WO2018043714A1 - 多能性幹細胞からミクログリアを得る方法 - Google Patents

多能性幹細胞からミクログリアを得る方法 Download PDF

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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining microglia from pluripotent stem cells.
  • Microglia are glial cells present in the cerebrospinal cord and are also called Hortega cells. It is derived from mesoderm and is activated by the invasion and trauma of a foreign substance such as a virus into the brain, and is known to have various physiological functions such as sterilization and tissue repair as well as antitumor action. Microglia also removes dead cells such as apoptosis and damage and waste products such as amyloid ⁇ by phagocytosis.
  • microglia In relation to the disease, microglia is involved in various diseases such as chronic neurodegenerative diseases with neurodegeneration such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, cerebral infarction, etc., and waste accumulated in the brain represented by amyloid ⁇ It has been reported that the reactivity changes depending on the product (Non-patent Document 1). Therefore, it is necessary to use microglia for the development and evaluation of therapeutic agents for diseases associated with these microglia. Therefore, various methods have been tried to prepare microglia.
  • Non-Patent Document 2 describes a method for obtaining microglia from mouse ES cells.
  • Patent Document 1 describes a method for obtaining microglia progenitor cells from human iPS cells. As described in Example 1, cells having immunoreactivity to CD45 obtained by differentiation (microglia progenitor cells). ) Is only 2-10%. As described in Non-Patent Document 3, in spite of attempts to differentiate iPS cells into microglia in many laboratories, at present, an efficient method for obtaining microglia from human iPS cells is unknown.
  • An object of the present invention is to efficiently produce microglia from pluripotent stem cells.
  • step (a) blood progenitor cells are prepared on feeder cells from human-derived iPS cells (step (a)), monocytes are prepared from blood progenitor cells by embryonic hematopoiesis (step (b)), and astrocytes Were co-cultured (step (c)) to prepare microglia.
  • step (a) blood progenitor cells are prepared on feeder cells from human-derived iPS cells
  • monocytes are prepared from blood progenitor cells by embryonic hematopoiesis
  • step (c) astrocytes Were co-cultured
  • step (c) all embryonic monocytes (100%) differentiated into microglia. That is, as described in Non-Patent Document 3, an efficient method for obtaining microglia is not known, and in the present invention, a cell surface marker (Iba1) peculiar to microglia and macrophages is expressed, and macrophages In other words, cells having protrusions in the shape of microglia were established very efficiently.
  • a cell surface marker (Iba1) peculiar to microglia and macrophages is expressed, and macrophages
  • macrophages cells having protrusions in the shape of microglia were established very efficiently.
  • the present inventor has a culture period of step (a) of 7 days or more (particularly 13 days or more), and 25 ng of IL-3 in step (b).
  • / Ml or more or 50-ng / ml or more of GM-CSF addition of 25-ng / ml or more of M-CSF in step (c) is particularly preferable, and the culture period in step (b) has no significant effect. I found out.
  • a method for producing microglia from pluripotent stem cells comprising the following steps: (A) co-culturing pluripotent stem cells with feeder cells for 7 days or more to obtain blood precursor cells, (B) co-culturing the blood progenitor cells obtained in step (a) with feeder cells in the presence of IL-3 and / or GM-CSF to obtain embryonic monocytes; and (c) step (b) The step of culturing the embryonic monocytes obtained in (1) in the presence of M-CSF with astrocytes or using an astrocyte supernatant.
  • a screening method for a preventive or therapeutic agent for a disease associated with microglia or an agent for improving memory or learning ability characterized by using the microglia produced by the method of (1) to (8).
  • Diseases involving microglia are spinal cord trauma, neuropathy due to stroke, epilepsy, neuropathic pain, vaso-occlusive eye disease, demyelinating disease, mental illness, cerebral infarction, Nasu hakora disease or neurodegenerative disease
  • the screening method according to (10), wherein the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, or amyotrophic lateral sclerosis.
  • microglia can be efficiently produced from pluripotent stem cells.
  • the obtained microglia can be used for various basic researches such as research on microglia itself and research on diseases related to microglia.
  • screening for therapeutic agents for diseases involving microglia, characterized by using microglia, or selecting optimal therapeutic agents for individuals using microglia prepared from pluripotent stem cells established from individual patients It is extremely useful in selecting so-called custom-made therapeutic agents.
  • utilization for cell therapy is also expected.
  • Iba1 immunostaining image of cells after differentiation induction by the method of the present invention (A) and (b) both enlarged images of cells after differentiation induction by the method of the present invention
  • the method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into microglia is a method comprising the following steps.
  • pluripotent stem cells are cultured under conditions suitable for promoting differentiation into blood precursor cells.
  • “Conditions suitable for promoting differentiation into blood precursor cells” means co-culturing pluripotent stem cells and feeder cells.
  • a pluripotent stem cell refers to a cell that maintains undifferentiated and pluripotent properties, typified by embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the ES cell may be an ES cell produced by nuclear reprogramming from a somatic cell.
  • Embryonic Germ Cell EG cell
  • mGS cell multipotent germline stem cell isolated from testis
  • multipotent adult progenitor cell isolated from bone marrow, etc.
  • these pluripotent stem cells are derived from humans.
  • the pluripotent stem cell is preferably an iPS cell, particularly preferably a human iPS (hiPS) cell.
  • Pluripotent stem cells can be prepared by known methods. For example, it is specifically described below.
  • Human iPS cell lines are available, for example, from the University of Tokyo Stem Cell Bank for TkDA3-4 and 201B7 from the Institute for iPS Cell Research at Kyoto University.
  • Human ES cell lines, for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) are available from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • ES cells or iPS cells are used as pluripotent stem cells, for example, as the medium, IMDM supplemented with FBS at a final concentration of 15% is used, and other growth factors and supplements are appropriately added even in the case of serum-free. Can be used.
  • VEGF may be added, and when culturing in a hypoxic environment, the same effect as when VEGF is added can be obtained without adding VEGF.
  • the concentration of VEGF is not particularly limited as long as blood precursor cells can be obtained, but may be 5 ng / ml to 50 ng / ml, and preferably 20 ng / ml or more.
  • “Hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air. Specifically, generally the conditions of low oxygen concentration than the oxygen concentration in the atmosphere of 5 ⁇ 10% CO 2/95 ⁇ 90% air used are exemplified by conventional cell culture, for example, oxygen in the atmosphere The condition where the concentration is 18% or less is applicable. Preferably, the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more, etc.), 0.5% or more (eg, 0.6 % Or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.95 or more, etc.), or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4 % Or more).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentrations are available from various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture manufactured by Thermo scientific, Ikemoto Riken, Toji Field, Waken Pharmaceutical, etc.) 2 incubators can be used).
  • any cell that contributes to differentiation induction of pluripotent stem cells can be used.
  • mouse embryo fibroblasts preferably 10T1 / 2 cell line, OP9 cells, etc. are used. be able to.
  • feeder cells it is preferable to suppress the proliferation of the cells, for example, by irradiating with radiation.
  • the culture period is not particularly limited as long as the pluripotent stem cells have sufficient days to “differentiate into blood precursor cells”. For example, a period of 7 days or more, 10 days or more, 13 days or more can be mentioned, but it is not limited thereto. Those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the conditions used.
  • Other culture conditions include, for example, 5% CO 2 , 36 to 38 ° C., preferably 37 ° C., but are not limited thereto. Culturing under the above conditions can be performed using, for example, a known CO 2 incubator.
  • “Blood progenitor cells” are CD34 negative cells, CD34 positive cells, Lin negative cells (CD2 negative cells, CD3 negative cells, CD4 negative cells, CD7 negative cells, CD8 negative cells, CD10 negative cells, CD14 negative cells, CD16 negative cells.
  • Cell CD19 negative cell, CD20 negative cell, CD24 negative cell, CD41 negative cell, CD45 negative cell, CD56 negative cell, CD66b negative cell or CD235a negative cell), CD38 negative cell, CD90 positive cell, CD49f positive cell, VEGFR2 Hematopoietic system characterized by a single cell or a combination of a plurality of markers among positive cells, CD31 positive cells, CD43 positive cells, CD34 positive, CD45 positive cells, Rhodamine weak positive cells, or Hoechst negative / weak positive cells Cells A.
  • step (b) the blood progenitor cells obtained in step (a) are cultured under conditions suitable for promoting differentiation into embryonic monocytes (embryonic hematopoiesis occurs).
  • “Conditions suitable for promoting differentiation into embryonic monocytes” means co-culturing blood precursor cells and feeder cells. More specifically, for example, blood precursor cells and feeder cells are co-cultured in the presence of IL-3 and / or GM-CSF.
  • the concentrations of IL-3 and GM-CSF are not particularly limited as long as embryonic monocytes are obtained.
  • IL-3 is 1 ng / ml to 200 ng / ml, 20 ng / ml to 150 ng / ml, 25 ng / ml to 100 ng / ml.
  • GM-CSF is 1 ng / ml to 200 ng / ml, 20 ng / ml to 150 ng / ml, 25 ng / ml to 100 ng / ml.
  • IL-3 is particularly preferably 25 ng / ml or more
  • GM-CSF is particularly preferably 50 ng / ml or more.
  • the culture period is not particularly limited as long as it is a sufficient number of days to “differentiate into monocytes” and is capable of embryonic hematopoiesis. Those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the conditions used.
  • “Monocytes” means CD11b positive cells, CD14 positive cells, CD15 positive cells, CD4 positive cells, CD163 positive cells, CD9 positive cells, CD11c positive cells, CDw12 positive cells, CD13 positive, CD17 positive cells, CD31 positive cells, CD32 positive cells, CD33 positive cells, CD35 positive cells, CD36 positive cells, CD38 positive cells, CD40 positive cells, CD43 positive cells, CD45RO positive cells, CD45RA positive cells, CD45RB positive cells, CD49b positive cells, CD49e positive cells, CD49f positive Cells, CD63 positive cells, CD64 positive cells, CD65s positive cells, CD68 positive cells, CD74 positive cells, CD84 positive cells, CD85 positive cells, CD86 positive cells, CD87 positive cells, CD89 positive cells, CD91 positive cells, D92 positive cells, CD93 positive cells, CD98 positive cells, CD101 positive cells, CD102 positive cells, CD111 positive cells, CD112 positive cells, CD115 positive cells, CD116 positive cells, CD119 positive cells, CD121b positive cells, CD123 positive cells,
  • Embryonic hematopoiesis is essentially hematopoiesis that occurs transiently in the yolk sac in the early embryonic period. In the present specification, it can be confirmed, for example, by the method described in Step 2 of Example 1 (5) that the hematopoietic stage is “embryo type”.
  • step (c) the embryonic monocytes obtained in step (b) are cultured under conditions suitable for promoting differentiation into microglia.
  • “Conditions suitable for promoting differentiation into microglia” means co-culturing embryonic monocytes and astrocytes, or culturing embryonic monocytes using an astrocyte supernatant. . More specifically, for example, embryonic monocytes and astrocytes are co-cultured or cultured using an astrocyte supernatant in the presence of M-CSF.
  • IL-34 may be present.
  • the concentration of IL-34 and / or M-CSF is not particularly limited as long as microglia can be obtained.
  • IL-34 is 1 ng / ml to 200 ng / ml, 20 ng / ml to 150 ng / ml, 25 ng / ml to 100 ng / ml.
  • M-CSF is 1 ng / ml to 200 ng / ml, 20 ng / ml to 150 ng / ml, 25 ng / ml to 100 ng / ml.
  • M-CSF has a great influence on the production of efficient microglia and is particularly preferably 25 ng / ml or more.
  • “Astrocyte supernatant” is obtained by culturing astrocytes collected from nerve tissue in a nutrient medium. For example, it can be prepared with reference to the method described in International Publication No. 2006/028049.
  • the culture period is not particularly limited as long as it is a sufficient number of days for “differentiation into microglia”. For example, a period of 3 days or more, 5 days or more, 7 days or more, 8 days or more can be mentioned, but it is not limited thereto. Particularly preferably, it is 7 days or more. Those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the conditions used.
  • microglia means Iba1 positive cells, CD11b positive cells, P2Y12 positive cells, P2X7 positive cells, P2X4 positive cells, IL-1 ⁇ positive cells, CX3CR1 positive cells, CCR2 positive cells, CCR7 positive cells, CD80 positive cells, CD209 positive cells, CD23 positive cells, CD163 positive cells, TREM2 positive cells, CD45 positive cells, P2X2 positive cells, CCL21 positive cells, IRF8 positive cells, IRF5 positive cells, TLR-4 positive cells, OX42 positive cells, CD14 positive cells, Among CD16-positive cells, integrin- ⁇ 4-positive cells, integrin- ⁇ 1-positive cells, and CD68-positive cells, the cells are characterized by one or a combination of a plurality of markers.
  • Iba1 positive cells, CD11b positive cells and the like are expressed not only in microglia but also in macrophages.
  • the microglia is not a macrophage.
  • the medium may be prepared as a basic medium.
  • the basic medium include IMDM medium, 199 medium, Eagle minimum essential medium (EMEM), alpha-MEM medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Ham F12 medium, RPMI 1640 medium, Fisher medium, Glasgow MEM, and the like Of the mixture.
  • the basic medium may contain serum or cytokines.
  • the surface of the culture dish is coated with collagen I, collagen IV, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, Matrigel TM ( It may be coated with a cell support substrate such as Becton, Dickinson and Company.
  • cytokines such as VEGF, IL-3, IL-34, M-CSF, and GM-CSF used in the present invention
  • natural cytokines or recombinant cytokines prepared by genetic engineering may be used.
  • a partial protein or peptide including a region related to binding to the receptor may be used.
  • it may be a protein or peptide in which the amino acid sequence or the three-dimensional structure is modified to such an extent that the binding force with the receptor is not lost.
  • proteins, peptides, drugs and the like that can function as agonists for these cytokine receptors may be used.
  • Screening method (screening method for therapeutic drugs for diseases involving microglia activation)
  • the present invention provides a screening method for a substance that acts on microglia by bringing the microglia obtained by I above into contact with a test substance.
  • test substance may be any known compound or novel compound, such as a nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, low molecular weight organic compound, compound library prepared using combinatorial chemistry techniques, Examples include random peptide libraries prepared by phase synthesis or phage display methods, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • the microglia obtained by the above I is brought into contact with the test substance, and the degree of influence on the microglia (for example, morphological change, cytokine production / release, phagocytosis, etc.) is measured. Then, compare the degree with the degree of microglia that does not come into contact with the test substance, and select the test substance that significantly changes the degree of influence as compared with the case without contact with the test substance as an effective component. To do.
  • the degree of influence on the microglia for example, morphological change, cytokine production / release, phagocytosis, etc.
  • a method known in this field can be used. For example, morphological changes can be captured by imaging and processing microglia, the concentration of cytokines released into the culture supernatant can be measured by ELISA, and the state of phagocytosing beads can be digitized by image processing. .
  • Test substances screened in this way include spinal cord trauma, neuropathy due to stroke, epilepsy, neuropathic pain, vaso-occlusive eye disease, demyelinating diseases (multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, etc.), Mental illness (depression, schizophrenia, autism, developmental disorder, addiction, etc.), cerebral infarction, Nasu hakora disease, neurodegenerative disease (especially Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, etc.) It can be used as an agent for preventing or treating or improving memory or learning ability.
  • customized therapeutic agent means an optimal therapeutic agent that suits the individuality of an individual patient.
  • induced differentiation of induced pluripotent stem cells produced from somatic cells of a subject suffering from spinal cord trauma, neuropathy due to stroke, epilepsy, neuropathic pain, vaso-occlusive eye disease or neurodegenerative disease The present invention provides a method for screening a therapeutic agent that acts on microglia by bringing the microglia thus obtained into contact with an existing therapeutic agent.
  • the screened therapeutic agent can be an optimal therapeutic agent for a subject for which induced pluripotent stem cells have been established.
  • Examples of existing therapeutic agents in the present invention include spinal cord trauma therapeutic agents such as baclofen and tizanidine, phenytoin, phenobarbital, carbamazepine, valproic acid, ethosuximide, zonisamide, gabapentin, topiramate, lamotrigine, levetiracetam and other epilepsy drugs, pregabalin, etc. And other therapeutic agents for Alzheimer's disease such as donepezil, rivastigmine, galantamine, memantine and the like.
  • Example 1 Production of microglia (1) Feeder cell (Mouse Embryonic Fibroblast; MEF) Mouse (strain; ICR) fetuses (E13.5) were dissected under a stereomicroscope, and after blood removal, the head, limbs and internal organs were removed with tweezers. The remaining part was finely chopped with scissors, and 10 ml of digestive fluid (0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Invitrogen) +1/1000 recombinant DNase (Takara)) was added.
  • EDTA trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid
  • the pellets were resuspended in medium A and counted, and then 4 ⁇ 10 6 in a flask (150 cm 2 ; TPP) coated with 0.1% gelatin (Sigma) / phosphate buffered saline (PBS) (Wako) for 30 minutes. Seeds per piece / flask. After culturing for 3 days, the cells were washed with PBS and 0.05% trypsin-EDTA was added to detach the cells. An equal amount of medium A was added to stop and collect the enzyme reaction, and the centrifuged pellet was suspended in Cell Banker 1 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) and stored frozen.
  • PBS phosphate buffered saline
  • cryopreserved cells were awakened and seeded at 2 ⁇ 10 6 cells / flask in a gelatin-coated flask under the same conditions as described above. After culturing for 3 days, the cells were detached by the same method as described above, and seeded at 2 ⁇ 10 6 cells / flask in a newly gelatin-coated flask under the same conditions as described above. After culturing for 3 days, the medium in the flask was replaced with medium A supplemented with 10 ⁇ g / ml mitomycin C (MMC; Sigma) to stop growth, and after 90 minutes of incubation, washed with PBS, Cells were detached by the same method. The obtained cells were stored frozen by the same method as described above. Cryopreserved MMC-treated MEFs were awakened the day before use and seeded at 5 ⁇ 10 5 cells / dish in gelatin-coated 10 cm cell culture dishes.
  • MMC mitomycin C
  • Stromal cells (10T1 / 2) It was obtained from RIKEN BioResource Center.
  • the medium is BME (Invitrogen) + 10% fetal calf serum (FCS) (Hyclone) + 1 / 100GlutaMAX1 (Invitrogen) +1/100 penicillin / streptomycin (Invitrogen)), and the cell detachment solution is 0.05% trypsin-EDTA (Invitrogen). Invitrogen) was used.
  • the passage was maintained in a 150 cm 2 flask, the passage was performed twice a week, and the cell density was about 1/8 times (1 flask of cells was passaged to about 8 flasks) each time (5 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 6 cells) (Maintained within the range of the flask) .
  • Those up to passage number p30 were used after growth inhibition by MMC.10T1 / 2 treated with MMC was seeded at 1 ⁇ 10 6 cells / dish on a gelatin-coated 10 cm cell culture dish. did.
  • the obtained cells were resuspended in medium B, and after counting, seeded in poly-D-lysine (PDL) coated flasks (75 cm 2 ; BD) at 5 ⁇ 10 5 cells / flask.
  • the medium B was exchanged 2 days and 5 days after sowing (after shaking for 3 hours with a shaker) and cultured for 7 days.
  • the cells were shaken with a shaker for 3 hours before cell collection, and after the medium B was replaced with PBS, the cells were further shaken for 5 hours.
  • 0.25% trypsin-EDTA Nacalai Tesque
  • the enzyme reaction was stopped with an equal volume of medium B and recovered.
  • the obtained cells were centrifuged (300G for 3 minutes), and the pellet was stored frozen in a cell banker.
  • Cryopreserved astrocytes are generated and seeded at 2.5 ⁇ 10 5 cells / dish in a gelatin-coated 10 cm cell culture dish, medium B is replaced after 4 days, and medium C for coculture (DMEM (Invitrogen) on day 7) + 10% FCS (Hyclone) + 1 / 100GlutaMAX1 (Invitrogen) +1/100 Sodium pyruvate (Invitrogen) +1/100 HEPES (Invitrogen) +1/100 penicillin-streptomycin (Invitrogen)) Used after.
  • the peeled MEF was sucked with an aspirator and further washed with PBS, and then differentiation medium D (IMDM (Invitrogen) + 15% fetal calf serum (FCS) (EquitechLab) +1/100 GlutaMAX1) (Invitrogen) +1/100 ITS- X (Invitrogen) +0.5 mmol / l monothioglycerol (Wako) +50 ⁇ g / ml L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n hydrate (Wako) +1/100 penicillin-streptomycin (Invitrogen)) Then, the hiPS cells were scraped with a cell scraper.
  • IMDM Invitrogen
  • FCS fetal calf serum
  • ITS- X Invitrogen
  • Wako monothioglycerol
  • Wako monothioglycerol
  • Wako monothioglycerol
  • Wako monothioglyce
  • the obtained hiPS cells were passaged by the method described in (3) at a density of 1/40 on 10T1 / 2 (1 dish of cells was seeded in about 40 dishes) at a density of 20 ng / ml VEGF (PEPROTECH; non According to Patent Document 4: Blood 2008 111: 5298-5306, it may not be added) and seeded.
  • Embryonic monocytes obtained in step 2 were coculture medium F (DMEM (Invitrogen) + 10% FCS (EquitechLab) +1/100 GlutaMAX1 (Invitrogen) +1/100 sodium pyruvate (Invitrogen) +1/100 HEPES (Invitrogen) +1/100 Penicillin-Streptomycin (Invitrogen)), 50 ng / ml M-CSF (PEPROTECH) and 50 ng / ml IL-34 (PEPROTECH) are added, and (4) described Seeded at a density of 1/2 on primary cultured rat astrocytes.
  • DMEM Invitrogen
  • FCS EquitechLab
  • Iba1 immunostaining Cells collected by the method described in (5) were seeded on a PDL / laminin-coated plate (Biocoat; Corning), and the next day, adherent cells were treated with 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS. Fix for 1 hour at ° C. The fixed cells were washed 3 times with PBS, treated with 0.1% Triton X-100 / PBS for 5 minutes, washed 3 times with PBS, and then treated with blocking solution (1.5% donkey serum / PBS) for 30 minutes. Next, 1/50 anti-Iba1 antibody (Abcam) / blocking solution was reacted at 4 ° C.
  • PFA paraformaldehyde
  • Example 2 Production of microglia using feeder-free iPS cells
  • TkDA3-4 strain purchased from Stem Cell Bank, University of Tokyo was used.
  • the coating is iMatrix-511 (Nippi)
  • the stripping solution is 0.5x Triple select (Triple TM select CTS (Invitrogen), 0.5 mol / l EDTA pH 8.0 (Nacalai Tesque), PBS (Wako)).
  • / Ml VEGF (PEPROTECH; it may not be added according to Non-Patent Document 4) was added and seeded. After seeding 3, 6, 8, 10 and 12 days, the differentiation medium E was replaced with 20 ng / ml VEGF (PEPROTECH, which may not be added according to Non-Patent Document 4), and on day 13 It was collected. While removing Sac with a cell scraper, it was peeled off from the cell culture dish and collected through a cell strainer (40 ⁇ ). The centrifuged pellet (120 G (confirmed that there was no effect on the rotation rate and purity at 100 to 150 G) for 10 minutes without brake) was resuspended in differentiation medium E.
  • Process 2 IL-3 (50 ng / ml; PEPROTECH) and GM-CSF (50 ng / ml; PEPROTECH) are added to all the cells obtained in step 1 and one resuspension for 5 cell culture dishes is added. Seeded on 10T1 / 2 in a cell culture dish. Three days later, 5 ml of differentiation medium E containing IL-3 and GM-CSF was added, and after 6 days, it was collected by pipetting. Process 3 The embryonic monocytes obtained in step 2 were resuspended in co-culture medium F, and 50 ng / ml M-CSF (PEPROTECH) and 50 ng / ml IL-34 (PEPROTECH) were added.
  • Iba1 immunostaining Cells collected in step 3 were seeded on a PDL / laminin-coated plate (Biocoat; Corning), and the next day, adherent cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS for 1 hour at 4 ° C. did.
  • the fixed cells were washed 3 times with PBS, treated with 0.1% Triton X-100 / PBS for 5 minutes, washed 3 times with PBS, and then treated with blocking solution (1.5% donkey serum / PBS) for 30 minutes.
  • blocking solution (1.5% donkey serum / PBS) for 30 minutes.
  • 1/50 anti-Iba1 antibody (Abcam) / blocking solution was reacted at 4 ° C.
  • Example 3 Examination of differentiation induction period in blood progenitor cell preparation stage (1) Differentiation induction step 1 The 10 cm cell culture dish to which the hiPS cells passaged by the method described in Example 1 (2) were adhered was washed with PBS, 1.5 ml of Dissolution Solution (ReproCELL) was added, and MEF was peeled off while shaking. The peeled MEF was sucked up with an aspirator, further washed with PBS, 10 ml of differentiation medium D was added, and hiPS cells were scraped off with a cell scraper.
  • Dissolution Solution ReproCELL
  • the obtained hiPS cells were subcultured by the method described in Example 1 (3) on 10T1 / 2 at a density of 1/40 (1 dish of cells was seeded in about 40 dishes) at a density of 20 ng / ml VEGF ( According to Non-Patent Document 4, it was not necessary to add PEPROTECH) and seeded. After the seeding 3, 6, 8, 10, 12 days, the culture medium was replaced with differentiation medium E supplemented with 20 ng / ml VEGF (PEPROTECH, which may not be added according to Non-Patent Document 4), and cultured for any number of days. After recovery. While removing Sac with a cell scraper, it was peeled off from the cell culture dish and collected through a cell strainer (40 ⁇ ).
  • Step 2 to Step 3 The same method as in Step 2 to Step 3 of Example 2 was performed.
  • Example 2 Iba1 immunostaining This was carried out in the same manner as in Example 2 (3).
  • the blood progenitor cell production period was set to 6, 13, 20, and 27 days, differentiation into microglia was carried out. Microglia production was possible under all conditions, but microglial differentiation induction efficiency was particularly high in 13 to 27 days. Was good.
  • Example 4 Examination of differentiation induction period in embryonic monocyte production stage (1) Differentiation induction step 1 The 10 cm cell culture dish to which the hiPS cells passaged by the method described in Example 1 (2) were adhered was washed with PBS, 1.5 ml of Dissolution Solution (ReproCELL) was added, and MEF was peeled off while shaking. The peeled MEF was sucked up with an aspirator, further washed with PBS, 10 ml of differentiation medium D was added, and hiPS cells were scraped off with a cell scraper.
  • Dissolution Solution ReproCELL
  • the obtained hiPS cells were subcultured by the method described in Example 1 (3) on 10T1 / 2 at a density of 1/40 (1 dish of cells was seeded in about 40 dishes) at a density of 20 ng / ml VEGF ( According to Non-patent Document 4, it was not necessary to add PEPROTECH) and seeded.
  • the differentiation medium E was replaced with 20 ng / ml VEGF (PEPROTECH, which may not be added according to Non-Patent Document 4), and on day 13 It was collected. While removing Sac with a cell scraper, it was peeled off from the cell culture dish and collected through a cell strainer (40 ⁇ ). Centrifuged (120G (confirmed that there was no effect on recovery and purity at 100-150G) 10 minutes without brake) pellets were resuspended in differentiation medium E.
  • IL-3 50 ng / ml; PEPROTECH
  • GM-CSF 50 ng / ml; PEPROTECH
  • Process 2 IL-3 (50 ng / ml; PEPROTECH) and GM-CSF (50 ng / ml; PEPROTECH) are added to all the cells obtained in step 1 and one resuspension for 5 cell culture dishes is added. Seeded on 10T1 / 2 in a cell culture dish. Three days later, 5 ml of differentiation medium E containing IL-3 and GM-CSF was added, and collected by pipetting after culturing for an arbitrary period. The collected cell suspension was centrifuged (300 G for 3 minutes), and the pellet cells were subjected to the next step.
  • Monocytes obtained in step 2 were resuspended in co-culture medium F, and M-CSF (50 ng / ml; PEPROTECH) and IL-34 (50 ng / ml; PEPROTECH) were added. Inoculated at a density of 1/2 on the primary cultured rat astrocytes described in (4). Two days after sowing, 5 ml of medium supplemented with M-CSF and IL-34 was added to medium F. On days 4 and 7, 7 ml of medium was collected and centrifuged (300 G for 3 minutes).
  • the pellet was resuspended in 8 ml of medium supplemented with TGF- ⁇ 1 (50 ng / ml; PEPROTECH; confirmed to have no effect on differentiation rate) in medium supplemented with CSF and IL-34 . Cells were collected by pipetting 9 days after seeding.
  • Example 2 Iba1 immunostaining This was carried out in the same manner as in Example 2 (3).
  • step 2 was skipped for convenience and expressed as 0 days for convenience
  • microglia could be efficiently produced in all induction days. It was.
  • Example 5 Examination of cytokine concentration (1) Differentiation induction step 1 Blood progenitor cells were prepared in the same manner as in Step 1 of Example 4. Process 2 IL-3 (PEPROTECH) and GM-CSF (PEPROTECH) are added to all cells obtained in step 1 at an arbitrary concentration, and a resuspension for 5 cell culture dishes is added to one cell culture. Seeded on 10T1 / 2 in dish. Three days later, 5 ml of differentiation medium E containing IL-3 and GM-CSF at the same concentrations as those at the time of cell seeding was added, and the cells were collected by pipetting after 6 days of culture. The collected cell suspension was centrifuged (300 G for 3 minutes), and the pellet cells were subjected to the next step.
  • Process 2 IL-3 (PEPROTECH) and GM-CSF (PEPROTECH) are added to all cells obtained in step 1 at an arbitrary concentration, and a resuspension for 5 cell culture dishes is added to one cell culture. Seeded on 10T
  • Process 3 The monocytes obtained in step 2 were resuspended in co-culture medium F, and M-CSF (PEPROTECH) and IL-34 (PEPROTECH) were added at arbitrary concentrations, respectively. ) The seeded primary cultured rat astrocytes were seeded at a density of 1/2. Two days after seeding, 5 ml of medium with M-CSF and IL-34 added to medium F at the same concentration as at the time of cell seeding was added, and 7 ml of medium was collected on days 4 and 7 and centrifuged (300 G for 3 minutes).
  • M-CSF PEPROTECH
  • IL-34 PEPROTECH
  • the pellet was resuspended with 8 ml of medium supplemented with TGF- ⁇ 1 (PEPROTECH) in medium F with M-CSF and IL-34 added at the same concentration as at the time of cell seeding. Cells were collected by pipetting 9 days after seeding.
  • Example 2 Iba1 immunostaining This was carried out in the same manner as in Example 2 (3).
  • the results are summarized in Table 1.
  • the equivalent differentiation induction efficiency was taken as ⁇ , and the differentiation induction efficiency below 1/10 was taken as ⁇ .
  • Experiments were conducted at respective cytokine concentrations of 0, 25, 50, and 100 ng / ml, and microglia could be produced under all conditions.
  • step 2 differentiation induction efficiency was particularly good when IL-3 was added at 25 ng / ml or more, or GM-CSF was added at 50 ng / ml or more.
  • the efficiency was particularly good when M-CSF was added at 25 ng / ml or more.
  • microglia can be efficiently produced from pluripotent stem cells.
  • the obtained microglia can be used for various basic researches such as research on microglia itself and research on diseases related to microglia.
  • a method for screening a therapeutic agent for a disease involving microglia, characterized by using microglia, or a so-called custom-made therapeutic agent that selects optimal therapeutic agents for individuals using microglia established from individual patients It is extremely useful in the selection of Furthermore, utilization for cell therapy is also expected.

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Abstract

本発明の目的は、多能性幹細胞から効率よくミクログリアを製造することである。 以下の工程を含む、多能性幹細胞からミクログリアを製造する方法： （ａ）多能性幹細胞を７日間以上フィーダー細胞と共培養し、血液前駆細胞を得る工程、 （ｂ）工程（ａ）で得られた血液前駆細胞をＩＬ－３及び／又はＧＭ－ＣＳＦの存在下でフィーダー細胞と共培養し、胚型単球を得る工程、及び （ｃ）工程（ｂ）で得られた胚型単球をＭ－ＣＳＦの存在下でアストロサイトと共培養又はアストロサイト上清を用いて培養する工程。

Description

多能性幹細胞からミクログリアを得る方法
　本発明は、多能性幹細胞からミクログリアを得る方法に関する。
　ミクログリアとは、脳脊髄中に存在する神経膠細胞であり、Ｈｏｒｔｅｇａ細胞とも呼ばれる。中胚葉由来であり、脳内へのウイルス等異物の侵入及び外傷により活性化し、殺菌、組織の修復の他、抗腫瘍作用等、様々な生理機能を担うことが知られている。また、ミクログリアはアポトーシスや損傷による死細胞やアミロイドβ等の老廃物を貪食作用により除去する。
　疾患との関係では、アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経変性を伴う慢性神経変性疾患や、脳梗塞等の様々な疾患にミクログリアが関与すること、アミロイドβに代表される脳内で蓄積する老廃物により反応性が変化することが報告されている（非特許文献１）。
　したがって、これらのミクログリアに関連する疾患の治療薬の開発と評価のためにミクログリアを用いることが必要である。そこで、ミクログリアを調製するために様々な方法が試みられている。
　非特許文献２には、マウスＥＳ細胞からミクログリアを得る方法が記載されている。
　特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞からミクログリア前駆細胞を得る方法が記載されているが、実施例１に記載の通り、分化して得られるＣＤ４５に対して免疫反応性を持つ細胞（ミクログリア前駆細胞）はわずか２～１０％である。
　非特許文献３にも記載されているように、数多くの研究室においてｉＰＳ細胞からミクログリアへの分化が試みられているにも関わらず、現時点において、ヒトｉＰＳ細胞からミクログリアを得る効率的な方法は知られていない。
国際公開第２０１０／１２５１１０号
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，　Ｖｏｌ．１，　ｐｐ．１４　（２００４） Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　５，　１４８１-１４９４（２０１０） Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ　１６５６，　Ｐａｇｅｓ　９８－１０６　（２０１７）
　本発明の目的は、多能性幹細胞から効率よくミクログリアを製造することである。
　本発明者は、鋭意研究の結果、ミクログリアが胎生初期に卵黄嚢マクロファージから発生し、中枢神経系へ遊走することが示唆されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　２０１１，　１１，　７７５－７８７）ことを参考に、効率よくミクログリアを製造することに成功した。具体的にはヒト由来のｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上で血液前駆細胞を作製し（工程（ａ））、血液前駆細胞から胚型造血で単球を作製し（工程（ｂ））、さらにアストロサイトと共培養する（工程（ｃ））ことによって、ミクログリアを作製した。工程（ａ）で得られた細胞を全て工程（ｂ）に付すと、全ての細胞（１００％）が胚型単球として得られた。その後、工程（ｃ）に付すと、胚型単球は全て（１００％）ミクログリアに分化した。つまり、非特許文献３にも記載の通り、ミクログリアを得る効率的な方法は知られていない現状において、本発明において、ミクログリア及びマクロファージに特有の細胞表面マーカー（Ｉｂａ１）を発現し、かつ、マクロファージには存在せず、ミクログリアに存在する形状である突起を有する細胞が、非常に効率よく樹立された。
　さらに、本発明者は研究を進め、製造効率を上げるためには、工程（ａ）の培養期間が７日以上（特に、１３日以上）であること、工程（ｂ）においてＩＬ－３を２５ｎｇ／ｍｌ以上もしくはＧＭ－ＣＳＦを５０ｎｇ／ｍｌ以上添加すること、工程（ｃ）においてＭ－ＣＳＦを２５ｎｇ／ｍｌ以上添加することが特に好ましいこと、また、工程（ｂ）の培養期間は大きく影響しないことを見出した。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）以下の工程を含む、多能性幹細胞からミクログリアを製造する方法：
　（ａ）多能性幹細胞を７日間以上フィーダー細胞と共培養し、血液前駆細胞を得る工程、
　（ｂ）工程（ａ）で得られた血液前駆細胞をＩＬ－３及び／又はＧＭ－ＣＳＦの存在下でフィーダー細胞と共培養し、胚型単球を得る工程、及び
　（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚型単球をＭ－ＣＳＦの存在下でアストロサイトと共培養又はアストロサイト上清を用いて培養する工程。
（２）工程（ａ）の培養期間が、１３日以上である、（１）記載の方法。
（３）工程（ｃ）において、ＩＬ－３４の存在下で培養することを特徴とする（１）又は（２）記載の方法。
（４）工程（ｂ）において、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦの存在下で培養することを特徴とする、（１）～（３）いずれかに記載の方法。
（５）フィーダー細胞が、１０Ｔ１／２細胞又はＯＰ９細胞である、（１）～（４）いずれかに記載の方法。
（６）工程（ａ）において、ＶＥＧＦの存在下で培養することを特徴とする、（１）～（５）いずれかに記載の方法。
（７）多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、（１）～（６）いずれかに記載の方法。
（８）ｉＰＳ細胞が、ヒト又はマウス由来である、（７）記載の方法。
（９）（１）～（８）の方法で製造されたミクログリアを用いることを特徴とする、ミクログリアが関与する疾患の予防若しくは治療剤又は記憶若しくは学習能力改善剤のスクリーニング方法。
（１０）ミクログリアが関与する疾患が、脊髄の外傷、脳卒中による神経障害、てんかん、神経障害性疼痛、血管閉塞性の眼疾患、脱髄疾患、精神疾患、脳梗塞、那須ハコラ病又は神経変性疾患である、（９）記載のスクリーニング方法。
（１１）神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症である、（１０）記載のスクリーニング方法。
　本発明の方法により、多能性幹細胞から効率よくミクログリアが製造できる。得られるミクログリアは、ミクログリア自体の研究、ミクログリアが関連する疾患の研究等、様々な基礎研究に利用可能である。また、ミクログリアを用いることを特徴とする、ミクログリアが関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法、又は、個々の患者から樹立した多能性幹細胞から作製したミクログリアを用いて個人に最適な治療薬を選別する、いわゆるオーダーメード治療薬の選択において極めて有用である。さらに、細胞治療への利用も期待される。
本発明の方法で分化誘導後の細胞のＩｂａ１免疫染色像 （ａ）、（ｂ）共に本発明の方法で分化誘導後の細胞の拡大像
　本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。なお、本明細書において、特に指示のない限り、分子生物学的手法及び免疫学的手法等は公知の方法が採用される。
Ｉ．多能性幹細胞からミクログリアへの分化誘導方法
　本発明の多能性幹細胞のミクログリアへの分化誘導方法は、以下の工程を含む方法である。
（ａ）多能性幹細胞を７日間以上フィーダー細胞と共培養し、血液前駆細胞を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた血液前駆細胞をＩＬ－３及び／又はＧＭ－ＣＳＦの存在下でフィーダー細胞と共培養し、胚型単球を得る工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚型単球をＭ－ＣＳＦの存在下でアストロサイトと共培養又はアストロサイト上清を用いて培養する工程。
　詳しくは、工程（ａ）において、多能性幹細胞を、血液前駆細胞への分化を促進させるのに適した条件下で培養する。「血液前駆細胞への分化を促進させるのに適した条件下」とは、多能性幹細胞とフィーダー細胞を共培養することを意味する。
　「多能性幹細胞」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に代表される未分化・多能性を維持する細胞を指す。ＥＳ細胞は体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であっても良い。またＥＳ細胞以外では、始原生殖細胞に由来するＥｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｇｅｒｍ　Ｃｅｌｌ（ＥＧ　ｃｅｌｌ）、精巣から単離されたｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　（ｍＧＳ　ｃｅｌｌ）、骨髄から単離されるＭｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ａｄｕｌｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　（ＭＡＰＣ）等が挙げられる。本発明において、これら多能性幹細胞の由来はヒト由来である。本発明において、多能性幹細胞は好ましくはｉＰＳ細胞、特に好ましくはヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞である。
　多能性幹細胞は公知の方法により作成可能である。例えば、以下に具体的に記載されている。国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１１／０３０９１５号、国際公開第２０１３／０９４７７１号、国際公開第２０１４／０１４１１９号、国際公開第２０１４／０６５４３５号。
　また、ヒトｉＰＳ細胞株は、例えば、ＴｋＤＡ３－４は東京大学ステムセルバンクから、２０１Ｂ７は京都大学ｉＰＳ細胞研究所から入手可能である。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）及びＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。
　多能性幹細胞としてＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いる場合、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子及びサプリメント等を加えたものを使用することができる。なお、ＶＥＧＦを加えてもよいし、低酸素環境下での培養を行う場合には、ＶＥＧＦを添加しなくても、ＶＥＧＦを添加した場合と同等の効果を得ることができる。
　ＶＥＧＦの濃度は、血液前駆細胞が得られる濃度であれば特に問わないが、５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌでもよく、好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ以上である。
　「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される５～１０％ＣＯ２／９５～９０％大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が１８％以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は１５％以下（例、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下等）、１０％以下（例、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下等）、又は５％以下（例、４％以下、３％以下、２％以下等）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは０．１％以上（例、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上等）、０．５％以上（例、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９５以上等）、又は１％以上（例、１．１％以上、１．２％以上、１．３％以上、１．４％以上等）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なＣＯ２インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なＣＯ２インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社等のメーカー製の低酸素培養用ＣＯ２インキュベーターを用いることができる）。
　「フィーダー細胞」としては、多能性幹細胞の分化誘導に寄与する細胞であればいずれも使用可能であり、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞等を用いることができる。フィーダー細胞を用いるときには、例えば、放射線を照射する等して、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。
　培養する期間は、多能性幹細胞が「血液前駆細胞への分化」するに十分な日数である限り、特に限定されない。例えば、７日以上、１０日以上、１３日以上の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。当業者は用いる条件に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。
　その他の培養条件としては、例えば、５％ＣＯ２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のＣＯ２インキュベーターを用いて行なうことができる。
　「血液前駆細胞」とは、ＣＤ３４陰性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、Ｌｉｎ陰性細胞（ＣＤ２陰性細胞、ＣＤ３陰性細胞、ＣＤ４陰性細胞、ＣＤ７陰性細胞、ＣＤ８陰性細胞、ＣＤ１０陰性細胞、ＣＤ１４陰性細胞、ＣＤ１６陰性細胞、ＣＤ１９陰性細胞、ＣＤ２０陰性細胞、ＣＤ２４陰性細胞、ＣＤ４１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＣＤ５６陰性細胞、ＣＤ６６ｂ陰性細胞、又は、ＣＤ２３５ａ陰性細胞）、ＣＤ３８陰性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ４９ｆ陽性細胞、ＶＥＧＦＲ２陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞、ＣＤ４３陽性細胞、ＣＤ３４陽性、かつ、ＣＤ４５陽性細胞、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ弱陽性細胞、あるいは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陰性／弱陽性細胞のうち、単独、あるいは複数のマーカーの組み合わせで特徴付けられる造血系の細胞である。
　工程（ｂ）において、工程（ａ）で得られた血液前駆細胞を、胚型単球への分化を促進させるのに適した条件下で培養する（胚型造血が起こる）。「胚型単球への分化を促進させるのに適した条件下」とは、血液前駆細胞とフィーダー細胞を共培養することを意味する。より詳しくは、例えば、ＩＬ－３及び／又はＧＭ－ＣＳＦの存在下で血液前駆細胞とフィーダー細胞を共培養する。
　ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦの濃度は、胚型単球が得られる濃度であれば特に限定されない。例えば、ＩＬ－３は、１ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。ＧＭ－ＣＳＦは、１ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。なお、効率的な製造のためには、ＩＬ－３は２５ｎｇ／ｍｌ以上、ＧＭ－ＣＳＦは５０ｎｇ／ｍｌ以上が特に好ましい。
　培養する期間は、「単球への分化」するに十分な日数であり、かつ、胚型造血可能な日数である限り、特に限定されない。当業者は用いる条件に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。
　その他の培養条件は、工程（ａ）（上記[００２３]）と同様である。
　「単球」とは、ＣＤ１１ｂ陽性細胞、ＣＤ１４陽性細胞、ＣＤ１５陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ１６３陽性細胞、ＣＤ９陽性細胞、ＣＤ１１ｃ陽性細胞、ＣＤｗ１２陽性細胞、ＣＤ１３陽性、ＣＤ１７陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞、ＣＤ３２陽性細胞、ＣＤ３３陽性細胞、ＣＤ３５陽性細胞、ＣＤ３６陽性細胞、ＣＤ３８陽性細胞、ＣＤ４０陽性細胞、ＣＤ４３陽性細胞、ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＢ陽性細胞、ＣＤ４９ｂ陽性細胞、ＣＤ４９ｅ陽性細胞、ＣＤ４９ｆ陽性細胞、ＣＤ６３陽性細胞、ＣＤ６４陽性細胞、ＣＤ６５ｓ陽性細胞、ＣＤ６８陽性細胞、ＣＤ７４陽性細胞、ＣＤ８４陽性細胞、ＣＤ８５陽性細胞、ＣＤ８６陽性細胞、ＣＤ８７陽性細胞、ＣＤ８９陽性細胞、ＣＤ９１陽性細胞、ＣＤ９２陽性細胞、ＣＤ９３陽性細胞、ＣＤ９８陽性細胞、ＣＤ１０１陽性細胞、ＣＤ１０２陽性細胞、ＣＤ１１１陽性細胞、ＣＤ１１２陽性細胞、ＣＤ１１５陽性細胞、ＣＤ１１６陽性細胞、ＣＤ１１９陽性細胞、ＣＤ１２１ｂ陽性細胞、ＣＤ１２３陽性細胞、ＣＤ１２７陽性細胞、ＣＤ１２８ｂ陽性細胞、ＣＤ１３１陽性細胞、ＣＤ１４２陽性細胞、ＣＤ１４７陽性細胞、ＣＤ１５６ａ陽性細胞、ＣＤ１５５陽性細胞、ＣＤ１５７陽性細胞、ＣＤ１６２陽性細胞、ＣＤ１６３陽性細胞、ＣＤ１６４陽性細胞、ＣＤ１６８陽性細胞、ＣＤ１７０陽性細胞、ＣＤ１７１陽性細胞、ＣＤ１７２ａ陽性細胞、ＣＤ１７２ｂ陽性細胞、ＣＤ１８０陽性細胞、ＣＤ１８４陽性細胞、ＣＤ１９１陽性細胞、ＣＤ１９２陽性細胞、ＣＤ１９５陽性細胞、ＣＤｗ１９８陽性細胞、ＣＤ２０６陽性細胞、ＣＤｗ２１０陽性細胞、ＣＤ２１３ａ１陽性細胞、ＣＤ２１３ａ２陽性細胞、ＣＤ２２６陽性細胞、ＣＤ２７７陽性細胞、ＣＤ２８１陽性細胞、ＣＤ２８２陽性細胞、ＣＤ２８４陽性細胞、ＣＤ２９５陽性細胞、ＣＤ３００ａ陽性細胞、ＣＤ３００ｃ陽性細胞、ＣＤ３００ｅ陽性細胞、ＣＤ３０２陽性細胞、ＣＤ３０５陽性細胞、ＣＤ３１２陽性細胞、ＣＤ３１７陽性細胞、ＣＤ３２２陽性細胞、ＣＤ３２８陽性細胞、ＣＤ３２９陽性細胞のうち、単独、あるいは複数のマーカーの組み合わせで特徴づけられる細胞である。
　「胚型造血」とは、本来、胎生初期に卵黄嚢において一過性に起こる造血である。本明細書において、造血段階が「胚型」であることは、例えば、実施例１（５）工程２に記載の方法で確認することができる。
　工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた胚型単球を、ミクログリアへの分化を促進させるのに適した条件下で培養する。「ミクログリアへの分化を促進させるのに適した条件下」とは、胚型単球とアストロサイトを共培養すること、又は胚型単球をアストロサイト上清を用いて培養することを意味する。より詳しくは、例えば、Ｍ－ＣＳＦの存在下で胚型単球と、アストロサイトを共培養する又はアストロサイト上清を用いて培養する。さらに、ＩＬ－３４が存在していてもよい。
　ＩＬ－３４及び／又はＭ－ＣＳＦの濃度は、ミクログリアが得られる濃度であれば特に限定されない。例えば、ＩＬ－３４は、１ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。Ｍ－ＣＳＦは、１ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。なお、Ｍ－ＣＳＦは効率的なミクログリアの製造に対する影響が大きく、２５ｎｇ／ｍｌ以上が特に好ましい。
　「アストロサイト上清」とは、神経組織より採取したアストロサイトを栄養培地中で培養することにより得られる。例えば、国際公開第２００６／０２８０４９号に記載の方法を参考に調製することができる。
　培養する期間は、「ミクログリアへの分化」するに十分な日数である限り特に限定されない。例えば、３日以上、５日以上、７日以上、８日以上の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。特に好ましくは７日以上である。当業者は用いる条件に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。
　その他の培養条件は、工程（ａ）（上記[００２３]）と同様である。
　得られた細胞が「ミクログリア」であることは、公知の指標を用いて確認することができる。例えば、「ミクログリア」とは、Ｉｂａ１陽性細胞、ＣＤ１１ｂ陽性細胞、Ｐ２Ｙ１２陽性細胞、Ｐ２Ｘ７陽性細胞、Ｐ２Ｘ４陽性細胞、ＩＬ―１β陽性細胞、ＣＸ３ＣＲ１陽性細胞、ＣＣＲ２陽性細胞、ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ８０陽性細胞、ＣＤ２０９陽性細胞、ＣＤ２３陽性細胞、ＣＤ１６３陽性細胞、ＴＲＥＭ２陽性細胞、ＣＤ４５陽性細胞、Ｐ２Ｘ２陽性細胞、ＣＣＬ２１陽性細胞、ＩＲＦ８陽性細胞、ＩＲＦ５陽性細胞、ＴＬＲ－４陽性細胞、ＯＸ４２陽性細胞、ＣＤ１４陽性細胞、ＣＤ１６陽性細胞、インテグリンーα４陽性細胞、インテグリンーβ１陽性細胞、ＣＤ６８陽性細胞のうち、単独、あるいは複数のマーカーの組み合わせで特徴づけられる細胞である。
　上記マーカーのうち、例えば、Ｉｂａ１陽性細胞、ＣＤ１１ｂ陽性細胞等は、ミクログリアだけでなく、マクロファージでも発現している。例えば、以下のいずれかの特徴と組み合わせることによって、マクロファージではなく、ミクログリアであると、判断することが可能である。
－　ミクログリアに特徴的な形態（突起）
－　プリン作動性受容体であるＰ２Ｙ１２の発現
　本発明において、特記がない限り、培地は基本培地として作成してよい。その基本培地の例としては、ＩＭＤＭ培地や１９９培地、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、アルファ－ＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、フィッシャー培地、グラスゴーＭＥＭ、及びそれらの混合物が挙げられる。基本培地は血清又はサイトカインを含有していてよい。
　接着型の培養の場合は、細胞の接着特性の向上のために、培養皿の表面をコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）等の細胞支持基質でコートしてもよい。
　本発明において使用するＶＥＧＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインは、天然のものを用いてもよいし、遺伝子工学により調製したリコンビナントサイトカインを用いてもよい。その際、これらのサイトカインの全長を含む必要は無く、レセプターとの結合に関る領域を含む一部分の蛋白質やペプチドでもよい。また、レセプターとの結合力を失わない程度にアミノ酸配列や立体構造に改変を加えた蛋白質やペプチドでもよい。さらには、これらのサイトカインのレセプターに対してアゴニストとして機能しうる蛋白質やペプチドや薬剤等でもよい。
ＩＩ．スクリーニング方法
（ミクログリアの活性化が関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法）
　本発明は、上記Ｉにより得られたミクログリアと試験物質とを接触させ、ミクログリアに対して作用する物質のスクリーニング方法を提供する。
　「試験物質」は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
　スクリーニングの方法においては、上記Ｉにより得られたミクログリアを試験物質と接触させ、ミクログリアへの影響（例えば、形態変化、サイトカイン産生・放出、貪食等）の程度を測定する。そしてその程度と、試験物質と接触させないミクログリアの場合の程度とを比較して、影響の程度を、試験物質と接触させない場合と比較して著しく変化させる試験物質を、効果的な構成要素として選択する。
　測定法においては、当該分野で公知の方法を利用することができる。例えばミクログリアを撮像して画像処理することによって形態変化を捉えたり、培養上清に放出されたサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したり、ビーズを貪食した様子を画像処理によって数値化することができる。
　このようにして、スクリーニングされた試験物質は、脊髄の外傷、脳卒中による神経障害、てんかん、神経障害性疼痛、血管閉塞性の眼疾患、脱髄疾患（多発性硬化症、ギランバレー症候群等）、精神疾患（抑うつ、統合失調症、自閉症、発達障害、依存症等）、脳梗塞、那須ハコラ病、神経変性疾患（特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等）等の予防若しくは治療剤又は記憶若しくは学習能力改善剤として使用しうる。
（オーダーメード治療薬をスクリーニングする方法）
　本発明において、「オーダーメード治療薬」とは、ある患者個人の個性にかなった最適な治療薬を意味する。
　本発明では、脊髄の外傷、脳卒中による神経障害、てんかん、神経障害性疼痛、血管閉塞性の眼疾患又は神経変性疾患を罹患する対象の体細胞から製造された人工多能性幹細胞を分化誘導させることにより得られた前記ミクログリアと既存の治療薬を接触させ、ミクログリアに対して作用する治療薬のスクリーニング方法を提供する。このように、スクリーニングされた治療薬は、人工多能性幹細胞を樹立された対象にとって最適な治療薬と成りうる。
　本発明における既存の治療薬として、例えば、バクロフェン、チザニジン等の脊髄の外傷治療薬、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、エトスクシミド、ゾニサミド、ガバペンチン、トピラマート、ラモトリギン、レベチラセタム等のてんかん薬、プレガバリン等の神経障害性疼痛治療薬、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチン等のアルツハイマー病治療薬等が挙げられるが、これらに限定されない。
　以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１　ミクログリアの製造
（１）フィーダー細胞（Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；　ＭＥＦ）
　マウス（系統；ＩＣＲ）の胎仔（Ｅ１３．５）を実体顕微鏡下で解剖し、脱血後ピンセットで頭部、手足、内臓を取り除いた。残った部位をハサミで細かく刻み、消化液（０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１０００　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社））を胎仔１体あたり１０ｍｌ加えた。室温で約１時間、スターラーで攪拌しながら分散し、等量の培地Ａ（Ｄ－ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社）＋１／１００ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を加えて酵素反応を停止させた。細胞分散液をセルストレーナー（７０φ；ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社）に通して回収し、遠心分離（３００Ｇ，　３分）後上清を除いた。ペレットを培地Ａに再懸濁して計数後、３０分間０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社）／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｗａｋｏ社）コートしたフラスコ（１５０ｃｍ２；　ＴＰＰ社）に４ｘ１０６個／フラスコで播種した。３日間の培養後、ＰＢＳで洗浄後０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを加えて細胞を剥離させた。等量の培地Ａを加えて酵素反応を停止して回収し、遠心分離後のペレットをセルバンカー１（日本全薬工業株式会社）に懸濁して凍結保存した。次に凍結保存した細胞を起こし、上記と同様の条件でゼラチンコートしたフラスコに２ｘ１０６個／フラスコで播種した。３日間培養後、上記と同様の手法にて細胞を剥離させ、新しく上記同様の条件でゼラチンコートしたフラスコに２ｘ１０６個／フラスコで播種した。３日間培養後、フラスコ内の培地を培地Ａに１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ；Ｓｉｇｍａ社）を添加したものに交換して増殖を停止させ、９０分培養後にＰＢＳで洗浄した後に、上記と同様の手法にて細胞を剥離させた。得られた細胞は上記と同様の手法にて凍結保存した。凍結保存したＭＭＣ処理済みＭＥＦは使用する前日に起こし、ゼラチンコートした１０ｃｍ細胞培養ディッシュに５ｘ１０５個／ディッシュで播種した。
（２）ｈｉＰＳ細胞
　東京大学ステムセルバンクより購入したＴｋＤＡ３－４株と京都大学ｉＰＳ細胞研究所より購入した２０１Ｂ７株を使用した。
　フィーダー細胞は（１）に記載の方法で作製したＭＥＦを用い、培地はＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ社）＋１／１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とし、細胞剥離液はＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社）を使用した。
（３）ストローマ細胞（１０Ｔ１／２）
　独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから入手した。
　培地はＢＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）＋１／１００ＧｌｕｔａＭＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、細胞剥離液は０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。（１５０ｃｍ２フラスコで継代維持し、週２回の頻度で継代し毎回約１／８倍（１フラスコの細胞を約８フラスコに継代）の細胞密度にした（５ｘ１０５～５ｘ１０６個／フラスコの範囲内で維持）。継代数ｐ３０までの物をＭＭＣによる増殖阻害をした上で使用した。ＭＭＣ処理済み１０Ｔ１／２はゼラチンコートした１０ｃｍ細胞培養ディッシュ上に１ｘ１０６個／ディッシュで播種した。
（４）初代培養ラットアストロサイト
　新生仔（Ｐ５－７）から大脳を分離して、実体顕微鏡下でピンセットを用いて髄膜を剥がした。培地Ｂ（ＡｄＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）＋１／１００ＧｌｕｔａＭＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を添加してピペッティングすることにより、機械的に脳を破壊して分散させた。静置した際の上清を回収し、セルストレーナー（１００Φ；　ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社）に通して遠心分離（２００Ｇ　４分）し、ペレットを回収した。得られた細胞を培地Ｂに再懸濁し、計数後ポリ-D-リシン（ＰＤＬ）コートフラスコ（７５ｃｍ２；　ＢＤ社）に５ｘ１０５個／フラスコで播種した。播種２日及び５日後に培地Ｂを交換（シェイカーで３時間振とう後）し、７日間培養したものを使用した。細胞回収前にシェイカーで３時間振とうし、培地ＢをＰＢＳに置換した後にさらに５時間振とうした。ＰＢＳを除去後に０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ナカライテスク株式会社）を添加し、シェイカーで３分振とう後に等量の培地Ｂで酵素反応を停止後回収した。得られた細胞は遠心分離（３００Ｇ　３分）し、ペレットをセルバンカーで凍結保存した。凍結保存したアストロサイトを起こし、ゼラチンコートした１０ｃｍ細胞培養ディッシュに２．５ｘ１０５個／ディッシュで播種し、４日後に培地Ｂを交換、７日目に共培養用培地Ｃ（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）＋１／１００ＧｌｕｔａＭＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００　ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に交換後３時間培養してから使用した。
（５）分化誘導
工程１
　（２）記載の方法で継代したｈｉＰＳ細胞が接着した１０ｃｍ細胞培養ディッシュをＰＢＳで洗浄し、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社）を１．５ｍｌ入れ、ゆすりながらＭＥＦを剥がした。剥がれたＭＥＦをアスピレーターで吸い取って、さらにＰＢＳで洗浄後、分化培地Ｄ（ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１５％　ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＥｑｕｉｔｅｃｈＬａｂ社）＋１／１００　ＧｌｕｔａＭＡＸ１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００　ＩＴＳ－Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋０．５ｍｍｏｌ／ｌ　モノチオグリセロール（ｗａｋｏ社）＋５０μｇ／ｍｌ　Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物（ｗａｋｏ社）＋１／１００　ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を１０ｍｌ添加し、セルスクレーパーでｈｉＰＳ細胞をかきとった。得られたｈｉＰＳ細胞を（３）に記載の方法で継代した１０Ｔ１／２上に１／４０（１ディッシュの細胞を約４０ディッシュに播種）の密度で、２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４：Ｂｌｏｏｄ　２００８　１１１：５２９８－５３０６によれば添加しなくても良い）を加えて播種した。播種３、６、８、１０、１２日後に分化培地Ｅ（ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１５％　ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＥｑｕｉｔｅｃｈＬａｂ社）＋１／１００　ＧｌｕｔａＭＡＸ１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００　ＩＴＳ－Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋０．５ｍｍｏｌ／ｌ　モノチオグリセロール（ｗａｋｏ社）＋５０μｇ／ｍｌ　Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物（ｗａｋｏ社）＋１／１００　ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））に２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い）を加えたものに交換し、１３日目に回収した。セルスクレーパーでＳａｃを破壊しながら細胞培養ディッシュから剥がして、セルストレーナー（４０Φ）を通して回収した。遠心分離（１２０Ｇ（１００～１５０Ｇで回収率と純度に影響がないことを確認済）１０分ブレーキ無し）したペレットを分化培地Ｅに再懸濁した。得られた細胞は約５０％がＣＤ３４陽性であることから、血液前駆細胞を作製できたと判断した。
工程２
　工程１で得られた血液前駆細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ　エリスロポエチン（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して１０Ｔ１／２上で培養して得られた赤血球のヘモグロビンの型が６日目まで全て胎児型であることから、血液前駆細胞からの分化誘導６日目までは全てが胚型造血であると判断した。
　工程１で得られた全細胞に５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－３（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）と５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して細胞培養ディッシュ５枚分の再懸濁液を１枚の細胞培養ディッシュ内の１０Ｔ１／２上に播種した。３日後に５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－３と５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭ－ＣＳＦを含む分化培地Ｅを５ｍｌ追加し、６日後にピペッティングによって回収した。回収した細胞懸濁液を遠心分離（３００Ｇ　３分）し、ペレットの細胞が全て（１００％）ＣＤ１４陽性であることから、６日目までは胚型造血であることと合わせて判断し、これらを胚型単球とした。
工程３
　工程２で得られた胚型単球は共培養用培地Ｆ（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１０％ＦＣＳ（ＥｑｕｉｔｅｃｈＬａｂ社）＋１／１００ＧｌｕｔａＭＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００　ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋１／１００ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））で再懸濁し、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）と５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－３４（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して、（４）記載の初代培養ラットアストロサイト上に１／２の密度で播種した。播種２日後に培地Ｆに５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦと５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－３４を加えた培地を５ｍｌ追加し、４日及び７日目には培地を７ｍｌ回収して遠心分離（３００Ｇ　３分）し、上記の培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を加えた培地に５０ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；入れなくても分化率に影響がない）を加えた培地８ｍｌでペレットを再懸濁して戻した。播種９日後（２５日後までは同様の結果が得られた）にピペッティングによって細胞を回収した。
（６）Ｉｂａ１免疫染色
　（５）に記載の方法で回収した細胞をＰＤＬ／ラミニンコートプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ；　Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、翌日接着細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを用いて４℃で１時間固定した。固定した細胞はＰＢＳで３回洗浄後、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳで５分処置し、ＰＢＳで３回洗浄後にブロッキング溶液（１．５％　ロバ血清／ＰＢＳ）で３０分処置した。次に１／５０　抗Ｉｂａ１抗体（Ａｂｃａｍ社）／ブロッキング溶液を４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで３回洗浄後に１／５００　ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　４８８　ｄｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）＋１／１０，０００　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）／ブロッキング溶液を加えて９０分反応させた。最後にＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡観察した。
　蛍光顕微鏡で撮影した像を図１に示す。回収した細胞の全て（１００％）がＩｂａ１陽性であり、突起を伸長していた（図２）。これは本方法によって、ｈｉＰＳ細胞より分化した細胞が、ミクログリアであることを示している。
実施例２　フィーダーフリーｉＰＳ細胞を用いたミクログリアの製造
（１）フィーダーフリーｉＰＳ細胞の維持培養
　東京大学ステムセルバンクより購入したＴｋＤＡ３－４株を使用した。コーティングにはｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ社）を、剥離液には０．５ｘＴｒｉｐｌｅ　ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｒｉｐｌｅ　ＴＭ　ｓｅｌｅｃｔ　ＣＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と０．５ｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ社）、ＰＢＳ（Ｗａｋｏ社）を２：１：１で混ぜ合わせたもの）、培地はＡＫ０３Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社）を使用した。
（２）分化誘導
工程１
　（１）に記載の方法で継代したｉＰＳ細胞が接着した６穴細胞接着プレートをＰＢＳで洗浄し、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１ｍｌ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃で１０分間処置した。再度ＰＢＳで洗浄後、分化培地Ｄを１０ｍｌ添加し、セルスクレーパーでｈｉＰＳ細胞をかきとった。得られたｈｉＰＳ細胞を実施例１の（３）に記載の方法で継代した１０Ｔ１／２上に約１／１０（６ｗｅｌｌプレート１ｗｅｌｌ分の細胞を１０ｃｍディッシュ２ディッシュに播種）の密度で、２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い）を加えて播種した。播種３、６、８、１０、１２日後に分化培地Ｅに２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い ）を加えたものに交換し、１３日目に回収した。セルスクレーパーでＳａｃを破壊しながら細胞培養ディッシュから剥がして、セルストレーナー（４０Φ）を通して回収した。遠心分離（１２０Ｇ（１００～１５０Ｇで回転率と純度に影響がないことを確認済）１０分ブレーキ無し）したペレットを分化培地Ｅに再懸濁した。
工程２
　工程１で得られた全細胞にＩＬ－３（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）とＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して細胞培養ディッシュ５枚分の再懸濁液を１枚の細胞培養ディッシュ内の１０Ｔ１／２上に播種した。３日後にＩＬ－３とＧＭ－ＣＳＦを含む分化培地Ｅを５ｍｌ追加し、６日後にピペッティングによって回収した。
工程３
　工程２で得られた胚型単球は共培養用培地Ｆで再懸濁し、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）と５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－３４（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して、実施例１の（４）記載の初代培養ラットアストロサイト上に１／２の密度で播種した。播種２日後に血球分化培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を加えた培地を５ｍｌ追加し、４日及び７日目には培地を７ｍｌ回収して遠心分離（３００Ｇ　３分）し、上記の血球分化培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を加えた培地に５０ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；入れなくても分化率に影響がないことを確認済み）を加えた培地８ｍｌでペレットを再懸濁して戻した。播種９日後にピペッティングによって細胞を回収した。
（３）Ｉｂａ１免疫染色
　工程３で回収した細胞をＰＤＬ／ラミニンコートプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ；　Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、翌日接着細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを用いて４℃で１時間固定した。固定した細胞はＰＢＳで３回洗浄後、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳで５分処置し、ＰＢＳで３回洗浄後にブロッキング溶液（１．５％　ロバ血清／ＰＢＳ）で３０分処置した。次に１／５０　抗Ｉｂａ１抗体（Ａｂｃａｍ社）／ブロッキング溶液を４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで３回洗浄後に１／５００　ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　４８８　ｄｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）＋１／１０，０００　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）／ブロッキング溶液を加えて９０分反応させた。最後にＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡観察した。その結果、回収した細胞の全て（１００％）がＩｂａ１陽性であり、突起を伸長していた。これは本方法によって、フィーダーフリーｈｉＰＳ細胞より分化した細胞が、ミクログリアであることを示している。
実施例３　血液前駆細胞作製段階の分化誘導期間検討
（１）分化誘導
工程１
　実施例１の（２）記載の方法で継代したｈｉＰＳ細胞が接着した１０ｃｍ細胞培養ディッシュをＰＢＳで洗浄し、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社）を１．５ｍｌ入れ、ゆすりながらＭＥＦを剥がした。剥がれたＭＥＦをアスピレーターで吸い取って、さらにＰＢＳで洗浄後、分化培地Ｄを１０ｍｌ添加し、セルスクレーパーでｈｉＰＳ細胞をかきとった。得られたｈｉＰＳ細胞を実施例１の（３）に記載の方法で継代した１０Ｔ１／２上に１／４０（１ディッシュの細胞を約４０ディッシュに播種）の密度で、２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い）を加えて播種した。播種３、６、８、１０、１２日後に分化培地Ｅに２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い ）を加えたものに交換し、任意の日数培養後回収した。セルスクレーパーでＳａｃを破壊しながら細胞培養ディッシュから剥がして、セルストレーナー（４０Φ）を通して回収した。遠心分離（１２０Ｇ（１００～１５０Ｇで回収率と純度に影響がないことを確認済）１０分ブレーキ無し）したペレットを分化培地Ｅに再懸濁した。
工程２～工程３
　実施例２の工程２～工程３と同じ方法で実施した。
（２）Ｉｂａ１免疫染色
　実施例２の（３）と同じ方法で実施した。
　血液前駆細胞作製期間を６、１３、２０、２７日間に設定してミクログリアへの分化誘導を実施したところ、全ての条件でミクログリア作製可能であるが、特に１３～２７日間においてミクログリア分化誘導効率が良かった。
実施例４　胚型単球作製段階の分化誘導期間検討
（１）分化誘導
工程１
　実施例１の（２）記載の方法で継代したｈｉＰＳ細胞が接着した１０ｃｍ細胞培養ディッシュをＰＢＳで洗浄し、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社）を１．５ｍｌ入れ、ゆすりながらＭＥＦを剥がした。剥がれたＭＥＦをアスピレーターで吸い取って、さらにＰＢＳで洗浄後、分化培地Ｄを１０ｍｌ添加し、セルスクレーパーでｈｉＰＳ細胞をかきとった。得られたｈｉＰＳ細胞を実施例１の（３）に記載の方法で継代した１０Ｔ１／２上に１／４０（１ディッシュの細胞を約４０ディッシュに播種）の密度で、２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い ）を加えて播種した。播種３、６、８、１０、１２日後に分化培地Ｅに２０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；非特許文献４によれば添加しなくても良い ）を加えたものに交換し、１３日目に回収した。セルスクレーパーでＳａｃを破壊しながら細胞培養ディッシュから剥がして、セルストレーナー（４０Φ）を通して回収した。遠心分離（１２０Ｇ（１００～１５０Ｇで回収率と純度に影響がないことを確認済）１０分ブレーキ無し）したペレットを分化培地Ｅに再懸濁した。
工程２
　工程１で得られた全細胞にＩＬ－３（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）とＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して細胞培養ディッシュ５枚分の再懸濁液を１枚の細胞培養ディッシュ内の１０Ｔ１／２上に播種した。３日後にＩＬ－３とＧＭ－ＣＳＦを含む分化培地Ｅを５ｍｌ追加し、任意の期間培養後にピペッティングによって回収した。回収した細胞懸濁液を遠心分離（３００Ｇ　３分）し、ペレットの細胞を次の工程に供した。
工程３
　工程２で得られた単球は共培養用培地Ｆで再懸濁し、Ｍ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）とＩＬ－３４（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して、実施例１の（４）記載の初代培養ラットアストロサイト上に１／２の密度で播種
した。播種２日後に培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を加えた培地を５ｍｌ追加し、４日及び７日目には培地を７ｍｌ回収して遠心分離（３００Ｇ　３分）し、培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を加えた培地にＴＧＦ－β１（５０ｎｇ／ｍｌ；　ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社；なくても分化率に影響がないことを確認済み）を加えた培地８ｍｌでペレットを再懸濁して戻した。播種９日後にピペッティングによって細胞を回収した。
（２）Ｉｂａ１免疫染色
　実施例２の（３）と同じ方法で実施した。
　単球誘導日数を０（工程２をスキップしたものを便宜上０日と表記した）、１、６、１０、１３、１７、２０日間で実験したところ、全ての誘導日数においてミクログリアを効率良く作製できた。
実施例５　サイトカイン濃度検討
（１）分化誘導
工程１
　実施例４の工程１と同様の方法で血液前駆細胞を作製した。
工程２
　工程１で得られた全細胞にそれぞれ任意の濃度でＩＬ－３（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）とＧＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して細胞培養ディッシュ５枚分の再懸濁液を１枚の細胞培養ディッシュ内の１０Ｔ１／２上に播種した。３日後に細胞播種時と同濃度のＩＬ－３とＧＭ－ＣＳＦを含む分化培地Ｅを５ｍｌ追加し、６日間培養後にピペッティングによって回収した。回収した細胞懸濁液を遠心分離（３００Ｇ　３分）し、ペレットの細胞を次の工程に供した。
工程３
　工程２で得られた単球は共培養用培地Ｆで再懸濁し、それぞれ任意の濃度でＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）とＩＬ－３４（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を添加して、実施例１の（４）記載の初代培養ラットアストロサイト上に１／２の密度で播種した。播種２日後に培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を細胞播種時と同じ濃度で加えた培地を５ｍｌ追加し、４日及び７日目には培地を７ｍｌ回収して遠心分離（３００Ｇ　３分）し、上記の培地ＦにＭ－ＣＳＦとＩＬ－３４を細胞播種時と同じ濃度で加えた培地にＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）を加えた培地８ｍｌでペレットを再懸濁して戻した。播種９日後にピペッティングによって細胞を回収した。
（２）Ｉｂａ１免疫染色
　実施例２の（３）と同じ方法で実施した。結果を表１にまとめる。実施例１の結果を基準とし、同等の分化誘導効率を○、１／１０以下の分化誘導効率を△とした。
　各サイトカイン濃度はそれぞれ０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌで実験を行い、全ての条件でミクログリアを作製可能であった。工程２ではＩＬ－３を２５ｎｇ／ｍｌ以上、もしくはＧＭ－ＣＳＦを５０ｎｇ／ｍｌ以上添加すると、特に分化誘導効率が良かった。工程３ではＭ－ＣＳＦを２５ｎｇ／ｍｌ以上で添加すると特に効率が良かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の方法により、多能性幹細胞から効率よくミクログリアが製造できる。得られるミクログリアは、ミクログリア自体の研究、ミクログリアが関連する疾患の研究等、様々な基礎研究に利用可能である。また、ミクログリアを用いることを特徴とする、ミクログリアが関与する疾患の治療薬のスクリーニング方法、又は、個々の患者から樹立したミクログリアを用いて個人に最適な治療薬を選別する、いわゆるオーダーメード治療薬の選択において極めて有用である。さらに、細胞治療への利用も期待される。

Claims (11)

  1. 以下の工程を含む、多能性幹細胞からミクログリアを製造する方法：
    　（ａ）多能性幹細胞を７日間以上フィーダー細胞と共培養し、血液前駆細胞を得る工程、
    　（ｂ）工程（ａ）で得られた血液前駆細胞をＩＬ－３及び／又はＧＭ－ＣＳＦの存在下でフィーダー細胞と共培養し、胚型単球を得る工程、及び
    　（ｃ）工程（ｂ）で得られた胚型単球をＭ－ＣＳＦの存在下でアストロサイトと共培養又はアストロサイト上清を用いて培養する工程。
  2. 工程（ａ）の培養期間が、１３日以上である、請求項１記載の方法。
  3. 工程（ｃ）において、ＩＬ－３４の存在下で培養することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
  4. 工程（ｂ）において、ＩＬ－３及びＧＭ－ＣＳＦの存在下で培養することを特徴とする、請求項１～３いずれかに記載の方法。
  5. フィーダー細胞が、１０Ｔ１／２細胞又はＯＰ９細胞である、請求項１～４いずれかに記載の方法。
  6. 工程（ａ）において、ＶＥＧＦの存在下で培養することを特徴とする、請求項１～５いずれかに記載の方法。
  7. 多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１～６いずれかに記載の方法。
  8. ｉＰＳ細胞が、ヒト又はマウス由来である、請求項７記載の方法。
  9. 請求項１～８の方法で製造されたミクログリアを用いることを特徴とする、ミクログリアが関与する疾患の予防若しくは治療剤又は記憶若しくは学習能力改善剤のスクリーニング方法。
  10. ミクログリアが関与する疾患が、脊髄の外傷、脳卒中による神経障害、てんかん、神経障害性疼痛、血管閉塞性の眼疾患、脱髄疾患、精神疾患、脳梗塞、那須ハコラ病又は神経変性疾患である、請求項９記載のスクリーニング方法。
  11. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症である、請求項１０記載のスクリーニング方法。
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