WO2017204284A1 - Ａｏｂｇｌ１１ホモログを用いたステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法 - Google Patents

Ａｏｂｇｌ１１ホモログを用いたステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to steviol and a method for producing steviol glycosides.
  • Stevia rebaudiana leaves contain a secondary metabolite called steviol, a kind of diterpenoid, and some steviol glycosides with sugar added to steviol contain about sugar. Some have a sweetness of 300 times, and they are used in the food industry as calorie-free sweeteners. Obesity has been developed internationally as a serious social problem, and the demand for calorie-free sweeteners is increasing day by day from the viewpoint of promoting health and reducing medical costs.
  • artificially synthesized amino acid derivatives such aspartame (Apartame) and acesulfame potassium (Acesulfame Potassium) are used as artificial sweeteners, but naturally occurring caloric-less sweeteners such as steviol glycosides are more popular. It is expected that it will be safe and easy for consumers to understand (Public Acceptance).
  • stevioside is a compound in which three glucoses are added to steviol, and it is most abundant in common stevia leaves.
  • Stevioside (stv) has a sweetness that is approximately 300 times that of sucrose but exhibits a slight bitter taste.
  • Steviol glycoside rebaudioside A is a compound in which four glucoses are added to steviol, and has a sweetness level about 400 times that of sucrose.
  • Stevioside and rebaudioside A are the central substances of Stevia's sweetness.
  • glycosides such as rebaudioside D (rebaudioside D; rebD) in which five glucoses are added to steviol and rebaudioside M (rebaudioside M; rebM) in which six glucoses are added are also known.
  • tea tea contains rubusoside (rub) with one glucose added at each of positions 13 and 19 of steviol, which is known to be the main sweetening ingredient of tea tea.
  • rubusoside rub
  • glycosides that are considered to be reaction intermediates and analogs with different types of sugars are known (FIG. 1).
  • Steviol is also known to have an effect of improving cognitive function.
  • steviol glycosides that can act on specific glycosidic bonds can be used, specific glycosides can be selectively produced or unnecessary glycosides can be removed. Therefore, there are great advantages such as improving the taste quality of stevia extract and facilitating the purification of a specific steviol glycoside.
  • steviol is useful also in the process of obtaining steviol glycosides by using steviol as a starting material and glycosylating steviol using yeast or the like. When steviol is added to the medium, the yeast can be taken into the cells. Therefore, when yeast in which the steviol glycosyltransferase gene is expressed in the cells is cultured in a medium containing steviol, the yeast is Steviol can be incorporated into and glycosylated.
  • Enzymatic activity to hydrolyze steviol glycosides has been reported in several biological species. Among them, aspergillus fungi produce steviol glycoside hydrolase, in raw soy sauce, there is activity to hydrolyze stevioside to rubusoside (Non-patent Document 1), Pectinase enzyme agent and Hesperidinase It has been reported that an enzyme agent, Takadiastase enzyme agent has an activity of hydrolyzing stevioside into steviol (Non-patent Documents 2-4).
  • Patent Document 1 a method for producing steviol from stevioside by using a combination of a pectinase enzyme agent derived from Aspergillus fungi and an enzyme agent derived from snail (Helix pomatia) has been reported (Patent Document 1). Aspergillus aculeatus-derived enzyme agent Viscozyme L (novozyme) is described as having an activity of hydrolyzing into stevioside ⁇ rubusoside ⁇ steviol monoglycosyl ester (Non-patent Document 5). Further, it is described that an individual culture extract of Aspergillus aculeatus has an activity of converting stevioside into steviol (Non-patent Document 6).
  • Aspergillus filamentous fungi including Neisseria gonorrhoeae have an enzyme gene having steviol glycoside hydrolyzing activity, the enzyme responsible for the enzyme activity and the gene encoding it There is no report.
  • Non-patent Document 7 a glycoside hydrolase (GH) 3 family ⁇ -glucosidase encoded by the AO090009000356 gene of Aspergillus hydrolyzes a disaccharide having a ⁇ -glucoside bond.
  • GH glycoside hydrolase
  • laminaribiose having a ⁇ -1,3 bond, ⁇ -gentiobiose having a ⁇ -1,6 bond, cellobiose having a ⁇ -1,4 bond, and sophorose having a ⁇ -1,2 bond in this order. Specificity of hydrolysis is high. However, it has not been reported whether there is an activity to hydrolyze terpene glycosides including steviol glycosides.
  • Naringenase derived from Penicillium decumbens includes an enzyme that hydrolyzes stevioside into steviol via rubusoside, steviolbioside, and steviolmonoglucoside, and this enzyme is a protein having a molecular weight of 121 kDa, pH 2.3-6.0, and temperature 40-. It is reported that the enzyme is stable at 60 ° C. (Non-patent Document 9). However, although all of these have found activity to hydrolyze steviol glycosides, the genes responsible for the activity have not been specified.
  • glycoside hydrolase homolog (GH3 family) protein AOBGL11p derived from Aspergillus oryzae var. Brunneus encoded by the AOBGL11 gene or a homologous gene thereof is steviol. It has been found that it has an activity of hydrolyzing glycosides. Furthermore, the protein AOBGL11p was found to cleave the glucoside bond and glucosyl ester bond of steviol glycosides.
  • AOBGL11p has the activity of cleaving the O-glucoside bond at position 13, the glucosyl ester bond at position 19, and the glycosidic bond in the side chain of the steviol glycoside for each monosaccharide.
  • the present invention has been completed. Furthermore, by selecting the reaction conditions, among the steviol glycosides, the hydrolysis reaction of the branched trisaccharide or sophorose bonded to the 13th position and the hydrolysis reaction of the branched trisaccharide bonded to the 19th position are suppressed. I found. Moreover, it discovered that it cut
  • a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) and a first steviol glycoside are reacted to form a glucoside bond at position 13 and a glucosyl at position 19 of the first steviol glycoside.
  • a method for producing steviol and / or a second steviol glycoside comprising hydrolyzing at least one of an ester bond and a glycosidic bond in a side chain, wherein the first and second steviols are produced Said method wherein the glycosides are different from each other: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (B) a glucoside at position 13 of the first steviol glycoside, comprising an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A protein having an activity of hydrolyzing at least one of a bond, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycosidic bond in the side chain (excluding rhamnoside bond); (C) an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a glucoside bond at position 13 and a glucosyl ester bond
  • the first steviol glycoside is steviol monoside, steviol monoglucosyl ester, rubusoside, steviolbioside, stevioside, rebaudioside B, rebaudioside A, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F and rebaudioside M, zulcoside A
  • the method according to [1] wherein the method is selected from the group consisting of Steviol glycoside B, Steviol glycoside C, Steviol glycoside D.
  • the second steviol glycoside is selected from the group consisting of steviol monoside, steviolbioside, rebaudioside B, steviol glycoside A, steviol glycoside B, steviol glycoside C, steviol glycoside D.
  • the organic solvent is acetonitrile.
  • the step of hydrolyzing the first steviol glycoside includes any one or more steps selected from the group consisting of the following (1) to (5): ]
  • the production method according to any one of (1) A step of preferentially cleaving a glycoside bond (excluding rhamnoside bond) in a disaccharide or a glucoside bond or a glucosyl ester bond of a glucose monosaccharide over a branched trisaccharide; (2) a step of preferentially cleaving glucose when xylose and glucose or rhamnose and glucose are further bound to glucose bound to aglycone; (3) a step of preferentially cleaving
  • the first steviol glycoside is steviol monoside, steviol monoglucosyl ester, rubusoside, steviolbioside, stevioside, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F and rebaudioside M, zulcoside A
  • the second steviol glycoside is selected from the group consisting of steviol monoside, steviolbioside, rebaudioside B, steviol glycoside A, steviol glycoside B, steviol glycoside C, steviol glycoside D.
  • the method according to any one of [8] to [12], wherein the step of reacting the first steviol glycoside is performed in the presence of an organic solvent.
  • the organic solvent is acetonitrile.
  • the step of hydrolyzing the first steviol glycoside includes any one or more steps selected from the group consisting of the following (1) to (5): 8] to [14], the production method according to any one of (1) A step of preferentially cleaving a glycoside bond (excluding rhamnoside bond) in a disaccharide or a glucoside bond or a glucosyl ester bond of a glucose monosaccharide over a branched trisaccharide; (2) a step of preferentially cleaving glucose when xylose and glucose or rhamnose and glucose are further bound to glucose bound to aglycone; (3) a step of preferentially cleaving
  • a method for producing steviol and / or steviol glycosides comprising culturing a non-human transformant introduced with a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e): (a) SEQ ID NO: A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of 1; (B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (C) a glucoside at position 13 of the first steviol glycoside, comprising an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding a protein having an activity to hydrolyze at least one of a bond, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycosidic bond in the side chain (excluding rhamnoside bond); (D) a glucoside bond
  • the method of the present invention provides a new method for producing steviol and steviol glycosides.
  • Steviol can be produced by the method of the present invention.
  • steviol glycosides can be produced by selecting reaction conditions. Specifically, by selecting the reaction conditions, the hydrolysis of the branched trisaccharide or sophorose bonded to the 13th position or the branched trisaccharide bonded to the 19th position is suppressed, and steviol glycosides having these sugar chains are suppressed. Can be manufactured.
  • the branched trisaccharide is one in which two glucoses are further bonded to one glucose bonded to steviol, which is an aglycon, one of which is ⁇ 2 ⁇ 1, and the other is ⁇ 3 ⁇ 1. It means what is.
  • rebaudioside B rebB
  • steviolbioside steB
  • steM steviolmonoside
  • A Reaction path when no organic solvent is contained in the reaction solution.
  • B Reaction path when acetonitrile is contained in the reaction solution.
  • A The optimum pH of AOBGL11p using pNP- ⁇ -Glc as a substrate.
  • B Optimum temperature of AOBGL11p using pNP- ⁇ -Glc as a substrate.
  • C pH stability of AOBGL11p using pNP- ⁇ -Glc as a substrate.
  • D Thermal stability of AOBGL11p using pNP- ⁇ -Glc as a substrate.
  • Comparison of amino acid sequences of AOBGL11p (amino acid sequence: SEQ ID NO: 2), AOBGL3p (amino acid sequence: SEQ ID NO: 5) and AOBGL1p (amino acid sequence: SEQ ID NO: 6). Comparison of amino acid sequences of AOBGL11p (amino acid sequence: SEQ ID NO: 2), AOBGL3p (amino acid sequence: SEQ ID NO: 5) and AOBGL1p (amino acid sequence: SEQ ID NO: 6) (continuation of FIG. 11A). HPLC analysis of the product with BGL11 crude enzyme solution with rebaudioside C (0.05 mg / ml) as substrate. The reaction time is 24 hours. FIG.
  • FIG. 12A shows data for only the substrate, and FIGS. 12B, C, and D show differences in the concentration of the protein of the present invention (B: 1/1000 dilution, C: undiluted solution, D: 20-fold concentration), respectively.
  • FIG. 13A shows data for only the substrate, and FIGS. 13B and 13C show differences in reaction time (B: 1 hour, C: 24 hours).
  • AOBGL11 is ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus oryzae, and its CDS sequence (SEQ ID NO: 1), amino acid sequence (SEQ ID NO: 2), ORF sequence (SEQ ID NO: 3) and genomic DNA sequence (SEQ ID NO: 4) are Are shown in the attached sequence listing.
  • the present invention relates to a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) (hereinafter referred to as “protein of the present invention”) and a glucoside bond at the 13-position , Reacting a first steviol glycoside having at least one of a glucosyl ester bond at position 19 and a glycosidic bond in a side chain, to form a glucoside bond at position 13 of the first steviol glycoside, 19
  • a method for producing steviol and / or a second steviol glycoside comprising hydrolyzing at least one of a glucosyl ester bond at a position and a glycosidic bond in a side chain (excluding rhamnoside bond).
  • this invention provides the manufacturing method of the steviol and / or steviol glycoside which contain the organic solvent in a reaction liquid.
  • the present invention provides a method for producing steviol and / or steviol glycosides containing acetonitrile in a reaction solution.
  • a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • B the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and a glucoside bond at position 13 of the steviol glycoside, position 19
  • C The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more, and the steviol glycoside has a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a side chain Protein having activity of hydrolyzing at least one of glycoside bonds (excluding rhamnoside bonds)
  • the protein described in the above (b) or (c) is typically a variant of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012 ”,“ Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 ”,“ Nuc.Acids.Res., 10,6487 (1982) ”,“ Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,6409 (1982) ”,“ Gene, 34,315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) ” And the like that can be artificially obtained using the site-directed mutagenesis method described in the above.
  • Such a protein includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99. It has an amino acid sequence having a sequence identity of 8% or more, or 99.9% or more, and a glucoside bond at the 13th position, a glucosyl ester bond at the 19th position, and a glycoside bond (rhamnoside) in the side chain of the steviol glycoside. And a protein having an activity of hydrolyzing at least one of (excluding a bond). In general, the larger the sequence identity value, the better.
  • the activity of hydrolyzing at least one of the 13-position glucoside bond, the 19-position glucosyl ester bond, and the glycoside bond in the side chain of steviol glycoside means that steviol, which is an aglycon, has a sugar.
  • steviol glycosides which are linked glycosides, cleave at least one of steviol's 13-position O-glucoside bond, 19-position glucosyl ester bond and side-chain glycoside bond (except rhamnoside bond) It means activity to (hydrolyze).
  • all glucoside bonds (except rhamnoside bonds), glucosyl ester bonds are hydrolyzed to produce steviol from steviol glycosides.
  • the first steviol glycoside is one in which a branched trisaccharide, disaccharide or glucose is bonded to position 13 and a branched trisaccharide, disaccharide or glucose is bonded to position 19.
  • the hydrolysis reaction of the branched trisaccharide or disaccharide bonded to position 13 of 1 steviol glycoside or the branched trisaccharide bonded to position 19 is suppressed, and the glucoside bond at position 13 and the glucoside in the disaccharide at position 19 are suppressed. Bonds and glucosyl ester bonds are preferentially hydrolyzed.
  • the 19-position glucosyl ester bond is cleaved in preference to the 13-position glucoside bond of steviol glycosides.
  • the glycosidic bond means a covalent bond formed by dehydration condensation of sugar and sugar or another organic compound with sugar, and among the glycosidic bonds, the bond with the first carbon of glucose is a glucoside bond,
  • the bond to the 1st carbon of rhamnose is called a rhamnoside bond
  • the bond to the 1st carbon of xylose is called a xyloside bond.
  • the protein of the present invention cleaves the bond between steviol (aglycone) of the steviol glycoside and the sugar (13-position glucoside bond, 19-position glucosyl ester bond) and the side-chain split glycoside bond.
  • Rhamnoside bonds are removed from bonds that are cleaved.
  • the first steviol glycoside has a branched trisaccharide, disaccharide, or glucose monosaccharide at the 13-position and / or a branched trisaccharide, disaccharide, or glucose at the 19-position.
  • the monosaccharide is a glucosyl ester bond
  • the present invention can perform any one or more cleavages selected from the group consisting of the following (1) to (5).
  • the activity of hydrolyzing at least one of the 13-position glucoside bond, the 19-position glucosyl ester bond, and the glycoside bond (except rhamnoside bond) in the side chain of steviol glycosides is compared with the protein of the present invention, for example, steviol. It is obtained by reacting steviol glycosides such as monoside, steviol monoglucosyl ester, rubusoside, steviolbioside, stevioside, rebaudioside B, rebaudioside A, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E and rebaudioside F, rebaudioside M, etc.
  • the purified reaction product can be purified, and the purified product can be confirmed by analyzing it using a known technique such as liquid chromatography (LC).
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • Group C asparagine, glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • the protein of the present invention can be obtained by, for example, expressing a polynucleotide encoding the same (see “polynucleotide of the present invention” described later) in an appropriate host cell.
  • the Fmoc method fluorenylmethyl
  • the Fmoc method can also be produced by chemical synthesis methods such as the oxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • AAPPPec LLC Perkin Elmer Inc. Manufactured by Protein Technologies Inc. Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as manufactured by PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, or SHIMADZU CORPORATION.
  • the “steviol glycoside” is a glycoside in which a sugar is bound to steviol, which is an aglycone.
  • Examples of steviol and steviol glycosides are represented by the following general formula (I).
  • steviol glycosides A and C are products obtained by reacting rebaudioside C with the protein of the present invention
  • steviol glycosides B and D are rebaudioside F and the protein of the present invention.
  • “Glc” indicates glucose
  • “Glc-” indicates that it contains a monoglucoside bond (R 1 position) or a monoglucosyl ester bond (R 2 position).
  • Rha and “Xyl” represent rhamnose and xylose, respectively.
  • sugar chain bonded to R 1 position or R 2 position is a branched trisaccharide
  • two glucoses are further bonded to one glucose bonded to steviol, which is an aglycone, and one bond is ⁇ 1
  • Two bonds are present, and the other is branched to this to represent ⁇ 1,3 bonds.
  • the “side chain” means a sugar or sugar chain bonded to steviol.
  • the enzymatic activity of the present invention can suppress the hydrolysis activity of some glycosidic bonds and glucosyl ester bonds, for example, by adding a solvent such as acetonitrile to the reaction solution. That is, by adding an organic solvent such as acetonitrile to the reaction solution, hydrolysis reaction of the branched trisaccharide or disaccharide side chain bonded to the 13-position or the branched trisaccharide glycoside bond bonded to the 19-position. And the glycoside bond at position 13 of the steviol glycoside, the glycoside bond within the disaccharide at position 19 and the glucosyl ester bond at position 19 are preferentially cleaved.
  • rebaudioside B can be obtained from rebaudioside D or rebaudioside A
  • steviolbioside can be obtained from stevioside. It is also possible to facilitate the purification of these steviol glycosides by hydrolyzing steviol glycosides other than rebaudioside M, rebaudioside B, steviolbioside to steviol from a mixture of steviol glycosides. It is.
  • the 19-position glucosyl ester bond is preferentially cleaved from the 13-position glucoside bond of steviol glycoside means that the 19-position glucosyl ester bond is greater than the 13-position glucoside bond of steviol glycoside.
  • Selective preference is to hydrolyze. For example, when rubusoside or stevioside is used as a substrate, steviol monoside or steviolbioside is preferentially produced over steviol or steviol monoglucosyl ester, and when rebaudioside D or rebaudioside A is used as a substrate, rebaudioside is used rather than steviol. B is preferentially generated.
  • the substrate in “a step of cleaving a glycoside bond (excluding rhamnoside bond) in a disaccharide or a glucoside bond or a glucosyl ester bond of a glucose monosaccharide in preference to a branched trisaccharide”, the substrate is located at the 13th or 19th position.
  • a branched trisaccharide is bound to a disaccharide and a substrate is bound to a disaccharide or a glucose monosaccharide
  • the bond in the substrate disaccharide or the bond between the glucose monosaccharide and the aglycone is preferentially hydrolyzed. Will be.
  • the branched trisaccharides of the side chains of rebaudioside M, rebaudioside D, rebaudioside A, and rebaudioside B are hardly hydrolyzed, and the disaccharides in the side chain at position 19 are not hydrolyzed.
  • the glucoside bond and the 19-position glucosyl ester bond in the 19-position side chain of the steviol glycoside having a glucoside bond and the 19-position glucosyl ester bond are preferably hydrolyzed.
  • step of preferentially cleaving glucose when xylose and glucose, or rhamnose and glucose are combined with glucose bound to aglycone for example, glucose binds to steviol at position 13, and the glucose
  • a steviol glycoside further formed by xylose ( ⁇ 1,2 bond) and glucose ( ⁇ 1,3 bond) is contacted with the enzyme of the present invention, ⁇ 1,3 bond with glucose is preferentially hydrolyzed.
  • rebaudioside F is hydrolyzed by this step, the 19-position glucosyl ester is preferentially hydrolyzed, and then the glucose ( ⁇ 1,3) bond of the 13-position branched trisaccharide is hydrolyzed.
  • rebaudioside M Is contacted with the enzyme of the present invention to produce rebaudioside B as an intermediate product, followed by steviol as the final degradation product.
  • “Glycosidic bonds within the disaccharide at position 13 are favored by glycosidic bonds at position 19 (except rhamnoside) and glucosyl ester bonds with glucose monosaccharide at position 19
  • the rebaudioside M is hydrolyzed under a condition in which the hydrolysis reaction is suppressed by adding an organic solvent such as acetonitrile to the reaction solution, whereby the 19-position branched trisaccharide is hydrolyzed.
  • the 19-branched trisaccharide is preferentially hydrolyzed as compared to the 13-branched trisaccharide in that rebaudioside B is produced by decomposition.
  • the glucosyl ester bond with the glucose monosaccharide at the 19th position is cleaved preferentially as compared with the hydrolysis of the disaccharide at the 13th position, resulting in steviolbioside. .
  • step of preferentially cleaving the glucosyl ester bond of the 19th glucose monosaccharide over the glucoside bond of the 13th glucose monosaccharide for example, when rubusoside is hydrolyzed with the enzyme of the present invention, 19 The glucosyl ester bond with the glucose monosaccharide at the position is cleaved to produce steviol monoside as an intermediate.
  • steviol glycoside having at least one of 13-position glucoside bond, 19-position glucosyl ester bond and glycoside bond in side chain as a starting material
  • the body is extracted from stevia and tencha (Rubus suauissimus) with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone), ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, high performance liquid chromatography.
  • solvent aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high performance liquid chromatography.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Ultra (High) Performance Liquid Chromatography: UPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
  • a steviol glycoside having at least one of a glucoside bond at the 13th position, a glucosyl ester bond at the 19th position, and a glycoside bond in the side chain as a starting material may be commercially available.
  • the method for producing steviol glycoside and / or steviol according to the present invention has at least one of the protein of the present invention, a glucoside bond at the 13th position, a glucosyl ester bond at the 19th position, and a glycoside bond in the side chain. It includes a step of reacting steviol glycoside to hydrolyze at least one of a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycoside bond (excluding rhamnoside bond) in the side chain.
  • the method of the present invention may further include a step of purifying the steviol and / or the second steviol glycoside of the present invention produced in the above step.
  • Steviol and / or steviol glycosides of the present invention can be extracted with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water, or organic solvent such as alcohol, ether or acetone), ethyl acetate or other organic solvents: water gradient, high speed It can be purified by known methods such as liquid chromatography (HPLC), ultra high performance liquid chromatography (Ultra (High) Performance Chromatography: UPLC), and the like.
  • aqueous solvent such as water, or organic solvent such as alcohol, ether or acetone
  • ethyl acetate or other organic solvents water gradient, high speed
  • HPLC liquid chromatography
  • Ultra (High) Performance Chromatography: UPLC ultra high performance liquid chromatography
  • the method for producing steviol glycosides and / or steviol according to the present invention can be carried out under conditions in which an organic solvent is added to a reaction solution containing a substrate.
  • the organic solvent can be in the range of 1% to 20% with respect to the total amount of the reaction solution, preferably 5% to 15%, 6 to 12%, more preferably 8%.
  • the organic solvent may be generally available, preferably mixed with water at an arbitrary ratio, and acetonitrile can be used.
  • the organic solvent may be added in advance to the reaction solution, or may be added in the middle of the reaction.
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • Examples of the polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 include a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a glucoside bond at position 13 and a glucosyl at position 19 of the steviol glycoside consisting of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the “protein having an activity of hydrolyzing at least one of an ester bond and a glycosidic bond (excluding rhamnoside bond) in a side chain” include those described above.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more, and the steviol glycoside has a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a side chain.
  • Examples of the “protein having an activity of hydrolyzing at least one of glycoside bonds (excluding rhamnoside bonds)” include those described above.
  • a polynucleotide that hybridizes under highly stringent conditions encodes a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • high stringent conditions means, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., or 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, The conditions are 60 ° C., 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 62 ° C., or 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C., but are not limited thereto. Under these conditions, it can be expected that DNA having high sequence identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency.
  • Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used, for example.
  • the membrane was subjected to a primary wash containing 0.1% (w / v) SDS at 55-60 ° C. After washing with a buffer, the hybridized DNA can be detected.
  • a probe based on a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 commercially available
  • DIG digoxigenin
  • a reagent for example, PCR labeling mix (Roche Diagnostics)
  • hybridization is performed using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics). Can be detected.
  • hybridizable polynucleotide encodes the DNA of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, when calculated by the BLAST homology search software using the default parameters.
  • sequence identity of the amino acid sequence and the base sequence is the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993).
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • the default parameters of each program are used.
  • the above-described polynucleotide of the present invention can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • the polynucleotide of the present invention may further include a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a secretory signal peptide.
  • a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a secretory signal peptide is included at the 5 'end of the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide from the secretory signal peptide and the base sequence encoding it is the same as described above.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably introduced into a host while being inserted into an appropriate expression vector.
  • Suitable expression vectors are usually (I) a promoter capable of transcription in a host cell; (Ii) a polynucleotide of the present invention linked to the promoter; and (iii) an expression cassette comprising, as a component, a signal that functions in a host cell for transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule. .
  • the method for producing the expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector. Good.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, a promoter, a terminator and / or a replication origin) depending on the type of host to be introduced.
  • an expression control region for example, a promoter, a terminator and / or a replication origin
  • Conventional promoters eg, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.
  • yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc.
  • Examples of the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC.
  • promoters for expressing a target gene in plant cells include the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, the rd29A gene promoter, the rbcS promoter, and the enhancer sequence of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter derived from Agrobacterium. And the mac-1 promoter added to the 5 'side of the mannopine synthase promoter sequence.
  • animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • markers include auxotrophic markers (ura5, niaD), drug resistance markers (hygromycin, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (respectively, Minoru Ogura et al., Biochemistry, vol. 64, p. 660, 1992; , Gene, vol. 101, p. 149, 1991) can be used.
  • the production method (production method) of the transformant of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method of transforming by introducing an expression vector containing the polynucleotide of the present invention into a host.
  • cells or organisms to be transformed various conventionally known cells or organisms can be suitably used.
  • cells to be transformed include bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), filamentous fungi (gonococci Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae), plant cells, and humans. Excluding animal cells and the like.
  • the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms exemplified in the host cell, animals other than plants or animals.
  • the transformant is preferably a yeast or a plant.
  • the host used for transformation is preferably one that produces steviol glycosides having at least one of a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycoside bond in the side chain.
  • a gene necessary for the production of a steviol glycoside having at least one of a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycoside bond in a side chain is described in, for example, WO2011 / 093509 Examples include steviol and genes having steviol glycoside synthesis activity.
  • a host cell transformation method As a host cell transformation method, a commonly known method can be used. For example, electroporation method (Mackenxie, DAet al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.66, p.4655-4661, 2000), particle delivery method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-287403 ), Spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75, p.1929,1978), lithium acetate method (J.Bacteriology, vol.153, p.163,1983) ), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual), but not limited thereto.
  • electroporation method Mackenxie, DAet al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.66, p.4655-4661, 2000
  • particle delivery method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-287403
  • Spheroplast method Pro
  • the yeast or koji mold transformed with the polynucleotide of the present invention expresses more of the protein of the present invention than the wild type.
  • the expressed protein of the present invention has a first steviol arrangement having at least one of a 13-position glucoside bond, a 19-position glucosyl ester bond, and a glycoside bond in the side chain produced in yeast or Neisseria gonorrhoeae.
  • Reacting with a saccharide, at least one of the 13th glucoside bond, the 19th glucosyl ester bond, and the glycoside bond (except rhamnoside bond) in the side chain of the first steviol glycoside is cleaved, and steviol And / or the second steviol glycoside is produced in yeast or Neisseria gonorrhoeae cells or in the culture medium, preferably in the culture medium.
  • the plant to be transformed in the present invention is the whole plant, plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem) , Soft tissue, xylem, vascular bundle, palisade tissue, spongy tissue, etc.) or plant culture cells, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, etc. Also means.
  • the plant used for the transformation may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • Whether or not the polynucleotide of the present invention has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • offspring can be obtained by sexual or asexual reproduction of the plant.
  • seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, and the like can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can.
  • plant of the present invention contains more of the protein of the present invention than its wild type.
  • the steviol glycoside in which the protein of the present invention has at least one of the glucoside bond at the 13th position, the glucosyl ester bond at the 19th position, and the glycosidic bond in the side chain produced in the plant of the present invention Reacts with the body, producing steviol in plants.
  • the hydrolysis reaction of the branched trisaccharide or disaccharide bonded to the 13th position or the branched trisaccharide bonded to the 19th position is suppressed, and the 13th position is suppressed.
  • Steviol glycosides in which the monoglucoside bond or the glycoside bond in the disaccharide bonded to the 19-position or the 19-position glucosyl ester bond is cleaved are produced.
  • the transformant of the present invention or the culture solution thereof has a higher content of the steviol glycoside of the present invention than its wild type, and the extract or culture solution contains the steviol glycoside of the present invention.
  • Glucose is contained at a high concentration.
  • the extract of the transformant of the present invention can be obtained by crushing the transformant using glass beads, a homogenizer, a sonicator or the like, centrifuging the crushed material, and collecting the supernatant. it can.
  • the transformant and the culture supernatant are separated by a usual method (for example, centrifugation, filtration, etc.) A culture supernatant containing the steviol glycoside of the present invention can be obtained.
  • the thus obtained extract or culture supernatant may be further subjected to a purification step.
  • Purification of the steviol glycoside of the present invention can be carried out according to ordinary separation and purification methods. The specific method is the same as described above.
  • the protein of the present invention is obtained by expressing the protein of the present invention in a host cell and disrupting the cell. be able to.
  • the steviol glycoside and / or steviol of the present invention can also be produced by allowing the protein of the present invention to act.
  • the enzyme derived from the transformed cell of the present invention is contacted with a steviol glycoside having at least one of a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycoside bond in the side chain.
  • the hydrolysis reaction of the branched trisaccharide or disaccharide bonded to the 13th position or the branched trisaccharide bonded to the 19th position is suppressed.
  • Steviol glycosides in which the monoglucoside bond at position 13 or the glycoside bond in the disaccharide bonded to position 19 or the glucosyl ester bond at position 19 are cleaved are produced. It has been confirmed in the Examples that the protein of the present invention exhibits the same activity when expressed in yeast as in the case of expression in Aspergillus.
  • the “enzyme derived from the transformed cell” is not limited as long as it is prepared using the transformed cell and contains the protein of the present invention.
  • the present invention provides an enzyme derived from a non-human transformed cell into which a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e) is introduced into a host cell, a glucoside bond at the 13th position, A glucosyl bond at position 13, a glucoside bond at position 13 of the first steviol glycoside, and a glucosyl at position 19
  • a method for producing steviol and / or a second steviol glycoside comprising hydrolyzing at least one of an ester bond and a glycosidic bond (excluding rhamnoside bond) in a side chain, wherein The second steviol glycosides provide a different method.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • C the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and a glucoside bond at position 13 of the steviol glycoside, position 19
  • D a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a side chain of steviol glycoside, having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (e) above is the polynucleotide of the present invention and is the same as described above.
  • Contact refers to an enzyme derived from the transformed cell of the present invention and a steviol glycoside having at least one of a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycoside bond in the side chain.
  • Means in the same reaction system or culture system for example, a glucoside bond at position 13, a glucosyl ester bond at position 19, and a glycoside in the side chain in a container containing the enzyme derived from the transformed cell of the present invention
  • the enzyme derived from the transformed cell of the present invention is Koshido coupling includes adding to a vessel containing a steviol glycoside having at least one of 19 of the glucosyl ester bond, and a glycoside bond in the side chain.
  • Stepviol glycoside “Steviol glycoside having at least one of glucoside bond at position 13, glucosyl ester bond at position 19, and glycoside bond in side chain”, and “position 13 of steviol glycoside The activity of hydrolyzing at least one of the glucoside bond, the glucosyl ester bond at the 19th position, and the glycoside bond (excluding the rhamnoside bond) in the side chain ”is the same as described above.
  • the steviol glycoside of the present invention thus obtained is used in accordance with a conventional method, for example, for use in production of foods and drinks, sweeteners, fragrances, pharmaceuticals, industrial raw materials (raw materials such as cosmetics and soaps) and the like. can do.
  • “food and beverage” is a general term for solids, fluids, liquids, and mixtures thereof that can be orally consumed.
  • Examples of the food and drink of the present invention include nutritional supplement food and drink, health food and drink, functional food and drink, infant food and drink, infant formula, premature infant formula, elderly food and drink, and the like.
  • Nutritional supplement foods and drinks are foods and drinks that are enriched with specific nutritional ingredients.
  • Healthy foods and drinks refer to foods and drinks that are said to be healthy or healthy, and include nutritional supplements and foods, natural foods and drinks, diet foods and drinks, and the like.
  • Functional food and drink refers to food and drink for replenishing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use.
  • Infant food and drink means food and drink for children up to about 6 years old.
  • Aged foods and beverages refer to foods and beverages that have been treated to be easier to digest and absorb than untreated food and beverages.
  • Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old.
  • Premature infant formula refers to formula that is given to premature infants until they are about 6 months old.
  • the phrase “at least” means that the number of specific items may be greater than or equal to the number listed.
  • the word “about” is present in the range of ⁇ 25%, ⁇ 10%, ⁇ 5%, ⁇ 3%, ⁇ 2%, or ⁇ 1% of the numerical value that the subject follows “about”. It means to do. For example, “about 10” means a range of 7.5 to 12.5.
  • AOBGL11-F 5'-ATGCCTCGTCTAGACCGTCGAGAA-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • AOBGL11-R 5'-TCACAGACCCAACCAGTAGGCGA-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Conidia of Aspergillus oryzae var. Brunneus (IFO30102) were added to a liquid medium (1 g, glucose 20 g, bactotryptone 1 g, yeast extract 5 g, NaNO 3 1 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0 0.5 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g) was inoculated into 10 ml, and cultured at 30 ° C. for 1 day. Bacteria were collected by filtration, ground in liquid nitrogen, and then genomic DNA was prepared using DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN).
  • PCR was performed with KOD-plus (Toyobo) using genomic DNA as a template and primers AOBGL11-F and AOBGL11-R.
  • the obtained DNA fragment of about 2.57 kbp was cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) to obtain plasmid pCR-AOBGL11g.
  • Koji molds were transformed as follows. As a host, Aspergillus oryzae niaD300 strain (Liquor Research Institute) was used. Host strains were inoculated on PDA plates and cultured at 30 ° C. for approximately 1 week. To obtain a conidial suspension, 0.1% tween 80, 0.8% NaCl was added to suspend the conidia. After filtration through Miracloth, conidia were collected by centrifugation, further washed with 0.1% tween 80, 0.8% NaCl, and suspended in sterile water.
  • Conidia were added to CD plates (6 g NaNO 3 , 0.52 g KCl 2, 1.52 g KH 2 PO 4 , 2 g glucose, 1 ml MgSO 4 , trace element solution (1 g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1 g ZnSO).
  • Agar 20 g (pH 6.5) was applied, and DNA was introduced by a particle delivery method.
  • Liquid medium for enzyme production (per 1 liter, maltose 100 g, bactotryptone 1 g, yeast extract 5 g, NaNO 3 1 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g) and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days.
  • the cells were collected by filtration through Miracloth. About 4 g of the obtained wet cells were frozen with liquid nitrogen and ground in a mortar. The ground cells were suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), mixed well, and then centrifuged. The obtained supernatant was concentrated by ultrafiltration with Amicon Ultra-15 50k (Merck) and replaced with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 (buffer A) containing 0.1% CHAPS. 1 ml of crude enzyme solution was obtained.
  • the protein concentration of the crude enzyme solution was quantified using a protein assay CBB solution (concentrated 5 times) (Nacalai Tesque). As a result, the BGL11-1 crude enzyme solution was 6.46 mg / ml and the C-1 crude enzyme solution was 4 mg / ml.
  • pNP- ⁇ -Glc degradation activity The degradation activity of pNP- ⁇ -Glc was examined. 10 ⁇ L of the crude enzyme solution, 50 ⁇ L of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 50 ⁇ L of 20 mM pNP- ⁇ -Glc aqueous solution and water were added to make a total of 200 ⁇ L, followed by reaction at 37 ° C. Since the BGL11-1 crude enzyme solution had high activity, the crude enzyme solution diluted 100-fold with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% CHAPS was used.
  • the optimal temperature, optimal pH, thermal stability, and pH stability of AOBGL11p were examined using pNP- ⁇ -Glc as a substrate (FIG. 2).
  • the BGL11-1 crude enzyme solution was diluted 5000 times with buffer A (protein concentration 1.3 ⁇ g / ml).
  • the reaction solution is 20 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water are added to make a total of 400 ⁇ l.
  • 100 ⁇ l was sampled and mixed with 100 ⁇ l 0.2 M sodium carbonate solution, and then the absorbance at 405 nm was measured to obtain ⁇ 405.
  • FIG. 2B shows the ratio of ⁇ 405 when the reaction is performed at each temperature with 45 ° C. at which ⁇ 405 is maximized as 1. As a result, it was found that 45-50 ° C. was the optimum temperature for the reaction.
  • Optimal pH The reaction solution was adjusted to a total of 400 ⁇ l by adding 20 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M buffer, 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water.
  • As the buffer sodium acetate buffer was used at pH 4.0-6.0, and sodium phosphate buffer was used at pH 6.0-8.0. Sampling and measurement were performed in the same manner as described above, and the ratio of ⁇ 405 when reacted at each pH with respect to the maximum value of ⁇ 405 is shown in FIG. 2A. As a result, it was found that pH 6.0-7.0 was the optimum reaction pH.
  • the crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml) diluted 5000 times was kept at 30 ° C., 37 ° C., 45 ° C., and 50 ° C. for 10 minutes, and then cooled on ice.
  • the reaction solution was 5 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water to make a total of 100 ⁇ l, at 37 ° C. for 45 minutes. After the reaction, 100 ⁇ l of 0.2M sodium carbonate solution was added, and the absorbance at 405 nm was measured.
  • AOBGL11p was stable up to 37 ° C. when treated for 10 minutes, but was deactivated to about half when treated at 45 ° C., and the activity was almost lost when treated at 50 ° C.
  • pH stability The crude enzyme solution was adjusted to pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 (0.2 M acetate buffer), pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8. The sample was diluted 5000 times with each buffer of 0 (0.2 M sodium phosphate buffer), kept at 37 ° C. for 1 hour, and then ice-cooled.
  • the reaction solution was 5 ⁇ l of crude enzyme solution (1.3 ⁇ g / ml), 100 ⁇ l of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP- ⁇ -Glc, and water to make a total of 100 ⁇ l, at 37 ° C. for 45 minutes.
  • Steviol glycoside hydrolysis activity Rebaudioside M, rebaudioside D, rebaudioside A, stevioside, rubusoside were used as substrates. Steviol glycosides were analyzed by HPLC or LC-MS. The analysis conditions of HPLC are as follows. Column: Cosmo Seal 5C 18 -AR-II 4.6 mmI. D. x250mm (Nacalai Tesque) Mobile phase: A; acetonitrile, B; 10 mM sodium phosphate buffer (pH 2.6) B conc. 70% ⁇ 30% 40 minutes linear gradient Flow rate: 1 ml / min Temperature: 40 ° C Detection: UV 210nm
  • Reaction condition (1)-Organic solvent is not included in the reaction solution- Substrate 50 ⁇ g / ml, BGL11 crude enzyme solution (protein concentration 6.5 mg / ml) 20 ⁇ l, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), total volume 100 ⁇ l, and reacted at 37 ° C. for 24 hours.
  • the reaction solution was washed with acetonitrile and then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water. Subsequently, the reaction solution was washed with 20% acetonitrile and then eluted with 50% acetonitrile.
  • the eluate was dried with a speed bag, redissolved with 100 ⁇ L of water, and subjected to HPLC.
  • the substrate was rebM, it was also used for LC-MS.
  • rebM was used as a substrate, steviol was detected as the main product, and rebD, stv, and rebB were detected as intermediates (FIG. 3A).
  • rebD FIG. 4A
  • rebA FIG. 5A
  • stv, and rub were used as substrates
  • the main product was steviol.
  • the same reaction was carried out with the C-1 crude enzyme solution, but no substrate was hydrolyzed and no product was detected. Therefore, the steviol glycoside hydrolyzing activity was attributed to AOBGL11p. I thought it was.
  • Reaction condition (2)-Acetonitrile is included in the reaction solution- Substrate 50 ⁇ g / ml, enzyme solution 20 ⁇ l, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), 0% or 8% acetonitrile, the total volume was 100 ⁇ l, and reacted at 37 ° C. for 24 hours.
  • the reaction solution was washed with acetonitrile and then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water. Subsequently, the reaction solution was washed with 20% acetonitrile and then eluted with 50% acetonitrile.
  • Reaction conditions (3) Substrate 50 ⁇ g / ml, BGL11 crude enzyme solution (protein concentration 6.5 mg / ml) 20 ⁇ l, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), total volume 100 ⁇ l, and reacted at 50 ° C. for 24 hours.
  • the reaction solution was washed with acetonitrile and then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water. Subsequently, the reaction solution was washed with 20% acetonitrile and then eluted with 50% acetonitrile.
  • the eluate was dried with a speed bag, redissolved with 100 ⁇ L of water, and subjected to HPLC.
  • rebM was not hydrolyzed.
  • rebD and rebA were partially hydrolyzed to yield rebB, but no further hydrolyzed product was detected.
  • Stv was partially hydrolyzed to produce steB, but no further hydrolyzed product could be detected.
  • Rub was partially hydrolyzed to form steM and steviol.
  • Rebaudio JM Stevia Extract Hydrolysis
  • Steviron S-100 Stevia Extract Hydrolysis
  • AOBGL11p The reaction conditions were: Rebaudio JM 1 mg / ml (FIG. 8) or 10 mg / ml (FIG. 7), or Steviron S-100 1 mg / ml (FIG. 9), enzyme solution 20 ⁇ l, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5). , 0%, 4% or 8% acetonitrile, the total volume was 100 ⁇ l, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 24 hours.
  • reaction solution was washed with acetonitrile and then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water. Subsequently, the reaction solution was washed with 20% acetonitrile and then eluted with 50% acetonitrile. The eluate was dried with a speed bag, redissolved with 100 ⁇ L of water, and subjected to HPLC.
  • Sep-PakC18 Waters
  • AOBGL11 cDNA Cloning of AOBGL11 cDNA The BGL11-1 strain was cultured in 10 ml of enzyme production medium, and the cells were collected by filtration. The cells were frozen with liquid nitrogen, ground in a mortar, and then total RNA was extracted with RNeasy (QIAGEN). CDNA was synthesized by SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Life Technologies). Using this as a template, PCR was performed with KOD-plus (Toyobo) using primers AOBGL11-F and AOBGL11-R.
  • the obtained DNA fragment of about 2.52 kbp was cloned by using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) to obtain the cDNA of AOBGL11 to obtain plasmid pCR-AOBGL11 cDNA.
  • the CDS sequence was as shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 10 shows a comparison of the AOBGL11 genomic DNA sequence and the CDS sequence.
  • Plasmid pCR-AOBGL11 cDNA was digested with EcoRI, and a DNA fragment of about 2.52 kbp was transformed into yeast expression vector pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221- 1228, 1995), and the one in which AOBGL11 was inserted in such a direction as to express from the GAPDH promoter of the vector pYE22m was selected as pYE-AOBGL3c.
  • the EH13-15 strain (trp1, MAT ⁇ ) of S. cerevisiae (Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989) was used as a parent strain for transformation.
  • EH13-15 strain was transformed by lithium acetate method using plasmids pYE22m (control) and pYE-AOBGL11 (for AOBGL11 expression), respectively.
  • the transformed strain was SC-Trp (per 1 L, yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, and amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine 0.6 g, aspartic acid 3 g, Glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, leucine 1.8 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g, uracil 0.6 g 1) containing 1.3 g) and those growing on an agar medium (2% agar) were selected.
  • SC-Trp per 1 L
  • the strain obtained by transformation with plasmid pYE22m was designated as CY strain, and the strain obtained by transformation with plasmid pYE-AOBGL11 was designated as AOBGL11-Y strain.
  • the selected CY strain and AOBGL11-Y strain were inoculated with 1 platinum ear in 10 mL of SC-Trp liquid medium supplemented with 1/10 volume of 1M potassium phosphate buffer, and cultured with shaking at 30 ° C. and 125 rpm for 2 days. .
  • the obtained culture was separated into a culture supernatant and cells by centrifugation.
  • the culture supernatant was concentrated to ultrafiltration with Amicon Ultra-15 50k (Merck), substituted with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% CHAPS, and about 1 ml of culture supernatant concentrate.
  • the cells are suspended in 1 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and 0.1% CHAPS solution.
  • the cells are disrupted with glass beads, and the supernatant obtained by centrifugation is disrupted. Liquid. Take 20 ⁇ l of the culture supernatant concentrate or cell disruption solution, add 1 ⁇ l of 2% X- ⁇ -Glc / DMF solution and react at room temperature for 5 minutes. Only the cell disruption solution derived from AOBGL11-Y strain is blue. And was suggested to have X- ⁇ -Glc activity.
  • the absorbance change at 405 nm per minute ( ⁇ 405) based on p-nitrophenol (pNP) released by hydrolysis of pNP- ⁇ -Glc was 0.068 in the AOBGL11-Y crude enzyme solution, and CY crude enzyme.
  • the liquid was 0.000.
  • Steviol glycoside hydrolyzing activity was examined in the cell disruption fluids of the CY and AOBGL11-Y strains. Substrate 50 ⁇ g / ml, enzyme solution 20 ⁇ l, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), the total volume was 100 ⁇ l, and reacted at 50 ° C. The reaction solution was washed with acetonitrile, then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water, subsequently washed with 20% acetonitrile, and eluted with 50% acetonitrile. The eluate was dried with a speed bag, redissolved with 100 ⁇ L of water, and subjected to HPLC.
  • Sep-PakC18 Waters
  • Rebaudioside C steviol glycoside containing rhamnose
  • Rebaudioside C rebC
  • the crude enzyme solution used was a protein concentration of 6.5 mg / ml (stock solution, C), a 1/1000 diluted solution (B), and a solution concentrated approximately 20 times by ultrafiltration (C).
  • reaction solution was washed with acetonitrile, then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water, subsequently washed with 20% acetonitrile, and then eluted with 50% acetonitrile.
  • the eluate was evaporated to dryness and then redissolved with 100 ⁇ L of water and subjected to HPLC and LC-MS. The results are shown in FIG.
  • RT16.2 minutes and RT17.5 minutes were recognized as hydrolysis products. From the relationship between the amount of enzyme and the product, it was considered that a product of RT16.2 minutes was first produced and further hydrolyzed to produce a product of RT17.5 minutes.
  • the peak at RT 16.2 min was m / z 787.4, steviol glycoside (2Glc + Rha), but RT did not match that of dulcoside A.
  • BGL11 preferentially hydrolyzes the sugar added at position 19, it is inferred that it is steviol glycoside C (13th position: Rha ⁇ 1,2 (Glu ⁇ 1,3) Glc ⁇ 1-, 19th position: H). It was done. On the other hand, the peak at RT 17.5 min is m / z 625.3, steviol glycoside (Glc + Rha), which is considered to be a hydrolyzate of steviol glycoside C. Therefore, steviol glycoside A (13 Position: Rha ⁇ 1,2Glc ⁇ 1-, 19th position: H). SteM or steE with 1 glucose added to steviol and steviol, which is an aglycon, could not be detected, suggesting that BGL11 cannot hydrolyze the rhamnoside bond.
  • rebaudioside F steviol glycoside containing xylose
  • rebaudioside F steviol glycoside containing xylose
  • BGL11 crude enzyme solution protein concentration 6.5 mg / ml
  • 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5
  • the reaction solution was washed with acetonitrile, then subjected to Sep-PakC18 (Waters) equilibrated with water, subsequently washed with 20% acetonitrile, and then eluted with 50% acetonitrile.
  • the eluate was evaporated to dryness and then redissolved with 100 ⁇ L of water and subjected to HPLC and LC-MS. The results are shown in FIG. 13 and the following table.
  • BGL11 could not hydrolyze rebC to steviol, which is an aglycon, and therefore it was considered that BGL11 hydrolyzed rebF to steviol, which is an aglycone. That is, it was suggested that BGL11 can hydrolyze the xyloside bond.

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Abstract

ステビオール配糖体およびステビオールの新たな製造方法が求められていた。 本発明は、ステビオール配糖体の１３位グルコシド結合、１９位グルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を切断する工程を含む、ステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法を提供する。

Description

ＡＯＢＧＬ１１ホモログを用いたステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法
　本発明は、ステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法に関する。
　キク科ステビア（Stevia rebaudiana）の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール（Ｓｔｅｖｉｏｌ）とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオールに糖が付加したステビオール配糖体の中には砂糖の約３００倍もの甘味を呈するものがあり、それらはカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム（Ａｓｐａｒｔａｍｅ）やアセスルファムカリウム（Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料がより安全で消費者理解（Ｐｕｂｌｉｃ　Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ）が得られやすいと期待される。
　ステビオール配糖体のうちステビオシド（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ：ｓｔｅｖ）は、ステビオールに３つのグルコースが付加した化合物で、一般的なステビアの葉にもっとも多く含まれている。ステビオシド（ｓｔｖ）は、ショ糖のおよそ３００倍の甘味度を有するが若干の苦味を呈する。ステビオール配糖体のレバウジオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ；ｒｅｂＡ）は、ステビオールに４つのグルコースが付加された化合物で、ショ糖のおよそ４００倍の甘味度を有する。ステビオシドとレバウジオシドＡがステビアの甘味の中心的な物質である。また、ステビオールにグルコースが５つ付加したレバウジオシドＤ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ｄ；ｒｅｂＤ）、グルコースが６つ付加したレバウジオシドＭ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ｍ；ｒｅｂＭ）といった配糖体も知られている。また、甜茶には、ステビオールの１３位と１９位にそれぞれグルコースが１つずつ付加されたルブソシド（ｒｕｂ）が含まれており、これが甜茶の主な甘味成分であることが知られている。これら以外に、反応中間体と思われる配糖体や糖の種類の違う類縁体の存在が知られている（図１）。
　また、ステビオールについては、認知機能の改善効果などが知られている。
　ステビオール配糖体のうち、特定のグリコシド結合にのみ作用する酵素を利用することができれば、特定の配糖体を選択的に生産したり、不要な配糖体を除去したりすることが可能になり、ステビア抽出物の味質の改善や特定のステビオール配糖体の精製が容易になるなどのメリットが大きい。
さらに、酵母等を利用して、ステビオールを出発物質とし、ステビオールを配糖化してステビオール配糖体を得る工程においても、ステビオールは有用である。培地中にステビオールを添加すれは、酵母は菌体内に取り込むことが可能であるため、ステビオール配糖化酵素遺伝子を菌体内に発現させた酵母を、ステビオールを含む培地で培養すると、当該酵母は菌体内にステビオールを取り込んで配糖化することができる。一方、ステビオール配糖体を培地中に添加しても酵母は菌体内に取り込むことができず、さらなる配糖化はできないことが分かっている。このように、酵母細胞内への取り込みに際しては、ステビオール配糖体よりステビオールの方が望ましく、ステビオールの需要がある。
　ステビオール配糖体を加水分解する酵素活性については、いくつかの生物種において報告されている。その中でも、アスペルギルス属糸状菌がステビオール配糖体加水分解酵素を生成することに関して、生醤油中には、ステビオシドをルブソシドに加水分解する活性があること（非特許文献１）、Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ酵素剤やＨｅｓｐｅｒｉｄｉｎａｓｅ酵素剤、Ｔａｋａｄｉａｓｔａｓｅ酵素剤中に、ステビオシドをステビオールに加水分解する活性があることが報告されている（非特許文献２－４）。また、アスペルギルス属糸状菌由来のペクチナーゼ酵素剤とカタツムリ（Helix pomatia）由来の酵素剤を組み合わせて使用することで、ステビオシドからステビオールを製造する方法が報告されている（特許文献１）。Aspergillus aculeatus　由来酵素剤　Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ　Ｌ（ｎｏｖｏｚｙｍｅ）には、ステビオシド→ルブソシド→ステビオールモノグリコシルエステルに加水分解する活性があることが記載されている（非特許文献５）。また、Aspergillus aculeatusの個体培養抽出物にステビオシドをステビオールに変換する活性があることが記載されている（非特許文献６）。
　以上のように、麹菌を含むアスペルギルス属糸状菌はステビオール配糖体加水分解活性を有する酵素遺伝子を有していることが示唆されてはいたものの、酵素活性を担う酵素やそれをコードする遺伝子についての報告はない。
　また、麹菌のAO090009000356遺伝子にコードされるグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）３ファミリーのβ－グルコシダーゼは、β－グルコシド結合を有する二糖類を加水分解するとの報告がある（非特許文献７）。具体的には、β－１，３結合を有するラミナリビオース、β－１，６結合を有するβ－ゲンチオビオース、β－１，４結合を有するセロビオース、β－１，２結合を有するソホロースの順に加水分解の特異性が高い。しかし、ステビオール配糖体をはじめとするテルペン配糖体を加水分解する活性があるかどうかは報告されていない。
　それ以外の生物でも、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することが報告されている。例えば、クラビバクター属細菌が、ルブソシドの１９位グルコシルエステル結合を分解するが１３位グルコシド結合は分解しない酵素を有することが開示されている（特許文献２）。また、Flavobacterium johnsonae由来のβ－グルコシダーゼに、ステビオール配糖体を分解する活性（１３位β－グルコシド結合と１９位グルコシルエステル結合を加水分解する活性）があることが報告されている（非特許文献８）。
また、Penicillium decumbens由来のナリンゲナーゼに、ステビオシドからルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオールモノグルコシドを経てステビオールに加水分解する酵素があり、この酵素は分子量１２１ｋＤａのタンパク質でｐＨ２．３－６．０、温度４０－６０℃で安定な酵素であることが報告されている（非特許文献９）。
　しかしながら、これらはいずれもステビオール配糖体を加水分解する活性を見出してはいるものの、その活性を担う遺伝子については特定されていない。
　さらに、麹菌には、β－グルコシダーゼ様活性を有するＧＨ３ファミリー酵素やＧＨ５ファミリー酵素をコードすると考えられる遺伝子が多数存在しており、酵素活性が検出できても、どの遺伝子がその活性を担っているかを特定するのは容易ではない。
特表2013-516963 特開平10-276775 特開平10-276775
日本食品工業学会誌　第37巻　第5号　369-374(1990) Phytochemistry,6,1107(1967) 薬誌，95,1507(1975) 日化誌，1981,726(1981) J.Agric.FoodChem.,60,6210-6216(2012) Wei Sheng Wu Xue Bao,54(1),62-68(2014) Biochim Biophys Acta.,1764 972-978(2006) Biosci. Biotechnol. Biochem.,64(2), 333-340, 2000 Appl. Microbiol. Biotechnol., 97, 8151-8161
　上記のような状況の下、ステビオールおよびステビオール配糖体の新たな生産方法が求められていた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＯＢＧＬ１１遺伝子またはそのホモログ遺伝子にコードされる麹菌Aspergillus oryzae var.Brunneus由来のグリコシドヒドロラーゼホモログ（ＧＨ３ファミリー）タンパク質ＡＯＢＧＬ１１ｐが、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することを見出した。さらに、タンパク質ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ステビオール配糖体のグルコシド結合およびグルコシルエステル結合を切断することを見出した。すなわち、ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ステビオール配糖体のステビオールと糖の結合部位である１３位のＯ－グルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、ならびに側鎖内のグリコシド結合を単糖ごとに切断する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　さらに、反応条件を選択することで、ステビオール配糖体のうち、１３位に結合した分岐三糖またはソホロースの加水分解反応や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応が抑制されることを見出した。また、１３位のグルコシド結合よりも、１９位のグルコシルエステル結合を優先して切断することを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］
　以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、第１のステビオール配糖体を反応させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合、のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質。
［２］
　前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＢ，レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［１］に記載の方法。
［３］
　前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
　前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる前記［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
　前記有機溶媒がアセトニトリルである、前記［４］に記載の方法。
［６］
　前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合または13位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）より１９位のグルコシルエステル結合または19位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）を優先して切断する工程を含む、前記［１］～［５］のいずれか一項に記載の製造方法。
［７］
　前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解工程は、下記（１）～（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、前記［１］～［６］のいずれか一項に記載の製造方法、
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
［８］
　宿主細胞に、以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、前記第１のステビオール配糖体と接触させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および／または側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［９］
　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［８］に記載の方法。
［１０］
　前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］
　前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［８］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
　前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、前記［８］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
　前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる、前記［８］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
　前記有機溶媒がアセトニトリルである、前記［１３］に記載の方法。
［１５］
　前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解する工程は、下記（１）～（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、前記［８］～［１４］のいずれか一項に記載の製造方法、
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
［１６］
　以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１７］
　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［１６］に記載の方法。
［１８］
　前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記［１６］または［１７］に記載の方法。
　本発明の方法により、ステビオールおよびステビオール配糖体の新たな製造方法が提供される。本発明の方法により、ステビオールを製造することができる。
　また、反応条件を選択することで、ステビオール配糖体を製造することができる。具体的には、反応条件を選択することで、１３位に結合した分岐三糖またはソホロースや、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応を抑え、これらの糖鎖を有するステビオール配糖体を製造することができる。ここで、分岐三糖とは、アグリコンであるステビオールと結合している１つのグルコースに更に２つのグルコースが結合したものであって、一方の結合がβ２→１であり、もう一方はβ３→１であるものをいう。
　具体的には、レバウジオシドＢ（ｒｅｂＢ）やステビオールビオシド（ｓｔｅＢ）、ステビオールモノシド（ｓｔｅＭ）を生成することができる。
さらに、本発明の方法ではラムノシド結合を加水分解しないので、ステビオール配糖体の混合物に本酵素を作用させることで、ラムノシドを有する配糖体を特異的に得ることもできる。
Ａ：反応液に有機溶媒が含まれていないときの反応経路。 Ｂ：反応液にアセトニトリルが含まれているときの反応経路。 Ａ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適ｐＨ。Ｂ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度。Ｃ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐのｐＨ安定性。Ｄ：ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質とした、ＡＯＢＧＬ１１ｐの熱安定性。 ｒｅｂＭ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＬＣ－ＭＳ分析。Ａ：基質のみ。Ｂ：アセトニトリル添加なし。　Ｃ：アセトニトリル　８％。 ｒｅｂＤ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル　８％。 ｒｅｂＡ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル　８％。 Ａ：レバウディオＪＭのＨＰＬＣ分析。Ｂ：ステビロン　Ｓ－１００ＨＰＬＣ分析。 レバウディオＪＭ（１ｍｇ／ｍｌ）の加水分解物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル　４％。Ｃ：アセトニトリル　８％。 レバウディオＪＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）の加水分解物のＨＰＬＣ分析。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル　４％。Ｃ：アセトニトリル　８％。 ステビロン　Ｓ－１００（１ｍｇ／ｍｌ）の加水分解物の分析結果。Ａ：アセトニトリル添加なし。Ｂ：アセトニトリル　４％。Ｃ：アセトニトリル　８％。 ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１Ｇ）とｃＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１ＣＤＳ）の比較。 ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１Ｇ）とｃＤＮＡ配列（ＡＯＢＧＬ１１ＣＤＳ）の比較（図１０Ａの続き）。 ＡＯＢＧＬ１１ｐ（アミノ酸配列：配列番号２）、ＡＯＢＧＬ３ｐ（アミノ酸配列：配列番号５）およびＡＯＢＧＬ１ｐ（アミノ酸配列：配列番号６）のアミノ酸配列の比較。 ＡＯＢＧＬ１１ｐ（アミノ酸配列：配列番号２）、ＡＯＢＧＬ３ｐ（アミノ酸配列：配列番号５）およびＡＯＢＧＬ１ｐ（アミノ酸配列：配列番号６）のアミノ酸配列の比較（図１１Ａの続き）。 レバウジオシドＣ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。反応時間は２４時間。図１２Ａは基質のみのデータであり、図１２Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれ、本発明のタンパク質の濃度の違いである（Ｂ:１/１０００希釈、Ｃ:原液、Ｄ:２０倍濃縮)。 レバウジオシドＦ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を基質としたＢＧＬ１１粗酵素液による生成物のＨＰＬＣ分析。図１３Ａは基質のみのデータであり、図１３Ｂ及びＣはそれぞれ反応時間の違いである（Ｂ:１時間、Ｃ:２４時間)。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2016年5 月25日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2016-104404号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　「ＡＯＢＧＬ１１」は、麹菌Aspergillus oryzae由来のβ－グルコシダーゼであり、そのＣＤＳ配列（配列番号１）、アミノ酸配列（配列番号２）、ＯＲＦ配列（配列番号３）およびゲノムＤＮＡ配列（配列番号４）は、添付の配列表にそれぞれ示される。
１．ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法
　本発明は、以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有する第１のステビオール配糖体を反応させて、当該第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、方法を提供する。一実施形態において、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合より１９位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される。また、一実施形態において、本発明は反応液に有機溶媒を含むステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法を提供する。また、一実施形態において、本発明は反応液にアセトニトリルを含むステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質
　上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、”Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons 1987-1997”、”Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)”、”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、”Gene,34,315(1985)”、”Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　「配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１～８３個、１～８０個、１～７５個、１～７０個、１～６５個、１～６０個、１～５５個、１～５０個、１～４９個、１～４８個、１～４７個、１～４６個、１～４５個、１～４４個、１～４３個、１～４２個、１～４１個、１～４０個、１～３９個、１～３８個、１～３７個、１～３６個、１～３５個、１～３４個、１～３３個、１～３２個、１～３１個、１～３０個、１～２９個、１～２８個、１～２７個、１～２６個、１～２５個、１～２４個、１～２３個、１～２２個、１～２１個、１～２０個、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個（１～数個）、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　ここで、「ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを加水分解する活性」とは、アグリコンであるステビオールに糖が結合した配糖体であるステビオール配糖体において、ステビオールの１３位のＯ－グルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを切断（加水分解）する活性を意味する。ある実施形態において、すべてのグルコシド結合（ラムノシド結合を除く）、グルコシルエステル結合が加水分解され、ステビオール配糖体からステビオールを生じる。別の実施形態では、第１のステビオール配糖体は１３位に分岐三糖、二糖またはグルコースが結合し、かつ１９位に分岐三糖、二糖またはグルコースが結合したものであり、当該第１のステビオール配糖体の１３位に結合した分岐三糖または二糖や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応が抑制され、１３位のグルコシド結合や１９位の二糖内のグルコシド結合やグルコシルエステル結合が優先的に加水分解される。さらに、別の実施態様では、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合よりも１９位のグルコシルエステル結合が優先して切断される。このように、一部の加水分解反応を抑制することで、一部の糖のみ切断されたステビオール配糖体を生じる。
　ここで、グリコシド結合とは糖と糖または糖と別の有機化合物が脱水縮合して形成する共有結合のことを意味し、グリコシド結合のなかでもグルコースの1位の炭素との結合をグルコシド結合、ラムノースの1位の炭素との結合をラムノシド結合、キシロースの1位の炭素との結合をキシロシド結合という。
　本発明のタンパク質は、ステビオール配糖体のステビオール（アグリコン）と糖との間の結合（１３位グルコシド結合、１９位グルコシルエステル結合）、および、側鎖内の分グリコシド結合を切断するが、その際に切断される結合からラムノシド結合は除かれる。
　ある実施態様では、前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、本願発明は、下記（１）～（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の切断を行うことができる。
（１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合に対する優先的な切断；
（２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースに優先的な切断；
（３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）に対する優先的な切断；
（４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合に対する優先的な切断；
（５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合に対する優先的な切断
　ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）の少なくとも１つを加水分解する活性は、本発明のタンパク質と、たとえばステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよびレバウジオシドＦ、レバウジオシドＭなどの、ステビオール配糖体を反応させて、得られた反応生成物を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
　「配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１～８３個のアミノ酸配列中の位置において、１～８３個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ　ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
　本発明において、「ステビオール配糖体」とは、アグリコンであるステビオールに糖が結合した配糖体である。ステビオールおよびステビオール配糖体の例は、下記一般式（Ｉ）で示される。

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表において、ステビオール配糖体ＡおよびＣは、レバウジオシドＣと本発明のタンパク質とを反応させることにより得られる生成物であり、また、ステビオール配糖体ＢおよびＤはレバウジオシドＦと本発明のタンパク質とを反応させることにより得られる生成物である。ステビオール配糖体Ａ～Ｄに該当する化合物には公称名が存在しないため、本願では仮の名称として「ステビオール配糖体Ａ～Ｄ」と称する。
　上記表において、「Ｇｌｃ」はグルコースを示し、「Ｇｌｃ－」は、モノグルコシド結合（Ｒ１位）またはモノグルコシルエステル結合（Ｒ２位）を含むことを示す。「Ｒｈａ」および「Ｘｙｌ」はそれぞれラムノースおよびキシロースを表す。Ｒ１位またはＲ２位に結合している糖鎖が分岐三糖の場合、アグリコンであるステビオールと結合している１つのグルコースに更に２つのグルコースが結合しており、一方の結合がβ１，２結合であり、もう一方はこれに分岐してβ１，３結合していることを表す。また、「側鎖」とはステビオールに結合した糖または糖鎖を意味する。
　本発明に係るステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法によって、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つが加水分解される。その例を図に示した（図１）。表２に反応液中に有機溶媒を含まないときの基質と生成物、表３に反応液中にアセトニトリルを添加した場合の基質と生成物をそれぞれまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の酵素を使用した場合、反応液に有機溶媒を含まない場合は、ステビオール配糖体のすべてのグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、グルコシルエステル結合が加水分解されステビオールが生じる。
　また、本発明の酵素活性は、たとえばアセトニトリルなどの溶媒を反応液中に加える等の方法で一部のグリコシド結合やグルコシルエステル結合の加水分解活性を抑制することができる。すなわち、アセトニトリルなどの有機溶媒を反応液中に加えることで、１３位に結合した分岐三糖または二糖の側鎖内のグリコシド結合や、１９位に結合した分岐三糖グリコシド結合の加水分解反応を抑制し、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合や１９位の二糖内のグリコシド結合や、１９位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される。これにより、例えば、レバウジオシドＤやレバウジオシドＡからレバウジオシドＢを、ステビオシドからステビオールビオシドを得ることができる。また、ステビオール配糖体の混合物から、例えばレバウジオシドＭやレバウジオシドＢ、ステビオールビオシド以外のステビオール配糖体をステビオールに加水分解することで、これらのステビオール配糖体の精製を容易にすることも可能である。
　本願において、「ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合より１９位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される」とは、ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合より１９位のグルコシルエステル結合を選択的に好んで加水分解することである。例えば、ルブソシドやステビオシドを基質とした場合は、ステビオールやステビオールモノグルコシルエステルよりもステビオールモノシドやステビオールビオシドが優先的に生成し、レバウジオシドＤやレバウジオシドＡを基質とした場合は、ステビオールよりもレバウジオシドＢが優先的に生成する。
　本願において、「分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程」では、基質が１３位または１９位に分岐三糖が結合している場合と、基質が二糖やグルコース単糖が結合している場合、基質の二糖内の結合やグルコース単糖とアグリコンとの結合が優先的に加水分解されることになる。例えば、ステビオール配糖体の混合物を基質とした場合は、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢの側鎖の分岐三糖は殆ど加水分解されず、１９位の側鎖内に二糖のグルコシド結合や１９位にグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が有する１９位の側鎖内の二糖のグルコシド結合や１９位のグルコシルエステル結合が好んで加水分解されることになる。
　また、「アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程」では、例えば、ステビオール１３位にグルコースが結合し、そのグルコースにさらにキシロース（β１，２結合）とグルコース（β１，３結合）したステビオール配糖体を本発明の酵素と接触させた場合、グルコースとのβ１，３結合が優先的に加水分解される。この工程によりレバウジオシドＦを加水分解すると１９位のグルコシルエステルが優先的に加水分解され、次いで１３位の分岐三糖のグルコース（β１，３）結合が加水分解される。
　「１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程」において、例えば、レバウジオシドＭを本発明の酵素と接触させると中間産物としてレバウジオシドＢが生じ、次いで最終分解物としてステビオールが生じる。
　「１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程」において、例えば、アセトニトリルなどの有機溶媒を反応液中に加えることで加水分解反応を反応を抑制した条件下でレバウジオシドＭを加水分解することにより、１９位の分岐三糖が加水分解されてレバウジオシドＢが生じるという点で、１９位の分岐三糖は１３位の分岐三糖に比べ優先的に加水分解されることになる。別の例としてはステビオシドを加水分解した際に、１３位の二糖の加水分解と比べて優先的に１９位のグルコース単糖とのグルコシルエステル結合が切断され、ステビオールビオシドが生じることになる。
　「１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程」では、例えば、ルブソシドを本発明の酵素で加水分解すると、優先的に１９位のグルコース単糖とのグルコシルエステル結合が切断され中間体としてステビオールモノシドが生じることになる。
　本発明のステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法において、出発物質となる１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体は、ステビアやテンチャ（Rubus suauissimus）から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー　（Ｕｌｔｒａ　（Ｈｉｇｈ）　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）　等の公知の方法によって抽出し、精製することによって入手することができる。あるいは、出発物質となる１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体は、市販のものでもよい。
　本発明に係るステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法は、本発明のタンパク質と、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を反応させて、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成した本発明のステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。
　ステビオールおよび／または本発明のステビオール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ　（Ｈｉｇｈ）　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
　本発明に係るステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法は、基質を含む反応液に有機溶媒を添加した条件下で行うことができる。有機溶媒は、反応液全量に対し１％～２０％の範囲とすることができ、好ましくは５％～１５％、６～１２％、より好ましくは８％である。有機溶媒は、一般的に入手可能なものでよく、好ましくは水と任意の割合で混合するものがよく、アセトニトリルを用いることが出来る。有機溶媒は、反応液に予め添加してもよく、また反応の途中段階で添加してもよい。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
　配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
　「配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
　「配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
　本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol. 4,Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons 1987-1997”などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５～６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990;Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
　本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。
　本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
　適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
　を含むように構成される。
　発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
　本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ－１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ　ｍａｍｍａｒｙ　ｔｕｍｏｒ　ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
　発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,vol. 81,p.337,1984）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，　ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，vol.64, p.660, 1992; Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991）などが利用可能である。
　本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、糸状菌（麹菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、酵母または植物である。
形質転換で用いられる宿主は、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を生成するものであれば好ましい。ステビアやテンチャのように、元来少なくとも１つの１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体を生成する植物だけではなく、本来１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体を生成しない細胞または生物に少なくとも１つの１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合および／または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、WO2011/093509などに記載のステビオールやステビオール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。
　宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie,D.A.et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, p.4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75,p.1929,1978）、酢酸リチウム法（J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983）、Methods in yeast genetics,2000 Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。また、植物、もしくは植物に由来する組織や細胞への遺伝子導入の際には、例えばアグロバクテリウム法（Plant Molecular Biology Mannual, Gelvin, S.B.et al., Academic Press Publishers）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポーレーション法などを適宜選択して用いることができる。
　形質転換体が、酵母または麹菌である場合、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母または麹菌は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母または麹菌で生成された１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有する第１のステビオール配糖体と反応し、当該第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つが切断され、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体が酵母または麹菌の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
　形質転換体が、植物である場合、本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成された１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体と反応し、ステビオールが植物中に生成する。また、植物体のなかの環境が加水分解反応に最適でない場合は、１３位に結合した分岐三糖または二糖や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応は抑制され、１３位のモノグルコシド結合や１９位に結合した二糖内のグリコシド結合や１９位のグルコシルエステル結合が切断されたステビオール配糖体が生成する。
　ある実施態様において、本発明の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のステビオール配糖体の含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のステビオール配糖体が高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のステビオール配糖体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のステビオール配糖体を含む培養上清を得ることができる。
　このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のステビオール配糖体の精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。
　非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を用いた本発明のステビオール配糖体および／またはステビオールの製造方法
　本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質を作用させることで、本発明のステビオール配糖体および／またはステビオールを生成することもできる。
　具体的には、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体と接触させることによりステビオールを生成することができる。また、反応液中にアセトニトリルのような有機溶媒を添加することで、１３位に結合した分岐三糖または二糖や、１９位に結合した分岐三糖の加水分解反応は抑制され、優先して１３位のモノグルコシド結合や１９位のに結合した二糖内のグリコシド結合や１９位のグルコシルエステル結合やが切断されたステビオール配糖体が生成する。本発明のタンパク質は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことが実施例においても確認されている。
「形質転換細胞に由来する酵素」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有する第１のステビオール配糖体と接触させて、当該第１ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含むステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、方法を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシドの結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　上記（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。
　「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素と１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を含む容器に１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素と１３位のグリコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体とを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体を含む容器に添加することが含まれる。
　「ステビオール配糖体」、「１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも１つを有するステビオール配糖体」、及び「ステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）のうち少なくとも１つを加水分解する活性」は、前記と同様である。
　その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY）”等を参照することができる。
　このようにして得られた本発明のステビオール配糖体は、常法に従って、例えば、飲食品、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
　本発明において、「飲食品」には固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、経口摂食可能なものの総称である。本発明の飲食品の例としては、栄養補助飲食品、健康飲食品、機能性飲食品、幼児用飲食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用飲食品等が挙げられる。
　栄養補助飲食品とは、特定の栄養成分が強化されている飲食品をいう。健康飲食品とは、健康的な又は健康によいとされる飲食品をいい、栄養補助飲食品、自然飲食品、ダイエット飲食品等を含む。機能性飲食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための飲食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用飲食品とは、約6歳までの子供に与えるための飲食品をいう。老人用飲食品とは、無処理の飲食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された飲食品をいう。乳児用調製乳とは、約1歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
　本願において、「少なくとも」との文言は、特定の項目の数が、挙げられた数以上であってよいことを意味する。また、本願内において、「約」との文言は、主体が「約」に続く数値の±２５％、±１０％、±５％、±３％、±２％または±１％の範囲に存在することを意味する。例えば「約１０」は、７．５～１２．５の範囲を意味する。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。
麹菌のβ‐グルコシダーゼ遺伝子の探索
　麹菌ゲノムデータ（PRJNA28175）より、β－グルコシダーゼホモログを探索し、菌体内β‐グルコシダーゼのホモログであるAO090701000244（ＣＤＳ配列：配列番号１、推定アミノ酸配列：配列番号２、ＯＲＦ配列：配列番号３、ゲノムＤＮＡ配列：配列番号４）を見出した。これをＡＯＢＧＬ１１としてクローン化することにした。
ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡのクローニング
　ＡＯＢＧＬ１１をクローニングするために、以下のプライマーを設計した。
ＡＯＢＧＬ１１－Ｆ：
　５´‐ＡＴＧＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＡ‐３´（配列番号７）
ＡＯＢＧＬ１１－Ｒ：
　５´‐ＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＧＡ‐３´（配列番号８）
　麹菌　Aspergillus oryzae var.Brunneus（ＩＦＯ３０１０２）の分生子を液体培地（１Ｌあたり、グルコース　２０ｇ、バクトトリプトン　１ｇ、酵母エキス　５ｇ、ＮａＮＯ３　１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１日間培養した。ろ過により菌体を集め、液体窒素中ですりつぶしたあと、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
　ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１－ＦとＡＯＢＧＬ１１－Ｒを用いて、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってクローン化し、プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。
麹菌発現用ベクターの構築
　麹菌用ベクターｐＵＮＡ（酒類総合研究所）を制限酵素ＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によって平滑化して得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＵＮＡ－ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。
麹菌の形質転換
　麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
　宿主として、Aspergillus oryzae ｎｉａＤ３００株（酒類総合研究所）を使用した。宿主株をＰＤＡプレートに植菌し、３０℃でおよそ１週間培養した。分生子懸濁液を得るために、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁した。
　分生子をＣＤプレート（１Ｌあたり、ＮａＮＯ３　６ｇ、ＫＣｌ　０．５２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　１．５２ｇ、グルコース　１０ｇ、１Ｍ　ＭｇＳＯ４　２ｍｌ、Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｌあたり、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　８．８ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　０．４ｇ、ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ　０．１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ　０．０５ｇ　）　１ｍｌ、アガー　２０ｇ（ｐＨ６．５））に塗布し、パーティクルデリバリー法により、ＤＮＡの導入を行った。ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ（バイオラッド）を使って、パーティクル：タングステンＭ－１０、ラプチャーディスク：１１００ｐｓｉ、距離：３ｃｍとした。形質転換株として、ＣＤプレートで生育するものを選抜した。プラスミドｐＵＮＡ－ＡＯＢＧＬ１１ｇにより形質転換して得られた形質転換株をＢＧＬ１１－１株、コントロールベクターｐＵＮＡにより形質転換して得られた形質転換株をＣ－１株とした。
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
　ＢＧＬ１１－１株またはＣ－１株をＣＤプレートに植菌し、３０℃で７日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％　ｔｗｅｅｎ８０，　０．８％　ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液としたこの分生子懸濁液を酵素生産用液体培地（１Ｌあたり、マルトース　１００ｇ、バクトトリプトン　１ｇ、酵母エキス　５ｇ、ＮａＮＯ３　１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０１ｇ）　に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。ミラクロスによりろ過して菌体を集めた。得られた湿菌体　約４ｇを液体窒素で凍結し、乳鉢ですりつぶした。すりつぶした菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、よく混合した後、遠心分離した。得られた上清を、アミコンウルトラ－１５　５０ｋ（メルク）で、限外ろ過により濃縮し、０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０（バッファーＡ）で置換することにより、約１ｍｌの粗酵素液を得た。
タンパク質濃度の測定
　粗酵素液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク）を用いて定量した。その結果、ＢＧＬ１１－１粗酵素液　６．４６ｍｇ／ｍｌ、Ｃ－１粗酵素液４ｍｇ／ｍｌであった。
ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ分解活性
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ水溶液　５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１－１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ　が加水分解して遊離したｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＢＧＬ１１－１粗酵素液で０．２４４、Ｃ－１粗酵素液で０．０００であった。
　以上のことからも、ＡＯＢＧＬ１１ｐがβ－グルコシダーゼ活性を担っていることが示唆された。
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃを基質として、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度、至適ｐＨおよび熱安定性、ｐＨ安定性を調べた（図２）。
　なお、ＢＧＬ１１－１粗酵素液はバッファーＡで５０００倍希釈したもの（タンパク質濃度　１．３μｇ／ｍｌ）を使用した。
　至適温度：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　２０μｌ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとし、反応開始から１５分、３０分、４５分に１００μｌをサンプリングして１００μｌ　０．２Ｍ　炭酸ナトリウム溶液と混合してから、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Δ４０５を求めた。Δ４０５が最大となった４５℃を１として、各温度で反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ｂに示した。これにより、４５－５０℃が反応至適温度であることが分かった。
　至適ｐＨ：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　２０μｌ、０．２Ｍ　バッファー　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとした。バッファーは、ｐＨ４．０－６．０のとき酢酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０－８．０のときリン酸ナトリウムバッファーを用いた。上記と同様にサンプリング、測定を行い、Δ４０５の最大値に対する各ｐＨで反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ａに示した。これにより、ｐＨ６．０－７．０が反応至適ｐＨであることが分かった。
　熱安定性：５０００倍希釈した粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）を３０℃、３７℃、４５℃、５０℃でそれぞれ１０分間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　５μｌ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液　１００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。熱処理しなかった酵素液による４５分後の４０５ｎｍの吸光度に対する各温度で処理したときの比率を求め、図２Ｄに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、１０分間の処理では３７℃まで安定であるが、４５℃での処理で約半分にまで失活し、５０℃の処理では、活性がほぼ失われることが分かった。
　ｐＨ安定性：粗酵素液を、ｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０（０．２Ｍ酢酸バッファー）、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０（０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー）の各バッファーで５０００倍希釈し、３７℃で１時間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）　５μｌ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）　１００μｌ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液　１００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性のもっとも高かったｐＨ６．５で保持したときの吸光度に対する各ｐＨで保持したときの吸光度の比率を求め、図２Ｃに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ｐＨ６．５付近で最も安定であることがわかった。
ステビオール配糖体加水分解活性
　基質として、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、ステビオシド、ルブソシドを用いた。
　ステビオール配糖体はＨＰＬＣまたはＬＣ－ＭＳで分析した。
　ＨＰＬＣの分析条件は以下のとおりである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ　４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；　１０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ２．６）
Ｂ　ｃｏｎｃ．７０％→３０％　４０分　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ　２１０ｎｍ
　ＬＣ－ＭＳ（ＩＴ－ＴＯＦ）の分析条件は以下のとおりである。
カラム：ｍｔａｋｔ　ＳＭ－Ｃ１８　　４．６　ｘ　２５０　ｍｍ
移動相：Ａ；０．５％　酢酸、Ｂ；　メタノール
Ｂ　ｃｏｎｃ．　１０％（０分－５分）→７０％（２０分）→１００％（２５分－３０分）→１０％（３１分―４０分）
流速：０．４ｍｌ／分
反応条件（１）～反応液に有機溶媒を含まない～
　基質　５０μｇ／ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液（タンパク質濃度６．５ｍｇ／ｍｌ）　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ－ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。基質がｒｅｂＭの場合はＬＣ－ＭＳにも供した。
　ｒｅｂＭを基質とした場合には、主な生成物としてステビオールが検出され、中間体としてｒｅｂＤ、ｓｔｖ、ｒｅｂＢが検出された（図３　Ａ）。ｒｅｂＤ（図４　Ａ）、ｒｅｂＡ（図５　Ａ）、ｓｔｖ、ｒｕｂを基質とした場合にも主な生成物はステビオールであった。
　なお、コントロールとしてＣ－１粗酵素液でも同様の反応を行ったがいずれの基質も加水分解されず、生成物は検出できなかったことから、上記ステビオール配糖体加水分解活性はＡＯＢＧＬ１１ｐによるものであると考えられた。
反応条件（２）～反応液にアセトニトリルを含む～　
　基質　５０μｇ／ｍｌ、酵素液　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０％または８％アセトニトリル、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ－ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。
　ｒｅｂＭは、反応液中に８％アセトニトリルを添加した場合、ほとんど分解されなかった（図３　Ｃ）。
　ｒｅｂＤとｒｅｂＡは、８％アセトニトリルを添加した場合でも、加水分解されｒｅｂＢを生じたが、ステビオールは検出されなかった（図４Ｂ、図５Ｂ）。
　ｓｔｖは８％アセトニトリルを添加した場合でも、加水分解されｓｔｅＢを生じ、２４時間の反応で基質は検出できなかった。ｓｔｅＢは、さらにステビオールにまで加水分解されていたが、その量はわずかであった。
　Ｒｕｂは２４時間の反応で加水分解され、ステビオールを生じた。２４時間反応で基質は検出できなかった。
反応条件（３）
　基質　５０μｇ／ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液（タンパク質濃度６．５ｍｇ／ｍｌ）　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、全量を１００μｌとし、５０℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ－ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。
　ｒｅｂＭは加水分解されなかった。
　ｒｅｂＤとｒｅｂＡは一部加水分解され、ｒｅｂＢを生じたが、さらに加水分解された生成物は検出されなかった。
　Ｓｔｖは一部加水分解され、ｓｔｅＢが生成したが、さらに加水分解された生成物は検出できなかった。
　Ｒｕｂは一部加水分解され、ｓｔｅＭとステビオールが生成した。
　以上の結果より、ＡＯＢＧＬ１１ｐによる加水分解反応は以下のとおりであると考えられた。
　（１）ステビオール配糖体をステビオールに加水分解する。中間生成物の存在から、糖を１つずつ加水分解すると考えられる。
　（２）ステビオール１９位に付加された糖をステビオール１３位に付加された糖よりも優先して加水分解する。
　（３）分岐三糖は反応条件によっては加水分解されない。
ステビア抽出物の加水分解
　レバウディオ　ＪＭ（守田化学工業株式会社、図６Ａ）とステビロンＳ－１００（守田化学工業株式会社、図６Ｂ）をＡＯＢＧＬ１１ｐで加水分解した。
　反応条件は、レバウディオ　ＪＭ　１ｍｇ／ｍｌ（図８）または１０ｍｇ／ｍｌ（図７）、またはとステビロンＳ－１００　１ｍｇ／ｍｌ（図９）、酵素液　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０％、４％または８％アセトニトリル、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ－ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。
ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡのクローニング
　ＢＧＬ１１－１株を酵素生産用培地１０ｍｌで培養し、ろ過により菌体を集めた。菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で菌体をすりつぶしてから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１－ＦとＡＯＢＧＬ１１－Ｒを用いて、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡをクローン化し、プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１ｃＤＮＡを得た。塩基配列を確認したところ、ＣＤＳ配列は配列番号１の通りであった。ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とＣＤＳ配列を比較したものを図１０に示す。
酵母用発現ベクターの構築と酵母の形質転換
　プラスミドｐＣＲ－ＡＯＢＧＬ１１　ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＡＯＢＧＬ１１がベクターｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターから発現する向きに挿入されたものを選抜し、ｐＹＥ－ＡＯＢＧＬ３ｃとした。形質転換の親株として、S.cerevisiaeのＥＨ１３－１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989）を用いた。
　プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ－ＡＯＢＧＬ１１（ＡＯＢＧＬ１１発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３－１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ－Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。
　プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換して得られた株をＣ－Ｙ株、プラスミドｐＹＥ－ＡＯＢＧＬ１１で形質転換して得られた株をＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株とした。
　選抜したＣ－Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ－Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。培養上清は、アミコンウルトラ－１５　５０ｋ（メルク）で限界ろ過に濃縮して０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）でバッファー置換し、約１ｍｌの培養上清濃縮液を得た。
　菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液　１ｍｌに懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。
　培養上清濃縮液または菌体破砕液を２０μｌとり、２％　Ｘ‐β‐Ｇｌｃ／ＤＭＦ溶液を１μｌ添加し、室温で５分間反応させたところ、ＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株由来の菌体破砕液のみ青色を呈し、Ｘ－β－Ｇｌｃ活性を有することが示唆された。
ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ活性測定
　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ　ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ水溶液　５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１－１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％　ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ－β－Ｇｌｃ　が加水分解して遊離したｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＡＯＢＧＬ１１－Ｙ粗酵素液で０．０６８、Ｃ－Ｙ粗酵素液で０．０００であった。
ステビオール配糖体の加水分解活性
　Ｃ－Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株の菌体破砕液のステビオール配糖体の加水分解活性を検討した。
　基質　５０μｇ／ｍｌ、酵素液　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）、全量を１００μｌとし、５０℃で反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したＳｅｐ－ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣに供した。
　Ｃ－Ｙ株由来の菌体破砕液で反応した場合、いずれのステビオール配糖体でも生成物を検出することはできなかった。
　一方、ＡＯＢＧＬ１１－Ｙ株由来の菌体破砕液で反応した場合、以下の表に示す基質と生成物が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　一方、反応液中に８％アセトニトリルを添加すると以下の表に示す基質と生成物が得られた。。
 
　このように、ＡＯＢＧＬ１１は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことがわかった。
レバウジオシドＣ（ラムノースを含むステビオール配糖体）の加水分解
　レバウジオシドＣ（ｒｅｂＣ）　５０μｇ/ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５）、全量を１００μｌとし、３７℃で２４時間反応させた。粗酵素液は、タンパク質濃度６.５ｍｇ/ｍｌのもの（原液、Ｃ）、１/１０００希釈したもの（Ｂ）、限外ろ過により約２０倍濃縮したもの（Ｃ）をそれぞれ用いた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ-ＰａｋＣ１８(Ｗａｔｅｒｓ)に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳに供した。結果を図１２に示す。
　レバウジオシドＣを基質とした場合、加水分解産物として、ＲＴ１６．２分、ＲＴ１７．５分の２つのピークが認められた。酵素量と生成物の関係から、まずＲＴ１６．２分の産物が生成し、それがさらに加水分解されてＲＴ１７．５分の産物が生成すると考えられた。ＬＣ－ＭＳ分析の結果を合わせると、ＲＴ１６．２分のピークは、ｍ/ｚ ７８７.４、ステビオール配糖体（２Ｇｌｃ　＋　Ｒｈａ）ではあるが、ズルコシドＡとはＲＴが一致しなかった。ＢＧＬ１１が１９位に付加された糖を優先的に加水分解するという性質からも、ステビオール配糖体Ｃ（１３位：Ｒｈａα１，２(Ｇｌｕβ１，３)Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。一方、ＲＴ１７．５分のピークはｍ/ｚ　 ６２５.３、ステビオール配糖体（Ｇｌｃ　＋　Ｒｈａ）であり、ステビオール配糖体Ｃの加水分解物だと考えられるので、ステビオール配糖体Ａ（１３位：Ｒｈａα１，２Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）とであると推察された。ステビオールにグルコース１個が付加されたｓｔｅＭやｓｔｅＥ、アグリコンであるステビオールを検出できなかったことから、ＢＧＬ１１は、ラムノシド結合を加水分解できないことが示唆された。
レバウジオシドＦ（キシロースを含むステビオール配糖体）の加水分解
　レバウジオシドＦ（ｒｅｂＦ）５０μｇ/ｍｌ、ＢＧＬ１１粗酵素液(タンパク質濃度６．５ｍｇ/ｍｌ)　２０μｌ、　５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.５）、全量を１００μｌとし、３７℃で１時間（図１３Ｂ）または２４時間（図１３Ｃ）反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したＳｅｐ-ＰａｋＣ１８(Ｗａｔｅｒｓ)に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、５０％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μＬの水で再溶解し、ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳに供した。結果を図１３および以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　基質のみを分析した結果、ｒｅｂＦに加えてｒｅｂＣが混合していることがわかった。反応１時間では、主な加水分解産物として、１６．２分、１６．７分のピーク（図１３Ｂ）が認められた。２４時間の反応では、さらに加水分解反応が進んで、上記ピークに加え、１７．５分、１８．５分（図１３Ｃ）のピークの生成、アグリコンであるステビオールの生成も認められた。ＬＣ－ＭＳの結果、ｒｅｂＣの加水分解の結果と合わせると、ＲＴ１６．２分、ＲＴ１７．５分のピークはそれぞれ、ステビオール配糖体Ｃ（１３位：Ｒｈａα１，２(Ｇｌｕβ１，３)Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）、ステビオール配糖体Ａ（１３位：Ｒｈａα１，２Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。また、１６．７分のピークは、ｍ/ｚ　７７３．４、ステビオール配糖体（２Ｇｌｃ　＋　Ｘｌｙ）であった。ＢＧＬ１１が１９位に付加された糖を優先的に加水分解することから、これは、ステビオール配糖体Ｄ（１３位：Ｘｙｌβ１，２(Ｇｌｕβ１，３)Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。一方、１８．５分のピークは、ｍ/ｚ　６１１．３（Ｇｌｃ　＋　Ｘｌｙ）であり、ステビオール配糖体Ｄの加水分解産物であると考えられたので、ステビオール配糖体Ｂ（１３位：Ｘｙｌβ１，２Ｇｌｃβ１-、１９位：Ｈ）であると推察された。上述したとおり、ステビオールの生成も認められた。本加水分解実験により、ＢＧＬ１１は、ｒｅｂＣをアグリコンであるステビオールに加水分解できなかったことから、ＢＧＬ１１は、ｒｅｂＦをアグリコンであるステビオールにまで加水分解したと考えられた。すなわち、ＢＧＬ１１はキシロシド結合を加水分解できることが示唆された。

Claims (18)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、第１のステビオール配糖体を反応させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合、のうち少なくとも１つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質。
  2. 　前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＢ，レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合または１３位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）より１９位のグルコシルエステル結合または１９位の側鎖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）を優先して切断する工程を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解工程は、下記（１）～（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法、
    （１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
    （２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
    （３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
    （４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
    （５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
  8. 　宿主細胞に、以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、前記第１のステビオール配糖体と接触させて、前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および／または側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を加水分解する工程を含む、ステビオールおよび／または第２のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第１及び第２のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法：
    （ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  9. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項８または９に記載の方法。
  11. 　前記第１のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦおよびレバウジオシドＭ、ズルコシドＡ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記第２のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、ステビオール配糖体Ａ、ステビオール配糖体Ｂ、ステビオール配糖体Ｃ、ステビオール配糖体Ｄからなる群より選択される、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記第１のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記第１のステビオール配糖体が、１３位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および／または、１９位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第１のステビオール配糖体を加水分解する工程は、下記（１）～（５）から成る群より選択されるいずれか１つ以上の工程を含む、請求項８～１４のいずれか一項に記載の製造方法、
    （１）分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
    （２）アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程；
    （３）１３位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）よりも、１９位の分岐三糖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）を優先して切断する工程；
    （４）１３位の二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）よりも、１９位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合（ラムノシドを除く）および１９位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程；
    （５）１３位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、１９位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
  16. 　以下の（ａ）～（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の製造方法
    （ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１～８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第１のステビオール配糖体の１３位のグルコシド結合、１９位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合（ラムノシド結合を除く）、のうち少なくとも１つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  17. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項１６または１７に記載の方法。
     
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