WO2018207866A1 - がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物 - Google Patents

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睿一 中山
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Definitions

  • the present invention relates to a test for predicting the effect or prognosis of cancer treatment and the use of an immune response-inducing peptide.
  • tissue types are roughly classified into small cell lung cancer (10%) and non-small cell lung cancer (NSCLC) (90%).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • lung adenocarcinoma accounts for 70-80%.
  • Median survival (OS) is about 12 months for small cell lung cancer and about 30 months for non-small cell lung cancer.
  • anti-PD-1 antibody therapy (nivolumab, pembrolizumab), which is an immune checkpoint molecule inhibitor, is the first and second-line treatment of advanced stage NSCLC. Prolonged, and anti-PD-1 antibody therapy is currently being implemented in Japan, the United States, and the European Union.
  • a useful biomarker for a successful example of an immune checkpoint molecule inhibitor is a PD-L1 molecule expressed in a tumor and an immunocompetent cell in the tumor, but the response rate is 30- even in the high PD-L1 expression group. Since it is about 40% and immune checkpoint molecule inhibitors are very expensive, the identification of new biomarkers is awaited.
  • XAGE1 antigen expressed in lung adenocarcinoma, the most common type of lung cancer.
  • XAGE1 antigen is expressed in 40-50% of advanced stage lung adenocarcinoma, and antibody (IgG) reaction against XAGE1 is observed in about half of patients expressing XAGE1 antigen, and those who are positive for antibody against XAGE1 (prognosis) Has been clarified to be extended (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • XAGE1 antigen is one of cancer testis antigens.
  • Cancer testis antigen (CT antigen) is expressed in many cancers, but is a general term for antigens expressed only in the testis in normal tissues, and many CT antigens are known (Non-patent Documents 3 and 4). .
  • the response rate in the CheckMate-017 trial in the phase III clinical trial comparing nivolumab and docetaxel in previously treated lung squamous cell carcinoma was 36% in the nivolumab group and 31% in the docetaxel group.
  • the response rate in the same CheckMate-057 trial comparing nivolumab and docetaxel in previously treated non-squamous non-small cell lung cancer was 19% in the nivolumab group and 12% in the docetaxel group.
  • the Nivolumab group was not significant compared to the docetaxel group in the CheckMate-017 trial and the CheckMate-057 trial, whereas the Nivolumab group 33%, the docetaxel group 30%, and the CheckMate-057 in the CheckMate-017 trial, respectively. In the study, it was 44% in the nivolumab group and 29% in the docetaxel group.
  • pembrolizumab Another useful anti-PD-1 antibody, pembrolizumab, was studied in the KEYNOTE-001 and KEYNOTE-010 studies for previously treated non-small cell lung cancer.
  • the overall response rate was 18-20%, and 19-23% of PD-L1-positive tumors and 9-13% of PD-L1-negative tumors were successful.
  • the KEYNOTE-010 trial is a phase III clinical trial comparing pembrolizumab and docetaxel in patients with tumor PD-L1 expression of 1% or higher, and the response rate is 18.0% -18.5% in the pembrolizumab group, The docetaxel group was 9.3%.
  • the OS was 10.4 to 12.7 months in the pembrolizumab group and 8.5 months in the docetaxel group. Therefore, the pembrolizumab group significantly increased OS compared to the docetaxel group.
  • the progression-free survival (PFS) was not significantly different from the docetaxel group.
  • the response rate was 29.1% -30.2% in the pembrolizumab group, whereas 7.9% in the docetaxel group.
  • the OS was 14.9 months to 17.3 months in the pembrolizumab group, and in the patient population with tumor PD-L1 expression of 50% or more, PFS was also significantly improved compared to the docetaxel group. Therefore, it was revealed that pembrolizumab prolongs the high antitumor effect and prognosis of tumors with high expression of tumor PD-L1.
  • the anti-PD-L1 antibody atezolizumab is also targeted for previously treated non-small cell lung cancer in the same manner as nivolumab and pembrolizumab.
  • OS showed a significant prolongation effect at 12.6 months in the atezolizumab group and 9.7 months in the docetaxel group.
  • PD-L1 was expressed in tumor or tumor-infiltrating immune cells in the cancer immune microenvironment, it was shown that the OS further extended the prognosis to 15.1-15.5 months.
  • the response rate of the atezolizumab group in which PD-L1 was highly expressed in the cancer immune microenvironment was 38%, and only about 15% in the docetaxel group in the cancer immune microenvironment without PD-L1 expression. Similar results to the POPLAR study have been observed in the OAK study, a Phase III study that is compared to docetaxel for previously treated non-small cell lung cancer.
  • PD-L1 expression in tumors or immunocompetent cells in tumors is useful as biomarkers for successful cases of immune checkpoint molecule inhibitors at present.
  • the response rate of the immune checkpoint molecule inhibitor is 30-40%, and also 10% for PD-L1 low expression or negative cases Examples of successful responses before and after.
  • each immune checkpoint molecule inhibitor (nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab) has been subjected to its own companion diagnostic method (PD-L1 expression analysis), which is causing confusion in clinical settings.
  • the present inventors have found that the therapeutic effect of cancer can be predicted or confirmed by detecting an antibody against a cancer testis antigen or an anti-p53 antibody.
  • an IgG type XAGE1 antibody hereinafter also referred to as XAGE1-IgG
  • an IgA type XAGE1 antibody hereinafter also referred to as XAGE1-IgA
  • an IgG type anti-NY-ESO- It was found that one antibody (hereinafter also referred to as NY-ESO-1-IgG) is an index for predicting the therapeutic effect and prognosis of cancer treatment.
  • the novel peptide for cancer vaccines and its composition were discovered. Furthermore, they found a screening method for cancer vaccine peptides. That is, the present invention includes the following aspects.
  • a method for examining a cancer therapeutic effect comprising detecting an antibody against a cancer testis antigen in a sample.
  • the cancer testis antigen is at least one cancer testis antigen selected from the group consisting of XAGE1, NY-ESO-1, MAEL, BAGE, BORIS, MAGE-B3 and SSX4.
  • 3. The test method according to item 1 or 2, wherein an IgG type antibody and an IgA type antibody are detected. 4).
  • a method for examining a cancer therapeutic effect comprising detecting an anti-p53 antibody in a sample. 6).
  • a carrier comprising at least one selected from the group consisting of a cancer testis antigen, a peptide comprising a part of a cancer testis antigen, p53 and a peptide comprising a part of p53, and an anti-human IgG antibody
  • a reagent kit for testing a therapeutic effect on cancer comprising a reagent and a reagent containing an anti-human IgA antibody. 8).
  • Activation comprising the step of stimulating and culturing CD4-positive T cells or CD8-positive T cells obtained from peripheral blood with SLP1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SLP2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • SLP1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • SLP2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • 9. A method for inducing an immune response with at least one peptide selected from a) to c) according to item 8 and at least one peptide selected from d) to f) according to item 8. 17.
  • the test method of the present invention can accurately predict the effect and prognosis of cancer treatment before cancer treatment. Moreover, the effect of cancer treatment can be confirmed after cancer treatment. More specifically, the effects of chemotherapy (effects of anticancer agents), the effects of immunotherapy, and the effects of immune checkpoint molecule inhibitors can be accurately predicted. In particular, it is possible to determine whether or not the immune checkpoint molecule inhibitor is successful regardless of PD-L1 expression. It is epoch-making that the effect can be predicted even for patients whose PD-L1 expression could not be predicted.
  • immune checkpoint molecular inhibitors are very expensive, and there is currently no effective biomarker indicating the end of the treatment. Unlike conventional chemotherapy, immune checkpoint molecule inhibitors are effective in some patients, but serious adverse events such as the development of systemic autoimmune diseases are also a concern.
  • the test method of the present invention can be predicted even for patients with low therapeutic effects, and the treatment can be stopped in consideration of balance with side effects. From these facts, the fact that immune checkpoint molecule inhibitors can be selected effectively by the present invention is epoch-making in terms of medical economics including treatment costs, side effects, etc.
  • novel peptide of the present invention and the composition for inducing an immune response containing the novel peptide can induce an immune response against cancer by actively inducing XAGE1 immunity, thereby becoming a cancer therapeutic agent (cancer vaccine).
  • cancer vaccine cancer vaccine
  • the novel peptide and composition for inducing immune response of the present invention can induce XAGE1-specific antibodies, particularly IgG-type anti-XAGE1 antibodies, and can further induce antigen-specific T cells.
  • novel peptide of the present invention and the composition for inducing immune response of the present invention actively induce XAGE1 immunity to ineffective cases of chemotherapy, immunotherapy and immune checkpoint molecule inhibitors, or poor prognosis groups
  • XAGE1 immunity to ineffective cases of chemotherapy, immunotherapy and immune checkpoint molecule inhibitors, or poor prognosis groups
  • it is possible to achieve a breakthrough treatment leading to a treatment success and a good prognosis group.
  • it enables powerful cancer immunotherapy by combining existing treatments and new treatments.
  • the immune response inducing composition of the present invention is also excellent in safety.
  • the novel peptide of the present invention is a long-chain peptide and thus contains various epitopes, and can induce a stronger immune response than conventional epitope vaccines. Furthermore, a stronger immune response can be induced by using at least one peptide selected from a) to c) and at least one peptide selected from d) to f) in combination.
  • the screening method of the present invention makes it possible to select peptides suitable for cancer vaccines.
  • the activated CD4 positive T cells or activated CD8 positive T cells obtained by the method for preparing activated CD4 positive T cells or activated CD8 positive T cells of the present invention are used for cell therapy such as adoptive immunity (T cell) therapy. Can be used.
  • FIG. 1 shows cancer-related antigens for sera collected from 157 patients with early or locally advanced lung adenocarcinoma (cStage I-IIIA) and 145 patients with advanced stage (cStage IIIB-IV) lung adenocarcinoma, The results of detecting antigen-specific IgG and antigen-specific IgA against XAGE1, MAGE-A3, SSX-2, NY-ESO-1 and TP53 are shown.
  • FIG. 2 shows the test results of serum collected from 157 patients with early or locally advanced lung adenocarcinoma (cStage I-IIIA) and 145 patients with advanced stage (cStageIIIB-IV) lung cancer.
  • FIG. 3A shows the results of examination of sera obtained from 55 lung adenocarcinoma patients positive for XAGE1 antigen for autoantibody responses to 51 types of cancer antigens.
  • XAGE1-IgG and XAGE1-IgA have been shown to be surrogate markers for immune responses against autologous tumors.
  • immune responses to various cancer antigens are observed.
  • an anti-XAGE1 antibody of IgA type indicates that the immune response against the self-tumor is attenuated.
  • XAGE1 immunonegative cases show that almost no immune response to self tumors is observed.
  • FIG. 3B shows that XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative individuals have an immune response to multiple cancer antigens and a potentially high immune response against cancer (immune activated state).
  • FIG. 4 shows the results of measuring immunosuppressive cytokines in the serum of 145 patients with advanced stage lung adenocarcinoma.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the state of B cells and T cells in the local cancer of patients with early or locally advanced lung adenocarcinoma. 5A and 5B show the accumulation state of cancer local (TIL) cells.
  • FIG. 5C shows that about 30% of cases have high IgA positive B cell infiltration.
  • FIG. 5D shows that the number of regulatory T cells in the tumor area is increased in cases where IgA positive B cell infiltration is high.
  • FIG. 5E shows that IL-10, an immunosuppressive cytokine, was observed in tumor-infiltrating lymphocytes compared to peripheral blood, and that B cells in addition to T cells also produced IL-10.
  • FIG. 5F shows that the IL-10 producing tumor infiltrating B cells shown in FIG. 5E are IgA positive.
  • FIG. 6 shows the results of analysis of immune checkpoint molecules expressed in IgA + B cells of lung adenocarcinoma patients.
  • FIG. 7 shows that the XAGE1-IgG positive group significantly prolongs the median survival, and this tendency is remarkable in EGFR gene mutation negative cases.
  • FIG. 8 shows that the success rate of the first chemotherapy is significantly higher in the XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative group than in the XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA positive group and the group without immune response.
  • FIG. 10 shows a group with an immune response to XAGE1 or NY-ESO-1 (XAGE1-IgG positive or NY-ESO-1-IgG positive group) and a group without an immune response (group without antibodies to XAGE1 and NY-ESO-1) Shows the response rate, progression-free survival (Progression-Free Survival) and overall survival (Overall Survival) after treatment with anti-PD-1 antibody, which is an immune checkpoint molecule inhibitor.
  • FIG. 11 shows the results shown in FIG.
  • FIG. 12 shows the results of monitoring anti-NY-ESO-1, anti-XAGE1 and anti-p53 antibodies in successful cases of anti-PD-1 antibody therapy.
  • FIG. 13A shows the results of analysis of immune responses to 50 cancer antigens including XAGE1 and NY-ESO-1 antibodies, using sera before treatment of patients treated with anti-PD-1 antibody therapy.
  • FIG. 14A shows the relationship between the rate of change in target lesions due to anti-PD-1 antibody therapy (minus means tumor shrinkage) and the antibody titers of antibodies against CT antigens (XAGE1-IgG and NYESO-1-IgG). Yes.
  • FIG. 14B shows the relationship between the rate of change of target lesions by anti-PD-1 antibody therapy and the number of immune responses (antigen spreading) to multiple antigens after treatment.
  • FIG. 15A shows the difference in immune response to multiple antigens before and after anti-PD-1 antibody therapy.
  • FIG. 15B shows that in the successful cases of anti-PD-1 antibody therapy, spreading of the immune response against MAGE-B3 antigen fistula and SSX4 antigen was frequently observed, and not in the non-successful cases.
  • FIG. 16 shows that an immune response to the SSX4 antigen was actually observed in a completely successful case of an anti-CCR4 antibody + anti-PD-1 antibody, preoperative combination physician-initiated clinical trial case.
  • FIG. 17 shows that the course of tumor shrinkage and the immune response to SSX4 were correlated.
  • FIG. 18 shows that positive antibodies against CT antigen (anti-XAGE1 antibody and anti-NY-ESO-1 antibody) can clearly discriminate the effect of anti-PD-1 antibody therapy from known biomarkers.
  • FIG. 19 shows that 4C34-1 which is a CD4 positive T cell clone specific for SLP2 (hereinafter also referred to as CD4 clone) and 8C34TY which is a CD8 positive T cell clone specific for SLP1 (hereinafter also referred to as CD8 clone) are recognized. The peptide to be shown is shown.
  • FIG. 20 shows the results of stimulating CD4 clone (4C34-1) T cells, CD8 clone (8C34TY) T cells, and a mixture of these T cells with SLP1 alone, SLP2 alone, or a combination of SLP1 and SLP2.
  • FIG. 5 shows that stimulation with a combination of SLP1 and SLP2 induces a stronger immune response.
  • FIG. 21 shows the results of detection of IgG and IgA on the surface of B cells after stimulation of peripheral blood mononuclear cells with CD4 clone T cells and CD8 clone T cells with SLP1 alone, SLP2 alone, or each peptide combination. . Increased expression of IgG on the surface of B cells was observed when SLP1 and SLP2 were used in combination.
  • FIG. 22 shows the detection results of XAGE1-specific antibodies in the culture supernatant after stimulation of B cells with SLP1 alone, SLP2 alone, or a combination of each peptide together with CD4 clone T cells and CD8 clone T cells.
  • SLP1 and SLP2 were used in combination, XAGE1-IgG was produced and IgA production was not observed.
  • FIG. 23 shows that administration of XAGE1 vaccine containing SLP1 and SLP2 showed an increase in XAGE1-IgG antibody titer in 4 of 7 cases, and that XAGE1-IgA and NY-ESO-1-IgG were not induced .
  • FIG. 22 shows the detection results of XAGE1-specific antibodies in the culture supernatant after stimulation of B cells with SLP1 alone, SLP2 alone, or a combination of each peptide together with CD4 clone T cells and CD8 clone T cells.
  • SLP1 and SLP2 were used in combination
  • FIG. 24 shows that suppression or reduction in tumor marker elevation was observed in 4 of 7 cases by administration of XAGE1 vaccine.
  • FIG. 25 shows that an immune response could be induced by low dose administration of XAGE1 vaccine.
  • CD4-positive T cells obtained from patients mainly respond to SLP1, indicating that the combined use of SLP1 and SLP2 enhances the immune response.
  • FIG. 26 shows that an immune response could be induced by administration of a dose in the XAGE1 vaccine.
  • CD4-positive T cells obtained from patients respond to SLP1 and SLP2, indicating that the combined use of SLP1 and SLP2 enhances the immune response.
  • the test method of the present invention is characterized by detecting an antibody against a cancer testis antigen or an anti-p53 antibody in a sample.
  • the method for screening a peptide for cancer vaccine of the present invention is characterized by detecting an antibody against a cancer testis antigen or an anti-p53 antibody in a sample.
  • the cancer testis antigen (hereinafter also referred to as CT antigen) is not particularly limited, and is an antigen that is expressed in cancer cells and expressed only in testis in normal tissues. is there.
  • CT antigen is an antigen that is expressed in cancer cells and expressed only in testis in normal tissues.
  • the present invention is characterized by detecting an antibody against a CT antigen, and preferred CT antigens include XAGE1, NY-ESO-1, MAEL, BAGE, BORIS, MAGE-B3 and SSX4. More preferred CT antigens include XAGE1 and NY-ESO-1.
  • the test method and screening method of the present invention preferably detect an antibody against an IgG type CT antigen or an anti-p53 antibody.
  • Preferred antibodies against CT antigen include XAGE1 antibody, anti-NY-ESO-1 antibody, anti-MAEL antibody, anti-BAGE antibody, anti-BORIS antibody, anti-MAGE-B3 antibody and anti-SSX4 antibody, these antibodies are of IgG type It is preferable. More preferable antibodies include IgG type anti-XAGE1 antibody and IgG type anti-NY-ESO-1 antibody.
  • an antibody against an IgA type CT antigen is detected in addition to an antibody against an IgG type CT antigen.
  • Suitable antibodies against IgA type CT antigens include IgA type anti-XAGE1 antibodies.
  • an IgG type anti-XAGE1 antibody and an IgA type anti-XAGE1 antibody are detected.
  • the “cancer vaccine” means a pharmaceutical composition capable of inducing an immune response against cancer, and the immune response induction includes humoral immunity induction and / or cellular immunity induction. included.
  • test method of the present invention detects an antibody against a CT antigen or an anti-p53 antibody in a sample collected from a subject before cancer treatment. Moreover, one Embodiment of the test
  • the effect and prognosis of the cancer treatment can be predicted before the cancer treatment.
  • the effect of the cancer treatment can be confirmed after cancer treatment and the prognosis can be predicted. Furthermore, the effect and prognosis of subsequent treatment can be predicted.
  • test method of the present invention is suitable for prediction, confirmation, and prognosis prediction of the effects of various cancer treatments, but is suitable for prediction, confirmation, and prognosis prediction of the effects of chemotherapy and immunotherapy. It is more suitable for predicting the effect of immunotherapy, and particularly suitable for predicting the effect of treatment with immune checkpoint molecule inhibitors.
  • Chemotherapy includes treatment by administration of various anticancer drugs such as platinum preparations.
  • Immunotherapy includes immunosuppression inhibition therapy (treatment with immune checkpoint molecule inhibitors), cytokine (IL-2 etc.) therapy, BRM therapy (immunostimulatory etc.), cancer vaccine therapy and the like.
  • Treatment with an immune checkpoint inhibitor includes treatment with a PD-1 inhibitor (such as nivolumab) and treatment with a CTLA-4 inhibitor (such as ipilimumab).
  • test method of the present invention uses a sample collected from a subject before cancer treatment as a test target.
  • “before cancer treatment” means before cancer treatment whose effect is to be predicted is started. That is, in the "before cancer treatment” of the present invention, before starting a new cancer treatment, before administration of a drug for cancer treatment, before administration of a drug during the continuation of cancer treatment, before changing the drug for cancer treatment, Including the period before the cancer treatment policy is changed and whether or not to stop cancer treatment.
  • test method of the present invention uses a sample collected from a subject after cancer treatment as a test target.
  • after cancer treatment means a stage in which a specific cancer treatment drug is selected, the effect of the cancer treatment drug is confirmed after a certain period of time after starting the cancer treatment. . That is, “after cancer treatment” of the present invention, before further drug administration during the cancer treatment is continued, before the change of the drug for cancer treatment, before the change of the cancer treatment policy, and the cancer treatment is stopped. Whether or not to consider.
  • sample in the screening method of the present invention, a sample collected from a B cell-containing solution cultured by stimulation with a candidate peptide for cancer vaccine is preferable.
  • the supernatant of the culture solution after stimulating the mononuclear cell-containing fraction or B cell-containing fraction obtained from human blood with a candidate peptide for cancer vaccine together with CD4 positive T cells and CD8 positive T cells can be used.
  • therapeutic effect is a concept including suppression of progression of cancer, reduction of cancer, disappearance of cancer, suppression of recurrence, suppression of metastasis, extension of survival time, and the like. Expressed by response rate, survival rate, survival time, etc.
  • the “cancer treatment” cancer in the test method of the present invention is not particularly limited, and may be any cancer. Suitable cancers include XAGE1-positive or NY-ESO-1-positive cancers. Moreover, the cancer of the peptide for cancer vaccines obtained by the screening method of the present invention is not particularly limited and may be any cancer. Suitable cancers include XAGE1-positive cancers. Examples of the cancer in the test method of the present invention and the screening method of the present invention include lung cancer, liver cancer, prostate cancer, gastric cancer, malignant melanoma, breast cancer, esophageal cancer, renal cancer, and bladder cancer. Preferable examples include lung cancer, and particularly non-small cell lung cancer. Furthermore, the test of the present invention is suitable for predicting the effects of intractable advanced stage non-small cell lung cancer treatment and advanced stage lung adenocarcinoma treatment.
  • XAGE1 (X Antigen Family, Member 1) is a known cancer testis antigen encoded by the XAGE1 gene and also known as Cancer / Testis antigen 12.1 (CT12.1). So far, five types of genes of XAGE1a-e have been identified, and the related protein is GAGED2, and it is known that there are two types of isoforms, GAGED2a and GAGED2d. To date, four alternative splice variants of XAGE 1a, b, c, d have been identified (Sato (et al., Cancer Immunity, unvol. 7, page 5 (2007)). XAGE1a and XAGE1b encode an XAGE1 (GAGED2a) protein consisting of 81 amino acids, and XAGE1d encodes an XAGE1 (GAGED2d) protein consisting of 69 amino acids.
  • the amino acid sequence of XAGE1 is known for various animal species.
  • the sequence of human XAGE1 (GAGED2a) is provided as NCBI Reference Sequence: NP_00109101073.2 and NP_00109101063.2
  • the sequence of human XAGE1 (GAGED2d) is provided as NCBI Reference Sequence: NP_001091074.
  • Human XAGE1 (GAGED2a): (SEQ ID NO: 3) mespkkknqq lkvgilhlgs rqkkiriqlr sqcatwkvic kscisqtpgi nldlgsgvkv kiipkeehck mpeageeqpq v
  • the anti-XAGE1 antibody to be measured in the test method or screening method of the present invention is an antibody against XAGE1 (GAGED2a) (hereinafter simply referred to as XAGE1).
  • the method for detecting the anti-XAGE1 antibody that is the detection target of the test method or screening method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method for detecting binding to an antigen.
  • the antigen to be bound may be full-length XAGE1 or a partial peptide consisting of a part of the amino acid sequence. Preferably, full length XAGE1 is used.
  • One embodiment of the test method or screening method of the present invention detects an IgG type anti-XAGE1 antibody.
  • an IgG type anti-XAGE1 antibody XAGE1-IgG
  • an IgA type anti-XAGE1 antibody XAGE1-IgA
  • the labeled anti-human IgG antibody can be used.
  • the method for detecting an IgA type antibody is not particularly limited.
  • a labeled anti-human IgA antibody can be used.
  • One embodiment of the test method or screening method of the present invention includes a step of detecting XAGE1-IgG and / or XAGE1-IgA.
  • XAGE1-IgG is a biomarker indicating that the immune response against self-tumor is enhanced
  • XAGE1-IgA is a biomarker indicating that the immune response against self-tumor is attenuated (suppressed) . It has been found for the first time that such a marker can be applied to predict the therapeutic effect of a cancer therapeutic agent.
  • NY-ESO-1 is also one of known cancer testis antigens. It is expressed in various degrees of 5-40% in various tumors including malignant melanoma, but expression is limited only in the testis in normal tissues.
  • the NY-ESO-1 protein consists of 180 amino acids and its sequence is provided as GenBank: CAA05908.1.
  • Human NY-ESO-1 (SEQ ID NO: 4) mqaegrgtgg stgdadgpgg pgipdgpggn aggpgeagat ggrgprgaga arasgpggga prgphggaas glngccrcga rgpesrllef ylampfatpm eaelarrsla qdapplpvpg vllkeftvsg niltirltaa dhrqlqlsis sclqqlsllm witqcflpvf laqppsgqrr
  • the method for detecting the anti-NY-ESO-1 antibody that is a detection target in the test method or screening method of the present invention is not limited, and examples include a method for detecting binding to an antigen.
  • the antigen to be bound may be full-length NY-ESO-1 or a partial peptide consisting of a part of the amino acid sequence. Preferably, full length NY-ESO-1 is used.
  • an IgG type anti-NY-ESO-1 antibody is detected. Furthermore, an IgA type anti-NY-ESO-1 antibody may be detected.
  • the method for detecting an IgG type antibody is not particularly limited. For example, a labeled anti-human IgG antibody can be used.
  • the method for detecting an IgA type antibody is not particularly limited. For example, a labeled anti-human IgA antibody can be used.
  • MAEL, BAGE, BORIS, MAGE-B3 and SSX4 are also known cancer testis antigens. It is expressed to various degrees in various tumors, but in normal tissues, expression is limited only to the testis.
  • p53 is known as a tumor suppressor protein.
  • anti-MAEL anti-BAGE antibody
  • anti-BORIS antibody anti-MAGE-B3 antibody
  • anti-SSX4 antibody anti-p53 antibody
  • anti-p53 antibody detection targets in the test method or screening method of the present invention.
  • a method for detecting binding is mentioned.
  • the antigen to be bound may be a full length or a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence.
  • IgG type anti-MAEL, anti-BAGE antibody, anti-BORIS antibody, anti-MAGE-B3 antibody, anti-SSX4 antibody and anti-p53 antibody are detected.
  • an IgA type antibody may be detected.
  • the labeled anti-human IgG antibody can be used.
  • the method for detecting an IgA type antibody is not particularly limited.
  • a labeled anti-human IgA antibody can be used.
  • the method for detecting an antibody against each CT antigen or anti-p53 antibody is not particularly limited as long as it can measure the amount, concentration or antibody titer of the antibody, and can be measured using a technique known in the art. For example, it can be measured by ELISA method, radioimmunoassay, immunoprecipitation method, affinity column method and the like.
  • the “subject” in the test method of the present invention is not particularly limited and is widely used in general mammals (human, mouse, rat, monkey, dog, cat, cow, horse, pig, sheep, goat, rabbit, hamster, etc. ), But preferably a human.
  • the subject is a human, not only a cancer patient or a patient suspected of having cancer, but also a healthy person can be a subject.
  • the sex, age, etc. of the subject are not particularly limited.
  • sample in the test method of the present invention include blood (serum, plasma, blood cells, etc.), urine, feces, sputum, chest / ascites, bronchoalveolar lavage fluid, peritoneal lavage fluid, biopsy tissue, and surgical excision. And the like.
  • a preferable sample includes serum.
  • At least one selected from the group consisting of the following 1) to 4) is determined to be effective for cancer treatment.
  • 1) antibody against cancer testis antigen or anti-p53 antibody is positive
  • 2) An antibody against an IgG type cancer testis antigen or an anti-p53 antibody is positive
  • 3) Antibody against IgG type cancer testis antigen or anti-p53 antibody is positive
  • antibody against IgA type cancer testis antigen or anti-p53 antibody is negative
  • Antibodies against multiple cancer testis antigens are positive.
  • an antibody against a CT antigen or an anti-p53 antibody when an antibody against a CT antigen or an anti-p53 antibody is positive, it is determined that there is an effect of cancer treatment.
  • Preferred examples include anti-XAGE1 antibody, anti-NY-ESO-1 antibody, anti-MAEL antibody, anti-BAGE antibody, anti-BORIS antibody, anti-MAGE-B3 antibody, anti-SSX4 antibody, and anti-p53 antibody.
  • the antibody against the CT antigen or the anti-p53 antibody is an IgG type antibody.
  • Preferable specific examples include XAGE1-IgG or NY-ESO-1-IgG.
  • an antibody against an IgG type CT antigen or an anti-p53 antibody when an antibody against an IgG type CT antigen or an anti-p53 antibody is positive and an antibody against an IgA type CT antigen or an anti-p53 antibody is negative, it is determined that there is an effect of cancer treatment. Is done.
  • Preferable specific examples include a case where XAGE1-IgG or NY-ESO-1-IgG is positive and XAGE1-IgA is negative.
  • XAGE1-IgG is positive, and XAGE1- The case where IgA is negative is mentioned.
  • An antibody against CT antigen or anti-p53 antibody is positive when the amount, concentration or antibody titer of the antibody against CT antigen or anti-p53 antibody is greater than or equal to a cutoff value, and negative is an antibody against CT antigen Alternatively, the amount, concentration or antibody titer of the anti-p53 antibody is below the cut-off value.
  • the cut-off value may be, for example, an antibody titer 10 to 1000 times that of a healthy person, an antibody titer 20 to 500 times, or an antibody titer 50 to 200 times. It may be 100 times.
  • the cut-off value may be set as the average of serum of 50 or more healthy adults + 3SD.
  • the amount, concentration or antibody titer of XAGE1-IgG or NY-ESO-1-IgG is equal to or higher than the cutoff value, it is determined that there is an effect of cancer treatment.
  • One embodiment of the test method of the present invention includes a step of detecting an antibody against a CT antigen or an anti-p53 antibody in a sample.
  • the sample is a sample collected from a subject before cancer treatment.
  • antibodies against the CT antigen include anti-XAGE1 antibody and anti-NY-ESO-1 antibody. More preferable specific examples include XAGE1-IgG, a combination of XAGE1-IgG and XAGE1-IgA, a combination of NY-ESO-1-IgG and a combination of NY-ESO-1-IgG and XAGE1-IgA.
  • the amount, concentration or antibody titer of XAGE1-IgA in the same sample as the step of detecting the amount, concentration or antibody titer of XAGE1-IgG in a sample collected from a subject is determined. Detecting. The presence of XAGE1-IgA indicates that immunity is suppressed, so that the amount, concentration or antibody titer of XAGE1-IgG is not less than the cutoff value, and XAGE1-IgA is not more than the cutoff value Therefore, it can be determined that there is an effect of cancer treatment.
  • XAGE1-IgG is a biomarker indicating that the immune response to self-tumor is enhanced.
  • IgA positive regulatory B cells were found to increase in the local cancer area, and XAGE1-IgA becomes a biomarker indicating that the immune response against self-tumor is attenuated.
  • XAGE1-IgA reaction is observed in about half of patients having XAGE1-IgG.
  • the screening method of the present invention includes, for example, a step of stimulating B cells isolated from human blood with a vaccine candidate peptide and a step of detecting an antibody against CT antigen or anti-p53 antibody in the culture supernatant.
  • the method further includes a step of determining that the candidate peptide has an effect of cancer treatment when the antibody against the CT antigen or the anti-p53 antibody is positive.
  • the method includes a step of determining that the candidate peptide has an effect of cancer treatment when XAGE1-IgA is negative and XAGE1-IgG or NY-ESO-1-IgG is positive.
  • the antibody against the CT antigen to be examined is not particularly limited, but preferably an anti-XAGE1 antibody, an anti-NY-ESO-1 antibody, an anti-MAEL antibody, an anti-BAGE antibody, an anti-BORIS antibody, an anti-MAGE-B3 antibody or an anti-SSX4 antibody including.
  • a patient in which antibodies against a plurality of CT antigens are detected has an immune response to multiple antigens and is in an immunostimulated state, and cancer treatment such as immunotherapy is successful.
  • the plurality should just be 2 or more, Preferably it is 3 or more.
  • limiting in an upper limit, 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less etc. are mentioned specifically from the complexity of a test
  • an antibody against anti-CT antigen or anti-p53 antibody as an index (by detecting an immune response against CT antigen or p53), preferably by using anti-XAGE1 antibody or anti-NY-ESO-1 antibody as an index
  • Anti-XAGE1 antibody or anti-NY-ESO-1 antibody positive clearly distinguishes the effect of anti-PD-1 antibody therapy from known biomarkers. In particular, it has become possible to clearly identify successful cases of immune checkpoint molecule inhibitors. Even if PD-L1 expression was positive, the response rate was 30%, and even if it was negative, the response rate was 10%. Therefore, it is epoch-making that these biomarkers can clearly identify the response rate. .
  • a preferred vaccine is a vaccine comprising a CT antigen, more preferably at least one CT antigen selected from the group consisting of XAGE1, NY-ESO-1, MAEL, BAGE, BORIS, MAGE-B3 and SSX4 or these antigens It is a vaccine containing the peptide which consists of one part.
  • the invention relating to the reagent kit includes a CT antigen, a peptide comprising a part of a CT antigen, p53, and a carrier on which at least one selected from the group consisting of a peptide comprising a part of p53 is immobilized, an anti-human IgG antibody and a reagent kit for testing a therapeutic effect on cancer comprising a reagent containing an anti-human IgA antibody.
  • a preferred embodiment is a carrier in which at least one peptide selected from the group of XAGE1, a peptide comprising a part of XAGE1, NY-ESO-1 and a peptide comprising a part of NY-ESO-1 is immobilized.
  • a reagent kit for testing a therapeutic effect on cancer comprising a reagent containing an anti-human IgG antibody and a reagent containing an anti-human IgA antibody. This kit is a reagent kit for examining the effects of cancer treatment.
  • the peptide consisting of a part of XAGE1 is a peptide having a sequence consisting of a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • it is a peptide containing 10 or more amino acids and contains one or more epitopes.
  • the peptide consisting of a part of NY-ESO-1 is a peptide having an amino acid sequence consisting of a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • it is a peptide containing 10 or more amino acids and contains one or more epitopes.
  • the carrier on which the peptide contained in the reagent kit of the present invention is solid-phased is selected from the group consisting of CT antigen, peptide consisting of part of CT antigen, p53, and peptide consisting of part of p53. At least one is immobilized. Preferably, at least one selected from the group consisting of XAGE1, a peptide consisting of a part of XAGE1, NY-ESO-1 and a part of NY-ESO-1, is immobilized.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a plate and a stick.
  • the reagent kit of the present invention includes a reagent containing an anti-human IgG antibody and a reagent containing an anti-human IgA antibody in addition to the carrier on which the peptide is immobilized. These antibodies are preferably labeled.
  • the kit of the present invention may contain a reagent for reacting with a label, a diluent, a reagent, and a test instrument.
  • the invention relating to the peptide of the present application is at least one peptide selected from the group consisting of the following a) to f).
  • a pharmaceutically acceptable salt or solvate of the peptide d) a peptide comprising a part of XAGE1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and / or the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and / or A peptide having an
  • the amino acid sequence of the peptide of the present invention is designed based on the sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, and can be synthesized by a usual method.
  • the number of amino acids of the peptide is preferably in the range of 20-30.
  • the peptide of this invention is a peptide which can be selected by the screening of the said peptide for cancer vaccines.
  • one amino acid is substituted with an amino acid having a similar structure or characteristic such that a hydrophobic amino acid is replaced with another hydrophobic amino acid.
  • the amino acids are exchanged for identical or similar amino acids in size and chemistry so that leucine is replaced by isoleucine.
  • certain amino acid substitutions are often more tolerated than other amino acid substitutions, which are of a size between the original amino acid and its substitution.
  • Charge, polarity, and hydrophobicity often show similar correlations, which is the basis for the definition of “conservative substitution”.
  • Conservative substitutions may be defined herein as being exchanged for one of the following five groups: Group 1—A low molecular weight aliphatic, nonpolar or slightly polar residue (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Group 2-polar, negatively charged residues and their amides (Asp, Asn, Glu, Gln); Group 3-polar, positively charged residues (His, Arg, Lys); Group 4 -High molecular weight aliphatic, nonpolar residues (Met, Leu, Ile, Val, Cys); and Group 5-High molecular weight, aromatic residues (Phe, Tyr, Trp).
  • Group 1 A low molecular weight aliphatic, nonpolar or slightly polar residue (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Group 2-polar, negatively charged residues and their amides (Asp, Asn, Glu, Gln); Group 3-polar, positively charged residues (His, Arg, Lys); Group 4 -High molecular weight aliphatic, nonpolar residues
  • the C-terminus of the peptide of the present invention may be an amide or ester.
  • suitable protecting groups e.g., formyl group, C 1 such as acetyl groups - such as 6 acyl group
  • glycopeptides to which sugar chains are bound are also included.
  • part of the amino acids may be D amino acids.
  • Examples of the salt of the peptide of the present invention include physiologically acceptable acid addition salts and the like.
  • the peptide of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like. It may be a prodrug. Prodrugs can be designed to convert to the peptides of the invention under physiological conditions in vivo.
  • the peptide of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the peptide of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protective group, the target peptide is produced by removing the protective group if necessary. be able to.
  • the number of amino acids to be extended and / or deleted is a maximum of 5, preferably 4, more preferably 3, more preferably 2. More preferably, it is 1. Most preferably 0.
  • the number of conservatively substituted amino acids is 2 or 1. More preferably, it is one.
  • the number of amino acids to be extended and / or deleted is a maximum of 5, preferably 4, more preferably 3, more preferably 2. More preferably, it is 1. Most preferably 0.
  • the number of conservatively substituted amino acids is 2 or 1. More preferably, it is one.
  • Preferred peptides of the present invention include at least one peptide selected from the group consisting of the following a1) to f1).
  • a1) A peptide comprising a part of XAGE1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an extension of at most 3 amino acids on the N-terminal side and / or C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or Or a peptide having an amino acid sequence that allows deletion b1) a peptide having an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence of the a1) is conservatively substituted c1) a pharmaceutical of the peptide of the a1) or b1) Pharmaceutically acceptable salt or solvate d1) a peptide comprising a part of XAGE1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the N-terminal side and / or C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A peptide having an amino acid
  • SLP1 and SLP2 are long peptides having 25 amino acid residues.
  • SLP1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • SLP2 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • SLP1 has the 8th to 32nd amino acid sequence of XAGE1 (SEQ ID NO: 3)
  • SLP2 has the 44th to 68th amino acid sequence of XAGE1.
  • the invention relating to the composition for inducing an immune response against cancer of the present application contains at least one peptide selected from the above a) to c) and at least one peptide selected from the above d) to f). More preferably, it contains at least one peptide selected from a1) to c1) and at least one peptide selected from d1) to f1). More preferably, SLP1 and SLP2 are contained. The combined use of these peptides achieved an effect that could not be achieved alone.
  • the invention relating to an effect enhancer of immunotherapy or chemotherapy for cancer of the present application is selected from the group consisting of at least one peptide selected from the group consisting of the above a) to c) and the above d) to f).
  • composition for inducing immune response of the present invention and the effect enhancer of the present invention can also be referred to as cancer vaccines.
  • composition for inducing an immune response of the present invention is used for inducing an immune response in a mammal (for example, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, human, etc.).
  • a mammal for example, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, human, etc.
  • the composition for inducing immune response of the present invention activates humoral immunity and cellular immunity, enhances immune response against cancer, and can be used for cancer treatment.
  • the effect of cancer treatment by chemotherapy, immunotherapy, and immune checkpoint inhibitors can be increased.
  • the composition for inducing immune response according to the present invention can be used to treat XAGE1 immunity by actively inducing chemotherapy and immunotherapy, ineffective cases of treatment with an immune checkpoint molecule inhibitor, or a poor prognosis group. Can lead to good response and good prognosis groups.
  • the immune response composition of the present invention is also excellent in safety.
  • the composition of the present invention can induce an immune response against a cancer expressing XAGE1, can be used for the treatment of the cancer, and can enhance the therapeutic effect of the cancer. .
  • XAGE1 immunity can be actively induced in cases where the cancer treatment is ineffective or in a poor prognosis group, leading to a treatment success and good prognosis group.
  • the cancer to be treated include lung cancer, liver cancer, prostate cancer, gastric cancer, malignant melanoma, breast cancer, esophageal cancer, renal cancer, or bladder cancer.
  • Particularly suitable cancers include lung cancer.
  • non-small cell lung cancer and lung adenocarcinoma particularly advanced non-small cell lung cancer and lung adenocarcinoma are suitable for inducing immune responses.
  • the composition for inducing immune response of the present invention can induce the production of anti-XAGE1 antibody.
  • the production of XAGE1-IgG can be induced. Since XAGE1-IgG positive patients and treatment subjects have good prognosis and therapeutic response, the composition for inducing immune response of the present invention has a poor prognosis even by treatment with chemotherapy, immunotherapy and immune checkpoint inhibitors, Patients who are expected to be ineffective treatment can have a good prognosis and a therapeutic response.
  • the present inventors have previously prepared an epitope vaccine containing a part of 16-17 amino acids of XAGE1, but the peptide of the present invention is a long-chain peptide unlike the epitope vaccine recognized by T cells.
  • a conventional epitope vaccine comprising an epitope and further using at least one peptide selected from the group consisting of a) to c) and at least one peptide selected from the group consisting of d) to f) A stronger immune response can be induced.
  • composition for inducing immune response of the present invention may contain an adjuvant in order to enhance the immune response.
  • a pharmacologically acceptable carrier and stabilizer may be included.
  • the composition for inducing immune response according to the present invention is produced according to known means generally used in the method for producing pharmaceutical preparations, for example, as an injection, parenterally (intravenous injection, intramuscular injection, etc.). It can be safely administered.
  • Examples of the pharmacologically acceptable carrier that may be used in the production of the immune response inducing composition of the present invention include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials.
  • excipients in solid formulations include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials.
  • excipients in solid formulations include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials.
  • excipients in solid formulations include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials.
  • Lubricants, binders and disintegrants include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials.
  • solvents in liquid preparations include solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers and soothing agents.
  • additives such as conventional preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, adsorbents, wetting agents and the like can be used in appropriate amounts.
  • the prepared injection may be a liquid preparation or a solid preparation that dissolves after use.
  • the solid preparation in administration, in the case of the solid preparation, it can be dissolved in a conventional aqueous diluent and used as a liquid.
  • Aqueous diluents include glucose aqueous solution, physiological saline, Ringer's solution, nutritional supplement solution and the like.
  • the content of the peptide of the present invention varies depending on the form of the preparation, but is usually about 0.1 to 100% by weight, preferably about 10 to 99% based on the whole preparation. It is about 9% by weight, more preferably about 20 to 90% by weight.
  • the ratio of the content of at least one peptide selected from a) to c) and at least one peptide selected from d) to f) is appropriately adjusted. Examples thereof include 1: 9 to 9: 1, 3: 7 to 7: 3, and 5: 5.
  • the dose of the composition for inducing immune response of the present invention varies depending on the route of administration, symptoms, patient age, etc., for example, when administered parenterally such as intravenous administration, as a peptide per kg body weight per day About 0.005 to 50 mg, preferably about 0.05 to 10 mg can be administered.
  • the composition for inducing immune response which is one embodiment of the present invention can be administered before administration of other chemotherapy, immunotherapy, immune checkpoint molecule inhibitor.
  • the composition for inducing an immune response of the present invention can be administered 1 day to 6 months before administration of these drugs, preferably 1 week to 3 months before, more preferably 2 weeks to 2 months. In a preferred embodiment, it can be administered 28 days to 3 months prior to administration of the immune checkpoint molecule inhibitor.
  • the present invention also stimulates CD4 positive T cells or CD8 positive T cells obtained from the peripheral blood of a patient with SLP1 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 and SLP2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2.
  • a method for preparing activated CD4 positive T cells or activated CD8 positive T cells, comprising a step of culturing.
  • CD4-positive T cells or CD8-positive T cells are separated from peripheral blood mononuclear cells, and subjected to stimulation culture in the presence of SLP1 and SLP2 for 3 to 21 days, preferably 7 to 18 days. Thereafter, it can be obtained by restimulation with SLP1 and / or SLP2 together with antigen-presenting cells for 3 to 24 hours, preferably 6 to 18 hours.
  • concentrations of SLP1 and SLP2 during stimulation culture are each 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.1 to 1 ⁇ M.
  • the obtained activated CD4-positive T cells and activated CD8-positive T cells can be used for cell therapy. For example, it can be administered to a patient who has provided peripheral blood and used for adoptive immunotherapy.
  • the blood used in the examples was provided with informed consent from a patient before cancer treatment.
  • XAGE1 protein (81 amino acids, SEQ ID NO: 3) was synthesized by GL Biochem (Shanghai, China). The synthesized XAGE1 protein is purified with an HPLC column, and it is confirmed that the purity is 90% or more.
  • XAGE1 carbonate buffer, pH 9.6
  • XAGE1 carbonate buffer, pH 9.6
  • a washing solution PBS / 0.1% TWEEN
  • FCS / PBS 5% FCS / PBS was added and blocking was performed at 37 ° C. for 1 hour.
  • serum diluted 100 times, 400 times, 1600 times, and 6400 times was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • a peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibody (diluted 5000 times) (manufactured by Jackson) or a peroxidase-conjugated goat anti-human IgA antibody (diluted 8000 times) (manufactured by Jackson) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. The reaction was carried out for 1 hour. After completion of the reaction, the substrate was washed with a washing solution, and a substrate solution (a solution in which orthophenylenediamine was dissolved in 0.05 M citrate buffer (pH 5.0)) was added to cause color development.
  • a substrate solution a solution in which orthophenylenediamine was dissolved in 0.05 M citrate buffer (pH 5.0)
  • the antibody titer was calculated by a general method for obtaining the antibody titer (Autoantibodies against Cancer Antigen: Sacha Gnjastic, Lloyd J. Old, Yao-Tseng Chen). Both IgG and IgA were positive when the antibody titer was 100 times or more that of normal human control serum, and less than 100 times was negative.
  • NY-ESO-1 180 amino acids, SEQ ID NO: 4
  • NY-ESO-1-IgG was detected by the same method as that for detecting XAGE1-IgG.
  • Each CT antigen or p53 was obtained from Okayama University in a state immobilized on beads (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2076-2084). Each CT antigen or p53 was detected by the same method as the method for detecting the XAGE1 antibody.
  • XAGE1-IgG positive persons were 33 cases (22.7%), and XAGE1-IgA immune response was confirmed in about half (15.3%) of them (FIG. 1). This was much more frequent than the immune response to MAGE-A3, SSX-2, NY-ESO-1, TP53 antigens, which are said to be highly immunogenic in lung cancer (IgG response to each antigen: (4.1%, 1.4%, 6.2%, 8.3%, IgA reaction: 0.7%, 0.7%, 0.7%, 4.1%) (FIG. 2). All XAGE1-IgA positive patients were XAGE1-IgG positive.
  • XAGE1-IgA immune response attenuated the immune response against self-tumor (XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA positive group). Furthermore, XAGE1-immune negative cases (XAGE1-IgG negative and XAGE1-IgA negative groups) showed almost no immune response against self-tumor. As shown in FIG. 3B, XAGE1-IgG-positive and XAGE1-IgA-negative individuals have an immune response to multiple cancer antigens compared to XAGE1-IgG-positive and XAGE1-IgA-positive subjects and have an immune response against cancer. Potentially high condition (immune activation state).
  • XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA positive individuals are more immunoreactive than XAGE1-IgG negative and XAGE1-IgA negative subjects, but immunoreactivity is suppressed more than XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative subjects. It is in a state.
  • TGF- ⁇ which is an immunosuppressive cytokine
  • IL-6 which is a poor prognostic factor and increases during immune exhaustion, is significantly higher in XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA positive compared to XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative, Compared to XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative persons, XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA positive persons are considered to be immune exhausted.
  • FIG. 5 shows that such locally accumulated IgA + B cells themselves produce IL-10, an immunosuppressive cytokine (FIG. 5F).
  • IgA + B cells are thought to be involved in local immune suppression and accumulation of regulatory T cells (local IL-10 is involved in accumulation).
  • immune checkpoint molecules molecules that suppress T cell function
  • PD-L1 + GAL ⁇ that highly expressed immune checkpoint molecules PD-L1 and Galectin-9 were analyzed. It was confirmed that 9 + IgA + B cells were significantly accumulated locally in the cancer (FIG. 6).
  • immunosuppressive cytokines (IL-6, IL-10, etc.) are produced in XAGE1-IgG + IgA + patients due to tumor genetic abnormalities, etc. It is considered that IgA + B cells (regulatory B cells) accumulate. IgA + B cells suppress their immunity indirectly by locally accumulating regulatory T cells in addition to their own IL-10 production and direct suppression of T cell functions by immune checkpoint molecules it seems to do.
  • the group with no XAGE1 expression for 1 month had a median survival time of 13.6 months, and it was revealed that the XAGE1-IgG positive group significantly prolonged the median survival time.
  • the prolongation of the median survival time was remarkable (FIG. 7).
  • the XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative groups are XAGE1-IgG positive and It was revealed that the response rate of the initial chemotherapy was significantly higher than the XAGE1-IgA positive group and the group without immune response (FIG. 8).
  • Anti-PD-1 antibody therapy which is an immune checkpoint molecule inhibitor, using immune response to highly immunogenic XAGE1 and NY-ESO-1 (with or without immune response to XAGE1 or NY-ESO-1) as an index Of 53 patients with advanced stage non-small cell lung cancer.
  • Patient sera were collected approximately 28 days before starting anti-PD-1 antibody therapy.
  • immune response to XAGE1 (XAGE1-IgG positive) or immune response to NY-ESO-1 (NY-ESO-1-IgG positive) group 16 cases
  • No immune response group (no antibody to XAGE1 and NY-ESO-1) Group) 37 cases
  • Fig. 9 shows the maximum change rate of the target lesion.
  • CR complete response
  • PR partial response
  • SD stable
  • PD pathological progression
  • progression-free survival (OverallOverSurvival) and overall survival (Overall Survival) in the group with and without immune response to XAGE1 or NY-ESO-1. Progression-free survival and overall survival were found to be significantly different between groups with and without immune response.
  • FIG. 11 shows the results shown in FIG. 3A for the immunity against each cancer antigen in the XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative group, the XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA positive group, the XAGE1-IgG negative and the XAGE1-IgA negative group.
  • the result of analyzing the reaction is shown.
  • FIG. 11 shows, an immune reaction against MAEL antigen and p53 antigen is specifically observed in XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative persons. Therefore, those who are positive for anti-MAEL antibody and those who are positive for anti-p53 antibody are XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative, and are immunostimulated.
  • FIG. 12 is a successful example of anti-PD-1 antibody therapy, and anti-NY-ESO-1 antibody, anti-XAGE1 antibody and anti-p53 antibody were monitored. As a result, in the successful cases, an enhanced immune response to the p53 antigen was observed, and the fluctuation of the anti-p53 antibody is useful for determining the therapeutic effect of the anti-PD-1 antibody therapy.
  • ⁇ Anti-NY-ESO-1 antibody, anti-BAGE antibody and anti-BORIS antibody> The immune response to 50 cancer antigens including XAGE1 and NY-ESO-1 antibodies was analyzed using the serum before treatment of patients treated with anti-PD-1 antibody therapy.
  • XAGE1-IgG and NY-ESO-1-IgG positive individuals have an immune response against multiple antigens as shown in FIG. Further, as shown in FIG. 13B, in 3 cases out of 8 cases that succeeded in anti-PD-1 antibody, the immune response to BAGE antigen or BORIS antigen was significantly positive (0 out of 12 cases in non-response cases)
  • the effect of anti-PD-1 therapy can be predicted by detection of anti-BAGE antibody or anti-BORIS antibody.
  • FIG. 14A shows the relationship between the rate of change of target lesions due to anti-PD-1 antibody therapy (minus means tumor shrinkage) and the antibody titers of antibodies against CT antigen (XAGE1-IgG and NY-ESO-1-IgG).
  • FIG. 14B shows the relationship between the rate of change of target lesions by anti-PD-1 antibody therapy and the number of immune responses (antigen spreading) to multiple antigens after treatment.
  • the effects of anti-PD-1 therapy can be predicted by detecting antibodies against multiple CT antigens.
  • FIG. 15A shows the difference in immune response to multiple antigens before and after anti-PD-1 antibody therapy.
  • FIG. 15B shows that in the successful case of the anti-PD-1 antibody therapy, spreading of the immune response against the MAGE-B3 antigen and the SSX4 antigen was frequently observed and not in the non-successful case. Therefore, anti-MAGE-B3 antibody, actually anti-SSX4 antibody, is a factor that significantly affects the effect of anti-PD-1 antibody therapy, and is useful for predicting therapeutic effects.
  • FIG. 16 and FIG. 17 are complete successful cases of clinical trials led by anti-CCR4 antibody + anti-PD-1 antibody, preoperative combination doctors, and show the images and immune responses of the same patients.
  • FIG. 16 shows that an immune response to the SSX4 antigen was observed.
  • the image in FIG. 17 is a chest CT image, and the baseline images are CT images after administration of the study drug and before surgery for 3 weeks and 7 weeks before administration of anti-CCR4 antibody + anti-PD-1 antibody.
  • Anti-CCR4 antibody was administered 4 times before surgery, anti-PD-1 antibody was administered 3 times before surgery, and surgery was performed at 8 weeks.
  • the CT image shows that the tumor is shrinking due to immunotherapy. This patient is an example of positive anti-SSX4 antibody, and immunotherapy was effective.
  • measurement of anti-SSX4 antibody is useful as a method for predicting the effect of immunotherapy.
  • Example 2 ⁇ Synthesis of XAGE1 long chain peptide and preparation of composition for inducing immune response (vaccine)>
  • SLP1 is a peptide consisting of positions 8-32 of XAGE1 (a protein consisting of 81 amino acids)
  • SLP2 is a peptide consisting of positions 44-68. It has been confirmed that the purity of each of SLP1 and SLP2 is 99% or more.
  • SLP1 amino acid sequence SEQ ID NO: 1: NQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQ SLP2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 2): ISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEH SLP1 and SLP2 obtained above were mixed to obtain a composition for inducing immune response (vaccine).
  • XAGE1 antibody positive patients XAGE1-IgG positive and XAGE1-IgA negative patients
  • a magnetic cell separation method manufactured by Militenny Biotech
  • CD4 positive T cells 1 ⁇ 10 6 and 40 Gy irradiated CD4 negative CD8 negative cells 1 ⁇ 10 6 in 96 ⁇ l U bottom culture plate with 200 ⁇ l of AIM culture medium containing 2% serum (including IL-2 and IL-7) SLP1 and SLP2 were each stimulated for 14 days in the presence of 1 ⁇ M.
  • 200 ⁇ l of AIM culture medium containing 2% serum (including IL-2 and IL-7) was used unless otherwise specified.
  • T-APC cells In order to use as antigen-presenting cells, a part of patient CD4-positive T cells obtained in a was stimulated with PHA to prepare T-APC cells.
  • T-APC 1 ⁇ 10 4 (30 ⁇ l) prepared as antigen-presenting cells was collected from the 96-well plate after 14 days of stimulation culture with b1 above in a new 96-well plate for 30 ⁇ l each for SLP1 and SLP2 restimulation and non-stimulation. ) was added to each well. Furthermore, SLP1 and SLP2 were added to SLP1 and SLP2 restimulation wells so that each amount was 1 ⁇ M and restimulated for 12 hours.
  • IFN ⁇ in the 96-well culture supernatant was detected by ELISA.
  • the IFN ⁇ activity of the culture supernatant stimulated with SLP1 and SLP2 is compared with that of the unstimulated culture supernatant, and antigen-specific T cells exist in wells with strong activity. Cloned.
  • the cloned cells were screened again by the method b3 to b5, and SLP1 or SLP2-specific CD4 positive T cell clones (hereinafter also referred to as CD4 clones) were selected to obtain a plurality of T cell clones.
  • the obtained clone T cells were proliferated by PHA stimulation and cryopreserved.
  • One of the CD4 clones obtained is 4C34-1.
  • CD8 clones SLP1 or SLP2 specific CD8 positive T cell clones (hereinafter also referred to as CD8 clones) were prepared in the same manner as b above. One of the resulting CD8 clones is 8C34TY.
  • T cells 2 ⁇ 10 4 of CD4 clone or CD8 clone were stimulated and cultured with the same number of T-APC for 12 hours so that each peptide was 1 ⁇ M, and IFN ⁇ in the supernatant was detected by ELISA.
  • the results are shown in FIG.
  • the CD4 clone 4C34-1 recognized amino acids 52-68 among SLP2 (44-68).
  • CD8 clone 8C34TY recognizes SLP1 (8-32) and amino acids at positions 19-33, and an epitope is considered to exist in this.
  • SLP1 and SLP2 succeeded in detecting a plurality of CD4 T cells and CD8 T cells that recognize SLP1 and SLP2 by stimulating and culturing peripheral blood mononuclear cells of anti-XAGE1 antibody-positive patients. This indicates that SLP1 and SLP2 vaccines are multi-antigenic cancer vaccines containing various epitopes, unlike epitope vaccines recognized by T cells.
  • CD4 clone (4C34-1) T cells 1 ⁇ 10 4 were stimulated with SLP1 alone (1 ⁇ M), SLP2 alone (1 ⁇ M) or a combination of each peptide (1 ⁇ M each) together with the same number of T-APCs.
  • CD4 clone T cells recognized SLP2.
  • CD8 clone (8C34TY) T cells 1 ⁇ 10 4 were stimulated and cultured with SLP1 alone (1 ⁇ M), SLP2 alone (1 ⁇ M), or each peptide combination (1 ⁇ M each) together with the same number of T-APCs.
  • CD8 clone T cells recognized SLP1.
  • Peripheral blood mononuclear cells 1 ⁇ 10 5 obtained in (a) above were present (500-fold dilution) in the presence of CD4 clone 4C34-1T cells 2 ⁇ 10 4 , CD8 clone C34TYT cells 2 ⁇ 10 4 and Protein Transport Inhibitor Cocktail (eBioscienc, USA).
  • SLP1 alone (1 ⁇ M), SLP2 alone (1 ⁇ M), or each peptide combination (1 ⁇ M each) was stimulated for 12 hours.
  • B cells were gated by flow cytometry, and IgG or IgA on the surface of B cells was detected under the stimulation of each peptide (FIG. 21). Increased expression of IgG on the surface of B cells was observed when SLP1 and SLP2 were used in combination. On the other hand, there was no change in the expression level of IgA.
  • XAGE1-specific antibody present in the culture supernatant When an XAGE1-specific antibody present in the culture supernatant was detected, XAGE1-IgG was detected when SLP1 and SLP2 were used in combination, and IgA was not observed (FIG. 22).
  • the composition containing SLP1 and SLP2 is a cancer vaccine that can induce the production of XAGE1-IgG and induce an immune response against cancer. Since XAGE1-IgG positivity is a treatment success group and a good prognosis group, the composition containing SLP1 and SLP2 can lead a patient to a treatment success and a good prognosis.
  • the dosage of the test substance was 2 mg / kg (SLP1: 0.2 mg / kg + SLP2: 0.2 mg / kg) and 2 mg / kg (SLP1: 2 mg / kg + SLP2: 2 mg / kg).
  • SLP1 and SLP2 dissolved in water for injection and picibanil were mixed with an equal amount of oil adjuvant MONTANIDE ISA 51 VG (ISA51) to form an emulsion and administered subcutaneously in the back at a dose volume of 1 mL / kg.
  • ISA51 oil adjuvant MONTANIDE ISA 51 VG
  • a vehicle control group for administering water for injection and an emulsion of picibanil and ISA51 and a physiological saline control group for administering physiological saline were provided.
  • SLP1 and SLP2 were emulsified with Montanide (ISA51, manufactured by SEPPIC) together with adjuvant OK432 picibanil to obtain a composition for inducing immune response (hereinafter also referred to as XAGE1 vaccine). More specifically, a mixed peptide consisting of two kinds of long-chain peptides prepared in GMP grade was prepared in three stages.
  • the test was conducted on the advanced stage or postoperative recurrent lung adenocarcinoma using the above three doses of XAGE1 vaccine. Each time the XAGE1 vaccine was administered to two different sites on the limb. Administration was performed 4 times at intervals of 2 weeks. Three doses were administered for each dose.
  • Adverse events are graded using the Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v4.0 Japanese translation JCOG version. Adverse events were determined according to CTCAE v4.0. The observation period for adverse events was from the first day of study drug administration to 6 weeks after the last administration (end of individual study).
  • CTCAE Common Terminology Criteria for Adverse Events
  • the safety evaluation was completed in 7 cases, 3 cases in the low dose group, 3 cases in the medium dose group, and 1 case in the high dose group. As shown in Table 1, all adverse events caused by XAGE1 vaccine were minor and no serious adverse events were observed.
  • XAGE1-IgG antibody titer was increased by administration of XAGE1 vaccine, and XAGE1-IgA and NY-ESO-1-IgG were not induced (FIG. 23).
  • XAGE1-IgA was positive (KMX-01) in 1 of 7 cases before treatment, but negative in the other cases.
  • the XAGE1 vaccine did not increase the XAGE1-IgA antibody titer. From the above, the specific induction of XAGE1-IgG immunity by SLP1 and SLP2 observed in vitro was also observed in vivo.
  • Tumor Marker As shown in FIG. 24, inhibition or decrease in tumor marker elevation was observed in 4 of 7 cases. a. In 2 out of 3 cases of the XAGE1 vaccine low-dose group, inhibition of tumor marker elevation was observed. b. A decrease in tumor marker was observed in 2 out of 3 patients in the XAGE1 vaccine medium dose group. c. In 3 of 4 cases in which the XAGE1-IgG antibody titer increased, tumor marker elevation was suppressed or decreased. On the other hand, an increase in tumor marker was observed in 2 out of 3 cases in which no increase in XAGE1-IgG antibody titer was observed. From the above, it was observed that tumor marker elevation was suppressed or decreased by the XAGE1 vaccine.
  • CD4-positive T cells were isolated from the peripheral blood of low-dose and medium-dose patients and examined for induction of antigen-specific T cells by XAGE1 vaccine administration. In both low-dose and medium-dose patients, it was demonstrated that IFN- ⁇ was produced by the combined stimulation of SLP1 and SLP2, and T cells reactive to SLP1 and SLP2 antigens were induced ( FIG. 25, FIG. 26).
  • the XAGE1 vaccine containing SLP1 and SLP2 is a vaccine that can induce antigen-specific T cells in cancer patients, and is also a multi-antigenic vaccine containing multiple epitopes, and mixes SLP1 and SLP2. Thus, it was proved in vivo that the vaccine can induce a stronger immune response.
  • the experimental protocol is as follows. a) A mononuclear cell fraction was obtained from peripheral blood 12 weeks after the start of vaccine administration by specific gravity centrifugation. Subsequently, using an anti-CD4 antibody-bound bead, an anti-CD8 antibody-bound bead, and an anti-CD19 antibody-bound bead (manufactured by Miltenyi Biotech), a CD8 positive fraction is sequentially obtained by magnetic cell separation (MACS, Miltenyi Biotech). CD4 positive fraction, CD19 positive fraction and CD4 ⁇ CD8 ⁇ CD19 ⁇ fraction were separated.
  • Detection of IFN- ⁇ producing cells The cell population containing antigen-specific T cells proliferated in the stimulation culture was subjected to secondary stimulation as described below to detect production of antigen-specific cytokines.
  • the same number of autologous EBV-B cells (Epstein-Barr virus-infected B cells: used as antigen-presenting cells) and peptides (SLP1, SLP2 or SLP1 + SLP2) are added to the cells after stimulation culture at 37 ° C. Secondary stimulation was performed in a CO 2 incubator for 4 hours. As a control, secondary stimulation was performed in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 4 hours without adding a peptide.
  • the cultured cells are suspended in 10 ml of AIM-V medium, and a rotator (Maxmix, manufactured by Millitney Biotech). ) And suspended in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the detection method of the present invention can predict the effect of cancer treatment and expands the possibility of cancer treatment. It also contributes to the medical economy.
  • the composition for inducing immune response according to the present invention can be directly used for cancer treatment, enhances the effect of treatment with chemotherapy, immunotherapy, immune checkpoint inhibitor, and treats treatment invalidity effectively. Can lead to.

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Abstract

【課題】新規ながん治療効果の検査方法、がんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法、並びにがんに対する免疫応答誘導用ペプチドおよび組成物を提供する。 【解決手段】試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とするがん治療効果の検査方法およびがんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法を提供する。好適には、抗ＸＡＧＥ１抗体（ＩｇＧ及び／又はＩｇＡ）を検出、又は、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体（ＩｇＧ）を検出する。さらに、がんに対する免疫応答を誘導する新規ペプチドと新規組成物を提供する。

Description

がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物
　本発明は、がん治療の効果の予測若しくは予後予測のための検査と免疫応答誘導ペプチドの利用に関する。
　本邦での肺癌の罹患者数は１１万人であり、２０１３年の主な部位別がん死亡数で第１位を占めている。組織型は小細胞肺癌（１０％）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（９０％）に大別され、非小細胞肺癌の中では肺腺癌が７０－８０％を占める。治療法としては、外科療法、放射線療法、化学療法があり、化学療法としては、チロシンキナーゼ阻害薬やプラチナ製剤を中心とした多剤併用療法が施行される。中央生存期間（ＯＳ）は小細胞肺癌で約１２ヶ月、非小細胞肺癌では約３０ヶ月である。
　近年、進行期ＮＳＣＬＣの１次、２次治療で、免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法（ニボルマブ、ペムブロリズマブ）が、標準治療に対し、有意に高い奏効率又は全生存期間の延長を認め、現在、日本、米国、欧州連合で抗ＰＤ－１抗体療法が実施されている。
　免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例に対する有用なバイオマーカーは、腫瘍及び腫瘍内の免疫担当細胞に発現するＰＤ－Ｌ１分子であるが、ＰＤ－Ｌ１高発現群であっても奏効率は３０－４０％程度であり、さらに免疫チェックポイント分子阻害薬は非常に高額であることから、新たなバイオマーカーの同定が待ち望まれている。
　さらに、免疫チェックポイント阻害薬以外の、より強い抗腫瘍効果を有する新規治療法の開発が望まれている。
　これまでに我々は、肺癌の中で最も多い肺腺癌に発現するＸＡＧＥ１抗原を同定した。ＸＡＧＥ１抗原は進行期肺腺癌の４０－５０％に発現し、ＸＡＧＥ１抗原が発現している約半数の患者でＸＡＧＥ１に対する抗体（ＩｇＧ）反応が観察され、ＸＡＧＥ１に対する抗体（ＩｇＧ）陽性者は予後が延長することを明らかにしてきた（非特許文献１、２）。
　ＸＡＧＥ１抗原はがん精巣抗原のひとつである。がん精巣抗原（ＣＴ抗原）は、多くのがんに発現するが、正常組織では精巣のみに発現する抗原の総称であり、数多くのＣＴ抗原が知られている（非特許文献３、４）。
　既治療肺扁平上皮癌を対象としてニボルマブとドセタキセルを比較した第III相臨床試験のＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０１７試験での奏効率は、ニボルマブ群で３６％、ドセタキセル群で３１％であった。主要評価項目である中央生存期間（以下、ＯＳともいう）において、ニボルマブ群で9.2ヶ月、ドセタキセル群で6.0ヶ月と有意な延長を示した。また、既治療非扁平上皮非小細胞肺癌を対象としたニボルマブとドセタキセルを比較する同様のＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０５７試験での奏効率は、ニボルマブ群で１９％、ドセタキセル群で１２％であった。主要評価項目であるＯＳにおいて、ニボルマブ群で１２．２ヶ月、ドセタキセル群で９．４ヶ月と有意な延長を示し、前治療歴を有する切除不能又は転移性の非小細胞肺癌においてニボルマブの単剤治療はドセタキセルと比較して、ニボルマブの有効性が証明された。
　病勢進行率において、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０１７試験、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０５７試験で、ニボルマブ群はドセタキセル群と比較して有意ではないもののそれぞれ、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０１７試験では、ニボルマブ群３３％、ドセタキセル群３０％、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０５７試験では、ニボルマブ群４４％、ドセタキセル群２９％であった。
　またバイオマーカー検索として、腫瘍発現ＰＤ－Ｌ１の多寡とＯＳ関係が検討され、ＰＤ－Ｌ１低発現又は陰性腫瘍は、ＯＳの改善は乏しかった。
　もう一つの抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブは、既治療の非小細胞肺癌を対象に、ＫＥＹＮＯＴＥ－００１、ＫＥＹＮＯＴＥ－０１０試験においてその有用性が検討された。ＫＥＹＮＯＴＥ－００１試験での、全体の奏効率は１８－２０%であり、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍で１９－２３%、ＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍においても９－１３％で奏功を認めた。ＫＥＹＮＯＴＥ－０１０試験では、腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現が１％以上を対象としてペムブロリズマブとドセタキセルを比較する第III相臨床試験で、奏効率は、ペムブロリズマブ群で１８．０％－１８．５％であり、ドセタキセル群は９．３％であった。ＯＳは、ペムブロリズマブ群で１０．４ヵ月－１２．７ヵ月であり、ドセタキセル群は８．５ヵ月であったことから、ドセタキセル群と比較してペムブロリズマブ群が有意にＯＳの延長を認めた。無増悪生存期間（ＰＦＳ）はドセタキセル群と比較し、有意な差を認めなかった。腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現が５０％以上の患者では、奏効率は、ペムブロリズマブ群で２９．１％－３０．２％、一方、ドセタキセル群は７．９％であった。ＯＳはペムブロリズマブ群で１４．９ ヵ月－１７．３ヵ月であり、腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現が５０％以上の患者集団においては、ＰＦＳもドセタキセル群と比較し有意に改善した。その為、腫瘍ＰＤ－Ｌ１高発現腫瘍においては、ペムブロリズマブの高い抗腫瘍効果と予後を延長することが明らかとなった。
　抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブもニボルマブやペムブロリズマブと同様に既治療非小細胞肺癌を対象とし、単剤投与の効果をみたＢＩＲＣＨ試験、さらにドセタキセルと比較する第II相臨床試験のＰＯＰＬＡＲ試験において、ＯＳはアテゾリズマブ群で１２．６ヶ月、ドセタキセル群９．７ヶ月と有意な延長効果を示した。さらにがん免疫微小環境で、腫瘍若しくは腫瘍浸潤免疫細胞でＰＤ－Ｌ１が発現している場合は、ＯＳが１５．１－１５．５ヶ月と、さらに予後を延長することが示された。また、がん免疫微小環境でＰＤ－Ｌ１が高発現しているアテゾリズマブ群の奏効率は３８％であり、ＰＤ－Ｌ１発現がないがん免疫微小環境のドセタキセル群では１５％程度にとどまった。既治療非小細胞肺癌を対象としドセタキセルと比較する第III相試験のＯＡＫ試験でも、ＰＯＰＬＡＲ試験と同様の結果が観測されている。
　以上のように、現時点での免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例に対するバイオマーカーは、腫瘍若しくは腫瘍内の免疫担当細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現が有用であると考えられている。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１高発現（１％以上若しくは５０％以上）であっても、免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功率は３０－４０％であり、またＰＤ－Ｌ１低発現又は陰性症例でも１０％前後の奏功例が認められている。
　さらに、それぞれの免疫チェックポイント分子阻害薬（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ）で、独自のコンパニオン診断法（ＰＤ－Ｌ１発現解析）が施行され、臨床現場では混乱を来している。
特許第５７０９１０８号 国際公開ＷＯ２０１６／１８１９１２
Ohue Y, et al. Clin Cancer Res. 20(19), 5052-5063 (2014) Ohue Y, et al. Cancer Immunol Res. 4(12), 1049-1060 (2016) Hofmann O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 23; 105(51), 20422-7 (2008) Wang C, et al. Nat Commun. 2016 Jan 27;7:10499
　本発明は、がん治療の効果を的確に予測できる、又は的確な予後予測を可能にする検査方法を提供することを課題とする。また、がん免疫応答を誘導する新規ペプチド、新規組成物及びそのペプチドのスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することにより、がんの治療効果を予測または確認できることを見いだした。好適には、がん治療前にＩｇＧタイプのＸＡＧＥ１抗体（以下、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧとも記載する）及びＩｇＡタイプのＸＡＧＥ１抗体（以下、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡとも記載する）、又はＩｇＧタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体（以下、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧとも記載する）ががん治療の治療効果の予測及び予後予測の指標になることを見出した。また、新規がんワクチン用ペプチドおよびその組成物を見いだした。さらに、がんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法を見いだした。即ち、本発明は下記の態様を包含する。
１．試料中のがん精巣抗原に対する抗体を検出することを特徴とする、がん治療効果の検査方法。
２．前記がん精巣抗原が、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つのがん精巣抗原である、前項１に記載の方法。
３．ＩｇＧタイプの抗体とＩｇＡタイプの抗体を検出する、前項１または２に記載の検査方法。
４．前記試料ががん治療前の被験体から採取された試料であり、該がん治療の効果を予測するための検査である、前項１～３のいずれか１に記載方法。
５．試料中の抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする、がん治療効果の検査方法。
６．以下の１）～４）からなる群から選択される少なくとも１の場合に、がん治療の効果があると判定される、前項１～５のいずれか一に記載の方法；
　１）がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
　２）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
　３）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である、
　４）複数のがん精巣抗原に対する抗体が陽性である。
７．がん精巣抗原、がん精巣抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、及び抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キット。
８．以下のａ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド；
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｂ）前記ａ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｃ）前記ａ）又はｂ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｅ）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｆ）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物。
９．前項８に記載のａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するがんに対する免疫応答誘導用組成物。
１０．前記がんが、ＸＡＧＥ１陽性の肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、又は、膀胱癌である前項９に記載の組成物。
１１．免疫療法前又は化学療法前に投与される、前項９または１０に記載の組成物。
１２．前項８に記載のａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するがんに対する免疫療法若しくは化学療法の効果増強剤。
１３．試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする、がんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法。
１４．前記試料が、がんワクチン用候補ペプチドによって刺激培養されたＢ細胞含有液から採取された試料である、前項１３に記載の方法。
１５．末梢血から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ２で刺激培養する工程を含む、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法。
１６．前項８に記載のａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドによる、免疫応答を誘導する方法。
１７．免疫療法または化学療法を開始する前に、前項８に記載のａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドを投与することによる、該免疫療法または該化学療法の効果を増大する方法。
１８．請求項１に記載の検査方法により、がん治療の効果があると判定されなかった場合に、抗体価を上昇させて、免疫療法を有効症例に導く方法。
　本発明の検査方法は、がん治療前にがん治療の効果および予後を的確に予測することができる。また、がん治療後にがん治療の効果を確認することができる。より具体的には、化学療法の効果（抗がん剤の効果）、免疫療法の効果、免疫チェックポイント分子阻害薬の効果を的確に予測することができる。特に、ＰＤ－Ｌ１発現によらず、免疫チェックポイント分子阻害薬が奏功する患者か否かの判別を可能にする。ＰＤ－Ｌ１発現では効果を予測できなかった患者についても効果を予測可能にしたことは画期的なことである。
　なお、免疫チェックポイント分子阻害薬は、非常に高価であり、またその治療の終了を示す有効なバイオマーカーが現在のところ存在しない。また、免疫チェックポイント分子阻害薬はこれまでの化学療法とは異なり、一部の患者では有効であるが、全身の自己免疫疾患の発症という重篤な有害事象も懸念されている。本発明の検査方法は、治療効果が低い患者についても予測可能であり、副作用とのバランスを考えて該治療を中止することもできる。これらのことより、本発明により、免疫チェックポイント分子阻害薬が著効する症例を選択できることは、治療費及び副作用対策などに係る費用等を含めた医療経済的にも画期的である。
　本発明の新規ペプチド及びその新規ペプチドを含有する免疫応答誘導用組成物は、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導することにより、がんに対する免疫応答を誘導しがん治療薬（がんワクチン）となり得る。本発明の新規ペプチド及び免疫応答誘導用組成物は、ＸＡＧＥ１特異的抗体、特に、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体を誘導でき、さらに、抗原特異的Ｔ細胞を誘導できる。
　本発明の新規ペプチド及び本発明の免疫応答誘導用組成物は、化学療法、免疫療法及び免疫チェックポイント分子阻害薬による治療の無効例、又は予後不良群に対し、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導することによって、治療奏功及び予後良好群に導く画期的治療を可能にする。さらに既存の治療法、新規治療法との併用による強力ながん免疫療法を可能にするものである。さらに本発明の免疫応答誘導用組成物は安全性にも優れている。
　本発明の新規ペプチドは、Ｔ細胞が認識するエピトープワクチンと違い、長鎖ペプチドであることから種々のエピトープを含み、従来のエピトープワクチンより強い免疫応答を誘導できる。さらに、前記ａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドとｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドを併用することにより、さらに強い免疫応答を誘導できる。
　本発明のスクリーニング方法は、がんワクチン用として好適なペプチドの選択を可能にする。
　本発明の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法により得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、養子免疫（Ｔ細胞）療法など、細胞治療に用いることができる。
図１は、１５７例の早期又は局所進行期の肺腺癌（ｃＳｔａｇｅ　Ｉ－ＩＩＩＡ）と１４５例の進行期（ｃＳｔａｇｅ　ＩＩＩＢ－ＩＶ）の肺腺癌患者から採取した血清について、がん関連抗原、ＸＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＴＰ５３に対する抗原特異的ＩｇＧ及び抗原特異的ＩｇＡを検出した結果を示す。 図２は、１５７例の早期又は局所進行期の肺腺癌（ｃＳｔａｇｅ　Ｉ－ＩＩＩＡ）と１４５例の進行期（ｃＳｔａｇｅＩＩＩＢ－ＩＶ）の肺腺癌患者から採取した血清の検査結果であり、がん関連抗原、ＸＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＴＰ５３に対する特異的ＩｇＧ陽性患者の頻度と特異的ＩｇＡ陽性患者の頻度を示す。 図３Ａは、５１種類のがん抗原に対する自己抗体反応について、ＸＡＧＥ１抗原陽性の５５例の肺腺癌患者から得られた血清を検査した結果を示す。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧとＸＡＧＥ１－ＩｇＡが自己腫瘍に対する免疫応答のサロゲートマーカーになることを示している。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、種々のがん抗原に対する免疫応答が観察される。一方でＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体の出現（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群）は、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱していることを示す。ＸＡＧＥ１免疫陰性例（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、自己腫瘍に対する免疫応答がほとんど観察されないことを示す。図３Ｂは、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者は、複数のがん抗原に免疫反応を有しがんに対する免疫応答が潜在的に高い状態（免疫活性化状態）であり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が高い状態であるが、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が抑制されている状態であることを示す。 図４は、進行期肺腺癌患者１４５例の血清中の免疫抑制サイトカインを計測した結果を示す。 図５は、早期又は局所進行の肺腺癌患者のがん局所のＢ細胞、Ｔ細胞の状態を解析した結果を示す。図５Ａ及びＢは、がん局所（ＴＩＬ）の細胞の集積状態を示す。末梢血に比べがん局所にＩｇＡ陽性Ｂ細胞が増加している。図５Ｃは、ＩｇＡ陽性Ｂ細胞浸潤が多い症例は３０％程度であることを示す。図５Ｄは、ＩｇＡ陽性Ｂ細胞浸潤が多い症例では、腫瘍局所の制御性Ｔ細胞が増加していることを示す。図５Ｅは、末梢血に比べ腫瘍浸潤リンパ球では、免疫抑制性のサイトカインであるＩＬ-１０の産生が認められ、Ｔ細胞以外にＢ細胞もＩＬ－１０を産生していることを示す。図５Ｆは、図５Ｅで示されたＩＬ－１０産生性の腫瘍浸潤Ｂ細胞がＩｇＡ陽性であることを示す。 図６は肺腺癌患者のＩｇＡ＋Ｂ細胞に発現する免疫チェックポイント分子を解析した結果を示す。免疫チェックポイント分子であるＰＤ－Ｌ１とＧａｌｅｃｔｉｎ－９を高発現したＰＤ－Ｌ１＋ＧＡＬ－９＋ＩｇＡ＋のＢ細胞が、がん局所に有意に集積していることを示す。 図７はＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性群が有意に中央生存期間を延長すること、この傾向はＥＧＦＲ遺伝子変異陰性症例に顕著であることを示す。 図８はＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群が、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群や免疫応答なし群に比べ、初回化学療法の奏功率が有意に高いことを示す。 図９は免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法の効果の指標として、ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答が有用であることを示す。ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性群）と免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する抗体なし群）における標的病変の最大変化率を示す。 図１０は、ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性群）と免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する抗体なし群）における、免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法後の奏効率、無増悪生存期間（Progression-Free Survival）及び全生存期間（Overall Survival）を示す。 図１１は、図３Ａに示す結果をさらにＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群で各がん抗原に対する免疫反応を解析した結果を示す。 図１２は、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例で、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＸＡＧＥ１抗体および抗ｐ５３抗体をモニターした結果を示す。 図１３Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法を実施した患者の治療前の血清を用いて、ＸＡＧＥ１およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を含むがん抗原５０種に対する免疫応答を解析した結果を示す。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性の患者は多抗原に対する免疫応答を有し免疫活性化状態であることを示す。図１３Ｂは抗ＰＤ－１抗体療法前の抗ＢＡＧＥ抗体または、抗ＢＯＲＩＳ抗体の検出により抗ＰＤ－１療法の効果を予測し得ることを示す。 図１４Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率（マイナスは腫瘍縮小を意味する）とＣＴ抗原に対する抗体（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＮＹＥＳＯ－１-ＩｇＧ）の抗体価との関係を示している。図１４Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率と治療後の多抗原に対する免疫反応の増強（抗原スプレディング）数との関係を示している。 図１５Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法の前後における多抗原に対する免疫応答の差を示す。図１５Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例では、ＭＡＧＥ－Ｂ３抗原 及びＳＳＸ４抗原に対する免疫応答のスプレディングが高頻度に認められ、非奏功例には認められなかったことを示す。 図１６は、抗ＣＣＲ４抗体＋抗ＰＤ－１抗体、術前併用医師主導治験症例の完全奏功例で、実際にＳＳＸ４抗原に対する免疫反応が観察されたことを示す。 図１７は、腫瘍縮小の経過とＳＳＸ４に対する免疫反応が相関したことを示す。 図１８は、ＣＴ抗原に対する抗体（抗ＸＡＧＥ１抗体及び抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体）陽性は、既知のバイオマーカーより抗ＰＤ－１抗体療法の効果を明確に判別することができることを示す。 図１９は、ＳＬＰ２に特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞クローン（以下、ＣＤ４クローンともいう）である４Ｃ３４－１とＳＬＰ１に特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（以下ＣＤ８クローンともいう）である８Ｃ３４ＴＹが認識するペプチドを示す。 図２０は、ＣＤ４クローン（４Ｃ３４－１）Ｔ細胞、ＣＤ８クローン（８Ｃ３４ＴＹ）Ｔ細胞、及びこれらＴ細胞の混合物をＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用により刺激した結果を示す。ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用による刺激がより強い免疫応答を誘導すること示す。 図２１は、末梢血単核球をＣＤ４クローンＴ細胞とＣＤ８クローンＴ細胞と共に、ＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独、又は各ペプチド併用で刺激した後、Ｂ細胞表面上のＩｇＧ及びＩｇＡを検出した結果を示す。Ｂ細胞表面上のＩｇＧは、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を併用することで発現の上昇が認められた。一方でＩｇＡの発現量には変化はなかった。 図２２は、Ｂ細胞を、ＣＤ４クローンＴ細胞及びＣＤ８クローンＴ細胞と共に、ＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独、又は各ペプチド併用で刺激した後の培養上清中のＸＡＧＥ１特異的抗体の検出結果を示す。ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用した場合に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧが産生され、ＩｇＡの産生は認められなかった。 図２３は、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含むＸＡＧＥ１ワクチンの投与により、７例中４例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認め、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡおよびＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧは誘導されなかったことを示す。 図２４は、ＸＡＧＥ１ワクチンの投与により腫瘍マーカーの上昇抑制または低下が、７例中４例で観察されたことを示す。 図２５は、ＸＡＧＥ１ワクチン低用量投与で、免疫応答が誘導できたことを示す。患者から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞は主にＳＬＰ１に反応し、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用により免疫応答が増強することを示す。 図２６は、ＸＡＧＥ１ワクチン中用量投与で、免疫応答が誘導できたことを示す。患者から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞はＳＬＰ１とＳＬＰ２に反応し、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用により免疫応答が増強することを示す。
　本発明の検査方法は、試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする。又、本発明のがんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法も、試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする。
　本発明の検査方法およびスクリーニング方法における、前記がん精巣抗原（以下、ＣＴ抗原ともいう）は、特に限定されるものではなく、がん細胞に発現し、正常組織では精巣のみに発現する抗原である。本発明はＣＴ抗原に対する抗体を検出すること特徴とし、好ましいＣＴ抗原としては、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４が挙げられる。さらに好ましいＣＴ抗原としては、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１が挙げられる。
　本発明の検査方法およびスクリーニング方法は、好ましくは、ＩｇＧタイプのＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する。好ましいＣＴ抗原に対する抗体として、ＸＡＧＥ１抗体、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＭＡＥＬ抗体、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体及び抗ＳＳＸ４抗体が挙げられ、これら抗体はＩｇＧタイプであることが好ましい。より好ましい抗体として、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体、ＩｇＧタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体が挙げられる。
　さらに好ましくは、ＩｇＧタイプのＣＴ抗原に対する抗体に加えてＩｇＡタイプのＣＴ抗原に対する抗体を検出する。好適なＩｇＡタイプのＣＴ抗原に対する抗体として、ＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体が挙げられる。好ましくは、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体とＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体を検出する。
　本明細書において「がんワクチン」は、がんに対する免疫応答を誘導させることのできる医薬組成物を意味し、また、該免疫応答誘導には、体液性免疫誘導及び／又は細胞性免疫誘導が含まれる。
　本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療前の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する。また、本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療後の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する。
　がん治療前の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することにより、がん治療前に該がん治療の効果及び予後を予測することができる。
　がん治療後の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することにより、がん治療後に該がん治療の効果を確認し予後を予測することができる。さらに、その後の治療の効果及び予後を予測することができる。
　本発明の検査方法は、種々のがん治療の効果の予測、確認、予後予測に適しているが、化学療法や免疫療法の効果の予測、確認、予後予測に適している。免疫療法の効果の予測により適しており、特に免疫チェックポイント分子阻害薬の治療の効果の予測に適している。
　化学療法には、プラチナ製剤等の各種抗がん剤の投与による治療が含まれる。免疫療法には、免疫抑制阻害療法（免疫チェックポイント分子阻害薬による治療）、サイトカイン（ＩＬ－２等）療法、ＢＲＭ療法（免疫賦活剤等）、がんワクチン療法等が含まれる。免疫チェックポイント阻害剤による治療には、ＰＤ－１阻害剤（ニボルマブ等）の投与による治療、ＣＴＬＡ－４阻害剤（イピリムマブ等）による治療等が含まれる。
　本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療前の被験体から採取された試料を検査対象とする。本明細書において「がん治療前」とは、効果を予測したいがん治療を始める前という意味である。すなわち、本発明の「がん治療前」には、がん治療を新たに始める前、がん治療用薬剤投与前、がん治療の継続中における薬剤投与前、がん治療用薬剤変更前、がん治療方針変更前、及びがん治療を中止するか否かの検討期間を含む。
　本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療後の被験体から採取された試料を検査対象とする。本明細書において「がん治療後」とは、特定のがん治療薬を選定し、がん治療を開始後、一定期間を経て、当該がん治療薬の効果を確認する段階という意味である。すなわち、本発明の「がん治療後」には、がん治療の継続中におけるさらなる薬剤投与前、がん治療用薬剤の変更前、がん治療方針の変更前、及びがん治療を中止するか否かの検討段階を含む。
　本発明のスクリーニング方法における「試料」としては、がんワクチン用候補ペプチドによって刺激培養されたＢ細胞含有液から採取された試料が好ましい。例えば、ヒト血液から得られた単核球含有画分又はＢ細胞含有画分を、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と共に、がんワクチン用候補ペプチドで刺激培養した後の培養液の上清が使用できる。
　本明細書において「治療効果」は、がんの病状進行抑制、がんの縮小、がんの消滅、再発抑制、転移抑制、生存期間の延長等を含む概念である。奏効率、生存率、生存期間等で表される。
　本発明の検査方法における「がん治療」のがんは、特に制限はなく、いずれのがんであってもよい。好適ながんとしては、ＸＡＧＥ１陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１陽性のがんが挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法により得られるがんワクチン用ペプチドのがんは、特に制限はなく、いずれのがんであってもよい。好適ながんとしては、ＸＡＧＥ１陽性のがんが挙げられる。本発明の検査方法および本発明のスクリーニング方法におけるがんとして、例えば、肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、及び、膀胱癌等が挙げられる。好適には、肺癌が挙げられ、特に非小細胞肺癌が挙げられる。さらには、本発明の検査は、難治である進行期非小細胞肺癌治療や進行期の肺腺癌治療の効果の予測に適している。
　ＸＡＧＥ１（Ｘ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｆａｍｉｌｙ，　Ｍｅｍｂｅｒ　１）は、ＸＡＧＥ１遺伝子によりコードされ、Ｃａｎｃｅｒ／Ｔｅｓｔｉｓ　ａｎｔｉｇｅｎ　１２．１（ＣＴ１２．１）としても知られる公知のがん精巣抗原である。これまでにＸＡＧＥ１ａ－ｅの５種類の遺伝子が同定され、その関連タンパク質はＧＡＧＥＤ２であり、ＧＡＧＥＤ２ａとＧＡＧＥＤ２ｄの二種類のアイソフォームが存在することが知られている。また、これまでにＸＡＧＥ１ａ，ｂ，ｃ，ｄの４種類の選択的スプライスバリアントが同定されている（Sato et al., Cancer Immunity, vol. 7, page 5 (2007)）。ＸＡＧＥ１ａとＸＡＧＥ１ｂは８１アミノ酸からなるＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）タンパク質をコードし、ＸＡＧＥ１ｄは、６９アミノ酸からなるＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ｄ）タンパク質をコードしている。
　種々の動物種についてＸＡＧＥ１のアミノ酸配列が公知である。例えば、ヒトＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）の配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１０９１０７３．２及びＮＰ＿００１０９１０６３．２として、ヒトＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ｄ）の配列はＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＰ＿００１０９１０７４．１として提供されている。
ヒトＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）：（配列番号３）
mespkkknqq lkvgilhlgs rqkkiriqlr sqcatwkvic kscisqtpgi nldlgsgvkv kiipkeehck mpeageeqpq v 
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法における測定対象である抗ＸＡＧＥ１抗体は、ＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）（以下、本明細書では単にＸＡＧＥ１と記載する）に対する抗体である。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の検出対象である抗ＸＡＧＥ１抗体を検出する方法に特に制限はないが、例えば、抗原との結合を検出する方法が挙げられる。結合させる抗原としては、全長ＸＡＧＥ１であっても、その一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチドであってもよい。好ましくは、全長ＸＡＧＥ１を用いる。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の一実施形態は、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体を検出する。好ましくは、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体（ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ）とＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体（ＸＡＧＥ１―ＩｇＡ）を検出する。ＩｇＧタイプの抗体の検出方法に特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。また、ＩｇＡタイプの抗体の検出方法にも特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の一実施形態は、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ及び／又はＸＡＧＥ１―ＩｇＡを検出する工程を含む。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧは、自己腫瘍に対する免疫応答が増強していることを示すバイオマーカーであり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡは、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱して（抑制されて）いることを示すバイオマーカーである。このようなマーカーが、がん治療薬の治療効果の予測に適用可能であることははじめて見出いだされた。
　ＮＹ－ＥＳＯ－１も公知のがん精巣抗原のひとつである。悪性黒色腫をはじめ各種腫瘍にさまざまな程度５－４０％に発現しているが、正常組織では精巣のみに発現が限られている。ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質は１８０のアミノ酸からなり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ０５９０８．１として提供されている。
ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１：(配列番号４)
mqaegrgtgg stgdadgpgg pgipdgpggn aggpgeagat ggrgprgaga arasgpggga 
prgphggaas glngccrcga rgpesrllef ylampfatpm eaelarrsla qdapplpvpg 
vllkeftvsg niltirltaa dhrqlqlsis sclqqlsllm witqcflpvf laqppsgqrr
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法における検出対象である抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を検出する方法に制限はないが、抗原との結合を検出する方法が挙げられる。結合させる抗原は、全長ＮＹ－ＥＳＯ－１であっても、その一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチドであってもよい。好ましくは、全長ＮＹ－ＥＳＯ－１を用いる。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の一態様は、ＩｇＧタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を検出する。さらに、ＩｇＡタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を検出してもよい。ＩｇＧタイプの抗体の検出方法は特に限定されない。例えば、標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。また、ＩｇＡタイプの抗体の検出方法にも特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。
　ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４も公知のがん精巣抗原である。各種腫瘍にさまざまな程度に発現しているが、正常組織では精巣のみに発現が限られている。ｐ５３は、がん抑制タンパク質として知られている。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法における検出対象である抗ＭＡＥＬ、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体及び抗ｐ５３抗体を検出する方法に制限はないが、抗原との結合を検出する方法が挙げられる。結合させる抗原は、全長であっても、その一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチドであってもよい。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法では、ＩｇＧタイプの抗ＭＡＥＬ、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体及び抗ｐ５３抗体を検出する。さらにＩｇＡタイプの抗体を検出してもよい。ＩｇＧタイプの抗体の検出方法に特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。また、ＩｇＡタイプの抗体の検出方法にも特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。
　各ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する方法は、抗体の量、濃度又は抗体価を測定できる方法であれば特に限定されず、当該分野において公知の手法を用いて測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、アフィニティーカラム法等によって測定することができる。
　本発明の検査方法における「被験体」は、特に限定されるものではなく広く哺乳動物一般（ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）を含むが、ヒトであることが好ましい。被験体がヒトである場合、がん患者やがんを有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被験体となり得る。被験体の性別、年齢等は特に限定されない。
　本発明の検査方法における「試料」としては、例えば、血液（血清、血漿、血球等）、尿、糞便、喀痰、胸・腹水、気管支肺胞洗浄液、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体等を挙げることができる。好ましい試料としては血清が挙げられる。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の好ましい実施形態では、以下の１）～４）からなる群から選択される少なくとも１の場合に、がん治療の効果があると判定される。
　１）がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
　２）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
　３）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である、
　４）複数のがん精巣抗原に対する抗体が陽性である。
　本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の好ましい実施形態では、ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である場合に、がん治療の効果があると判定される。好ましい具体例として、抗ＸＡＧＥ１抗体、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＭＡＥＬ抗体、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体、及び抗ｐ５３抗体が挙げられる。該ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体はＩｇＧタイプの抗体であることがさらに好ましい。好ましい具体例として、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧが挙げられる。
　また、好ましい実施形態では、ＩｇＧタイプのＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である場合に、がん治療の効果があると判定される。好ましい具体例としては、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧが陽性であり、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡが陰性である場合が挙げられ、特に好ましい具体例として、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧが陽性であり、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡが陰性である場合が挙げられる。
　ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であるとは、ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体の量、濃度又は抗体価がカットオフ値以上である場合であり、陰性であるとはＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体の量、濃度又は抗体価がカットオフ値以下である場合である。カットオフ値は、例えば、健常人の抗体価の１０～１０００倍の抗体価であってもよく、２０～５００倍の抗体価であってもよく、５０～２００倍の抗体価であってもよく、また、１００倍であってもよい。また、カットオフ値は、５０検体以上の健常成人の血清の平均＋３ＳＤのように設定してもよい。好ましくは、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧの量、濃度又は抗体価がカットオフ値以上である場合に、がん治療の効果があると判定される。
　本発明の検査方法の一実施形態は、試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む。好ましくは、該試料は、がん治療前の被検体から採取された試料である。該ＣＴ抗原に対する抗体の具体例としては、抗ＸＡＧＥ１抗体と又抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体が挙げられる。さらに好ましい具体例として、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧとＸＡＧＥ１―ＩｇＡの組み合わせ、ＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧ及びＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧとＸＡＧＥ１―ＩｇＡの組み合わせが挙げられる。
　本発明の検査方法の一実施形態は、被験体から採取された試料中のＸＡＧＥ１―ＩｇＧの量、濃度又は抗体価を検出する工程と同一試料中のＸＡＧＥ１―ＩｇＡの量、濃度又は抗体価を検出する工程とを含む。ＸＡＧＥ１―ＩｇＡの存在は、免疫が抑制されていることを示していることより、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧの量、濃度又は抗体価がカットオフ値以上であり、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡがカットオフ値以下である場合に、がん治療の効果があると判定することができる。
　ＸＡＧＥ１－ＩｇＧは、自己腫瘍に対する免疫応答が増強していることを示すバイオマーカーである。一方、がん局所で、ＩｇＡ陽性の制御性Ｂ細胞が増加していることが判明し、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡは、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱していることを示すバイオマーカーになる。なお、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧを有する患者の約半数でＸＡＧＥ１－ＩｇＡ反応がみられる。
　本発明のスクリーニング方法は、例えばヒト血液から分離したＢ細胞を、ワクチン用候補ペプチドによって刺激培養する工程及び培養上清中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む。
　好ましくは、さらに、ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性の場合に、候補ペプチドにがん治療の効果があると判定する工程を含む。好適には、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡが陰性でありＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧが陽性である場合に、候補ペプチドにがん治療の効果があると判定する工程を含む。
　また、本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の好ましい他の実施形態では、複数のＣＴ抗原に対する抗体が陽性である場合に、がん治療の効果があると判定される。本実施形態では、被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体の量、濃度又は抗体価を検出する工程と、同一試料中の該ＣＴ抗原とは異なる他のＣＴ抗原に対する抗体の量、濃度又は抗体価を検出する工程とを含む。検査されるＣＴ抗原に対する抗体に特に制限はないが、好ましくは、抗ＸＡＧＥ１抗体、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＭＡＥＬ抗体、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体又は抗ＳＳＸ４抗体を含む。複数のＣＴ抗原に対する抗体が検出される患者は、多抗原に対する免疫応答を有し免疫活性化状態であり、免疫療法等のがん治療が奏功する。複数は２以上であればよく、好ましくは３以上である。上限に制限はないが、検査の煩雑さから具体的には、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下等が挙げられる。
　抗ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を指標にすることで（ＣＴ抗原若しくはｐ５３に対する免疫応答を検出することで）、好ましくは、抗ＸＡＧＥ１抗体若しくは抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を指標にすることで（ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答を検出することで）、がん治療効果を的確に予測することができるようになった。抗ＸＡＧＥ１抗体若しくは抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体陽性は、既知のバイオマーカーより抗ＰＤ－１抗体療法の効果を明確に判別する。特に、免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例を明確に判別することができるようになった。ＰＤ－Ｌ１発現が陽性であっても、奏効率は３０％であり、陰性であっても奏功例が１０％であったため、これらバイオマーカーにより明確に奏功例を判別できることは画期的である。
　本発明の検査方法により、がん治療効果がありと判定された場合には、免疫療法、又は化学療法を行い得る。本発明の検査方法によりがん治療効果があると判定されなかった場合に、抗体価を上昇させて、免疫療法、又は化学療法を有効症例に導くことができる。抗体価を上昇させる方法の一実施形態として、ワクチン投与が挙げられる。好ましいワクチンは、ＣＴ抗原を含むワクチンであり、より好ましくは、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つのＣＴ抗原またはこれら抗原の一部からなるペプチドを含むワクチンである。
　本願は、試薬キットに係る発明も含む。試薬キットに係る発明は、ＣＴ抗原、ＣＴ抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、及び抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キットである。
　好ましい、実施形態は、ＸＡＧＥ１、ＸＡＧＥ１の一部からなるペプチド、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＮＹ－ＥＳＯ－１の一部からなるペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドが固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、並びに抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キットである。本キットは、がん治療の効果を検査するための試薬キットである。
　ＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドとは、配列番号３に表されるアミノ酸配列の一部からなる配列を有するペプチドである。好ましくは、１０以上のアミノ酸を含むペプチドであり、１つ以上のエピトープを含む。ＮＹ－ＥＳＯ－１の一部からなるペプチドとは、配列番号４に表されるアミノ酸配列の一部からなるアミノ酸配列を有するペプチドである。好ましくは、１０以上のアミノ酸を含むペプチドであり、１つ以上のエピトープを含む。
　本発明の試薬キットの中に含まれるペプチドが固相化された担体には、ＣＴ抗原、ＣＴ抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化されている。好ましくは、ＸＡＧＥ１、ＸＡＧＥ１の一部からなるペプチド、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＮＹ－ＥＳＯ－１の一部からなる群から選択される少なくとも１が固相化されている。担体は、特に限定されるのもではなく、例えばプレートやスティックが挙げられる。
　本発明の試薬キットは、ペプチドが固相化された担体の他に、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬と抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含む。これら抗体は標識されていることが好ましい。また、本発明のキットには、標識と反応させるための試薬や、希釈液等、さらに試薬や検査用器具を含有してもよい。
　本願のペプチドに係る発明は、以下のａ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドである。
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｂ）前記ａ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｃ）前記ａ）又はｂ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｅ）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｆ）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
　本発明のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列に基づき設計され、通常の方法により合成することができる。該ペプチドのアミノ酸数は、好ましくは２０～３０の範囲である。また、本発明のペプチドは、上記がんワクチン用ペプチドのスクリーニングにより選択され得るペプチドである。
　前記保存的置換では、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に置き換わるように、１個のアミノ酸が類似構造又は特性を持つアミノ酸に置換される。更に、ロイシンがイソロイシンに置換されるように、サイズおよび化学的性質が同一あるいは類似のアミノ酸に交換される。自然発生的な相同タンパク質ファミリーにおける配列多様性の研究において、ある種のアミノ酸置換は他のアミノ酸置換より認容性が高いことが多く、これらは元のアミノ酸とその置換物との間で、大きさ、電荷、極性、疎水性が類似の相関関係を示すことが多く、これが、「保存的置換」の定義の基礎である。保存的置換は、本明細書では次の５グループの１つに交換されることと定義されてもよい：グループ１－分子量が小さい脂肪族の、非極性またはやや極性残基（Ala, Ser,Thr, Pro, Gly）；グループ２－極性、負電荷残基及びそれらのアミド類（Asp, Asn, Glu, Gln）；グループ３－極性、正電荷残基（His, Arg, Lys）；グループ４－分子量が大きい脂肪族の、非極性残基（Met, Leu, Ile, Val, Cys）；そしてグループ５－分子量が大きい、芳香残基（Phe、Tyr、Trp）。
　本発明のペプチドのＣ末端は、アミド又はエステルであってもよい。また、Ｎ末端のアミノ基や分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えば、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されていてもよい。また、糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなども含まれる。また、アミノ酸の一部がＤアミノ酸であってもよい。
　本発明のペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩等が挙げられる。本発明のペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。プロドラッグ化されていてもよい。プロドラッグは、生体内における生理条件下で本発明のペプチドに変換するように設計され得る。
　本発明のペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチド若しくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、必要であれば保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
　前記ａ）で特定されるペプチドにおいて、伸長及び／又は欠失するアミノ酸の数は、最大５個であり、好ましくは４個であり、より好ましくは３個であり、より好ましくは２個であり、さらに好ましくは１個である。最も好ましくは０個である。
　前記ｂ）で特定されるペプチドにおいて、保存的置換されるアミノ酸の数は、２個又は１個である。より好ましくは１個である。
　前記ｄ）で特定されるペプチドにおいて、伸長及び／又は欠失するアミノ酸の数は、最大５個であり、好ましくは４個であり、より好ましくは３個であり、より好ましくは２個であり、さらに好ましくは１個である。最も好ましくは０個である。
　前記ｅ）で特定されるペプチドにおいて、保存的置換されるアミノ酸の数は、２個又は１個である。より好ましくは１個である。
　本発明の好ましいペプチドとして、以下のａ１）～ｆ１）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドが挙げられる。
ａ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大３個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｂ１）前記ａ１）のペプチドのアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｃ１）前記ａ１）又はｂ１）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
ｄ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大３個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｅ１）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｆ１）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
　本発明の最も好ましいペプチドとしてＳＬＰ１とＳＬＰ２が挙げられる。ＳＬＰ１及びＳＬＰ２は、２５個のアミノ酸残基を有する長鎖ペプチドである。ＳＬＰ１は配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＳＬＰ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
ＳＬＰ１：（配列番号１）NQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQ
ＳＬＰ２：（配列番号２）ISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEH
ＳＬＰ１はＸＡＧＥ１（配列番号３）の８番目から３２番目のアミノ酸配列を有し、ＳＬＰ２は、ＸＡＧＥ１の４４番目から６８番目のアミノ酸配列を有する。
　本願のがんに対する免疫応答誘導用組成物に係る発明は、前記ａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。より好ましくは、前記ａ１）～ｃ１）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ１）～ｆ１）から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。さらに好ましくは、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含有する。これらペプチドの併用により、単独では達し得なかった効果を達成した。
　本願のがんに対する免疫療法若しくは化学療法の効果増強剤に係る発明は、前記ａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。より好ましくは、前記ａ１）～ｃ１）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ１）～ｆ１）から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。さらに好ましくは、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含有する。これらペプチドの併用により、単独では達し得なかった効果を達成した。
　本発明の免疫応答誘導用組成物及び本発明の効果増強剤は、がんワクチンということもできる。
　本発明の免疫応答誘導用組成物は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の免疫応答を誘導するために用いられる。
　本発明の免疫応答誘導用組成物は、体液性免疫、細胞性免疫を活性化し、がんに対する免疫応答を増強させ、がんの治療に用いることができる。また、化学療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤によるがん治療の効果を増大させることができる。さらに、本発明の免疫応答誘導用組成物は、化学療法及び免疫療法、免疫チェックポイント分子阻害薬による治療の無効例、又は予後不良群に対し、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導することによって、治療奏功及び予後良好群に導くことができる。また、本発明の免疫応答組成物は安全性にも優れている。
　本発明の組成物は、ＸＡＧＥ１を発現しているがんに対する免疫応答を誘導することができ、そのがんの治療に用いることができ、また、そのがんの治療効果を増強することができる。また、そのがんの治療の無効例、又は予後不良群に対し、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導し、治療奏功及び予後良好群に導くことができる。治療対象がんとして、例えば、肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、又は、膀胱癌を挙げることができる。特に、適しているがんとしては、肺癌が挙げられ、肺癌の中でも、非小細胞肺癌、肺腺癌、特に進行期の非小細胞肺癌、肺腺癌の免疫応答誘導に適している。
　本発明の免疫応答誘導用組成物は、抗ＸＡＧＥ１抗体の産生を誘導することができる。特に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの産生を誘導することができる。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性の患者や治療対象は、予後良好、治療奏効であることより、本発明の免疫応答誘導用組成物は、化学療法、免疫療法及び免疫チェックポイント阻害剤による治療によっても予後不良、治療無効と予想される患者等を予後良好、治療奏効に導くことができる。
　本発明者等は、ＸＡＧＥ１の一部の１６～１７アミノ酸を含むエピトープワクチンを以前作成したが、本発明のペプチドは、Ｔ細胞が認識するエピトープワクチンと違い、長鎖ペプチドであることから種々のエピトープを含み、さらに、前記ａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを併用することで従来のエピトープワクチンより強い免疫応答が誘導できる。
　本発明の免疫応答誘導用組成物は免疫応答を高めるためにアジュバントを含んでいてもよい。その他に薬理学的に許容される担体、安定剤を含んでいてもよい。本発明の免疫応答誘導用組成物は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って製造され、例えば注射剤として、非経口的（静脈内注射、筋肉内注射等）に安全に投与することができる。
　本発明の免疫応答誘導用組成物の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
　調製された注射剤は、液剤であっても、用事溶解する固形製剤であってもよい。投与にあたっては、前記の固形製剤の場合は、慣用の水性希釈剤中で溶解し、液剤として用いることができる。水性希釈剤としてはぶどう糖水溶液、生理食塩水、リンゲル液、栄養補給剤液などが含まれる。
　本発明の免疫応答誘導用組成物において、本発明のペプチドの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１～１００重量％、好ましくは約１０～９９．９重量％、さらに好ましくは約２０～９０重量％程度である。前記ａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドの含有量の比は適宜調整される。例えば、１：９～９：１、３：７～７：３、５：５等が挙げられる。本発明の免疫応答誘導用組成物の投与量は、投与ルート、症状、患者の年令などによっても異なるが、例えば、静脈内投与など非経口的に投与する場合、１日当たり体重１ｋｇあたりペプチドとして約０．００５～５０ｍｇ，好ましくは約０．０５～１０ｍｇを投与できる。
　本発明一態様である免疫応答誘導用組成物は、他の化学療法、免疫療法、免疫チェックポイント分子阻害薬投与の前に投与することができる。これらの前に本発明の免疫応答誘導用組成物を投与することにより、該化学療法、該免疫療法、該免疫チェックポイント分子阻害薬の効果を増強することができる。例えば、これらの薬剤の投与の１日～半年前、好ましくは、１週間～３ヶ月前、さらに好ましくは２週間～２ヶ月前に投与することができる。好ましい一実施形態として、免疫チェックポイント分子阻害薬投与の２８日～３ヶ月前に投与することができる。
　本発明は、また、患者の末梢血から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ２で刺激培養する工程を含む、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法である。
　より詳細には、末梢血単核球細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離し、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２存在下で３日～２１日間、好ましくは７日～１８日間刺激培養する。その後、抗原提示細胞と共にＳＬＰ１及び／又はＳＬＰ２で３～２４時間、好ましくは６～１８時間再刺激することにより得ることができる。刺激培養時のＳＬＰ１及びＳＬＰ２の濃度はそれぞれ、０．１～１０μＭ、好ましくは、０．１～１μＭの濃度が好ましい。
　得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞は細胞療法に用いることができる。例えば、末梢血を提供した患者本人に投与し、養子免疫療法に利用することができる。
　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
　実施例で用いられている血液は、がん治療を行う前の患者からインフォームドコンセントのもとに提供を受けた。
［実施例１］
＜ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ１－ＩｇＡの検出＞
　ＸＡＧＥ１タンパク質（８１個のアミノ酸、配列番号３）は、ＧＬバイオケム社（上海、中国）で合成されたものを使用した。合成したＸＡＧＥ１タンパク質は、ＨＰＬＣカラムで精製を行い、純度が９０％以上であることを確認している。
　１μｇ／ｍｌの濃度のＸＡＧＥ１（炭酸バッファー、ｐＨ９．６）を４℃オーバーナイトで９６穴プレート（ヌンク社製）に固相化した後に、洗浄液（ＰＢＳ／０．１％ＴＷＥＥＮ）で９６穴プレートを洗浄し、５％ＦＣＳ／ＰＢＳを加えて、３７℃で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、１００倍、４００倍、１６００倍、６４００倍に希釈した血清を加えて、３７℃で２時間反応させた。次いで、洗浄液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（５０００倍希釈）（ジャクソン社製）若しくはペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（８０００倍希釈）（ジャクソン社製）を加えて、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液で洗浄し、過酸化水素を加えた基質溶液（オルトフェニレンジアミンを０．０５Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解した溶液）を加えて発色させた。発色後、６Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用いて吸光度（波長４９０ｎｍ）を測定した。これら吸光度をもとに、一般的な抗体価の求め方で抗体価を算出した（Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ：Ｓａｃｈａ　Ｇｎｊａｔｉｃ，Ｌｌｏｙｄ　Ｊ．　Ｏｌｄ，Ｙａｏ－Ｔｓｅｎｇ　Ｃｈｅｎ）。ＩｇＧ、ＩｇＡともに健常人コントロール血清の抗体価の１００倍以上をもって陽性とし、１００倍未満を陰性とした。
＜ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧの検出＞
　ＮＹ－ＥＳＯ－１（１８０個のアミノ酸、配列番号４）は、通常の方法により大腸菌を用いて作成した。ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧは上記ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの検出方法と同様の方法で検出した。
＜ＣＴ抗原若しくはｐ５３に対する抗体の検出＞
　各ＣＴ抗原若しくはｐ５３は、ビーズに固定化された状態で岡山大学より入手した（Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2076-2084）。各ＣＴ抗原若しくはｐ５３は、上記ＸＡＧＥ１抗体の検出方法と同様の方法で検出した。
［試験例１］
＜ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及び ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ反応＞
　１４５例の進行期（ｃＳｔａｇｅＩＩＩＢ－ＩＶ）の肺腺癌患者から採取した血清について、がん抗原、ＸＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＴＰ５３に対する特異的ＩｇＧ及びＩｇＡを検査した。
　ＭＡＧＥ－Ａ３は、ＡＴｇｅｎ社（韓国）より入手し、ＳＳＸ－２は、ＡＴｇｅｎ社（韓国）より入手し、ＴＰ５３は、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（アメリカ）より入手した。ＮＹ－ＥＳＯ－１（１８０個のアミノ酸、配列番号４）は、通常の方法により大腸菌を用いて作成した。それぞれの抗原に対する特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの検出は、上記ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ１－ＩｇＡの検出方法と同様の方法で検出した。
　ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性者は３３例（２２．７％）であり、その約半数の１５例（１０．３％）でＸＡＧＥ１－ＩｇＡ免疫応答を確認した（図１）。これは、肺癌で、高免疫原性を有すると言われるＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＰ５３抗原に対する免疫応答よりもはるかに高頻度であった（各抗原に対するＩｇＧ反応：４．１％、１．４％、６．２％、８．３％、ＩｇＡ反応：０．７％、０．７％、０．７％、４．１％）（図２）。なお、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性患者はすべてＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性であった。
［試験例２］
＜サロゲートマーカーとしてのＸＡＧＥ１－ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ反応＞
　ＸＡＧＥ１抗原が陽性の５５例の肺腺癌患者から得られた血清について５１種類のがん抗原への自己抗体反応を検査した結果（図３Ａ）、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群には、種々のがん抗原に対する免疫応答が観察され、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ１－ＩｇＡが自己腫瘍に対する免疫応答のサロゲートマーカーになっていることが明らかになった。一方でＸＡＧＥ１－ＩｇＡ免疫応答の出現は、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱していた（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群）。さらに、ＸＡＧＥ１免疫陰性例（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、自己腫瘍に対する免疫応答はほとんど観察されなかった。
　図３Ｂで示すように、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者に比べ、複数のがん抗原に免疫反応を有し、がんに対する免疫応答が潜在的に高い状態（免疫活性化状態）である。一方、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が高い状態であるが、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が抑制されている状態である。
　免疫活性化状態と免疫抑制状態をもたらす原因として、腫瘍自体の性質がまず考えられる。肺腺癌患者１４５例の血清中の免疫抑制サイトカインを計測した結果を図４に示す。免疫抑制性のサイトカインであるＴＧＦ－βの値は、ＸＡＧＥ１免疫を有さない患者に比べ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者では有意に低値であり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者では同等であった。さらに予後不良因子であり、免疫疲弊の時に上昇するサイトカインであるＩＬ－６の値は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者に比べＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者で有意に高く、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者に比べＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者は免疫疲弊状態であると考えられる。
　さらに、がん局所の解析（図５）において、ＩｇＡ＋Ｂ細胞が局所に高集積している患者では、がん局所において免疫を抑制する細胞である制御性Ｔ細胞の頻度が有意に高く（図５Ｄ）、そのような局所に集積するＩｇＡ＋Ｂ細胞自体が、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ－１０を産生している（図５Ｆ）ことが示された。よって、ＩｇＡ＋Ｂ細胞は、局所の免疫抑制および制御性Ｔ細胞の集積（局所のＩＬ－１０が集積に関与）に関与していると考えられる。また、 ＩｇＡ＋Ｂ細胞に発現する免疫チェックポイント分子（Ｔ細胞機能を抑制する分子）を解析した結果、免疫チェックポイント分子であるＰＤ－Ｌ１とＧａｌｅｃｔｉｎ－９を高発現したＰＤ－Ｌ１＋ＧＡＬ－９＋ＩｇＡ＋Ｂ細胞が、がん局所に有意に集積していることが認められた（図６）。
　以上の結果より、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋患者では、腫瘍の遺伝子異常等により、免疫抑制性のサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１０など）が産生され、がん局所に免疫を抑制するようなＩｇＡ＋Ｂ細胞（制御性Ｂ細胞）が集積してくると考えられる。 ＩｇＡ＋Ｂ細胞は、自身の産生するＩＬ－１０や、免疫チェックポイント分子による直接的なT細胞の機能抑制の他に、制御性T細胞を局所に集積させることによって間接的にも免疫を抑制していると考えられる。
［試験例３］
＜ＸＡＧＥ１免疫による化学療法の奏効率及び予後予測＞
　進行期肺腺癌１４５例の検討で、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ、免疫応答なし、ＸＡＧＥ１発現なしを指標として生存曲線を解析した結果、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、中央生存期間３３．８ヶ月、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群は、中央生存期間１９．７ヶ月、免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、中央生存期間１１．９ヶ月、ＸＡＧＥ１発現無し群は、中央生存期間１３．６ヶ月であり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性群が有意に中央生存期間を延長することが明らかになった。特に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は中央生存期間の延長が顕著であった（図７）。
　これらの傾向はＥＧＦＲ遺伝子変異陰性症例に顕著であり、ＥＧＦＲ遺伝子変異陰性の進行期肺腺癌１０１例の検討で、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、中央生存期間３２．０ヶ月、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群は、中央生存期間１６．０ヶ月、免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、中央生存期間１５．４ヶ月、ＸＡＧＥ１発現無し群は、中央生存期間１１．７ヶ月であった（図７）。
　さらに、ＥＧＦＲ遺伝子変異陰性であり、ＸＡＧＥ１抗原が発現している病変の測定が可能な３６例の進行期肺腺癌患者では、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群や免疫応答なし群に比べ、初回化学療法の奏功率が有意に高いことが明らかとなった（図８）。
　以上のことより、ＸＡＧＥ１に対する免疫応答（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ、免疫応答なし）を指標とすることで、化学療法の奏効率及び予後を明確に予測できることが明らかになった。
［試験例４］
＜免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例に対するバイオマーカーとしてのＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１免疫＞
　高免疫原性のＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答（ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり、免疫応答なし）を指標として、免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法の効果について、５３例の進行期非小細胞肺癌患者で検討した。患者の血清は抗ＰＤ－１抗体療法を始める概ね２８日前に採血した。
　　ＸＡＧＥ１に対する免疫応答あり（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性）又はＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり（ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性）群：１６例
　　免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する抗体なし群）：３７例
　図９に標的病変の最大変化率を示す。ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群で、ほとんどの症例で著明な標的病変の腫瘍縮小効果を認めたが、免疫応答なし群では、著明な腫瘍縮小効果は認められなかった。奏効率を図１０に示す。ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群では、ＣＲ（完全奏功）：５例、ＰＲ（部分奏功）：６例、ＳＤ（安定）：３例、ＰＤ（病態進行）：２例であった。免疫応答なし群では、ＰＲ：２例、ＳＤ：９例、ＰＤ：２６例であった。また、ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群と免疫応答なし群における無増悪生存期間（Progression-Free Survival）と全生存期間（Overall Survival）を図１０に示す。無増悪生存期間と全生存期間は、免疫応答あり群と免疫応答なし群で顕著な差があることが明らかになった。
［試験例５］
　現在の指針では、免疫チェックポイント阻害薬は、ＥＧＦＲ遺伝子変異、ＥＭＬ－４／ＡＬＫ融合遺伝子異常といったドライバー遺伝子変異を有する肺癌では、免疫療法の効果が少ないということで免疫療法は慎重に適応を決めるよう（控えるよう）に通達が来ている。しかしながら、ＥＧＦＲ遺伝子変異1名、ＥＭＬ－４／ＡＬＫ融合遺伝子異常1名のＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性の患者２名に免疫療法（免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法）を施行した結果、ＥＧＦＲ遺伝子変異1名はＳＤ、ＥＭＬ－４／ＡＬＫ融合遺伝子異常1名は著効にて９０％以上腫瘍が縮小した。現在の指針では見逃してしまう免疫療法（免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法）著効症例を、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧとＸＡＧＥ１－ＩｇＡを指標とすることで、見逃すことなく治療することができる。
　以上のとおり、ＸＡＧＥ－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ－ＩｇＡが存在するかどうかが、化学療法、免疫療法の予後に関与することが明らかであり、ＩｇＧとＩｇＡセットで検査することが好適である。
　図１１は、図３Ａに示す結果をさらにＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群で各がん抗原に対する免疫反応を解析した結果を示す。図１１が示すように、ＭＡＥＬ抗原およびｐ５３抗原に対する免疫反応は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者に特異的に認められる。その為、抗ＭＡＥＬ抗体陽性者および抗ｐ５３抗体陽性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性であり、免疫活性化状態である。
　また、抗ｐ５３抗体に対する免疫応答は、化学療法の効果及び免疫療法の効果を予測する。図１２は、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例で、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＸＡＧＥ１抗体および抗ｐ５３抗体をモニターした。その結果、奏功例でｐ５３抗原に対する免疫応答の増強が認められ、抗ｐ５３抗体の変動は、抗ＰＤ－１抗体療法の治療効果判定に有用である。
＜抗ＮＹ-ＥＳＯ－１抗体、抗ＢＡＧＥ抗体および抗ＢＯＲＩＳ抗体＞
　抗ＰＤ－１抗体療法を実施した患者の治療前の血清を用いて、ＸＡＧＥ１およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を含むがん抗原５０種に対する免疫応答を解析した。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧおよびＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性者は図１３Ａで示すように多抗原に対する免疫応答を有し免疫活性化状態である。また、図１３Ｂで示すように、抗ＰＤ－１抗体に奏功した８例中３例で、ＢＡＧＥ抗原または、ＢＯＲＩＳ抗原に対する免疫反応が有意に陽性であり（非奏功例１２例中０例）、抗ＢＡＧＥ抗体または、抗ＢＯＲＩＳ抗体の検出により抗ＰＤ－１療法の効果を予測し得る。
＜抗原スプレディング＞
　図１４Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率（マイナスは腫瘍縮小を意味する）とＣＴ抗原に対する抗体（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＮＹ－ＥＳＯ－１-ＩｇＧ）の抗体価との関係を示している。図１４Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率と治療後の多抗原に対する免疫反応の増強（抗原スプレディング）数との関係を示している。ＣＴ抗原に対する抗体価が高いほど抗ＰＤ－１療法の腫瘍の縮小率が高く、また様々なＣＴ抗原に対する免疫反応の数が多い（抗原スプレディングが多い）ほど、抗ＰＤ－１療法の腫瘍の縮小率が高いことが明かになった。よって、複数のＣＴ抗原に対する抗体を検出することにより、抗ＰＤ－１療法の効果を予測し得る。
＜抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体＞
　図１５Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法の前後における多抗原に対する免疫応答の差を示す。図１５Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例では、ＭＡＧＥ－Ｂ３抗原 及びＳＳＸ４抗原に対する免疫応答のスプレディングが高頻度に認められ、非奏功例には認められなかったことを示す。よって、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、実際に抗ＳＳＸ４抗体は、抗ＰＤ－１抗体療法の効果に重大な影響を及ぼす因子であり、治療効果予測に有用である。
　図１６及び図１７は、抗ＣＣＲ４抗体＋抗ＰＤ－１抗体、術前併用医師主導治験症例の完全奏功例であり、同一患者の画像と免疫反応を示す。図１６は、ＳＳＸ４抗原に対する免疫反応が観察されたことを示す。図１７の画像は胸部ＣＴ画像であり、ベースラインの画像は、抗ＣＣＲ４抗体＋抗ＰＤ－１抗体投与前、３週および７週は、治験薬投与後かつ術前までのＣＴ画像である。抗ＣＣＲ４抗体は術前に４回、抗ＰＤ－１抗体は術前に３回投与し、手術は８週に行った。ＣＴ画像は、免疫療法により腫瘍が縮小していることを示す。本患者は、抗ＳＳＸ４抗体陽性であり、免疫療法が著効した例である。このように免疫療法の効果を予測する方法として抗ＳＳＸ４抗体の測定が有用である。
［実施例２］
＜ＸＡＧＥ１長鎖ペプチドの合成及び免疫応答誘導用組成物（ワクチン）の作製＞
　ＸＡＧＥ１の部分ペプチドである２５アミノ酸残基を有する長鎖ペプチドＳＬＰ１及びＳＬＰ２を通常の方法でＧＭＰグレードで株式会社ペプチド研究所にて合成した。ＳＬＰ１は、ＸＡＧＥ１（８１アミノ酸からなるタンパク質）の８位－３２位からなるペプチドであり、ＳＬＰ２は、４４位－６８位からなるペプチドである。ＳＬＰ１及びＳＬＰ２の各々の純度は９９％以上であることを確認している。
ＳＬＰ１アミノ酸配列（配列番号１）：NQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQ
ＳＬＰ２アミノ酸配列（配列番号２）：ISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEH
　上記で得られたＳＬＰ１及びＳＬＰ２を混合し、免疫応答誘導用組成物（ワクチン）を得た。
＜ＳＬＰ１及びＳＬＰ２による細胞刺激＞
ａ．細胞の分離
　ＸＡＧＥ１抗体陽性患者（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性患者）の末梢血から比重遠心法によって単核球を得た。次いで、抗ＣＤ４抗体結合ビーズ及び抗ＣＤ８抗体結合ビーズ（ミリテニーバイオテク社製）を用いて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ、ミリテニーバイオテク社製）によって、順次ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、及びＣＤ４陰性ＣＤ８陰性細胞を分離した。
ｂ．ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞クローンの樹立
ｂ１．ＣＤ４陽性Ｔ細胞１x１０６と４０Ｇｙの放射線照射済みのＣＤ４陰性ＣＤ８陰性細胞１ｘ１０６を、９６穴Ｕボトムカルチャープレートで、２％血清入りＡＩＭ培養メディウム２００μｌ（ＩＬ－２、ＩＬ－７を含む）で、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２各々１μＭ存在下で１４日間刺激培養した。
　以下の実験における培養においても、特に記載の無い限り、２％血清入りＡＩＭ培養メディウム２００μｌ（ＩＬ－２、ＩＬ－７を含む）を用いた。
ｂ２．抗原提示細胞として利用するために、aで入手した患者ＣＤ４陽性Ｔ細胞の一部をＰＨＡで刺激しＴ－ＡＰＣ細胞を調製した。
ｂ３．上記ｂ１で１４日間刺激培養した後の９６穴プレートより、新たな９６穴プレートに３０μｌずつＳＬＰ１及びＳＬＰ２再刺激用と未刺激用に採取し、抗原提示細胞として調整したＴ－ＡＰＣ　１ｘ１０４（３０μｌ）を各ｗｅｌｌに添加した。さらに、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２再刺激用ｗｅｌｌにＳＬＰ１及びＳＬＰ２が各１μＭになるように添加し１２時間再刺激した。
ｂ４．１２時間後９６ｗｅｌｌの培養上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した。
ｂ５．ＳＬＰ１及びＳＬＰ２で刺激した培養上清と未刺激の培養上清のＩＦＮγ活性を比較し、活性が強いｗｅｌｌの中に、抗原特異的なＴ細胞が存在するので、そのｗｅｌｌを限界希釈法にてクローニングした。
ｂ６．クローニングした細胞を再度、ｂ３～ｂ５の方法にてスクリーニングし、ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞クローン（以下、ＣＤ４クローンともいう）を選別して、複数のＴ細胞クローンを得た。
ｂ７．得られたクローンＴ細胞は、ＰＨＡ刺激にて細胞を増殖させ、凍結保存した。得られたＣＤ４クローンの１つが４Ｃ３４－１である。
ｃ．ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンの樹立方法
　ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（以下、ＣＤ８クローンともいう）を上記ｂと同様に調製した。得られたＣＤ８クローンの１つが８Ｃ３４ＴＹである。
ｄ．得られたクローンＴ細胞のＳＬＰ１及びＳＬＰ２への反応及びエピトープ解析
　上記ｂで得られたＣＤ４クローン４Ｃ３４－１、及び上記ｃで得れたＣＤ８クローン８Ｃ３４ＴＹについて解析した。
　ＸＡＧＥ１のアミノ酸配列の一部からなる２０のペプチドを合成した。各々のアミノ酸配列は配列番号５～２４に示す。また、各ペプチドのＸＡＧＥ１のアミノ酸配列上の位置については、配列表と図１９に示すとおりである。ペプチド合成は通常の合成法によりＰＨジャパン（日本）において合成した。純度は各々９５％以上である。
　ＣＤ４クローン若しくはＣＤ８クローンのＴ細胞２ｘ１０４を、同数のＴ－ＡＰＣと共に、各々のペプチドが１μＭになるように１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した。
　結果を図１９に示す。ＣＤ４クローンである４Ｃ３４－１はＳＬＰ２（４４－６８）の中でも、５２－６８位のアミノ酸を認識していた。また、ＣＤ８クローンである８Ｃ３４ＴＹはＳＬＰ１（８－３２）と１９－３３位のアミノ酸を認識し、この中にエピトープが存在すると考えられる。
　ＳＬＰ１及びＳＬＰ２で、抗ＸＡＧＥ１抗体陽性患者の末梢血単核球を刺激培養することで、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を認識する複数のＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の検出に成功した。このことは、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２ワクチンが、Ｔ細胞が認識するエピトープワクチンと違い、種々のエピトープを含む多抗原性のがんワクチンであることを示す。
＜ＳＬＰ１及びＳＬＰ２の併用療法の有用性＞
　ＣＤ４クローン（４Ｃ３４－１）Ｔ細胞１ｘ１０４を、同数のＴ－ＡＰＣと共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各のペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した（図２０）。ＣＤ４クローンのＴ細胞はＳＬＰ２を認識した。
　同様にＣＤ８クローン（８Ｃ３４ＴＹ）Ｔ細胞１ｘ１０４を、同数のＴ－ＡＰＣと共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各のペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した（図２０）。ＣＤ８クローンのＴ細胞はＳＬＰ１を認識していた。
　そこで、ＣＤ４クローン（４Ｃ３４－１）Ｔ細胞１ｘ１０４とＣＤ８クローン（８Ｃ３４ＴＹ）Ｔ細胞１ｘ１０４を同数のＴ－ＡＰＣと共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各のペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出したところ、ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用することで、反応が上昇した。
　ヒトの末梢血には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のみ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のみ存在するということはないので、ＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独ではなく、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用がより強い免疫応答を誘導することが可能である。
＜ＩｇＧ免疫の誘導能＞
　上記ａで得られた末梢血単核球１ｘ１０５を、ＣＤ４クローン４Ｃ３４－１Ｔ細胞２ｘ１０４、ＣＤ８クローンＣ３４ＴＹＴ細胞２ｘ１０４及びProtein Transport Inhibitor Cocktail（eBioscienc社、アメリカ）存在下（５００倍希釈）で、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各ペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養した。
　フローサイトメトリー法にてＢ細胞にゲートし、それぞれのペプチド刺激下でのＢ細胞表面上のＩｇＧ若しくはＩｇＡを検出した（図２１）。Ｂ細胞表面上のＩｇＧは、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を併用することで発現の上昇を認めた。一方でＩｇＡの発現量には変化はなかった。
　次に、上記ａと同一の患者血清から分離したＢ細胞１ｘ１０５を、ＣＤ４クローン４Ｃ３４－１Ｔ細胞２ｘ１０４とＣＤ８クローン８Ｃ３４ＴＹＴ細胞２ｘ１０４と共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各ペプチド併用（各１μＭ）で７２時間刺激培養した。
　その培養上清中に存在するＸＡＧＥ１特異的抗体を検出したところ、ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用した場合に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの検出を認め、ＩｇＡは認められなかった(図２２)。
　以上のとおり、抗ＸＡＧＥ１抗体陽性患者の末梢血単核球を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用して刺激することで、Ｂ細胞より抗原特異的なＩｇＧを検出した。よって、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を含有する組成物は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの産生を誘導でき、がんに対する免疫応答を誘導できるがんワクチンである。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性は、治療奏功群かつ予後良好群である為、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を含有する組成物は、患者を治療奏功かつ予後良好に導くことができる。
＜安全性＞
　ＳＬＰ１およびＳＬＰ２の混合物をアジュバントとともにSprague-Dawley系ラット（Crl:CD(SD)、投与開始時６週齢、１群雌雄各１０匹）の背部皮下に１０週間反復投与（１４日おきに５回間歇投与）し、毒性試験を行った。
　被験物質の投与量は、０．２ｍｇ／ｋｇ（ＳＬＰ１：０．２ｍｇ／ｋｇ＋ＳＬＰ２：０．２ｍｇ／ｋｇ）及び２ｍｇ／ｋｇ（ＳＬＰ１：２ｍｇ／ｋｇ＋ＳＬＰ２：２ｍｇ／ｋｇ）の２用量とした。注射用水及びピシバニールに溶解させたＳＬＰ１及びＳＬＰ２を等量のオイルアジュバントMONTANIDE ISA 51 VG（ISA51）と混和し、エマルジョンとし、１ｍＬ／ｋｇの投与容量で背部皮下に投与した。更に、注射用水及びピシバニールとISA51のエマルジョンを投与する媒体対照群と生理食塩液を投与する生理食塩液対照群を設けた。
　投与期間中、一般状態観察、体重測定及び摂餌量測定を行い、投与１０週に尿検査及び眼科学検査を行った。投与期間終了時には、血液学検査、血液化学検査、剖検、器官重量測定及び病理組織学検査を行った。
　被験物質投与に起因する死亡はみられず、いずれの検査においても被験物質投与による変化はみられなかった。
　なお、投与部位（背部皮下）において、媒体対照群及び被験物質投与群の雌雄ほぼ全例に投与物質の残留によると考えられる白色巣が剖検でみられ、病理組織学的には投与物質の貯留とともに、リンパ球/プラズマ細胞及び組織球の浸潤並びに線維化がみられた。また、媒体対照群の雌少数例では好中球浸潤もみられた。しかし、被験物質投与群における変化はいずれも媒体投与群と同程度であり、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２による変化の増強は認められなかった。
　アジュバントに起因する投与部位皮下の炎症反応がみられたが、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２による増強は認められず、被験物質投与に起因する毒性学的意義のある変化はみられなかった。したがって、本試験におけるＳＬＰ１及びＳＬＰ２の無毒性量は雌雄ともに２ｍｇ／ｋｇを上回ると考えられた。
＜ヒト用ワクチンの作製＞
　ＳＬＰ１およびＳＬＰ２をアジュバントＯＫ４３２ピシバニールと共にモンタナイド（ＩＳＡ５１、ＳＥＰＰＩＣ製）でエマルジョン化して、免疫応答誘導用組成物を得た（以下、ＸＡＧＥ１ワクチンともいう）。より具体的には、ＧＭＰグレードで作成した二種の長鎖ペプチドからなる混合ペプチドを３段階の用量で用意した。
　低用量：５００μg（ＳＬＰ１：２５０μｇ＋ＳＬＰ２：２５０μｇ）
　中用量：１ｍｇ（ＳＬＰ１：５００μｇ＋ＳＬＰ２：５００μｇ）
　高用量：２ｍｇ（ＳＬＰ１：１ｍｇ＋ＳＬＰ２：１ｍｇ）
これら混合ペプチドをＯＫ４３２（中外製薬）０．２ＫＥと共に１．２５ｍｌの生食に混和し、モンタナイド１．２５ｍｌによりエマルジョン化した。
＜安全性（第一相臨床試験）＞
　上記ＸＡＧＥ１ワクチンを進行期肺腺がん患者に対して投与した。本試験は、主目的として安全性を確認し、副次目的として試験薬の投与に伴うＸＡＧＥ１抗体価の変動を検討する第I相臨床試験である。本臨床試験は、「ヘルシンキ宣言」、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」およびＸＡＧＥ１ワクチン臨床試験実施計画書に則り実施したが、ICH E6(R1)-GCP（Guideline for Good Clinical Practice）に可能な限り準拠した。
　試験は、進行期または術後再発の肺腺がんを対象に、上記３段階の用量のＸＡＧＥ１ワクチン用いて行った。ＸＡＧＥ１ワクチンは、毎回、四肢の異なる部位２ヵ所に投与した。投与は、２週間隔で計４回行った。各用量は３例ずつ投与を行った。
　安全性に関しては、有害事象の種類・頻度・程度を観察した。有害事象のgradingは、Common Terminology Criteria for Adverse Events（CTCAE） v4.0日本語訳JCOG版を用いる。有害事象はCTCAE v4.0に従い、判定を行った。尚有害事象の観察期間は、試験薬初回投与日から最終投与6週後（個々の試験の終了）までとした。
　低用量群の３例、中用量群の３例および高用量群の１例の計７例で安全性に関する評価が終了した。表１で示すように、ＸＡＧＥ１ワクチンによる有害事象は、すべて軽微であり重篤な有害事象は観察されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜ＸＡＧＥ１ワクチンの有効性について＞
１．ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの誘導
　ＸＡＧＥ１ワクチンの投与により、７例中４例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認め、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡおよびＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧは誘導されなかった（図２３）。
ａ．ＸＡＧＥ１ワクチン低用量群３例中２例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認めた。
ｂ．ＸＡＧＥ１ワクチン中用量群３例中２例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認めた。
ｃ．ＸＡＧＥ１－ＩｇＡは治療前より７例中１例で陽性（ＫＭＸ－０１）であったが、その他は陰性であった。ＸＡＧＥ１ワクチンによって、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ抗体価の上昇は認められなかった。
　以上より、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで観察された、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２によるＸＡＧＥ１－ＩｇＧ免疫の特異的な誘導が、ｉｎ　ｖｉｖｏでも観察された。
２．腫瘍マーカー
　図２４で示すように、腫瘍マーカーの上昇抑制または低下が、７例中４例で観察された。
ａ．ＸＡＧＥ１ワクチン低用量群３例中２例で腫瘍マーカーの上昇抑制を認めた。
ｂ．ＸＡＧＥ１ワクチン中用量群３例中２例で腫瘍マーカーの低下を認めた。
ｃ．ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価が上昇した４例中３例で、腫瘍マーカーの上昇抑制もしくは低下が認められた。一方、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇が認められなかった３例中２例で腫瘍マーカーの上昇が観察された。
　以上より、ＸＡＧＥ1ワクチンによって腫瘍マーカーの上昇抑制もしくは低下が観察された。
２．抗原特異的Ｔ細胞の誘導
　低用量投与の患者及び中用量投与の患者の末梢血よりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、ＸＡＧＥ１ワクチン投与による抗原特異的Ｔ細胞の誘導について調べた。低用量投与の患者及び中用量投与の患者とも、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用刺激により、ＩＦＮ－γが産生され、ＳＬＰ１抗原及びＳＬＰ２抗原に反応性のＴ細胞が誘導されていることが証明された（図２５、図２６）。
　中用量投与の患者においては、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２の単独刺激によりＩＦＮγの産生が認められた。これらはＳＬＰ１およびＳＬＰ２が、複数のエピトープを含んでいることの証明であり、ＸＡＧＥ１ワクチンがＳＬＰ１単独ワクチン及びＳＬＰ２単独ワクチンより有用であることを示す。また、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用刺激より、より強いＩＦＮγの産生が確認できた（図２６）。
　以上より、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含むＸＡＧＥ１ワクチンは、がん患者において、抗原特異的なＴ細胞を誘導できるワクチンであり、かつ、 複数のエピトープを含む多抗原性ワクチンでもあり、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を混合することにより、より強い免疫応答を誘導できるワクチンであることがｉｎ　ｖｉｖｏで証明された。
　実験プロトコールは以下のとおりである。
ａ）ワクチン投与開始後１２週目の末梢血から比重遠心法によって単核球分画を得た。次いで、抗ＣＤ４抗体結合ビーズ、抗ＣＤ８抗体結合ビーズおよび抗ＣＤ１９抗体結合ビーズ（ミリテニーバイオテク社製）を用いて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ、ミリテニーバイオテク社製）によって、順次ＣＤ８陽性分画、ＣＤ４陽性分画、ＣＤ１９陽性分画およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ１９－分画を分離した.
ｂ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞１ｘ１０６個と、抗原提示細胞として、同数のＸ線照射（６０Ｇｙ）ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞とを、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２　各々１μＭ存在下で、９６ウェルプレートを用いてＣＯ２インキュベーター内で１２日間共培養した。Ｔ細胞を培養するための培地としては、特に記載がない場合は、５％プール血清／ＡＩＭ－Ｖ（ＩＬ－２　１０ＩＵ／ｍｌ、ＩＬ－７　１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。
ｃ）ＩＦＮ－γ産生細胞の検出
　刺激培養で増殖した抗原特異的なＴ細胞が含まれる細胞集団に、以下のように二次刺激を行い、抗原特異的なサイトカインの産生を検出した。
　刺激培養した後の細胞に、これと同数の自己のＥＢＶ－Ｂ細胞（エプスタイン・バール・ウイルス感染Ｂ細胞：抗原提示細胞として利用）及び、ペプチド（ＳＬＰ１、ＳＬＰ２若しくはＳＬＰ１＋ＳＬＰ２）を加え、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で二次刺激を行った。コントロールは、ペプチドを加えずに、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で二次刺激を行った。
　その後、ヒトＩＦＮ－γキャッチ抗体（ミリテニーバイオテク社製）２μｌを用いて培養細胞を標識するために、培養細胞を１０ｍｌのＡＩＭ－Ｖ培地に懸濁し、ローテーター（マックスミックス、ミリテニーバイオテク社製）を用いて懸濁しながら３７℃で４５分間、ＣＯ２インキュベーター内で反応させた。細胞を洗浄した後に、ＰＥ標識ヒトＩＦＮ－γ抗体（ミリテニーバイオテク社製）２μｌ、７ＡＡＤ（ＢＤ社製）２μｌ、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体またはＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体（ミリテニーバイオテク社製）１μｌを加えて染色した。
　染色後、ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒ（１％ＦＣＳ／ＰＢＳ，０．０２％アジ化ナトリウム）を加えて細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社製）を用いてフローサイトメトリーを行い、ＩＦＮ－γ産生細胞を検出した。ＩＦＮ－γ産生細胞の頻度は、データ解析ソフト（ＦｌｏｗＪｏ，Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ社製）を用いて解析した。結果を図２５及び図２６に示す。
　本発明の検出方法は、がん治療の効果を予測することができ、がん治療の可能性を広げるものである。また、医療経済にも貢献する。また、本発明の免疫応答誘導用組成物は、直接にがんの治療に用いることができるほか、化学療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害薬による治療の効果を増強させ、治療無効を治療有効に導くことができる。

Claims (15)

  1. 　試料中のがん精巣抗原に対する抗体を検出することを特徴とする、がん治療効果の検査方法。
  2. 　前記がん精巣抗原が、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つのがん精巣抗原である、請求項１に記載の方法。
  3. 　ＩｇＧタイプの抗体とＩｇＡタイプの抗体を検出する、請求項１または２に記載の検査方法。
  4. 　前記試料ががん治療前の被験体から採取された試料であり、該がん治療の効果を予測するための検査である、請求項１～３のいずれか１に記載方法。
  5. 　試料中の抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする、がん治療効果の検査方法。
  6. 　以下の１）～４）からなる群から選択される少なくとも１の場合に、がん治療の効果があると判定される、請求項１～５のいずれか一に記載の方法；
    　１）がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
    　２）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
    　３）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である、
    　４）複数のがん精巣抗原に対する抗体が陽性である。
  7. 　がん精巣抗原、がん精巣抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、及び抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キット。
  8. 　以下のａ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド；
    ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
    ｂ）前記ａ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
    ｃ）前記ａ）又はｂ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
    ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
    ｅ）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
    ｆ）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物。
  9. 　請求項８に記載のａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと請求項８に記載のｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するがんに対する免疫応答誘導用組成物。
  10. 　前記がんが、ＸＡＧＥ１陽性の肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、又は、膀胱癌である請求項９に記載の組成物。
  11. 　免疫療法前又は化学療法前に投与される、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. 　請求項８に記載のａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと請求項８に記載のｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するがんに対する免疫療法若しくは化学療法の効果増強剤。
  13. 　試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする、がんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法。
  14. 　前記試料が、がんワクチン用候補ペプチドによって刺激培養されたＢ細胞含有液から採取された試料である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　末梢血から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ２で刺激培養する工程を含む、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法。
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