WO2018203517A1 - プラスミンにより切断可能な抗不溶性フィブリン抗体と薬物とのコンジュゲート - Google Patents

プラスミンにより切断可能な抗不溶性フィブリン抗体と薬物とのコンジュゲート Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an antibody drug conjugate and a composition containing the conjugate for use in treating cancer.
  • Insoluble fibrin does not exist in tissues under normal physiological conditions, unlike the precursor fibrinogen widely recognized in the living body.
  • the thrombin that has leaked out of the blood vessel and activated cleaves fibrinogen to form a fibrin monomer, and the fibrin monomer is polymerized and crosslinked to form fibrin fibers. Therefore, insoluble fibrin is specific to tissues in a pathological state such as bleeding and inflammation, and is formed when a pathological condition accompanied by coagulation such as cancer, myocardial infarction, and cerebral infarction occurs.
  • insoluble fibrin is a marker molecule for such thrombosis-related diseases
  • insoluble fibrin present in cancer tissues in the absence of cerebral circulatory diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction is just a cancer-specific molecule.
  • Patent Document 1 an antibody specific to insoluble fibrin and an antibody drug conjugate (ADC) using the antibody have been proposed.
  • the present inventors have developed an ADC of an antibody and a drug specific for insoluble fibrin, wherein the linker connecting the antibody and the drug has a plasmin cleavage sequence.
  • the inventors have found that the resulting ADC is delivered to insoluble fibrin and that it is cleaved by plasmin at the point of delivery to release the drug in situ.
  • the present inventors can use a tumor model animal to target the location where the obtained ADC accumulates insoluble fibrin around the tumor and release the drug on the spot, thereby anticancer against tumors. It has been found that it works.
  • the present inventors acquired a new insoluble fibrin-specific antibody. The present invention is based on these findings.
  • an antibody-drug conjugate The antibody is an antibody that binds to fibrin and has a higher affinity for insoluble fibrin than that for fibrinogen,
  • the drug is a cytotoxic agent
  • An ADC in which an antibody and a drug are linked by a linker having a plasmin cleavage site so that the antibody and the drug can be cleaved by plasmin.
  • the ADC according to (1) above The ADC, wherein the linker has a valine-leucine-lysine peptide sequence as a plasmin cleavage site.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the ADC according to (1) or (2) above.
  • an antibody that binds to fibrin An antibody, or an antigen-binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8.
  • an antibody that binds to fibrin A heavy chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 9, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 10, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 11, A light chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 13, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 14, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 15; Or an antibody that competes with the antibody for binding to fibrin; or an antigen-binding fragment thereof.
  • an antibody that binds to fibrin An antibody, or an antigen-binding fragment thereof, having a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 16.
  • a pharmaceutical composition comprising the ADC according to (9) above.
  • FIG. 1 shows that the antibody obtained in the present invention is an insoluble fibrin-specific antibody.
  • FIG. 2 shows that the insoluble fibrin-specific monoclonal antibody obtained in the present invention accumulates in the tumor formation part.
  • FIG. 3 shows in particular the drug moiety and linker moiety of the antibody drug conjugates made in the present invention.
  • FIG. 4 shows the in vitro anticancer activity verification results using the antibody drug conjugate prepared in the present invention.
  • FIG. 5 shows Kaplan-Meier curves of antibody drug conjugates generated in the present invention against a spontaneous model of pancreatic cancer.
  • FIG. 6A shows the inhibitory effect of antibody drug conjugates made in the present invention on the increase in tumor volume in tumor subcutaneously transplanted mice.
  • FIG. 6A shows the inhibitory effect of antibody drug conjugates made in the present invention on the increase in tumor volume in tumor subcutaneously transplanted mice.
  • FIG. 6B shows the change over time in the body weight of the mice observed in FIG. 6A.
  • FIG. 7 shows the cell growth inhibitory action of an ADC having a plasmin linker having a plasmin cleavage site and a cathepsin linker having a cathepsin cleavage site instead of a plasmin cleavage site.
  • FIG. 8 shows the putative mechanism of action of the antibody drug conjugates made in the present invention.
  • subject means a mammal, and may be a human in particular.
  • treatment is used to mean treatment (therapeutic treatment) and prevention (preventive treatment).
  • treatment means treatment, cure, prevention or amelioration of a disease or disorder or a reduction in the rate of progression of a disease or disorder.
  • prevention means reducing the likelihood of the onset of a disease or condition or delaying the onset of a disease or condition.
  • disease means a symptom for which treatment is beneficial.
  • cancer means a malignant tumor.
  • antibody means an immunoglobulin and includes a polyclonal antibody and a monoclonal antibody.
  • a preferred antibody is a monoclonal antibody.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a non-human animal antibody, a non-human mammal antibody, and a human antibody.
  • the antibody may also be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody may also be a bispecific antibody.
  • therapeutically effective amount means the amount of a drug effective for treating (preventing or treating) a disease or condition.
  • a therapeutically effective amount of a drug reduces the rate of worsening of a symptom of a disease or condition, stops the worsening of the symptom, improves the symptom, cures the symptom, or develops or develops the symptom Can be suppressed.
  • insoluble fibrin means fibrin crosslinked by Factor XIII.
  • fibrinogen is converted into fibrin monomer by the action of thrombin, and the fibrinogen monomer is polymerized to form a hardly soluble fibrin polymer.
  • Fibrin polymer is cross-linked by factor XIII to become insoluble fibrin.
  • insoluble fibrin-specific antibody refers to an antibody that binds to insoluble fibrin and has a higher affinity for insoluble fibrin than for fibrinogen. Such an insoluble fibrin-specific antibody can be easily obtained by screening with affinity for insoluble fibrin and affinity for fibrinogen. Fibrin has an epitope site that is exposed only when it becomes insoluble and undergoes conformational transformation in insoluble fibrin. Therefore, an “insoluble fibrin-specific antibody” can be obtained by immunization using this exposed domain, that is, the D domain (hereinafter also referred to as “D-domain”) as an immunogen. It can also be obtained using linear peptides.
  • Insoluble fibrin-specific antibodies when immunizing a partial peptide of fibrin B ⁇ chain corresponding to positions 231 to 246 of the amino acid sequence of fibrin B ⁇ chain (for example, human fibrin B ⁇ chain may have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25), “Insoluble fibrin-specific antibodies "can be obtained.
  • insoluble fibrin-specific antibody can also be obtained by immunization using the peptide of SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27 as an immunogen.
  • Such insoluble fibrin-specific antibodies can be antibodies that have a higher affinity for insoluble fibrin than for any of fibrinogen, fibrin monomer and fibrin polymer.
  • An antibody having an affinity ratio for insoluble fibrin and affinity for fibrinogen exceeding 1, for example, 1.5 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more can be obtained as an insoluble fibrin-specific antibody.
  • Affinity means binding affinity (KD) and can be determined by a known method such as ELISA or binding equilibrium exclusion.
  • “competing” means competing with another binding antibody for binding to an antigen. Competition can occur when the binding sites of two antibodies for an antigen overlap. Such antibodies can be obtained by immunization with epitopes as described above, and / or by confirming whether binding of one antibody to an antigen is reduced by the other antibody by a competition assay. Obtainable.
  • antibody-drug conjugate means a substance in which an antibody and a cytotoxic agent are linked.
  • the antibody and cytotoxic agent can be linked via an appropriate linker.
  • a chemotherapeutic agent, a radioisotope, and a toxin can be used.
  • the ADC also includes a conjugate of an antigen-binding fragment of an antibody and a drug.
  • the term “antigen-binding fragment” means a part of an antibody that maintains the binding to an antigen.
  • the antigen-binding fragment can comprise the heavy chain variable region or the light chain variable region of the antibody of the present invention, or both.
  • the antigen-binding fragment may be chimerized or humanized.
  • Examples of the antigen-binding fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, scFv (single chain Fv), diabody, and sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ).
  • Such antibody fragments are not particularly limited, and can be obtained, for example, by treating an antibody with an enzyme.
  • Fab can be obtained by digesting an antibody with papain.
  • F (ab ′) 2 can be obtained by digesting the antibody with pepsin
  • Fab ′ can be obtained by further reducing this.
  • such an antigen-binding fragment of an antibody can be used.
  • the antibody and cytotoxic agent in the antibody-drug conjugate are linked via a linker.
  • cytotoxic agents include chemotherapeutic agents (for example, anticancer agents such as commercially available anticancer agents such as auristatin (auristatin E, auristatin F phenylenediamine (AFP), monomethyl auristatin E, monomethyl auri).
  • chemotherapeutic agents for example, anticancer agents such as commercially available anticancer agents such as auristatin (auristatin E, auristatin F phenylenediamine (AFP), monomethyl auristatin E, monomethyl auri).
  • Statins F and their derivatives maytansinoids DM1 and DM4 and their derivatives), camptothecin (SN-38, irinotecan, roottecan, DB67, BMP1350, ST1481, CKD602, topotecan and exatecan, and their derivatives), DNA minor Groove binders (endiin, lexitropsin, duocarmycin and their derivatives), taxanes (paclitaxel and docetaxel and their derivatives), polyketides (discodermolide and their derivatives), anthraquinones (mi Xanthrone and its derivatives), benzodiazepines (pyrrolobenzodiazepine, indolinobenzodiazepine, and oxazolidinobenzodiazepines and their derivatives), vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, vindesine, and vinorelbine and their derivatives), doxorubicins (doxorubicin, morpholino- Doxorubi
  • cytotoxic agent in the ADC of the present invention for example, camptothecin, particularly SN-38, or exatecan can be used.
  • cytotoxic agent any of those used for the treatment of cancer can be used.
  • a pharmaceutically acceptable salt, solvate (for example, hydrate), ester, or prodrug of the above cytotoxic agent may be used.
  • the linker of the ADC contains a plasmin cleavage sequence and can be cleaved in the presence of plasmin.
  • the ADC linker consists of a stable chemical bond in the process other than the plasmin cleavage sequence until it is delivered to insoluble fibrin after administration. With such a configuration, the ADC of the present invention is stable until it is delivered to insoluble fibrin after administration, and is cleaved by plasmin after binding to insoluble fibrin and releases the cytotoxic agent only in the vicinity of insoluble fibrin. Will be.
  • the plasmin cleavage sequence is an amino acid sequence, specifically valine-leucine-lysine, glycine-proline-lysine, glutamic acid-lysine-lysine, lysine-phenylalanine-lysine, norvaline-chlorohexylalanyl-lysine, and norleucine -A peptide chain comprising an amino acid sequence such as a plasmin cleavage sequence selected from the group consisting of hexahydrotyrosine-lysine.
  • a linker can be appropriately selected and synthesized by those skilled in the art in the production of ADC.
  • the linker may have a first spacer introduced between the antibody and the plasmin cleavage sequence, for example, polyethylene glycol (PEG), for example, about 5 to 40 repeating units per molecule. PEG can be used as the first spacer.
  • a second spacer may be introduced between the plasmin cleavage sequence and the cytotoxic agent.
  • PABC p-aminobenzyloxycarbonyl
  • the linker comprises a first spacer and a plasmin cleavage sequence.
  • the linker comprises a first spacer, a plasmin cleavage sequence, and a second spacer.
  • the linker comprises PEG, a plasmin cleavage sequence, and PABC. In some embodiments, the linker does not include a cleavable moiety other than a plasmin cleavage sequence.
  • the bond between the antibody and the linker can be linked to, for example, a sulfhydryl group of the antibody via a maleimide group.
  • the antibody is linked to an anticancer agent through its sulfhydryl group with a linker having a maleimide-PEG-plasmin cleavage sequence.
  • the antibody is linked to an anticancer agent through its sulfhydryl group with a linker having a maleimide-PEG-plasmin cleavage sequence-PABC.
  • the anticancer agent is linked to the anticancer agent by a linker having a plasmin cleavage site that can be cleaved by plasmin, and the ADC reaches a location where insoluble fibrin has accumulated. Then, the linker is cleaved at the plasmin cleavage site by plasmin present around the plasmin, and an anticancer agent is released around the insoluble fibrin.
  • insoluble fibrin has accumulated based on bleeding due to cancer infiltration around the cancer tissue (see FIG. 8), and the antibody of the present invention (that is, the insoluble fibrin-specific antibody). ) Is useful for targeting cancer in drug delivery systems, and the ADC of the present invention is considered useful as a therapeutic agent for cancer.
  • an antibody that binds to fibrin A heavy chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 1, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 2 and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 3; A light chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 5, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 6, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 7; And an antibody that competes with the antibody for binding to fibrin.
  • These antibodies can be used as insoluble fibrin specific antibodies.
  • the present invention also provides the following antibodies: An antibody that binds to fibrin, An antibody having a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 8.
  • This antibody can be used as an insoluble fibrin-specific antibody.
  • This antibody A heavy chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 1, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 2 and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 3; A light chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 5, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 6, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 7; It can also be said that it has an antibody.
  • an antibody that binds to fibrin A heavy chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 9, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 10, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 11, A light chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 13, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 14, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 15; And an antibody that competes with the antibody for binding to fibrin.
  • These antibodies can be used as insoluble fibrin specific antibodies.
  • the present invention also provides the following antibodies: An antibody that binds to fibrin, An antibody having a heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region shown in SEQ ID NO: 16.
  • This antibody can be used as an insoluble fibrin-specific antibody.
  • This antibody A heavy chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 9, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 10, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 11, A light chain variable region comprising CDR1 set forth in SEQ ID NO: 13, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 14, and CDR3 set forth in SEQ ID NO: 15; It can also be said that it has an antibody.
  • insoluble fibrin-specific antibodies, and antigen-binding fragments thereof can be used as antibody portions in the ADC of the present invention.
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the above ADC (also referred to as “ADC of the present invention”).
  • ADC of the present invention a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the above ADC
  • the ADC of the present invention and the pharmaceutical composition can each be used for treating cancer.
  • the cancer to be treated by the ADC or pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but cancer, for example, lung cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, prostate cancer, bladder cancer, breast cancer, esophagus. Cancer, stomach cancer, colon cancer, uterine cancer, ovarian cancer, skin cancer, thyroid cancer, thymic cancer, kidney cancer, testicular cancer, penile cancer, liver cancer, biliary tract cancer, brain tumor Bone and soft tissue tumors, retroperitoneal tumors, angio-lymphatic sarcomas, and these metastatic cancers.
  • lung cancer pancreatic cancer, head and neck cancer
  • prostate cancer bladder cancer
  • breast cancer esophagus
  • Cancer stomach cancer, colon cancer, uterine cancer, ovarian cancer, skin cancer, thyroid cancer, thymic cancer, kidney cancer, testicular cancer, penile cancer, liver cancer, biliary tract cancer, brain tumor Bone and soft tissue tumors, retroperitoneal tumors, angio-lymphatic sarcom
  • the subject of the present invention may be a subject not suffering from a thrombotic disorder or a disease with a thrombotic disorder, or a subject that has not been diagnosed as having a thrombotic disorder or a disease with a thrombotic disorder. This can be expected to reduce side effects in tissues other than cancer. Therefore, determine whether the subject with cancer is suffering from a thrombotic disorder or a disease with thrombotic disorder, and then to a subject not suffering from a thrombotic disorder or a disease with thrombotic disorder
  • the ADC of the present invention may be administered. Whether or not the patient is suffering from a thrombotic disorder or a disease accompanied by a thrombotic disorder can be appropriately determined by a doctor.
  • the pharmaceutical composition comprises the ADC of the present invention and an excipient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by administration methods such as intravenous administration, subcutaneous administration, intratumoral administration, intraperitoneal administration, intraventricular administration, and intramuscular administration.
  • the dose can be appropriately determined by a doctor in consideration of the patient's age, sex, weight, disease severity, and the like.
  • the ADC of the present invention targets insoluble fibrin that accumulates in the stroma of these cancers and accumulates cytotoxic agents at the target site, but is not only activated at the site where insoluble fibrin is present.
  • a plasmin-cleavable linker that releases the cytotoxic agent at the targeting site.
  • an insoluble fibrin-specific antibody in the manufacture of a medicament for use in treating cancer.
  • an ADC of an insoluble fibrin-specific antibody and a cytotoxic agent in the manufacture of a medicament for use in treating cancer, an ADC of an insoluble fibrin-specific antibody and a cytotoxic agent, wherein the antibody and the cytotoxic agent are capable of plasmin cleavage.
  • the use of an ADC is provided.
  • a method of treating cancer in a subject in need thereof comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of an ADC of the present invention.
  • a method for treating cancer in a subject in need thereof comprising determining whether a subject having cancer suffers from a thrombotic disorder or a disease with a thrombotic disorder,
  • a method comprising administering a therapeutically effective amount of an ADC of the invention to a subject not suffering from a thrombotic disorder or a disease associated with a thrombotic disorder.
  • Example 1 Production of Insoluble Fibrin Specific Antibody
  • an antibody having a selectively higher affinity for insoluble fibrin than for fibrinogen hereinafter referred to as “insoluble fibrin specific antibody”.
  • an antibody was obtained by immunizing an animal with the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 and the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 as an immunogen.
  • mice were immunized 6 times every 2 weeks.
  • the first and fourth immunization preparations were as follows.
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 and a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 were used as immunogens, respectively.
  • An immunogen adjusted to 0.5 mg / ml with sterile PBS was prepared and placed in a 1 ml syringe.
  • Freund's Complete Adjuvant (Difco) equal in volume to the immunogen was placed in separate 1 ml syringes, and each syringe was connected with an adapter and pushed out together until resistance was felt.
  • the immunogen preparations for the second, third, fifth and sixth immunizations were as follows. An immunogen adjusted to 0.5 mg / ml with sterilized PBS was prepared, and GERBU ADJUVANT 100 (Nacalai Tesque) equivalent to the immunogen was mixed in a 1.5 ml tube and placed in a 1 ml syringe. In the second, third, fifth and sixth immunizations, 100 ⁇ l of the immunogen was administered intraperitoneally. For final immunization, an immunogen adjusted to 0.1 mg / ml with sterilized PBS was prepared and placed in a 1 ml syringe. The immunogen was first administered to the peritoneal cavity at 100 ⁇ l, and 10 minutes later, 400 ⁇ l was administered to the tail vein.
  • the mouse collected blood from the tail vein one week before the final immunization. The sample was centrifuged at 4,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected and used as a sample. The antibody titer was measured by ELISA using samples diluted stepwise from 100-fold dilution to 12800-fold dilution. Prior to ELISA, an antigen-immobilized plate was prepared in advance. Fibrinogen from human plasma (SIGMA) was dissolved in TBS (pH 8.5) to prepare a 20 ⁇ g / ml fibrinogen solution.
  • SIGMA Fibrinogen from human plasma
  • a fibrinogen plate was added to a 96-well immunoplate at 50 ⁇ l / well and allowed to stand overnight at 4 ° C.
  • Thrombin diluted to 0.05 NIH U / ml with thrombin dilution [7 mM L-Cystein (Wako), 1 mM CaCl 2 (Wako), TBS (pH 8.5)] was added to this fibrinogen plate at 100 ⁇ l per well.
  • the fibrin plate was added and incubated at 37 ° C for 2 hours.
  • the plate on which each antigen was immobilized was washed 3 times with 200 ⁇ l of PBS-T (PBS, 0.5% (v / v) Tween20), and 200 ⁇ L of blocking solution [PBS-T, 1% (w / v) BSA] was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking. 50 ⁇ l / well of serially diluted samples were added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The solution was discarded, washed 3 times with PBS-T, 50 ⁇ l of secondary antibody diluted to 0.3 ⁇ g / ml with blocking solution was added to each well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • spleen was surgically removed from the mouse and immersed in a medium supplemented with RPMI 1640 with 200 units / ml Penicillin-200 ⁇ g / ml Streptomycin-500 ng / ml Amphotericin B.
  • RPMI1640 was injected into the spleen using a syringe 10 ml (TERUMO) and an injection needle 22G (TERUMO), spleen cells were taken out, and passed through an EASY strainer 70 ⁇ m mesh (greiner).
  • the collected cell suspension was centrifuged at 270 ⁇ g, 5 min, room temperature, the supernatant was removed, and then suspended in 10 ml of RPMI 1640. This washing with RPMI 1640 was repeated twice, suspended in 5 ml of RPMI 1640, and cell fusion was performed like cell fusion using mouse iliac lymph nodes.
  • the third screening 50 ⁇ l of the culture supernatant was dispensed from the well inoculated with the colony and used as the primary antibody.
  • ELISA was performed using a fibrin plate and a fibrinogen plate in the same manner as the antibody titer measurement.
  • the well cells that were positive in the third screening were subjected to limiting dilution.
  • 50 ⁇ l of the culture supernatant was dispensed from only a single cell well and used as the primary antibody.
  • ELISA was performed using a fibrin plate and a fibrinogen plate in the same manner as the antibody titer measurement. As a result, cells producing an insoluble fibrin-specific antibody were selected.
  • 99-5 clones were obtained from mice immunized with the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.
  • 1101 clones were obtained from mice immunized with the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.
  • this “99-5 clone” may be simply referred to as “99 clone”.
  • Example 2 Characterization of the obtained monoclonal antibody
  • the affinity of the antibody was verified by ELISA and surface plasmon resonance (SPR).
  • the fibrin plate was incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • the plate on which each antigen was immobilized was washed 3 times with 200 ⁇ l of PBS-T (PBS, 0.5% (v / v) Tween20), and 200 ⁇ L of blocking solution [PBS-T, 1% (w / v) BSA] was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking.
  • Samples serially diluted with PBS were added at 50 ⁇ l / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the solution was discarded, washed 3 times with PBS-T, 50 ⁇ l of secondary antibody diluted to 0.3 ⁇ g / ml with blocking solution was added to each well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • secondary antibody Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins / HRP (Dako) and Polyclonal Rabbit Anti-Rat Immunoglobulins / HRP (Dako) were used depending on the sample.
  • the solution was discarded and washed 3 times with PBS-T, and 100 ⁇ l of the chromogenic substrate solution was added to each well and allowed to react at room temperature for 10 minutes. 30 ⁇ l of 2N H2SO4 was added to each well to stop the reaction. Absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with Spectra Max paradigm (Molecular Devices).
  • the antibodies obtained from the 99 and 1101 clones newly obtained in the above example were insoluble fibrin-specific antibodies that bind to insoluble fibrin more strongly than to fibrinogen. . Moreover, it reacted more strongly to fibrin than the antibody obtained from the 102-10 clone obtained in WO2016 / 167227.
  • Example 3 Verification of antibody accumulation in a pancreas cancer subcutaneous transplant model
  • LSL-Kras G12D / + provided by Y. Kawaguchi, C. Wright, D. Tuveson P53, p48, and K-Ras triple mutant mice (pancreatic cancer model mice) were created by combining LSL-Trp53 R172H / + from Ptf1a-Cre and National Cancer Institute at Frederick. Since we were able to establish a pancreatic cancer cell line derived from it, we performed in vivo imaging using that cell line. This triple mutant mouse has been reported to mimic the development of human pancreatic cancer.
  • Pancreatic cancer cell line is 100 ml Fetal Bovine Serum (FBS, gibco) deactivated in 500 ml RPMI 1640 (Wako) and 10 ml 100 units / ml Penicillin- 100 ⁇ g / ml Streptomycin -250 ng / ml The cells were cultured in a medium supplemented with Amphotericin B (Wako).
  • the culture supernatant was removed, washed with PBS (Invitrogen), and 2 ml of Trypsin-EDTA [0.25% (w / v) Trypsin-1.0 mmol / l thylenediaminetetraacetic acid 4Na Solution with Phenol Red, Japanese Kosei Pharmaceutical Co., Ltd.] was added, the cells were peeled off by pipetting, and placed in a 15 ml tube (corning). Centrifugation was performed using a centrifuge (Universal Centrifuge 5800, KUBOTA) under the conditions of 270 ⁇ g, 3 min, 4 ° C., and the supernatant was removed.
  • a centrifuge Universal Centrifuge 5800, KUBOTA
  • the suspension was resuspended in 10 ml of PBS and centrifuged at 270 ⁇ g, 3 min, 4 ° C. Repeat this 3 times, adjust to 2 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ l with PBS, and inject 50 ⁇ l per mouse into the base of the left foot of 5-week-old BALB / c Slc nu / nu mice (Japan SLC) did.
  • Alexa647-labeled anti-insoluble fibrin antibody and control antibody were administered at 300 ⁇ g tail vein per mouse.
  • InVivoMAb Mouse IgG1 Isotype control BioXCell was used for control.
  • images were taken with an in vivo biological observation system OV110 (olympus) on the 1st, 3rd, 5th and 7th days.
  • the surgically removed tumor was embedded in OCT®compound® (Sakura Finetech Japan Co., Ltd.) and frozen to prepare a 6 ⁇ m thin section. After air drying with a dryer for 45 minutes, it was fixed with cold acetone bottle (Wako) for 10 minutes. After washing with PBS, nuclear staining was performed with Mayer's hematoxylin (Muto Chemical Co., Ltd.) for 2 minutes. After washing with running water for 10 minutes, the cytoplasm was stained with an eosin alcohol bottle (Muto Chemical Co., Ltd.) diluted 3-fold with 100% ethanol.
  • the surgically removed tumor was embedded in OCT®compound® (Sakura Finetech Japan Co., Ltd.) and frozen to prepare a 6 ⁇ m thin section. After air drying with a dryer for 45 minutes, it was fixed with cold acetone bottle (Wako) for 10 minutes. After washing with PBS, the cells were immersed in 0.3% (v / v) H2O2 for 20 minutes to inhibit endogenous peroxidase. After washing with PBS three times for 5 minutes, blocking was performed with blocking solution [5% (w / v) skim milk (Difco), PBS] for 30 minutes.
  • Example 4 In vitro anticancer activity
  • ADC antibody drug conjugate in which monomethylauristatin E (MMAE) was linked to the obtained insoluble fibrin-specific antibody was prepared, and its anticancer activity was produced. Verified.
  • an ADC having the structure shown in FIG. 3 was synthesized and used.
  • This ADC is obtained by linking MMAE to a monoclonal antibody (mAb) as an anticancer agent.
  • mAb monoclonal antibody
  • the antibody and MMAE are linked via a polyethylene glycol (PEG) spacer and a plasmin cleavage site, Val-Leu-Lys, and cleaved in the presence of plasmin, and MMAE is released from the antibody. Is done.
  • the ADC was synthesized as follows. DIPEA (0.54 mL, 3.10 mmol) and p-nitrophenyl chloroformate (472 mg, 1.55 mmol) were added to a DMF (2 mL) solution of Fmoc-Val-Leu-Lys (Mmt) -aminobenzylalcohol (0.74 g, 0.773 mmol) at 0 degrees. And stirred at room temperature for 12 hours. The reaction was quenched with saturated aqueous ammonium chloride and extracted with chloroform. The extract layer was washed with saturated brine, dried over Na 2 SO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • MMAE (14.1 mg, 0.0197 mmol) was added to a solution of p-nitrophenyl carbonate (33.2 mg, 0.0296 mmol), HOBt (0.5 mg, 0.0039 mmol) in pyridine (80 mL)-DMF (0.4 mL) at 0 degrees. It was. After stirring the reaction solution at room temperature for 10 hours, the reaction solution was directly purified by LH20 (chloroform / methanol 1/1), and Fmoc-Val-Leu-Lys (Mmt) -OPABC-MMAE (22.7 mg, 68%) was added. Obtained as a colorless amorphous. MS (MALDI-TOFMS) calcd for [C 99 H 132 N 10 O 15 + K] + 1739.95; found 1741.37.
  • HIPAL-Leu-Lys (Mmt)-OPABC-MMAE (458 mg, 0.309 mmol) in methylene chloride solution (2 mL) and DIPEA (160 mL, 0.927 mmol) and Mal-PEG 12 -OSu (295 mg, 0.340 mmol) in methylene chloride (1 mL) was added at 0 ° C.
  • a fibrin plate was produced. 5 ⁇ L of a 25 mg / ml fibrinogen solution was added to the wall surface of a 96-well plate for cell culture. 1 ⁇ l of thrombin solution was added to each well, and the mixture was centrifuged for 1 minute at 40 ° ⁇ g and 4 ° C. The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours and then stored at 4 ° C. until use.
  • 5-11 cell line (TG mouse-derived pancreatic cancer cells) was seeded on fibrin-coated plates obtained at 2000 cells / well and cultured overnight at 37 ° C.
  • the culture solution was RPMI medium containing 10% FBS.
  • the dilution series was adjusted so that the final concentration of ADC was 0 to 25 nM (MMAE conversion).
  • the final concentrations of plasminogen, tPA, and ⁇ 2-antiplasmin were adjusted to the same levels as in normal plasma, that is, about 1500 nM, about 0.3 nM, and about 1000 nM, respectively.
  • the culture solution was removed from the fibrin plate, 90 ⁇ l of the above solution containing plasminogen, tPA, ⁇ 2-antiplasmin was added, and then 10 ⁇ l of a dilution series of ADC (referred to as “Fbn-ADC” in the figure) was added. .
  • Fbn-ADC a dilution series of ADC
  • the result was as shown in FIG.
  • the ADC of the insoluble fibrin-specific antibody showed a cancer cell growth inhibitory effect, but no significant tumor growth inhibitory effect was observed in the control. This indicates that insoluble fibrin-specific antibody-ADC has bound to the fibrin coating the plate and that the linker has been cleaved by plasmin to release MMAE and killed the tumor.
  • the IC 50 of the insoluble fibrin specific antibody-ADC was 19 nM.
  • Example 5 In vivo fibrin-specific antibody in vivo-anti-cancer effect of ADC
  • the present inventors damage blood vessels surrounding the cancer and cause bleeding, thereby causing hemostasis. Therefore, it was hypothesized that insoluble fibrin accumulates in the vicinity of the tumor, and if an antibody that binds to the accumulated insoluble fibrin is used, an anticancer drug can be delivered to the periphery of the cancer.
  • the present inventors also introduced an anti-cancer agent in an insoluble fibrin-dependent manner by introducing a plasmin cleavage site into the ADC linker, whereby the ADC that has reached the insoluble fibrin is cleaved and further activated on the insoluble fibrin.
  • the concept of a new anticancer drug that releases The present inventors hypothesized that, by this, ADC accumulates in an insoluble fibrin-dependent manner, and the anticancer agent is released, thereby enhancing the cancer specificity.
  • the therapeutic effect of the ADC was verified against a model having pancreatic cancer that spontaneously occurred in the above-mentioned triple mutant mice of P53, K-ras, and P48 (pancreatic cancer spontaneous development model).
  • Insoluble fibrin-specific antibody-ADC 0.3 mg (converted to MMAE) / kg body weight / 3-4 days (ie, 20 mg (converted to ADC) / kg body weight / 3-4 days) ADC was administered to the model, and Kaplan-Meier curve The significance level in the log rank test was set to 0.05, and an anti-4M-Tag antibody was used as a control ADC (referred to as “Control-ADC” in the figure).
  • ADC (referred to as “ ⁇ Fbn-ADC” in the figure) significantly improved the survival rate of the spontaneous pancreatic cancer model compared to the control. This proved that the hypothesis was correct.
  • Example 6 Anticancer activity of the insoluble fibrin-specific antibody-ADC in a subcutaneous tumor model with fibrin deposition
  • a cell line was established from a pancreatic cancer spontaneously generated from the triple mutant.
  • the anticancer effect of insoluble fibrin-specific antibody-ADC was verified using a subcutaneous tumor model obtained by transplanting the cell line subcutaneously.
  • a cell line was established from pancreatic cancer spontaneously generated from the triple mutant and named 5-11.
  • a subcutaneous transplantation model was prepared by transplanting 5 ⁇ 10 5 of 5-11 subcutaneously to BALB / C nude mice. This subcutaneous transplant model had fibrin deposition subcutaneously.
  • insoluble fibrin-specific antibody-ADC was 0.3 mg (converted to MMEA) / kg body weight / 3 to 4 days (that is, 20 mg (converted to ADC) / kg body weight / 3-4 days).
  • the change of the tumor volume increase rate was observed, and the significance level of comparison with ANOVA was set to 0.01.
  • ADC (referred to as “ ⁇ Fbn-ADC” in the figure) significantly suppressed the increase in tumor volume relative to the control.
  • the time course of the change in body weight of the subcutaneous transplantation model was as shown in FIG. 6B. As shown in FIG. 6B, there was no significant increase / decrease in body weight, and it became clear that the ADC of the present invention can be a therapeutic drug with few side effects.
  • the final concentrations of plasminogen, tPA, and ⁇ 2-antiplasmin were adjusted to the same ratio as that in normal plasma, that is, about 150 nM, about 0.03 nM, and about 100 nM, respectively.
  • IC 50 was calculated from the optical density curve obtained by A450.
  • the ADC having a plasmin cleavage site (referred to as “plasmin linker” in the figure) clearly showed a cell growth inhibitory effect on tumor cells, whereas the plasmin cleavage site was In the ADC (referred to as “cathepsin linker” in the figure) replaced with a linker having a cathepsin cleavage site in place of the existing linker, a cell growth inhibitory effect on tumor cells was hardly observed.
  • the anti-insoluble fibrin antibody-cytotoxic agent conjugate having a linker having a plasmin cleavage site is delivered from the bloodstream to the periphery of the cancer where insoluble fibrin accumulates, and in the vicinity of fibrin.
  • the linker moiety is cleaved by plasmin, releasing the cytotoxic agent around the cancer. This causes the cancer to come into contact with the cytotoxic agent. This is considered to be the mechanism of action of the ADC of the present invention.
  • Cancer is more invasive to tissues as the degree of malignancy is higher. When blood vessels infiltrate, bleeding occurs, and insoluble fibrin is formed at the bleeding site.
  • the ADC of the present invention is considered to be particularly effective against such highly malignant cancers. Moreover, if it was an insoluble fibrin specific antibody, even if other antibodies were used, ADC was thought to exhibit an anticancer effect similarly.
  • Example 7 Antibody sequencing 5 ⁇ 10 5 cells are transferred from a 100 mm dish (Corning) to a 15 ml tube and centrifuged at 270 ⁇ g for 3 minutes at 4 ° C. After removing the supernatant, 1 ml of RNAiso Plus (Takara Bio Inc.) was added, transferred to an eppen, and vortexed. Then, it left still for 5 minutes at room temperature. Total RNA was extracted from this cell suspension using RNeasy Mini Kit (Qiagen). 200 ⁇ l of chloroform (Wako) was added to the cell suspension, vortexed for 30 seconds, and allowed to stand for 3 minutes.
  • RNeasy Mini Kit Qiagen
  • the sample was reacted at 72 ° C for 3 minutes using a ProFlex PCR system, and then reacted at 42 ° C for 2 minutes. After spin down, 1 ⁇ l of SMARTerIIA oligo was added. To this sample, 4 ⁇ l of Buffer Mix, 0.25 ⁇ l of RNase inhibitor, and 1 ⁇ l of SMART Scribe Reverse Transcriptase were mixed. Using the ProFlex PCR system, the reaction was performed at 42 ° C for 90 minutes, followed by reaction at 72 ° C for 10 minutes to synthesize cDNA, and then the sequence of the cDNA was decoded. The sequence of the obtained antibody was as follows.
  • Heavy chain variable region of mAb (mouse IgG1) obtained from 99 clones (99-5 clone)
  • Heavy chain variable region of mAb (mouse IgG1) obtained from 1101 clone
  • Heavy chain variable region of mAb (mouse IgG2b) obtained from clone 0211
  • SEQ ID NOS: 1 to 399 correspond to heavy chain CDRs 1 to 3 of antibody 99 respectively correspond to heavy chain variable region of SEQ ID NO: 499 antibody (amino acid numbers 1 to 19 are signal sequences)
  • SEQ ID NOs: 5 to 799 correspond to the light chain CDRs 1 to 3 of the antibody respectively corresponding to the light chain variable region of the SEQ ID NO: 899 antibody (amino acid numbers 1 to 19 are signal sequences)
  • SEQ ID NOs: 9 to 11 correspond to the heavy chain CDR1 to 3 of the 1101 antibody, respectively, correspond to the heavy chain variable region of the SEQ ID NO: 12 1101 antibody (amino acid numbers 1 to 19 are signal sequences)
  • SEQ ID NOs: 13 to 15 correspond to the light chain CDRs 1 to 3 of the 1101 antibody, respectively, correspond to the light chain variable region of the SEQ ID NO: 16 1101 antibody (amino acid numbers 1 to 27 are signal sequences)
  • SEQ ID NOs: 17-19 Corresponds to the heavy chain CDR

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Abstract

本発明は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）および当該コンジュゲートを含む、がんを治療することに用いるための組成物に関する。本発明によれば、不溶性フィブリンに特異的な抗体と薬物とのＡＤＣにおいて、抗体と薬物とを連結するリンカーがプラスミン切断配列を有するＡＤＣおよび該ＡＤＣを含む癌を治療することに用いるための医薬組成物が提供される。

Description

プラスミンにより切断可能な抗不溶性フィブリン抗体と薬物とのコンジュゲート
　本発明は、抗体薬物コンジュゲートおよび当該コンジュゲートを含む、がんを治療することに用いるための組成物に関する。
　血管が傷つき、血液が傷害血管壁や血管内皮下組織に接触したり、組織因子の血中流入があると、血液凝固反応が開始され、血液中のフィブリノーゲンが不溶性フィブリンに変わり、フィブリンの網が強固な止血栓として傷口を固めることが明らかになっている。
　血液凝固は、癌と密接な関係があることが古くから示唆されている（１８００年代のフランスの外科医トルソーの「胃癌患者における四肢の血栓による浮腫」に記載）。最近の臨床疫学データでも、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍をはじめとして、殆どの癌において凝固亢進による血栓症の頻度が健常人より有意に高いことが明らかとなっている（非特許文献１）。また、癌組織の内部においても凝固異常に伴う、不溶性フィブリンの蓄積、凝固壊死、血管新生が癌の進展とともに繰り返し起こっているものと考えられている。
　不溶性フィブリンは、前駆体のフィブリノーゲンが生体に広く認められるのとは異なり、正常な生理的条件下の組織には存在しない。血管外に漏れ出て活性化されたトロンビンがフィブリノーゲンを切断することにより、フィブリンモノマーが形成されて、そのフィブリンモノマーが重合、架橋してフィブリン繊維が形成されることによって生じる。そのため、不溶性フィブリンは、出血や炎症など病理的状態の組織に特異的な存在であり、癌や心筋梗塞、脳梗塞等の凝固を伴う病態が起きたときに形成される。従って、不溶性フィブリンは、かかる血栓関連疾患のマーカー分子であり、特に心筋梗塞や脳梗塞等の脳循環器疾患がない状況における癌組織中に存在する不溶性フィブリンは、まさに癌特異的分子といえる。
　このような技術的背景の下、不溶性フィブリンに特異的な抗体および当該抗体を用いた抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が提案されている（特許文献１）。
WO2014/133093
　本発明者らは、不溶性フィブリンに特異的な抗体と薬物とのＡＤＣにおいて、抗体と薬物とを連結するリンカーがプラスミン切断配列を有するＡＤＣを開発した。本発明者らは、得られたＡＤＣが不溶性フィブリンに送達されること、および、送達された箇所でプラスミンにより切断され、薬物をその場で放出することを見出した。さらに、本発明者らは、腫瘍モデル動物を用いて、得られたＡＤＣが腫瘍周辺の不溶性フィブリンの蓄積箇所を標的化でき、かつ、その場で薬物を放出し、腫瘍に対して抗がん作用を発揮することを見出した。また、本発明者らは、新たな不溶性フィブリン特異的抗体を取得した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
　すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
　抗体は、フィブリンに結合する抗体であり、不溶性フィブリンに対する親和性がフィブリノーゲンに対する親和性よりも高く、
　薬物は、細胞傷害剤であり、
　抗体と薬物とは、プラスミンにより切断可能なようにプラスミン切断部位を有するリンカーにより連結されている、ＡＤＣ。
（２）上記（１）に記載のＡＤＣであって、
　リンカーが、プラスミン切断部位として、バリン－ロイシン－リジンのペプチド配列を有する、ＡＤＣ。
（３）上記（１）または（２）に記載のＡＤＣを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物。
（４）がんが、浸潤性がんである、上記（３）に記載の医薬組成物。
（５）フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号１に示されるＣＤＲ１と、配列番号２に示されるＣＤＲ２と、配列番号３に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
　　配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
　を有する、抗体；若しくは、該抗体とフィブリンへの結合に関して競合する抗体；または、これらの抗原結合性断片。
（６）フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号４に示される重鎖可変領域と、配列番号８に示される軽鎖可変領域とを有する、抗体、またはその抗原結合性断片。
（７）フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号９に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号１１に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
　配列番号１３に示されるＣＤＲ１と、配列番号１４に示されるＣＤＲ２と、配列番号１５に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
　を有する、抗体；若しくは、該抗体とフィブリンへの結合に関して競合する抗体；または、これらの抗原結合性断片。
（８）フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号１２に示される重鎖可変領域と、配列番号１６に示される軽鎖可変領域とを有する、抗体、またはその抗原結合性断片。
（９）抗体が、上記（５）～（８）のいずれかに記載の抗体である、上記（１）または（２）に記載のＡＤＣ。
（１０）上記（９）に記載のＡＤＣを含む、医薬組成物。
（１１）がんを治療することに用いるための上記（１０）に記載の医薬組成物。
図１は、本発明で得られた抗体が不溶性フィブリン特異的な抗体であることを示す。 図２は、本発明で得られた不溶性フィブリン特異的なモノクローナル抗体が、腫瘍形成部に蓄積することを示す。 図３は、本発明で作製した抗体薬物コンジュゲートの、特に薬物部位およびリンカー部位を示す。 図４は、本発明で作製した抗体薬物コンジュゲートを用いたインビトロでの抗がん作用の検証結果を示す。 図５は、膵がん自然発生モデルに対する本発明で作製した抗体薬物コンジュゲートのカプランマイヤー曲線を示す。 図６Ａは、腫瘍の皮下移植マウスの腫瘍体積の増加に対する本発明で作製した抗体薬物コンジュゲートの抑制効果を示す。 図６Ｂは、図６Ａで観察されたマウスの体重の経時的変化を示す。 図７は、プラスミン切断部位を有するプラスミンリンカーとプラスミン切断部位を有さず、代わりにカテプシン切断部位を有するカテプシンリンカーを有するＡＤＣの細胞増殖抑制作用を示す。 図８は、本発明で作製した抗体薬物コンジュゲートの推定される作用機序を示す。
発明の具体的説明
　本発明では、「対象」とは、哺乳動物を意味し、特にヒトであり得る。
　本明細書では、「処置」とは、治療（治療的処置）と予防（予防的処置）とを含む意味で用いられる。本明細書では、「治療」とは、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減を意味する。本明細書では、「予防」とは、疾患もしくは病態の発症の可能性を低下させる、または疾患もしくは病態の発症を遅らせることを意味する。
　本明細書では、「疾患」とは、治療が有益な症状を意味する。本明細書では、「がん」とは悪性腫瘍を意味する。
　本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。
　本明細書では、「治療上有効量」とは、疾患や状態を処置（予防または治療）するために有効な薬剤の量を意味する。治療上有効量の薬剤は、疾患または状態の症状の悪化速度を低下させること、前記症状の悪化を止めること、前記症状を改善すること、前記症状を治癒すること、または前記症状の発症または発展を抑制することが可能である。
　本明細書では、「不溶性フィブリン」とは、第ＸＩＩＩ因子により架橋されたフィブリンを意味する。生体では、例えば出血が生じると、フィブリノーゲンがトロンビンの作用によってフィブリンモノマーに変換され、フィブリノーゲンモノマーが重合して難溶性のフィブリンポリマーが形成される。フィブリンポリマーは、第ＸＩＩＩ因子により架橋され、不溶性フィブリンとなる。
　本明細書では、「不溶性フィブリン特異的抗体」とは、不溶性フィブリンに結合する抗体であって、フィブリノーゲンに対するよりも不溶性フィブリンに対して高い親和性を有する抗体をいう。このような不溶性フィブリン特異的抗体は、不溶性フィブリンに対する親和性とフィブリノーゲンに対する親和性とでスクリーニングして得ることが容易にできる。フィブリンは不溶性フィブリン中で立体構造変換が生じ、不溶性になることで初めて露出するエピトープ部位を有する。従って、「不溶性フィブリン特異的抗体」は、この露出したドメイン、すなわちＤドメイン（以下、「D-domain」ともいう）を免疫原として免疫することで得ることができる。また、線形ペプチドを用いて得ることも可能である。例えば、フィブリンBβ鎖（例えば、ヒトフィブリンBβ鎖は、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有し得る）のアミノ酸配列の２３１～２４６位に対応するフィブリンBβ鎖の部分ペプチドを免疫すると、「不溶性フィブリン特異的抗体」を得ることができる。その他、配列番号２６または配列番号２７のペプチドを免疫原として免疫しても、「不溶性フィブリン特異的抗体」を得ることができる。このような不溶性フィブリン特異的抗体は、フィブリノーゲン、フィブリンモノマーおよびフィブリンポリマーのいずれに対するよりも、不溶性フィブリンへの親和性が高い抗体であり得る。不溶性フィブリンに対する親和性とフィブリノーゲンに対する親和性の比が、例えば、１を超える、１．５以上、２以上、３以上、４以上、または５以上の抗体を不溶性フィブリン特異的抗体として得ることができる。親和性は結合親和性（ＫＤ）を意味し、ＥＬＩＳＡや結合平衡除外法等の周知の方法で決定することができる。
　本明細書では、「競合する」とは、抗原への結合に関して、他の結合抗体と結合を奪い合うことを意味する。競合は、ある抗原に対して２つの抗体の結合部位が重複する場合に生じ得る。このような抗体は、上記のようにエピトープを用いた免疫によって得ることができ、および／または、競合アッセイにより抗原に対する一方の抗体の結合が他方の抗体により減少するか否かを確認することでも得ることができる。
　本明細書では、「抗体－薬物コンジュゲート」（以下、「ＡＤＣ」ともいう）とは、抗体と細胞傷害剤とが連結した物質を意味する。ＡＤＣでは、抗体と細胞傷害剤とは適切なリンカーを介して連結させることができる。細胞傷害剤としては、化学療法剤、放射性同位体、および毒素を用いることができる。ＡＤＣには、抗体の抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートも含まれる。
　本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）2（単鎖（Ｆｖ）2）が挙げられる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）2を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
　本発明では、抗体－薬物コンジュゲートにおいて抗体と細胞傷害剤とは、リンカーを介して連結している。細胞傷害剤としては、化学療法剤（例えば、市販の抗がん剤などの抗がん剤、例えば、オーリスタチン（オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦとそれらの誘導体）、メイタンシノイドＤＭ１およびＤＭ４とそれらの誘導体）、カンプトテシン（ＳＮ－３８、イリノテカン、ルートテカン、ＤＢ６７、ＢＭＰ１３５０、ＳＴ１４８１、ＣＫＤ６０２、トポテカンおよびエキサテカン、並びにそれらの誘導体）、ＤＮＡ副溝結合剤（エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシンとそれらの誘導体）、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルとそれらの誘導体）、ポリケチド（ディスコデルモライドとその誘導体）、アントラキノン系（ミトキサントロンとその誘導体）、ベンゾジアゼピン（ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピンとそれらの誘導体）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンとそれらの誘導体）、ドキソルビシン類（ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ－ドキソルビシンとそれらの誘導体）、強心配糖体（ジギトキシンやその誘導体）、カレキアマイシン、エポチロン、クリプトフィシン、セマドチン、セマドチン、リゾキシン、ネトロプシン、コンブレタスタチン、エリュテロビン、エトポシド、Ｔ６７（チュラリク）、およびノコダゾール）、放射性同位体（例えば、32Ｐ、60Ｃ、90Ｙ、111Ｉｎ、131Ｉ、125Ｉ、153Ｓｍ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、および212Ｂｉ）、および毒素（例えば、ジフテリアトキシンＡ、シュードモナスエンドトキシン、リシン、サポリン等）が挙げられ、本発明のＡＤＣにおける細胞傷害剤として用いることができる。本発明のＡＤＣにおける細胞傷害剤としては、好ましくは例えば、カンプトテシン、特にＳＮ－３８、またはエキサテカンを用いることができる。細胞傷害剤はいずれも、がんの治療に用いられるものを用いることができる。細胞傷害剤としては、上記細胞傷害剤の薬学上許容可能な塩、溶媒和物（例えば、水和物）、エステル、またはプロドラッグを用いてもよい。
　本発明では、ＡＤＣのリンカーはプラスミン切断配列を含み、プラスミン存在下で切断可能である。本発明では、ＡＤＣのリンカーは、プラスミン切断配列以外の部位は、投与後不溶性フィブリンに送達されるまでの過程で安定な化学結合からなる。このような構成とすることで本発明のＡＤＣは、投与後不溶性フィブリンに送達されるまで安定であり、かつ、不溶性フィブリンに結合した後にプラスミンにより切断され、不溶性フィブリン近傍でのみ細胞傷害剤を放出することとなる。プラスミン切断配列は、アミノ酸配列であり、具体的には、バリン－ロイシン－リジン、グリシン－プロリン－リジン、グルタミン酸－リジン－リジン、リジン－フェニルアラニン－リジン、ノルバリン－クロロヘキシルアラニル－リジン、およびノルロイシン－ヘキサヒドロチロシン－リジンからなる群から選択されるプラスミン切断配列などのアミノ酸配列を含むペプチド鎖であり得る。このようなリンカーは、ＡＤＣの作製において当業者であれば適宜選択し、合成することができる。ある態様では、リンカーは、例えば、抗体とプラスミン切断配列との間には第１のスペーサーが導入されていてもよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、１分子あたり繰り返し単位５～４０程度のＰＥＧを第１のスペーサーとして用いることができる。プラスミン切断配列と細胞傷害剤との間には第２のスペーサーが導入されていてもよく、例えば、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）を第２のスペーサーとして用いることができる。
　ある態様では、リンカーは、第１のスペーサーおよびプラスミン切断配列を含む。ある態様では、リンカーは、第１のスペーサー、プラスミン切断配列、および第２のスペーサーを含む。ある特定の対象では、リンカーは、ＰＥＧ、プラスミン切断配列、およびＰＡＢＣを含む。
　ある態様では、リンカーは、プラスミン切断配列以外の開裂性部分を含まない。
　抗体とリンカーとの結合は、例えば抗体のスルフヒドリル基にマレイミド基を介して連結することができる。
　ある態様では、抗体は、そのスルフヒドリル基を介して、マレイミド－ＰＥＧ－プラスミン切断配列を有するリンカーで抗がん剤と連結されている。ある態様では、抗体は、そのスルフヒドリル基を介して、マレイミド－ＰＥＧ－プラスミン切断配列－ＰＡＢＣを有するリンカーで抗がん剤と連結されている。
　いずれにしても、本発明のＡＤＣでは、抗がん剤は、プラスミンにより切断可能なプラスミン切断部位を有するリンカーで抗がん剤と連結されており、当該ＡＤＣが不溶性フィブリンが蓄積した箇所に到達すると、その周囲に存在するプラスミンにより、リンカーがプラスミン切断部位で切断され、不溶性フィブリンの周辺に抗がん剤を放出する。がん組織の周辺には、がんの浸潤による出血に基づいて不溶性フィブリンが蓄積した箇所が多数存在していると考えられ（図８参照）、本発明の抗体（すなわち、不溶性フィブリン特異的抗体）は、薬物デリバリーシステムにおけるがんの標的化に有用であり、本発明のＡＤＣはがんの治療薬として有用であると考えられる。
　本発明では、以下の抗体が提供される：
　フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号１に示されるＣＤＲ１と、配列番号２に示されるＣＤＲ２と、配列番号３に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
　　配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
　を有する、抗体；および、該抗体とフィブリンへの結合に関して競合する抗体。これらの抗体は、不溶性フィブリン特異的抗体として用いることができる。
　本発明ではまた、以下の抗体が提供される：
　フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号４に示される重鎖可変領域と、配列番号８に示される軽鎖可変領域とを有する、抗体。この抗体は、不溶性フィブリン特異的抗体として用いることができる。
　この抗体は、
　配列番号１に示されるＣＤＲ１と、配列番号２に示されるＣＤＲ２と、配列番号３に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
　　配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
　を有する抗体とも言える。
　本発明では、以下の抗体が提供される：
　フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号９に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号１１に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
　　配列番号１３に示されるＣＤＲ１と、配列番号１４に示されるＣＤＲ２と、配列番号１５に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
　を有する、抗体；および、該抗体とフィブリンへの結合に関して競合する抗体。これらの抗体は、不溶性フィブリン特異的抗体として用いることができる。
　本発明ではまた、以下の抗体が提供される：
　フィブリンに結合する抗体であって、
　配列番号１２に示される重鎖可変領域と、配列番号１６に示される軽鎖可変領域とを有する、抗体。この抗体は、不溶性フィブリン特異的抗体として用いることができる。
　この抗体は、
　配列番号９に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号１１に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
　配列番号１３に示されるＣＤＲ１と、配列番号１４に示されるＣＤＲ２と、配列番号１５に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
　を有する抗体とも言える。
　上記抗体、および不溶性フィブリン特異的抗体、並びにこれらの抗原結合性断片は、本発明のＡＤＣにおいて抗体部分として用いることができる。
　本発明によれば、治療上有効量の上記ＡＤＣ（「本発明のＡＤＣ」ともいう）を含む、医薬組成物が提供される。本発明によれば、本発明のＡＤＣおよび上記医薬組成物はそれぞれ、がんを治療することに用いることができる。
　本発明のＡＤＣまたは医薬組成物の治療対象となるがんとしては、特に限定されないが、がん、例えば、肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、膀胱がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、甲状腺がん、胸腺がん、腎臓がん、精巣がん、陰茎がん、肝臓がん、胆道がん、脳腫瘍、骨軟部腫瘍、後腹膜腫瘍、血管・リンパ管肉腫、およびこれらの転移性のがんが挙げられる。
　本発明の対象としては、血栓性障害若しくは血栓性障害を伴う疾患に罹患していない対象、または血栓性障害若しくは血栓性障害を伴う疾患であるとの診断がなされていない対象であり得る。これにより、がん以外の組織での副作用を軽減することが期待できる。従って、がんを有する対象が血栓性障害若しくは血栓性障害を伴う疾患に罹患しているか否かを決定し、その後、血栓性障害若しくは血栓性障害を伴う疾患に罹患していない対象に対して本発明のＡＤＣを投与してもよい。血栓性障害または血栓性障害を伴う疾患に罹患しているか否かは、医師により適宜判断することができる。
　本発明のある態様では、医薬組成物は、本発明のＡＤＣと賦形剤とを含む。本発明の医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、脳室内投与、筋肉内投与等の投与方法により投与され得る。用量は、患者の年齢、性別、体重、疾患の重症度などを考慮して医師が適宜決定することができる。
　本発明のＡＤＣは、これらのがんの間質に蓄積する不溶性フィブリンを標的化し、細胞傷害剤を当該標的化部位に蓄積させるが、それだけではなく、さらに不溶性フィブリンの存在する箇所で活性化されるプラスミンにより切断可能なリンカーを有し、標的化部位で細胞傷害剤を遊離させる。これにより、遊離部位周辺のがんを部位特異的に傷害することができる。
　本発明によれば、がんを治療することに用いるための医薬の製造における、不溶性フィブリン特異的抗体の使用が提供される。本発明によれば、がんを治療することに用いるための医薬の製造における、不溶性フィブリン特異的抗体と細胞傷害剤とのＡＤＣであって、抗体と細胞傷害剤がプラスミン切断可能なプラスミン切断部位を有する、ＡＤＣの使用が提供される。
　本発明によれば、がんをその必要のある対象において治療する方法であって、前記対象に治療上有効量の本発明のＡＤＣを投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、がんをその必要のある対象において治療する方法であって、がんを有する対象が血栓性障害若しくは血栓性障害を伴う疾患に罹患しているか否かを決定し、その後、血栓性障害若しくは血栓性障害を伴う疾患に罹患していない対象に対して治療上有効量の本発明のＡＤＣを投与することを含む方法が提供される。
　本発明によれば、がんを治療する方法に用いるための、本発明のＡＤＣの使用が提供される。
実施例１：不溶性フィブリン特異的抗体の作製
　本実施例では、フィブリノーゲンに対するよりも不溶性フィブリンに対する親和性が選択的に高い抗体（以下、「不溶性フィブリン特異的抗体」とよぶ）を作製した。
（１）免疫原の説明
　本実施例では、配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号２７のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として動物に免疫して抗体を得た。
（２）免疫方法
　マウスに対する免疫は以下の通り行った。マウスに対する免疫は2週間おきに６回行った。
　免疫1回目と4回目の免疫原の調製は以下の通りであった。配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号２７のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれ免疫原として用いた。滅菌したPBSで0.5 mg/mlに調整した免疫原を作製し、1 mlのシリンジに入れた。その免疫原と等量のFreund’s Complete Adjuvant (Difco社)を別の1 mlのシリンジに入れ、それぞれのシリンジをアダプターで繋ぎ合わせ、抵抗を感じるまで互いに押し出した。免疫1回目と4回目では、免疫原は腹腔に200 μl投与した。
　免疫2, 3, 5, 6回目の免疫原の調製は以下の通りであった。滅菌したPBSで0.5 mg/mlに調整した免疫原を作製し、その免疫原と等量のGERBU ADJUVANT 100 (ナカライテスク社)を1.5 ml tube内で混合し、1 mlのシリンジに入れた。免疫2, 3, 5, 6回目では、免疫原は腹腔に100 μl投与した。最終免疫は滅菌したPBSで0.1 mg/mlに調整した免疫原を作製
し、1 mlのシリンジに入れた。免疫原はまず腹腔に100 μl投与し、10分後に尾静脈に400μl投与した。
（３）抗体価の測定
　マウスは最終免疫の1週間前に尾静脈から採血を行った。4,000 ×g、10分、4℃で遠心し、上清を回収し、サンプルとした。抗体価測定は100倍希釈から12800倍希釈まで2倍ずつ段階的に希釈したサンプルを用いてELISAで行った。ELISAを行うにあたり、事前に抗原固相化プレートの準備を行った。TBS (pH8.5)でFibrinogen from human plasma (SIGMA社)を溶解し、20 μg/mlのフィブリノーゲン溶解液を作製した。96 wellイムノプレートに50 μl/wellずつ添加し4℃で一晩静止したものをフィブリノーゲンプレートとした。このフィブリノーゲンプレートにトロンビン希釈液 [7 mM L-Cystein (Wako社), 1 mM CaCl2 (Wako社), TBS (pH 8.5)]で0.05 NIH U/mlに希釈したトロンビンを各wellに100 μlずつ添加し、37°Cで2時間インキュベートしたものをフィブリンプレートとした。各抗原を固相化したプレートを200 μlのPBS-T (PBS, 0.5% (v/v) Tween20)で3回洗浄し、各wellに200 μLのブロッキング溶液 [PBS-T, 1% (w/v)BSA]を加え、室温で1時間静置してブロッキングを行った。段階希釈したサンプルを50 μl/wellずつ添加し室温で1時間静止した。溶液を捨てPBS-Tで3回洗浄し、ブロッキング溶液で0.3 μg/mlに希釈した二次抗体を各wellに50 μlずつ添加し室温で30分間静止した。二次抗体はPolyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP (Dako社)とPolyclonal Rabbit Anti-Rat Immunoglobulins /HRP (Dako社)をサンプルに応じて使い分けた。溶液を捨てPBS-Tで3回洗浄し、発色基質溶液 (1-StepTM Slow TMB-ELISA Substrate Solution, Thermo Fisher Scientific社)を各wellに100 μlずつ添加し、室温で10分間反応させた。2N H2SO4を各wellに30 μlずつ添加し反応を停止させた。450 nmの波長の吸光度をSpectra Max paradigm (Molecular Devices社)で測定した。
（４）ハイブリドーマの調製
　マウスから脾臓を外科的に摘出し、RPMI 1640に200 units/ml Penicillin-200 μg/ml Streptomycin-500 ng/ml Amphotericin Bを添加した培地に浸した。シリンジ 10 ml (TERUMO社)と注射針 22G (TERUMO社)を用いてRPMI1640を脾臓に注入し、脾細胞を取り出し、EASY strainer 70 μm メッシュ (greiner 社)を通した。回収した細胞懸濁液は270 ×g、5 min、室温の条件で遠心して、上清を除去後、10 mlのRPMI 1640に懸濁した。このRPMI 1640による洗浄を2回繰り返し、5 mlのRPMI 1640に懸濁し、マウスの腸骨リンパ節を用いた細胞融合のように細胞融合を行った。
（５）ハイブリドーマのスクリーニング
　細胞融合を行って10日後からELISAでスクリーニングを開始した。１次スクリーニングでは全てのwellから培養上清を50 μl分注し、1次抗体として用いた。免疫に使用したペプチドを固相化したプレートを準備した。ペプチドをリン酸緩衝液で20 μg/mlに希釈し、96 wellイムノプレート (MAXI BREAKAPART NUNC-IMMUNO MODULE, nunc社)の各wellに50μlずつ加え、室温で1時間静置して固相化を行った。固相化後は抗体価測定と同じような方法でELISAを行った。これにより抗体を産生している細胞があるwellを確認した。
　２次スクリーニングでは１次スクリーニングで陽性だったwellのみから培養上清を50 μl分注し、1次抗体として用いた。フィブリンプレートおよびフィブリノーゲンプレートを用いて抗体価測定と同じような方法でELISAを行った。これにより不溶性フィブリン特異的な抗体を産生している細胞があるwellを確認した。２次スクリーニングで陽性だったwellに関しては200 μl目盛付チップ イエロー (Watson社)を用いてコロニーピッキングを行った。コロニーにチップを押し当て5 μl吸い取り、新しいCostar 96-Well Cell Culture Platesに播種した。
　３次スクリーニングではコロニーを播種したwellから培養上清を50 μl分注し、1次抗体として用いた。フィブリンプレートおよびフィブリノーゲンプレートを用いて抗体価測定と同じような方法でELISAを行った。３次スクリーニングで陽性だったwellの細胞を限界希釈した。
　４次スクリーニングでは単一細胞のwellのみから培養上清を50 μl分注し、1次抗体として用いた。フィブリンプレートおよびフィブリノーゲンプレートを用いて抗体価測定と同じような方法でELISAを行った。これにより不溶性フィブリン特異的な抗体を産生する細胞を選択した。
　配列番号２６のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫したマウスから９９－５クローンが得られた。また、配列番号２７のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫したマウスから１１０１クローンが得られた。以下、この「９９－５クローン」を単に「９９クローン」と呼ぶことがある。
実施例２：得られたモノクローナル抗体の特性解析
　本実施例では、ELISAおよび表面プラズモン共鳴（SPR）により抗体の親和性を検証した。
（１）ELISAによる親和性の検証
　ELISAを行うにあたり、事前に抗原固相化プレートの準備を行った。TBS (pH8.5)でFibrinogen from human plasma (SIGMA社)を溶解し、20 μg/mlのフィブリノーゲン溶解液を作製した。96 wellイムノプレートに50 μl/wellずつ添加し4℃で一晩静止したものをフィブリノーゲンプレートとした。このフィブリノーゲンプレートにトロンビン希釈液 [7 mM L-Cystein (Wako社), 1 mM CaCl2 (Wako社), TBS (pH 8.5)]で0.05 NIH U/mlに希釈したトロンビンを各wellに100 μlずつ添加し、37°Cで2時間インキュベートしたものをフィブリンプレートとした。各抗原を固相化したプレートを200 μlのPBS-T (PBS, 0.5% (v/v) Tween20)で3回洗浄し、各wellに200 μLのブロッキング溶液 [PBS-T, 1% (w/v)BSA]を加え、室温で1時間静置してブロッキングを行った。PBSで段階希釈したサンプルを50 μl/wellずつ添加し室温で1時間静止した。溶液を捨てPBS-Tで3回洗浄し、ブロッキング溶液で0.3 μg/mlに希釈した二次抗体を各wellに50 μlずつ添加し室温で30分間静止した。二次抗体はPolyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP (Dako社)とPolyclonal Rabbit Anti-Rat Immunoglobulins /HRP (Dako社)をサンプルに応じて使い分けた。溶液を捨てPBS-Tで3回洗浄し、発色基質溶液を各wellに100 μlずつ添加し、室温で10分間反応させた。2N H2SO4を各wellに30 μlずつ添加し反応を停止させた。450 nmの波長の吸光度をSpectra Max paradigm (Molecular Devices社)で測定した。
　結果は、図１に示される通りであった。図１に示されるように、上記実施例で新たに得られた99クローンおよび1101クローンから得られた抗体は、不溶性フィブリンに対してフィブリノーゲンに対するよりも強く結合する、不溶性フィブリン特異的抗体であった。また、WO2016/167227で得られた102－10クローンから得られた抗体よりもフィブリンに対して強く反応した。
（２）SPRによる親和性の検証
　抗原が不溶性である場合には、SPRによる親和性の検証には適していないが、抗体同士の相対的な親和性の強さを比較するため参考として測定した。
　抗体の不溶性フィブリンに対する親和性をBiacore T200 (GE Healthcare社)を用いて表面プラズモン共鳴 (Surface plasmon resonance: SPR)解析から算出し、抗体の分子間相互作用の評価を行った。流路で使用するbufferにはHBS-N buffer (GE Healthcare社)を用いた。10 mM sodium acetate, pH 5.5 (GE Healthcare社)で102-10のエピトープ部分のペプチド（WO2016/167227参照）を1 μg/mlに希釈し、センサーチップ (Biacore sensor chip CM5, GE Healthcare社)に固定化した。固定化はamine coupling kit (BR-1000-50, GEHeathcare社)を用いて、固定化量を90 RUに設定して行った。次に1×HBS-N bufferで48.875、93.75、187.5、375、750、1500 nMに希釈した抗体を用いて、マルチサイクルカイネティクス法にて表１の条件で抗原抗体反応を行った。測定後はKD値、kd値、ka値を求めるためにBIAevaluation (GE Healthcare社)を用いて解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結果は、表２に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３：膵臓がんの皮下移植モデルを用いた抗体のがんへの蓄積性の検証
　本実施例では、Y. Kawaguchi、C. Wright、D. Tuvesonから提供されたLSL-KrasG12D/+とPtf1a-Cre、National Cancer Institute at Frederickから提供されたLSL-Trp53R172H/+をかけ合わせてp53、p48、およびK-Rasの三重変異マウス (膵臓がんモデルマウス)を作製し、三重変異マウス由来の膵臓がん細胞株を樹立することができたため、その細胞株を用いてin vivo imagingを行った。この三重変異マウスはヒト膵がんの発生を模倣すると報告されている。膵臓がん細胞株は500 mlのRPMI 1640 (Wako社) に非働化した100 ml Fetal Bovine Serum (FBS, gibco社)と10 mlの100 units/ml Penicillin- 100 μg/ml Streptomycin -250 ng/ml Amphotericin B (Wako社)を添加した培地で培養した。そして、培養上清を除去し、PBS (Invitrogen社)を用いて洗浄し、2 mlの Trypsin-EDTA [0.25% (w/v) Trypsin-1.0 mmol/l thylenediaminetetraacetic acid ・4Na Solution with Phenol Red, 和光純薬工業社]を添加し、細胞をピペッティングで剥がし、15 ml tube (corning社)に入れた。270 ×g、3 min、4℃の条件で遠心機 (ユニバーサル遠心機5800, KUBOTA社)を用いて遠心し、上清を除去した。10 mlのPBSで再懸濁し、270 ×g、3 min、4℃の条件で遠心した。これを三回繰り返し、PBSで2×106 cells/50 μlに調整し、5週齢のBALB/c Slc nu/nuマウス (日本SLC社)の左足の付け根に1匹当たり50 μlずつ皮下注射した。1か月後、Alexa647標識した抗不溶性フィブリン抗体とコントロール抗体を1匹当たり300 μg尾静脈投与した。コントロールにはInVivoMAb Mouse IgG1 Isotype control (BioXCell社)を使用した。投与後1時間後、1日目、3日目、5日目、7日目にin vivo生体観察システム OV110 (olympus社)で撮影を行った。
　結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、得られた不溶性抗不溶性フィブリン抗体（特に１１０１および９９）は、がんへの蓄積性が高いことがイメージングから明らかとなった。
　次いで、外科的に摘出した腫瘍をOCT compound (サクラファインテックジャパン社)に包埋して凍結し、6 μmの薄層切片を作製した。ドライヤーで45分風乾後、冷アセトン (Wako社)で10分固定した。PBSで洗浄後、マイヤーヘマトキシリン (武藤化学社)で2分間核染色した。流水で10分間洗浄を行った後、100%エタノールで3倍希釈したエオジンアルコール (武藤化学社) で細胞質を染色した。流水で洗浄後、100%エタノールに3分ずつ3回浸し、キシレン (Wako社)に3分ずつ3回浸して、脱水と透徹を行った。最後にMount-Quick (大道産業社)で封入した。
　外科的に摘出した腫瘍をOCT compound (サクラファインテックジャパン社)に包埋して凍結し、6 μmの薄層切片を作製した。ドライヤーで45分風乾後、冷アセトン (Wako社)で10分固定した。PBSで洗浄後、0.3% (v/v) H2O2に20分間浸し、内因性ペルオキシダーゼ阻害を行った。PBSで5分間の洗浄を3回行った後に、ブロッキング溶液 [5% (w/v)スキムミルク (Difco社), PBS]で30分間ブロッキングした。ブロッキング溶液で1 μg/mlに希釈したHRP標識抗体を200 μl滴下し、4℃で一晩反応させた。PBSで5分間3回洗浄した後、3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド (Dako社)で酵素基質反応を行った。その後、滅菌蒸留水で3分間洗浄を行い、マイヤーヘマトキシリン (武藤化学社)で2分間核染色した。流水で10分間洗浄を行った後、100%エタノールに3分ずつ3回浸し、キシレン (Wako社)に3分ずつ3回浸して、脱水と透徹を行った。最後にMount-Quick (大道産業社)で封入した。
実施例４：in vitro抗がん作用
　本実施例では、得られた不溶性フィブリン特異的抗体にモノメチルオーリスタチンE（ＭＭＡＥ）を連結した抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製し、その抗がん作用を検証した。
　ＡＤＣとしては、図３に示される構造を有するＡＤＣを合成して用いた。このＡＤＣは、抗がん剤としてＭＭＡＥを、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に連結させたものである。このＡＤＣでは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーとプラスミン切断部位でありＶａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓを介して、抗体とＭＭＡＥとが連結されており、プラスミンが存在する環境下で切断され、ＭＭＡＥが抗体から遊離される。
　上記ＡＤＣは、具体的には以下の通り合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-aminobenzylalcohol (0.74 g, 0.773 mmol) のDMF (2 mL) 溶液にDIPEA (0.54 mL, 3.10 mmol) とp-nitrophenyl chloroformate (472 mg, 1.55 mmol) を0度にて加え、室温にて12 時間撹拌した。反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液で停止し、クロロホルムで抽出した。抽出層を飽和食塩水にて洗浄し、Na2SO4 で乾燥後、減圧下濃縮した。残さをシリカゲルクロマトグラフィー (CHCl3/MeOH 95/5 - 9/1) にて精製した。Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-p-nitrophenyl carbonate を無色アモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 8.01 (br, 1H), 7.76 (br, 1H), 7.05-7.60 (m, 13H), 6.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.49 (br, 1H), 5.25 (br, 1H), 4.94 (br, 1H), 4.77 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 4.00-4.85 (m, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.55-3.90 (m, 2H), 3.26 (d, J =19.6 Hz, 1H), 3.00 (d, J = 19.6 Hz, 1H), 2.32 (br, 1H), 1.26 (s, 3H), 1.05-2.25(m, 15H), 0.70-1.05 (m, 12H); HRMS (ESI-MS) : calcd for C72H85N6O17: 1305.5971 [M+H]+; found 1305.5935.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　p-ニトロフェニルカーボネート体 (33.2 mg, 0.0296 mmol), HOBt (0.5 mg, 0.0039 mmol) のピリジン (80 mL) - DMF (0.4 mL)溶液にMMAE (14.1 mg, 0.0197 mmol) を0度にて加えた。反応液を室温にて１０時間撹拌後、反応液を直接LH20 (クロロホルム/メタノール 1/1)により精製し、Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)- OPABC-MMAE (22.7 mg, 68%) を無色アモルファスとして得た。
MS (MALDI-TOFMS) calcd for [C99H132N10O15+K]+ 1739.95; found 1741.37.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)- OPABC-MMAE (626 mg, 0.368 mmol) のDMF (3 mL) 溶液にピペリジン(110 mL, 1.10 mmol) を加え、室温にて40分撹拌した。反応液をLH20 (クロロホルム/メタノール 1/1) とHPLC (YMC T4000 10.0 mL/min, CHCl3:MeOH 4:1, 254nm)にて精製し、H-Val-Leu-Lys(Mmt)- OPABC-MMAE (458 mg, 84%) を無色アモルファスとして得た。
MS (MALDI-TOFMS) calcd for [C94H122N10O13+K]+ 1519.02; found 1519.65.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　H-Val-Leu-Lys(Mmt)- OPABC-MMAE (458 mg, 0.309 mmol) の塩化メチレン溶液 (2 mL) にDIPEA (160 mL, 0.927 mmol) とMal-PEG12-OSu (295 mg, 0.340 mmol) の塩化メチレン溶液 (1 mL) を０度にて加えた。反応液を室温にて22時間撹拌した後、LH20 (クロロホルム/メタノール 1/1) と分子ふるいリサイクルHPLC (YMC T4000 10.0 mL/min, CHCl3, 254nm) により精製し、Mal-PEG12-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE (498 mg, 72%) を無色アモルファスとして得た。
MS (MALDI-TOFMS) calcd for [C118H180N12O29+K-Mmt]+ 1997.51; found 1999.49.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Mal-PEG12-Val-Leu-Lys(Mmt)- OPABC-MMAE (498 mg, 0.223 mmol) を5% TFA 塩化メチレン溶液 (2 mL) に溶解し、メタノール (50 mL) を加え、室温にて１時間撹拌した。反応液を直接LH20 (クロロホルム/メタノール 1/1)、続いて、 HPLC (YMC T4000 10.0 mL/min, CHCl3, 254nm) ) により精製し、Mal-PEG12-Val-Leu-Lys- OPABC-MMAE (440 mg, 90%) を無色アモルファスとして得た。
MS (MALDI-TOFMS) calcd for [C98H164N12O28+K]+ 1997.51; found 1998.31.
　次に、フィブリンプレートを作製した。細胞培養用９６wellプレートに25 mg/mlフィブリノーゲン溶液５μＬを壁面に添加した。トロンビン溶液１μｌを各wellに添加し、40 ×g, 4℃の条件下で、１分間遠心した。37℃で２時間反応させ、その後、使用するまで４℃で保存した。
　5-11細胞株（TGマウス由来膵がん細胞）を2000 cells/wellで得られたフィブリンコートプレートに播種し、37℃で一晩培養した。培養液としては、10％FBSを含むRPMI培地とした。
　ＡＤＣを終濃度で０～２５nM（MMAE換算）となるように希釈系列を調整した。
　プラスミノーゲン、ｔPA、α２－抗プラスミンの終濃度が、正常血漿中の濃度と同程度、すなわち、それぞれ約１５００ｎＭ、約０．３ｎＭ、約１０００ｎＭとなるように調整した。
　フィブリンプレートから培養液を除去し、プラスミノーゲン、ｔPA、α２－抗プラスミンを含む上記溶液を９０μｌ添加し、その後、ＡＤＣ（図中、「Ｆｂｎ－ＡＤＣ」と称する）の希釈系列を１０μｌ添加した。対照として、不溶性フィブリン抗体単体（図中、「ＩｇＧ」と称する）および図３の抗体として抗４Ｍ－Ｔａｇ抗体（対照ＩｇＧ）を用いたＡＤＣ（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＡＤＣ」と称する）を用いた。３７℃で７２時間インキュベートし、その後、培養液を除去して、CCK-8（同仁化学）：培養液＝1:10の割合で混合した反応液を添加して、37℃で３時間インキュベートした。Ａ４５０により求めた光学密度曲線からＩＣ50を算出した。
　結果は、図４に示される通りであった。不溶性フィブリン特異的抗体のＡＤＣは、がん細胞の増殖抑制効果を示したが、対照では、有意な腫瘍の増殖抑制効果は観察されなかった。このことは、不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣが、プレートをコーティングするフィブリンに結合したこと、および、その後、プラスミンによりリンカーが切断されてＭＭＡＥが放出され、腫瘍を殺傷したことを示すものである。不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣのＩＣ50は、１９ｎＭであった。
実施例５：インビボにおける上記不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣの抗がん作用
　本発明者らは、体内でがんが増殖するとがんを取り巻く血管を損傷し、出血を生じること、これによって止血のために不溶性フィブリンが腫瘍付近に蓄積し、蓄積した不溶性フィブリンに結合する抗体を用いればがん周辺に抗がん剤を送達できると仮説した。本発明者らはまた、ＡＤＣのリンカーにプラスミン切断部位を導入することにより、不溶性フィブリンに到達したＡＤＣが切断され、さらに不溶性フィブリン上で活性化したプラスミンにより、不溶性フィブリン依存的に抗がん剤を放出する、新しい抗がん剤の概念を創出した。本発明者らは、これにより不溶性フィブリン依存的にＡＤＣが蓄積し、かつ抗がん剤が放出されることにより、がん特異性を高めることができると仮説した。
　上記のP53、K-ras、P48の３重変異マウスにおいて自然発生した膵がんを有するモデル（膵がん自然発生モデル）に対して上記ＡＤＣによる治療効果を検証した。不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣを０．３ｍｇ（ＭＭＡＥ換算）／ｋｇ体重／３～４日（すなわち、２０ｍｇ（ＡＤＣ換算）／ｋｇ体重／３～４日でＡＤＣをモデルに投与し、カプランマイヤー曲線を求めた。ログランク検定での有意水準を０．０５とした。対照ＡＤＣ（図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＡＤＣ」と称される）としては、抗４Ｍ－Ｔａｇ抗体を用いた。
　結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、ＡＤＣ（図中、「αＦｂｎ－ＡＤＣ」と称される）は、対照に対して有意に膵がん自然発生モデルの生存率を改善した。これにより上記仮説が正しいことが実証された。
実施例６：フィブリン沈着を有する皮下腫瘍モデルにおける上記不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣの抗がん作用
　本実施例では、上記３重変異体から自然発生した膵がんから細胞株を樹立し、当該細胞株を皮下移植して得られた皮下腫瘍モデルを用いて、不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣの抗がん作用を検証した。
　上記３重変異体から自然発生した膵がんから細胞株を樹立して５－１１と命名した。５－１１をBALB/Cヌードマウスの皮下に5×105個移植して皮下移植モデルを作製した。この皮下移植モデルは、皮下にフィブリンの沈着を有していた。得られた皮下腫瘍モデルに対して、不溶性フィブリン特異的抗体－ＡＤＣを０．３ｍｇ（ＭＭＥＡ換算）／ｋｇ体重／３～４日（すなわち、２０ｍｇ（ＡＤＣ換算）／ｋｇ体重／３～４日で投与し、腫瘍体積増加率の推移を観察した。ANOVAでの比較の有意水準を０．０１とした。
　結果は、図６Ａに示される通りであった。図６Ａに示されるように、ＡＤＣ（図中、「αＦｂｎ－ＡＤＣ」と称される）は、対照に対して有意に腫瘍体積の増加を抑制した。
　皮下移植モデルの体重変化の経時的推移は、図６Ｂに示される通りであった。図６Ｂに示されるように、体重については有意な増減がなく、本発明のADCは副作用の少ない治療薬たり得ることが明らかになった。
　次にリンカーがプラスミン切断配列を有しない場合と抗腫瘍効果を比較した。
　44As3を3000 cells/wellで得られたフィブリンコート及び非コートプレートに播種し、37℃で一晩培養した。培養液としては、10％FBSを含むRPMI培地とした。
　カテプシンリンカー（バリン－シトルリンを有する）を用いたＡＤＣ並びにプラスミンリンカーを用いたＡＤＣをそれぞれ終濃度で０～３ nM（MMAE換算）となるように希釈系列を調整した。
　プラスミノーゲン、ｔPA、α２－抗プラスミンの終濃度が、正常血漿中の濃度と同比程度、すなわち、それぞれ約１５０ｎＭ、約０．０３ｎＭ、約１００ｎＭとなるように調整した。
　各プレートから培養液を除去し、プラスミノーゲン、ｔPA、α２－抗プラスミンを含む上記溶液を９０μｌ添加し、その後、ＡＤＣの希釈系列をそれぞれのプレートに１０ μｌ添加した。３７℃で７２時間インキュベートし、その後、培養液を除去して、CCK-8（同仁化学）：培養液＝1:10の割合で混合した反応液を添加して、37℃で２時間インキュベートした。Ａ４５０により求めた光学密度曲線からＩＣ50を算出した。
　結果は図７に示される通りであった。図７に示されるように、プラスミン切断部位を有する上記ＡＤＣ（図中、「プラスミンリンカー」と称する）では、腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制効果が明確に示されたのに対して、プラスミン切断部位を有するリンカーの代わりにカテプシン切断部位を有するリンカーに置き換えたＡＤＣ（図中、「カテプシンリンカー」と称する）では、腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制効果がほとんどみられなかった。
　上記結果から、図８に示されるように、プラスミン切断部位有するリンカーを備えた抗不溶性フィブリン抗体－細胞傷害剤コンジュゲートは、血行から不溶性フィブリンが蓄積するがん周辺部に送達され、フィブリン付近でプラスミンでリンカー部分が切断されて、細胞傷害剤をがん周辺に放出する。これにより、がんは、細胞傷害剤と接触することとなる。これが、本願発明のADCの作用機序であると考えられる。
　がんは、悪性度が高いほど組織に浸潤性が高い。血管に浸潤した場合には出血が生じ、そうすると出血部位で不溶性フィブリンが形成される。本発明のADCは、このような悪性度が高いがんに対して特に有効性が高いと考えられる。また、不溶性フィブリン特異的抗体であれば、他の抗体を用いた場合でもＡＤＣは、同様に抗がん作用を発揮すると考えられた。
実施例７：抗体の配列解読
　5×105 個の細胞を100 mm dish (Corning社)から15 ml tubeに移し、270 ×g、3分、4°Cの条件で遠心する。上清を除去後、RNAiso Plus (タカラバイオ社) を1 ml加えて、エッペンに移し、vortexを行った。その後、室温で5分間静置した。この細胞懸濁液から、RNeasy Mini Kit (Qiagen社) を用いてtotal RNAを抽出した。細胞懸濁液にクロロホルム (Wako社) を200 μl加え、30秒間vortexし、3分間静置した。その後20,400 ×g、15分、4°Cの条件で遠心して、500 μlの上清を回収した。回収した上清に500 μlの70% EtOHを加えて、その溶液をRNeasy Mini spin column へ移した。15,000 ×g、1 min、室温の条件で遠心し、フロースルーを捨て、700 μlのBuffer RW1 (Qiagen社)を加え、8,000 ×g、1 min、室温の条件で遠心した。フロースルーを捨て、500 μlのBuffer RPE (Qiagen社)を加え、8,000 ×g、1 min、室温の条件で遠心した。この洗浄を3回繰り返し、最後に50μlの滅菌蒸留水を加え、20,400 ×g、1 min、室温の条件で遠心し、RNAを抽出した。
　SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (タカラバイオ社)を用いて、抽出したRNAからcDNAを合成した。あらかじめBuffer Mix(5×First-Strand buffer 2 μl, 20 mM DTT 1 μl, 10 mM dNTP Mix 1 μl)を調整し、室温に置いた。PCR用8連tube (Thermo Scientific社) に5'-CDS primer-A を1 μl取り、total RNA 300 ng を加えた後、Nuclease-free Waterを用いて3.75 μlにメスアップした。そのサンプルをProFlex PCR systemを用いて、72°Cで3分間反応を行った後、42°Cで2分間反応を行った。スピンダウン後、SMARTerIIAオリゴを1 μl加えた。このサンプルに4 μlのBuffer Mix、0.25 μlの RNase inhibitor、1 μlのSMART Scribe Reverse Transcriptaseを混合した溶液を加えた。ProFlex PCR systemを用いて、42°Cで90分間反応を行った後、72°Cで10分間反応を行い、cDNAを合成し、その後、cDNAの配列を解読した。得られた抗体の配列は以下の通りであった。
　９９クローン（９９－５クローン）から得られるｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）の重鎖可変領域
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　９９クローン（９９－５クローン）から得られるｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）の軽鎖可変領域
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　１１０１クローンから得られるｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）の重鎖可変領域
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　１１０１クローンから得られるｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）の軽鎖可変領域
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　０２１１クローンから得られるｍＡｂ（マウスＩｇＧ２ｂ）の重鎖可変領域
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　０２１１クローンから得られるｍＡｂ（マウスＩｇＧ２ｂ）の軽鎖可変領域
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
配列表
配列番号１～３　　　９９抗体の重鎖ＣＤＲ１～３にそれぞれ対応
配列番号４　　　　　９９抗体の重鎖可変領域に対応（アミノ酸番号１～１９がシグナル配列である）
配列番号５～７　　　９９抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３にそれぞれ対応
配列番号８　　　　　９９抗体の軽鎖可変領域に対応（アミノ酸番号１～１９がシグナル配列である）
配列番号９～１１　　１１０１抗体の重鎖ＣＤＲ１～３にそれぞれ対応
配列番号１２　　　　１１０１抗体の重鎖可変領域に対応（アミノ酸番号１～１９がシグナル配列である）
配列番号１３～１５　１１０１抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３にそれぞれ対応
配列番号１６　　　　１１０１抗体の軽鎖可変領域に対応（アミノ酸番号１～２７がシグナル配列である）
配列番号１７～１９　０２１１抗体の重鎖ＣＤＲ１～３にそれぞれ対応
配列番号２０　　　　０２１１抗体の重鎖可変領域に対応（アミノ酸番号１～１９がシグナル配列である）
配列番号２１～２３　０２１１抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３にそれぞれ対応
配列番号２４　　　　０２１１抗体の軽鎖可変領域に対応（アミノ酸番号１～２０がシグナル配列である）
配列番号２５　　　　ヒトフィブリンBβ鎖
配列番号２６　　　　９９の免疫原として使用したヒトフィブリンBβ鎖断片
配列番号２７　　　　１１０１の免疫原として使用したヒトフィブリンBβ鎖断片
配列番号２８　　　　免疫原として利用できるヒトフィブリンBβ鎖断片（No.2ペプチド）

Claims (11)

  1. 　抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
    　抗体は、フィブリンに結合する抗体であり、不溶性フィブリンに対する親和性がフィブリノーゲンに対する親和性よりも高く、
    　薬物は、細胞傷害剤であり、
    　抗体と薬物とは、プラスミンにより切断可能なようにプラスミン切断部位を有するリンカーにより連結されている、ＡＤＣ。
  2. 　請求項１に記載のＡＤＣであって、
    　リンカーが、プラスミン切断部位として、バリン－ロイシン－リジンのペプチド配列を有する、ＡＤＣ。
  3. 　請求項１または２に記載のＡＤＣを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物。
  4. 　がんが、浸潤性がんである、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　フィブリンに結合する抗体であって、
    　配列番号１に示されるＣＤＲ１と、配列番号２に示されるＣＤＲ２と、配列番号３に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
    　　配列番号５に示されるＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
    　を有する、抗体；若しくは、該抗体とフィブリンへの結合に関して競合する抗体；または、これらの抗原結合性断片。
  6. 　フィブリンに結合する抗体であって、
    　配列番号４に示される重鎖可変領域と、配列番号８に示される軽鎖可変領域とを有する、抗体、またはその抗原結合性断片。
  7. 　フィブリンに結合する抗体であって、
    　配列番号９に示されるＣＤＲ１と、配列番号１０に示されるＣＤＲ２と、配列番号１１に示されるＣＤＲ３とを有する重鎖可変領域と、
    　配列番号１３に示されるＣＤＲ１と、配列番号１４に示されるＣＤＲ２と、配列番号１５に示されるＣＤＲ３とを有する軽鎖可変領域と、
    　を有する、抗体；若しくは、該抗体とフィブリンへの結合に関して競合する抗体；または、これらの抗原結合性断片。
  8. 　フィブリンに結合する抗体であって、
    　配列番号１２に示される重鎖可変領域と、配列番号１６に示される軽鎖可変領域とを有する、抗体、またはその抗原結合性断片。
  9. 　抗体が、請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体である、請求項１または２に記載のＡＤＣ。
  10. 　請求項９に記載のＡＤＣを含む、医薬組成物。
  11. 　がんを治療することに用いるための請求項１０に記載の医薬組成物。
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