinib showed the same effect as afatinib on the phosphorylation of the EGFR signaling system.
  • Ba / F3 (BaF3 L858R) in which leucine at position 858 is mutated to arginine, Ba / F3 (BaF3 T790M / L858R) having a duplicate mutation of T790M and L858R, Ba / F3 having a duplicate mutation of C797S and L858R Using F3 (BaF3 C797S / L858R) and Ba / F3 (BaF3 C797S / T790M / L858R) having the above three mutations, the effects of gefitinib, afatinib, osmeltinib, and brigatinib were analyzed.
  • a Ba / F3 mutant was prepared in the same manner as described above, and the cell viability was determined by CellTiter-Glo assay. The results are shown in FIG.
  • Afatinib, gefitinib, and osmeltinib inhibit the growth of cells with the L858R point mutation.
  • afatinib was very strong against the L858R mutant strain and showed a cell growth inhibitory effect.
  • brigatinib has a low cytostatic effect on cells having the L858R point mutation (FIG. 3A).
  • osimertinib has a strong cell growth inhibitory effect (IC 50 5.8 nM), but afatinib has an IC 50 of 39.2 nM and gefitinib has an IC 50 of 5922 nM. With little effect.
  • brigatinib has a remarkable cytostatic effect (IC 50 161.5 nM), but oximeltinib (IC 50 1171 nM), afatinib ( IC 50 804.2 nM), gefitinib (IC 50 > 10000 nM) shows little effect (FIG. 3D).
  • EGFR and phosphorylation of the downstream signal transduction system were analyzed using the above four cell lines having the L858R mutation (FIGS. 4A to 4D).
  • Afatinib strongly suppresses phosphorylation of EGFR and downstream signal transduction system in cells expressing L858R mutant, somewhat weaker effect in cells expressing C797S / L858R mutant, and very weak inhibitory effect in T790M / L858R
  • T790M / L858R mutant-expressing cells almost no inhibitory effect was observed.
  • Osimertinib is weaker than afatinib in L858R mutant-expressing cells, but has an inhibitory effect on phosphorylation of the signal transduction system, and T790M / L858R mutant-expressing cells have the strongest inhibitory effect.
  • T790M / L858R mutant-expressing cells have the strongest inhibitory effect.
  • osmeltinib hardly showed phosphorylation inhibitory effect.
  • Bligatinib was observed to have a certain phosphorylation inhibitory effect on the EGFR signaling system even in cells expressing L858R, T790M / L858R, and C797S / L858R mutants. Further, brigatinib was the only compound that was found to have the effect of suppressing phosphorylation of the EGFR signaling system in cells expressing the C797S / T790M / L858R mutant. This result agrees very well with the results of cell viability shown in FIG. 3, and brigatinib is thought to suppress cell proliferation through suppression of the EGFR signal transduction system.
  • brigatinib has a cell growth inhibitory effect on active EGFR having C797S / T790M overlapping point mutations.
  • brigatinib has an effect of suppressing cell growth in the same manner regardless of whether the active EGFR mutation causing the cancer is a deletion mutation of exon 19 or a point mutation L858R.
  • gefitinib showed a similar effect on EGFR signaling phosphorylation, although it was weaker than afatinib.
  • ALK inhibitors are AP26113 analogs that are analogs thereof, AZD3463, TAE684, LDK378 (ceritinib), and ASP3026 (FIG. 5).
  • brigatinib, AP26113 analog, and AZD3463 have the same effect in that they have a high cell growth inhibitory effect on the EGFR mutant cell line having a C797S mutation in addition to T790M.
  • R 1 is a group represented by the following formula (II) or (III):
  • R 2 is —N (CH 3 ) 2 , —NH 2, or a group represented by the following formula (IV). Since these compounds have the same skeleton as brigatinib, AP26113 analog, and AZD3463, it is considered that the same effect as brigatinib or the like is exhibited against the EGFR mutant.
  • PC9 is a cell line derived from human non-small cell lung cancer having a deletion mutation in exon 19 of EGFR. EGFR mutant-expressing cells were similarly prepared using PC9, and the effects of these compounds were analyzed (FIG. 9).
  • cells expressing EGFR having mutations of T790M and C797S / T790M were prepared, and gefitinib, osmeltinib and brigatinib were concentrated at concentrations from 0.3 nM to 10,000 nM in the parent strain PC9 (del19)
  • the cell viability after 72 hours was determined by CellTiter-Glo assay in the same manner as described above.
  • gefitinib and osmeltinib show cell growth inhibitory effects on the parent strain PC9 (exon 19 deletion mutation), whereas brigatinib is a very weak cell. Only a growth inhibitory effect was shown (FIG. 9A).
  • a cell line T790M / del19 in which a T790M mutation was introduced into PC9
  • osimertinib showed a very strong cell growth inhibitory effect
  • brigatinib showed a weak cell growth inhibitory effect
  • gefitinib showed almost a cell growth inhibitory effect.
  • Figure 9B There was no ( Figure 9B).
  • brigatinib and AP26113 analogs have an inhibitory effect on phosphorylation of EGFR and downstream signaling systems, whereas afatinib, osimertinib and gefitinib all inhibit EGFR phosphorylation No inhibitory effect was shown (FIG. 10C).
  • AZD3463 was also analyzed for effects on these mutants (FIG. 10D).
  • AZD3463 also had the effect of suppressing phosphorylation of the EGFR signal transduction system in PC9 triple mutant-expressing cells having mutations in C797S, similarly to brigatinib and AP26113 analogs.
  • AZD3463 was found to suppress phosphorylation of EGFR and its downstream signal transduction system even in the EGFR mutant-expressing cells into which the parent strain PC9 and T790M mutation were introduced.
  • ⁇ Effect of tyrosine kinase inhibitor in wild-type EGFR expressing cells The effect of brigachinib on cell proliferation was analyzed using cell lines having mutations other than EGFR point mutations and deletion mutations.
  • the cell lines used were analyzed using A431 amplified by EGFR, A549 and H460 having mutations in K-ras.
  • A431 is a human epidermoid carcinoma, and A549 and H460 are cell lines derived from human lung cancer.
  • EGFR although A431 is amplified, there is no mutation, and no mutation is observed in EGFR for A549 and H460.
  • Afatinib and osimertinib inhibit cell proliferation with respect to A431 in which EGFR is amplified.
  • afatinib has a weak cell growth inhibitory effect on A549, others have little inhibitory effect on cell growth.
  • brigatinib did not show a cell growth inhibitory effect against any cell line. This indicates that brigatinib does not inhibit cell growth against wild-type EGFR, that is, it targets only cancer cells and does not inhibit growth of normal cells.
  • FIG. 12A shows the results of transplanting C797S / T790M / del19 mutant-expressing cells
  • FIG. 12B shows the results of transplanting T790M / del19 mutant-expressing cells.
  • brigatinib had a strong growth inhibitory effect on C797S / T790M / del19 having both C797S and T790M mutations (FIG. 12A). Moreover, the growth inhibitory effect was recognized also with respect to T790M / del19 (FIG. 12B). Osimertinib had an effect on T790M / del19, but showed almost no inhibitory effect on C797S / T790M / del19.
  • brigatinib has an effect not only on cultured cells but also on EGFR mutations having C797S and T790M mutations in vivo.
  • the survival curve based on the Kaplan-Meier method is shown in FIG. 13B. Both the osmeltinib administration group and the brigatinib administration group transplanted with PC9 expressing T790M survived during the observation period. One mouse that died in the brigatinib treatment group died accidentally at the time of oral administration on the 10th day.
  • EGFR having a C797S / T790M / del19 mutation was expressed in PC9 cells and transplanted into Balb-c nu / nu in the same manner as described above, and the effects of osimertinib and brigatinib were examined (FIG. 14).
  • Osimertinib had little effect on the EGFR triple mutation, whereas brigatinib showed a significant growth inhibitory effect on tumor growth (FIG. 14A).
  • the EGFR in the tumor after mouse transplantation and the downstream signal transduction system were analyzed by Western blotting in the same manner as described above.
  • brigatinib showed a clear phosphorylation-inhibiting effect on EGFR and downstream signal transduction systems, whereas the osimertinib-administered group showed almost no phosphorylation-inhibiting effect (FIG. 14B). .
  • brigatinib exhibits a growth-inhibitory effect on cell proliferation at low concentrations against PC9 expressing EGFR having the C797S / T790M / del19 mutation, but osmeltinib must be treated at high concentrations. It has no effect on cell proliferation (see FIG. 9C).
  • treatment with cetuximab was conducted to examine the effect on cell proliferation (FIG. 15A).
  • PC9 expressing EGFR having a mutation of C797S / T790M / del19 was added to the culture solution at a concentration of 300 nM for brigatinib and osimertinib and 10 ⁇ g / ml for cetuximab, and after 72 hours, the cell viability was set in the same manner as described above. Analysis was by CellTiter-Glo assay. Cetuximab has no effect on cell proliferation at a concentration of 10 ⁇ g / ml. On the other hand, brigachinib, when treated at a concentration of 300 nM, has an inhibitory effect on cell proliferation even when alone, but when added in combination with cetuximab, cell viability was as strong as about 50%. . In contrast, Osimertinib was not effective against cell proliferation when used in combination with cetuximab.
  • PC9 expressing EGFR having a C797S / T790M / del19 mutation was treated with brigatinib in the range of 0 to 1000 nM in the presence or absence of cetuximab, and phosphorylation of EGFR and downstream signaling system was performed. Analysis was performed by Western blotting (FIG. 15B). In cells treated with cetuximab and brigatinib in combination, EGFR and phosphorylation of downstream signaling proteins were more strongly suppressed than brigatinib alone. In particular, a stronger signal suppression effect was observed in the signal transduction system downstream of EGFR.
  • PC9 expressing EGFR having a triple mutation was transplanted into mice in the same manner as described above, solvent alone, brigatinib alone, osimertinib alone, cetuximab alone, brigatinib and cetuximab in combination, and tumor cell growth was controlled by tumor volume It examined (FIG. 15C).
  • Brigatinib was administered by gavage once daily at a dose of 75 mg / kg and osmeltinib at 50 mg / kg, and cetuximab was administered at a dose of 1 mg / mouse three times a week.
  • brigatinib alone, osimertinib alone, and cetuximab alone showed a certain tumor growth inhibitory effect, but in the group that received brigatinib and cetuximab together, there was an obvious tumor A growth inhibitory effect was observed, and gradually regression of the tumor was observed (FIG. 15C).
  • the EGFR in the tumor after mouse transplantation and the phosphorylation of the downstream signal transduction system were analyzed by Western blotting in the same manner as described above (FIG. 15D).
  • FIG. 15C phosphorylation of EGFR and its downstream signal transduction system was remarkably suppressed in tumors obtained from the group administered with brigatinib and cetuximab in combination.
  • the survival curve based on the Kaplan-Meier method is shown in FIG. 15E.
  • administration of ocimertinib alone had little effect, whereas administration of brigatinib alone or cetuximab alone had a certain life-prolonging effect.
  • all mice survived during the 60-day observation period. Therefore, it is desirable to administer brigatinib and cetuximab in combination for tumors expressing EGFR with a triple mutation.
  • EGFR having a C797S / T790M / del19 mutation was expressed in Ba / F3 cells, and the combined effect with an anti-EGFR antibody was analyzed (FIG. 16).
  • Cells were cultured in 30 nM brigatinib, 30 nM AP26113 analog, 100 nM AZD3463, 300 nM osimertinib in the presence or absence of 10 ⁇ g / ml cetuximab, and after 72 hours, cell viability was evaluated by CellTiter-Glo assay.
  • Bligatinib, AP26113 analog, AZD3463, and osmeltinib alone have an effect of reducing cell viability, but cetuximab alone has no effect of reducing cell viability at a concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • cetuximab alone was not observed at a concentration of 10 ⁇ g / ml, a stronger effect on cell viability was observed when used in combination with brigatinib, AP26113 analog, and AZD3463.
  • Ba / F3 cells expressing EGFR having a mutation of C797S / T790M / del19 were treated with brigatinib in the range of 0 to 1000 nM in the presence or absence of cetuximab, and EGFR and downstream signal transduction system Phosphorylation was analyzed by Western blotting (FIG. 16B).
  • a stronger signal suppression effect was seen compared to brigatinib alone.
  • a stronger signal suppression effect was observed in the signal transduction system downstream of EGFR.
  • nM brigatinib 100 nM AP26113 analogs in the culture medium of Ba / F3 cells expressing EGFR having a mutation of C797S / T790M / del19 in the presence or absence of 20 ⁇ g / ml panitumumab (Panitumumab, Takeda Pharmaceutical) Cells or 300 nM osmeltinib were added, cells were cultured, and cell viability was assessed 72 hours later by CellTiter-Glo assay.
  • panitumumab alone has no effect on cell viability, but when combined with brigatinib and AP26113 analogs, there is a significant decrease in cell viability. It was seen. Moreover, the combined use effect of panitumumab was not seen with respect to osimertinib (FIG. 17A).
  • panitumumab The effect of panitumumab was similarly examined on cells in which EGFR having a C797S / T790M / del19 mutation was expressed in PC9 cells. 300 nM brigatinib or 300 nM osimertinib was added to the culture solution, and the cells were cultured in the presence or absence of 20 ⁇ g / ml panitumumab, and the cell viability was similarly evaluated 72 hours later. Similar to Ba / F3 cells expressing the EGFR triple mutant, brigatinib showed a combined effect with panitumumab, but osimertinib did not show the combined effect (FIG. 17B).
  • panitumumab and brigatinib The effect of panitumumab and brigatinib on the EGFR signaling system in mice transplanted with PC9 expressing the triple mutant of EGFR was analyzed by Western blotting.
  • PC9 expressing a triple mutant of EGFR was transplanted into mice, brigatinib was administered by oral gavage once a day at 75 mg / kg, panitumumab was administered intraperitoneally at a dose of 0.5 mg / mouse twice a week, Eight days later, tumors were taken from two mice in each group and analyzed by Western blotting.
  • mice transplanted with PC9 expressing a triple mutant of EGFR the combined effect of brigatinib and anti-EGFR antibody was examined.
  • tumor volume reached 200-300 mm 3
  • solvent alone, brigatinib alone, panitumumab alone, brigatinib and cetuximab combination The tumor volume and survival rate were analyzed.
  • brigatinib is administered by oral gavage once a day at a dose of 75 mg / kg or 37.5 mg / kg
  • panitumumab is administered intraperitoneally twice a week at a dose of 0.5 mg / mouse
  • cetuximab is 1 mg / mouse.
  • the tumor volume and survival rate were analyzed over time (FIG. 18). It should be noted that administration of brigatinib at 37.5 mg / kg in mice corresponds to a dose slightly lower than that in humans.
  • panitumumab alone has a certain effect on tumor growth but does not provide a complete tumor suppression effect as compared with the solvent-administered group as a control.
  • brigatinib and panitumumab or cetuximab which is an anti-EGFR antibody, were administered in combination, not only a tumor growth effect was obtained, but also the result that the tumor gradually regressed was obtained (FIG. 18A).
  • the JFCR-163 cell line is a cell line established from the pleural effusion of a patient refractory to osimertinib at the Cancer Society, and has an EGFR triple mutation (L858R / T790M / C797S). JFCR-163 cells were transplanted into two Balb-c nu / nu mice in the same manner as described above, and after the tumor volume reached about 100 mm 3 , the mice were randomly divided into two groups, one of which was treated, The other was a control group to which only the solvent was administered.
  • brigatinib was orally administered once a day at a dose of 50 mg / kg
  • panitumumab was intraperitoneally administered once a week at a dose of 0.5 mg / kg.
  • an increase in tumor volume was observed in the control group to which only the solvent was administered, but no increase in tumor volume was observed in the group to which brigatinib and panitumumab were administered in combination.
  • the compound represented by the general formula (I) represented by brigatinib, the AP26113 analog, and AZD3463 is an EGFR-TKI resistant tumor against the EGFR mutant having a mutation in C797S. And has a growth-inhibiting effect. Furthermore, a stronger effect can be obtained by using in combination with an anti-EGFR antibody such as cetuximab or panitumumab. Therefore, in EGFR gene mutation-positive non-small cell lung cancer, it can be an effective therapeutic agent for a third generation EGFR-TKI resistant tumor for which there is currently no effective treatment.

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Abstract

ＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、及びＡＺＤ３４６３に代表される化合物を有効成分とする医薬が、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓに点突然変異を有する化学療法薬に耐性を獲得した非小細胞肺癌に有効であることを見出した。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体を併用することによって、腫瘍増殖に顕著な抑制効果を示す。第１世代の治療薬であるゲフィチニブ、第３世代の治療薬であるオシメルチニブに対して耐性を有する非小細胞肺癌に対して有効な治療薬となる。

Description

ＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性を獲得した肺癌の治療薬
　本発明は、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子変異を有する肺癌の治療において、ＥＧＦＲ-ＴＫＩ（ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）に対する耐性を獲得した癌の治療に関する。特に、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌の最初の治療薬として選択されるゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、又はアファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）に対して耐性を獲得した後、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）にも耐性を獲得した癌に対して奏功する治療薬に関する。
　本邦における肺癌の死亡率は、１９６０年には１０万対で男性で７．９人、女性で３．２人であったが、近年は急速に増加の一途をたどっている。国立がん研究センターから発表された２０１５年の肺癌死亡者予測数は７７，２００人で部位別の癌死亡で第１位であり、男性では５５，３００人で第１位、女性でも２１，９００人で第２位になっている。
　２００４年に大野、中村らによって報告された２０２０年の我が国での肺癌の１年間の新患者予測数は男性約９１，０００人、女性約３４，０００人であったが、前述の国立がんセンターからの発表ではすでに２０１５年時点で男性９０，７００人、女性４２，８００人の新患者数が推計されており（非特許文献１）、２０２０年の時点ではこの予測をさらに上回ることが危惧され、治療法の開発は大きな課題となっている。世界的に見ても肺癌による死亡者数は増加している。国際対がん連合（ＵＩＣＣ）の統計によれば、肺癌による死亡者数はがんの中でも最多となっており、がんによる全死亡のうち１／５に相当するといわれている。
　肺癌は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌の２つに大別され、非小細胞肺癌は肺癌全体の約８０－８５％、小細胞肺癌が約１０－１５％を占めている。切除不能の進行非小細胞肺癌では、根治照射が可能な場合には化学放射線治療が標準であり、根治的放射線照射不能IIIＢ期およびIV期の非小細胞肺癌の標準治療は化学療法である。１９９５年にシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＣＤＤＰ）と既存の抗がん剤を併用した化学療法群が、ｂｅｓｔ　ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ　ｃａｒｅ（ＢＳＣ）群と比べて生存期間中央値（ＭＳＴ：ｍｅｄｉａｎ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｍｅ）を６－８週、１年生存率を１５％改善したことが示された。その後に行われた、Ｅａｓｔｅｒｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）による４群比較第III相（ＥＣＯＧ１５９４）試験（非特許文献２）や、本邦におけるＦＡＣＳ（Ｆｏｕｒ　Ａｒｍｓ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｔｕｄｙ）試験（非特許文献３）などの結果により、プラチナ製剤および第３世代抗癌剤のいずれかの組み合わせが非小細胞肺癌に対する標準治療として確立した。さらに、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）（ＢＭＤＪ，ＰＡＲＡＭＯＵＮＴ試験（非特許文献４））やベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（ＥＣＯＧ４５９９試験（非特許文献５））といった非扁平上皮癌に対して有効な薬剤が開発されたことにより生存期間の延長が達成され、これらの薬剤が肺腺癌に対する治療の重要な位置を占めてきた。しかしながら、生存期間延長効果は、ペメトレキセドやベバシズマブの登場によって、前述のＥＣＯＧ試験やＦＡＣＳ試験において示された殺細胞性抗がん剤による生存期間延長効果の１年前後から、おおよそ半年から１年弱の上乗せが得られたものの、それ以上の進展は乏しく足踏み状態となっていた。
　一方で、ＥＧＦＲ－ＴＫＩの有効性が示されてきた。２００４年に非小細胞肺癌でのＥＧＦＲ遺伝子変異の存在が報告され、ＥＧＦＲ遺伝子変異の有無とＥＧＦＲ－ＴＫＩの効果が関連していることが示された（非特許文献６、７）。ＥＧＦＲ－ＴＫＩは、細胞内のＥＧＦＲチロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害することによりＥＧＦＲのシグナル伝達を阻害する薬剤で、本邦ではゲフィチニブ（製品名：Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））とエルロチニブ（製品名：Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、アファチニブ（製品名：Ｇｉｏｔｒｉｆ（登録商標））が承認されている。
　ＥＧＦＲ遺伝子変異は、チロシンキナーゼ領域であるエクソン１８－２１が大半を占め、エクソン１９の欠失変異が４８％、Ｌ８５８Ｒ（８５８番目のロイシンのアルギニンへの置換。以下、点突然変異はアミノ酸の位置、及び置換前後の配列で記載する。）が４３％を占め、その他Ｇ７１９Ｘや稀な変異が１５％程度を占めることが明らかにされている。エクソン１９の欠失変異は７４６－７５０のＥＬＲＥＡの５つのアミノ酸を中心とする部位の単純欠失変異が最も多いが、欠失アミノ酸の個数や、アミノ酸置換を伴うものなど、非常に多くのバリエーションを含んでいる（非特許文献８）。
　最初に開発が進んだＥＧＦＲ－ＴＫＩであるゲフィチニブは、幾つかの臨床試験を経て２次治療以後での腫瘍縮小効果がまず示された。しかし、しばしば劇的な効果を認める症例があることが知られていたものの、当初は真の効果予測因子は明らかではなかった。また、患者選択を行わない対象症例での第III相試験では有意な延命効果は示されなかった。
　しかし、ＥＧＦＲ－ＴＫＩの有効性が期待される臨床背景（非喫煙者、アジア人、腺癌）の症例に患者選択を行いゲフィチニブと、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ＣＢＤＣＡ）／パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ＰＴＸ）併用療法を比較する第III相試験であるＩＰＡＳＳ（Ｉｒｅｓｓａ　Ｐａｎ　Ａｓｉａ　Ｓｔｕｄｙ）が行われ、ゲフィチニブ群でＰＦＳ（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ、無増悪生存期間）が有意に延長することが示された（非特許文献９）。このＩＰＡＳＳ試験ではＥＧＦＲ遺伝子変異の有無で部分解析が行われており、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性群においては有意にＰＦＳが良好（ＨＲ（ハザード比）＝０．４８、ゲフィチニブ群　９．５か月、ＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸ群　６．３か月）であったが、変異陰性群では臨床背景で選択しているにもかかわらず、ゲフィチニブでのＰＦＳは不良（ＨＲ＝２．８５、ゲフィチニブ群　１．５か月、ＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸ群　５．５か月）であり、ＥＧＦＲ遺伝子変異が効果予測因子であることが示された。この後、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性症例の患者を選択して行った、１次治療におけるＥＧＦＲ－ＴＫＩとプラチナ併用療法の比較第III相試験が複数行われ、現在までに報告されているすべての試験においてＥＧＦＲ－ＴＫＩによるＰＦＳの有意な延長が示されている。
　その中で、本邦において行われたゲフィチニブとＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸの比較第III相試験であるＮＥＪ００２試験（非特許文献１０）やゲフィチニブとＣＤＤＰ＋ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ＤＴＸ）併用療法の比較第III相試験であるＷＪＴＯＧ３４０５試験（非特許文献１１）では、ゲフィチニブ群においてＰＦＳが有意に延長することが示されている（ＮＥＪ００２；ＨＲ＝０．３０、ゲフィチニブ群　１０．８ヶ月、ＣＢＤＣＡ＋ＰＴＸ群　５．４ヶ月、ＷＪＴＯＧ３４０５；ＨＲ＝０．５２０、ゲフィチニブ群　９．６ヶ月、ＣＤＤＰ＋ＤＴＸ群　６．６ヶ月）。これらの試験では、その後の報告において生存中央値がＷＪＴＯＧ３４０５で３４．８ヶ月、ＮＥＪ００２で２７．７ヶ月であることが示されており、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性患者にＥＧＦＲ－ＴＫＩを投与する重要性が広く示されることとなった。
　このＥＧＦＲ－ＴＫＩの発見を皮切りに肺腺癌においては、ＥＭＬ４－ＡＬＫ転座融合、ＲＥＴ転座融合、ＲＯＳ１転座融合、ＨＥＲ２変異、ＢＲＡＦ変異などといった治療ターゲットとなる癌原遺伝子が次々と発見され、対応する治療薬の開発がそれぞれの疾患を有する患者に大きなメリットをもたらしている。癌原遺伝子の有無を正確に検出することと、対応する適切な分子標的薬治療を行うことの有益性が、Ｋｒｉｓらによっても２０１４年に報告され、いまや肺癌治療において必須の領域となった（非特許文献１２）。
　このように分子標的薬が臨床にもたらしたインパクトは代えがたいものであるが、治療効果は開始早期にいかに大きくともおおよそ１年～数年程度しか持続せず、ほぼすべての症例で獲得耐性が出現することで病状が再燃する。ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌に対する第１世代薬であるゲフィチニブやエルロチニブ投与後の獲得耐性の機序は研究が進んでいる。非特許文献１３によれば、おおよそ６０％前後がゲートキーパー変異といわれる阻害剤の結合部位に生じる変異であり、ＥＧＦＲタンパク質のＡＴＰ結合部位内に存在する７９０番目のスレオニンがメチオニンに置換することで阻害薬のＡＴＰ結合阻害能が低下するものであることが明らかになっている。当初、ゲフィチニブやエルロチニブ耐性例に対しての治療開発はさまざまな臨床試験において複数行われたが、いずれも十分に有益な治療効果を示すことができず、唯一奏効率２９％が得られたアファチニブとセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）の併用療法も有害事象が強く臨床現場に応用されていない（非特許文献１４）。
　次いでＴ７９０Ｍ陽性ＥＧＦＲを標的とした共有結合型ＥＧＦＲ－ＴＫＩが相次いで開発が開始された。最も開発が先行していたオシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１、製品名：Ｔａｇｒｉｓｓｏ（登録商標））は２０１４年ＡＳＣＯ　ａｎｎｕａｌ　ｍｅｅｔｉｎｇにて第１／２相試験の結果が報告された（非特許文献１５、１６）のを皮切りに、Ｔ７９０Ｍ陽性ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌での良好な治療成績が次々と発表され、２０１５年１１月には米国ＦＤＡによって承認されており、２０１６年中には日本でも承認され、保険適用されることとなった。
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　オシメルチニブの臨床への登場で、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌の治療方針としてＴＫＩの重要性がさらに増すことが確実であると考えられる。しかし、２０１５年には良好な治療効果と同時にその耐性機構もすでに報告されている。オシメルチニブのＴ７９０Ｍ陽性ＥＧＦＲ肺癌を対象とした臨床試験症例において、オシメルチニブ耐性となった患者の血漿中ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡからはＣ７９７Ｓ変異が検出された（非特許文献１７）。他の患者からは、それ以外のパターンとしてＴ７９０Ｍ変異の消失による異なる３種類の耐性が出現したことが報告され（非特許文献１８、１９）、これを裏付けるような報告が他の第３世代ＥＧＦＲ－ＴＫＩであるＣＯ－１６８６の臨床試験で得られた知見からも見て取れる。
　Ｔ７９０Ｍ消失とｂｙｐａｓｓ　ｐａｔｈｗａｙ依存の耐性機構については、その性質から克服法として併用療法等の想定が可能であるが、Ｃ７９７Ｓ変異の出現については現時点では有効な対策が明確に示されていない。Ｎｉｅｄｅｒｓｔらによる、Ｃ７９７Ｓの出現がＴ７９０Ｍと同一の遺伝子上（ｃｉｓ）か、対立遺伝子上（ｔｒａｎｓ）かに関する研究によれば、ｔｒａｎｓの場合には第１世代ＥＧＦＲ－ＴＫＩ（ゲフィチニブやエルロチニブ）と第３世代ＥＧＦＲ－ＴＫＩ（オシメルチニブなど）の併用が有効であること、ｃｉｓの場合には現存するＴＫＩでは全く無効であることが示唆されていて（非特許文献２０）、特にｃｉｓの克服困難が予想される。また、Ｔ７９０ＭとＣ７９７Ｓがｔｒａｎｓに出現するということが、臨床において再現されるかどうかは現在のところ明らかではない。
　Ｃ７９７Ｓ変異出現による獲得耐性は、第３世代耐性症例の総数自体が十分蓄積されていないということを差し引く必要はあるものの、２０１５年ＷＣＬＣ（Ｗｏｒｌｄ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ）において報告された頻度を参考にすれば、肺癌全体の４－５％に相当することが推量される。その頻度は、ＡＬＫ陽性肺癌症例とおおよそ同程度であり一定の臨床上の比重を占めるといえる。したがって、この集団に対する治療法を確立することは臨床上重要な課題である。
　最近、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、及びＣ７９７Ｓの変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して、ＥＡＩ０４５がアロステリック阻害剤として有効であることが明らかとなった。ＥＡＩ０４５は、抗ＥＧＦＲ抗体医薬であるセツキシマブと併用投与することによって、マウスモデルにおいて顕著な腫瘍増殖に対する阻害効果があることが示されている（非特許文献２１）。しかしながら、ＥＡＩ０４５は開発段階の化合物であり、すぐに実臨床で使用できるわけではない。また、ＥＧＦＲ変異陽性肺癌の約半数を占めるエクソン１９欠失型変異型には有効ではない。したがって、Ｃ７９７Ｓ変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して有効な治療薬が必要であるという現状には変わりがない。
　本発明は、以下の医薬、医薬の有効性を検査する方法、及び検査キットに関する。
（１）一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （２）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である（１）記載のＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
（３）前記ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位の変異を有する癌である（１）又は（２）記載の非小細胞肺癌治療薬。
（４）前記非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位、及び７９０位に変異を有する癌である（１）～（３）いずれか１つに記載の非小細胞肺癌治療薬。
（５）抗ＥＧＦＲ抗体と併用投与される（１）～（４）いずれか１つ記載の非小細胞肺癌治療薬。
（６）ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌において、ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出する一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性を検査する方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （７）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である（６）に記載の医薬の有効性を検査する方法。
（８）前記ＥＧＦＲの７９７位の変異の検出が、核酸、及び／又はタンパク質を検出するものであることを特徴とする（６）又は（７）記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
（９）前記核酸の検出が、ＰＣＲによるものであり、前記タンパク質の検出が、抗体によるものである（８）記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
（１０）ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体を含む一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性検査キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （１１）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である（１０）記載の医薬の有効性検査キット。
（１２）ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異、Ｌ８５８Ｒの変異、及びＴ７９０Ｍの変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体をさらに含む（１０）又は（１１）に記載する医薬の有効性検査キット。
　また、以下の非小細胞肺癌の治療方法に関する。
（１３）ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌の治療方法であって、ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出し、下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬と、抗ＥＧＦＲ抗体とを併用することを特徴とする治療方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （１４）前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である治療方法。
（１５）前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、又はネシツムマブである（１３）又は（１４）記載の非小細胞肺癌治療法。
　本明細書に記載の化合物により、オシメルチニブに代表される第３世代ＥＧＦＲ-ＴＫＩ耐性となったＥＧＦＲの７９７位に変異を生じた癌に対して治療を行うことができる。すなわち、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌は、まず、ゲフィチニブ、エルロチニブ、又はアファチニブによる治療が行われる。これら医薬による治療によって、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異により不応となった場合は、オシメルチニブ等第３世代のＥＧＦＲ－ＴＫＩにより治療が行われる。さらに、Ｃ７９７Ｓの変異によりオシメルチニブ等に不応となった場合、すなわち、癌の原因となるＥＧＦＲのエクソン１９の欠失、あるいはＬ８５８Ｒの変異、第２の変異であるＴ７９０Ｍに加えて、第３の変異であるＣ７９７Ｓの変異を獲得した三重変異体ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌に対し、本発明の治療薬を使用することにより有用な治療効果を得ることが可能となった。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体と併用することによって、より強い効果を得ることができる。特に、抗ＥＧＦＲ抗体との併用は、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験において、癌の縮小効果が認められ、治療薬に対して耐性を獲得した肺癌の治療に効果が期待される。
ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異体を発現する細胞株の増殖を阻害する薬剤のスクリーニング結果を示す図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのエクソン１９欠失変異体発現細胞に対するゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びブリガチニブ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞でのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞でのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異体発現細胞に対するゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びブリガチニブの細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異体発現細胞でのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記化合物によるＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記化合物によるＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記化合物によるＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＡＬＫ阻害剤の構造を示す図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのエクソン１９欠失変異体発現細胞に対するＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３、ＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞に対する上記ＡＬＫ阻害剤の細胞生存率に対する効果を示す図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とするＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞でのＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞での上記ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞での上記ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ヒト肺癌細胞株ＰＣ９（ＥＧＦＲエクソン１９欠失変異体）に対するゲフィチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブの細胞生存率に対する効果を示す図。 ＰＣ９を親株とするＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＰＣ９を親株とする三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対する上記化合物の細胞生存率に対する効果を示す図。 ＰＣ９細胞での種々のチロシンキナーゼ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＰＣ９を親株とするＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞での種々のチロシンキナーゼ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞での種々のチロシンキナーゼ阻害剤のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＰＣ９、及びその変異体におけるＡＺＤ３４６３のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＥＧＦＲの変異のない細胞株に対するアファチニブの効果を示す図。 ＥＧＦＲの変異のない細胞株に対するオシメルチニブの効果を示す図。 ＥＧＦＲの変異のない細胞株に対するブリガチニブの効果を示す図。 アファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブの各細胞株に対する効果をまとめた図。 ＥＧＦＲの三重変異体Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異を有するＢａ／Ｆ３を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。 ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異を有するＢａ／Ｆ３を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。 ＰＣ９を親株とするＴ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。 上記マウスの生存曲線を示す図。 マウスに移植した上記欠失変異体発現細胞に対するブリガチニブ、及びブリガチニブとセツキシマブ併用処置のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブの効果を示す図。 マウスに移植した上記三重変異体発現細胞に対するオシメルチニブ、ブリガチニブ処置のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するセツキシマブとチロシンキナーゼ阻害剤の併用効果を検討した図。 上記三重変異体細胞株のＥＧＦＲシグナル伝達系に対するブリガチニブ、セツキシマブの効果を解析した図。 上記三重変異体細胞株を移植したマウスに対するブリガチニブ、オシメルチニブ、セツキシマブ、及びブリガチニブとセツキシマブ併用投与の効果を示す図。 マウスに移植した上記三重変異体発現細胞に対するブリガチニブ、オシメルチニブ、セツキシマブ、ブリガチニブとセツキシマブの併用処置のＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を解析した図。 上記三重変異体発現細胞を移植したマウスの生存曲線を示す図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するセツキシマブとチロシンキナーゼ阻害剤の併用効果を検討した図。 上記三重変異体細胞株のＥＧＦＲシグナル伝達系に対するブリガチニブ、セツキシマブの効果を解析した図。 Ｂａ／Ｆ３を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するパニツムマブとチロシンキナーゼ阻害剤の併用効果を検討した図。 ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞の細胞生存率に対するパニツムマブとブリガチニブ、又はオシメルチニブとの併用効果を検討した図。 ＰＣ９を親株とする三重変異体発現細胞を移植したマウスにおけるパニツムマブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系に対する効果を解析した図。 ＰＣ９を親株とする三重変異発体現細胞を移植したマウスに対するブリガチニブ、パニツムマブ、及びその併用投与の効果を示す図。 上記マウスの生存曲線を示す図。 ＪＦＣＲ－１６３（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ三重変異株）を移植したマウスに対するブリガチニブ、パニツムマブの併用投与の効果を示す図。
　以下データを示しながら、Ｃ７９７Ｓの点突然変異を有する非小細胞肺癌であって、ゲフィチニブに代表される第１世代のＥＧＦＲ－ＴＫＩ、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１）に代表される第３世代のＥＧＦＲ－ＴＫＩに耐性を獲得した癌に対して効果を奏する化合物、該化合物の有効性を検査する方法、及び治療方法について説明する。
　本発明者らはＡＬＫ阻害剤ブリガチニブが、オシメルチニブで治療した後に出現するＣ７９７Ｓの点突然変異を有する細胞に対して増殖抑制を引き起こすことを見出した。本発明者らは、オシメルチニブに対して耐性を獲得した細胞がＣ７９７Ｓの変異を有することに着目し、Ｃ７９７Ｓ、Ｔ７９０Ｍの変異を併せもつ細胞株を用いて多数の化合物をスクリーニングした。その結果、下記一般式で示されるＡＬＫ阻害剤が細胞増殖を抑制することを見出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　この細胞増殖抑制は、ＥＧＦＲの活性を低下させることによって誘導されることから、第３世代のＥＧＦＲ-ＴＫＩに対して耐性を有する肺癌に対して有効な医薬となる。また、上記化合物を有効成分とした医薬は、ここで検討したＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌だけではなく、ＥＧＦＲに同様の突然変異Ｃ７９７Ｓを有する腫瘍についても同様に効果を奏するものと考えられる。
　さらに、これら化合物と抗ＥＧＦＲ抗体と併用することによって、より強い腫瘍縮小効果が得られることが明らかとなった。抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ活性を阻害するものであればどのようなものを用いてもよい。このような抗体としては、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により非小細胞肺癌（扁平上皮肺癌）治療薬として承認されたネシツムマブ、現在結腸・直腸癌などの治療に用いられているセツキシマブ、パニツムマブが例示されるがこれに限ることなく、ＥＧＦＲ活性を阻害する抗体であればどのような抗体であってもよい。現在使用されている抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、リガンドであるＥＧＦとの結合を阻害すると考えられている（非特許文献２２－２４）。治療に用いる抗体は、ＥＧＦＲ活性を阻害することができれば、これら抗体とエピトープが重複するような抗体であってもよいし、異なるエピトープを認識していてもよい。
　以下の実施例で示すように、上記化合物を有効成分とする治療薬が有効な症例は、ＥＧＦＲの７９７位にシステインからセリンへの点突然変異が生じている症例である。したがって、これら医薬の有効性を確認するための検査は、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓの変異を検出することができれば、どのような方法であってもよい。
　遺伝子の変異を検出する方法としては、ＰＣＲをベースとした検査方法や、ダイレクトシークエンス法などＥＧＦＲの７９７位の配列を確認することができればどのような方法であってもよい。また、ＥＧＦＲタンパク質の変異を検出するのであれば、Ｃ７９７Ｓの変異を特異的に認識する抗体を用いて、組織染色、ＥＬＩＳＡ等の方法により変異を検出すればよい。検査する対象としては、腫瘍組織の他、胸水をはじめとする体腔液、喀痰、吸引痰、血液など腫瘍細胞が含まれているものであればどのようなものを用いてもよい。
　以下、データを示しながら本発明について説明する。
１．ブリガチニブのＥＧＦＲ変異体に対する効果
≪ＥＧＦＲ変異体、及び変異体発現細胞株の作製≫
　前述のように、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌は、エクソン１９の欠失、あるいはＬ８５８Ｒの変異がほとんどであり、併せて全体の８０％以上を占める。そこで、エクソン１９の欠失変異、Ｌ８５８Ｒ点突然変異を有する細胞株を作製して解析を行った。
　野生型ＥＧＦＲはＡ５４９細胞株のｃＤＮＡより得た。ＥＧＦＲ変異体であるエクソン１９欠失変異体はＨＣＣ８２７細胞株、Ｌ８５８Ｒ変異体は肺癌標本よりＰＣＲによって増幅し、夫々ｐＥＮＴＲベクター（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）に活性型の完全長ＥＧＦＲを含むようにクローニングした。
　Ｔ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓの変異は、以下のプライマーを用いて、夫々単一の変異、あるいは二重変異として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（アジレント社製）によって各ＥＧＦＲに導入した。
Ｔ７９０Ｍ　Ｆ：ＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣ（配列番号１）
Ｔ７９０Ｍ　Ｒ：ＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧ（配列番号２）
Ｃ７９７Ｓ　Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴＡ（配列番号３）
Ｃ７９７Ｓ　Ｒ：ＴＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧ（配列番号４）
　得られたＥＧＦＲ変異体を、レンチウイルスベクター、ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＤＥＳＴ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入し各ＥＧＦＲ変異体を構築した。ＥＧＦＲ変異体は、Ｖｉｒａ-Ｐｏｗｅｒ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によってマウスプロＢ細胞Ｂａ／Ｆ３に導入した。
≪ＥＧＦＲ変異体発現細胞に対するチロシンキナーゼ阻害剤の効果≫
　Ｂａ／Ｆ３細胞に、肺癌と同様にＥＧＦＲのエクソン１９に欠失変異を有し、さらにＣ７９７Ｓの変異を導入した細胞株（ＢａＦ３　Ｃ７９７Ｓ／ｄｅｌ１９）、また、第１世代の医薬の耐性として出現する点突然変異である７９０位のスレオニンからメチオニンへの変異であるＴ７９０Ｍを導入した変異株（ＢａＦ３　Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）、第３世代の医薬の耐性として出現する点突然変異である７９７位のシステインがセリンに変異したＣ７９７Ｓ変異をさらに導入した変異株（ＢａＦ３　Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）を用いて、Ｃ７９７Ｓ変異を有する細胞株の増殖を阻害する薬剤のスクリーニングを行った。
　上記４種のＢａ／Ｆ３細胞変異体株に３０種のチロシンキナーゼ阻害剤を１００ｎＭの濃度になるように添加してその効果を解析した。７２時間後に、細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイ（登録商標、プロメガ社製）により解析した。用いたチロシンキナーゼ阻害剤とその入手先を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　ＤＭＳＯを添加したものをコントロールとした相対的な生存率を図１に示す。ブリガチニブとポナチニブ（ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）のみが、表１に示す解析に用いた阻害剤のうち、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９の欠失変異体に対して１００ｎＭの濃度で５０％程度の阻害効果を示した。しかしながら、ポナチニブは親株であるＢａ／Ｆ３に対しても、同程度のＩＣ５０であったことから、Ｃ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して特異的に増殖阻害効果を有するものではないと考えられる。
≪Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／エクソン１９欠失変異体発現細胞に対するブリガチニブの効果≫
　上記のスクリーニングの結果、ブリガチニブがＣ７９７Ｓ変異体発現細胞に対して増殖抑制効果を有することが明らかとなったので、ゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、本発明者らがＣ７９７Ｓ変異に対して有効であることを見出したブリガチニブの濃度を変えて処理を行い細胞の生存率を求めた。
　２０００個のＢａ／Ｆ３変異体細胞を９６穴プレートに播種し、各細胞を０．３ｎＭ～１００００ｎＭのゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブで処理し、７２時間後に細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより解析した。
　図２Ａ～Ｄに薬剤処理による各変異体細胞株の生存率を、表２にＩＣ５０を示す。ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異（ｄｅｌ１９）に対しては、アファチニブ、オシメルチニブ、ゲフィチニブが細胞増殖抑制効果を示した（図２Ａ）。また、エクソン１９の変異に加えて、Ｔ７９０Ｍの変異（Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）を有するＢａ／Ｆ３は、オシメルチニブにＩＣ５０６．７ｎＭと高い反応性を示したが、ゲフィチニブに対してはＩＣ５０５６０３ｎＭと強い耐性を示した（表２）。
　ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異に加えて、Ｃ７９７Ｓの点突然変異を有する細胞株（Ｃ７９７Ｓ／ｄｅｌ１９）に対しては、ゲフィチニブ、アファチニブが細胞増殖抑制を示した（図２Ｃ）。
　一方、ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異に加えて、７９７位、７９０位の２か所に点突然変異を有する三重変異体発現細胞株（Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）に対しては、ゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブはいずれも、細胞を高濃度で処理しても増殖を抑制しないのに対し、ブリガチニブはＩＣ５０６７．２ｎＭの低濃度で細胞増殖を抑制した（図２Ｄ、表２）。すなわち、ブリガチニブは、エクソン１９の欠失変異、Ｔ７９０Ｍの変異に加えて、Ｃ７９７Ｓの変異を有する細胞に対して有効に作用する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　次に、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞株を１０、１００、１０００ｎＭのアファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブで処理した際のＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した（図２Ｅ、Ｆ）。
　抗ｐｈｏｓｐｈｏ-ＥＧＦＲ抗体（Ｔｙｒ１０６８、Ａｂｃａｍ社製、ａｂ５６４４）、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃４２６７）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃４０６０）、抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃４６９１）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ-ＥＲＫ抗体（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃９１０１）、抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃９１０２）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓ６抗体（Ｓｅｒ２４０／２４４、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃５３６４）、抗Ｓ６抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃２２１７）、抗β-アクチン抗体（シグマ－アルドリッチ社製、Ａ５２２８）を用いて、各タンパク質の検出を行った。
　Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞を用いた結果を図２Ｅに、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞を用いた結果を図２Ｆに示す。オシメルチニブは、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９　Ｂａ／Ｆ３細胞ではＥＧＦＲのリン酸化を強く抑制しているものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９　Ｂａ／Ｆ３細胞では全くＥＧＦＲのリン酸化を抑制しなかった。また、アファチニブは、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９　Ｂａ／Ｆ３細胞では、１００ｎＭで処理した場合には、ＥＧＦＲのリン酸化の抑制が認められるものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９　Ｂａ／Ｆ３細胞では全くリン酸化の抑制が認められなかった。これに対し、ブリガチニブはいずれの細胞でもＥＧＦＲ、及び下流のシグナルのリン酸化を抑制している。特に、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９細胞では、ＥＧＦＲ及び下流のシグナル伝達系であるＡｋｔ、ＥＲＫ、Ｓ６のリン酸化の減少が認められるのはブリガチニブのみであった。なお、ここでは示さないが、ゲフィチニブはＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化に対して、アファチニブと同様の効果を示した。
≪Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞におけるブリガチニブの効果≫
　肺癌においてＥＧＦＲエクソン１９内のアミノ酸欠失変異とともに多く見られる変異として、ＥＧＦＲの８５８位のアミノ酸であるロイシンがアルギニンへと置換された点突然変異Ｌ８５８Ｒがある。そこで、Ｌ８５８Ｒの変異に対する各薬剤の効果について解析を行った。
　８５８位のロイシンをアルギニンに変異させたＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３　Ｌ８５８Ｒ）、Ｔ７９０Ｍの変異とＬ８５８Ｒの変異の重複変異を有するＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３　Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ）、Ｃ７９７ＳとＬ８５８Ｒの重複変異を有するＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３　Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ）、上記３つの変異を有するＢａ／Ｆ３（ＢａＦ３　Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ）を用いて、ゲフィチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブの効果を解析した。上記と同様にしてＢａ／Ｆ３変異株を作製し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより細胞の生存率を求めた。結果を図３、表３に示す。
　アファチニブ、ゲフィチニブ、オシメルチニブは、Ｌ８５８Ｒの点突然変異を有する細胞の増殖を阻害する。特に、アファチニブは、Ｌ８５８Ｒ変異体株に対して非常に強く細胞増殖抑制効果が見られた。一方、ブリガチニブはＬ８５８Ｒの点突然変異を有する細胞に対しては、細胞増殖抑制効果は低い（図３Ａ）。また、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒの重複変異を有する細胞に対しては、オシメルチニブは強い細胞増殖抑制効果を奏するが（ＩＣ５０　５．８ｎＭ）、アファチニブはＩＣ５０が３９．２ｎＭ、ゲフィチニブは、ＩＣ５０が５９２２ｎＭとほとんど効果を示さない。ブリガチニブは、ゲフィチニブと比較すると有意な細胞増殖抑制効果を示すが、その効果はオシメルチニブに比べて非常に弱い（図３Ｂ）。また、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒの重複変異に対して効果を有するのはアファチニブ（ＩＣ５０　７．７ｎＭ）、ゲフィチニブのみであり（ＩＣ５０　１５．５ｎＭ）、オシメルチニブはほとんど細胞増殖抑制効果を示さず、ブリガチニブはオシメルチニブと比較すると有意な細胞増殖抑制効果を示すが、アファチニブ、ゲフィチニブと比較するとその効果は弱い（図３Ｃ）。一方、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒの３つの変異を有するＢａ／Ｆ３細胞に対しては、ブリガチニブは顕著な細胞増殖抑制効果を有するが（ＩＣ５０　１６１．５ｎＭ）、オシメルチニブ（ＩＣ５０　１１７１ｎＭ）、アファチニブ（ＩＣ５０　８０４．２ｎＭ）、ゲフィチニブ（ＩＣ５０　＞１００００ｎＭ）はほとんど効果を示さない（図３Ｄ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　次に、Ｌ８５８Ｒの変異を有する上記４種の細胞株を用いてＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化を解析した（図４Ａ～Ｄ）。アファチニブは、Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、ＥＧＦＲ及び下流のシグナル伝達系のリン酸化を強く抑制し、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞ではそれよりは幾分弱い効果、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒでは非常に弱い抑制効果が認められるものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、ほとんど抑制効果が認められなかった。
　オシメルチニブは、Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞ではアファチニブより弱いもののシグナル伝達系のリン酸化に対して抑制効果が認められ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、最も強い抑制効果が認められる。一方、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、オシメルチニブは、ほとんどリン酸化抑制効果が認められなかった。
　ブリガチニブは、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞でもＥＧＦＲシグナル伝達系に対して一定のリン酸化抑制効果が認められた。さらに、ブリガチニブは、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ変異体発現細胞では、唯一ＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を抑制する効果が認められた化合物であった。この結果は、図３で示した細胞生存率の結果と非常に良く一致しており、ブリガチニブはＥＧＦＲシグナル伝達系の抑制を介して細胞増殖を抑制しているものと考えられる。
　以上の結果から、ブリガチニブはＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍの重複した点突然変異を有する活性型ＥＧＦＲに対して細胞増殖抑制効果を備えているものと考えられる。かつブリガチニブは、癌の原因となった活性型ＥＧＦＲの変異がエクソン１９の欠失変異であっても、点突然変異Ｌ８５８Ｒであっても同じように細胞増殖を抑制する効果がある。なお、ここでは示さないが、ゲフィチニブはＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化に対して、アファチニブより弱いものの同様の効果を示した。
２．ＡＬＫ阻害剤のＥＧＦＲ変異体に対する効果
≪三重変異体に効果を奏する他のＡＬＫ阻害剤の探索≫
　ブリガチニブはＡＬＫ阻害剤であることから、他のＡＬＫ阻害剤が、ブリガチニブと同様の効果を有するか解析した。解析したＡＬＫ阻害剤は、ブリガチニブに加えてその類縁体であるＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３、ＴＡＥ６８４、ＬＤＫ３７８（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、セリチニブ）、ＡＳＰ３０２６の６つの化合物である（図５）。
　まず、Ｂａ／Ｆ３にエクソン１９の欠失変異体（ｄｅｌ１９）、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９（Ｔ／Ｄ）、Ｃ７９７Ｓ／ｄｅｌ１９（Ｃ／Ｄ）、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９（Ｃ／Ｔ／Ｄ）変異体を導入した細胞株を用いて細胞生存率の解析を行った。結果を図６Ａ～Ｄ、表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、いずれの変異を有するＥＧＦＲ変異体を導入したＢａ／Ｆ３に対しても、強い細胞増殖抑制効果を示した。特にブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体は、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体に対して、夫々ＩＣ５０６７．２ｎＭ、ＩＣ５０５９．１ｎＭと非常に強い増殖抑制効果を示した。
　次に、Ｂａ／Ｆ３にＬ８５８Ｒ（Ｌ８５８Ｒ）、Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ（Ｔ/Ｌ）、Ｃ７９７Ｓ／Ｌ８５８Ｒ（Ｃ／Ｌ）、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ（Ｃ／Ｔ／Ｌ）の変異体を導入した細胞株についても細胞生存率の解析を行った（図７Ａ～Ｄ、表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、いずれの変異を有するＥＧＦＲ変異体を導入したＢａ／Ｆ３に対しても、強い細胞増殖抑制効果を示した。ブリガチニブは、Ｌ８５８Ｒをベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞では、Ｃ７９７Ｓの変異とＴ７９０Ｍの変異を併せもつ場合に強い細胞増殖抑制効果が見られた（図７Ｄ）。一方、エクソン１９の欠失変異をベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞では、Ｔ７９０Ｍ変異のみの場合には細胞増殖抑制効果がやや低下するが、Ｃ７９７Ｓ変異単独またはＣ７９７ＳとＴ７９０Ｍの両方の変異（三重変異）があれば高い細胞増殖抑制効果を有する点で変異体による差が見られた（図６Ｂ～Ｄ）。しかしながら、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、Ｔ７９０Ｍに加えて、Ｃ７９７Ｓの変異を有するＥＧＦＲ変異細胞株に、高い細胞増殖抑制効果を有するという点では同様の効果を奏している。
　また、同じＡＬＫ阻害剤であってもＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６はＥＧＦＲ変異体発現細胞に対する細胞増殖抑制効果はほとんど見られなかった。図５に示すブリガチニブをはじめとする６つの化合物は基本骨格が同じであり、非常に類似した化合物である。しかしながら、ＥＧＦＲ変異体に対する効果は異なることが明らかとなった。
　ＡＬＫ阻害剤の解析結果から、下記一般式（Ｉ）で表される化合物がＣ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲに対して効果を有すると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 これらの化合物であれば、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３と同等の骨格を有するので、ＥＧＦＲ変異体に対してブリガチニブ等と同様の効果を示すものと考えられる。
　次に、各化合物のＥＧＦＲ、及びＥＧＦＲの下流のシグナル伝達系のリン酸化に対する抑制効果を解析した（図８Ａ～Ｄ）。Ｂａ/Ｆ３を親株とするエクソン１９の欠失変異をベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞（図８Ａ、Ｂ）、Ｌ８５８Ｒの変異をベースに有するＥＧＦＲ変異体発現細胞（図８Ｃ、Ｄ）を用いて解析を行った。細胞生存率に対する効果と同様に、ブリガチニブ、及びその類縁体であるＡＰ２６１１３類縁体はＥＧＦＲシグナル伝達系に対して阻害活性を示す。特にＣ７９７Ｓ、Ｔ７９０Ｍの変異を併せ持つ場合には、強い抑制効果を示す。一方、ＴＡＥ６８４、セリチニブ、ＡＳＰ３０２６は、１μＭの高濃度で処理してもほとんどＥＧＦＲシグナル伝達系に対する抑制効果を示さなかった。
≪ヒト肺癌由来細胞株ＰＣ９を用いた解析≫
　ここまで、解析に用いてきたＢａ／Ｆ３細胞は、マウスのｐｒｏＢ細胞由来の株であることから、ヒト肺癌由来細胞株でも同様の結果を得ることができるかＰＣ９を用いて解析を行った。ＰＣ９は、ＥＧＦＲのエクソン１９に欠失変異を有するヒト非小細胞肺癌由来の細胞株である。ＰＣ９を用いて、ＥＧＦＲ変異体発現細胞を同様に作製し、これら化合物の効果の解析を行った（図９）。親株であるＰＣ９（ｄｅｌ１９）に、エクソン１９の欠失に加えて、さらにＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍの変異を有するＥＧＦＲを発現する細胞を作製し、ゲフィチニブ、オシメルチニブ、ブリガチニブを０．３ｎＭ～１００００ｎＭまで濃度を変えて添加し、７２時間後の細胞の生存率を上記と同様にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイにより求めた。
　Ｂａ／Ｆ３細胞株で作製したＥＧＦＲ変異体と同様に、親株のＰＣ９（エクソン１９欠失変異）に対しては、ゲフィチニブ、オシメルチニブは細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ブリガチニブは非常に弱い細胞増殖抑制効果しか示さなかった（図９Ａ）。ＰＣ９にＴ７９０Ｍ変異を導入した細胞株（Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）では、オシメルチニブは非常に強い細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ブリガチニブは弱い細胞増殖抑制効果を示し、ゲフィチニブはほとんど細胞増殖抑制効果を示さなかった（図９Ｂ）。さらに、Ｃ７９７Ｓの変異を有する三重変異体（Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９）に対しては、ブリガチニブは細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ゲフィチニブ、オシメルチニブは高濃度で処理してもほとんど細胞増殖抑制効果を示さなかった（図９Ｃ）。
　次に、ＰＣ９、及びＰＣ９を親株とする細胞株を種々のチロシンキナーゼ阻害剤で処理し、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す（図１０）。親株であるＰＣ９において、アファチニブは非常に強く、オシメルチニブ、ゲフィチニブもＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化を強く抑制した。一方、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体はＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化を抑制する効果を示すもののアファチニブと比較するとその効果は弱いものであった（図１０Ａ）。
　ＰＣ９にＴ７９０Ｍを導入した細胞株では、オシメルチニブ、アファチニブ、ブリガチニブの順でＥＧＦＲのリン酸化、及びその下流のシグナル伝達系を抑制する効果が見られた。また、ＡＰ２６１１３類縁体は、ブリガチニブと同等の抑制効果を示したが、ゲフィチニブはほとんどリン酸化抑制効果を示さなかった（図１０Ｂ）。
　ＰＣ９の三重変異体に対しては、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体は、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化に対する抑制効果を示すのに対し、アファチニブ、オシメルチニブ、ゲフィチニブはいずれもＥＧＦＲのリン酸化に対する抑制効果を示さなかった（図１０Ｃ）。さらに、ＡＺＤ３４６３についても、これら変異体に対する効果を解析した（図１０Ｄ）。ＡＺＤ３４６３もブリガチニブやＡＰ２６１１３類縁体と同様に、Ｃ７９７Ｓに変異を有するＰＣ９の三重変異体発現細胞において、ＥＧＦＲシグナル伝達系のリン酸化を抑制する効果があった。また、ＡＺＤ３４６３は、親株であるＰＣ９、さらに、Ｔ７９０Ｍ変異を導入したＥＧＦＲ変異体発現細胞でも、ＥＧＦＲ及びその下流のシグナル伝達系に対してリン酸化を抑制する効果が見られた。
　以上の結果から、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３は、Ｂａ／Ｆ３で得られた結果と同様の効果をヒト肺癌細胞であるＰＣ９でも奏することが示された。
≪野生型ＥＧＦＲ発現細胞におけるチロシンキナーゼ阻害剤の効果≫
　ブリガチニブの細胞増殖に対する効果をＥＧＦＲの点突然変異や欠失変異以外の変異を有する細胞株を用いて解析した。用いた細胞株はＥＧＦＲが増幅しているＡ４３１、Ｋ－ｒａｓに変異を有するＡ５４９、Ｈ４６０を用いて解析を行った。Ａ４３１はヒト類上皮細胞癌、Ａ５４９、Ｈ４６０はヒト肺癌由来の細胞株である。なお、ＥＧＦＲについては、Ａ４３１は増幅しているものの変異はなく、Ａ５４９、Ｈ４６０についてもＥＧＦＲには変異は認められない。
　アファチニブ、オシメルチニブはＥＧＦＲが増幅しているＡ４３１に対しては細胞増殖を抑制する。また、Ｋ－ｒａｓに変異のある細胞株では、アファチニブがＡ５４９に対して弱い細胞増殖抑制効果を示すものの、他はほとんど細胞増殖に対して抑制効果を示さない。一方、ブリガチニブはいずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制効果を示さなかった。これはブリガチニブが、野生型ＥＧＦＲに対しては細胞増殖を抑制しないこと、すなわち癌細胞のみを標的とし、正常細胞の増殖を抑制しないことを示している。
３．ブリガチニブのｉｎ　ｖｉｖｏにおける効果
≪ＥＧＦＲ変異体を発現するＢａ／Ｆ３を移植したマウスを用いた検討≫
　培養細胞系を用いた実験で示したＣ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲに対するブリガチニブの効果が、ｉｎ　ｖｉｖｏでも同様に生じるか解析を行った。
　Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体、又はＴ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体を発現する２×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞を５０μｌのＨＢＳＳに懸濁し、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。腫瘍細胞の増殖は、週２回、キャリパーで腫瘍の幅と長さを測定し、堆積を計算によって求めた（０．５×長さ×幅×幅（ｍｍ３））。マウスは、腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達した後、溶媒のみ、５０ｍｇ／ｋｇ　オシメルチニブ、又は７５ｍｇ／ｋｇ　ブリガチニブの３つの群にランダムに分け、１日１回、強制経口投与を行った。投与開始日の腫瘍容積を１として投与後の腫瘍容積の変化を算出した。図１２ＡにＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体発現細胞、図１２ＢにＴ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９変異体発現細胞を移植した結果を示す。
　培養細胞を用いた実験結果と同様に、ブリガチニブは、Ｃ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍ変異を併せ持つＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対しては強い増殖抑制効果を有していた（図１２Ａ）。また、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対しても増殖抑制効果が認められた（図１２Ｂ）。オシメルチニブは、Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対しては効果を有するものの、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９に対してはほとんど抑制効果を示さなかった。
　以上の結果から、ブリガチニブは培養細胞だけではなく、ｉｎ　ｖｉｖｏでもＣ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍ変異を併せ持つＥＧＦＲの変異に対して効果を有することが明らかとなった。
≪ＥＧＦＲ変異体を発現するＰＣ９を移植したマウスを用いた検討≫
　ＰＣ９を親株とする細胞株について、同様にｉｎ　ｖｉｖｏでブリガチニブの効果の確認を行った（図１３）。ＰＣ９細胞に、エクソン１９の欠失に加えてさらにＴ７９０Ｍの変異を有するＥＧＦＲを発現する細胞をＢａｌｂ－ｃ　ｎｕ／ｎｕ　マウスの皮下に移植し、腫瘍容積が平均２００ｍｍ３に達した後、溶媒のみ、５０ｍｇ／ｋｇ　オシメルチニブ、又は７５ｍｇ／ｋｇ　ブリガチニブの３群、各５匹にランダムに分け、１日１回、強制経口投与を行った。腫瘍容積は上記と同様にして計測した。オシメルチニブは、腫瘍増殖に対して顕著な効果が見られた。ブリガチニブは、オシメルチニブほどの顕著な効果は見られないものの、溶媒のみを投与した群に比べて、明らかな腫瘍増殖抑制効果が見られた（図１３Ａ）。
　カプラン－マイヤー法に基づく生存曲線を図１３Ｂに示す。Ｔ７９０Ｍを発現するＰＣ９を移植したオシメルチニブ投与群もブリガチニブ投与群もいずれも観察期間中生存していた。なお、ブリガチニブ処理群で死亡した１匹のマウスは１０日目に経口投与時に誤って死亡したものである。
　マウスに移植した腫瘍におけるＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化について検討を行った（図１３Ｃ）。上記と同様にして腫瘍を移植後、溶媒のみ、７５ｍｇ／ｋｇ　ブリガチニブ投与、７５ｍｇ／ｋｇ　ブリガチニブに加えて、週３回セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、メルク株式会社製）を１ｍｇ／マウスの用量で投与し、１０日後に腫瘍を摘出し、ウェスタンブロッティングにより解析を行った。各群２匹ずつの結果を示している。ブリガチニブ投与群では、コントロールである溶媒のみを投与した群と比較して、いずれもＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化が抑制されていた。また、セツキシマブを併用した群では、ブリガチニブ単独投与群に比べて、より強い効果を得ることができた（図１３Ｃ）。
　次に、ＰＣ９細胞にＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させ、上記と同様にしてＢａｌｂ－ｃ　ｎｕ／ｎｕに移植し、オシメルチニブ、及びブリガチニブの効果を検討した（図１４）。オシメルチニブはＥＧＦＲの三重変異に対しては、ほとんど効果がないのに対して、ブリガチニブは腫瘍増殖に対して有意な増殖抑制効果を示した（図１４Ａ）。マウス移植後の腫瘍におけるＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系に関して、上記と同様にしてウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、ブリガチニブはＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系に対して、明らかなリン酸化の抑制効果が見られたのに対し、オシメルチニブ投与群ではリン酸化抑制効果はほとんど見られなかった（図１４Ｂ）。
４．抗ＥＧＦＲ抗体との併用効果
≪セツキシマブ併用の効果≫
　抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲのリン酸化を抑制することから、ＥＧＦＲに変異を有し、恒常的に活性化している腫瘍に対して効果があることが知られている。ブリガチニブの効果が抗ＥＧＦＲ抗体と相乗効果があるか検討を行った。
　上記で検討したように、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＰＣ９に対してブリガチニブは低濃度で細胞増殖に対して増殖抑制効果を示すが、オシメルチニブは高濃度で処理しなければ細胞増殖に対して効果を示さない（図９Ｃ参照）。ブリガチニブ、又はオシメルチニブと併用して、セツキシマブで処理を行い細胞増殖に対する効果を検討した（図１５Ａ）。
　Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＰＣ９に、ブリガチニブ、オシメルチニブは３００ｎＭ、セツキシマブは１０μｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加し、７２時間後に細胞の生存率を上記と同様にしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより解析した。セツキシマブは１０μｇ／ｍｌの濃度では、細胞増殖に対する効果は見られない。一方、ブリガチニブは、３００ｎＭ濃度で処理した場合、単独でも細胞増殖に対し抑制効果は見られるものの、セツキシマブと併用して添加することにより、細胞生存率は約５０％と強い抑制効果が得られた。これに対し、オシメルチニブはセツキシマブと併用しても細胞増殖に対して効果が得られなかった。
　Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＰＣ９に、セツキシマブ存在下、非存在下で、ブリガチニブを０～１０００ｎＭ濃度の範囲で処理し、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した（図１５Ｂ）。セツキシマブとブリガチニブを併用して処理した細胞では、ブリガチニブ単独に比べてより強くＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化が抑制されていた。特に、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達系ではより一層強いシグナル抑制効果が見られた。
　三重変異を有するＥＧＦＲを発現するＰＣ９を上記と同様にしてマウスに移植し、溶媒のみ、ブリガチニブ単独、オシメルチニブ単独、セツキシマブ単独、ブリガチニブとセツキシマブを併用して投与し、腫瘍細胞の増殖を腫瘍容積により検討した（図１５Ｃ）。ブリガチニブは７５ｍｇ／ｋｇ、オシメルチニブは５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回、強制経口投与を行い、セツキシマブは、週３回１ｍｇ／マウスの用量で投与した。コントロールである溶媒のみを投与した群と比較して、ブリガチニブ単独、オシメルチニブ単独、セツキシマブ単独投与群でも一定の腫瘍増殖抑制効果が見られたが、ブリガチニブとセツキシマブを併用投与した群では、明らかな腫瘍増殖抑制効果が見られ、徐々に腫瘍の退縮が観察された（図１５Ｃ）。
　マウス移植後の腫瘍におけるＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化を上記と同様にしてウェスタンブロッティングにより解析を行った（図１５Ｄ）。図１５Ｃで示した結果と呼応して、ブリガチニブとセツキシマブを併用投与した群から得た腫瘍ではＥＧＦＲ、及びその下流のシグナル伝達系のリン酸化が著しく抑制されていた。
　カプラン－マイヤー法に基づく生存曲線を図１５Ｅに示す。三重変異を有するＥＧＦＲを発現するＰＣ９を移植した場合、オシメルチニブ単独投与では、ほとんど効果がないのに対し、ブリガチニブ単独、セツキシマブ単独投与では一定の延命効果を有していた。これに対し、ブリガチニブとセツキシマブを併用して投与した群では６０日の観察期間中、すべてのマウスが生存していた。したがって、三重変異を有するＥＧＦＲを発現する腫瘍に対しては、ブリガチニブとセツキシマブを併用して投与することが望ましい。
　次に、Ｂａ／Ｆ３細胞に、Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させ、抗ＥＧＦＲ抗体との併用効果の解析を行った（図１６）。３０ｎＭ　ブリガチニブ、３０ｎＭ　ＡＰ２６１１３類縁体、１００ｎＭ　ＡＺＤ３４６３、３００ｎＭオシメルチニブに１０μｇ／ｍｌセツキシマブ存在下、又は非存在下で細胞を培養し、７２時間後に細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより評価した。
　ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３、オシメルチニブは単独でも細胞生存率を低下する効果が見られるが、１０μｇ／ｍｌの濃度ではセツキシマブ単独では細胞生存率を低下する効果は見られなかった。また、１０μｇ／ｍｌの濃度ではセツキシマブ単独での効果は見られないのにも関わらず、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３と併用することによって、細胞生存率に対するより強い効果が見られた。一方、オシメルチニブではセツキシマブの併用効果は観察されなかった。
　Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＢａ／Ｆ３細胞に、セツキシマブ存在下、非存在下で、ブリガチニブを０～１０００ｎＭ濃度の範囲で処理し、ＥＧＦＲ、及び下流のシグナル伝達系のリン酸化をウェスタンブロッティングにより解析した（図１６Ｂ）。セツキシマブとブリガチニブを併用して処理した細胞では、ブリガチニブ単独に比べてより強いシグナル抑制効果が見られた。特に、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達系ではより一層強いシグナル抑制効果が見られた。
≪パニツムマブ併用の効果≫
　ブリガチニブ等との併用効果がセツキシマブ特有のものではないことを確認するために、ＥＧＦＲの活性を阻害する他の抗ＥＧＦＲ抗体を用いて同様の解析を行った（図１７）。Ｃ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させたＢａ／Ｆ３細胞の培養液に、２０μｇ／ｍｌパニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、武田薬品工業製）存在下、又は非存在下で、１００ｎＭ　ブリガチニブ、１００ｎＭ　ＡＰ２６１１３類縁体、又は３００ｎＭ　オシメルチニブを添加し、細胞を培養し７２時間後に細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏアッセイにより評価した。セツキシマブで検討した結果と同様に、２０μｇ／ｍｌの濃度では、パニツムマブ単独では細胞生存率に対して効果が得られないものの、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体と併用した場合に、細胞生存率の著しい減少が見られた。また、オシメルチニブに対してはパニツムマブの併用効果は見られなかった（図１７Ａ）。
　ＰＣ９細胞にＣ７９７Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／ｄｅｌ１９の変異を有するＥＧＦＲを発現させた細胞についても同様にパニツムマブの効果の検討を行った。３００ｎＭ　ブリガチニブ、又は３００ｎＭ　オシメルチニブを培養液に添加し、２０μｇ／ｍｌパニツムマブ存在下、又は非存在下で細胞を培養し、７２時間後に細胞の生存率を同様にして評価した。ＥＧＦＲ三重変異体を発現しているＢａ／Ｆ３細胞と同様に、ブリガチニブではパニツムマブとの併用効果が見られるものの、オシメルチニブでは併用効果を見ることはできなかった（図１７Ｂ）。
　ＥＧＦＲの三重変異体を発現するＰＣ９を移植したマウスにおけるパニツムマブ、ブリガチニブのＥＧＦＲシグナル伝達系に対する効果をウェスタンブロッティングにより解析した。ＥＧＦＲの三重変異体を発現するＰＣ９をマウスに移植し、ブリガチニブは７５ｍｇ／ｋｇで１日１回強制経口投与を行い、パニツムマブは腹腔内に０．５ｍｇ／マウスの用量で週２回投与し、８日後に各群２匹のマウスから腫瘍を取り出しウェスタンブロッティングにより解析した。ブリガチニブ単独、パニツムマブ単独でもＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化に対して抑制効果は見られるものの、ブリガチニブとパニツムマブを投与した群では、ＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化が顕著に抑制されていた（図１７Ｃ）。
　ＥＧＦＲの三重変異体を発現するＰＣ９を移植したマウスにおいて、ブリガチニブと抗ＥＧＦＲ抗体の併用効果を検討した。三重変異ＥＧＦＲを発現するＰＣ９を移植し、腫瘍容積が２００～３００ｍｍ３に達した後、マウスを各５匹ずつ、溶媒のみ、ブリガチニブ単独、パニツムマブ単独、ブリガチニブとセツキシマブの併用、ブリガチニブとパニツムマブの併用で投与し、腫瘍容積と生存率の解析を行った。
　なお、ブリガチニブは７５ｍｇ／ｋｇ、又は３７．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回強制経口投与を行い、パニツムマブは０．５ｍｇ／マウス、セツキシマブは１ｍｇ／マウスの用量で週２回腹腔内投与を行い、経時的に腫瘍容量と生存率を解析した（図１８）。なお、マウスにおいてブリガチニブ３７．５ｍｇ／ｋｇでの投与は、ヒトでの投与量よりやや少ない用量に対応する。
　上記でセツキシマブを用いて解析した場合と同様に、パニツムマブ単独でもコントロールである溶媒投与群と比較して、腫瘍増殖に対して一定の効果が得られるものの完全な腫瘍抑制効果は得られない。一方、ブリガチニブと抗ＥＧＦＲ抗体であるパニツムマブ、又はセツキシマブを併用して投与した場合には腫瘍増殖効果が得られるだけではなく、徐々に腫瘍が退縮するという結果が得られた（図１８Ａ）。
　カプラン－マイヤー法による生存曲線による解析結果においても、ブリガチニブとパニツムマブ、又はセツキシマブを併用して投与した場合には約６０日目まですべてのマウスが生存していた。一方、ブリガチニブ単独、パニツムマブ単独投与群では、コントロールよりは長期に生存していたものの、４０日前後ですべてのマウスが死亡した。
　さらに、ヒト肺癌細胞から樹立した細胞株を用いてブリガチニブとパニツムマブの併用効果の解析を行った。ＪＦＣＲ－１６３細胞株は、がん研究会においてオシメルチニブに不応の患者の胸水から樹立した細胞株であり、ＥＧＦＲの三重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）を有している。ＪＦＣＲ－１６３細胞を上記と同様にして、Ｂａｌｂ－ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス各２匹に移植し、腫瘍容積が約１００ｍｍ３に達した後、マウスをランダムに２群に分け、一方を処置群、他方を溶媒のみを投与するコントロール群とした。処置群は、５０ｍｇ／ｋｇの用量でブリガチニブを１日１回強制経口投与し、パニツムマブは０．５ｍｇ／ｋｇの用量で週１回腹腔内投与を行った。経時的に腫瘍容量を計測した結果、溶媒のみを投与したコントロール群は腫瘍容量の増大が認められたが、ブリガチニブとパニツムマブを併用投与した群では腫瘍容量の増加は認められなかった。
　Ｌ８５８Ｒ変異をベースに有する三重変異であっても、エクソン１９欠失変異をベースに有する三重変異であっても、ブリガチニブと抗ＥＧＦＲ抗体の併用投与による効果が認められたことは、第３世代のＥＧＦＲ-ＴＫＩによってＣ７９７Ｓに変異を生じ耐性を獲得した肺癌の治療に大きな意味を持つ。
　これらの結果から、癌の原因となるＥＧＦＲのエクソン１９の欠失、あるいはＬ８５８Ｒの変異、第２の変異であるＴ７９０Ｍに加えて、第３の変異であるＣ７９７Ｓの変異のあるＥＧＦＲ変異体に対して、ブリガチニブ、あるいはこれと同様の骨格を有する化合物と抗ＥＧＦＲ抗体を併用することによって、より強い治療効果を得ることができることが示された。抗ＥＧＦＲ抗体としては、ここではセツキシマブ、パニツムマブについて検討を行ったが、リガンドの結合を制御しうる抗体であれば同様の効果を奏するものと考えられる。
　上記示してきたように、ブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、ＡＺＤ３４６３に代表される一般式（Ｉ）で表される化合物は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性となった腫瘍のうちＣ７９７Ｓに変異を有するＥＧＦＲ変異体に対して増殖抑制効果を備えている。さらに、セツキシマブ、パニツムマブのような抗ＥＧＦＲ抗体と併用することにより、より強い効果を得ることができる。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性非小細胞肺癌において、現在のところ効果的な治療法がない第３世代のＥＧＦＲ-ＴＫＩ耐性腫瘍に対して効果的な治療薬となり得る。

Claims (12)

  1. 　一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とするＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  2. 　前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である請求項１記載のＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌治療薬。
  3. 　前記ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位の変異を有する癌である請求項１又は２記載の非小細胞肺癌治療薬。
  4. 　前記非小細胞肺癌がＥＧＦＲの７９７位、及び７９０位に変異を有する癌である請求項１～３いずれか１項に記載の非小細胞肺癌治療薬。
  5. 　抗ＥＧＦＲ抗体と併用投与される請求項１～４いずれか１項記載の非小細胞肺癌治療薬。
  6. 　ＥＧＦＲ遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌において、
    　ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出する一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性を検査する方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  7. 　前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である請求項６に記載の医薬の有効性を検査する方法。
  8. 　前記ＥＧＦＲの７９７位の変異の検出が、
    　核酸、及び／又はタンパク質を検出するものであることを特徴とする請求項６又は７記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
  9. 　前記核酸の検出が、ＰＣＲによるものであり、
    　前記タンパク質の検出が、抗体によるものである請求項８記載の前記医薬の有効性を検査する方法。
  10. 　ＥＧＦＲの７９７位の変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体を含む一般式（Ｉ）で示される化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする医薬の有効性検査キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は次式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     Ｒ２は、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ２、又は次式（ＩＶ）で表される基である。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  11. 　前記化合物がブリガチニブ、ＡＰ２６１１３類縁体、又はＡＺＤ３４６３である請求項１０記載の医薬の有効性検査キット。
  12. 　ＥＧＦＲのエクソン１９の欠失変異、Ｌ８５８Ｒの変異、及びＴ７９０Ｍの変異を検出するＰＣＲプライマー、又は抗体をさらに含む請求項１０又は１１に記載する医薬の有効性検査キット。
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