WO2018070854A2 - 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prophylaxis or treatment of hepatitis containing a monoacetyldiacylglycerol compound, and more particularly, it is possible to effectively prevent and treat hepatitis, and to use a safe monoacetyldiacylglycerol compound with no side effects in use. It relates to a composition for preventing or treating hepatitis containing.
  • Liver is one of the most important metabolic organs in the organs of the body, and performs important functions such as bile secretion, nutrient storage, and detoxification.
  • Metabolic disorders such as protein metabolism and hepatic brain disease, vitamin metabolism, and poor absorption, may occur, and liver disease may worsen due to infection, fatty liver, cirrhosis, and the like.
  • Hepatic diseases known to date include a variety of hepatic disorders such as acute hepatitis caused by drugs, fatty liver caused by drinking, acute hepatitis caused by viral infections, chronic hepatitis modified by electric acute hepatitis, or cirrhosis accompanied by electrical disorders.
  • hepatitis is a disease caused by T cell mediated immune response and inflammation of the liver. Under these conditions, new leukocyte increases and hepatic sites of these cells lead to the onset of the disease. Although much is known about the pathogenesis of hepatitis, treatment targets (subjects, targets) are still unsatisfactory.
  • Concanavalin A (hereafter ConA) induces T cell activity and results in T cell mediated liver damage (Gantner F, Leist M, Lohse AW, Germann PG, Tiegs G. Concanavalin A-induced T-cell -mediated hepatic injury in mice: the role of tumor necrosis factor.Hepatology 1995; 21: 190-198).
  • IL-4 is produced by human umbilical vein endothelium (Striz I, Mio T, Adachi Y, Robbins RA, Romberger DJ, Rennard SI.
  • IL-4 and IL-13 stimulate human bronchial epithelial cells to release IL- 8. Inflammation 1999; 23: 545-555) and this cytokine induces trafficking regulation of neutrophils via the STAT3 pathway.
  • galactosamine which is known as a substance capable of causing liver disease similar to carbon tetrachloride, may specifically act on the liver and cause various diseases, mainly hepatocellular necrosis and inflammation in hepatocytes and hepatic portal veins. Induced by chronic liver disease, it is known that can cause cirrhosis, cellular tumors.
  • SIL silymarin
  • DDB biphenyl dimethyl dicarboxylate
  • UDCA ursodeoxycholic acid
  • these therapeutic agents have the disadvantage that the type of hepatic disease that can be applied is limited. Because of the various functions of the liver, when a therapeutic agent is administered to treat one type of disease, the desired disease can be treated, but unexpected side effects may occur, and when hepatic disease is misdiagnosed, incorrect administration of the therapeutic agent may result. This is because hepatic disease may be worse.
  • extracts from green tea may increase the activity of UDP-glucuronosyl transferase, resulting in increased excretion of carcinogens in the liver (see A. Bu-Abbas et al., Food and Chemical Toxicology, 33 (1): 27-30, 1995; OS Sohn et al., Food and Chemical Toxicology, 36: 617-621, 1998). Although it has not been proved, studies on extracts that can improve other liver diseases have not made much progress.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hepatitis containing a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following formula (1) as an active ingredient.
  • R1 and R2 are each independently a fatty acid group having 14 to 22 carbon atoms.
  • the present invention also provides a health functional food composition containing the composition as an active ingredient, which can prevent or improve hepatitis, and the prophylaxis or treatment of hepatitis comprising administering the composition to a suspicion of a hepatitis disease.
  • a health functional food composition containing the composition as an active ingredient, which can prevent or improve hepatitis, and the prophylaxis or treatment of hepatitis comprising administering the composition to a suspicion of a hepatitis disease.
  • composition according to the present invention may not only be useful for the prevention or treatment of hepatitis, but may be safely used because there are no side effects.
  • FIG. 1 is a view showing an example of a mechanism for preventing hepatitis using the PLAG of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in cytokines in plasma when the composition of the present invention is administered.
  • FIG. 3 is a graph (A) and RT-PCR photograph (B) showing changes in cytokines in liver tissue when the composition of the present invention is administered.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in neutrophils and leukocytes in blood (A) and liver tissue (B) when the composition of the present invention is administered.
  • Figure 5 is a photograph showing whether the neutrophil cells remaining in the damage site in the liver tissue when administered the composition of the present invention.
  • Figure 6 is a picture of the relief effect of PLAG on liver damage when the composition of the present invention is administered.
  • Figure 7 is a graph showing the results of WST assay of HepG3B cells and HL-60 cells of liver cell origin according to PLAG dose when the composition of the present invention is administered.
  • FIG. 8 is a diagram showing the inhibitory effect of IL-4-induced STAT6 activity and related signaling mechanisms according to the dosage of PLAG when the composition of the present invention is administered.
  • FIG 9 shows the structure (A) and the effect comparison (B and C) of PLAG and PLG of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the transcriptional activity of STAT6 when the composition of the present invention is administered.
  • 11 is a view showing the effect of reducing the expression and changes in cell adhesion of IL-8 and VCAM-1 according to the dosage to PLAG when the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis according to the present invention contains a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • R1 and R2 are each independently a fatty acid group having 14 to 22 carbon atoms, preferably 15 to 20 carbon atoms.
  • monoacetyldiacylglycerol compound in the present invention means a derivative of glycerol having one acetyl group and two acyl groups, also referred to simply as monoacetyldiacylglycerol (MADG).
  • MADG monoacetyldiacylglycerol
  • R1 and R2 are each a fatty acid group having 14 to 22 carbon atoms (in the fatty acid, refers to the remaining portion excluding the hydroxy group), preferably palmitoyl, oleoyl, linoleyl (linoleoyl), linolenoyl (linolenoyl), stearoyl (stearoyl), myristoyl (myristoyl) or arachidonoyl (arachidonoyl) and the like, but is not limited thereto.
  • the combination of R1 and R2 is oleoyl / palmitoyl, palmitoyl / oleoyl, palmitoyl / linoleyl, palmitoyl / linolenoyl, palmitoyl / arachidonoyl, palmitoyl / stearo Sun, palmitoyl / palmitoyl, oleoyl / stearoyl, linoleyl / palmitoyl, linoleyl / stearoyl, stearoyl / linoleyl, stearoyl / oleoyl, myristoyl / linol Leoyl or myristoyl / oleoyl and the like, most preferably the combination of R1 and R2 is palmitoyl / linoleonyl, respectively.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound may be (R) -type, (S) -type or racemate (rac), preferably racemate, the stereoisomer of the compound All also fall within the scope of the present invention.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound may be a compound represented by the following formula (2).
  • the compound represented by Formula 2 is 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol, which corresponds to the case where R1 and R2 of Formula 1 are palmitoyl and linoleyl, respectively, Accordingly it is named "PLAG” or "EC-18".
  • the monoacetyldiacylglycerol compound of the present invention can be extracted / separated from antler or prepared by a known organic synthesis method.
  • the deer antler may be extracted with hexane, the extract residue may be extracted with chloroform again, and the extract obtained may be distilled under reduced pressure to obtain an antler chloroform extract.
  • the amount of hexane and chloroform, which are the extraction solvents used for the extraction, is sufficient to cover the amount of antler, respectively, and in general, hexane and chloroform may be used in a ratio of about 4 to 5 L per 1 kg of antler, but the extraction solvent The type and amount of use is not limited to this.
  • the chloroform extract of antler obtained in this manner can be further fractionated and purified by silica gel column chromatography or TLC to obtain a monoacetyldiacylglycerol compound used in the present invention.
  • Chloroform / methanol, hexane / ethyl acetate, hexane / ethyl acetate / acetic acid, etc. may be used as the eluent in the chromatography purification step, but is not limited thereto.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound exhibits excellent activity in improving, preventing or treating hepatitis.
  • the content of the monoacetyldiacylglycerol compound included in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is 0.0001 to 100.0% by weight, preferably 0.001 to 99% by weight, more preferably 0.001 to the total weight of the composition. To 50% by weight, most preferably 0.01 to 20% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include other active ingredients having a therapeutic effect of hepatitis, and, for example, when prepared as a soft capsule, as an anti-oxidant, 0 to 5% by weight, preferably 0.1 to 3% by weight, more preferably 0.5 to 1.5% by weight of alpha-tocopherol and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may have a formulation of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, lyophilizers, suppositories, or the like. Or may be various parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include carriers, excipients, diluents and the like which are commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, It is prepared by mixing lactose, gelatin and the like.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, It is prepared by mixing lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like can also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol, olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the compounds of the present invention can be administered in pharmaceutically effective amounts.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of subject, age, sex, weight, type of disease. , The severity of the disease, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the form of the drug, the route of administration, the duration of administration, the rate of release, the drug used concurrently, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with other therapeutic agents.
  • Preferred dosages of the compounds of the invention can be determined by the practitioner within the scope of good medical judgment, but are generally from 0.001 to 2,000 mg / kg, preferably from 0.05 to 400 mg / kg, more preferably from 0.1 to 200 mg
  • the amount of / kg may be administered once to several times daily. For example, it can be administered once to several times at a dose of 1 mg to 1 g, preferably 30 mg to 120 mg per day for an adult weighing 60 kg.
  • the compounds of the present invention may be taken for a long time for the purpose of prophylaxis or treatment since they do not have toxicity and side effects.
  • composition of the present invention can be applied to any individual for the purpose of preventing or treating hepatitis.
  • individuals include humans, as well as non-human animals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, morphotes, rats, mice, cattle, sheep, pigs, goats, mammals, and the like.
  • the present invention contains a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following formula (1) as an active ingredient, provides a health functional food composition that can prevent and improve hepatitis.
  • R1 and R2 are each independently a fatty acid group having 14 to 22 carbon atoms.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound of the present invention may be included in the nutraceutical composition to prevent or improve hepatitis of the subject.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound and hepatitis are as described above.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use.
  • the compound of the present invention is preferably 0.01 to 15 parts by weight, more preferably 0.02 to 10 parts by weight, still more preferably 0.3 to 1 parts by weight based on 100 parts by weight of the raw material. It can be added in amounts.
  • the amount may be below the above range, and may be used in an amount above the above range as necessary.
  • the types of health functional foods that may include the compounds of the present invention, specifically meats, sausages, breads, chocolates, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, and ice creams.
  • Dairy products, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, etc. may include all of the general dietary supplements, and may include animal feed.
  • the health functional food composition of the present invention when used in the form of a beverage, it may contain a conventional sweetening agent, flavoring agent, natural carbohydrate and the like as additional components.
  • the natural carbohydrate can be glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be preferably about 0.01 to 0.04 g, more preferably 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the sweetener may be a natural sweetener such as taumartin, stevia extract and a synthetic sweetener such as saccharin, aspartame.
  • the nutraceutical composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin , Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. Others may contain pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating hepatitis, comprising administering the pharmaceutical composition to a susceptible subject to hepatitis. That is, hepatitis can be effectively prevented or treated by administering the compound of the present invention to a subject suspected of hepatitis.
  • the suspicion of the hepatitis means a subject having hepatitis or a possibility of onset.
  • the type of the monoacetyldiacylglycerol compound, the dosage of the monoacetyldiacylglycerol compound, and the hepatitis are as described above.
  • administration means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suspected of hepatitis in a suitable manner.
  • the route of administration can be various oral or parenteral routes as long as the target tissue can be reached, for example, oral, intraperitoneal, transdermal (such as topical application), intravenous, intramuscular, subcutaneous Intradermal administration, intranasal administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration and the like may be used, but is not limited thereto.
  • prevention in the present invention means any action that inhibits or delays the development of hepatitis by administration of the composition of the present invention
  • treatment is any action that improves or beneficially changes the symptoms of hepatitis disease by the composition of the present invention
  • Immprovement refers to any act that improves or benefits the suspicion of a hepatitis disease and the symptoms of the onset individual using the composition of the present invention.
  • FIG. 1 is a view showing an example of a mechanism for preventing hepatitis using the PLAG of the present invention.
  • IL-4 is induced into concanavalin A, and induced IL-4 induces phosphorylation of STAT6, moving neutrophils from the blood to the liver, thereby neutrophils
  • the recruited and phosphorylated STAT6 secretes chemokines, such as IL-8 and eotaxin, which in turn promote neutrophil migration and induce liver tissue damage.
  • chemokines such as IL-8 and eotaxin
  • the expression and / or activity of IL-4, IL-6, MIP-2 may be inhibited to inhibit PKC- ⁇ , Phosphorylation of PKC ⁇ , PKC ⁇ , STAT6, and mixtures thereof, expression of adsorption molecules and / or excessive migration of neutrophils from the blood to the liver can be prevented or treated.
  • ConA concanavalin A
  • EC-18 or PLAG 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol
  • Hep3B, HepG2, EL-4 and HL-60 cell lines were incubated at a temperature of 5% CO 2 and 37 ° C. Values for comparison between groups in the body were analyzed using one analysis method of analysis of variance (ANOVA), and two groups of in vitro were analyzed using independent student's t test. It was. Statistical significance was assumed to be p ⁇ 0.05.
  • mice were randomly divided into three groups: control, ConA treated group and PLAG pretreated group.
  • the Con A and PLAG were both dissolved in PBS (phosphate buffer saline).
  • Mice were orally administered with PBS or PLAG, and 2 hours later, 20 mg / kg BW of Con A was intravenously injected into the Con A treated group and the PLAG pretreated group, respectively. Thereafter, PLAG was orally administered to mice in an amount of 100 mg / kg BW.
  • BW means body weight.
  • Blood samples were obtained from cardiac puncture 18 hours after Con A administration in mice of Example 1 and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes.
  • liver tissue lysate animals were killed and livers were washed using PBS.
  • the liver was homogenized and filtered using a 70 ⁇ m mesh cell strainer (mesh cell strainer, BD Falcon cell strainer, BD Biosciences, Bedford, MA) in PBS.
  • the supernatants were also collected by centrifugation at 2,000 rpm for 5 minutes. Lower cell pellets were resuspended in PBS and analyzed for complete blood cell count (CBC).
  • CBC complete blood cell count
  • FIG. 2 is a graph showing changes in cytokines in plasma when the composition of the present invention is administered.
  • PLAG reduced IL-4, IL-6, IL-10, MIP-2 in ConA-treated mouse plasma.
  • IL-4, IL-6, IL-10, MIP-2 in rat plasma injected with ConA were significantly higher than control rats, and IL-4, IL-6, IL-10 increased by stimulation of ConA.
  • MIP-2 were significantly decreased in PLAG-ingested rats, and the increased concentration of IFN ⁇ in the ConA-induced group was not significantly reduced compared to mice not treated with PLAG.
  • PLAG can reduce the secretion of cytokines leading to onset associated with hepatitis induced by ConA treatment.
  • FIG. 3 is a graph (A) and an RT-PCR photograph (B) showing changes in cytokines in liver tissue when the composition of the present invention is administered.
  • FIG. 3 high protein and mRNA levels of liver IL-4 and MIP-2 were observed in liver tissue of ConA administered mice. Increased expression of cytokines (IL-4, MIP-2, etc.) in the ConA-administered group was significantly reduced in the additional administration of PLAG. These results show that PLAG regulates cytokines such as IL-4 and MIP-2 levels in plasma (see A in FIG. 3).
  • CBC Complete blood count
  • FIG. 4 is a graph showing changes in neutrophils and leukocytes in blood (A) and liver tissue (B) when the composition of the present invention is administered.
  • the number of circulating leukocytes was slightly downregulated in Con-A stimulated mice, and circulating neutrophils were significantly increased in the group further administered PLAG (FIG. 4A).
  • the number of leukocytes present in the liver was increased in mice administered Con-A, and the number of neutrophils present in the liver was significantly reduced in the group administered additional PLAG (FIG. 4B).
  • Liver sites were harvested from mice 8 hours after Con A administration in the mice of Example 1.
  • the liver site was fixed in 10% neutral buffered formarlin, embedded in paraffin and cut to a thickness of 5 um. After removing paraffin and rehydrating, the flakes were stained with hematoxylin and eosin. In addition, for neutrophil identification, liver sites were stained with anti-mouse neutrophil antibody. All samples were evaluated histologically under Leica (Leica, Wetzlar, Germany) optical microscope and digital images were taken at X200 magnification.
  • Figure 5 is a photograph showing whether the neutrophil cells remaining in the injury site in the liver tissue when the composition of the present invention is administered.
  • administration of ConA may induce a large number of leukocyte infiltration and then affect autologous tissue destruction, but administering PLAG mitigates neutrophil migration into the liver.
  • Has the potential to Total neutrophil counts were measured by immunohistochemical staining using anti-neutrophil antibodies.
  • Hepatic tissues treated with ConA were severely damaged while hepatic tissues treated with PLAG had little damage to hepatocytes. have.
  • neutrophils enhanced by stimulation of ConA can be effectively alleviated by PLAG treatment.
  • a scale bar means 200 um.
  • FIG. 6 is a photograph of the alleviation effect of PLAG on liver damage when the composition of the present invention is administered.
  • the alleviating effect of PLAG on liver damage was tested using hematoxylin-eosin staining. Histological examination of the liver site can be seen to result in intravenous administration of ConA such as severe hepatocellular injury, hepatic hepatic sinusoid structure, and intrahepatic neutrophil infiltration within 8 hours.
  • ConA such as severe hepatocellular injury, hepatic hepatic sinusoid structure, and intrahepatic neutrophil infiltration within 8 hours.
  • PLAG treatment significantly alleviated the pathological changes as described above, including rare neutrophil infiltration and rarely necrotic foci.
  • PLAG mitigates the hepatitis induced by ConA.
  • Hep3B cells were placed in a 12-well well plate (2.5x10 ⁇ 5 per sphere), treated with PLAG at various concentrations (0.1, 1, 10, 100 ug / mL), and after 2 hours, for 1 hour with IL-4 Activated.
  • the total protein extract was immunoblot used as phospho-STAT6, STAT6, phospho-JAK1 and phosphor-PKC ⁇ / ⁇ Abs (cell signaling).
  • HL-60 cells were placed in 12-hole grooves (1 ⁇ 10 6 for each sphere) and treated as described above.
  • Total protein extracts were immunoblotted with isoforms of phospho-PKC ( ⁇ , ⁇ , ⁇ / ⁇ , ⁇ / ⁇ ) (cell signaling) and GAPDH Abs (Santa Cruz Biotechnolgy Inc., CA). Detection was performed using Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore Corporation, Billerica, Mass.).
  • FIG. 7 is a graph showing the results of WST assay of HepG3B cells and HL-60 cells of hepatic cell origin according to the dose of PLAG when the composition of the present invention is administered
  • FIG. 8 is a diagram showing PLAG when the composition of the present invention is administered.
  • This figure shows the inhibitory effect of STAT6 activity and related signaling mechanisms induced by IL-4 according to the dosage of.
  • the intracellular mechanism for alleviating liver damage using PLAG was confirmed in vitro.
  • HepG2 and Hep3B were used as hepatocytes and HL-60 as neutrophil cells. Cytotoxicity of EC-18 in liver cells and leukocytes was confirmed by WST assay.
  • FIG. 9 is a view showing the structure (A) and effect comparison (B and C) of the PLAG and PLG of the present invention.
  • the selectivity of PLAG was confirmed by comparison of PLAG and PLG at each STAT6 phosphorylation and transcriptional activity.
  • PLG is the prototype of the DAG and PLAG is the type of acetylated DAG (see A of FIG. 9).
  • the specificity of PLAG function for alleviation of live injury was indirectly examined through STAT6 activity analysis.
  • Western blot analysis using anti-phospho-SAT6 shows that phosphorylation of STAT6 is significantly reduced in PLAG treated Hep3B cells but not in PLG treated cells.
  • the results as described above show that PLAG plays a very special role in protecting against hepatic damage in ConA-induced hepatitis.
  • HepG2 and Hep3B cells were transfected into a reporter luciferase plasmid containing four pairs of binding sites of STAT6 (p4xSTAT6-Luc2P; Addgene, Cambridge, Mass.), And reporter vectors were transfected into the Attractene reagent and into the cell system. Injected.
  • STAT6 reporter vectors 10 ng / ml IL-4 was used for 6 hours after treatment with the cells, and luciferase activity was measured using a luciferase assay system by luminometer. Luciferase activity of each sample was normalized to correspond to the sample transfected with PLAG.
  • FIG. 10 is a graph showing the transcriptional activity of STAT6 when the composition of the present invention is administered. As shown in FIG. 10, it can be seen that STAT6 transcriptional activity associated with gene expression for neutrophil migration is effectively prevented by treating 10 and 100 ug / ml PLAG and 20 nM and 200 nM STAT6 inhibitors as positive controls. have. These data show that EC-18 mitigates the activity of PKC- ⁇ / ⁇ and has an effect on successive dephosphorylation of Jak1 in PKC- ⁇ , JAK1 and STAT6 cascades.
  • FIG. 11 is a view showing the effect of reducing the expression and changes in cell adhesion of IL-8 and VCAM-1 according to the dosage to PLAG when the composition of the present invention.
  • RT-PCR data show that expression of IL-8 and VCAM-1 stimulated and secreted by IL-4 to allow HL-60 cells to be adsorbed to fibronectin via PLAG administration (dose dependent method). Etc.), it can be effectively and effectively suppressed (FIG. 11A).
  • the activity of HL-60 regulated by IL-4 and / or PLAG was calculated using WST-1 analysis and cell number.
  • 10 ng / ml IL-4 is sufficient to stimulate HL-60 cells for adsorption on coated fibronectin, and 100, 10, 1 ug / mL PLAG significantly reduced the adsorption of dose dependent HL-60. (See B and C in FIG. 11).

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Abstract

간염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 사용시 부작용이 없어 안전한 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물이 개시된다. 상기 조성물은 명세서의 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유한다. 명세서의 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.

Description

모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 사용시 부작용이 없어 안전한 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간장은 신체 장기에서 가장 중요한 대사 기관의 하나로서, 담즙분비, 영양소의 저장, 해독작용 등의 중요한 기능을 수행하므로, 간장에 이상이 생길 경우에는 당질대사, 지질대사, 단백질과 질소 대사, 아미노산 대사, 단백질 대사와 간성 뇌질환, 비타민 대사, 흡수 불량 등의 대사성 장애가 발생하고, 감염, 지방성 간장, 간경변증 등으로 간장질환이 악화될 수 있다. 현재까지 알려진 간장질환으로는 약물 등에 의한 급성 간염, 음주 등에 의한 지방간, 바이러스 감염에 의한 급성 간염, 전기 급성 간염이 변형된 만성 간염 또는 전기 장해에 수반되는 간경변 등의 다양한 간장기능장해를 나타내는 질환이 알려져 있다.
그 중 간염은 T세포 매개의 면역 반응 및 간의 염증에 의한 질환이다. 이러한 조건에서, 신규 백혈구 증가 및 이러한 세포들의 간장내 부위는 병의 발병이 유도된다. 간염의 발병기전에 대해 많이 알고 있긴 하지만, 여전히 치료 목표(대상, 표적)는 만족하지 못한다. 콘카나발린 A(Concanavalin A, 이하 ConA)는 T세포의 활성 및 T세포 매개 간 손상의 초래를 유도한다(Gantner F, Leist M, Lohse AW, Germann PG, Tiegs G. Concanavalin A-induced T-cell- mediated hepatic injury in mice: the role of tumor necrosis factor. Hepatology 1995;21:190-198). 이러한 간세포 손상상태에서 T세포와 대식세포는 IFNγ, TNFα, IL-4등 다양한 사이토카인을 분비하며 특히 IL-4 및 IL-13은 STAT6을 활성화시키며, 그것은 Th2 분화, 조직 부착, 염증 및 조혈 조직에 대한 여러가지 효과들을 일으키는 주요 원인이다. IL-4는 인간 제대정맥혈관내피에 의한 IL-8 생산(Striz I, Mio T, Adachi Y, Robbins RA, Romberger DJ, Rennard SI. IL-4 and IL-13 stimulate human bronchial epithelial cells to release IL-8. Inflammation 1999;23:545-555) 및 이 사이토카인의 STAT3 경로를 통한 호중구의 트래피킹 조절을 유도한다. 또한 최근의 보고에 따르면 IL-4에 의한 STAT6 활성이 백혈구의 이동을 촉진함으로서 간손상 악화를 유도하기도 한다(Jaruga B, Hong F, Sun R, Radaeva S, Gao B. Crucial role of IL-4/STAT6 in T cell-mediated hepatitis: up-regulating eotaxins and IL-5 and recruiting leukocytes. J Immunol 2003;171:3233-3244).
또한, 이러한 간장질환을 치료하기 위한 약물을 개발하려는 노력이 계속되고 있으나, 지금까지 간장질환에 대하여 임상적으로 효과가 인정되는 약물은 소수에 불과하다. 이러한 약물의 약리효과를 검색하기 위하여 가장 유용한 방법으로서는, 사염화탄소(CCl4)에 의한 유발되는 혈청 중의 GOT 및 GPT의 수준의 급격한 증가에 대한 보호효과를 측정하는 방법이 알려져 있으며, 이렇게 사염화탄소에 의하여 유발된 간장질환을 억제할 수 있는 물질로서 검색된 약물은 간보호 활성(liver-protective action) 및 해독촉진효과(detoxifying effect)를 나타내는 것으로 알려져 있다(참조: Kiso, Y., Shoyaku, 36:238-243, 1982; Glende, E. A., Biochem. Pharmacol., 25:2163-2169, 1976). 또한, 사염화탄소와 유사하게 간장질환을 유발시킬 수 있는 물질로서 알려진 갈락토사민은 간에 특이적으로 작용하여 각종 질환을 야기시킬 수 있는데, 주로 간세포괴사 및 간세포와 간문맥(hepatic portal vein)에서의 염증을 유발시키고, 만성 간장질환으로 유도할 경우, 간경변, 세포성 종양을 유발시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
현재까지, 간장질환의 치료제로서 다양한 제품이 개발되어 있으나, 실질적으로 효능을 입증받은 것은 실리마린(silymarin, SIL), 비페닐 디메틸 디카르복실산염(biphenyl dimethyl dicarboxylate, DDB), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid, UDCA) 등 몇 종류에 불과하며, 이들 치료제는 적용될 수 있는 간장질환의 종류가 제한되어 있다는 단점이 있다. 이는 간장의 다양한 기능으로 인하여, 한 종류의 질환을 치료하기 위하여 치료제를 투여할 경우, 목적하는 질환은 치료할 수 있었으나, 예상치 못한 부작용이 발생할 수도 있고, 간장질환이 오진되는 경우, 치료제의 잘못된 투여로 인하여, 간장질환이 더욱 악화될 수도 있기 때문이다. 더욱이, 현재까지 개발된 약물들은 대부분이 발병된 간장질환을 치료하기 위한 약물이며, 간장질환을 사전에 예방할 수 있는 약물에 대한 연구성과는 미비한 실정이다. 이에, 부작용이 없고 간장질환의 예방 및 치료에 사용할 수 있는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있어, 천연물 추출물로부터 부작용이 없는 간장질환의 예방 및 치료효과를 나타내는 성분을 추출하려는 노력이 계속되었다. 예를 들어, 녹차에서 추출된 추출물이 UDP-글루쿠로노실 트랜스퍼라제(UDP-glucuronosyl transferase)의 활성을 증가시켜서, 간장내 발암물질의 배출을 증가시킬 수 있다는 결과(참조: A. Bu-Abbas et al., Food and Chemical Toxicology, 33(1):27-30, 1995; O. S. Sohn et al., Food and Chemical Toxicology, 36:617-621, 1998)가 보고되기도 하였으나, 실질적인 간암의 치료효과를 증명하지는 못하였으며, 그 외의 간장 질환을 호전시킬 수 있는 추출물에 대한 연구는 별다른 진전이 없는 실정이다.
따라서, 부작용이 없고, 효과적으로 간염의 예방 및 치료에 사용할 수 있는 조성물을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 간염을 효과적으로 예방 또는 치료하면서, 부작용이 없는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017014242-appb-I000001
상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 함유하며, 간염의 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물을 제공하고, 상기 조성물을 간염 질환의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 간염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 간염의 예방 또는 치료에 유용할 뿐만 아니라, 부작용이 없어 안전하게 사용 가능할 수 있다.
도 1은 본 발명의 PLAG를 이용한 간염을 예방하는 메커니즘의 일예를 보여주는 도면.
도 2는 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 혈장 내 사이토카인의 변화를 보여주는 그래프.
도 3은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간 조직 내 사이토카인의 변화를 보여주는 그래프(A) 및 RT-PCR 사진(B).
도 4는 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 혈액(A) 및 간 조직(B) 내 호중구 및 백혈구의 변화를 보여주는 그래프.
도 5는 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간 조직 내 손상부위에 위치하는 호중구 세포의 잔존여부를 보여주는 사진.
도 6은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간 손상에 대한 PLAG의 완화 효과를 사진.
도 7은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, PLAG 투여량에 따라 간 세포 기원의 HepG3B 세포 및 HL-60 세포의 WST assay 결과를 보여주는 그래프.
도 8은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, PLAG의 투여량에 따른 IL-4로 유도되는 STAT6 활성 및 관련신호전달기작의 억제효과를 보여주는 도면.
도 9는 본 발명의 PLAG 및 PLG의 구조(A) 및 효과 비교(B 및 C)를 보여주는 도면.
도 10은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, STAT6의 전사 활성을 보여주는 그래프.
도 11은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, PLAG에 투여량에 따라 IL-8 및 VCAM-1의 발현 변화와 세포접착능을 감소효과를 보여주는 도면.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017014242-appb-I000002
상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 14 내지 22, 바람직하게는 탄소수15 내지 20의 지방산기이다.
본 발명에서 용어 "모노아세틸디아실글리세롤 화합물"은 하나의 아세틸기와 2개의 아실기를 갖는 글리세롤의 유도체를 의미하며, 단순히 모노아세틸디아실글리세롤(MADG)이라고도 한다. 상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기(지방산에서, 히드록시기가 제외된 나머지 부분을 말한다)이며, 바람직하게는 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 리놀레노일(linolenoyl), 스테아로일(stearoyl), 미리스토일(myristoyl) 또는 아라키도노일(arachidonoyl) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 상기 R1 및 R2의 조합은 올레오일/팔미토일, 팔미토일/올레오일, 팔미토일/리놀레오일, 팔미토일/리놀레노일, 팔미토일/아라키도노일, 팔미토일/스테아로일, 팔미토일/팔미토일, 올레오일/스테아로일, 리놀레오일/팔미토일, 리놀레오일/스테아로일, 스테아로일/리놀레오일, 스테아로일/올레오일, 미리스토일/리놀레오일 또는 미리스토일/올레오일 등일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 R1 및 R2의 조합이 각각 팔미토일/리놀레오닐이다. 또한, 광학활성에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 (R)-형, (S)-형 또는 라세미체(rac)일 수 있고, 바람직하게는 라세미체이며, 상기 화합물의 입체 이성질체도 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
예를 들어, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2017014242-appb-I000003
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸-rac-글리세롤이며, 상기 화학식 1의 R1 및 R2가 각각 팔미토일 및 리놀레오일인 경우에 해당하고, 필요에 따라 "PLAG" 또는 "EC-18"이라 명명된다.
본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 녹용으로부터 추출/분리되거나, 공지의 유기합성법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출한 다음, 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 클로로포름 추출물을 수득할 수 있다. 상기 추출에 사용되는 추출용매인 헥산 및 클로로포름의 양은 각각 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로 녹용 1 kg에 대하여 헥산 및 클로로포름을 각각 4 내지 5 ℓ정도의 비율로 사용할 수 있으나, 추출용매의 종류와 사용량이 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법으로 수득한 녹용의 클로로포름 추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 또는 TLC에 의해 더 분획화하고 정제하여, 본 발명에 사용되는 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물을 얻을 수 있다. 상기 크로마토그래피 정제 단계의 용리액으로는 클로로포름/메탄올, 헥산/에틸아세테이트, 헥산/에틸아세테이트/아세트산 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 화학적으로 합성하는 방법의 일 예는 대한민국 등록특허 10-0789323호에 개시되어 있다. 상기 특허 방법에 의하면, (a) 1-R1-글리세롤의 3번 위치에 보호기를 붙여 1-R1-3-보호기-글리세롤을 제조하는 과정; (b) 1-R1-3-보호기-글리세롤의 2번 위치에 R2기를 도입하여 1-R1-2-R2-3-보호기-글리세롤을 제조하는 과정 및; (c) 1-R1-2-R2-3-보호기-글리세롤의 탈보호 반응 및 아세틸화 반응을 동시에 수행하는 과정에 의해 목적하는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 합성할 수 있다. 다른 방법으로는 포스파티딜콜린을 가아세트산 분해(acetolysis)하는 방법을 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 간염의 개선, 예방 또는 치료에 뛰어난 활성을 나타낸다.
본 발명의 약학(pharmaceutical) 조성물에 포함되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 100.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 50 중량%, 가장 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 필요에 따라, 본 발명의 약학 조성물은 간염의 치료 효과를 가진 다른 활성 성분을 더욱 포함할 수 있고, 예를 들면, 연질캡슐(soft capsule)로 제조할 경우, 산화방지제(anti-oxidant)로서, 0 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.5 중량%의 알파토코페롤(alpha-tocopherol) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 동결 건조제, 좌제 등의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 활성 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에, 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 있다. 비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 등의 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류, 연령, 성별, 체중, 질병의 종류, 질병의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 약물의 형태, 투여 경로, 투여 기간, 배출 비율, 동시 사용되는 약물, 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명 화합물의 바람직한 투여량은, 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 2,000 mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 400 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 200 mg/kg의 양을 하루 1회 내지 수 회 분할하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 체중 60 kg인 성인 1일 1 mg 내지 1 g의 용량, 바람직하게는 30 mg 내지 120 mg의 용량으로 1회 내지 수 회 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 없으므로 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 간염의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 모든 개체에 적용될 수 있다. 이러한 개체의 예는, 인간뿐만 아니라, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 포유류 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하며, 간염을 예방 및 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017014242-appb-I000004
상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
즉, 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 건강기능식품 조성물에 포함시켜, 대상 개체의 간염을 예방 또는 개선할 수 있다. 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물, 간염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 화합물을 건강기능식품 조성물에 포함시킬 경우, 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에, 본 발명의 화합물은 원료 100 중량부에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 15 중량부, 보다 바람직하게는 0.02 내지 10 중량부, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1 중량부의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 필요에 따라 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적으로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물용 사료를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는, 통상의 감미제, 향미제, 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04 g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03 g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 간염의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 화합물을 간염의 의심 개체에 투여함으로써, 간염을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 상기 간염의 의심 개체는 간염을 가지고 있거나, 발병 가능성이 있는 개체를 의미한다. 본 발명의 치료 방법에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 종류, 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 투여량 및 간염에 대하여는 상술한 바와 같다. 본 발명에서 용어 "투여"는 적절한 방법으로 간염의 의심 개체에 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로일 수 있으며, 예를 들면, 경구 투여, 복강 내 투여, 경피 투여(국소 도포 등), 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 비 내 투여, 직장 내 투여, 강 내 투여, 복강 내 투여 등의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 간염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 조성물에 의해 간염 질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 간염 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
도 1은 본 발명의 PLAG를 이용한 간염을 예방하는 메커니즘의 일예를 보여주는 도면이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 콘카나발린 A(concanavalin A)로 IL-4가 유도되고, 유도된 IL-4는 혈액에서 간으로 호중구를 이동시키면서, STAT6의 인산화를 유도하고, 이로 인하여 호중구가 모집되고, 인산화된 STAT6에 의해 IL-8, 이오탁신(eotaxin) 등의 케모카인이 분비되어 다시 호중구세포의 이동을 촉진시켜 간 조직 손상을 유도한다. 상기 메커니즘에 본 발명의 조성물을 투여하면, IL-4, IL-6, MIP-2(예를 들면, CXCL2 및/또는 IL-8 등) 등의 발현 및/또는 활성을 억제하여 PKC-ζ, PKCδ, PKCθ, STAT6 및 이들의 혼합물 등의 인산화, 흡착 분자의 발현 및/또는 호중구가 혈액에서 간으로 과도하게 이동하는 것을 봉쇄하여 간염을 예방 또는 치료할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤(EC-18 또는 PLAG)의 간염의 예방 및 치료 효능을 확인하기 위하여, concanavalin A(콘카나발린 A, 이하 ConA)로 유도되는 간염 감쇠 모델을 이용하여 실험을 수행하였다. 실험 모델로서, 10주된 Balb/c계 마우스(코아텍 사, 한국)를 특정 병원체 부재 동물(specific pathogen free, SPF)하에서 유지시켜 이용하였고, PLAG 및 PLG(엔지켐 생명과학, 한국)는 체내 또는 체외 처리하기 전에 준비하였다. 또한, Hep3B, HepG2, EL-4 및 HL-60 세포계(미국 균주은행, ATCC)를 5 %의 CO2 및 37 ℃의 온도 하에서 배양하였다. 체내에서 진행하는 그룹간의 비교시 값은 분산분석(analysis of variance, ANOVA)의 한가지 분석 방법을 이용하여 분석하였고, 체외에서 진행되는 두 개의 실험군의 비교는 독립적인 student's t test를 이용하여 값을 분석하였다. 통계적 유의는 p < 0.05로 가정하였다.
[실시예 1] 대조군 및 실험군의 준비
마우스를 무작위로 대조군, ConA 처리군 및 PLAG 전처리군의 세 그룹으로 나누었다. 상기 Con A 및 PLAG는 모두 PBS(phosphate buffer saline)에 용해시켜 사용하였다. 마우스에 PBS 또는 PLAG를 구강 투여하고, 2 시간 후에 20 mg/kg BW의 Con A을 Con A 처리군 및 PLAG 전처리군 각각에 정맥 주사하였다. 그 후, PLAG는 100 mg/kg BW의 양을 마우스에 구강 투여하였다. 여기서, BW는 body weight를 의미한다.
[실험예 1] 혈장 및 조직 사이토카인(cytokine) 분석
혈액 샘플은 실시예 1의 마우스에서 Con A 투여 후 18시간 뒤에 심장 천자(cardiac puncture)로부터 얻었고, 10 분 동안 3,000 rpm에서 원심분리 하였다. 간 조직 파쇄액에 있는 사이토카인 측정을 위하여, 동물들을 죽인 후 PBS를 이용하여 간을 세척하였다. 간을 균질화 시키고, PBS 내에서 70 μm 메쉬 셀 스트레이너(mesh cell strainer, BD Falcon cell strainer, BD Biosciences, Bedford, MA)를 이용하여 여과하였다. 또한, 상청액은 5 분 동안 2,000 rpm의 속도로 원심분리 하여 수집하였다. 하층의 셀 펠렛은 PBS 내에서 재부유시키고 일반 혈액 검사(complete blood cell count, CBC) 분석하였다. 혈장 샘플 및 간 파쇄액의 상청액은 사이토카인이 측정될 때까지 영하 20도를 유지시켰다. IL-6, IL-10, IL-4, MIP-2 및 IFNγ의 농도는 엘리사 세트를 이용하여 검출하였다.
도 2는 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 혈장 내 사이토카인의 변화를 보여주는 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이, PLAG는 ConA가 투여된 마우스 혈장의 IL-4, IL-6, IL-10, MIP-2를 감소시켰다. 구체적으로, ConA를 주사한 쥐 혈장의 IL-4, IL-6, IL-10, MIP-2가 대조군 쥐보다 상당히 높고, ConA의 자극에 의해 증가된 IL-4, IL-6, IL-10 및 MIP-2는 PLAG를 섭취한 쥐에서 상당히 감소하였으며, ConA로 유도된 군에서 증가된 IFNγ의 농도는 PLAG 처리하지 않은 마우스와 비교하여, 의미있게 감소하지 않았다. 따라서, PLAG가 ConA 처리에 의해 유도되는 간염과 관련된 발병을 유도하는 사이토카인의 분비를 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 3은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간 조직 내 사이토카인의 변화를 보여주는 그래프(A) 및 RT-PCR 사진(B)이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 간의 IL-4 및 MIP-2의 높은 단백질 및 mRNA 정도는 ConA 투여된 마우스의 간 조직 내에서 관찰되었다. ConA가 투여된 군의 사이토카인(IL-4, MIP-2 등)의 증가된 발현은 PLAG를 추가로 투여한 군에서 상당히 감소하였다. 이와 같은 결과는 PLAG가 혈장 내에 IL-4 및 MIP-2 정도와 같은 사이토카인을 조절한다는 것을 알 수 있다(도 3의 A 참조). 또한, 케모카인 수용체 CXCR4 mRNA 및 흡착 분자, ICAM-1 및 VCAM의 조절은 ConA로 유도되는 간 조직에서 RT-PCR을 이용하여 평가하였고, 그 결과, PLAG가 CXCR4 mRNA의 발현을 하향조절 시키고, ICAM-1 및 VCAM을 포함하는 흡착분자에는 영향을 끼치지 않는다는 것을 알 수 있다(도 3의 B 참조).
[실험예 2] 전혈 및 간 샘플의 혈액학적 분석
전혈 및 간 샘플은 실시예 1의 마우스에서, Con A 투여 후 18 시간 뒤에 채취하였다. 마우스로부터 채취한 절단된 간은 실험예 1에서 상술한 바와 같이 균질화시켰다. 혈액검사(Complete blood count, CBC) 분석은 전체 백혈구 세포의 정량, 전체 백혈구 세포의 호중구 및 림프구 일부를 포함하고, 혈액학 분석은 민드레이 BC 5300을 이용하여 측정하였다(Shenzhen Mindray Bio-medical Electronics, China).
도 4는 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 혈액(A) 및 간 조직(B) 내 호중구 및 백혈구의 변화를 보여주는 그래프이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 순환성 백혈구의 수는 Con-A로 자극된 마우스에서 조금 하향조절되었고, 순환성 호중구는 PLAG를 추가 투여한 군에서 상당히 증가되었다(도 4의 A). 또한, 간에 존재하는 백혈구들의 수는 Con-A를 투여한 마우스에서 증가되었고, 간에 존재하는 호중구의 수는 PLAG를 추가 투여한 군에서 상당히 감소되었다(도 4의 B). 이와 같은 결과는 혈액에서 간으로부터 백혈구의 이동(분출)이 ConA 투여된 마우스에서 가속되고, 호중구의 이동은 PLAG를 추가로 투여한 군에서 원래대로 돌아오는 것을 나타낸다.
[실험예 3] 조직학 분석
간 부위는 실시예 1의 마우스에서 Con A 투여하고 8시간 뒤에 마우스에서 채취하였다. 상기 간 부위는 10%의 중성 완충포르말린(neutral buffered formarlin)에 고정하고, 파라핀에 박아 5 um의 두께로 잘랐다. 파라핀을 제거하고, 재수화(rehydration)한 후, 박편을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. 또한, 호중구 식별을 위하여, 간 부위를 항-마우스 호중구 항체로 염색하였다. 모든 샘플들을 레이카(Leica, Wetzlar, Germany) 광학 현미경 하에서 조직학 적으로 평가하였고, 디지털 이미지들은 X200 배율로 촬영하였다.
도 5는 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간 조직 내 손상부위에 위치하는 호중구 세포의 잔존여부를 보여주는 사진이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 간에서, ConA의 투여는 많은 수의 백혈구 침윤을 유도하고, 그 후, 자가 조직 파괴에 영향을 미칠 수도 있지만, PLAG를 투여함으로서, 간으로 호중구가 이동하는 것을 완화시킬 가능성을 가지고 있다. 전체 호중구 수는 항-호중구 항체를 이용하여 면역조직학적 염색을 통하여 측정하였고, ConA를 투여한 간 조직은 간세포의 손상이 심한 반면, PLAG를 처리한 간 조직은 간세포의 손상이 거의 없는 것을 알 수 있다. 따라서, ConA의 자극으로 향상된 호중구는 PLAG 처리를 함으로서 효과적으로 완화시킬 수 있다. 도 5에서 스케일 바(scale bar)는 200 um를 의미한다.
도 6은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, 간 손상에 대한 PLAG의 완화 효과를 사진이다. 도 6에 도시된 바와 같이, 간 손상에 대한 PLAG의 완화 효과는 헤마톡실린-에오진 염색을 이용하여 실험하였다. 간 부위의 조직학적 검사는 8시간 이내에 심각한 간세포 손상, 간의 모세혈관망(hepatic sinusoid) 구조 및 간 내 호중구 침윤 등의 ConA를 정맥 투여 결과를 야기하는 것을 볼 수 있다. 그러나, 100 mg/kg의 PLAG 투여시, PLAG 처리는 분포가 드문 호중구 침윤 및 거의 없는 괴사 반점(necrotic foci)을 포함하는 상술한 바와 같은 병적인 변화를 현저하게 완화시켰다. 따라서, PLAG가 ConA로 유도되는 간염을 완화시킨다는 것을 알 수 있다.
[실험예 4] 웨스턴 블롯 분석
Hep3B 세포를 12구 홈판(well plate, 각 구당 2.5x10^5)에 넣고, 여러 농도(0.1, 1, 10, 100 ug/mL)의 PLAG로 처리하고 2시간 뒤에, IL-4로 1시간 동안 활성화 시켰다. 전체 단백질 추출물은 phospho-STAT6, STAT6, phospho-JAK1 및 phosphor-PKCξ/λ Abs(세포 신호, Cell signaling)로 면역 블롯법을 이용하였다.
HL-60 세포는 12구 홈판(각 구당 1x10^6)에 넣고, 상술한 바와 같이 처리하였다. 전체 단백질 추출물은 phospho-PKC의 동형 단백질(δ, θ, ξ/λ, α/β)(세포 신호, Cell Signaling) 및 GAPDH Abs (Santa Cruz Biotechnolgy Inc., CA)로 면역블롯법을 이용하였다. 검출은 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore Corporation, Billerica, MA)를 이용하여 수행하였다.
도 7은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, PLAG 투여량에 따라 간 세포 기원의 HepG3B 세포 및 HL-60 세포의 WST assay 결과를 보여주는 그래프이고, 도 8은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, PLAG의 투여량에 따른 IL-4로 유도되는 STAT6 활성 및 관련신호전달기작의 억제효과를 보여주는 도면이다. 도 7 및 8에 도시된 바와 같이, PLAG을 이용하여 간 손상 완화를 위한 세포 내 메커니즘은 체외 상태에서 확인하였다. HepG2 및 Hep3B는 간세포로서 사용하였고, HL-60은 호중구 세포로서 사용하였다. 간 세포 및 백혈구 내의 EC-18의 세포 독성은 WST assay로 확인하였다. Hep3B 및 HL-60 세포의 생존은 각각 1,000 ug/mL 이상의 농도를 가지는 PLAG와 함께 배양하는 24 시간 동안 영향을 받지 않았다(도 7 참조). WST assay의 결과에 기초하여, 100, 10, 1ug/mL의 PLAG를 세포에 사용하였다. PKC-ξ/λ, JAK1 및 STAT6의 활성은 ConA로 유도되는 간염에서 중요한 역할을 하고, 이러한 키나아제는 IL-4에 의해 증가하였다. 웨스턴 블롯 분석은 PKC 및 STAT6의 인산화는 IL-4 자극에 의해 유도되고, 이러한 키나아제(PKC, STAT6 등)의 인산화는 투여량 의존 방법으로 PLAG를 처리함으로서 상당히 완화되었다(도 8 참조). 따라서, PLAG가 PKC-ξ/λ 활성을 완화시킴으로서, IL-4로 유도되는 간염을 효과적으로 제어할 수 있음을 알 수 있다. 또한 PLAG는 PKC isotype 중 PKCδ와 PKCθ의 활성완화에도 영향을 미치는 것을 확인한 반면 PKCα/β활성완화에는 영향을 미치지 않았다 (도 8B 참조).
또한, 도 9는 본 발명의 PLAG 및 PLG의 구조(A) 및 효과 비교(B 및 C)를 보여주는 도면이다. 도 9에 도시된 바와 같이, PLAG의 선택성은 각각의 STAT6 인산화 및 전사 활성에서 PLAG 및 PLG의 비교에 의해 확인하였다. PLG는 DAG의 원형(prototype)이고, PLAG는 아세틸화된 DAG의 타입이다(도 9의 A 참조). 간 손상(live injury)의 완화에 대한 PLAG 기능의 특이성은 STAT6 활성 분석을 통해 간접적으로 검사하였다. 항-인산(phospho)-SAT6을 사용한 웨스턴 블롯 분석은 STAT6의 인산화는 PLAG 처리된 Hep3B 세포에서 상당히 감소하지만, PLG 처리된 세포 내에서는 변화하지 않는 것을 보여준다. 상술한 바와 같은 결과는 PLAG가 ConA로 유도되는 간염 내에 간 손상으로부터 보호하는 매우 특별한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
[실험예 5] RNA 분리 및 RT-PCR 분석
전체 RNA는 TRIzol 시약(Incitrogen, Carlsbad, CA)으로 간 균질액에서 분리했다. HL-60 세포는 12구 홈판(각 구당 1x10^6)에 넣고, 실험예 4와 같이 처리하였다. cDNA는 M-MLV 역전사 효소와 올리고-dT(Promega, Madison, WI)를 이용하여 전체 세포 RNA로부터 합성되었다. PCR 프라이머((Bioneer, Daejeon)는 프라이머3 프로그램을 이용하여 디자인하였고, 마우스 및 사람의 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
Name Forward primer(5`-3`) Reverse primer(5`-3`)
mIL-4 TGACGGCACAGAGCTATTGA TGTTCTTCGTTGCTGTGAGG
mCXCL2 (MIP-2) AGTGAACTGCGCTGTCAATG CTTTGGTTCTTCCGTTGA GG
mCXCL12 (SDF-1) GAGCCAACGTCAAGCATCTG CGGGTCAATGCACACTTG TC
mCXCR4 (CXCL12 receptor) GGGGACATCAGTCAGG GTGGAAGAAGGCGAGGG
mVCAM CCTCACTTGCAGCACTACGGGCT TTTTCCAATATCCTCAATGACGGG
hIL-8 GCAGGAATTCACCTCAAGA CTTCAGGAACAGCCACCAAT
hVCAM AGTTGAAGGATGCGGGAGTA TCTCCAGTTGAACATATCAAGCA
반응 샘플들의 cDNA 증폭량은 2% 아가로스 겔(Roche Applied Science, Salt Lake city, UT) 전기영동으로 확인하였다.
[실험예 6] 루시퍼라아제 리포터 유전자 분석
HepG2 및 Hep3B 세포를 STAT6의 결합 부위(p4xSTAT6-Luc2P; Addgene, Cambridge, MA)의 네 개의 쌍을 포함하고 있는 리포터 루시퍼라아제 플라스미드(plasmid)에 형질주입하였고, 리포터 벡터를 Attractene 시약과 세포계 안으로 형질 주입하였다. STAT6 리포터 벡터들의 활성을 위해서, 10 ng/ml의 IL-4은 6 시간 동안 세포에 처리하여 이용하였고, 루시퍼라아제 활성은 루미노미터에 의해 루시퍼라아제 분석 시스템을 이용하여 측정하였다. 각 샘플의 루시퍼라아제 활성은 PLAG로 형질 주입된 샘플에 해당하는 것으로 정규화되었다.
도 10은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, STAT6의 전사 활성을 보여주는 그래프이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 호중구 이동을 위한 유전자 발현과 관련된 STAT6 전사 활성은 10 및 100 ug/ml의 PLAG 및 양성 대조군으로서 20 nM 및 200 nM의 STAT6 억제제를 처리함으로서, 효과적으로 방지된다는 것을 알 수 있다. 이러한 데이터는 EC-18이 PKC-ξ/λ의 활성을 완화하고, PKC-ξ, JAK1 및 STAT6 케스캐이드 내의 연속적인 Jak1의 탈인산화에 대한 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 7] 호중구 흡착 분석
피브로넥틴(fibronectin)의 호중구 흡착에 대한 PLAG의 효과 여부를 밝히기 위해, 24구 조직 배양 플레이트는 이전 연구들(Wang YH, Wang WY, Liao JF, Chen CF, Hou YC, Liou KT, Chou YC, et al. Prevention of macrophage adhesion molecule-1 (Mac-1)-dependent neutrophil firm adhesion by taxifolin through impairment of protein kinase-dependent NADPH oxidase activation and antagonism of G protein-mediated calcium influx. Biochem Pharmacol 2004;67:2251-2262.)에서와 같이 피브로넥틴으로 코팅하였다. 상기 플레이트를 25 ug/ml의 피브로넥틴과 37 ℃에서 2 시간 동안 배양시켰다. 결합하지 않은 단백질(unbund protein)을 세척하여 제거하였고, 호중구는 실험하기 2 시간 전에 PLAG를 전처리하였으며, 호중구 활성은 4 시간 동안 IL-4와 함께 수행하였다. 흡착되지 않은 호중구는 흡인(사레, aspiration)으로 용리하였고, PBS로 두번 세척하였다. 부착된 호중구는 혈구계산판(homocytometer)을 이용하여 각 구의 바닥에 있는 세포의 수를 계산하여 측정하였다. 남아있는 흡착 세포들은 18 시간 동안 배양기에 보관하였고, 이 때, 세포에의 분광계 평가를 위해 WST-1 시약(Roche Applied Science)의 시약에 노출시켰다.
도 11은 본 발명의 조성물을 투여한 경우, PLAG에 투여량에 따라 IL-8 및 VCAM-1의 발현 변화와 세포접착능을 감소효과를 보여주는 도면이다. 도 11에 도시된 바와 같이, RT-PCR 데이터는 HL-60 세포가 피브로넥틴에 흡착되도록 IL-4에 의해 자극되어 분비되는 IL-8 및 VCAM-1의 발현을 PLAG 투여를 통해(투여량 의존 방법 등) 효과적으로 효과적으로 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다(도 11의 A). IL-4 및/또는 PLAG에 의해 조절되는 HL-60의 활성은 WST-1 분석 및 세포 수를 이용하여 계산하였다. 10 ng/ml의 IL-4는 코팅된 피브로넥틴에 흡착을 위한 HL-60 세포를 자극하는데 충분하고, 100, 10, 1 ug/mL의 PLAG는 투여량 의존하는 HL-60의 흡착을 상당히 감소시켰다(도 11의 B 및 C 참조).

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017014242-appb-I000005
    상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 팔미토일, 올레오일, 리놀레오일, 리놀레노일, 스테아로일, 미리스토일 및 아라키도노일로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것인, 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2017014242-appb-I000006
  4. 제 1항에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 IL-4, IL-6 및/또는 MIP-2의 발현 및/또는 활성을 억제하는 것인, 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 MIP-2는 CXCL2 및/또는 IL-8인 것인, 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 IL-4는 간 사이토카인의 인산화, 흡착 분자의 발현 및/또는 호중구의 이동을 억제하는 것인, 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 사이토카인은 PKC-ζ, PKCδ, PKCθ, STAT6 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하며, 간염의 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017014242-appb-I000007
    상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 간염 질환의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 간염의 예방 또는 치료 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 투여량은 하루 0.001 내지 2000 mg/kg인 것인, 간염의 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2017/014242 2016-10-13 2017-12-06 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 간염의 예방 또는 치료용 조성물 Ceased WO2018070854A2 (ko)

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