WO2018182014A1 - 腫瘍溶解性ウイルスの増殖方法及び抗腫瘍剤 - Google Patents

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    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to a novel antitumor therapy using an oncolytic virus.
  • Malignant tumor is the first cause of Japanese death, and statistically one in three people die from malignant tumors. Through years of efforts, advances in surgical treatment for malignant tumors, radiation therapy, and chemotherapy including molecular targeted drugs have been remarkable, and treatment results have improved. However, the mortality rate due to malignant tumor is still high, and a new treatment method effective for malignant tumor is desired.
  • oncolytic virus therapy has attracted attention because it has a direct cytocidal effect.
  • oncolytic adenoviruses and herpes simplex viruses which are DNA viruses, have been conducted on brain tumors and breast cancer, and results suggesting safety and effectiveness have been reported.
  • RNA virus Picornaviridae enterovirus
  • the RNA virus has no integration into the host cell genome after infection and has a low risk of canceration due to genetic mutation.
  • the growth rate in the cell is fast, a rapid and high antitumor effect can be expected.
  • enterovirus coxsackievirus (CV) A21 type, echovirus (EV) type 6, EV7 type, EV11 type, EV12 type, EV13 type, EV29 type Patent Document 1
  • CVA13 type Oncolytic virus therapy using CVA15 type, CVA18 type, CVA21 type, EV1 type, EV7 type, EV8 type, EV22 type Patent Document 2 has been reported.
  • Coxsackievirus A11 type referred to as “CVA11 type”
  • Echovirus type 4 EV4 type
  • the present invention relates to providing an antitumor therapy using an oncolytic virus that exhibits an excellent antitumor effect and has few side effects.
  • the present inventor has promoted the growth of the virus by using a specific anticancer agent in combination with Coxsackie virus and the like, and the antitumor caused by the virus without enhancing side effects It has been found that the effect is remarkably enhanced.
  • the present invention includes the following 1) to 18).
  • An antitumor agent comprising a combination of an oncolytic virus and an anticancer agent selected from oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite.
  • the antitumor agent according to 1) wherein the oncolytic virus is Coxsackie virus or adenovirus.
  • the antitumor agent according to 2) wherein the Coxsackie virus is A11 type or B3 type.
  • An antitumor agent comprising an oncolytic virus and an anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents and antimetabolite agents.
  • the antitumor agent according to any one of 6) to 8), wherein the plant alkaloid anticancer agent comprises one or more selected from SN-38, irinotecan and salts thereof.
  • any one of 1) to 5 which is a kit comprising a drug comprising an oncolytic virus and a drug comprising an anticancer agent selected from oxaliplatin and plant alkaloid anticancer agents.
  • the antitumor agent as described in. 12 An antitumor effect enhancer for an oncolytic virus comprising as an active ingredient an anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents and antimetabolites.
  • a method for promoting the growth of an oncolytic virus by culturing an anticancer agent selected from oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite together with an oncolytic virus.
  • a virus receptor expression enhancer for cancer cells comprising as an active ingredient an anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents and antimetabolites. 16) The virus receptor expression enhancer according to 15), wherein the virus receptor is DAF and / or ICAM-1. 17) Use of an oncolytic virus and an anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents and antimetabolite agents for producing an antitumor agent.
  • an antitumor therapy that exhibits an excellent antitumor effect and is highly safe for humans.
  • A The figure at the time of oxaliplatin and CVA11 combined use.
  • B The figure at the time of cisplatin and CVA11 combined use. The figure which shows that the proliferation of CVB3 type
  • An oncolytic virus is a virus that infects cancer cells to lyse and kill the cancer cells.
  • the oncolytic virus of the present invention is not particularly limited as long as it is a virus that lyses cancer cells and causes cell death.
  • enteroviruses such as CVA11 type, CVB3 type (Coxsackie virus), EV4 type (echovirus), adeno AAV which is a virus, HF10 which is a mutant of a simple perpes virus, and the like are mentioned, and CVA11 type, CVB3 type and AAV are particularly preferable.
  • CVA11 type and CVB3 type are Coxsackie virus, which is a kind of enteric virus (Enterovirus) belonging to the Picornaviridae family.
  • Coxsackie viruses are divided into two groups, A and B. Group A is further divided into type 24 and group B is divided into type 6.
  • the CVA11 type of the present invention is a group A 11 type coxsackie virus
  • the CVB3 type is a group B type 3 coxsackie virus.
  • Oncolytic viruses can infect cells by binding to viral receptors on the cell surface. Examples of the virus receptor include decay accelerating factor (DAF or CD55), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1 or CD54), integrin ⁇ 2 ⁇ 1 (CD49b), and the like. The oncolytic virus interacts with the viral receptor to destabilize the capsid, which induces the oncolytic virus shed.
  • DAF decay accelerating factor
  • IAM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • CD49b integrin ⁇ 2 ⁇ 1
  • the oncolytic virus can be isolated from a specimen or the like by a known virus isolation method such as a centrifugation method or a virus propagation method using cultured cells.
  • the oncolytic virus of the present invention can be selected from organisms by culturing naturally occurring viruses in cell lines over many passages so as to acquire high infectivity to cancer cells. Good.
  • Cell lines suitable for biological selection are preferably those having viral receptors such as DAF, ICAM-1, integrin ⁇ 2 ⁇ 1 , HEK293 cells, H1299 cells, A549 cells, LK-87 cells, PC-9 cells, H460 cell etc. are mentioned.
  • the oncolytic virus of the present invention may be naturally occurring, modified, or partially mutated.
  • a vector virus may be used.
  • CVA11 type variants include those from which the capsid has been removed.
  • the capsid can be removed, for example, by treatment with a protease such as chymotrypsin or trypsin.
  • the capsid can be removed by treating CVA11 type with chymotrypsin in the presence of a surfactant such as an alkyl sulfate.
  • the protein present in the capsid is a major activator of humoral immunity and cellular immunity of the host, the host immune response can be reduced by removing the CVA11 type capsid. As a result, the infectivity to CVA11 type cancer cells, and thus the cytotoxicity of the pharmaceutical composition to cancer cells can be improved.
  • the oncolytic virus includes a nucleic acid derived from an oncolytic virus that infects cancer cells.
  • Nucleic acids derived from oncolytic viruses include viral RNA isolated directly from oncolytic viruses, synthetic RNA, and cDNA corresponding to the base sequence of isolated viral RNA. To isolate viral RNA, any method such as phenol / chloroform extraction or magnetic bead isolation can be used.
  • the nucleic acid may be a virus plasmid or expression vector into which a nucleic acid for generating a virus is incorporated.
  • Expression vectors include, for example, plasmids that can express DNA encoding viral proteins required to generate viruses.
  • the expression vector may include a transcriptional regulatory control sequence to which the inserted nucleic acid is operably linked.
  • the transcriptional regulatory control sequence here is, for example, a promoter for initiating transcription, an expression control element for enabling ribosome binding to the transcribed mRNA, and the like.
  • the nucleic acid derived from the CVA11 type specifically includes a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Specific examples of the nucleic acid derived from CVB3 type include a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Examples of expression vectors include pSV2neo, pEF-PGk. puro, pTk2, non-replicating adenovirus shuttle vector, cytomegalovirus promoter, and the like can be used.
  • a cDNA encoding a viral protein necessary to give rise to a virus can be prepared by reverse transcription of viral RNA or a fragment thereof.
  • the nucleic acid derived from AAV specifically includes a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the expression vector include pSV2neo, pEF-PGk. puro, pTk2, non-replicating adenovirus shuttle vector, cytomegalovirus promoter, and the like can be used.
  • a cDNA encoding a viral protein necessary to give rise to a virus can be prepared by reverse transcription of viral RNA or a fragment thereof.
  • the anticancer agent is selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents, and antimetabolites, and examples of plant alkaloid anticancer agents include vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine. , Etoposide, irinotecan or an active metabolite thereof or a salt thereof, nogitecan, sobuzoxane, docetaxel, paclitaxel, paclitaxel injection, eribulin and the like, and irinotecan, SN-38 and a salt thereof are preferable.
  • Antimetabolites include 5-fluorouracil (5-FU), 5-FU prodrugs (eg, tegafur or a salt thereof), capecitabine or a salt thereof, TS-1 (also referred to as S-1, a modulator for tegafur).
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • 5-FU prodrugs eg, tegafur or a salt thereof
  • capecitabine or a salt thereof
  • TS-1 also referred to as S-1, a modulator for tegafur
  • fluoropyrimidine anticancer agents such as carmofur and doxyfluridine, gemcitabine, cytarabine, enositabine, mercaptopurine, fludarabine, cladribine, methotrexate, pemetrexed, hydroxycarbamide, nelarabine, pentostatin and their pros Drugs and the like can be mentioned, and fluorinated pyrimidine-based anticancer agents that allow 5-fluorouracil to exist in vivo are more preferable, and 5-FU or a salt thereof is particularly preferable.
  • Oxaliplatin is a third generation platinum complex anticancer agent also known as L-OHP.
  • oxaliplatin means cis-oxaloto (trans-l-1,2-diaminocyclohexane) platinum (II), and its optical enantiomer, cis-oxaloto (trans-d-1,2-diaminocyclohexane).
  • Platinum (II) and mixtures thereof are included.
  • Irinotecan is a derivative of camptothecin, which is an antitumor alkaloid derived from Cannaboku, and has a topoisomerase I inhibitory action.
  • SN-38 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin) is an active metabolite of irinotecan and has stronger antitumor activity than irinotecan.
  • Examples of the salt of irinotecan and SN-38 include salts with inorganic acids or organic acids, and hydrochlorides are preferable.
  • 5-FU is a fluorinated pyrimidine-based antimetabolite and is an anticancer agent that exerts an antitumor effect by inhibiting nucleic acid synthesis.
  • oxaliplatin is preferred.
  • Oxaliplatin and SN-38, 5-FU have antitumor effects by themselves, but as shown in the examples described later, oxaliplatin has an action of promoting the growth of oncolytic viruses, particularly coxsackie viruses, In addition, it has an action of promoting the expression of viral receptors (DAF, ICAM-1) of cancer cells.
  • DAF viral receptors
  • plant alkaloid anticancer agents such as oxaliplatin and SN-38 and antimetabolites such as 5-FU, when coxsackie virus and oxaliplatin are used in combination, prevent coxsackie virus against cancer cells resistant to oxaliplatin. It exhibits much stronger cytotoxicity than when applied as a single agent.
  • an anticancer agent selected from oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite is oncolytic.
  • an anticancer agent selected from oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite can be an expression enhancer of a cancer cell virus receptor.
  • the growth promoting effect of oncolytic virus by an anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agent and antimetabolite is from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agent and antimetabolite It is obtained by culturing the selected anticancer agent and oncolytic virus together.
  • a known method such as a virus propagation method using cultured cells can be used.
  • the growth promoting effect can be evaluated by using a known method for calculating the infectious titer (MOI) of a virus.
  • the antitumor effect (cytotoxicity against cancer cells) by the anticancer drug selected from the oncolytic virus and oxaliplatin of the present invention, plant alkaloid anticancer drug and antimetabolite is in the presence of the anticancer drug.
  • Methods for testing cell line survival include, for example, a method of quantifying the number of viable stained cells by staining fixed cells with a staining solution, a method of quantifying a crystal violet method, an apoptosis-specific marker, etc. There is. Using these methods, cancer cells that have been incubated with oncolytic virus in the presence of anti-cancer drugs are quantified after lapse of time, resulting in tumor lysis. The dead cancer cells can be quantified by the cytotoxicity of the sex virus and the anticancer agent.
  • the cancer type targeted by the anti-tumor therapy of the present invention is not particularly limited as long as it is an oncolytic virus, particularly an oncolytic virus that infects cancer cells and exhibits cytotoxicity.
  • Including cancer examples of cancer cells in which particularly strong cytotoxicity is induced in solid cancer include, for example, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung squamous cell carcinoma, malignant mesothelioma, colorectal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, esophageal cancer, Examples include cancer cells such as hypopharyngeal cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, and bladder cancer.
  • cancer cells such as non-Hodgkin lymphoma, lymphocytic leukemia, human B lymphoma and the like in addition to the solid cancer, and cancer cells of colorectal cancer and colorectal cancer are preferably used. Particularly preferred.
  • the antitumor therapy of the present invention can also be used for the treatment of cancers resistant to oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents or antimetabolites, so-called refractory cancers.
  • an oxaliplatin-resistant cancer for example, a cancer in which a decrease in tumor volume, suppression of increase, or improvement of a condition related to the cancer is not observed even when a dose of oxaliplatin that is clinically effective is administered
  • an anticancer agent selected from an oncolytic virus and oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite is contained in an appropriate combination ratio, and Even a combination drug formulated into a dosage form (single-drug form) can be formulated separately with drugs containing effective amounts of oncolytic virus and anticancer drug so that they can be used separately at the same time or at intervals. It may be a combination (two-drug form, referred to as a kit).
  • the combination drug may contain a carrier, a diluent, an adjuvant and a carrier.
  • a carrier for example, liposome, micelle and the like are preferable.
  • Liposomes contain a combination of lipids and steroids or steroid precursors that contribute to membrane stability.
  • examples of the lipid include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipid, phosphatidylethanolamine, cerebroside, and ganglioside.
  • Oncolytic viruses covered with liposomes or micelles can reduce the host immune response.
  • the diluent include demineralized water, distilled water, and physiological saline.
  • the adjuvant include plant oils, cellulose derivatives, polyethylene glycol, and fatty acid esters.
  • the carrier various types commonly used for ordinary drugs, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, diluents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, pH adjusting agents. , Buffers, stabilizers, colorants, flavoring agents, flavoring agents and the like.
  • a compounding agent can be administered in combination with drugs other than a compounding agent.
  • the kit is administered in combination with a drug containing an oncolytic virus and a drug containing an anticancer drug selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer drugs and antimetabolite drugs. can do.
  • the above-mentioned preparation containing an oncolytic virus may contain a carrier, a diluent or an adjuvant in addition to the oncolytic virus.
  • a carrier for example, liposome, micelle and the like are preferable.
  • Liposomes contain a combination of lipids and steroids or steroid precursors that contribute to membrane stability.
  • examples of the lipid include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipid, phosphatidylethanolamine, cerebroside, and ganglioside.
  • Oncolytic viruses covered with liposomes or micelles can reduce the host immune response.
  • the diluent include demineralized water, distilled water, and physiological saline.
  • the adjuvant include plant oils, cellulose derivatives, polyethylene glycol, and fatty acid esters.
  • a preparation containing an anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents and antimetabolites can be prepared by a generally known method using a pharmacologically acceptable carrier.
  • a pharmacologically acceptable carrier include various types commonly used for ordinary drugs, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, diluents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, pH. Examples include regulators, buffers, stabilizers, colorants, flavoring agents, and flavoring agents.
  • the amount of oncolytic virus in the preparation is, for example, 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 10 plaque forming units per 1 mL of solution, and 1 ⁇ 10 5 plaque forming units or more. preferable.
  • the compounding amount of the anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agents and antimetabolites is, for example, preferably 1 to 1000 mg in the preparation.
  • an oncolytic virus and an anticancer agent selected from oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite are used in various ways, that is, oral, muscle, subcutaneous, rectal, vagina. It can be administered to cancer patients via the nasal cavity or the like, but is preferably administered intratumorally, intravenously, or intraperitoneally depending on the type of cancer.
  • many digestive organ cancers such as esophageal cancer and colon cancer can be directly injected into the tumor tissue while visually confirming the tumor tissue with an endoscope or the like. In this case, since the injected site can be confirmed with an endoscope or the like, there is also an advantage that it is easy to cope with bleeding.
  • the oncolytic virus and the anticancer agent selected from oxaliplatin, plant alkaloid anticancer agent and antimetabolite should only be administered in an amount sufficient to treat cancer,
  • the dose is determined based on the patient's weight, age, sex, tumor tissue size, and the like. For example, per adult day, oncolytic viruses can be exemplified by 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 10 plaque forming units, and anticancer agents can be exemplified by 1-1000 mg.
  • the administration method may be single administration or multiple administration, and may be continuously administered as a sustained release preparation.
  • the administration sequence and the administration interval are not particularly limited as long as the effect of the combination of an oncolytic virus and an anticancer agent selected from oxaliplatin, a plant alkaloid anticancer agent and an antimetabolite is obtained.
  • Example 1 Antitumor effect by combined use of oxaliplatin and CVA11 type
  • Method (a) Preparation of CVA11 type was obtained from National Institute of Infectious Diseases. CVA11 type was grown using HELA cells (purchased from ATCC).
  • MOI Dulbecco's modified Eagle medium
  • the collected HELA cells were frozen and thawed three times using liquid nitrogen, and then centrifuged at 4 ° C. and 3000 rpm for 15 minutes to collect the supernatant.
  • the collected supernatant (virus solution) was stored at ⁇ 80 ° C.
  • C Examination of antitumor effect using CVA11 type crystal violet method The antitumor effect (cytotoxicity) by CVA11 type was evaluated by the crystal violet method.
  • Oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line (WiDr) was seeded in a 24-well plate at a density (3 ⁇ 10 4 cells / well) that became confluent after 72 hours.
  • the medium was removed from the plate, 200 ⁇ L of CVA11 dilution was added to each well, and the plate was maintained at 37 ° C., 5% CO 2 for 1 hour.
  • the CVA11 type diluent was removed, 1 mL of each cell culture medium was added to each well, and cultured for 72 hours. After 72 hours, the cells were gently washed with phosphate buffered saline (PBS), 300 ⁇ L of PBS containing 0.5% glutaraldehyde was added to each well, and then allowed to stand at room temperature for 15 minutes to fix viable adherent cells. .
  • PBS phosphate buffered saline
  • the glutaraldehyde-containing PBS is removed, washed with PBS, 300 ⁇ L of sterilized water containing 2% ethanol and 0.1% crystal violet is added to each well, and the cells are allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Was stained. Each well of the stained plate was washed twice with 500 ⁇ L of sterilized water, and staining was recorded using a scanner, thereby confirming the antitumor effect.
  • A Oxaliplatin and CVA11 type not added
  • B Oxaliplatin only added (50 ⁇ M)
  • C Oxaliplatin added (50 ⁇ M)
  • CVA11 type added (MOI 0.01)
  • FIG. 1 shows the results of the crystal violet method.
  • B No antitumor effect was observed with WiDr to which only oxaliplatin was added and D: CVA11 type alone was added.
  • D CVA11 type alone was added.
  • MOI 0.01
  • Example 1 (1) the infectious titer of the virus was measured by the method described in Example 1 (1) (b).
  • A: Oxaliplatin and CVA11 type not added, B: Oxaliplatin not added, only CVA11 type added, C: Oxaliplatin added (50 ⁇ M), then CVA11 type added (MOI 0.01)
  • C Oxaliplatin added (50 ⁇ M)
  • FIG. 2 shows the CVA11 virus titer results. When oxaliplatin was added, a significant increase in the amount of CVA11 virus was observed. It was confirmed that oxaliplatin promotes the growth of CVA11 type.
  • Example 3 Viral Receptor Expression Promoting Action by Oxaliplatin
  • the cultured oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line (WiDr) was suspended in DMEM medium so as to be 3 ⁇ 10 6 cells / mL. 100 ⁇ L of the obtained cell suspension was dispensed into each well of a 96-well plate and seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / well. After leaving the plate at 37 ° C., 5% CO 2 for about 8 hours, oxaliplatin was added to a final concentration of 50 ⁇ M. Thereafter, the plate was allowed to stand for about 42 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 , and then mRNA was collected to prepare cDNA.
  • FIG. 3 shows the results of real-time PCR.
  • the addition of oxaliplatin significantly increased the expression of viral receptors DAF and ICAM-1.
  • the addition of CVA11 virus did not increase the expression of DAF and ICAM-1.
  • Some of the receptors are known to affect the growth of the virus. From this result, the antitumor effect of CVA11 against WiDr was increased by pretreatment with oxaliplatin because DAF and ICAM-1 This was thought to be due to the growth of CVA11 virus.
  • Example 4 In vivo antitumor effect 1 by combined use of oxaliplatin and CVA11 type 1 (1) Method The antitumor effect on CVA11 type cancer cells confirmed in Example 1 was examined using tumor-bearing nude mice with an oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line WiDr. WiDr was washed with PBS and suspended in OPTI-MEM I to 5.0 ⁇ 10 7 cells / mL. Suspensions containing WiDr were injected subcutaneously into the right flank of 6-8 week old BALB / c nude mice using a 27G needle.
  • mice were divided into 4 groups: 1) non-administration group, 2) oxaliplatin single administration group, 3) CVA11 type single administration group, and 4) CVA11 type administration group after oxaliplatin administration.
  • Oxaliplatin 100 ⁇ g was administered intraperitoneally to day1.
  • Type CVA11 was locally injected into subcutaneous tumors on days 2, 4, 6, 8, 10 with 5 ⁇ 10 7 plaque forming units (PFU).
  • PFU plaque forming units
  • OPTI-MEM I not containing CVA11 type was administered to the right flank in the same amount as in the CVA11 type administered group.
  • the tumor volume and body weight of each group were measured. The tumor volume was calculated by major axis ⁇ minor axis ⁇ minor axis ⁇ 0.5.
  • the test was performed using 5 mice in each group, and the t-test was used for the test.
  • FIG. 4 shows the tumor volume of the non-administered group and the tumor volume of the group administered with oxaliplatin alone, the group administered with CVA11 alone, and the group administered with CVA11 after administration of oxaliplatin (combination group).
  • mice administered with CVA11 after administration of oxaliplatin an increase in tumor volume was significantly suppressed as compared to the non-administered group.
  • the combination group had a high antitumor effect because the increase in tumor volume was suppressed as compared with the oxaliplatin single administration group and the CVA11 type single administration group.
  • FIG. 5 shows changes in body weight of these four groups.
  • mice administered with oxaliplatin alone As compared with the non-administration group, no significant weight loss was observed in mice administered with oxaliplatin alone, mice administered with CVA11 type alone, and mice administered with CVA11 type after oxaliplatin administration. Since weight loss at this point suggests an adverse event, it can be said that no weight loss was observed in mice administered CVA type 11 after oxaliplatin administration, and the antitumor therapy of the present invention was It can be said that safety is high.
  • Example 5 In vivo antitumor effect 2 by combined use of oxaliplatin and CVA11 type 2 (1) Method The survival rate of tumor-bearing nude mice subcutaneously transplanted with the oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line WiDr in Example 4 was compared. E. (Hematoxylin eosin) staining was evaluated.
  • FIG. 6 shows data comparing survival rates in cancer-bearing nude mice.
  • the survival rate of mice administered with CVA11 after administration of oxaliplatin was improved as compared with mice in the untreated group, mice in the group administered with oxaliplatin alone, and mice in the group administered with CVA11 alone.
  • 7 shows a pathological tissue (HE staining) of the tumor tissue.
  • Example 6 Antitumor effect by combined use of oxaliplatin and CVB3 type
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • OPTI-MEM I After removing the medium, 1 mL of OPTI-MEM I was added to the petri dish for culture, and the cells were peeled and collected using a cell scraper.
  • CVB3 type and HELA cells were cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the collected HELA cells were frozen and thawed three times using liquid nitrogen, and then centrifuged at 4 ° C. and 3000 rpm for 15 minutes to collect the supernatant.
  • the collected supernatant (virus solution) was stored at ⁇ 80 ° C.
  • FIG. 8 shows the results of the crystal violet method. No anti-tumor effect was observed in the case where only oxaliplatin was added (CVB3 type MOI in FIG. 8 in a horizontal row with 0), and in the case where only CVB3 type was added (OXA in FIG. 8 was in a vertical row). On the other hand, in the group to which CVA11 type was added after the addition of oxaliplatin (group in the frame), a strong antitumor effect was observed depending on the amount of MOI and oxaliplatin added.
  • Example 7 CVB3 Type Growth Promotion Action by Oxaliplatin (1)
  • Method CVB3 type was prepared in the same manner as in Example 6 (1) (a).
  • the MOI was calculated by the same method as in Example 1 (1) (b).
  • the cultured oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line (WiDr) was suspended in DMEM medium to 3 ⁇ 10 6 cells / mL. 100 ⁇ L of the obtained cell suspension was dispensed into each well of a 96-well plate, and seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / well. After leaving the plate at 37 ° C. under 5% CO 2 for about 8 hours, oxaliplatin was added to a final concentration of 0 (no addition), 0.5, and 1.0 ⁇ M.
  • Example 1 (1) the infectious titer of the virus was measured by the method described in Example 1 (1) (b). Comparison was made by dividing into three groups: 1: no oxaliplatin added, 2: oxaliplatin added at 0.5 ⁇ M, 3: oxaliplatin added at 1.0 ⁇ M. The test was performed 6 times, and t-test was used for the test.
  • FIG. 9 shows the results of virus titer of CVB3 type.
  • oxaliplatin When oxaliplatin was added, an increase in the amount of CVB3 virus was observed. In particular, a significant increase was observed when 1 ⁇ M oxaliplatin was added. Thus, it was confirmed that oxaliplatin promotes not only CVA11 type but also CVB3 type proliferation.
  • Example 8 AAV Growth-Promoting Action by Oxaliplatin
  • Method (a) Preparation of AAV As AAV pAAV-CMV Vector (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • pAAV-CMV Vector was prepared using AAVpro® Helper Free System (manufactured by Takara Bio Inc.). The collected supernatant (virus solution) was stored at ⁇ 80 ° C.
  • AAVpro® Titration Kit for Real Time PCR Ver. 2 (manufactured by Takara Bio Inc.) was used to measure the copy number of the virus. The t-test was used for the test.
  • FIG. 10 shows the results of AAV copy numbers.
  • oxaliplatin was added, a significant increase in the AAV copy number was observed.
  • the amount of oxaliplatin added was between 0.25 and 1.0 ⁇ M. This confirmed that oxaliplatin promoted AAV proliferation.
  • Example 9 Growth Promotion Action of CVA11 Type by SN-38
  • Method Preparation of CVA11 type and calculation of MOI were carried out in the same manner as in Example 1 (1) (a) and (b).
  • the cultured oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line (WiDr) was suspended in DMEM medium to 3 ⁇ 10 6 cells / mL. 100 ⁇ L of the obtained cell suspension was dispensed into each well of a 96-well plate, and seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / well. After leaving the plate at 37 ° C., 5% CO 2 for about 8 hours, SN-38 was added to a final concentration of 0 (no addition), 1.0, 5.0, 50 ⁇ M.
  • Example 1 (1) the infectious titer of the virus was measured by the method described in Example 1 (1) (b). Comparison was made in four groups: 1: SN-38 not added, 2: SN-38 added at 1.0 ⁇ M, 3: SN-38 added at 5.0 ⁇ M, 4: SN-38 added at 50 ⁇ M. The test was performed 6 times, and t-test was used for the test.
  • FIG. 11 shows the results of virus titer of CVA11 type when SN-38 was added. When SN-38 was added, a significant increase in the amount of CVA11 virus was observed. It was confirmed that CVA11 type proliferation was promoted not only in oxaliplatin but also in SN-38.
  • Example 10 Growth Promotion Action of CVA11 Type by 5-FU (1) Method Preparation of CVA11 type and calculation of MOI were performed in the same manner as in Example 1 (1) (a) and (b).
  • the cultured oxaliplatin-resistant colorectal cancer cell line (WiDr) was suspended in DMEM medium to 3 ⁇ 10 6 cells / mL. 100 ⁇ L of the obtained cell suspension was dispensed into each well of a 96-well plate, and seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / well. After leaving the plate at 37 ° C., 5% CO 2 for about 8 hours, 5-FU was added to a final concentration of 0 (no addition) and 50 ⁇ M. Thereafter, the plate was allowed to stand for about 12 hours at 37 ° C.
  • Example 1 (1) the infectious titer of the virus was measured by the method described in Example 1 (1) (b). Comparison was made by dividing into two groups of 1: 5-FU not added and 2: 5-FU added at 50 ⁇ M. The test was performed 6 times, and t-test was used for the test.
  • FIG. 12 shows the results of CVA11 type virus titer when 5-FU was added. With the addition of 5-FU, a significant increase in the amount of CVA11 virus was observed. It was confirmed that not only oxaliplatin and SN-38 but also 5-FU promotes the growth of CVA11 type.
  • Example 11 Antitumor effect by combined use of oxaliplatin and CVA11 type when using brain tumor cell line U-87
  • Method (a) Preparation of CVA11 type CVA11 type was prepared in Example 1 (1) (a ).
  • C Examination of antitumor effect using crystal violet method of CVA11 type Antitumor effect (cytotoxicity) by combined use of CVA11 type and oxaliplatin when brain tumor cell line U-87 is used by crystal violet method evaluated.
  • the CVA11 type diluent was removed, 1 mL of each cell culture medium was added to each well, and cultured for 72 hours. After 72 hours, the cells were gently washed with phosphate buffered saline (PBS), 300 ⁇ L of PBS containing 0.5% glutaraldehyde was added to each well, and then allowed to stand at room temperature for 15 minutes to fix viable adherent cells. . Thereafter, the glutaraldehyde-containing PBS is removed, washed with PBS, 300 ⁇ L of sterilized water containing 2% ethanol and 0.1% crystal violet is added to each well, and the cells are allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Was stained. Each well of the stained plate was washed twice with 500 ⁇ L of sterilized water, and staining was recorded using a scanner, thereby confirming the antitumor effect.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 13 shows the results of the crystal violet method.
  • the anti-tumor effect was confirmed only with CVA11 type, but the enhancement of the anti-tumor effect was confirmed in combination with oxaliplatin 50 ⁇ M.
  • the antitumor therapy is effective for brain tumors which are cancer types other than colorectal cancer.
  • FIG. 14A shows the results of the crystal violet method when oxaliplatin is added
  • FIG. 14B shows the results of the crystal violet method when cisplatin is added.
  • the combination of CVA11 type and oxaliplatin showed a strong antitumor effect compared to the combination of CVA11 type and cisplatin. From these results, it was shown that the combination of CVA11 type and oxaliplatin, which is an oncolytic virus, is particularly useful as compared with the combination of CVA11 type and cisplatin already reported (International Publication No. 2013-157648). .
  • FIG. 15 shows the results of virus titer of CVB3 type. Unlike the case where oxaliplatin was added (FIG. 9), no increase in the amount of CVB3 virus was observed even when cisplatin was added. From this result, it was shown that oxaliplatin is more useful in combination with oncolytic virus than cisplatin.

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Abstract

優れた抗腫瘍効果を発揮し且つ副作用の少ない、腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗腫瘍療法を提供する。　腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。

Description

腫瘍溶解性ウイルスの増殖方法及び抗腫瘍剤
　本発明は、腫瘍溶解性ウイルスを用いた新たな抗腫瘍療法に関する。
　悪性腫瘍は、日本人の死因の第１番目であり、統計上は国民の３人に１人が悪性腫瘍を原因として死亡している。長年の努力により、悪性腫瘍に対する手術療法、放射線療法、分子標的薬を含む化学療法の進歩は著しく、治療成績は向上している。しかし、悪性腫瘍による死亡率は依然として高く、悪性腫瘍に有効な新たな治療方法が望まれている。
　新たな治療方法として、腫瘍溶解性ウイルス療法が直接的な殺細胞効果を有する点で注目されてきている。例えば、ＤＮＡウイルスである腫瘍溶解性アデノウイルスや単純ヘルペスウイルスを用いた臨床研究が脳腫瘍や乳癌を対象として実施されており、安全性と有効性を示唆する結果が報告されている。
　また、ＲＮＡウイルスであるピコルナウイルス科のエンテロウイルスは、感染後に宿主細胞のゲノムへの組み込みがなく遺伝子変異による癌化リスクが低いことに加え、癌遺伝子を有していないため安全性が高く、また、細胞内での増殖速度が速いため、迅速かつ高い抗腫瘍効果が期待できる。例えば、エンテロウイルスであるコクサッキーウイルス（ＣＶ）Ａ２１型、エコーウイルス（ＥＶ）６型、ＥＶ７型、ＥＶ１１型、ＥＶ１２型、ＥＶ１３型、ＥＶ２９型を用いた腫瘍溶解性ウイルス療法（特許文献１）、ＣＶＡ１３型、ＣＶＡ１５型、ＣＶＡ１８型、ＣＶＡ２１型、ＥＶ１型、ＥＶ７型、ＥＶ８型、ＥＶ２２型を用いた腫瘍溶解性ウイルス療法（特許文献２）等が報告されている。
　さらに、本発明者らは、近年、コクサッキーウイルスＡ１１型（「ＣＶＡ１１型」と称する）とエコーウイルス４型（ＥＶ４型）が腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を示すと共に、ヒトに対する病原性が低く安全性が高いウイルスであることを見出している（特許文献３）。
特表２００７－５２７７１９号公報 特開２０１２－４６４８９号公報 国際特許公開第２０１３／１５７６４８号
　本発明は、優れた抗腫瘍効果を発揮し且つ副作用の少ない、腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗腫瘍療法を提供することに関する。
　本発明者は、腫瘍溶解性ウイルス療法について研究を重ねた結果、特定の抗がん剤をコクサッキーウイルス等と併用することにより当該ウイルスの増殖が促進され、副作用を増強することなく当該ウイルスによる抗腫瘍効果が顕著に増強されることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の１）～１８）を包含する。
　１）腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
　２）腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである１）記載の抗腫瘍剤。
　３）コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である２）記載の抗腫瘍剤。
　４）植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ－３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる１）～３）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
　５）代謝拮抗剤が、５－ＦＵ又はその塩である１）～３）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
　６）腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含む抗腫瘍剤。
　７）腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである６）記載の抗腫瘍剤。
　８）コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である７）記載の抗腫瘍剤。
　９）植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ－３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる６）～８）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
　１０）代謝拮抗剤が、５－ＦＵ又はその塩である６）～８）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
　１１）腫瘍溶解性ウイルスを含有してなる薬剤と、オキサリプラチン及び植物アルカロイド系抗がん剤から選ばれる抗がん剤を含有してなる薬剤からなるキットである１）～５）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
　１２）オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤。
　１３）腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである１２）記載の抗腫瘍効果増強剤。
　１４）オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と、腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによる腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進方法。
　１５）オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする癌細胞のウイルス受容体発現増強剤。
　１６）ウイルス受容体が、ＤＡＦ及び／又はＩＣＡＭ－１である１５）記載のウイルス受容体発現増強剤。
　１７）抗腫瘍剤を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の使用。
　１８）抗腫瘍療法に使用される、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせ。
　１９）腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を患者に投与する、抗腫瘍療法。
　本発明によれば、優れた抗腫瘍効果を発揮し、ヒトに対する安全性が高い抗腫瘍療法を提供することができる。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）に対する細胞傷害性を示す図。Ａ：オキサリプラチン、ＣＶＡ１１型ともに不添加，Ｂ：オキサリプラチンのみ添加（５０μＭ），Ｃ：オキサリプラチン添加（５０μＭ）後、ＣＶＡ１１型添加（ＭＯＩ（感染力価）＝０．０１），Ｄ：ＣＶＡ１１型のみ添加（ＭＯＩ＝０．０１）。 オキサリプラチンによりＣＶＡ１１型の増殖が促進されることを示す図。 オキサリプラチンによるウイルス受容体の発現増加効果を示す図。 ヒト大腸癌担癌マウスにおける抗腫瘍効果（腫瘍体積の増加抑制）を示す図。 ヒト大腸癌担癌マウスにおける有害事象の発現（体重減少抑制）を示す図。 ヒト大腸癌担癌マウスにおける抗腫瘍効果（生存率）を示す図。 ヒト大腸癌担癌マウスにおける抗腫瘍効果を示す図（腫瘍組織像）。矢印は、死細胞を示す。 オキサリプラチンとＣＶＢ３型の併用によるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）に対する細胞傷害性を示す図。 オキサリプラチンによりＣＶＢ３型の増殖が促進されることを示す図。１：オキサリプラチン不添加、２：オキサリプラチン　０．５μＭ添加、３：オキサリプラチン　１．０μＭ添加。 オキサリプラチンによりＡＡＶの増殖が促進されることを示す図。 ＳＮ－３８によりＣＶＡ１１型の増殖が促進されることを示す図。１：ＳＮ－３８不添加、２：ＳＮ－３８　１．０μＭ添加、３：ＳＮ－３８　５．０μＭ添加、４：ＳＮ－３８　５０μＭ添加。 ５－ＦＵによりＣＶＡ１１型の増殖が促進されることを示す図。１：５－ＦＵ不添加、２：５－ＦＵ　５０μＭ添加。 脳腫瘍細胞Ｕ－８７に対する細胞傷害性を示す図。 オキサリプラチンとシスプラチンのＣＶＡ１１併用時の細胞傷害性を比較した図。（ａ）オキサリプラチンとＣＶＡ１１併用時の図。（ｂ）シスプラチンとＣＶＡ１１併用時の図。 シスプラチンの添加ではＣＶＢ３型の増殖が促進されないことを示す図。
　腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染して癌細胞を溶解、細胞死させるウイルスである。本発明の腫瘍溶解性ウイルスとしては、癌細胞を溶解させて細胞死を起こさせるウイルスであれば特に限定されないが、エンテロウイルスであるＣＶＡ１１型、ＣＶＢ３型（コクサッキーウイルス）やＥＶ４型（エコーウイルス）、アデノウイルスであるＡＡＶ、単純ペルペスウイルスの変異種であるＨＦ１０等が挙げられ、特にＣＶＡ１１型、ＣＶＢ３型及びＡＡＶが好ましい。ＣＶＡ１１型及びＣＶＢ３型は、ピコルナウイルス科に属する腸管系ウイルス（エンテロウイルス）の一種であるコクサッキーウイルス（Coxsackie virus）である。コクサッキーウイルスはＡ、Ｂの２群に分けられ、Ａ群はさらに２４型に，Ｂ群は６型に分けられる。本発明のＣＶＡ１１型はＡ群１１型のコクサッキーウイルスであり、ＣＶＢ３型はＢ群３型のコクサッキーウイルスである。
　腫瘍溶解性ウイルスは、細胞表面のウイルス受容体に結合することによって、当該細胞に感染することができる。ウイルス受容体としては、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ又はＣＤ５５）、細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ‐１又はＣＤ５４）、インテグリンα２β１（ＣＤ４９ｂ）等が挙げられる。腫瘍溶解性ウイルスがウイルス受容体と相互作用することでカプシドが脱安定化され、これにより腫瘍溶解性ウイルスの脱外皮が誘導される。
　腫瘍溶解性ウイルスは、検体等から、遠心分離法や培養細胞によるウイルス増殖法等の既知のウイルス単離方法によって単離できる。また、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞への高い感染性を獲得するよう、天然に存在しているウイルスを、多数回の継代にわたって細胞株において培養することによって生物選抜してもよい。生物選抜に好適な細胞株は、ＤＡＦ、ＩＣＡＭ‐１、インテグリンα２β１等のウイルス受容体を有するものが好ましく、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈ１２９９細胞、Ａ５４９細胞、ＬＫ－８７細胞、ＰＣ－９細胞、Ｈ４６０細胞等が挙げられる。
　本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、天然に存在するものであってもよく、改変されたもの、一部変異したものであってもよい。また、通常のウイルス以外にもベクター型ウイルスであってもよい。例えば、ＣＶＡ１１型の改変体としては、そのカプシドが除去されたものが挙げられる。カプシドは、例えば、キモトリプシン又はトリプシン等のプロテアーゼによる処理によって除去できる。具体的には、例えば、ＣＶＡ１１型を、アルキル硫酸塩等の界面活性剤の存在下においてキモトリプシンで処理することで、カプシドを除去できる。ＣＶＡ１１型のカプシドを除去することで、ウイルスの癌細胞への感染性を増大させることができる。また、カプシドに存在するタンパク質は宿主の体液性免疫及び細胞性免疫の主要な活性化因子であるので、ＣＶＡ１１型のカプシドを除去することで、宿主の免疫応答を低下させることができる。この結果、ＣＶＡ１１型の癌細胞に対する感染性、ひいては医薬組成物の癌細胞に対する細胞傷害性を向上させることができる。
　また、本発明において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染する腫瘍溶解性ウイルスに由来する核酸を含む。腫瘍溶解性ウイルスに由来する核酸は、腫瘍溶解性ウイルスから直接単離されたウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、単離されたウイルスＲＮＡの塩基配列に対応するｃＤＮＡを包含する。
　ウイルスＲＮＡを単離するには、フェノール／クロロホルム抽出法や磁気ビーズによる単離等の任意の方法を使用することができる。
　また、上記核酸は、ウイルスを生じさせるための核酸を組み込んだウイルスプラスミドや発現ベクターであってもよい。発現ベクターには、例えば、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを発現することができるプラスミドが含まれる。発現ベクターには、挿入された核酸が機能的に連結された転写調節制御配列が含まれてもよい。ここでの転写調節制御配列は、例えば、転写を開始させるためのプロモーター、転写されたｍＲＮＡに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメント等である。
　コクサッキーウイルスのうち、ＣＶＡ１１型に由来する核酸としては、具体的には配列番号１に示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。ＣＶＢ３型に由来する核酸としては、具体的には配列番号２に示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ－ＰＧｋ．ｐｕｒｏ 、ｐＴｋ２、非複製アデノウイルスシャトルベクター、サイトメガロウイルスプロモーター等を用いることができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はそのフラグメントを逆転写することによって調製することができる。
　アデノウイルスのうち、ＡＡＶに由来する核酸としては、具体的には配列番号３に示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。発現ベクターとしては、発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ－ＰＧｋ．ｐｕｒｏ 、ｐＴｋ２、非複製アデノウイルスシャトルベクター、サイトメガロウイルスプロモーター等を用いることができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はそのフラグメントを逆転写することによって調製することができる。
　本発明において、抗がん剤は、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれるものであり、植物アルカロイド系抗がん剤としては、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エトポシド、イリノテカン若しくはその活性代謝物又はそれらの塩、ノギテカン、ソブゾキサン、ドセタキセル、パクリタキセル、パクリタキセル注射剤、エリブリン等が挙げられ、イリノテカン、ＳＮ－３８及びそれらの塩が好ましい。また、代謝拮抗剤としては、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、５－ＦＵのプロドラッグ（例えばテガフール又はその塩）、カペシタビン又はその塩、ＴＳ－１（Ｓ－１ともいう。テガフールにモジュレーターを併用した配合剤）、カルモフール、ドキシフルリジン等のフッ化ピリミジン系抗がん剤の他、ゲムシタビン、シタラビン、エノシタビン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ヒドロキシカルバミド、ネララビン、ペントスタチンやこれらのプロドラッグ等が挙げられ、生体内で５‐フルオロウラシルを存在させるフッ化ピリミジン系抗がん剤がより好ましく、特に５‐ＦＵ又はその塩が好ましい。
　オキサリプラチンは、Ｌ－ＯＨＰとしても知られる第三世代の白金錯体系抗がん剤である。本発明において、「オキサリプラチン」は、ｃｉｓ－オキサロト（ｔｒａｎｓ－ｌ－１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、その光学エナンチオマーであるｃｉｓ－オキサロト（ｔｒａｎｓ－ｄ－１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）及びこれらの混合物が包含される。
　イリノテカンは、カンレンボク由来の抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシンの誘導体で、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有する。ＳＮ－３８（７－ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）は、イリノテカンの活性代謝物であり、イリノテカンに比べ強い抗腫瘍活性を有する。
　イリノテカン及びＳＮ－３８の塩としては、無機酸又は有機酸との塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。
　５－ＦＵは、フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤で、核酸の合成を阻害することにより抗腫瘍効果を発揮する抗がん剤である。
　上記抗がん剤のうち、好ましくはオキサリプラチンである。オキサリプラチンやＳＮ－３８、５－ＦＵは、それ自体で抗腫瘍効果を有するが、後述する実施例に示すとおり、オキサリプラチンは腫瘍溶解性ウイルス、特にコクサッキーウイルスの増殖を促進する作用を有し、また、癌細胞のウイルス受容体（ＤＡＦ、ＩＣＡＭ‐１）の発現促進作用を有する。そして、オキサリプラチンやＳＮ－３８等の植物アルカロイド系抗がん剤及び５－ＦＵ等の代謝拮抗剤は、コクサッキーウイルスとオキサリプラチンを併用した場合、オキサリプラチン抵抗性の癌細胞に対して、コクサッキーウイルスを単剤で適用した場合よりも遥かに強い細胞傷害性を発揮する。これは、オキサリプラチンやＳＮ－３８、５－ＦＵによってコクサッキーウイルスが有する抗腫瘍効果が増強されたものと考えられる。
　すなわち、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤又は代謝拮抗剤と、腫瘍溶解性ウイルスの併用において、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進剤、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤となり得、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせは抗腫瘍剤となり得る（以下、これらを纏めて本発明の「抗腫瘍療法」とも称する）。また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は癌細胞のウイルス受容体の発現増強剤となり得る。
　ここで、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤による腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進効果は、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによって得られる。培養は、培養細胞によるウイルス増殖法等の既知の方法を用いることができる。増殖促進効果は、ウイルスの感染力価（ＭＯＩ）を算出する既知の方法を用いることで評価することができる。
　本発明の腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤による抗腫瘍効果（癌細胞に対する細胞傷害性）は、抗がん剤の存在下で腫瘍溶解性ウイルスに暴露された癌細胞の細胞株の生存を試験することで確認することができる。細胞株の生存を試験する方法には、例えば、固定した細胞を染色液で染色して、染色された生細胞の数を定量する方法、クリスタルバイオレット法、アポトーシス特異的なマーカーを定量する方法等がある。これらの方法を用いて、抗がん剤存在下で腫瘍溶解性ウイルスとインキュベーションされた癌細胞の細胞株について、所定時間後に生存している癌細胞を定量することで、結果的に、腫瘍溶解性ウイルスと抗がん剤による細胞傷害性によって、死滅した癌細胞を定量することができる。
　本発明の抗腫瘍療法が対象とする癌種は、腫瘍溶解性ウイルス、特に腫瘍溶解性ウイルスが癌細胞に感染し細胞傷害性を発揮するものであれば特に限定されず、固形癌及び液性癌を含む。
　固形癌において特に強い細胞傷害性が誘導される癌細胞としては、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、下咽頭癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌等の癌細胞が挙げられる。したがって、本発明の抗腫瘍療法では、前記固形癌に加え、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病、ヒトＢリンパ腫等の癌細胞を対象に用いられるのが好ましく、大腸癌、結腸直腸癌の癌細胞が特に好ましい。
　また、本発明の抗腫瘍療法は、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤又は代謝拮抗剤に抵抗性の癌、いわゆる難治性癌の治療に対しても使用することができる。例えばオキサリプラチン抵抗性の癌は、例えば、臨床上効果が得られる用量のオキサリプラチンを投与しても、腫瘍体積の減少、増大の抑制又は当該癌に関連する状態の改善等が見られない癌であり、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、下咽頭癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病、ヒトＢリンパ腫等の癌で見られる。
　本発明の抗腫瘍療法では、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を、それぞれの有効量を適当な配合比で含み、一の剤型に製剤化した配合剤（１剤型形態）でも、同時に又は間隔を空けて別々に使用できるように腫瘍溶解性ウイルスと抗がん剤のそれぞれの有効量を含有する薬剤を単独に製剤化して組み合わせたもの（２剤型形態。キットと称する）であってもよい。配合剤には、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤に加えて、キャリア、希釈剤、補助剤、担体を含むようにしてもよい。キャリアとしては、例えば、リポソーム、ミセル等が好ましい。リポソームは、脂質と膜安定性に寄与するステロイド又はステロイド前駆体との組み合わせを含む。この場合、脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。リポソーム又はミセルで覆われた腫瘍溶解性ウイルスは宿主の免疫応答を低下させることができる。希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水及び生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル等が挙げられる。担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。また、配合剤は、配合剤以外の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
　また、キットは、腫瘍溶解性ウイルスを含有する薬剤とオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有する薬剤以外に、さらに他の薬剤を組み合わせて投与することができる。
　腫瘍溶解性ウイルスを含有する上記の製剤は、腫瘍溶解性ウイルスに加えて、キャリア、希釈剤又は補助剤等を含むようにしてもよい。キャリアとしては、例えば、リポソーム、ミセル等が好ましい。リポソームは、脂質と膜安定性に寄与するステロイド又はステロイド前駆体との組み合わせを含む。この場合、脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。リポソーム又はミセルで覆われた腫瘍溶解性ウイルスは宿主の免疫応答を低下させることができる。
　希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水及び生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル等が挙げられる。
　また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有する製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
　尚、上記製剤中における腫瘍溶解性ウイルスの配合量は、例えば液剤１ｍＬに１×１０２～１×１０１０プラーク形成ユニットとすることが挙げられ、１×１０５プラーク形成ユニット以上とするのが好ましい。また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の配合量は、例えば製剤中に１～１０００ｍｇであるのが好ましい。
　本発明の抗腫瘍療法では、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を種々の方法、すなわち経口、筋肉、皮下、直腸、膣、鼻腔等を介してがん患者に投与することができるが、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、腹腔内投与することが好ましい。特に、食道癌、大腸癌等の消化器癌の多くは、内視鏡等で腫瘍組織を視認しながら、上記の製剤組成物を腫瘍組織に直接注射できる。この場合、内視鏡等で注射した部位を確認できるため、出血しても対処しやすいという利点もある。
　また、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は、癌を治療するのに十分な量となるように投与されればよく、投与量は、患者の体重、年齢、性別、腫瘍組織の大きさ等に基づいて決定される。例えば、成人一日あたり、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０２～１×１０１０プラーク形成ユニットが例示でき、抗がん剤は、１～１０００ｍｇが例示できる。
　投与方法は、単回投与でも複数回投与でもよく、徐放製剤として持続的に投与してもよい。また、投与順序や投与間隔は、腫瘍溶解性ウイルスと、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせの効果が得られる範囲であれば特に制限されないが、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の投与後に腫瘍溶解性ウイルスを投与することがより好ましい。また、キットとする場合は、それぞれ単独の製剤を、同時に或いは間隔を空けて投与してもよい。
　以下の実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１　オキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用による抗腫瘍効果
（１）方法
（ａ）ＣＶＡ１１型の調製
　ＣＶＡ１１型は、国立感染症研究所から入手した。ＣＶＡ１１型は、ＨＥＬＡ細胞（ＡＴＣＣから購入）を用いて増殖した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を１０ｍＬ用いて継代培養したＨＥＬＡ細胞（約２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）にＣＶＡ１１型（播種量：ＭＯＩ＝０．１～１．０）を１時間孵置した後、培地をＤＭＥＭに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ １ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、ＣＶＡ１１型及びＨＥＬＡ細胞は、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。液体窒素を用いて、回収したＨＥＬＡ細胞の凍結、融解を３回繰り返した後、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清（ウイルス溶液）は、－８０℃で保存した。
（ｂ）ＭＯＩの算出
　ＭＯＩは、特許文献３に記載の以下の方法で算出した。
　オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）（ＡＴＣＣから入手）を９６穴のプレートに５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で５時間維持した。ウイルスは、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉで１００倍又は１０００倍希釈して、これをＭＯＩ測定用のウイルス原液とした（ここでの希釈倍率の常用対数をＬとする）。ウイルス原液を１０倍ずつ段階希釈し（ここでの希釈倍率の常用対数をｄとする）、希釈系列液を調製した。次に、各ウェルに希釈系列液を０．０５ｍＬずつ添加した（添加した希釈系列液の体積をｖとする）。１２０時間後に５０％以上の細胞変性効果が認められたウェル数の合計を８で除算した値Ｓを算出し、ＭＯＩを以下の式で算出した。
（数１）
　ｌｏｇ１０（ＭＯＩ）＝Ｌ＋ｄ（Ｓ－０．５）＋ｌｏｇ１０（１／ｖ）
（ｃ）ＣＶＡ１１型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
　クリスタルバイオレット法により、ＣＶＡ１１型による抗腫瘍効果（細胞傷害性）を評価した。
　オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を７２時間後にコンフルエントになる密度（３×１０４ｃｅｌｌｓ/ウェル）で２４穴のプレートに播種した。適切な感染力価（ＭＯＩ＝０．００１、０．０１、０．１）になるように、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ ＩでＣＶＡ１１型を希釈し、ＣＶＡ１１型の希釈液を調製した。約６時間後、プレートから培地を除去し、ＣＶＡ１１型の希釈液を各ウェルに２００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを１時間維持した。次に、ＣＶＡ１１型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに１ｍＬ加え、７２時間培養した。７２時間後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩やかに洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを各ウェルに３００μＬ添加した後、１５分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを除去し、ＰＢＳで洗浄後、２％エタノール及び０．１％クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに３００μＬ添加し、室温で１０分間静置することで生細胞を染色した。染色後のプレートの各ウェルを滅菌水５００μＬで２回洗浄し、スキャナを用いて染色を記録することで、抗腫瘍効果を確認した。
Ａ：オキサリプラチン、ＣＶＡ１１型ともに不添加、Ｂ：オキサリプラチンのみ添加（５０μＭ）、Ｃ：オキサリプラチン添加（５０μＭ）後、ＣＶＡ１１型添加（ＭＯＩ＝０．０１）、Ｄ：ＣＶＡ１１型のみ添加（ＭＯＩ＝０．０１）の４群に分けて比較した。
（２）結果
　図１にクリスタルバイオレット法の結果を示す。Ｂ：オキサリプラチンのみを添加したもの、Ｄ：ＣＶＡ１１型のみを添加したＷｉＤｒでは抗腫瘍効果は認められなかった。一方、Ｃ：オキサリプラチン添加後ＣＶＡ１１型を添加（ＭＯＩ＝０．０１）した群で強い抗腫瘍効果が認められた。
実施例２　オキサリプラチンによるＣＶＡ１１型の増殖促進作用
（１）方法
　培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＡ１１型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。Ａ：オキサリプラチン、ＣＶＡ１１型ともに不添加、Ｂ：オキサリプラチンを添加せず、ＣＶＡ１１型のみを添加、Ｃ：オキサリプラチン添加（５０μＭ）後、ＣＶＡ１１型添加（ＭＯＩ＝０．０１）の３群に分けて比較をした。検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図２にＣＶＡ１１型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、有意なＣＶＡ１１型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチンがＣＶＡ１１型の増殖を促進することが確認された。
実施例３　オキサリプラチンによるウイルス受容体発現促進作用
（１）方法
　培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ２下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２下にプレートを約４２時間静置した後、ｍＲＮＡを採取しｃＤＮＡを作成した。細胞播種後、約２０時間後にＣＶＡ１１型を添加したものと比較した。ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＩＣＡＭ－１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）の発現をｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲにより比較した。検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図３にｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲの結果を示す。
　オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）において、オキサリプラチン添加により、ウイルス受容体あるＤＡＦとＩＣＡＭ－１の発現が有意に増加した。一方、ＣＶＡ１１型ウイルスを添加したものは、ＤＡＦとＩＣＡＭ－１の発現は増加しなかった。受容体の中にはウイルスの増殖に影響するものも知られており、この結果より、ＣＶＡ１１型によるＷｉＤｒに対する抗腫瘍効果がオキサリプラチンによる前処理によって増加したのは、ＤＡＦやＩＣＡＭ－１がウイルスの増殖に関与し、ＣＶＡ１１型ウイルスが増殖したためと考えられた。
実施例４　オキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用によるｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍効果１
（１）方法
　実施例１で確認したＣＶＡ１１型の癌細胞に対する抗腫瘍効果を、オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株ＷｉＤｒによる担癌ヌードマウスを用いて検討した。ＷｉＤｒをＰＢＳ で洗浄し、５.０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉに懸濁した。 ６－８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部にＷｉＤｒを含む懸濁液を、１００μＬずつ２７Ｇ針を用いて皮下注射した。マウスは、１）非投与群、２）オキサリプラチン単独投与群、３）ＣＶＡ１１型単独投与群、４）オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与した群の４つに分けた。オキサリプラチン１００μｇは、ｄａｙ１に腹腔内投与された。ＣＶＡ１１型は５×１０７プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）をｄａｙ２，４，６，８，１０に皮下腫瘍内に局所注射された。非投与群に対しては、右側腹部にＣＶＡ１１型を含まないＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉを、ＣＶＡ１１型投与群と同量投与した。ＣＶＡ１１型投与後、各群の腫瘍体積及び体重を測定した。なお、腫瘍体積は、長径×短径×短径×０．５で算出した。また、試験は各群５匹のマウスを用いて行い、検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図４は、非投与群の腫瘍体積およびオキサリプラチン単独投与群、ＣＶＡ１１型単独投与群、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与した群（併用群）の腫瘍体積を示す。オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスでは、非投与群と比較して、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。また、併用群は、オキサリプラチン単独投与群、ＣＶＡ１１型単独投与群と比較しても腫瘍体積の増加が抑制されており、高い抗腫瘍効果を有していることが確認された。
　また、図５は、これら４群の体重の変化を示す。この結果、非投与群と比べて、オキサリプラチン単独投与したマウス、ＣＶＡ１１型を単独投与したマウス、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスにおいて有意な体重減少を認めなかった。この時点での体重減少は、有害事象を示唆するため、体重減少を認めないことは、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスにおいても有害事象を認めなかったといえ、本発明の抗腫瘍療法は安全性が高いといえる。
　実施例５　オキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用によるｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍効果２
（１）方法
　実施例４におけるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株ＷｉＤｒを皮下移植された担癌ヌードマウスにおける生存率を比較し、皮下移植後ｄａｙ　４０の腫瘍の病理組織をＨ．Ｅ．（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ　ｅｏｓｉｎ）染色にて評価した。
（２）結果
　図６に担癌ヌードマウスにおける生存率を比較したデータを示す。オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスの生存率は、未治療群のマウス、オキサリプラチン単独投与群のマウス、ＣＶＡ１１型単独投与群のマウスと比べて改善が見られた。また、図７に腫瘍組織の病理組織（Ｈ．Ｅ．染色）を示す。Ｈ．Ｅ．染色された腫瘍の病理組織においては、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスの腫瘍の病理組織において、より広範囲に細胞死をみとめた。これにより、生存率や病理組織の観察からも本発明が高い抗腫瘍効果を有することが確認された。
実施例６　オキサリプラチンとＣＶＢ３型の併用による抗腫瘍効果
（１）方法
（ａ）ＣＶＢ３型の調製
　ＣＶＢ３型は、国立感染症研究所から入手した。ＣＶＢ３型は、ＨＥＬＡ細胞（ＡＴＣＣから購入）を用いて増殖した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を１０ｍＬ用いて継代培養したＨＥＬＡ細胞（約２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）にＣＶＡ１１型（播種量：ＭＯＩ＝０．１～１．０）を１時間孵置した後、培地をＤＭＥＭに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ １ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、ＣＶＢ３型及びＨＥＬＡ細胞は、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。液体窒素を用いて、回収したＨＥＬＡ細胞の凍結、融解を３回繰り返した後、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清（ウイルス溶液）は、－８０℃で保存した。
（ｂ）ＭＯＩの算出
　ＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。
（ｃ）ＣＶＢ３型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
　ウイルスとしてＣＶＢ３型を使用した。また、ＣＶＢ３型の感染力価（ＭＯＩ）を０（不添加）、０．００１、０．０１、０．１とし、オキサリプラチンの添加量を０μＭ（不添加）、０．５μＭ、１μＭ、５μＭとした以外は、実施例１（１）（ｃ）と同様の方法で行った。
（２）結果
　図８にクリスタルバイオレット法の結果を示す。オキサリプラチンのみを添加したもの（図８のＣＶＢ３型のＭＯＩが０の横一列）、ＣＶＢ３型のみを添加したもの（図８のＯＸＡが０の縦一列）では抗腫瘍効果は認められなかった。一方、オキサリプラチン添加後ＣＶＡ１１型を添加した群（枠内の群）では、ＭＯＩ及びオキサリプラチン添加量の量に依存して強い抗腫瘍効果が認められた。
実施例７　オキサリプラチンによるＣＶＢ３型の増殖促進作用
（１）方法
　ＣＶＢ３型の調製は、実施例６（１）（ａ）と同様の方法で行った。また、ＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。
　培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度が０（不添加）、０．５、１．０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＢ３型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。１：オキサリプラチン不添加、２：オキサリプラチン　０．５μＭ添加、３：オキサリプラチン　１．０μＭ添加の３群に分けて比較した。試験は６回試験とし、検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図９にＣＶＢ３型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、ＣＶＢ３型ウイルス量の増加がみとめられた。特にオキサリプラチン１μＭ添加時には有意な増加がみとめられた。これにより、オキサリプラチンがＣＶＡ１１型だけでなく、ＣＶＢ３型の増殖も促進することが確認された。
実施例８　オキサリプラチンによるＡＡＶの増殖促進作用
（１）方法
（ａ）ＡＡＶの調製
　ＡＡＶとしてｐＡＡＶ－ＣＭＶ　Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）を使用した。ｐＡＡＶ－ＣＭＶ　Ｖｅｃｔｏｒは、ＡＡＶｐｒｏ(R)　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ（株）製）を用いて調製を行った。回収した上清（ウイルス溶液）は、－８０℃で保存した。
（ｂ）ＭＯＩの算出
　ＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。
（ｃ）オキサリプラチンの添加
　培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度が０（無添加）、０．２５、０．５、１．０、２．５μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約２４時間静置した後、ＡＡＶをＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、ＡＡＶｐｒｏ(R)　Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）Ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いてウイルスのコピー数を測定した。検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図１０にＡＡＶのコピー数の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、有意なＡＡＶのコピー数の増加がみとめられた。特に、オキサリプラチンの添加量が０．２５～１．０μＭの間で顕著な増加が見られた。これにより、オキサリプラチンがＡＡＶの増殖を促進することが確認された。
実施例９　ＳＮ－３８によるＣＶＡ１１型の増殖促進作用
（１）方法
　ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ａ）及び（ｂ）と同様の方法で行った。
　培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、ＳＮ－３８を最終濃度が０（不添加）、１．０、５．０、５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＡ１１型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。１：ＳＮ－３８不添加、２：ＳＮ－３８　１．０μＭ添加、３：ＳＮ－３８　５．０μＭ添加、４：ＳＮ－３８　５０μＭ添加の４群に分けて比較をした。試験は６回試験とし、検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図１１にＳＮ－３８添加時のＣＶＡ１１型のウイルス力価の結果を示す。ＳＮ－３８添加を行ったもので、有意なＣＶＡ１１型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチンだけでなく、ＳＮ－３８においてもＣＶＡ１１型の増殖を促進することが確認された。
実施例１０　５－ＦＵによるＣＶＡ１１型の増殖促進作用
（１）方法
　ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ａ）及び（ｂ）と同様の方法で行った。
　培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、５－ＦＵを最終濃度が０（不添加）、５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＡ１１型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。１：５－ＦＵ不添加、２：５－ＦＵ　５０μＭ添加の２群に分けて比較をした。試験は６回試験とし、検定はt検定を用いた。
（２）結果
　図１２に５－ＦＵ添加時のＣＶＡ１１型のウイルス力価の結果を示す。５－ＦＵ添加を行ったもので、有意なＣＶＡ１１型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチン、ＳＮ－３８だけでなく、５－ＦＵにおいてもＣＶＡ１１型の増殖を促進することが確認された。
実施例１１　脳腫瘍細胞株Ｕ－８７を使用した際のオキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用による抗腫瘍効果
（１）方法
（ａ）ＣＶＡ１１型の調製
　ＣＶＡ１１型の調製は、実施例１（１）（ａ）と同様の方法で行った。
（ｂ）ＭＯＩの算出
　ＭＯＩの算出は、オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）の代わりに脳腫瘍細胞株Ｕ－８７を使用したこと以外は実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。
（ｃ）ＣＶＡ１１型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
　クリスタルバイオレット法により、脳腫瘍細胞株Ｕ－８７を使用した際のＣＶＡ１１型及びオキサリプラチンの併用による抗腫瘍効果（細胞傷害性）を評価した。
　脳腫瘍細胞株Ｕ－８７を７２時間後にコンフルエントになる密度（３×１０４ ｃｅｌｌｓ/ウェル）で２４穴のプレートに播種した。その後、オキサリプラチンを０（不添加）又は５０μＭ添加した。感染力価がＭＯＩ＝０．００１になるように、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ ＩでＣＶＡ１１型を希釈し、ＣＶＡ１１型の希釈液を調製した。約６時間後、プレートから培地を除去し、ＣＶＡ１１型の希釈液を各ウェルに２００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを１時間維持した。次に、ＣＶＡ１１型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに１ｍＬ加え、７２時間培養した。７２時間後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩やかに洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを各ウェルに３００μＬ添加した後、１５分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを除去し、ＰＢＳで洗浄後、２％エタノール及び０．１％クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに３００μＬ添加し、室温で１０分間静置することで生細胞を染色した。染色後のプレートの各ウェルを滅菌水５００μＬで２回洗浄し、スキャナを用いて染色を記録することで、抗腫瘍効果を確認した。
（２）結果
　図１３にクリスタルバイオレット法の結果を示す。ＣＶＡ１１型のみにおいても抗腫瘍効果が確認されたが、オキサリプラチン５０μＭとの併用で抗腫瘍効果の増強が確認された。これにより大腸癌以外の癌種である脳腫瘍に対しても当該抗腫瘍療法が効果的であることが示された。
比較例１　ＣＶＡ１１型とオキサリプラチン又はシスプラチン併用時における抗腫瘍効果の比較
（１）方法
（ａ）ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出
　ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ａ）及び（ｂ）と同様の方法で行った。
（ｃ）クリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の比較
　ＣＶＡ１１型の感染力価（ＭＯＩ）を０（不添加）、０．００１、０．０１、０．１とし、オキサリプラチン又はシスプラチンの添加量を０μＭ（不添加）、０．５μＭ、１μＭ、５μＭとした。それ以外は、実施例１（１）（ｃ）と同様の方法で行った。
（２）結果
　図１４（ａ）にオキサリプラチン添加時、図１４（ｂ）にシスプラチン添加時のクリスタルバイオレット法の結果を示す。ＣＶＡ１１型とオキサリプラチンの併用は、ＣＶＡ１１型とシスプラチンの併用と比較して、強い抗腫瘍効果を示した。この結果より、腫瘍溶解性ウイルスであるＣＶＡ１１型とオキサリプラチンの組み合わせは、既報（国際公開第２０１３－１５７６４８号）のＣＶＡ１１型とシスプラチンとの組み合わせと比較して特に有用であることが示された。
比較例２　シスプラチンによるＣＶＢ３型の増殖促進作用
（１）方法
　オキサリプラチンの代わりにシスプラチンを使用した以外は、実施例７と同様の方法で行った。１：シスプラチン不添加、２：シスプラチン　０．５μＭ添加、３：シスプラチン　１．０μＭ添加の３群に分けて比較をした。
（２）結果
　図１５にＣＶＢ３型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチンを添加した場合（図９）と異なり、シスプラチンを添加してもＣＶＢ３型ウイルス量の増加はみとめられなかった。この結果より、オキサリプラチンはシスプラチンと比較して、腫瘍溶解性ウイルスとの併用において有用であることが示された。

Claims (19)

  1. 　腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
  2. 　腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項１記載の抗腫瘍剤。
  3. 　コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である請求項２記載の抗腫瘍剤。
  4. 　植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ－３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる請求項１～３のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  5. 　代謝拮抗剤が、５－ＦＵ又はその塩である請求項１～３のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  6. 　腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含む抗腫瘍剤。
  7. 　腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項６記載の抗腫瘍剤。
  8. 　コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である請求項７記載の抗腫瘍剤。
  9. 　植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ－３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる請求項６～８のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  10. 　代謝拮抗剤が、５－ＦＵ又はその塩である請求項６～８のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  11. 　腫瘍溶解性ウイルスを含有してなる薬剤と、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有してなる薬剤からなるキットである請求項１～５のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  12. 　オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤。
  13. 　腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項１２記載の抗腫瘍効果増強剤。
  14. 　オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と、腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによる腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進方法。
  15. 　オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする癌細胞のウイルス受容体発現増強剤。
  16. 　ウイルス受容体が、ＤＡＦ及び／又はＩＣＡＭ－１である請求項１５記載のウイルス受容体発現増強剤。
  17. 　抗腫瘍剤を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の使用。
  18. 　抗腫瘍療法に使用される、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせ。
  19. 　腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を患者に投与する、抗腫瘍療法。
     
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