WO2018091704A1 - Verfahren und mikroskop zum ermitteln einer fluoreszenzintensität - Google Patents

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fluorescence
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determining
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Christian Franke
Markus Sauer
Sebastian VAN DE LINDE
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
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Definitions

  • the invention relates to a method for determining a fluorescence intensity, wherein a plurality of two-dimensional individual images of a sample are recorded by means of a microscope, wherein the same sample area is contained in each of the individual images and during the recording of the individual images different emitters are excited to emit fluorescence, so that in at least one of the single pictures at least one
  • diffraction-limited intensity distribution of a fluorescence emission of an emitter is isolated, and determines the single image with the scattered intensity distribution and their
  • fluorescence is intended to encompass any type of luminescence, in particular also phosphorescence.
  • Microscope image is diffraction-limited if it has a diffraction-related extension that corresponds to an extension of a point transfer function of the microscope.
  • An intensity is isolated when it is free of overlaps with intensity distributions of other emitters - as far as the intensity distributions are above the statistical background.
  • Sources of error are, for example, the large variance of the Poisson distribution for fluorescence events, the uncertainty of the size of the
  • Fluorophore transformed into a stimulable state (activated) and then excited in a known manner by light of an excitation wavelength to fluorescence.
  • the remaining non-activated fluorophores can not be excited to fluoresce by the excitation wavelength. Due to the random distribution, the activated and excited fluorophores are usually spatially so far apart that the
  • Fluorescence events resulting diffraction-limited intensity distributions of the point sources do not overlap each other (ie are isolated). This also applies in particular to a projection onto a two-dimensional image, in which the intensity distributions extend due to the diffraction broadening over a plurality of picture elements (pixels) before they exit in the background noise The activation is not repeated until the last activated fluorophores have been bleached or transformed into a non-fluorescent state
  • Fluorescence events in the frames are diffraction-enhanced
  • Intensity distributions by means of a compensation calculation, in which a model function is adapted in the form of a Gaussian distribution to the measured two-dimensional intensity distribution, located with subpixel resolution and entered into a high-resolution result image.
  • a model function is adapted in the form of a Gaussian distribution to the measured two-dimensional intensity distribution, located with subpixel resolution and entered into a high-resolution result image.
  • this individual fluorophore localization which differ in the procedure for singling.
  • Stochastic Optical Reconstruction Microscopy for example, the paired fluorophores are introduced into theirs by means of a second light source
  • the equalization calculation used in all of these localization methods can also be used to determine the absolute intensity of a fluorescence event based on the volume of the fitted model function. In the context of the present invention, however, it has been recognized that this systematically results in a too low absolute intensity for the fluorescence event.
  • a further problem is the third dimension in all super-resolution microscopy methods.
  • one possibility would be to be able to assign a position not only in two but in three dimensions to all identified fluorescence emitters, without having to time-shift the focus of the microscope.
  • axial resolution ie along the optical axis of the detection objective, should likewise be achieved.
  • a first, optically complex approach is based on the formation of a one-to-one depth-dependent
  • a third approach is the simultaneous inclusion of two
  • the invention has for its object to provide a method of the type mentioned and a microscope for its implementation, which allow determination of the absolute intensity of a recorded fluorescence event with low error with the shortest possible measurement duration. In a further development, they should also determine an axial position of an emitter with high spatial resolution and low error and
  • the object is achieved by a method having the features specified in claim 1 or claim 10, and by a microscope having the features specified in claim 17.
  • the invention is particularly, but not exclusively, for use with
  • the essence of the invention is therefore the use of other images of a time series to the background corrector instead of the environment of the scattered intensity distribution in the same frame.
  • a higher accuracy of the background correction is achieved since the not necessarily correct assumption that it is possible to conclude with regard to the background from one sample area to another sample area is omitted. Because the environment of the Intensity distribution in contrast to conventional aperture photometry in the
  • the sample may be provided for this purpose before the recording step, wherein the sample is labeled as an emitter with at least one photoswitchable, photoactivatable or flickering under optical excitation fluorescent dye.
  • the separation as in DE 10 2015 121 920 can take place by taking the individual image with an exposure duration that is shorter than the mean lifetime of a dark state of a flashing fluorescent dye contained in the sample. Since almost all fluorescent dyes flash on small time scales, one can
  • an activation step can be dispensed with.
  • a plurality of other individual images can be determined, each of which is free of fluorescence emissions (apart from a fluorescence emission) at least in a respective image region corresponding to the subarea of the scattered intensity distribution
  • the second intensity value IBG can be obtained by integrating the recorded intensities of the picture elements of the respective picture area of each of the other picture frames and dividing by the number of detected other picture frames. In this way, the accuracy of the background intensity and thus the accuracy of the determination of the fluorescence intensity can be improved. If the isolation is based solely on flashing (without special activation), the should Image acquisition frequency preferably higher, in particular significantly higher than one
  • a particularly high accuracy of the determination of the fluorescence intensity can be achieved if the subregion in which the respective pixels of the isolated
  • a further aspect of the invention relates to the determination of a coordinate
  • Fluorescence intensity Ii based on a first intensity value I ra w, i and a second
  • IBG Intensity value
  • Fluorescence intensity and the second adjusted fluorescence intensity in particular on the basis of a quotient I2 / I1 from the second adjusted fluorescence intensity I 2 and the first adjusted fluorescence intensity Ii or from its reciprocal.
  • the absolute fluorescence intensities Ii and I2 are determined, specifically from the raw intensity and the background intensity in the respective partial region.
  • a localization of the emitter in a third spatial dimension is particularly super-resolution with higher Accuracy as possible in the prior art.
  • axial positions could be determined super-resolution with an accuracy of 16 nm.
  • the determined coordinate can describe an absolute position, but does not have to. It can also be another, z-dependent variable, in particular a photometric parameter.
  • the first subregion is a circular ring in which the adjusted intensity Ir is present
  • the second subregion is the circular surface in the interior of the circular ring in which the adjusted intensity I 2 is present
  • the resulting reciprocals of the above quotients differ only by the amount 1 from each other:
  • Embodiments in which two individual images with different focal positions in the third spatial dimension are recorded simultaneously are particularly advantageous, in particular by dividing a detection beam path into two sections with different optical path length until detection, in particular on different regions of the same detector. With the resulting greater depth of field high-resolution axial localization in a large depth range is possible. In particular, for this type of detection the method and the microscope can be made
  • Compensation calculation based on a model function for the intensity distribution in the second Correction or replacement of the subarea, using the originally determined second corrected fluorescence intensity in the compensation calculation. So also subpixel intensity information can be considered. This may be particularly advantageous if the second subregion comprises only a few whole pixels.
  • the compensation calculation is preferably carried out with a fixed (predetermined) half-width.
  • the coordinate value can be determined on the basis of predetermined calibration values, in particular on the basis of a stored table of quotients of fluorescence intensities for different coordinate values in the third dimension. This allows the determination of an absolute position in the third dimension. In addition, the coordinates determined in this way can be corrected to avoid deviations in the
  • Intensity distribution can be carried out according to the invention, a localization in the third dimension based on a photometric parameter.
  • a localization in the third dimension based on a photometric parameter.
  • Fluorescence events of a sample labeled with at least one fluorescent dye, wherein the intensity distributions have a respective diffraction-related expansion, which corresponds to an extension of a point transfer function of the microscope, and at least one intensity distribution of a single one of the fluorescence events is separated the following steps are provided:
  • the first and second intensity values can be adjusted for statistical background by means of conventional aperture photometry, for example. This can be a
  • the photometric characteristic to be assigned a position in a third spatial dimension, in particular with storage of the microscope image together with the assigned position.
  • the position may be the determined value of the parameter itself.
  • the value of the parameter can be converted into an absolute position based on stored (separately determined) calibration values.
  • the sample is irradiated by means of at least one light source and diffraction-limited by means of a light receiver
  • the sample may be labeled with at least one sort of transformable fluorophore as an emitter, and before taking each of the frames, first transform a subset of the transformable fluorophores into a stimulable state such that the transformed stimulable fluorophores have at least a lower density than one Indicates the reciprocal of a diffraction-dependent insoluble volume, wherein by means of a light source, the sample at least partially with
  • Excited light is irradiated and emitted to record the individual images of the sample emitted fluorescence radiation by means of a microscope objective diffraction broadened to at least one light receiver.
  • the transformation can be done chemically or optically.
  • the optical switching method is used, for example, in PAL microscopy and STOR microscopy.
  • the activated fluorophores can be deactivated (ie transformed into a non-excitable state), for example by bleaching.
  • a (stochastic) subset of the transformable fluorophores may then again be activated and excited at a sufficiently low density.
  • a laser scanning microscope is used to transform to the stimulable state. As a result, it is possible to activate locally, for example ROI-selectively, ie to transform it into the excitable state.
  • the fluorescence events may originate from spectrally different emitting fluorescent dye types.
  • the image elements of the individual images can be separated or separated spectrally before the determination of an intensity. In this way, several types of fluorophore can be localized in one measurement.
  • Focus of a scattered intensity distribution of a fluorescence event can be determined by means of a compensation calculation with sub-diffraction-limited accuracy. In this way, super-resolution can be achieved in all three spatial dimensions.
  • the invention also includes control units and computer programs, in particular stored on a data carrier, which are suitable for carrying out a method according to the invention
  • the invention encompasses a microscope with an illumination beam path with a light source for exciting at least one type of fluorescent dye in a sample, in particular also for photoactivation or photo switching of a light source
  • Fluorescent dye Fluorescent dye, a detection beam path with a microscope objective and a subordinate light receiver and with a control unit, the
  • Fig. 1 shows schematically a microscope for receiving microscope images, for the highly accurate determination of an absolute fluorescence intensity and super-resolution localization in three spatial dimensions.
  • FIG. 2 is a flow chart of a method for highly accurate determination of an absolute fluorescence intensity.
  • FIG. 5 shows a flowchart of a method for determining an axial coordinate value P in two alternative embodiments
  • FIG. 7 shows the effects of different sizes of the first subarea by integrating the intensity distribution of a fluorescence event
  • Fig. 1 is a microscope 1, the control unit 34 for carrying out the
  • the microscope 1 is arranged according to the invention, shown schematically.
  • the microscope 1 is also equipped in each case for wide field illumination and recording of two-dimensional images as a laser scanning microscope (LSM).
  • LSM laser scanning microscope
  • Illumination module L with lasers 23 a scanning module S, a detection module D and the microscope unit M with the microscope objective 31
  • the light of the laser 23 can be influenced by light flaps 24 and attenuator 25 of the control unit 34, before it via optical fibers and
  • Coupling optics 20 is fed into the scanning unit S and united. On the
  • the main beam splitter 30 may be formed, for example, as a dichroic color splitter.
  • the detection module D has a plurality of detection channels, each with a pinhole 31, a filter 28 and a photomultiplier 32, which are separated by color divider 29.
  • pinhole apertures 31 slit apertures (not shown) can also be used, for example in the case of line-shaped illumination.
  • the confocal pinholes 31 are used to discriminate sample light not from the
  • Focus volume originates.
  • the photomultiplier 32 therefore detect only light from the focus volume.
  • the confocally illuminated and recorded focus volume of the sample 22 can be moved by means of the scanning unit 30 over the sample 22 in order to record a pixel by pixel by the galvanometer mirror of the scanning unit 30 are selectively rotated. Both the movement of the galvanometer mirror and the switching of the
  • Lighting by means of the light flaps 24 or the attenuator 25 are controlled directly by the control unit 34.
  • the data acquisition from the photomultipliers 32 also takes place via the peripheral interface 4.
  • the imaging beam path in front of the camera 12 is divided by means of a beam splitter 13 into two sections A, B with different optical path length, both of which terminate side by side on different areas of the camera 12. Due to the different optical Path lengths thus take up these two areas images from different levels of the sample 22.
  • These two (parallel) focal planes differ by their positions in the axial direction. This direction is referred to below as dimension z and z direction.
  • the image acquisition by means of the light source 11 and camera 12 is independent of the setting of the scanning unit 30.
  • the light source 11 can consist of two switchable by the control unit 34 partial light sources, a first partial light source for activation (transformation to a stimulable state) of fluorophores with an activation wavelength and second Partial light source for excitation of these fluorophores to fluorescence. But it is also possible that the light source 11 emits only a single wavelength, if the used
  • control unit 34 can be constructed in a simplified manner, for example without interfaces for such components.
  • the evaluation unit / control unit 34 may be a commercially available electronic computer ("computer") with an interface for the light source 11 and camera 12.
  • FIG. 2 shows a flowchart of an exemplary method according to the invention for determining a fluorescence intensity carried out by the control unit 34, wherein the steps for activation, excitation, identification and 2D localization of emitters are not illustrated. For the sake of clarity, only single images are taken at first, which were recorded with only one (constant) focal plane.
  • Fluorescence events is first a small number of fluorophores by means of the light source 11 or, depending on location, by means of one of the laser 23 by a weak
  • Flash of light with an activation wavelength transformed into its excitable state The selection of the subset of the actually activated fluorophores from the total amount of all lying in the respective illumination field fluorophores happens purely stochastically.
  • the density of the activated fluorophores is "sufficiently low” if it is smaller than a reciprocal of a volume which can not be resolved by the objective 21 due to diffraction the activated fluorophores have distances that are predominantly greater than an extension of the PSF of the microscope objective 21.
  • Light source 11 or, depending on location, done with one of the laser 23.
  • the fluorescence radiation then emitted by the excited fluorophores is recorded by means of the camera 12 in a two-dimensional single image ("microscope image"), which is preferably stored before the quantitative evaluation
  • microscope image a two-dimensional single image
  • the intensity distributions of the fluorescence events are represented by the microscope image of the microscope objective 21 corresponding to the extent of the point transfer function of the microscope objective 21 in the
  • Microscope image predominantly overlap-free.
  • the activated fluorophores are then deactivated by re-photo-switching or bleaching, and a new acquisition-activation cycle begins
  • Intensity distributions of fluorescence emissions are isolated, and recording in another frame. By repeating the recording cycle, more frames are taken.
  • the individual fluorescence events are identified in the microscope image.
  • the microscope image for example, first processed in a known manner by means of a Gaussian filter and then by means of a Laplace filter.
  • These filters can be realized, for example, as block operators (operator matrices), which are passed pixel-by-pixel over the microscope image.
  • a block operator also takes into account the intensities of the surrounding pixels to determine an intensity of a filtered pixel, for example a block of 5x5 pixels for the Gaussian filter and an overall block of 3x3 pixels for the Laplacian filter.
  • the Gaussian filter removes shot noise
  • the Laplace filter removes large contiguous areas.
  • a fluorescence event in a region is determined necessarily also the place within the region. This is achieved, for example, by sector-wise searching for a pixel or a pixel group with an intensity value which is greater than a predetermined identification threshold value. For example, the existence of a fluorescence event in a pixel is recognized when the recorded intensity value of the pixel in question is greater than one equivalent of 50 photons.
  • FIG. 3 to illustrate the method illustrated in FIG. 2, four sections of four individual images of a time series are shown. Each section shows the same sample area at different times.
  • a central circular area Ai with the radius ri (for clarity but not shown) is marked as a first partial area of the single image by a solid line.
  • This circular area is surrounded by a circular ring AEZ, the outer circle (radius ⁇ for clarity, not shown) is drawn interrupted.
  • the first frame in Fig. 3A is a
  • Intensity distribution # 1 of a fluorescence emission of an emitter within the first subrange identified by the above localization method is a fluorescence emission of an emitter within the first subrange identified by the above localization method.
  • the first sub-area results as a circular area around this center, its radius ri being 1.86 times the half-width (FWHM) of the intensity distribution # 1.
  • Intensity distribution are determined. To correct the raw intensity value I raw, the statistical background of the fluorescence emission must now be determined. Serve with other frames.
  • the radius ⁇ is twice the radius n.
  • the circle defined by it represents an exclusion zone, which must be free from fluorescence emissions in the other individual images, so that they can be used to determine the statistical background. Since in the second frame in Fig. 3B, a fluorescence event # 2 intersects the exclusion zone and, in addition, another fluorescence event # 3 is in the central first portion, this frame can not be used to determine and correct the background.
  • fluorescence event # 4 in the third frame in Figure 3C is outside the exclusion zone.
  • the central first section is also free (hatched).
  • the third frame can therefore contribute to the determination of the background.
  • the intensities of the picture elements within the area Ai are therefore integrated into a first partial value ⁇ , ⁇ . Since both the exclusion zone AEZ and the central first subregion Ai are free apart from the statistical background in the fourth single image in FIG. 3D, the intensities of the image elements within the surface Ai are also integrated here, resulting in a second subvalue IAI. From the partial values ⁇ , ⁇ and IAI, 2 the mean value is calculated as
  • the adjusted fluorescence intensity value Ii is calculated from the raw intensity value l mw and the background intensity value IBG.
  • Fig. 4 is a schematic representation of the distribution of an example already identified and located in two dimensions intensity distribution in two
  • Subareas as well as the different extents of fictitious intensity distributions of fluorescence emissions from different z-planes are shown.
  • the partial areas are formed by concentric circular areas with the radii n and r 2 and the area contents Ai and A 2 .
  • FIG. 5 shows the sequence for determining a photometric parameter P as the axial coordinate of the relevant emitter.
  • the intensities of the picture elements in the areas Ai and A 2 are integrated into respective roughness intensity values I ra w, i and I RAW , 2.
  • Subarea Ai is free from fluorescence emissions, the statistical background of the first sub-area determined in the form of an underground intensity value IBG. This is used to clean up the raw intensity values I ra w, i and I RAW , 2. For this purpose, the
  • the photometric parameter P is determined and stored as an axial coordinate of the relevant emitter by quotient formation.
  • photometric parameter P can be determined from a quotient, in which a second determined by means of a compensation calculation Fluorescence intensity lFit, 2 is received as a counter.
  • this compensation calculation it is possible to adapt a Gaussian model function to the measured intensity distributions of the second subarea A 2 .
  • the second fluorescence intensity I 2 determined by integration can be included in the outlet calculation as output parameter.
  • FIG. 6 shows results for axial coordinate values P for emitters in different axial positions from three different calculation methods.
  • the data points marked by a rhombus were formed according to FIG. 5 by integration of the measured intensities in two concentric subregions and subtraction of the one determined from other individual images
  • FIG. 7 shows the accuracy of the method according to the invention for determining an absolute fluorescence intensity on the one hand as a function of the size of the first portion and on the other hand as a function of the number of other individual frames used for background determination. It can be seen that the best result is achieved with a radius ri of 1.86 half-widths (marked by an arrow). From a number of seven frames used for background detection of the statistical error does not decrease significantly.
  • FIG. 8 shows experimentally determined calibration values for the different evaluation methods described in FIG.
  • FIG. 8A shows the z-dependence (median) of the parameter P as a function of the axial position of a single emitter, which was determined by means of a piezo-z scanner.
  • Beam path section B were determined. From a photometric parameter P, an absolute position z can be derived by interpolation between the calibration points.
  • Fig. 8D shows the already interpolated calibration curves obtained by fitting polynomials.
  • Fig. 8E shows the raw calibration curves, above for the photometric
  • Parameter P on the basis of experimentally determined by adjusted intensity ratios photometric parameters and below for the associated half-widths.

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Abstract

2.1. Absolute Fluoreszenzintensitäten werden in der superauflö senden Mikroskopie bisher anhand von Ausgleichsrechnungen, dann aber systematisch zu niedrig, oder mittels Aperturphotometrie ermittelt, dann aber mit relativ großem Fehler und niedriger Geschwindigkeit. Daneben ist in der superauflö senden Mikroskopie die axiale Lokalisierungsgenauigkeit bisher relativ niedrig. 2.2.Zur Lösung des ersten Problems wird ein über einen Teilbereich einer vereinzelten Intensitätsverteilung integrierter Fluoreszenzintensitätswert aus einem ersten Einzelbild mittels eines über denselben Bildbereich integrierten Untergrundmtentisitätswerts aus einem anderen Einzelbild, in dem dieser Bildbereich frei von Fluoreszenz ist, korrigiert. Zur Lösung des zweiten Problems kann die axiale Position anhand von zwei derart korrigierten Fluoreszenzintensitätswerten aus jeweils unterschiedlichen Teilbereichen der Intensitätsverteilung ermittelt werden. 2.3. Superauflösende Mikroskopie

Description

Verfahren und Mikroskop zum Ermitteln einer Fluoreszenzintensität
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln einer Fluoreszenzintensität, wobei mehrere zweidimensionale Einzelbilder einer Probe mittels eines Mikroskops aufgenommen werden, wobei in jedem der Einzelbilder derselbe Probenbereich enthalten ist und während der Aufnahme der Einzelbilder unterschiedliche Emitter zur Emission von Fluoreszenz angeregt werden, so dass in mindestens einem der Einzelbilder mindestens eine
beugungsbegrenzte Intensitätsverteilung einer Fluoreszenzemission eines Emitters vereinzelt ist, und das Einzelbild mit der vereinzelten Intensitätsverteilung ermittelt und deren
Gesamtintensität ermittelt wird.
Der Begriff der Fluoreszenz soll im Sinne der Erfindung jede Art von Lumineszenz, insbesondere auch Phosphoreszenz, umfassen. Eine Intensitätsverteilung in einem
Mikroskopbild ist beugungsbegrenzt, wenn sie eine beugungsbedingte Ausdehnung aufweist, die einer Ausdehnung einer Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht. Eine Intensität ist vereinzelt, wenn sie frei von Überlappungen mit Intensitätsverteilungen anderer Emitter - soweit die Intensitätsverteilungen oberhalb des statistischen Untergrundes liegen.
Forschungsgebiete wie die Systembiologie, die mit quantitativen Modellen biologische Systeme beschreiben will, sind auf quantitative Daten angewiesen. Solche Daten können mittels der Fluoreszenzmikroskopie bisher nur mit geringer Genauigkeit ermittelt werden, beispielsweise mittels eines„Flying-Spot" -Mikroskops (Pawley:„Biological Confocal Microscopy", Springer Verlag, 3. Auflage 2006, S. 6) oder durch Kalziumbildgebung (engl. „Calcium Imaging") (Pawley, S. 529), weil eine große Anzahl von Fehler- und Rauschquellen zu Intensitätsfluktuationen führt. Eine gesuchte Größe ist beispielsweise die absolute
Intensität eines Fluoreszenzereignisses. Fehlerquellen sind beispielsweise die große Varianz der Poissonverteilung für Fluoreszenzereignisse, die Unsicherheit der Größe des
mikroskopischen Detektionsvolumens, Detektorrauschen, photophysikalische Eigenschaften wie Quanteneffizienz, Anregungs- und Effizienzspektren und Bleichverhalten der
verwendeten Fluorophore. Weitere Unsicherheiten sind Unterschiede zwischen verschiedenen Fluorophorsorten, Beleuchtungsinhomogenitäten und Hintergrund- und Autofluoreszenz der Probe. Diese Fehler sind umso größer (oder fallen mehr ins Gewicht), je kleiner die untersuchten Volumina und damit die Anzahl der untersuchten der Moleküle sind und je größer das räumliche Auflösungsvermögen des Mikroskops ist. Ein hohes Auflösungsvermögen des verwendeten Mikroskops ist jedoch für eine hohe räumliche Genauigkeit erforderlich. Das Auflösungsvermögen hängt von der sogenannten Punktübertragungsfunktion (engl.„Point Spread Function"; PSF) des Mikroskopobjektivs ab, die aufgrund der Beugung des von der Probe aufgenommen Lichts im Mikroskopobjektiv stets eine von Null verschiedene Ausdehnung (räumlich: ein von Null verschiedenes
Volumen) aufweist, so dass eine punktförmige Lichtquelle wie ein fluoreszierendes Molekül optisch auf eine endliche Fläche abgebildet wird. Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops ist daher grundsätzlich begrenzt (Abbe 1873). Im Stand der Technik sind jedoch mehrere Ansätze bekannt, um Bilder zu erzeugen, die höher aufgelöst sind, als diese grundsätzliche Grenze es zulässt (nachfolgend als„Superauflösung" bezeichnet).
Aus WO 2006/127692 A2 ist zur Erhöhung des Auflösungsvermögens die Verwendung photoschaltbarer Fluoreszenzfarb Stoffe bekannt (engl.„Photo-activated Localization
Microscopy"; PALM). Durch Licht sehr geringer Intensität bei einer Aktivierungswellenlänge wird eine äußerst geringe Anzahl zufällig verteilter Fluoreszenzfarbstoffmoleküle
(Fluorophore) in einen anregbaren Zustand transformiert (aktiviert) und anschließend auf bekannte Weise durch Licht einer Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Die übrigen, nichtaktivierten Fluorophore lassen sich durch die Anregungswellenlänge nicht zur Fluoreszenz anregen. Aufgrund der zufälligen Verteilung liegen die aktivierten und angeregten Fluorophore in der Regel räumlich so weit auseinander, dass die aus den
Fluoreszenzereignissen entstehenden, beugungsbegrenzt abgebildeten Intensitätsverteilungen der Punktquellen einander nicht überlappen (also vereinzelt sind). Das gilt insbesondere auch für eine Projektion auf ein zweidimensionales Bild, in dem sich die Intensitätsverteilungen aufgrund der Beugungsverbreiterung über mehrere Bildelemente (engl,„picture elements"; Pixel) erstrecken, bevor sie im Untergrundrauschen aufgehend auslaufen. Im PALM- Verfahren wird eine Vielzahl von Einzelbildern mit einer jeweils geringen Anzahl von in der Regel nichtüberlappenden Fluoreszenzereignissen aufgenommen. Die Aktivierung wird dabei erst wiederholt, wenn die zuletzt aktivierten Fluorophore ausgebleicht oder in einen nicht fluoreszierenden Zustand transformiert worden sind. Die Ursprünge der einzelnen
Fluoreszenzereignisse werden in den Einzelbildern anhand der beugungsverbreiterten
Intensitätsverteilungen mittels einer Ausgleichsrechnung, in der eine Modellfunktion in Form einer Gaußverteilung an die gemessene zweidimensionale Intensitätsverteilung angepasst wird, mit Subpixelauflösung lokalisiert und in ein hochauflösendes Ergebnisbild eingetragen. Es sind weitere Varianten dieser individuellen Fluorophorenlokalisierung bekannt, die sich in der Vorgehensweise zur Vereinzelung unterscheiden. In der sogenannten STOR-Mikroskopie (engl.„Stochastic Optical Reconstruction Microscopy"; STORM) werden die paarweise genutzten Fluorophore beispielsweise mittels einer zweiten Lichtquelle in ihren
Ausgangszustand zurückgeschaltet (deaktiviert), sobald genügend Photonen in ein Einzelbild aufgenommen wurden. Daneben gibt es noch die Verfahren PALMIRA („PALM with independently running acquisition"), FPALM („Fluorescence PALM"), dSTORM („direct STORM") und GSDFM („Ground State Depletion and Individual Molecule return").
Die in all diesen Verfahren zur Lokalisierung genutzte Ausgleichsrechnung kann auch zur Ermittlung der absoluten Intensität eines Fluoreszenzereignisses anhand des Volumens der angepassten Modellfunktion genutzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde jedoch erkannt, dass sich hierbei systematisch eine zu niedrige absolute Intensität für das Fluoreszenzereignisses ergibt.
In der Mikroskopie ist es daneben auch bekannt, absolute Intensitäten mittels der aus der Astronomie stammenden Aperturphotometrie (engl,„aperture photometry"; AP) zu ermitteln. Sie ist beispielsweise in„Defining the Limits of Single-Molecule FRET Resolution in TIRF Microscopy" von S. J. Holden et al. in Biophysical Journal, Ausgabe 99 vom November 2010, Seite 3102, beschrieben. Die AP weist jedoch relativ große Fehler auf. Zudem erfordert ihre Anwendung eine starke Vereinzelung der angeregten Emitter mit sehr großen Abständen zueinander, um in der Umgebung einer Fluoreszenzintensitätsverteilung ausreichend statistischen Untergrund aufnehmen zu können. Das verlangsamt das Aufnahmeverfahren, da in der gesamten Probe weniger Emitter gleichzeitig angeregt werden dürfen und zum
Ausgleich mehr Einzelbilder aufgenommen werden müssen.
Ein weiteres Problem stellt bei allen superauflösenden Mikroskopierverfahren die dritte Dimension dar. Ideal wäre eine Möglichkeit, allen identifizierten Fluoreszemittern eine Position nicht nur in zwei, sondern in drei Dimensionen zuordnen zu können, ohne den Fokus des Mikroskops zeitaufwendig verstellen zu müssen. Dabei sollte axial, also längs der optischen Achse des Detektionsobjektivs, ebenfalls Superauflösung erreicht werden können. Zu diesem Zweck gibt es im Stand der Technik mehrere Ansätze. Ein erster, optisch aufwendiger Ansatz beruht auf der Formung einer eineindeutig tiefenabhängigen
Punktübertragungsfunktion des Mikroskops („PSF engineering").in Form einer Doppelhelix wie in US 2010/278400 AI . Einfachere Ansätze wie in US 2014339439 AI gehen davon aus, dass aus der Ausdehnung einer beugungsbegrenzten Intensitätsverteilung, die aus einer Ausgleichsrechnung durch Anpassung einer Modellfunktion in Form einer Gaußverteilung an die gemessene Intensitätsverteilung ermittelt wird, auf die axiale Lage des Emitters geschlossen werden kann. Aufgrund der axialen Symmetrie der PSF ist es damit jedoch nicht möglich, Emittern abseits der Fokalebene eine eindeutige axiale Position zuzuordnen, sondern nur eine eindeutige Entfernung von der Fokalebene.
Ein anderer Ansatz zur 3 D-Lokalisierung sieht die gezielte Aufprägung eines Astigmatismus vor, wobei wie in US 2011/002530 AI anhand der daraus resultierenden Deformation der Intensitätsverteilung auf die axiale Position des Emitters geschlossen wird. Dadurch wird die eindeutige Zuordnung beiderseits der Fokalebene möglich. Die mit dem Astigmatismus einhergehende Defokussierung führt jedoch zu einer Verschlechterung der lateralen
Lokalisierungsgenauigkeit. Ein dritter Ansatz ist die simultane Aufnahme zweier
unterschiedlicher Fokalebenen mit„herkömmlicher" (in axialer Richtung symmetrischer) PSF wie in US 2009/242798 AI . Hier ist gegenüber der einfachen Ermittlung der axialen Position anhand der Ausdehnung der Intensitätsverteilung der axiale Anwendungsbereich
(Schärfentiefe) vergrößert, da im Prinzip jeder Intensitätsverteilung eine eindeutige axiale Position zugeordnet werden kann.
Die Auflösung und die Genauigkeit der axialen Lokalisierung sind jedoch in all diesen Verfahren im Vergleich zur lateralen Auflösung und Genauigkeit relativ niedrig.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art und ein Mikroskop zu dessen Durchführung anzugeben, die eine Ermittlung der absoluten Intensität eines aufgenommenen Fluoreszenzereignisses mit geringem Fehler bei möglichst kurzer Messdauer ermöglichen. In einer Weiterbildung sollen sie zudem die Ermittlung einer axialen Position eines Emitters mit hoher räumlicher Auflösung und geringem Fehler und
ermöglichen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 1 oder Anspruch 10 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 17 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Erfindung ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, für den Einsatz mit
superauflösenden Mikroskopierverfahren ausgelegt. Es sind dabei alle Verfahren möglich, welche die in der Probe vorhandenen Fluoreszenzemitter vereinzelt anregen, insbesondere PALM, FPALM, PALMIRA, STORM und dSTORM.
Erfindungsgemäß ist zur Lösung der Aufgabe vorgesehen, dass zusätzlich zu den eingangs genannten Schritten folgende Schritte durchgeführt werden:
- Ermitteln eines ersten Intensitätswertes Law - als Rohintensitätswert - in einem (ersten) Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung, insbesondere in der gesamten vereinzelten Intensitätsverteilung - soweit sie über dem statistischen Untergrund liegt -, durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten betreffender Bildelemente des Einzelbildes,
- Ermitteln mindestens eines anderen der Einzelbilder, welches zumindest in einem dem (ersten) Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung entsprechenden Bildbereich frei ist von Fluoreszenzemissionen (die über dem statistischen Untergrund liegen), insbesondere frei von einer Emission des Emitters, zu dem die in dem (ersten) Teilbereich des ersten
Einzelbilds enthaltene vereinzelte Intensitätsverteilung gehört,
- Ermitteln eines zweiten Intensitätswertes IBG - als Untergrundintensitätswert - in dem Bildbereich des anderen Einzelbildes durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten betreffender Bildelemente des anderen Einzelbildes und
- Ermitteln einer bereinigten Fluoreszenzintensität I als Differenz Law-fec zwischen dem ersten Intensitätswert aw und dem zweiten Intensitätswert IBG.
Der Kern der Erfindung ist also die Verwendung von anderen Bildern einer Zeitserie zur Untergrundkorrektor anstelle der Umgebung der vereinzelten Intensitätsverteilung in demselben Einzelbild. Im Unterschied zur herkömmlichen Aperturphotometrie wird eine höhere Genauigkeit der Untergrundkorrektur erzielt, da die nicht zwangsläufig zutreffende Annahme, dass hinsichtlich des Untergrunds von einem Probenbereich auf einen anderen Probenbereich geschlossen werden kann, entfällt. Weil die Umgebung der Intensitätsverteilung im Gegensatz zur herkömmlichen Aperturphotometrie bei der
Auswertung keine Rollte spielt, wird im Vergleich zur AP das Erfordernis ausreichender Abstände zwischen vereinzelten Intensitätsverteilungen deutlich abgeschwächt, was die Vereinzelung und damit die Bildaufnahme beschleunigt. Der wichtigste Unterschied zum Stand der Technik, besteht jedoch in der höheren systematischen Genauigkeit der
erfindungsgemäß ermittelten absoluten Fluoreszenzintensitäten gegenüber der
Volumenermittlung von angepassten Modellfunktionen.
Die Vereinzelung erfolgt dabei entweder auf bekannte Weise durch Aktivierung und
Anregung wie in einem der oben beschriebenen superauflösenden Lokalisierungsverfahren, beispielsweise wie in WO 2006/127692 A2 oder in US 2009/242798 AI . Zweckmäßigerweise kann dazu vor dem Aufnahmeschritt die Probe bereitgestellt werden, wobei die Probe mit mindestens einem photoschaltbaren, photoaktivierbaren oder unter optischer Anregung blinkenden Fluoreszenzfarbstoff als Emitter markiert ist.
Alternativ zur gesonderten Aktivierung kann die Vereinzelung wie in DE 10 2015 121 920, deren Inhalt insoweit hier einbezogen wird, durch Aufnahme des Einzelbildes mit einer Belichtungsdauer, die kürzer als die mittlere Lebensdauer eines dunklen Zustandes eines in der Probe enthaltenen blinkfähigen Fluoreszenzfarbstoffs ist, erfolgen. Da auf kleinen Zeitskalen nahezu alle Fluoreszenzfarbstoffe blinken, kann mit einem
höchstlichtempfindlichen Detektor und einer entsprechend kurzen Belichtungsdauer auf besondere aktivierbare oder transformierbare Fluoreszenzfarbstoffe verzichtet werden.
Entsprechend kann auch auf einen Aktivierungsschritt verzichtet werden. Derartige
Detektoren sind jedoch aufwendig.
Vorteilhafterweise können mehrere andere Einzelbilder ermittelt werden, von denen jedes zumindest in einem jeweiligen, dem Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung entsprechenden Bildbereich frei von Fluoreszenzemissionen (abgesehen von einem
statistischen Untergrund) ist, und der zweite Intensitätswert IBG kann durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten der Bildelemente des betreffenden Bildbereichs jedes der anderen Einzelbilder und Dividieren durch die Anzahl der ermittelten anderen Einzelbilder ermittelt werden. Auf diese Weise kann die Genauigkeit der Untergrundintensität und damit die Genauigkeit der Ermittlung der Fluoreszenzintensität verbessert werden. Basiert die Vereinzelung alleine auf Blinken (ohne besondere Aktivierung), sollte die Bildaufnahmefrequenz vorzugsweise höher, insbesondere signifikant höher als eine
Blinkfrequenz eines oder mehrerer in der Probe enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffe sein.
Eine besonders hohe Genauigkeit der Ermittlung der Fluoreszenzintensität kann erreicht werden, wenn der Teilbereich, in dem die betreffenden Bildelemente der vereinzelten
Intensitätsverteilung und der anderen Einzelbilder integriert werden, einer diskret gerasterten Kreisfläche mit einem Radius zwischen dem einer 1.46-fachen und dem 2.26-fachen einer Halbwertsbreite der Punktübertragungsfunktion des Mikroskops, insbesondere mit einem Radius von einer 1,86-fache Halbwertsbreite der Punktübertragungsfunktion, entspricht.
Ein weitergehender Aspekt der Erfindung betrifft die Ermittlung einer Koordinate
(Lokalisierung) für einen Fluoreszenzemitter in einer dritten räumlichen Dimension, insbesondere in axialer Richtung des Mikroskopobjektivs, anhand zweidimensionaler Einzelbilder, wofür die Erfindung zusätzlich zur Ermittlung einer bereinigten ersten
Fluoreszenzintensität Ii anhand eines ersten Intensitätswerts Iraw,i und eines zweiten
Intensitätswerts IBG,I folgende Schritte vorsieht:
- Ermitteln einer zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität I2 für einen zweiten Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung anhand derselben Schritte wie für die erste bereinigte Fluoreszenzintensität Ii (also anhand eines eigenen ersten Intensitätswerts Iraw,2 und eines eigenen zweiten Intensitätswerts IBG,2), wobei der zweite Teilbereich von dem ersten
Teilbereich verschieden, insbesondere kleiner als dieser und insbesondere in diesem enthalten ist, und zur Ermittlung des zweiten Intensitätswertes I2 entweder i) die aufgenommenen Intensitäten der Bildelemente des betreffenden Bildbereichs in dem oder den anderen
Einzelbildern integriert werden oder ii) der zweite Intensitätswert für den ersten Teilbereich auf die Fläche des zweiten Teilbereichs skaliert wird, und
- Ermitteln eines Koordinatenwertes für den Emitter anhand der ersten bereinigten
Fluoreszenzintensität und der zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität, insbesondere anhand eines Quotienten I2/I1 aus der zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität I2 und der ersten bereinigten Fluoreszenzintensität Ii oder anhand dessen Kehrwert.
Es werden also für zwei verschiedene Teilbereiche derselben Intensitätsverteilung die absoluten Fluoreszenzintensitäten Ii und I2 bestimmt, und zwar jeweils aus der Rohintensität und der Untergrundintensität in dem jeweiligen Teilbereich. Damit ist eine Lokalisierung des Emitters in einer dritten Raumdimension insbesondere superauflösend mit höherer Genauigkeit als im Stand der Technik möglich. Experimentell konnten axiale Positionen superauflösend mit einer Genauigkeit von 16 nm bestimmt werden. Die ermittelte Koordinate kann dabei eine absolute Position beschreiben, muss aber nicht. Es kann sich auch um eine andere, z-abhängige Größe handeln, insbesondere um eine photometrischen Kenngröße.
Vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen der erste Teilbereich und der zweite
Teilbereich identische Formen, insbesondere Kreisflächen, aber unterschiedliche Größen aufweisen, insbesondere in konzentrischer Anordnung zueinander. Das erlaubt die
Lokalisierung in der dritten Dimension mit der höchsten Genauigkeit. Es ist dabei möglich, andere Formen wie Quadrate oder Polygone höherer Ordnung (n-Ecke mit n = 5, 6, 7, 8, ...) zu verwenden. Es ist aber auch möglich, nur radiale Segmente solcher Kreisflächen beziehungsweise solcher Polygone als Teilbereiche zu verwenden.
Handelt es sich beispielsweise bei dem ersten Teilbereich um einen Kreisring, in dem die bereinigte Intensität Ir vorliegt, und bei dem zweiten Teilbereich um die Kreisfläche im Inneren des Kreisrings, in welcher die bereinigte Intensität I2 vorliegt, so kann stattdessen auch als erster Teilbereich die Gesamtfläche des Außenkreises des Kreisrings verwendet werden, in welcher die bereinigte Intensität Ii = Ir + I2 vorliegt. Die resultierenden Kehrwerte der obengenannten Quotienten unterscheiden sich lediglich um den Betrag 1 voneinander:
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Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen zwei Einzelbilder mit in der dritten räumlichen Dimension verschiedenen Fokuslagen simultan aufgenommen werden, insbesondere durch Teilung eines Detektionsstrahlengangs auf zwei Abschnitte mit unterschiedlicher optischer Weglänge bis zur Detektion, insbesondere auf verschiedenen Bereichen desselben Detektors. Mit der dadurch erzielbaren größeren Schärfentiefe ist eine hochauflösende axiale Lokalisierung in einem großen Tiefenbereich möglich. Insbesondere können für diese Art der Detektion das Verfahren und das Mikroskop aus
US 2009/242798 AI, deren Inhalt insoweit hier einbezogen wird, verwendet werden.
Experimentell konnte axiale Superauflösung in einem Tiefenbereich von mehr als 800 nm nachgewiesen werden.
Es kann vorteilhaft sein, die zweite bereinigte Fluoreszenzintensität mittels einer
Ausgleichsrechnung anhand einer Modellfunktion für die Intensitätsverteilung im zweiten Teilbereich zu korrigieren oder zu ersetzen, wobei in der Ausgleichsrechnung die ursprünglich ermittelte zweite bereinigte Fluoreszenzintensität verwendet wird. So kann auch Subpixel-Intensitätsinformation berücksichtigt werden. Das kann insbesondere vorteilhaft sein, wenn der zweite Teilbereich nur wenige ganze Pixel umfasst. Vorzugsweise wird die Ausgleichsrechnung mit einer festen (vorgegebenen) Halbwertsbreite durchgeführt.
Zweckmäßigerweise kann der Koordinatenwert anhand von vorgegebenen Kalibrierwerten ermittelt werden, insbesondere anhand einer gespeicherten Tabelle von Quotienten von Fluoreszenzintensitäten für unterschiedliche Koordinatenwerte in der dritten Dimension. Das erlaubt die Ermittlung einer absoluten Position in der dritten Dimension. Zusätzlich können die auf diese Weise ermittelten Koordinaten korrigiert werden, um Abweichungen im
Brechungsindex auszugleichen, wie in„Orientati on imaging of Single molecules by wide-field epifluorescence microscopy" von M. Böhmer & J. Enderlein in J. Opt. Soc. Am. B 20, 554- 559 (2003), oder in„Image analysis of defocused single-molecule images for three dimensional molecule orientation studies" von D. Patra et al. in J. Phys. Chem. A 108, 6836- 6841 (2004).
Auch ohne die hochgenaue Korrektur des statistischen Untergrunds der vereinzelten
Intensitätsverteilung kann erfindungsgemäß eine Lokalisierung in der dritten Dimension anhand einer photometrischen Kenngröße erfolgen. Für ein solches Verfahren zum Auswerten eines zweidimensionalen Mikroskopbildes, das Intensitätsverteilungen von
Fluoreszenzereignissen einer mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Probe enthält, wobei die Intensitätsverteilungen eine jeweilige beugungsbedingte Ausdehnung aufweisen, die einer Ausdehnung einer Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht, und zumindest eine Intensitätsverteilung eines einzelnen der Fluoreszenzereignisse vereinzelt ist, sind folgende Schritte vorgesehen:
- Ermitteln eines integrierten ersten Intensitätswertes in einem ersten Teilbereich der überlappungsfreien Intensitätsverteilung, insbesondere in der gesamten vereinzelten
Intensitätsverteilung,
- Ermitteln eines integrierten zweiten Intensitätswertes in einem zweiten Teilbereich der überlappungsfreien Intensitätsverteilung, wobei der zweite Teilbereich von dem ersten Teilbereich verschieden ist, insbesondere kleiner als der erste Teilbereich und in diesem enthalten ist, und
- Ermitteln einer photometrischen Kenngröße der vereinzelten Intensitätsverteilung anhand des ersten Intensitätswerts und des zweiten Intensitätswerts, insbesondere anhand eines Quotients der beiden Intensitätswerte.
Die ersten und zweiten Intensitätswerte können beispielsweise mittels herkömmlicher Aperturphotometrie um statistischen Untergrund bereinigt werden. Dazu kann ein
Untergrundintensitätswert in einer fiuoreszenzemissionsfreien Umgebung außerhalb der Vereinigungsmenge des ersten und zweiten Teilbereichs, beispielsweise in einem Kreisring um den ersten Teilbereich, ermittelt und, auf die Fläche des jeweiligen Teilbereichs skaliert, jeweils von den integrierten ersten und zweiten Intensitätswerten abgezogen werden, bevor die photometrische Kenngröße ermittelt wird.
Zur Lokalisierung kann der vereinzelten Intensitätsverteilung dann anhand der
photometrischen Kenngröße eine Position in einer dritten räumlichen Dimension zugeordnet werden, insbesondere mit Speicherung des Mikroskopbildes zusammen mit der zugeordneten Position. Die Position kann der Einfachheit halber der ermittelte Wert der Kenngröße selbst sein. Alternativ kann der Wert der Kenngröße anhand von gespeicherten (separat ermittelten) Kalibrierwerten in eine absolute Position umgerechnet werden.
Vorzugsweise wird zur Aufnahme des Mikroskopbildes die Probe mittels mindestens einer Lichtquelle derart bestrahlt und mittels eines Lichtempfängers beugungsbegrenzt
aufgenommen wird, dass mindestens ein Fluoreszenzereignis auftritt, das in dem
aufgenommenen Bild zumindest eine vereinzelte Intensitätsverteilung bewirkt, die eine beugungsbedingte Ausdehnung aufweist, die einer Ausdehnung einer
Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht.
Zweckmäßigerweise kann die Probe mit mindestens einer Sorte von transformierbaren Fluorophoren als Emitter markiert sein und vor der Aufnahme eines jeden der Einzelbilder zunächst eine Untermenge der transformierbaren Fluorophore derart in einen anregbaren Zustand transformiert werden, dass die transformierten anregbaren Fluorophore zumindest lokal eine geringere Dichte aufweisen als ein Kehrwert eines beugungsbedingt unauflösbaren Volumens angibt, wobei mittels einer Lichtquelle die Probe zumindest teilweise mit
Anregungslicht bestrahlt wird und zur Aufnahme der Einzelbilder von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Mikroskopobjektivs beugungsverbreitert auf mindestens einen Lichtempfänger abgebildet wird. Das Transformieren kann chemisch oder optisch erfolgen. Das optische Schaltverfahren wird beispielsweise in der PAL-Mikroskopie und der STOR-Mikroskopie verwendet. Nach der Aufnahme des Mikroskopbildes (oder weiterer Mikroskopbilder, also Einzelbilder) können die aktivierten Fluorophore deaktiviert (also in einen nicht anregbaren Zustand transformiert) werden, beispielsweise durch Bleichen. In einem weiteren Aufnahmezyklus kann dann erneut eine (stochastische) Untermenge der transformierbaren Fluorophore mit einer ausreichend geringen Dichte aktiviert und angeregt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird zum Transformieren in den anregbaren Zustand ein Laser-Scanning-Mikroskop verwendet. Dadurch kann lokal, beispielsweise ROI-selektiv, aktiviert, also in den anregbaren Zustand transformiert werden.
In besonderen Ausführungsformen können die Fluoreszenzereignisse von spektral unterschiedlich emittierenden Fluoreszenzfarbstoffsorten stammen. Insbesondere können die Bildelemente der Einzelbilder vor der Ermittlung einer Intensität spektraler entmischt oder separiert werden. Auf diese Weise können mehrere Fluorophorsorten in einer Messung lokalisiert werden.
Zur lateralen Lokalisierung kann vorteilhafterweise ein zweidimensionaler Ort eines
Schwerpunkts einer vereinzelten Intensitätsverteilung eines Fluoreszenzereignisses mittels einer Ausgleichsrechnung mit sub-beugungsbegrenzter Genauigkeit ermittelt werden. Auf diese Weise kann in allen drei Raumdimensionen Superauflösung erreicht werden.
Die Erfindung umfasst auch Steuereinheiten und Computerprogramme, insbesondere gespeichert auf einem Datenträger, die zur Durchführung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens eingerichtet sind.
Insbesondere umfasst die Erfindung ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Lichtquelle zur Anregung mindestens einer Art von Fluoreszenzfarbstoffen in einer Probe, insbesondere auch zum Photoaktivieren oder Photoschalten eines
Fluoreszenzfarbstoffs, einem Detektionsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv und einem diesem nachgeordneten Lichtempfänger und mit einer Steuereinheit, die zur
Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet und mit der Lichtquelle und dem Lichtempfänger verbunden ist. Die Aufnahme von Einzelbildern kann insbesondere unter Anregung von Fluoreszenz ausschließlich in einer dünnen Schicht erfolgen, beispielsweise an einer totalreflektierenden Grenzfläche (TIRF -Mikroskopie).
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 schematisch ein Mikroskop zur Aufnahme von Mikroskopbildern, zur hochgenauen Ermittlung einer absoluten Fluoreszenzintensität und zur superauflösenden Lokalisierung in drei räumlichen Dimensionen.
Fig. 2 ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur hochgenauen Ermittlung einer absoluten Fluoreszenzintensität,
Fig. 3 beispielhaft derselbe Probenbereich in verschiedenen Einzelbildern in perspektivischer Darstellung,
Fig. 4 schematisch die Aufteilung einer Intensitätsverteilung zur Lokalisierung in axialer Richtung,
Fig. 5 ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Ermittlung eines axialen Koordinatenwertes P in zwei alternativen Ausführungsformen,
Fig. 6 beispielhafte Ergebnisse für axiale Koordinatenwerte P für Emitter in unterschiedlichen axialen Lagen aus drei verschiedenen Berechnungsmethoden,
Fig. 7 die Auswirkungen unterschiedlicher Größen des ersten Teilbereichs, indem die Intensitätsverteilung eines Fluoreszenzereignis integriert wird, und
Fig. 8 Kalibrierwerte zur Zuordnung absoluter axialer Positionen.
In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen. In Fig. 1 ist ein Mikroskop 1, dessen Steuereinheit 34 zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist, schematisch dargestellt. Das Mikroskop 1 ist neben einer Lichtquelle 11 und einer Kamera 12, vor der ein Strahlteiler 13 angeordnet ist, jeweils zur Weitfeldbeleuchtung und -aufnähme zweidimensionaler Bilder auch als Laser- Scanning-Mikroskop (LSM) ausgerüstet. Das LSM ist modular aus einem
Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23, einem Abtastmodul S (engl,„scanning module"), einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31
zusammengesetzt. Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor es über Lichtleitfasern und
Koppeloptiken 20 in die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über den
Hauptstrahlteiler 33 und die X- Y-Abtasteinheit 30 (engl.„Scanner"), die zwei
Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22, wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet. Von der Probe reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Kamera 12 oder über die Abtasteinheit 30 durch den Hauptstrahlteiler 30 in das
Detektionsmodul D. Der Hauptstrahlteiler 30 kann beispielsweise als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist mehrere Detektionskanäle mit jeweils einer Lochblende 31, einem Filter 28 und einem Photovervielfacher 32 auf, die durch Farbteiler 29 separiert sind. Anstelle von Lochblenden 31 können, beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung, auch Schlitzblenden (nicht abgebildet) verwendet werden. Die konfokalen Lochblenden 31 dienen der Diskriminierung von Probenlicht, das nicht aus dem
Fokusvolumen stammt. Die Photovervielfacher 32 detektieren daher ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Das konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der
Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme von den Photovervielfachern 32 erfolgt ebenfalls über die Peripherieschnittstelle 4.
Der Abbildungsstrahlengang vor der Kamera 12 ist mittels eines Strahlteilers 13 in zwei Abschnitte A, B mit unterschiedlicher optischer Weglänge aufgeteilt, die beide nebeneinander auf unterschiedlichen Bereichen der Kamera 12 enden. Durch die unterschiedlichen optischen Weglängen nehmen diese beiden Bereiche also Bilder aus unterschiedlichen Ebenen der Probe 22 auf. Diese beiden (parallelen) Fokalebenen unterscheiden sich durch ihre Lagen in axialer Richtung. Diese Richtung wird nachfolgend als Dimension z und als z-Richtung bezeichnet.
Die Bildaufnahme mittels Lichtquelle 11 und Kamera 12 ist unabhängig von der Einstellung der Abtasteinheit 30. Die Lichtquelle 11 kann aus zwei von der Steuereinheit 34 schaltbaren Teillichtquellen bestehen, eine erste Teillichtquelle zur Aktivierung (Transformation in einen anregbaren Zustand) von Fluorophoren mit einer Aktivierungswellenlänge und zweite Teillichtquelle zur Anregung dieser Fluorophoren zur Fluoreszenz. Es ist aber auch möglich, dass die Lichtquelle 11 nur eine einzige Wellenlänge emittiert, wenn das verwendete
Vereinzelungsverfahren entsprechend ausgestaltet ist.
Die LSM-Komponenten L, S und D sind nicht notwendig, können aber beispielsweise für eine Aktivierung und Anregung in einzelnen Probenbereichen vorteilhaft sein. Entsprechend kann die Steuereinheit 34 vereinfacht aufgebaut sein, beispielsweise ohne Schnittstellen für solche Komponenten. Beispielsweise kann die Auswerteeinheit/Steuereinheit 34 ein handelsüblicher elektronischer Rechner (engl.„Computer") mit einer Schnittstelle für die Lichtquelle 11 und Kamera 12 sein.
Fig. 2 zeigt ein Flussdiagramm eines beispielhaften, von der Steuereinheit 34 ausgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens zu Ermittlung einer Fluoreszenzintensität, wobei die Schritte zur Aktivierung, Anregung, Identifizierung und 2D-Lokalisierung von Emittern nicht dargestellt sind. Dem Verständnis halber werden zunächst nur Einzelbilder betrachtet, die mit nur einer (konstanten) Fokalebene aufgenommen wurden.
Zur Aufnahme eines Einzelbildes mit ausreichend geringer Dichte von
Fluoreszenzereignissen wird zunächst eine nur geringe Zahl von Fluorophoren mittels der Lichtquelle 11 oder, ortsabhängig, mittels eines der Laser 23 durch einen schwachen
Lichtblitz mit einer Aktivierungswellenlänge in ihren anregbaren Zustand transformiert. Die Auswahl der Untermenge der tatsächlich aktivierten Fluorophore aus der Gesamtmenge aller im jeweiligen Beleuchtungsfeld liegenden Fluorophore geschieht dabei rein stochastisch. Die Dichte der aktivierten Fluorophore ist dabei„ausreichend gering", wenn sie kleiner ist als ein Kehrwert eines beugungsbedingt von dem Objektiv 21 unauflösbaren Volumens. In der Folge haben die aktivierten Fluorophore voneinander Abstände, die überwiegend größer als eine Ausdehnung der PSF des Mikroskopobjektivs 21 sind. Mittels einer von der
Aktivierungswellenlänge verschiedenen Anregungswellenlänge werden die derart
transformierten Fluorophore anschließend angeregt. Dies kann wiederum mit der
Lichtquelle 11 oder, ortsabhängig, mit einem der Laser 23 erfolgen.
Die daraufhin von den angeregten Fluorophoren emittierte Fluoreszenzstrahlung wird mittels der Kamera 12 in ein zweidimensionales Einzelbild („Mikroskopbild") aufgenommen, das vorzugsweise vor der quantitativen Auswertung gespeichert wird. Aufgrund der Beugung des einfallenden Lichts im Mikroskopobjektiv 21 wird jedes Fluoreszenzereignis mit einer Intensitätsverteilung in das betreffende Mikroskopbild abgebildet, deren Ausdehnung der Ausdehnung der Punktübertragungsfunktion des Mikroskopobjektivs 21 entspricht, also in der zweidimensionalen Projektion etwa dem Durchmesser einer Airy-Scheibe. Wegen der Abstände der aktivierten Fluorophore (überwiegend größer als eine Ausdehnung der PSF des Mikroskopobjektivs) sind die Intensitätsverteilungen der Fluoreszenzereignisse im
Mikroskopbild überwiegend überlappungsfrei.
Die aktivierten Fluorophore werden anschließend durch erneutes Photoschalten oder durch Bleichen deaktiviert und es beginnt ein neuer Aufnahmezyklus mit Aktivierung und
Anregung von Emittern der Art, dass die in der Kamera 12 aufgenommenen
Intensitätsverteilungen der Fluoreszenzemissionen vereinzelt sind, und Aufnahme in ein weiteres Einzelbild. Durch Wiederholung des Aufnahmezyklus werden weitere Einzelbilder aufgenommen.
Anschließend werden die einzelnen Fluoreszenzereignisse im Mikroskopbild identifiziert. Zu diesem Zweck wird das Mikroskopbild beispielsweise zunächst in bekannter Weise mittels eines Gauß-Filters und anschließend mittels eines Laplace-Filters verarbeitet. Diese Filter können beispielsweise als Blockoperatoren (Operatormatrizen) realisiert werden, die pixelweise über das Mikroskopbild geführt werden. Ein Blockoperator bezieht zur Ermittlung einer Intensität eines gefilterten Pixels auch die Intensitäten der umliegenden Pixel ein, also beispielsweise einen Block von 5x5 Pixeln für den Gauß-Filter und insgesamt einen Block von 3x3 Pixeln für den Laplace-Filter. Der Gauß-Filter entfernt Schrotrauschen, der Laplace- Filter entfernt große zusammenhängende Gebiete. Für die Identifikation wird im allgemeinen Fall nur die Existenz eines Fluoreszenzereignisses in einer Region ermittelt, nicht notwendigerweise auch der Ort innerhalb der Region. Dies gelingt beispielsweise durch sektorweises Suchen nach einem Pixel oder einer Pixelgruppe mit einem Intensitätswert, der größer als ein vorgegebener Identifikationsschwellwert ist. Beispielsweise wird die Existenz eines Fluoreszenzereignisses in einem Pixel erkannt, wenn der aufgenommene Intensitätswert des betreffenden Pixels größer als ein Äquivalent von 50 Photonen ist.
In Fig. 3 sind zur Erläuterung des in Fig. 2 dargestellten Verfahrens vier Ausschnitte aus vier Einzelbildern einer Zeitserie dargestellt. Jeder Ausschnitt zeigt denselben Probenbereich zu verschiedenen Zeitpunkten. In allen Ausschnitten ist eine zentrale Kreisfläche Ai mit dem Radius ri (der Übersichtlichkeit halber aber nicht dargestellt) als erster Teilbereich des Einzelbildes durch eine durchgezogene Linie markiert. Diese Kreisfläche wird von einem Kreisring AEZ umgeben, dessen Außenkreis (Radius ΓΕΖ der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt) unterbrochen gezeichnet ist. Im ersten Einzelbild in Fig. 3A liegt eine
Intensitätsverteilung #1 einer anhand des oben dargestellten Lokalisierungsverfahrens identifizierten Fluoreszenzemission eines Emitters innerhalb des ersten Teilbereichs.
Ausgehend vom superauflösend lokalisierten Mittelpunkt der Intensitätsverteilung ergibt sich der erste Teilbereich als Kreisfläche um diesen Mittelpunkt, wobei ihr Radius ri das 1,86- fache der Halbwertsbreite (FWHM) der Intensitätsverteilung #1 beträgt. Durch Integrieren der Intensitäten der Bildelemente über die Fläche Ai kann der Rohintensitätswert Law der
Intensitätsverteilung ermittelt werden. Zur Bereinigung des Rohintensitätswerts I raw muss nun der statistische Untergrund der Fluoreszenzemission ermittelt werden. Dazu dienen andere Einzelbilder.
Der Radius ΓΕΖ beträgt das Doppelte des Radius n. Der durch ihn definierte Kreisring stellt eine Ausschlusszone dar, die in den anderen Einzelbildern frei von Fluoreszenzemissionen sein muss, damit diese zur Ermittlung des statistischen Untergrunds verwendbar sind. Da in dem zweiten Einzelbild in Fig. 3B ein Fluoreszenzereignis #2 die Ausschlusszone schneidet und außerdem ein weiteres Fluoreszenzereignis #3 im zentralen ersten Teilbereich liegt, kann dieses Einzelbild nicht zur Bestimmung und Korrektur des Untergrunds verwendet werden.
Das Fluoreszenzereignis #4 im dritten Einzelbild in Fig. 3C liegt jedoch außerhalb der Ausschlusszone. Auch der zentrale erste Teilbereich ist frei (schraffiert dargestellt). Das dritte Einzelbild kann daher zur Bestimmung des Untergrunds beitragen. Die Intensitäten der Bildelemente innerhalb der Fläche Ai werden daher zu einem ersten Teilwert ΙΑΙ,Ι integriert. Da auch im vierten Einzelbild in Fig. 3D sowohl die Ausschlusszone AEZ als auch der zentrale erste Teilbereich Ai abgesehen vom statistischen Untergrund frei sind, werden auch hier die Intensitäten der Bildelemente innerhalb der Fläche Ai integriert, was einen zweiten Teilwert IAI, ergibt. Aus den Teilwerten ΙΑΙ,Ι und IAI,2 wird der Mittelwert als
Untergrundintensitätswert IBG gebildet.
Schließlich wird aus dem Rohintensitätswert lmw und dem Untergrundintensitätswert IBG der bereinigte Fluoreszenzintensitätswert Ii berechnet.
In Fig. 4 ist in schematischer Darstellung die Aufteilung einer beispielsweise bereits identifizierten und in zwei Dimensionen lokalisierten Intensitätsverteilung in zwei
Teilbereiche sowie zur Anschauung die unterschiedlichen Ausdehnungen von fiktiven Intensitätsverteilungen von Fluoreszenzemissionen aus unterschiedlichen z-Ebenen dargestellt. In diesem Beispiel werden die Teilbereiche durch konzentrische Kreisflächen mit den Radien n und r2 und den Flächeninhalten Ai und A2 gebildet.
Fig. 5 zeigt den Ablauf zur Ermittlung einer photometrischen Kenngröße P als axiale Koordinate des betreffenden Emitters. In beiden Teilbereichen der Intensitätsverteilung aus Fig. 4 werden die Intensitäten der Bildelemente in den Flächen Ai und A2 zu jeweiligen Rohintensitätswerten Iraw,i und IRAW,2 integriert.
Wie zu Fig. 3 erläutert wird aus mehreren anderen Einzelbildern, in denen der erste
Teilbereich Ai frei von Fluoreszenzemissionen ist, der statistische Untergrund des ersten Teilbereichs in Form eines Untergrundintensitätswertes IBG ermittelt. Dieser wird genutzt, um die Rohintensitätswerte Iraw,i und IRAW,2 zu bereinigen. Zu diesem Zweck wird der
Untergrundintensitätswert IBG, der für den ersten Teilbereich Ai bestimmt wurde, anhand des Verhältnisses der Flächeninhalte A2/Ai auf die Größe des zweiten Teilbereichs A2 skaliert.
Aus den derart bereinigten ersten und zweiten Fluoreszenzintensitäten Ii und I2 der beiden Teilbereiche wird durch Quotientenbildung die photometrische Kenngröße P als axiale Koordinate des betreffenden Emitters ermittelt und gespeichert.
Alternativ oder zusätzlich kann photometrische Kenngröße P aus einem Quotienten bestimmt werden, in den eine mittels einer Ausgleichsrechnung ermittelte zweite Fluoreszenzintensität lFit,2 als Zähler eingeht. In dieser Ausgleichsrechnung kann, dass eine Gauß-Modellfunktion an die gemessene Intensitätsverteilungen zweiten Teilbereich A2 angepasst werden. Als Ausgangsparameter kann dabei die durch Integration ermittelte zweite Fluoreszenzintensität I2 in die Auslassrechnung einfließen.
Fig. 6 zeigt Ergebnisse für axiale Koordinatenwerte P für Emitter in unterschiedlichen axialen Lagen aus drei verschiedenen Berechnungsmethoden. Die durch eine Raute markierten Datenpunkte wurden gemäß Fig. 5 durch Integration der gemessenen Intensitäten in zwei konzentrischen Teilbereichen und Abzug des aus anderen Einzelbildern ermittelten
Untergrunds gewonnen. Die beiden anderen Kurven wurden in zwei herkömmlichen
Ausgleichsrechnungen durch Anpassung einer Gauß-Funktion an die Intensitätsverteilung in dem gesamten ersten Teilbereich Ai ermittelt. In der einen Ausgleichsrechnung (Datenpunkte als Quadrate dargestellt) wurde die Halbwertsbreite der Gauß-Funktion fest vorgegeben. In der anderen Ausgleichsrechnung (Datenpunkte als Kreise dargestellt) war die Halbwertsbreite ein freier Parameter. Erkennbar ist die systematische Abweichung des herkömmlichen Verfahrens.
In Fig. 7 ist die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ermittlung einer absoluten Fluoreszenzintensität einerseits in Abhängigkeit der Größe des ersten Teilbereichs und andererseits in Abhängigkeit der Anzahl der zur Untergrundbestimmung verwendeten anderen Einzelbilder dargestellt. Erkennbar ist, dass das beste Ergebnis bei einem Radius ri von 1,86 Halbwertsbreiten (markiert durch einen Pfeil) erreicht wird. Ab einer Anzahl von sieben zur Untergrundermittlung verwendeten Einzelbildern sinkt der statistische Fehler nicht weiter signifikant.
Um aus der photometrischen Kenngröße P (dem Quotienten der bereinigten
Fluoreszenzintensitäten in den verschiedenen Teilbereichen einer Intensitätsverteilung) eine absolute Raumposition ableiten zu können, ist eine Kalibrierung erforderlich. Fig. 8 zeigt experimentell ermittelte Kalibrierwerte für die in Fig. 6 beschriebenen unterschiedlichen Auswertungsmethoden. In Fig. 8A ist die z- Abhängigkeit (Median) der Kenngröße P als Funktion der axialen Position eines einzelnen Emitters dargestellt, die mittels eines Piezo-z- Scanners ermittelt wurde. Fig. 8B zeigt die zugehörigen relativen Fehler bei einer Größe der Bildelemente der Kamera 12 von 133 nm, einer Größe des ersten Teilbereichs von ri=6,5 Bildelementen (entsprechend dem 1.86-fachen einer Halbwertsbreite) sowie Mittelung des Untergrunds über sieben andere Einzelbilder.
Fig. 8C zeigt Kalibrierungspunkte für simultane Einzelbildaufnahmen in zwei verschiedenen Fokalebenen (nachfolgend als Kanäle bezeichnet). Sie wurden berechnet als f(chl, ch2) = (Pi- P2)/(Pi+P2), wobei die photometrische Kenngröße PI aus den Einzelbildern des ersten Kanals chl (entsprechend dem Strahlengangabschnitt A) und die photometrischen
Kenngröße P2 aus den Einzelbildern des zweiten Kanals ch2 (entsprechend dem
Strahlengangabschnitt B) ermittelt wurden. Aus einer photometrischen Kenngröße P kann durch Interpolation zwischen den Kalibrierungspunkten eine absolute Position z abgeleitet werden.
Fig. 8D zeigt die bereits interpolierten Kalibrierungskurven, die durch Anpassung von Polynomen ermittelt wurden. Die mit BP bezeichnete Kurve wurde gemäß f(chl, ch2) = -(wi- w2)/(wi+w2) berechnet, worin wi und W2 für die Halbwertsbreiten der Intensitätsverteilung in Kanal eins und zwei stehen.
Schließlich zeigt Fig. 8E die rohen Kalibrierungskurven, oben für die photometrische
Kenngröße P anhand von experimentell durch bereinigte Intensitätsverhältnisse ermittelten photometrischen Kenngrößen und unten für die zugehörigen Halbwertsbreiten.
Bezugszeichenliste
1 Mikroskop
2 Mikroskopbild
11 Lichtquelle
12 Kamera
13 Strahlteiler
20 Kollimationsoptik
21 Mikroskopobj ektiv
22 Probe
23 Laser
24 Lichtklappe
25 Abschwächer
26 Faserkoppler
27 Tubuslinse
28 Filter
29 Dichroitischer Strahlteiler
30 Scannerspiegel
31 Lochblende
32 Photovervielfacher
33 Hauptstrahlteiler
34 Steuereinheit
D Detektionsmodul
M Mikroskop
L Beleuchtungsmodul
S Abtastmodul
A, B Strahlengangabschnitte

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Ermitteln einer Fluoreszenzintensität, wobei folgende Schritte
durchgeführt werden:
a) Aufnehmen mehrerer zweidimensionaler Einzelbilder einer Probe mittels eines Mikroskops, wobei in jedem der Einzelbilder derselbe Probenbereich enthalten ist und während der Aufnahme der Einzelbilder unterschiedliche Emitter zur Emission von Fluoreszenz angeregt werden, so dass in mindestens einem der Einzelbilder mindestens eine beugungsbegrenzte Intensitätsverteilung einer Fluoreszenzemission eines Emitters vereinzelt ist,
b) Ermitteln des Einzelbildes mit der vereinzelten Intensitätsverteilung,
gekennzeichnet durch folgende Schritte:
c) Ermitteln eines ersten Intensitätswertes in einem Teilbereich der vereinzelten
Intensitätsverteilung, insbesondere in der gesamten vereinzelten Intensitätsverteilung, durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten betreffender Bildelemente des Einzelbildes,
d) Ermitteln mindestens eines anderen der Einzelbilder, welches zumindest in einem dem Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung entsprechenden Bildbereich frei von Fluoreszenzemissionen ist,
e) Ermitteln eines zweiten Intensitätswertes in dem Bildbereich des anderen Einzelbildes durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten betreffender Bildelemente des anderen Einzelbildes und
f) Ermitteln einer bereinigten Fluoreszenzintensität als Differenz zwischen dem ersten Intensitätswert und dem zweiten Intensitätswert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei
- in Schritt d) mehrere andere Einzelbilder ermittelt werden, von denen jedes zumindest in einem jeweiligen, dem Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung entsprechenden Bildbereich frei von Fluoreszenzemissionen ist, und
- in Schritt e) der zweite Intensitätswert durch Integrieren der aufgenommenen
Intensitäten der Bildelemente des betreffenden Bildbereichs jedes der anderen
Einzelbilder und Dividieren durch die Anzahl der ermittelten anderen Einzelbilder ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei vor Schritt a) die Probe bereitgestellt wird, wobei die Probe mit mindestens einem photoschaltbaren, photoaktivierbaren oder unter optischer Anregung blinkenden Fluoreszenzfarbstoff als Emitter markiert ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Teilbereich, in dem die betreffenden Bildelemente der vereinzelten Intensitätsverteilung und der anderen
Einzelbilder integriert werden, einer diskret gerasterten Kreisfläche mit einem Radius zwischen dem einer 1.46-fachen und dem 2.26-fachen einer Halbwertsbreite der
Punktübertragungsfunktion des Mikroskops, insbesondere mit einem Radius von einer 1,86-fache Halbwertsbreite der Punktübertragungsfunktion, entspricht.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Ermitteln einer Koordinate für einen Fluoreszenzemitter in einer dritten räumlichen Dimension anhand
zweidimensionaler Einzelbilder, wobei zusätzlich folgende Schritte durchgeführt werden: g) Ermitteln einer zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität für einen zweiten Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung anhand der Schritte a) bis f), wobei der zweite Teilbereich von dem ersten Teilbereich verschieden, insbesondere kleiner als dieser und insbesondere in diesem enthalten ist, und zur Ermittlung des zweiten Intensitätswertes entweder i) die aufgenommenen Intensitäten der Bildelemente des betreffenden
Bildbereichs in dem oder den anderen Einzelbildern integriert werden oder ii) der zweite Intensitätswert für den ersten Teilbereich auf die Fläche des zweiten Teilbereichs skaliert wird, und
h) Ermitteln eines Koordinatenwertes für den Emitter anhand der ersten bereinigten Fluoreszenzintensität und der zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität, insbesondere anhand eines Quotienten aus der ersten bereinigten Fluoreszenzintensität und der zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität.
6. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der erste Teilbereich und der
zweite Teilbereich identische Formen, insbesondere Kreisflächen, aber unterschiedliche Größen aufweisen, insbesondere in konzentrischer Anordnung zueinander.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei in Schritt a) zwei Einzelbilder mit in der dritten räumlichen Dimension verschiedenen Fokuslagen simultan aufgenommen werden, insbesondere durch Teilung eines Detektionsstrahlengangs auf zwei Abschnitte mit unterschiedlicher optischer Weglänge bis zur Detektion, insbesondere auf verschiedenen Bereichen desselben Detektors.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei vor Schritt h) die zweite bereinigte Fluoreszenzintensität mittels einer Ausgleichsrechnung anhand einer Modellfunktion für die Intensitätsverteilung im zweiten Teilbereich korrigiert oder ersetzt wird, wobei in der Ausgleichsrechnung die ursprünglich ermittelte zweite bereinigte Fluoreszenzintensität verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Koordinatenwert anhand von vorgegebenen Kalibrierwerten ermittelt wird, insbesondere anhand einer gespeicherten Tabelle von Quotienten von Fluoreszenzintensitäten für unterschiedliche
Koordinatenwerte in der dritten Dimension.
10. Verfahren zum Auswerten eines zweidimensionalen Mikroskopbildes, das
Intensitätsverteilungen von Fluoreszenzereignissen einer mit mindestens einem
Fluoreszenzfarbstoff markierten Probe enthält, wobei die Intensitätsverteilungen eine jeweilige beugungsbedingte Ausdehnung aufweisen, die einer Ausdehnung einer Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht, und zumindest eine
Intensitätsverteilung eines einzelnen der Fluoreszenzereignisse vereinzelt ist, umfassend folgende Schritte:
- Ermitteln eines integrierten ersten Intensitätswertes in einem ersten Teilbereich der überlappungsfreien Intensitätsverteilung, insbesondere in der gesamten vereinzelten Intensitätsverteilung,
- Ermitteln eines integrierten zweiten Intensitätswertes in einem zweiten Teilbereich der überlappungsfreien Intensitätsverteilung, wobei der zweite Teilbereich von dem ersten Teilbereich verschieden ist, insbesondere kleiner als der erste Teilbereich und in diesem enthalten ist, und
- Ermitteln einer photometrischen Kenngröße der vereinzelten Intensitätsverteilung anhand des ersten Intensitätswerts und des zweiten Intensitätswerts, insbesondere anhand eines Quotients der beiden Intensitätswerte.
11. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der vereinzelten
Intensitätsverteilung anhand der photometrischen Kenngröße eine Position in einer dritten räumlichen Dimension zugeordnet wird, insbesondere mit Speicherung des Mikroskopbildes zusammen mit der zugeordneten Position.
12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei zur Aufnahme des Mikroskopbildes die Probe mittels mindestens einer Lichtquelle derart bestrahlt und mittels eines Lichtempfängers beugungsbegrenzt aufgenommen wird, dass mindestens ein Fluoreszenzereignis auftritt, das in dem aufgenommenen Bild zumindest eine vereinzelte Intensitätsverteilung bewirkt, die eine beugungsbedingte Ausdehnung aufweist, die einer Ausdehnung einer
Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe (22) mit
mindestens einer Sorte von transformierbaren Fluorophoren als Emitter markiert ist und vor der Aufnahme eines jeden der Einzelbilder zunächst eine Untermenge der
transformierbaren Fluorophore derart in einen anregbaren Zustand transformiert wird, dass die transformierten anregbaren Fluorophore zumindest lokal eine geringere Dichte aufweisen als ein Kehrwert eines beugungsbedingt unauflösbaren Volumens angibt und mittels einer Lichtquelle die Probe zumindest teilweise mit Anregungslicht bestrahlt wird, und zur Aufnahme der Einzelbilder von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Mikroskopobjektivs beugungsverbreitert auf mindestens einen Lichtempfänger abgebildet wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluoreszenzereignisse von spektral unterschiedlich emittierenden Fluoreszenzfarbstoffsorten stammen, insbesondere mit spektraler Entmischung oder Separation der Bildelemente der
Einzelbilder vor der Ermittlung einer Intensität.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein zweidimensionaler Ort eines Schwerpunkts einer vereinzelten Intensitätsverteilung eines Fluoreszenzereignisses mittels einer Ausgleichsrechnung mit sub-beugungsbegrenzter Genauigkeit ermittelt wird.
16. Steuereinheit (34) oder Computerprogramm, insbesondere gespeichert auf einem
Datenträger, eingerichtet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der
vorhergehenden Ansprüche.
17. Mikroskop (1) mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Lichtquelle (11, 23) zur Anregung mindestens einer Art von Fluoreszenzfarbstoffen in einer Probe (22), insbesondere auch zum Photoaktivieren oder Photoschalten eines Fluoreszenzfarbstoffs, einem Detektionsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv (21) und einem diesem nachgeordneten Lichtempfänger (12, 28) und mit einer Steuereinheit (34) nach dem vorhergehenden Anspruch, die mit der Lichtquelle (11, 23) und dem Lichtempfänger (12, 28) verbunden ist.
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