WO2018212366A1 - 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법 - Google Patents

캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention introduces pyruvate decarboxylase derived from Candida tropicalis, which is less active than self-retained pyruvate decarboxylase, into cells, thereby producing ethanol, which acts as a by-product in the production of 2,3-butanediol.
  • the present invention relates to a recombinant yeast for producing 2,3-butanediol capable of producing acetyl-CoA necessary for growth, and a method for producing 2,3-butanediol using the same.
  • the present invention relates to a method for producing 2,3-butanediol, and more particularly, to a method for producing 2,3-butanediol in which the production of glycerol, a by-product of 2,3-butanediol production is suppressed. .
  • 2,3-butanediol (2,3-butanediol) is a chemical used in the synthesis of the major substances that make up solvents, antifreezes, plasticizers, pharmaceuticals, cosmetics, etc., and the liquid fuel additive MEK (Methyl Ethyl Ketone) It is a biochemical material used as a precursor of 1,3-butadiene for the production and synthesis of SBR (Stylene-butadiene Rubber), a raw material for automobile tires.
  • MEK Metal Ethyl Ketone
  • 2,3-dimethyl butane as a conventional strain used for the production of all the keulrep when Ella oxy cytokine (Klebsiella oxytoca), Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae ), Aerobacter aerogenes , Bacillus subtilis , Paenibacillus polymyxa ) and Serratia marcescens .
  • the strains can produce 2,3-butanediol in high yield / high productivity, they are classified as pathogenic microorganisms and have inherent limitations in safety and industrialization. Therefore, a technique for producing 2,3-butanediol using yeast, which is well known as a GRAS microorganism, has been developed in the past. However, yeast had the following limitations to be industrially used as a 2,3-butanediol producing strain.
  • the yeast strain succeeded in producing a high yield of 2,3-butanediol by introducing the 2,3-butanediol biosynthetic pathway, but with the removal of the PDC enzyme, the rate of cell growth and substrate consumption was significantly reduced. There was a problem that the productivity of, 3-butanediol was significantly low.
  • Biochemical material production technology is a technology for producing raw materials of various chemical substances and polymers using biomass as a raw material.
  • 2,3-butanediol is a substance that can be converted into synthetic rubber 1,3-butadiene, which is a material for automobile tires. In addition, it can be used for the production of methyl ethyl ketone (MEK), a liquid fuel additive through the dehydrogenation process. In addition, it can be converted into a material used in pharmaceuticals, cosmetics, etc. through the esterification reaction.
  • MEK methyl ethyl ketone
  • the 2,3-butanediol producing strain is a glycerol is produced as a by-product together with 2,3-butanediol, there is a problem that additional cost occurs in the purification process when glycerol is contained in the fermentation product. .
  • the present invention is to develop and provide a method for producing 2,3-butanediol with high purity and high productivity in a state in which the production of glycerol, a by-product generated in the production of 2,3-butanediol, is suppressed.
  • the present invention is transformed to lose the function of pyruvate decarboxylase, Candida Tropicalis ( Candida transformed to express pyruvate decarboxylase derived from tropicalis ), transformed to express acetolactate synthase, and express acetolactate decarboxylase It provides a recombinant Saccharomyces cerevisiae for 2,3-butanediol production, characterized in that it is transformed as possible, and transformed to express butanediol dehydrogenase. .
  • pyruvate decarboxylase derived from Candida tropicalis may be, for example, an amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the yeast strain for producing 2,3-butanediol of the present invention introduces Pdc derived from Candida tropicalis, which has lower activity than its own pyruvate decarboxylase (Pdc), into the cells, thereby producing acetyl-CoA without ethanol production. Synthesis of was able to increase the growth rate and substrate consumption rate of the cells, and ultimately significantly increased the productivity of 2,3-butanediol.
  • Saccharomyces cerevisiae for producing 2,3-butanediol of the present invention, the transformation of the pyruvate decarboxylase to be lost is performed.
  • Saccharomyces cerevisiae from the cells, fragmenting or removing part of the PDC1 gene encoding pyruvate decarboxylase 1, and removing the whole of the PDC5 gene encoding pyruvate decarboxylase 5 It may be achieved by crushing a portion or removing a whole, crushing a portion of the PDC6 gene encoding pyruvate decarboxylase 6 or removing the whole.
  • Loss of enzymatic activity can be achieved by partial or complete destruction of the gene encoding the enzyme. Partial disruction and knock-out of the gene are readily performed using techniques well known in the genetic engineering community. Since it is possible, a detailed description thereof will be omitted.
  • pyruvate decarboxylase derived from Candida tropicalis is expressed.
  • Such trait is for switching, one example Candida Tropical faecalis (Candida The PDC1 gene encoding pyruvate decarboxylase 1 derived from tropicalis ) was identified as Saccharomyces. cerevisiae ) can be achieved by introducing into cells.
  • Candida tropicalis ( Candida) Pyruvate decarboxylase 1 derived from tropicalis ) was moderately low in activity, and acetyl-CoA could be biosynthesized without ethanol production, resulting in high cell growth and glucose consumption rates.
  • Candida tropicalis of the present invention ( Candida) tropicalis) PDC1 gene of origin is preferably GPD2 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 2) It is recommended that the expression is controlled by the promoter.
  • GPD2 promoter may be composed of, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the trophy faecalis Candida (Candida The PDC1 gene derived from tropicalis ) is preferably introduced into one copy of the cells. According to the following experiments, when the GPD2 promoter was used and one copy was introduced into the cells, the cell growth and glucose consumption rates were high, ethanol was not produced, and ultimately the productivity of 2,3-butanediol was high. appear.
  • the present invention provides a method for producing 2,3-butanediol, characterized in that the culture of the recombinant Saccharomyces cerevisiae of the present invention.
  • the culturing is preferably performed using a medium containing glucose.
  • Glucose is the preferred carbon source of Saccharomyces cerevisiae, because when used as a carbon source can maximize the growth of the strain to increase productivity.
  • the production method of 2,3-butanediol of the present invention is preferably carried out while supplying oxygen, because it can promote the growth of microorganisms by generating a large amount of ATP through oxygen supply.
  • the production method of 2,3-butanediol of the present invention can be carried out by fed-batch culture to continuously supply glucose.
  • fed-batch culture By continuously feeding the medium in a fed-batch, it is possible to maximize production of 2,3-butanediol in one batch.
  • the present invention is determined in 2,3-butane diol produced saccharide as MY process three Levy jiae for, remove all of the genes GPD1 and GPD2 gene involved in the biosynthesis of glycerol and, NADH oxidase (NADH oxidase) encoding gene is introduced to the three Levy MY that a recombinant Saccharomyces process according to claim jiae (Saccharomyces cerevisiae ).
  • Saccharomyces cerevisiae for the production of 2,3-butanediol of the present invention refers to Saccharomyces cerevisiae which has introduced a route for the production of 2,3-butanediol through various genetic manipulations.
  • the transformation of the acetolactate synthase (acetolactate synthase) to be expressed is preferably achieved by introducing the gene alsS encoding alpha-acetolactate sythase
  • the acetolactate dekar Transformation to express the expression of acetlactate decarboxylase is preferably accomplished by introducing a gene alsD encoding alpha-acetolactate decarboxylase, wherein said butanediol dehydrogenase (butanediol dehydrogenase) expression is preferably achieved by overexpressing the gene BDH1 encoding 2,3-butanediol dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae itself It is good to be.
  • Saccharomyces cerevisiae of the present invention ( Saccharomyces) In cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae for producing 2,3-butanediol loses its own function of pyruvate decarboxylase, and Candida Tropicalis ( Candida)
  • the gene PDC1 encoding pyruvate decarboxylase derived from tropicalis is preferably introduced.
  • the loss of function of the pyruvate decarboxylase may partially destroy any one or more genes selected from the genes PDC1 , PDC5 , and PDC6 encoding pyruvate decarboxylase. Or by removing them all.
  • the PDC1 gene coding for the pyruvate kinase Cartesian acid la is, it is appropriate that are preferably expressed under the promoter GPD2.
  • the NADH oxidase is preferably NADH oxidase derived from Lactobacillus lactis .
  • the gene encoding the NADH oxidase is preferably inserted into the p426GPD plasmid, which is a multi copy plasmid, and it is preferable to use a promoter of the TDH3 gene as a promoter. This is because NADH oxidase activity was very high under these conditions.
  • the present invention is transformed to express acetolactate synthase (acetolactate synthase), transformed to express acetolactate decarboxylase, butanediol dehydrogenase (butanediol a dehydrogenase) that can be transformed to express, the genes GPD1 and GPD2 gene involved in the biosynthesis of glycerol is removed, and encoding gene is introduced to the NADH oxidase (NADH oxidase);
  • Recombinant Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • 2,3-butanediol can be produced in high purity, high yield, and high productivity without producing glycerol as a by-product.
  • the recombinant Saccharomyces cerevisiae preferably loses its own function of pyruvate decarboxylase and is candy. It is preferable to use the one in which the gene PDC1 encoding pyruvate decarboxylase derived from Candida tropicalis is introduced.
  • the production method of 2,3-butanediol of the present invention is preferably carried out while continuously supplying oxygen.
  • NADH can be consumed to lower the concentration of NADH in the cytoplasm. That is, GPD1 and The elimination of GPD2 allows the consumption of NADH accumulated in the cytoplasm.
  • the continuous supply of oxygen is more preferably lower the amount of oxygen supplied in the middle of the fermentation compared to the initial fermentation to continuously supply.
  • the amount of NADH supplied in the cytoplasm is high, which requires a large amount of oxygen to consume NADH.
  • the amount of oxygen needed to consume NADH is reduced.
  • acetoin which is an oxidized form of 2,3-butanediol, may accumulate as a by-product. Therefore, it is preferable to lower the amount of oxygen after the initial fermentation.
  • the culture is preferably a fed-batch culture to continuously supply glucose.
  • the fed-batch culture can maximize the yield of 2,3-butanediol.
  • the yeast strain for producing 2,3-butanediol of the present invention introduces Pdc derived from Candida tropicalis, which has lower activity than its own pyruvate decarboxylase (Pdc), into the cells, thereby producing acetyl but not ethanol. Synthesis of -CoA was able to increase the growth rate and substrate consumption rate of the cells, and ultimately significantly increased the productivity of 2,3-butanediol.
  • Figure 1 (A) is a graph of the result of fermentation with 2,3-butanediol producing strain (control) that does not express PDC .
  • Figure 1 (B) is a graph of the fermentation results of strains expressed with CtPDC1 .
  • Figure 1 (C) is a graph of the fermentation results of the strain expressed in KmPDC1 .
  • Candida tropicalis is Candida Tropicalis ( Candida) tropicalis ) Pdc titers according to various expression conditions (promoter type, copy number) of pyruvate decarvoxylase-expressing strains.
  • 3 is a graph showing the yield for the product (ethanol, glycerol, 2,3-butanediol) of PDC expression strains having various expression conditions.
  • Figure 4 (A) is a graph of 2,3-butanediol fermentation results 120 hours of the control group.
  • 4 (B) is a graph of 120 hours of fermentation of 2,3-butanediol of the BD5_G1CtPDC1 strain.
  • Figure 5 is a graph of 2,3-butanediol production results of the BD5_G1CtPDC1 strain measured by fed-batch culture.
  • Figure 8 shows the change of 2,3-butanediol fermentation pattern of BD5_Ctnox strain according to the oxygen supply amount. A) 25% air injection, B) 50% air injection, C) 100% air injection.
  • FIG. 11 is a map of a plasmid for Cas9 expression.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing a point mutation process for GPD1 gene removal.
  • Figure 13 is a schematic diagram showing the point mutation process for GPD2 gene removal.
  • Figure 14 shows the GPD1 gene sequence from which activity is removed, with the underlined portion showing the mutated portion.
  • Figure 15 shows the GPD1 gene sequence from which activity is removed, with the underlined portion showing the mutated portion.
  • A BD5_p426TDH3_Llnox
  • B BD5_T2nox_dGPD1
  • C BD5_T2nox_dGPD2
  • D BD5_T2nox_dGPD1dGPD2.
  • 17 is a high concentration of 2,3-butanediol production fermentation profile using BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 strain.
  • 2,3-butanediol high-productivity recombinant yeast was developed using metabolic techniques, and 2,3-butanediol was produced from glucose using high productivity. .
  • the pyruvate decarboxylase genes PDC1 , PDC5 and PDC6 were disrupted to construct a strain from which pyruvate decarboxylase activity was completely removed.
  • acetolactate synthase alsS
  • acetolactate decarboxylase alsD
  • Yeast strain from which the PDC gene was removed had a low rate of cell growth and substrate consumption, resulting in low productivity of 2,3-butanediol.
  • Candida Tropical faecalis (Candida tropicalis ), Kluyveromyces marxianus , Of the genome (genomic) after the extraction of the DNA, Candida Tropical faecalis (Candida tropicalis) PDC1 (CtPDC1) , Hyundai Vero My process Marcia Taunus (Kluyveromyces marxianus) derived by the PCR method of the saccharide My process three Levy jiae (Saccharomyces cerevisiae) in PDC1 (ScPDC1), PDC5 (ScPDC5), PDC6 (ScPDC6) genes from PDC1 (KmPDC1), Saccharomyces cerevisiae were cloned.
  • p426GPD plasmid containing 'origin' of '2 micron plasmid' and TDH3 promoter and CYC1 terminator from S. cerevisiae was used.
  • the PDC gene fragment obtained by the PCR method was ligated to the restriction sites of Xma I and Xho I of the p426GPD plasmid to construct a recombinant vector.
  • the recombinant vector constructed above was introduced into the PDC1 , 5, 6 removal yeast strain of Preparation Example 1 through transformation.
  • the CtPDC1 strain was significantly less active than other Pdc strains. Using low activity CtPDC1 strain, it was determined that the Pdc activity required to optimize 2,3-butanediol production could be controlled.
  • CtPDC1 expressing strain 2,3-butanediol producing strain, CtPDC1 expressing strain, and KmPDC1 expressing strain which did not express Pdc were used.
  • CtPDC1 and KmPDC1 were expressed using the TDH3 promoter and CYC1 terminator of S. cerevisiae .
  • a medium containing 6.7 g / L of 'yeast nitrogen base w / o nitrogen base', 1.4 g / L of 'amino acid mixture' and 80 g / L of glucose was used.
  • the initial seeding cell concentration was 0.2 g / L
  • the fermentation temperature was maintained at 30 ° C. and the stirring speed was 80 rpm.
  • the glucose consumption rate per hour was 0.10 g / L / h
  • the strain expressing CtPDC1 was 0.94 g / L / h
  • the strain expressing KmPDC1 was 1.09 g / L / h. .
  • the maximum dry cell concentration of the strain that did not express PDC was 0.2 g DCW / L
  • the strain expressing CtPDC1 was 2.7 g DCW / L
  • the strain expressing KmPDC1 was 2.8 g DCW / L.
  • the yield of 2,3-butanediol and ethanol in the strain without PDC expression was 0.259 g 2,3- butanediol / g glucose and 0 g ethanol / g glucose, and the strain expressing CtPDC1 0.185 g 2,3 -butane diol / g glucose, 0.185 g ethanol / g glucose, one strain expressing KmPDC1 is 0.134 g was 2,3-butane diol / g glucose, 0.275 g ethanol / g glucose.
  • 2,3-butanediol productivity of the strain that did not express PDC was 0.026 g 2,3- butanediol / L / h
  • the strain expressing CtPDC1 0.175 g 2,3- butanediol / L
  • the strain expressing / h, KmPDC1 was 0.147 g 2,3- butanediol / L / h.
  • FIG. 1 is a graph of the result of fermentation with 2,3-butanediol producing strain (control) that does not express PDC .
  • 1 (B) is a graph of fermentation results of strains expressed with CtPDC1 .
  • Figure 1 (C) is a graph of the fermentation results of the strain expressed in KmPDC1 .
  • Example 3 candy Tropicalis ( Candida tropicalis Origin Pyruvate Decarboxylase (pyruvate decarboxylase Strains with various expression conditions) in vitro activity assay ']
  • Candida Tropical faecalis (C. tropicalis) amplifies the PDC1 gene (CtPDC1) derived from each of the expression vector-inserted (each CYC1 promoter as the promoter, the promoter sequence number GPD2 3-, CYC1 terminator both as a TDH3 promoter and terminator used) After transformation, recombinant yeast strains were prepared. As a strain to be used for transformation, cells were cultured in a YNB medium for 2 days, and then the cells at the time of OD value 3 were used.
  • FIG. 2 shows Pdc titers of pyruvate decarvoxylase-expressing strains derived from Candida tropicalis .
  • Example 4 candy Tropicalis ( Candida tropicalis Origin Pyruvate Decarboxylase (pyruvate decarvoxylase 2,3- using strains expressing Butanediol production]
  • the initial inoculum cell concentration was 0.2 g / L, the fermentation temperature was maintained at 30 ° C and the stirring speed of 80 rpm in a glass flask.
  • the 2,3-butanediol yield was 0.292 g 2,3- butanediol / g glucose and no ethanol was produced.
  • the yields of 2,3-butanediol were similar between BD5_C1CtPDC1 and BD5_G1CtPDC1 strains, but BD5_C1CtPDC1 produced a high by-product yield of glycerol, which was not preferable. Therefore, the BD5_G1CtPDC1 strain was more suitable as a 2,3-butanediol producing strain.
  • the PDC expression strain increased cell growth and glucose consumption rate, while the glucose consumption rate per unit time of the control group was 0.26 g glucose / L / h, 0.62 g glucose / L / h for the BD5_G1CtPDC1 strain.
  • the yield of 2,3-butanediol was comparable compared to the control, but the productivity of 2,3-butanediol increased from 0.076 g / L / h to 0.181 g / L / h of the control ( 4).
  • FIG. 4 (A) is a graph of 120 hours fermentation result of 2,3-butanediol in the control group
  • FIG. 4 (B) is a graph of 120 hours fermentation result of 2,3-butanediol of strain BD5_G1CtPDC1.
  • a fed-batch culture in which glucose was added in the middle of fermentation was carried out in order to determine whether the BD5_G1CtPDC1 strain is suitable as a 2,3-butanediol producing strain.
  • YP medium Yeast extract 10 g / L, peptone 20 g / L
  • the initial glucose concentration was 270 g / L
  • 800 g / L of glucose solution was added in the middle of fermentation.
  • the initial seeding cell concentration was 2 g / L
  • the fermentation temperature was maintained at 30 ° C.
  • 0.5 vvm of air was injected
  • the stirring speed was maintained at 200 rpm.
  • FIG. 5 is a graph of the production results of 2,3-butanediol measured by fed-batch culture using BD5_G1CtPDC1 strain.
  • Candida Tropicale of the present invention ( Candida) A pyruvate decarboxylase introduced strain derived from tropicalis was found to be suitable for 2,3-butanediol production.
  • Recombinant Saccharomyces cerevisiae strain for producing 2,3-butanediol is an alpha-acetolactate synthase derived from Bacillus subtilis for the introduction of 2,3-butanediol biosynthetic pathway.
  • alpha-acetolactate sythase, alsS ), alpha-acetolactate decarboxylase ( alsD ) are introduced, and 2,3-butanediol dehadrazinase of yeast itself (2,3- butanediol dehydrogenase ( BDH1 ) gene is based on overexpression, the present inventors in this basic 2,3-butanediol producing strain, Saccharomyces ( Saccharomyces) cerevisiae ) has developed a pyruvate decarboxylase (Pdc) gene PDC1 , PDC5 , PDC6 fragment ('BD5' strain), which is possessed by its own strain, and is more active than its own Pdc.
  • Pdc pyruvate decarboxylase
  • NADH oxidase NADH oxidase, NoxE
  • glycerol-3-phosphate dehydrogenase GPD1, GPD2
  • yeast strains disrupted for by the gene, all the newly produced 2,3-dimethyl butane production (refer to Fig. 2 ).
  • NADH can be consumed because NADH oxidase that can oxidize NADH is overexpressed.
  • the present invention is to produce a high purity, high yield and high productivity while still completely inhibiting, 2,3-butane diol production of glycerol by removing all of GPD1 and GPD2 gene. (Reference figure 2).
  • the NADH oxidase-introduced strain constructed in the present invention regulates the activity according to the amount of oxygen supplied into the incubator and also affects 2,3-butanediol production.
  • the development of high concentration / high yield / high productivity 2,3-butanediol production technology has been developed through optimization of the culture process such as sugar concentration and oxygen supply control.
  • Yeast strains for producing 2,3-butanediol were produced in the inventors' prior studies (Korean Patent Publication No. 10-2015-0068581, Korean Patent Application No. 10-2015-0124845), and the present inventors was carried out as a parent strain ('BD5' strain).
  • the parent strain removed the pyruvate decarboxylase (Pdc) genes PDC1 , PDC5 , and PDC6 from S. cerevisiae strains, and alpha from Bacillus subtilis .
  • Pdc pyruvate decarboxylase
  • Acetolactate synthase (AlsS) and alpha-acetolactate decarboxylase (AlsD) and 2,3-butanediol dehydro of Saccharomyces cerevisiae Ginase (2,3-butanediol dehydrogenase, Bdh1) is introduced or enhanced to form a 2,3-butanediol biosynthetic pathway.
  • expression plasmid preparation and gene cloning were performed. A total of five expression plasmids were prepared for expression.
  • PRS406 single copy plasmid
  • pRS406 Multiple copy plasmid
  • Sac I Bam HI restriction enzyme site of plasmid
  • Saccharomyces cerevisiae the GPD2 gene promoter 1144 bp, Sac I, Xba I restriction enzyme was inserted into the 655 bp TDH3 gene promoter.
  • Sac I, Bam HI locus of p426GPD plasmid (Mumberg et al., Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.Gen 156 (1), 119-122), which is a multi copy plasmid was inserted at the Saccharomyces access to my Celebi jiae CYC1 gene promoter 289 bp, GPD2 gene promoter 1144 bp, Sac I, TDH3 gene promoter on the 655 bp xba I place.
  • a total of five expression plasmids (p406GPD2, p406TDH3, p426CYC1, p426GPD2, p426TDH3) thus prepared were cloned from the Lactobacillus lactis subsp.cremoris MG1363 strain by PCR method (NADH oxidase gene). SEQ ID NO: 4) was inserted.
  • pyruvate decarboxylase gene used to increase glucose consumption rate and cell growth rate of Pdc-deficient yeast strains was introduced in a previous study.
  • a single copy plasmid having a resistance gene against aureobasidin A, an antibiotic, expressed NADH oxidase using the TDH3 promoter and CYC1 terminator, and Candida Tropicalis ( Candida tropicalis) the pyruvate kinase called Cartesian acid (pyruvate decarboxylase, CtPDC1) was derived from the expression under GPD2 promoter.
  • the gene encoding pyruvate decarboxylase (CtPDC1) from Candida tropicalis is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the CYC1 promoter is set forth in SEQ ID NO: 5
  • GPD2 The promoter is set forth in SEQ ID NO: 3
  • TDH3 promoter is set forth in SEQ ID NO: 6.
  • NADH oxidase expression plasmid prepared in Example 6 was designed to have different activities. Therefore, in vitro enzyme titers were measured to compare the expression levels of actual NADH oxidase of the prepared strains.
  • YNB medium Yeast nitrogen base 6.7 g / L, amino acid mixture 1.4 g / L
  • a medium containing 80 g / L glucose and 0.5 g / L ethanol was used.
  • the supernatant was used for the measurement of NADH oxidase after extracting the enzyme in cells using 'Yeast Protein Extraction Reagent (Y-PER, Thermo Scientific, MA)'.
  • NADH oxidase measurement was carried out at 30 °C, was measured using a reduced absorbance at 340 nm by reacting in a condition containing 0.4 mM NADH, 0.3 mM EDTA in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). Protein concentration in the crude extract was measured by the 'bradford' method. One unit was expressed as 1 ⁇ mol NADH oxidized per minute.
  • the NADH oxidase activity was different depending on the promoter and the copy number used for expression.
  • the control group was BD5 strain (Kim et al., Expression of Lactococcus) lactis NADH oxidase increases 2,3-butanediol production in Pdc-deficient Saccharomyces cerevisiae , Bioresource Technology 191 (2015) 512-519), a strain with p426TDH3 empty vector inserted.
  • BD5_p406GPD2_Llnox strain showed 11.2 mU / mg protein activity compared with 4.8 mU / mg protein in control group, and 9153 mU / mg protein showed about 900-fold improvement in BD5_p406GPD2_Llnox strain compared to BD5_p406GPD2_Llnox strain. Indicated.
  • NADH In yeast strains producing Pdc-deficient 2,3-butanediol, NADH accumulates in the cytoplasm when producing 2,3-butanediol from sugars, and oxidizing it through respiration is limited, thereby causing excess glycerol It is produced as a byproduct.
  • the production yield of glycerol was decreased and the production yield of 2,3-butanediol was increased through the expression of NADH oxidase.
  • the effect also increased as the NADH oxidase expression amount increased.
  • NADH oxidase used in this study reacts with NADH using oxygen as a substrate and produces water and NAD + . Therefore, the activity of NADH oxidase can be controlled through the amount of oxygen supplied into the medium under fermentation while controlling the amount of NADH oxidase enzyme expression.
  • batch culture experiments with different oxygen conditions were performed to confirm the effect of NADH oxidase on the supply of oxygen and its effect on 2,3-butanediol fermentation.
  • a medium containing 90 g / L of glucose in YP Yeast extract 10 g / L, Peptone 20 g / L
  • the oxygen supply conditions were varied so that 25%, 50%, 100% air was introduced by mixing nitrogen with the air supplied into the medium.
  • the fermentation temperature was maintained at 30 degrees and air and air / nitrogen mixed gas were injected at 2 vvm and stirred at 500 rpm.
  • a fermentor of 1 L size was used and the working volume was 500 mL.
  • Figure 8 shows the change of 2,3-butanediol fermentation pattern of BD5_Ctnox strain according to the oxygen supply amount. A) 25% air injection, B) 50% air injection, C) 100% air injection.
  • NADH and NAD + concentrations in the cells were measured using the cells at 20 hours obtained in Example 9. About 4 ⁇ 10 7 cells were used for the measurement and measured using the NAD + / NADH measurement kit (BioAssay Systems, CA).
  • BD5_Ctnox strain As a 2,3-butanediol mass production strain, fed-batch culture in which glucose was added in the middle of fermentation was performed. The fermentation intermediate oxygen feed was switched to modulate the activity of NADH oxidase to reduce the production of glycerol and maximize the production of 2,3-butanediol.
  • the medium used was YP medium, the initial glucose concentration was 330 g / L, and 800 g / L of glucose solution was added in the middle of fermentation. Initial cell inoculation concentration was 2.0 g / L and fermentation temperature was maintained at 30 degrees.
  • Oxygen was supplied under the condition of 2 vvm, 500 rpm from the beginning to the middle of fermentation, and then oxygen was supplied under the condition of 1 vvm, 200 rpm.
  • 154.3 g / L of 2,3-butanediol was produced after 78 hours of incubation, and the productivity was 1.98 g 2,3- Butanediol / L / h (see FIG. 10 and Table 5).
  • the yield of 2,3-butanediol was 0.404 g 2,3- Butanediol / g Glucose .
  • Gpd Levy jiae dehydratase
  • the GPD1 and the recombinant 2,3-butane diol for the production of yeast strain removing the GPD2 gene was constructed to 2,3-butane diol production when, completely inhibiting the occurrence of glycerol in the invention. It was applied to Cas9-CRISPR way to achieve this, to remove the GPD1 and GPD2 gene activity in a manner to switch the GPD1 and GPD2 codon of ORF middle of the gene stop codon.
  • the yeast was expressed by inserting the Cas9 gene sequence into a plasmid containing the AUR1-C gene resistant to the Aureobasidin A antibiotic, and expressing each mutant portion of GPD1 and GPD2.
  • a guide target DNA and the DNA repair is the NADH oxidase by the transformed in 2,3-butane diol-producing strain expressing the conversion activity of GPD1, GPD2 remove strain BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 was produced that.
  • Candida Tropical expressed by GPD2 promoter BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 faecalis strains (Candida tropicalis ) -derived pyruvate decarboxylase to prepare a BD5_T2nox_dGPD1dGPD2_CtPDC1 strain.
  • FIG. 11 is a map of a plasmid for Cas9 expression.
  • 12 is a schematic diagram showing a point mutation process for GPD1 gene removal.
  • Figure 13 is a schematic diagram showing the point mutation process for GPD2 gene removal.
  • Figure 14 shows the GPD1 gene sequence from which activity is removed, with the underlined portion showing the mutated portion.
  • Figure 15 shows the GPD1 gene sequence from which activity is removed, with the underlined portion showing the mutated portion.
  • a 2,3-butanediol producing strain without NADH oxidase activity was prepared by removing the NADH oxidase expression plasmid from the BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, and BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 strains prepared in Example 12.
  • BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, and BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 strains were repeatedly passaged in a medium containing uracil, a marker of NADH oxidase expression plasmid, and the medium containing uracil and the uracil-free medium did not contain lysyllate medium. Strains from which the NADH oxidase plasmid was removed were selected by replica plating.
  • NADH oxidase plays a role in oxidizing additional NADH resulting from removal of the GPD gene into NAD + , thereby allowing this recombinant strain to grow.
  • 16 shows the results of plasmid curing experiments of BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, and BD5_T2nox_dGPD1_dGPD2 strains.
  • Batch culture was performed using the yeast strain for producing 2,3-butanediol prepared in Example 12.
  • YP medium was used, and initially 100 g / L of glucose and 0.7 g / L of ethanol were supplied as carbon sources. Inoculation cell concentration, culture temperature, culture conditions and the like were the same as in Example 3.
  • A BD5_p426TDH3_Llnox
  • B BD5_T2nox_dGPD1
  • C BD5_T2nox_dGPD2
  • D BD5_T2nox_dGPD1dGPD2.
  • Example 15 Batch , Oil price High productivity and high productivity through cultivation method and oxygen supply control 2,3- Butanediol production]
  • 17 is a high concentration of 2,3-butanediol production fermentation profile using BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 strain.

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Abstract

본 발명은 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제를 균체 내로 도입함으로써, 2,3-부탄다이올의 생산에 부산물로 작용하는 에탄올이 생성 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해, 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도가 증가시킬 수 있었다. 이를 통해, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있었다. 본 발명은 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것으로, 기존의 사카로마이세스 세레비지애 (효모)를 이용한 2,3-부탄다이올 생산 기술은 2,3-부탄다이올의 생산과 함께 부산물로 글리세롤이 다량 생산되었다. 하지만, 본 발명의 효모 균주는 부산물인 글리세롤의 생산이 억제된 상태에서, 2,3-부탄다이올을 고순도, 고수율, 고생산성으로 생산할 수 있다.

Description

캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법
본 발명은 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제를 균체 내로 도입함으로써, 2,3-부탄다이올의 생산에 부산물로 작용하는 에탄올의 생성은 최소화되나, 생육에 필요한 아세틸-CoA를 생산할 수 있는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명은 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 2,3-부탄다이올 생산의 부산물인 글리세롤의 생성이 억제된 2,3-부탄다이올이 생산방법에 관한 것이다.
2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)은 용매, 부동액, 가소제, 의약품, 화장품 등을 구성하는 주요 물질의 합성에 이용되는 화학 물질이며, 액체 연료 첨가제인 MEK(Methyl Ethyl Ketone)의 생산, 자동차 타이어의 원료 물질인 SBR(Stylene-butadiene Rubber)의 합성을 위한 1,3-부타디엔의 전구체로 사용되고 있는 바이오화학소재이다.
생물학적 방법을 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하기 위해서는 대사공학적 기술을 응용하여, 2,3-부탄다이올 균주를 개발해야 하고, 최적의 발효 공정을 개발해야 한다. 특히, 2,3-부탄다이올의 대량 생산을 위한 균주의 안전성을 확보하고, 상업화를 위하여 높은 수율과 높은 생산성을 갖는 균주의 개발이 필요하다.
한편, 2,3-부탄다이올의 생산을 위해 사용된 기존의 균주로는 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca ), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 아에로박터 아에로게네스(Aerobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa ), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 등이 있었다.
그런데, 상기 균주들은 2,3-부탄다이올을 고수율/고생산성으로 생산할 수 있음에도 불구하고, 병원성 미생물로 분류되어 안전 및 산업화에 태생적인 한계가 있었다. 이에 GRAS 미생물로 잘 알려진 효모를 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하는 기술이 종래에 개발되었다. 하지만, 효모는 산업적으로 2,3-부탄다이올 생산 균주로 이용되기에는 다음의 한계점을 가지고 있었다.
기존 기술에서는 2,3-부탄다이올의 주요 전구체인 파이루베이트를 에탄올로 전환되는 것을 막기 위하여 핵심 유전자인 PDC (pyruvate decarboxylase) 유전자를 제거한 효모 균주를 이용하였다. 이 효모 균주는 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 도입하여 높은 수율의 2,3-부탄다이올을 생산하는 데에는 성공하였지만, PDC 효소의 제거에 따라 세포 성장 및 기질 소모 속도가 현저히 감소하여 2,3-부탄다이올의 생산성이 현저히 낮은 문제가 있었다.
따라서, 효모를 이용하여 2,3-부탄다이올을 상업적으로 생산하기 위해서는 기존 균주의 갖는 낮은 세포 성장 속도 및 기질 소모 속도를 해결해야 하는 문제가있었던 것이다.
바이오화학소재 생산 기술이란, 바이오매스를 원료로 하여 각종 화학물질 및 고분자의 원료를 생산하는 기술이다.
2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)은 자동차 타이어의 소재가 되는 합성고무 1,3-부타디엔(butadiene)으로 전환 가능한 물질이다. 또한, 탈수소화 과정을 통하여 액체 연료 첨가제인 메틸 에틸 케톤 (methyl ethyl ketone, MEK)의 생산에도 이용될 수 있다. 그 외에 에스테르화 반응을 통하여 제약, 화장품 등에 사용되는 소재로 전환이 가능하다.
2,3-부탄다이올을 생물학적 방법을 통하여 생산하고자 할 때, 대사공학기법을 이용하여 2,3-부탄다이올 생산용 균주와 이를 이용한 발효 공정의 개발이 필요하다. 특히, 2,3-부탄다이올의 산업적, 경제적 생산을 위해, 높은 수율, 생산성, 순도로 생산 가능한 균주 개발이 필요하다.
미생물 발효를 통한 2,3-부탄다이올 생산은 주로 크렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등의 박테리아 균주를 이용한 방법이다. 하지만, 이들 박테리아 균주는 대부분 병원성 미생물로 분류되어 안전 및 산업화에 제약이 있다.
따라서, 최근에는 GRAS 미생물인 효모를 이용한 2,3-부탄다이올 생산 방법이 개발되었다. 이 기술에서는 효모로부터 에탄올이 생산되는 것을 막고, 2,3-부탄다이올의 생산을 증가시키기 위하여 핵심 유전자인 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase) 유전자를 제거하거나 발현량을 조절하고, 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 도입함으로써, 고농도의 2,3-부탄다이올을 생산하는데 성공하였다.
그런데, 상기 2,3-부탄다이올 생산 균주는 2,3-부탄다이올과 함께 부산물로 글리세롤이 생산되며, 발효 산물에 글리세롤이 포함되어 있을 경우 정제 공정상에 추가적인 비용이 발생하는 문제가 있다.
따라서, 2,3-부탄다이올을 좀 더 경제적이고, 상업적으로 생산하기 위해서는 글리세롤의 생산이 억제된 2,3-부탄다이올 생산 균주의 개발이 필요하다.
본 발명에서는 기존의 2,3-부탄다이올 생산용 균주가 갖는 낮은 세포 성장 속도 및 기질 소모 속도를 해결하여 고 생산성으로 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 2,3-부탄다이올 생산시 발생하는 부산물인 글리세롤의 생산이 억제된 상태에서 2,3-부탄다이올을 고순도, 고생산성로 생산할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은, 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되며, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고, 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고, 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다. 이때, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)는, 일 예로 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주는 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제 (Pdc)보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써, 에탄올 생성이 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도가 증가시킬 수 있었고, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있었다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환하는 것은, 일 예로, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체로부터, 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하고, 피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)를 암호화하는 PDC5 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하며, 피루베이트 데카르복실라아제 6 (pyruvate decarboxylase 6)을 암호화하는 PDC6 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거함으로써 달성될 수 있다.
효소 활성의 소실은 해당 효소를 암호화하는 유전자를 일부 파쇄하거나 전체를 제거함으로써 달성 가능한데, 유전자의 일부 파쇄 (partial disruction) 및 전체 제거 (knock-out)는 유전공학계에 널리 알려진 기술을 이용하여 쉽게 수행 가능하므로, 이에 관한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환하는 것은, 일 예로 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 다른 유래의 것들보다 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 1가 그 활성이 적절히 낮아 에탄올 생성은 하지 않으면서도, 아세틸-CoA는 생합성할 수 있어 세포 성장 및 글루코스 소비속도가 높게 나타났다.
한편, 상기 본 발명의 상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는, 바람직하게 GPD2 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 2) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것이 좋다. GPD2 프로모터는 일 예로 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
또한, 상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는, 바람직하게 균체 내로 1 카피(copy) 도입되는 것이 좋다. 하기 실험에 의할 경우, GPD2 프로모터를 이용하고 균체 내로 1 카피 도입하였을 경우, 세포 성장 및 글루코스 소비속도가 높게 나타나고, 에탄올은 생성되지 않았으며, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성이 높게 나타났다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다. 이때, 상기 배양은 바람직하게 글루코스를 함유하는 배지를 이용하여 수행되는 것이 좋다. 글루코스는 사카로마이세스 세레비지애가 선호하는 탄소원으로써, 이를 탄소원으로 사용할 경우, 균주의 생육이 극대화되어 생산성을 높일 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올의 생산방법은, 바람직하게 산소를 공급하면서 수행하는 것이 좋은데, 산소 공급을 통해 ATP가 다량 생성됨으로써 미생물의 생육을 촉진시킬 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올의 생산방법은, 글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양으로 수행할 수 있다. 배지를 유가식으로 계속 공급함으로써, 한 배치 (one batch)에서 2,3-부탄다이올을 최대로 생산할 수 있다.
본 발명은 2,3-부탄다이올 생산용 사카로마이세스 세레비지애에 있어서, 글리세롤 생합성에 관여하는 GPD1 유전자 및 GPD2 유전자가 모두 제거되고, NADH 옥시다아제 (NADH oxidase)를 암호화하는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다. GPD1 유전자 및 GPD2 유전자를 모두 제거하고, NADH 옥시다아제 (NADH oxidase)를 암호화하는 유전자를 도입하면, 글리세롤의 생산없이 2,3-부탄다이올을 고순도, 고수율, 고생산성으로 생산할 수 있음이 하기 본 발명의 실험을 통해 확인되었다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 사카로마이세스 세레비지애는 다양한 유전적 조작을 통해 2,3-부탄다이올의 생산을 위한 경로가 도입된 사카로마이스세 세레비지애를 의미하는 것으로, 이와 같은 목적으로 그 기개발된 공지의 균주들 (Ng et al., Production of 2,3-butanediol in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering, Microbial Cell Factories, 2012, 11:68)을 이용할 수도 있는데, 바람직하게는 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되어 있으며, 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되어 있고, 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환되어 있는 것을 사용하는 것이 좋다.
이때, 상기 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환하는 것은 바람직하게 알파-아세토락테이트 신타아제 (alpha-acetolactate sythase)를 암호화하는 유전자 alsS를 도입함으로써 달성되며, 상기 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환하는 것은 바람직하게 알파-아세토락테이트 데카르복실라아제 (alpha-acetolactate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 alsD를 도입함으로써 달성되고, 상기 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 하는 것은 바람직하게 사카로마이세스 세레비지애 자체 보유의 2,3-부탄다이올 데하드로지나아제 (2,3-butanediol dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 BDH1를 과발현함으로써 달성되는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 상기 2,3-부탄다이올 생산용 사카로마이세스 세레비지애는, 자체 보유의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되고, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1이 도입되어 있는 것이 좋다. 이때, 더욱 바람직하게 상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능 소실은, 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1, PDC5, PDC6 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 일부 파쇄하거나, 전부 제거함으로써 달성되는 것이 좋다. 또한, 상기 피루베이트 데카르복실라아제를 암호화하는 유전자 PDC1은, 바람직하게 GPD2 프로모터 하에서 발현되는 것이 좋다.
사카로마이세스 세레비지애 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제 (Pdc)보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써, 에탄올 생성이 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도를 증가시킬 수 있고, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있기 때문이다 (대한민국 특허출원 제10-2015-0124845호 참조요망).
한편, 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 상기 NADH 옥시다아제는 바람직하게 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) 유래의 NADH 옥시다아제인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 상기 NADH 옥시다아제를 암호화하는 유전자는 바람직하게 다중 카피 플라스미드 (multi copy plasmid)인 p426GPD 플라스미드에 삽입되어 있고, 프로모터로 TDH3 유전자의 프로모터를 사용하는 것이 좋다. 이와 같은 조건에서 NADH 옥시다아제의 활성이 매우 높게 나타났기 때문이다.
한편, 본 발명은 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되어 있고, 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되어 있으며, 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환되어 있고, 글리세롤 생합성에 관여하는 GPD1 유전자 및 GPD2 유전자가 제거되고, NADH 옥시다아제 (NADH oxidase)를 암호화하는 유전자가 도입된; 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 포도당이 첨가되어 있는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산방법에 의할 경우, 부산물인 글리세롤의 생산 없이 2,3-부탄다이올을 고순도, 고수율, 고생산성으로 생산할 수 있다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올의 생산방법에 있어서, 상기 재조합 사카로마이세스 세레비지애는 바람직하게 자체 보유의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되고, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1이 도입되어 있는 것을 사용하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올의 생산방법은, 바람직하게 산소를 지속적으로 공급하면서 수행하는 것이 좋다. 산소가 공급됨으로써, NADH를 소비하게 되어 세포질 내 NADH 농도를 낮출 수 있다. 즉, GPD1 및 GPD2의 제거로 인해 세포질 내에 쌓인 NADH를 소비할 수 있는 것이다. 이때, 상기 산소의 지속적 공급은 더욱 바람직하게 발효 중간에 공급되는 산소의 양을 발효 초기에 비해 낮추어 지속적으로 공급하는 것이 좋다. 발효 초기엔 세포 성장 및 포도당 소모 속도가 크기 때문에, 세포질 내 공급되는 NADH의 양이 많아 많은 양의 산소를 공급하여 NADH를 소모시켜야 하지만, 발효 초기 이후에는 세포 성장속도 저하 및 포도당 소모 속도가 감소하여 NADH를 소모시키기 위해 필요한 산소의 양이 줄어든다. 이때 과량의 산소가 공급되었을 경우, 2,3-부탄다이올의 산화된 형태인 아세토인이 부산물로 축적될 수 있으므로, 발효 초기 이후에는 산소의 양을 낮추는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산방법에 있어서, 상기 배양은 바람직하게 포도당을 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다. 유가식 배양을 통해 2,3-부탄다이올의 생산량을 극대화할 수 있다.
기존의 효모를 이용한 2,3-부탄다이올 생산 기술은 2,3-부탄다이올을 낮은 생산성으로 생산할 수밖에 없었다.
하지만, 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주는 자체 보유 피루베이트 데카르복실라아제 (Pdc)보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써, 에탄올 생성이 안 되면서도 아세틸-CoA의 합성은 가능해 균체의 성장속도 및 기질 소모 속도를 증가시킬 수 있었고, 궁극적으로 2,3-부탄다이올의 생산성을 크게 향상시킬 수 있었다.
즉, 종래의 Pdc 결여 균주는, Pdc 결여에 따라, 에탄올 생합성 외에 아세틸-CoA까지 생성되지 않아, 균체가 효율적으로 성장하지 못하였는데, 본 발명에서는 이와 같은 문제를 캔디다 트로피칼리스 유래의 Pdc를 균체 내로 도입함으로써 해결한 것이다. 이를 통해 본 발명에서는 고농도의 2,3-부탄다이올을 높은 생산성으로 생산할 수 있었다.
기존의 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (효모)를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산 기술은 2,3-부탄다이올의 생산과 함께 부산물로 글리세롤이 다량 생산되었다. 하지만, 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용할 경우, 글리세롤의 생산이 억제된 상태에서, 2,3-부탄다이올을 고순도, 고수율, 고생산성로 생산할 수 있다.
도 1(A)는 PDC를 발현하지 않는 2,3-부탄다이올 생산 균주(대조군)로 발효한 결과 그래프이다. 도 1(B)는 CtPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이다. 도 1(C)는 KmPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이다.
도 2는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarvoxylase) 발현 균주의 다양한 발현 조건 (프로모터 종류, 카피 수)에 따른 Pdc 역가 측정 결과이다.
도 3은 다양한 발현 조건을 갖는 PDC 발현 균주의 생산물 (에탄올, 글리세롤, 2,3-부탄다이올)에 대한 수율을 나타내는 그래프이다.
도 4(A)는 대조군의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이다. 도 4(B)는 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이다.
도 5는 유가식 배양을 통해 측정한 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 생산 결과 그래프이다.
도 6은 NADH 옥시다아제 발현 균주의 in vitro 역가 측정 결과로서, Con; BD5_p426TDH3, G1; BD5_p406GPD2_Llnox, C2; BD5_p426CYC1_Llnox, T1; BD5_p406TDH3_Llnox, G2; BD5_p426GPD2_Llnox, T2; BD5_p426TDH3_Llnox이다.
도 7은 회분식 배양을 통해 NADH 옥시다아제 발현 균주의 2,3-부탄다이올 발효 양상 변화를 확인한 결과이다. A; BD5_p426TDH3 (대조군), B; BD5_p426TDH3_Llnox.
도 8은 산소 공급량에 따른 BD5_Ctnox 균주의 2,3-부탄다이올 발효 양상 변화를 보여준다. A) 25% 공기 주입, B) 50% 공기 주입, C) 100% 공기 주입.
도 9는 산소 공급량에 따른 세포 내 보효소 NADH 및 NAD+ 농도 변화 측정 결과이다.
도 10은 BD5_Ctnox 균주를 이용한 유가식 배양 프로파일이다.
도 11은 Cas9 발현용 플라스미드의 맵이다.
도 12는 GPD1 유전자 제거를 위한 점 돌연변이 (point mutation) 과정을 보여주는 모식도이다.
도 13은 GPD2 유전자 제거를 위한 점 돌연변이 과정을 보여주는 모식도이다.
도 14는 활성이 제거된 GPD1 유전자 서열을 보여주는데, 밑줄 부분은 돌연변이된 부분을 나타낸다.
도 15는 활성이 제거된 GPD1 유전자 서열을 보여주는데, 밑줄 부분은 돌연변이된 부분을 나타낸다.
도 16은 GPD 유전자 제거 균주의 발효 프로파일이다. A, BD5_p426TDH3_Llnox; B, BD5_T2nox_dGPD1; C, BD5_T2nox_dGPD2; D, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2.
도 17은 BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주를 이용한 고농도 2,3-부탄다이올 생산 발효 프로파일이다. A, 회분식 배양; B, 유가식 배양.
본 발명에서는 대사공학적 기법을 이용하여 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol) 고생산성 재조합 효모를 개발하고, 이를 이용하여 글루코스로부터 2,3-부탄다이올을 고생산성으로 생산하고자 하였다.
피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소를 암호화하는 Pdc 활성도의 적절한 조절을 위하여 활성이 낮은 PDC 유전자를 탐색하였는데, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래의 PDC1(CtPDC1)유전자-서열번호 1의 핵산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 클로닝하여 싱글 카피 (single copy)로 발현해 2,3-부탄다이올을 고수율로 생산하기 위한 균주를 구축하였다 (하기 참고도 1 참조 요망).
[참고도 1]
Figure PCTKR2017005008-appb-I000001
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 제조예 1: PDC1 , PDC5 , PDC6 유전자 파쇄 및 2,3- 부탄다이올 생합성 경로가 도입된 2,3-부탄다이올 생산 균주의 구축]
야생 효모의 경우, 포도당 대사 산물로 생산되는 피루베이트가 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 및 알콜 데하이드로지나아제(alcohol dehydrogenase)에 의하여 에탄올로 대부분 전환된다. 따라서, 효모로부터 2,3-부탄다이올을 높은 수율로 생산하기 위해서는 피루베이트가 에탄올로 전환되는 것을 막을 필요가 있다.
이에 본 발명에서는, 우선 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 유전자인 PDC1 , PDC5 , PDC6를 파쇄하여 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 활성이 완전히 제거된 균주를 구축하였다. 또한, 이 균주에 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 도입하기 위하여, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase (alsS))와 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase (alsD))를 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)의 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터를 포함한 플라스미드를 도입하였고, 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)의 2,3-부탄디올 디하이드로제네이즈(2,3-butanediol dehydrogenase (BDH1))을 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터를 포함한 플라스미드를 도입하였다 (실험방법 등에 대해서는 본 발명자들이 출원한 대한민국 특허공개공보 제10-2015-0068581호 참조 요망).
[ 실시예 1: 활성이 낮은 피루베이트 데카르복실라아제 ( pyruvate decarboxylase, PDC ) 유전자의 탐색]
(1) 개요
PDC 유전자를 제거한 효모 균주는 세포 성장 및 기질 소모 속도가 현저히 낮아 2,3-부탄다이올의 생산성이 낮았다.
따라서, 효율적인 2,3-부탄다이올 생산을 위하여 피루베이트 데카르복실라아제의 활성을 적절히 발현되도록 조절하여 2,3-부탄다이올 전구체인 파이루베이트 기질을 확보하고, 동시에 세포 성장에 필수적인 C2 컴파운드의 공급이 가능하도록 하기 위해 활성이 낮은 PDC 유전자를 탐색하고자 하였다.
(2) 재료 및 방법
가. 유전자 및 플라스미드
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈(genomic) DNA를 추출한 후, PCR 방법을 통하여 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래의 PDC1 (CtPDC1), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)의 PDC1 (KmPDC1), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 PDC1 (ScPDC1), PDC5 (ScPDC5), PDC6 (ScPDC6) 유전자를 클로닝하였다.
효모용 발현 벡터로는 '2 micron plasmid'의 'origin'과 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 유래의 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터가 포함되어 있는 p426GPD 플라스미드를 이용하였다.
PCR 방법을 통하여 얻은 상기 PDC 유전자 단편을 상기 p426GPD 플라스미드의 XmaI과 XhoI의 제한효소 자리에 라이게이션하여 재조합 벡터를 구축하였다.
나. 효모 형질 전환
상기에서 구축한 재조합 벡터를 형질전환을 통해 상기 제조예 1의 PDC1 , 5, 6 제거 효모 균주에 도입하였다.
(3) 결과
상기 형질전환된 효모 균주의 'in vitro enzyme activity'를 측정하여 다양한 농도의 기질의 활성(activity) 값으로부터 'Km, Vmax'의 키네틱 상수(kinetic constant) 값을 산출하였다. 그 값은 하기 표 1에 명시하였다.
균주 CtPDC1 KmPDC1 ScPDC1 ScpPDC5 ScPDC6
Km (mM) 2.7 7.7 4.7 9.9 8.2
Vmax (mU/mg protein) 107 383 541 437 415
실험결과, CtPDC1 균주의 경우 다른 Pdc 균주에 비하여 현저히 활성이 낮았다. 활성이 낮은 CtPDC1 균주를 이용할 경우, 2,3-부탄다이올 생산을 최적화하는데 필요한 Pdc 활성 조절이 가능할 것으로 판단되었다.
[ 실시예 2: CtPDC1 과 KmPDC1 을 발현한 균주의 세포 성장, 포도당 소비 속도, 2,3-부탄다이올 생산성 측정]
(1) 개요
실시예 1에서 제조한 Pdc 발현 균주 (CtPDC1, KmPDC1)를 이용하여 세포 성장 및 포도당 소비속도를 측정하고, 2,3-부탄다이올의 생산성을 비교하였다.
(2) 재료 및 방법
가. 균주 및 플라스미드
Pdc를 발현하지 않은 2,3-부탄다이올 생산 균주, CtPDC1 발현 균주, KmPDC1 발현 균주를 이용하였다. CtPDC1과 KmPDC1은 S. cerevisiae의 TDH3 프로모터 및 CYC1 터미네이터를 이용하여 발현하였다.
나. 배지 및 배양 조건
발효시 'yeast nitrogen base w/o nitrogen base' 6.7 g/L, 'amino acid mixture' 1.4 g/L, 글루코스(glucose) 80 g/L가 포함된 배지를 사용하였다. 초기 접종 세포 농도는 0.2 g/L이었며, 발효 온도는 30℃를 유지하였고, 교반 속도는 80 rpm이었다.
(3) 결과
PDC를 발현하지 않은 대조군의 경우, 시간당 포도당 소모 속도는 0.10 g/L/h 였던 것에 반해, CtPDC1을 발현한 균주는 0.94 g/L/h, KmPDC1을 발현한 균주는 1.09 g/L/h이었다.
PDC를 발현하지 않은 균주의 경우의 최대 건조 균체 농도는 0.2 gDCW/L이었으며, CtPDC1을 발현한 균주는 2.7 gDCW/L, KmPDC1을 발현한 균주는 2.8 gDCW/L이었다.
PDC를 발현하지 않은 균주의 2,3-부탄다이올과 에탄올 수율은 0.259 g2,3- 부탄다이올/g포도당과 0 g에탄올/g포도당 이었으며, CtPDC1을 발현한 균주는 0.185 g2,3- 부탄다이올/g포도당과 0.185 g에탄올/g포도당, KmPDC1을 발현한 균주는 0.134 g2,3- 부탄다이올/g포도당과 0.275 g에탄올/g포도당 이었다.
한편, PDC를 발현하지 않은 균주의 2,3-부탄다이올 생산성은 0.026 g2,3- 부탄다이올/L/h 이었으며, CtPDC1을 발현한 균주는 0.175 g2,3- 부탄다이올/L/h, KmPDC1을 발현한 균주는 0.147 g2,3- 부탄다이올/L/h 이었다.
이상의 실험으로부터 PDC-결여 2,3-부탄다이올 생산 균주에 PDC를 발현시킨 결과 세포 성장 및 포도당 소모 속도가 크게 증가함을 확인할 수 있었고, 생산성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1(A)는 PDC를 발현하지 않는 2,3-부탄다이올 생산 균주(대조군)로 발효한 결과 그래프이고. 도 1(B)는 CtPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이고. 도 1(C)는 KmPDC1로 발현한 균주의 발효 결과 그래프이다.
[ 실시예 3: 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) 유래 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase )의 다양한 발현 조건을 갖는 균주 구축 및 ' in vitro activity assay']
(1) 개요
PDC의 발현량은 2,3-부탄다이올의 수율 및 생산성에 직접적으로 영향을 미치므로, 최적의 CtPDC1 발현 균주를 선정하기 위하여 다양한 발현 조건을 갖는 CtPDC1 발현 균주를 구축하였다.
(2) 재료 및 방법
가. 다양한 프로모터를 갖는 플라스미드 구축
캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 유래의 PDC1 유전자 (CtPDC1)를 증폭하여 각각의 발현 벡터(프로모터로 각각 CYC1 프로모터, GPD2 프로모터-서열번호 3-, TDH3 프로모터 사용 및 터미네이터로 CYC1 터미네이터 공히 사용)에 삽입한 후 형질전환하여 재조합 효모 균주를 제작하였다. 형질전환에 사용할 균주는 YNB 배지에서 2일간 배양 후, OD값이 3이 되는 시점의 균체를 이용하였다.
나. 형질전환
형질전환은 LiAc 방법을 이용하였으며, 형질전환 이후에 YNB leu-his-trp-ura- 평판배지에서 균주를 선별하였다. 그 결과, CYC1 프로모터와 싱글 카피(single copy)로 발현한 균주 (BD5_C1CtPDC1), GPD2 프로모터와 싱글 카피(single copy)로 발현한 균주 (BD5_G1CtPDC1), CYC1 프로모터와 멀티 카피(multi copy)로 발현한 균주 (BD5_C2CtPDC1), TDH3 프로모터와 멀티 카피(multi copy)로 발현한 균주 (BD5_T2CtPDC1)를 구축하였다.
(3) 결과
이 균주들의 PDC 발현 정도를 확인하기 위하여 'in vitro Pdc activity assay'를 실시하였다. 그 결과, 대조군에서는 Pdc 역가가 나타나지 않았고, 구축된 균주는 여러 가지 Pdc 발현 수준을 나타내었다(도 2). 도 2는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarvoxylase) 발현 균주의 Pdc 역가 측정 결과이다.
[ 실시예 4: 캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) 유래 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarvoxylase )가 발현된 균주를 이용한 2,3- 부탄다이올 생산]
(1) 개요
상기 실시예 3에서 구축된 균주들의 2,3-부탄다이올 발효 양상을 확인하기 위하여 초기 90 g/L의 포도당을 함유한 YNB 배지에서 발효 실험을 실시하였다. 대조군으로는 'CtPDC1이 들어있지 않은 p426GPD 공벡터'로 형질전환된 균주를 사용하였다.
(2) 발효 방법
초기 접종 균체 농도는 0.2 g/L이었으며, 발효 온도는 30℃로 유지하였고, 유리 플라스크에서 80 rpm의 교반속도를 유지하였다.
(3) 결과
대조군의 경우, 2,3-부탄다이올 수율은 0.292 g2,3- 부탄다이올/g포도당 이었고, 에탄올은 생성되지 않았다.
PDC 발현 균주 중 PDC가 멀티 카피(multi copy)로 발현된 BD5_C2CtPDC1과 BD5_T2CtPDC1 균주에서는 다량의 에탄올이 생산되었으며, 이와 함께 2,3-부탄다이올의 수율이 각각 0.245, 0.150 g2,3- 부탄다이올/g포도당으로 감소하였다 (도 3). 도 3은 대조군 및 PDC 발현 균주의 생산물에 대한 수율을 나타내는 그래프이다. 도 3에서 BD5_C1CtPDC1와 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 생산수율은 비슷한 것으로 나타났으나, BD5_C1CtPDC1는 부산물인 글리세롤의 생산 수율이 높게 나타나 바람직하지 않았다. 따라서, 2,3-부탄다이올 생산균주로는 BD5_G1CtPDC1 균주가 더 적합한 것으로 판단되었다.
한편, PDC 발현 균주는 세포 성장 및 포도당 소모 속도가 증가하였는데, 대조군의 단위시간당 포도당 소모 속도가 0.26 g포도당/L/h 인 것에 반해, BD5_G1CtPDC1 균주의 경우 0.62 g포도당/L/h로 확인되었다. BD5_G1CtPDC1 균주의 경우, 대조군과 비교하여 2,3-부탄다이올 생산수율은 비슷하였지만, 2,3-부탄다이올 생산성은 대조군의 0.076 g/L/h에서 0.181 g/L/h로 증가하였다 (도 4).
도 4(A)는 대조군의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이고, 도 4(B)는 BD5_G1CtPDC1 균주의 2,3-부탄다이올 120시간 발효 결과 그래프이다.
[실시예 5 :유가식 배양을 통한 2,3-부탄다이올 생산]
(1) 개요
BD5_G1CtPDC1 균주가 2,3-부탄다이올 생산 균주로 적합한지 최종 판단하기 위하여 발효 중간에 포도당을 첨가하는 유가식 배양을 수행하였다.
(2) 재료 및 방법
배지는 YP 배지 (Yeast extract 10 g/L, peptone 20 g/L)를 사용하였으며, 초기 포도당 농도는 270 g/L이었고, 발효 중반에 800 g/L의 포도당 용액을 추가하였다. 초기 접종 세포 농도는 2 g/L이었고, 발효 온도는 30℃로 유지하였으며, 0.5 vvm의 공기를 주입하였고, 200 rpm으로 교반 속도를 유지하였다.
(3) 결과
80 시간의 배양시간 동안 121.8 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이때, 2,3-부탄다이올의 수율은 0.329 g2,3- 부탄다이올/g포도당 이었으며, 생산성은 1.61 g/L/h로 높게 나타났다 (도 5). 도 5는 BD5_G1CtPDC1 균주를 이용한 유가식 배양을 통해 측정한 2,3-부탄다이올의 생산 결과 그래프이다.
이와 같은 결과로부터, 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase) 도입 균주는 2,3-부탄다이올 생산을 위해 적합한 것으로 판단할 수 있었다.
기존 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애 균주는 2,3-부탄다이올 생합성 경로 도입을 위해, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 알파-아세토락테이트 신타아제 (alpha-acetolactate sythase, alsS), 알파-아세토락테이트 데카르복실라아제 (alpha-acetolactate decarboxylase, alsD)가 도입되고, 효모 자체의 2,3-부탄다이올 데하드로지나아제 (2,3-butanediol dehydrogenase, BDH1) 유전자가 과발현되는 것을 기본으로 하는데, 본 발명자는 이와 같은 기본 2,3-부탄다이올 생성 균주에, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주가 자체 보유하고 있는 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase, Pdc) 유전자 PDC1, PDC5, PDC6가 파쇄된 균주('BD5' 균주)를 개발한 바 있고, 더 나아가 자체 보유 Pdc보다 활성이 낮은 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1이 도입된 균주('BD5_G1CtPDC1' 균주)를 개발한 바 있다 (상기 참고도 1).
그런데, 본 발명에서는 상기 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주에 추가로 락바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) 유래의 NADH 옥시다아제 (NADH oxidase, NoxE) 유전자를 발현하였고, 글리세롤 생합성 (glycerol biosynthesis)에 관여하는 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로지나아제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPD1, GPD2) 유전자를 파쇄함으로써, 새롭게 제작된 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주를 제작하였다 (하기 참고도 2).
NADH를 보효소로 사용하여 글리세롤 생합성에 관여하는 GPD1 또는 GPD2 유전자를 제거할 경우, 글리세롤 생산량이 감소할 수는 있으나, NADH가 소비되지 못하여, 세포질 내에 NADH가 축적되고, 이로 말미암아 균주가 원활히 생장하지 못하는 문제가 발생한다. 하지만, 본 발명에서는 NADH를 산화시킬 수 있는 NADH 옥시다아제가 과발현되어 있기 때문에 NADH를 소비할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 GPD1과 GPD2 유전자 모두를 제거하여 글리세롤의 생산을 완전히 억제시키면서도, 2,3-부탄다이올을 고순도, 고수율, 고생산성을 생산할 수 있는 것이다. (참고도 2).
[참고도 2]
Figure PCTKR2017005008-appb-I000002
한편, 본 발명에서는, 본 발명에서 구축한 NADH 옥시다아제 도입 균주가 배양기 내로 공급되는 산소량에 따라 활성도가 조절되고, 2,3-부탄다이올 생산량에도 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한, 당농도 및 산소공급 조절 등의 배양공정 최적화를 통하여 고농도/고수율/고생산성의 2,3-부탄다이올 생산 기술을 개발하였다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 6: NADH 옥시다아제 발현 균주 제작]
본 발명자들의 선행 연구(대한민국 특허공개번호 제10-2015-0068581호, 대한민국특허출원 제10-2015-0124845호)에서 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주가 제작되었으며, 본 발명자는 이 균주를 모균주('BD5' 균주)로 하여 진행하였다. 모균주는 사카로마이스세 세레비지애 (S. cerevisiae) 균주에 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase, Pdc) 유전자 PDC1 , PDC5 , PDC6가 제거되었으며, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 알파-아세토락테이트 신타아제 (alpha-acetolactate synthase, AlsS)와 알파-아세토락테이트 데카르복실라아제 (alpha-acetolactate decarboxylase, AlsD) 그리고 사카로마이세스 세레비지애의 2,3-부탄다이올 데하이드로지나아제 (2,3-butanediol dehydrogenase, Bdh1)가 도입 또는 강화되어, 2,3-부탄다이올 생합성 경로가 형성되어 있다.
한편, 상기 모균주에 추가로 NADH 옥시다아제를 도입하기 위해 발현용 플라스미드 제작 및 유전자 클로닝을 진행하였다. 발현을 위하여 총 5종의 발현용 플라스미드를 제작하였다.
단일 카피 플라스미드 (single copy plasmid)인 pRS406 (Mumberg et al., Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156 (1), 119-122) 플라스미드의 SacI, BamHI 제한효소 자리에 사카로마이세스 세레비지애의 GPD2 유전자 프로모터 1144 bp, SacI, XbaI 제한효소 자리에 TDH3 유전자 프로모터 655 bp를 삽입하였다.
또한, 다중 카피 플라스미드 (multi copy plasmid)인 p426GPD 플라스미드 (Mumberg et al., Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156 (1), 119-122)의 SacI, BamHI 자리에 사카로마이세스 세레비지애 CYC1 유전자 프로모터 289 bp, GPD2 유전자 프로모터 1144 bp, SacI, XbaI 자리에 TDH3 유전자 프로모터 655 bp를 삽입하였다.
이렇게 제작된 총 5종의 발현용 플라스미드 (p406GPD2, p406TDH3, p426CYC1, p426GPD2, p426TDH3)에 락토바실러스 락티스 서브시스 크레모리스 (Lactobacillus lactis subsp. cremoris) MG1363균주로부터 PCR 방법을 통하여 클로닝 한 NADH 옥시다아제 유전자 (서열번호 4)를 삽입하였다.
이와 같은 과정을 통하여 NADH 옥시다아제가 발현된 2,3-부탄다이올 생산 균주 5종(BD5_p406GPD2_Llnox, BD5_p406TDH3_Llnox, BD5_p426CYC1_Llnox, BD5_p426GPD2_Llnox, BD5_p426TDH3_Llnox)을 제작하였다.
또한, 선행 연구에서 Pdc-결여 효모 균주의 포도당 소모 속도 및 세포 성장 속도를 증가시키는데 사용된 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase) 유전자를 도입하였다. 이를 위하여 항생제인 아우레오바시딘 A (aureobasidin A)에 대해 저항성 유전자를 가지는 단일 카피 플라스미드로 TDH3 프로모터와 CYC1 터미네이터를 이용하여 NADH 옥시다아제를 발현하였고, 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase, CtPDC1)를 GPD2 프로모터 하에서 발현시켰다. 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase, CtPDC1)를 암호화하는 유전자는 서열번호 1에 기재하였다.
상기의 과정으로부터, NADH 옥시다아제와 피루베이트 데카르복실라아제가 동시에 발현된 BD5_Ctnox 균주를 구축할 수 있었다.
NADH 옥시다아제 발현 플라스미드 구축을 위해 사용한 프라이머
Primers Restrictionsite Sequence
Cloning of S. cerevisiae promoters
F_CYC1P Sac I cGAGCTCatttggcgagcgttg
R_CYC1P Bam HI cgcGGATCCttagtgtgtgtatttgtgtttgc
F_GPD2P Sac I cGAGCTCcaaaaacgacatatctattatagtg
R_GPD2P Bam HI cgcGGATCCctttgagtgcagttgtgttt
Cloning of L. lactis noxE
F_nox Bam HI cgcGGATCCaaaatgaaaatcgtagttatcggta
R_XhoI_nox Xho I ccgCTCGAGtttatttggcattcaaagct
R_SalI_nox Sal I acgcGTCGACtttatttggcattcaaagct
CYC1 프로모터는 서열번호 5에 기재하였고, GPD2 프로모터는 서열번호 3에 기재하였으며, TDH3 프로모터는 서열번호 6에 기재하였다.
[ 실시예 7: NADH 옥시다아제가 발현된 균주의 in vitro 효소 역가 측정]
실시예 6에서 제작한 NADH 옥시다아제 발현용 플라스미드는 서로 다른 활성도를 가질 수 있도록 설계하였다. 따라서, 제작한 균주의 실제 NADH 옥시다아제의 발현량을 비교하기 위하여 in vitro 효소 역가 측정을 진행하였다.
YNB 배지 (Yeast nitrogen base 6.7 g/L, amino acid mixture 1.4 g/L)에 80 g/L의 포도당과 0.5 g/L의 에탄올이 포함된 배지에서 배양한 약 1 x 109의 대수증식기의 세포를 이용하였다.
'Yeast Protein Extraction Reagent(Y-PER, Thermo Scientific, MA)'를 이용하여 세포 내 효소를 추출한 후 상등액을 NADH 옥시다아제의 측정에 이용했다. NADH 옥시다아제 측정은 30℃에서 진행하였고, 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 (pH 7.0)에 0.4 mM NADH, 0.3 mM EDTA가 포함된 조건에서 반응을 하여 340 nm에서 감소한 흡광도를 이용하여 측정하였다. 조 추출물 내의 단백질 농도는 'bradford' 방법을 통하여 측정하였다. 1 unit은 분당 산화되는 1 μmol의 NADH로 표시하였다.
실험 결과, 도 6과 같이, 발현에 사용된 프로모터와 카피 수에 따라서 다른 NADH 옥시다아제 활성도를 나타내었다. 대조군은 BD5 균주 (Kim et al., Expression of Lactococcus lactis NADH oxidase increases 2,3-butanediol production in Pdc-deficient Saccharomyces cerevisiae, Bioresource Technology 191 (2015) 512-519)에, p426TDH3 공벡터가 삽입된 균주를 이용하였다. 대조군의 경우 4.8 mU/mg protein의 활성도를 나타낸 것에 비하여, BD5_p406GPD2_Llnox 균주의 경우 11.2 mU/mg protein의 활성도를 나타내었고, BD5_p426TDH3_Llnox 균주의 경우, BD5_p406GPD2_Llnox 균주에 비하여 약 900배 향상된 9153 mU/mg protein의 활성도를 나타내었다.
도 6은 NADH 옥시다아제 발현 균주의 in vitro 역가 측정 결과로서, Con; BD5_p426TDH3, G1; BD5_p406GPD2_Llnox, C2; BD5_p426CYC1_Llnox, T1; BD5_p406TDH3_Llnox, G2; BD5_p426GPD2_Llnox, T2; BD5_p426TDH3_Llnox이다.
[ 실시예 8: NADH 옥시다아제 활성도에 따른 2,3- 부탄다이올 발효 양상 변화 확인]
Pdc-결여 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주는, 당으로부터 2,3-부탄다이올을 생산할 때 세포질 내에 NADH가 축적되는데, 이를 호흡을 통하여 산화하는 것은 제한적이며, 이로 말미암아 과량의 글리세롤이 부산물로 생성된다.
따라서, 본 발명에서는 NADH 옥시다아제를 도입하여 추가로 NADH를 산화할 수 있는 경로를 도입하고자 하였다. 이와 같은 예측이 성공할 경우, 부산물인 글리세롤의 축적을 감소시키고, 2,3-부탄다이올의 생산량을 증가시킬 수 있을 것이다.
이를 확인하기 위하여 회분식 발효 실험을 진행하였다. YNB에 초기 포도당 80 g/L와 0.5 g/L의 에탄올이 있는 배지를 사용하였고, 발효 온도는 30℃로 유지하였다. 250 mL 플라스크에서 50 ml 워킹 볼륨 (working volume)으로 80 rpm 속도로 교반하였다. 초기 세포 접종 농도는 600 nm 파장에서의 OD (optical density)값이 1.0이었다.
실험 결과는 도 7 및 표 3과 같이 나타났다. 대조군과 실험군 모두 약 76 시간 이내에 80 g/L의 포도당을 모두 소모하였다. 대조군의 경우 글리세롤의 생산 수율이 0.278 gGlycerol/gGlucose인 것에 반해, BD5_p426TDH3_Llnox 균주의 경우, 0.209 gGlycerol/gGlucose로 감소하였다. 이와 함께 2,3-부탄다이올 생산 수율이 대조군의 경우, 0.332 g2,3- Butanediol/gGlucose인 것에 반해, BD5_p426TDH3_Llnox 균주의 경우, 0.367 g2,3- Butanediol/gGlucose로 증가하였다. 이와 같이 NADH 옥시다아제의 발현을 통하여 글리세롤의 생산수율이 감소하였고, 2,3-부탄다이올의 생산수율이 증가하였다. 이때, NADH 옥시다아제 발현량이 증가할수록 그 효과도 증대하였다.
도 7은 회분식 배양을 통해 NADH 옥시다아제 발현 균주의 2,3-부탄다이올 발효 양상 변화를 확인한 결과이다. A; BD5_p426TDH3 (대조군), B; BD5_p426TDH3_Llnox.
NADH 옥시다아제 발현 균주를 이용한 회분식 발효 결과
Parameter* Value (mean ±standard deviation)
BD5_p426TDH3 BD5_p406GPD2_Llnox BD5_p426CYC1_Llnox BD5_p406TDH3_Llnox BD5_p426GPD2_Llnox BD5_p426TDH3_Llnox
DCW (g/L) 2.09±0.10 1.93 ±0.07 1.74 ±0.11 1.55 ±0.09 1.68 ±0.04 1.69 ±0.03
Yglycerol (g/g) 0.278 ±0.011 0.266 ±0.010 0.229 ±0.001 0.231 ±0.005 0.216 ±0.009 0.209 ±0.004
Y2,3- BD (g/g) 0.332 ±0.000 0.338 ±0.001 0.359 ±0.000 0.359 ±0.001 0.364 ±0.003 0.367 ±0.002
Yacetoin (g/g) 0.010 ±0.001 0.009 ±0.001 0.012 ±0.001 0.011 ±0.001 0.010 ±0.000 0.012 ±0.001
Vglucose (g/L·h-1) 1.10 ±0.03 1.11 ±0.02 1.06 ±0.01 1.13 ±0.00 1.07 ±0.02 1.10 ±0.00
P2,3- BD (g/L·h-1) 0.364±0.011 0.374±0.008 0.381±0.003 0.404±0.002 0.391±0.006 0.403±0.002
[ 실시예 9: 산소 공급 차이에 의한 2,3- 부탄다이올 발효 양상의 변화 확인]
본 연구에서 사용한 NADH 옥시다아제는 산소를 기질로 하여 NADH와 반응하고 물과 NAD+를 생성한다. 따라서, NADH 옥시다아제 효소 발현량을 조절하는 것과 함께, 발효 중인 배지 내부로 공급하는 산소량을 통하여 NADH 옥시다아제의 활성도를 조절할 수 있다.
본 실시예에서는 산소의 공급에 따라 NADH 옥시다아제의 활성도가 변화하고 이것이 2,3-부탄다이올 발효에 미치는 영향을 확인하기 위하여 산소 조건을 다르게 한 회분식 배양 실험을 실시하였다.
배지는 YP (Yeast extract 10 g/L, Peptone 20 g/L)에 90 g/L의 포도당이 포함되어있는 배지를 이용하였다. 배지 내로 공급되는 공기에 질소 섞어 줌으로써 25%, 50%, 100% 공기가 유입되도록 산소 공급 조건을 달리하였다. 발효 온도는 30도로 유지하였고 2 vvm으로 공기 및 공기/질소 혼합가스를 주입하였으며, 500 rpm으로 교반하였다. 1 L 크기의 발효기를 이용하였고, 워킹 볼륨 (working volume)은 500 mL이었다. 균주는 BD5_Ctnox 균주를 이용하였다.
실험 결과는 표 4 및 도 8과 같이 나타났다. 표 8과 같이 공급하는 산소량에 따라 2,3-부탄다이올 생산 양상이 바뀌었다. 산소 공급량을 증가할수록, 글리세롤 생산량이 감소하였고, 아세토인의 생산량이 증가하였다. 2,3-부탄다이올의 생산 수율은 50%의 공기가 포함된 조건에서 가장 큰 값을 나타내었다. 세포 성장량은 세 조건에서 큰 차이를 보이지 않았지만, 100% 공기를 주입한 조건에서는 다른 두 조건에 비하여 포도당 소모 속도가 감소하는 것으로 나타났다.
도 8은 산소 공급량에 따른 BD5_Ctnox 균주의 2,3-부탄다이올 발효 양상 변화를 보여준다. A) 25% 공기 주입, B) 50% 공기 주입, C) 100% 공기 주입.
산소 공급량에 따른 BD5_Ctnox 균주의 2,3-부탄다이올 발효 양상 변화
Parameters DCWmax Glycerol Acetoin 2,3-BD Glycerol yield 2,3-BD Yield 2,3-BDproductivity
(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/g) (g/g) (g/L·h-1)
25% 3.0 19.2 2.0 31.4 0.216 0.363 1.42
50% 3.3 11.3 2.2 33.1 0.128 0.374 1.44
100% 3.4 3.7 14.2 17.7 0.050 0.237 0.71
[ 실시예 10: 산소 공급량에 따른 세포 내 NADH / NAD + 보효소 농도 변화 측정]
실시예 9에서 수득한 20시간째의 세포를 이용하여 세포 내의 NADH 및 NAD+ 농도를 측정하였다. 약 4×107개의 세포를 측정에 사용하였고, NAD+/NADH 측정용 kit (BioAssay Systems, CA)를 이용하여 측정하였다.
실험 결과는 도 9와 같았다. 도 9에서 보듯이 25%의 공기 비율이었을 경우에 비하여, 100%의 공기 비율일 경우에 NADH의 농도가 감소하고, NAD+ 농도가 증가하였다. 즉, 산소 공급이 증가할수록 세포 내 NADH 옥시다아제의 활성이 증가하며, 이것이 직접적으로 세포 내의 NADH에 작용하여 NADH를 산화하는 반응을 진행했음을 알 수 있었다.
도 9는 산소 공급량에 따른 세포 내 보효소 NADH 및 NAD+ 농도 변화 측정 결과이다.
[ 실시예 11: 유가식 배양 공정의 산소 공급 조절을 통한 고농도 고생산성 2,3-부탄다이올 발효]
BD5_Ctnox 균주가 2,3-부탄다이올 대량 생산용 균주로 이용 가능성을 판단하기 위하여 발효 중간에 포도당을 첨가하는 유가식 배양을 수행하였다. NADH 옥시다아제의 활성을 조절하여 글리세롤의 생산량을 줄이고 2,3-부탄다이올의 생산량을 최대화하기 위하여 발효 중간 산소 공급량을 전환하였다. 배지는 YP 배지를 사용하였고, 초기 포도당 농도는 330 g/L이며, 발효 중반에 800 g/L의 포도당 용액을 추가하였다. 초기 세포 접종 농도는 2.0 g/L 였고, 발효 온도는 30도로 유지하였다. 처음부터 발효 중반까지 2 vvm, 500 rpm의 조건으로 산소를 공급하였고, 이후에는 1 vvm, 200 rpm의 조건으로 산소를 공급하였다. 그 결과, 78시간의 배양 시간 끝에 154.3 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하여 생산성은 1.98 g2,3- Butanediol/L/h였다 (도 10 및 표 5 참조). 이때, 2,3-부탄다이올 생산 수율은 0.404 g2,3- Butanediol/gGlucose였다.
도 10은 BD5_Ctnox 균주를 이용한 유가식 배양 프로파일이다.
BD5_Ctnox 균주를 이용한 유가식 배양 결과
Parameters DCWMax Glucose consumed Glycerol 2,3-BD Ethanol Glycerol yield 2,3-BD yield 2,3-BDproductivity
(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/g) (g/g) (g/L·h-1)
BD5_Ctnox 6.2 404.3 32.5 154.3 0.1 0.088 0.404 1.98
[ 실시예 12: GPD1 , GPD2이 제거된 2,3- 부탄다이올 생산용 균주 제작]
사카로마이세스 세레비지애에서 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로지나아제 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, Gpd)는 글리세롤 생산을 위한 핵심적인 대사 효소이며, GPD1 , GPD2 유전자에 의하여 발현된다.
본 발명에서는 2,3-부탄다이올 생산시, 발생하는 글리세롤을 완전히 억제하기 위하여 GPD1 및 GPD2 유전자를 제거한 재조합 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주를 구축하였다. 이를 위해 Cas9-CRISPR 방법을 적용하였고, GPD1과 GPD2 유전자의 ORF 중간의 코돈을 종결 코돈으로 전환하는 방법으로 GPD1과 GPD2의 유전자 활성을 제거하였다. Cas9-CRISPR 방법을 적용하기 위하여 아우레오바시딘 A (Aureobasidin A) 항생제에 대해 내성을 가진 AUR1-C 유전자가 포함된 플라스미드에 Cas9 유전자 서열을 넣어 효모에 발현시켰고, GPD1, GPD2 각각의 돌연변이 부분을 목표로 하는 guide DNA와 repair DNA를 NADH 옥시다아제가 발현된 2,3-부탄다이올 생산 균주에 형질전환하여 GPD1, GPD2의 활성이 제거된 균주 BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2를 제작하였다.
또한, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주에 GPD2 프로모터에 의해 발현된 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 도입하여 BD5_T2nox_dGPD1dGPD2_CtPDC1 균주를 제작하였다.
도 11은 Cas9 발현용 플라스미드의 맵이다. 도 12는 GPD1 유전자 제거를 위한 점 돌연변이 (point mutation) 과정을 보여주는 모식도이다. 도 13은 GPD2 유전자 제거를 위한 점 돌연변이 과정을 보여주는 모식도이다. 도 14는 활성이 제거된 GPD1 유전자 서열을 보여주는데, 밑줄 부분은 돌연변이된 부분을 나타낸다. 도 15은 활성이 제거된 GPD1 유전자 서열을 보여주는데, 밑줄 부분은 돌연변이된 부분을 나타낸다.
[ 실시예 13: NADH 옥시다아제 활성이 없는 GPD1 및 GPD2 제거 균주의 제작]
실시예 12에서 제작한 BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주에서 NADH 옥시다아제 발현 플라스미드를 제거하는 방법으로 NADH 옥시다아제 활성이 없는 2,3-부탄다이올 생산 균주를 제작하고자 하였다.
이를 위하여 BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주를 NADH 옥시다아제 발현 플라스미드의 마커(marker)인 우라실(uracil)이 포함된 배지에서 반복 계대 배양하였고, 우라실이 포함된 배지와 우라실이 포함되지 않은 배지에 리플리카 플레이팅 (replica plating)을 통하여 NADH 옥시다아제 플라스미드가 제거된 균주를 선별하였다.
그 결과, BD5_T2nox_dGPD1 균주의 경우, 총 16개의 균주 중 5개의 균주에서 NADH 옥시다아제가 제거되었고, BD5_T2nox_dGPD2 균주의 경우 총 16개의 균주 중 6개의 균주에서 NADH 옥시다아제가 제거된 것을 확인하였다 (표 6 및 도 16).
하지만, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주의 경우, 총 120개의 균주에서 NADH 옥시다아제가 제거된 균주를 얻을 수 없었다. 이는 NADH 옥시다아제가 Pdc-결여 Gpd-결여 2,3-부탄다이올 효모 균주가 성장하는 데 필수적인 효소임을 뜻한다. NADH 옥시다아제는 GPD 유전자의 제거로 인하여 발생되는 추가의 NADH를 NAD+로 산화하는 역할을 함으로써, 이 재조합 균주가 성장할 수 있도록 하는 것으로 최종 결론을 내릴 수 있었다. 도 16은 BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, BD5_T2nox_dGPD1_dGPD2 균주의 플라스미드 큐어링 (plasmid curing) 실험 결과이다.
BD5_T2nox_dGPD1, BD5_T2nox_dGPD2, BD5_T2nox_dGPD1_dGPD2 균주의 플라스미드 큐어링 (plasmid curing) 실험 결과
Strains Ura- cell / Total cells
BD5_T2nox_dGPD1 5/16 -
BD5_T2nox_dGPD2 6/16 -
BD5_T2nox_dGPD1_dGPD2 0/24 0/96
[ 실시예 14: GPD가 제거된 균주를 이용한 2,3- 부탄다이올 발효]
실시예 12에서 제작된 2,3-부탄다이올 생산용 효모 균주를 이용하여 회분식 배양을 실시하였다. YP배지를 이용하였고, 초기 100 g/L의 포도당과 0.7 g/L의 에탄올을 탄소원으로 공급하였다. 접종세포 농도, 배양온도, 배양조건 등은 실시예 3과 동일하게 하였다.
배양 결과, 글리세롤 수율의 경우, 대조군의 0.166 gGlycerol/gGlucose에서 GPD1을 제거한 균주는 0.086 gGlycerol/gGlucose로 감소하였고, GPD2를 제거한 균주는 0.083 gGlycerol/gGlucose로 감소하였다. 또한, GPD1과 GPD2 모두를 제거한 균주의 경우, 글리세롤이 관찰되지 않았으며, 2,3-부탄다이올의 수율이 대조군에 비하여 10% 증가한 0.363 g2,3-Butanediol/gGlucose를 나타내었다 (도 16, 표 7).
도 16은 GPD 유전자 제거 균주의 발효 프로파일이다. A, BD5_p426TDH3_Llnox; B, BD5_T2nox_dGPD1; C, BD5_T2nox_dGPD2; D, BD5_T2nox_dGPD1dGPD2.
GPD 유전자 제거 균주의 발효 결과
Parameters DCWmax Glycerol Acetoin 2,3-BD Glycerol yield 2,3-BD yield 2,3-BDproductivity
(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/g) (g/g) (g/L·h-1)
BD5_T2nox 1.3 15.7 1.9 31.5 0.166 0.333 0.33
BD5_T2nox_dGPD1 1.1 6.4 5.6 22.3 0.086 0.302 0.19
BD5_T2nox_dGPD2 1.1 6.4 5.1 24.3 0.083 0.317 0.20
BD5_T2nox_dGPD1_dGPD2 1.0 0 1.7 16.5 0 0.363 0.14
[ 실시예 15: 회분식 , 유가식 배양방법과 산소 공급 조절을 통한 고농도 고생산성 2,3- 부탄다이올 생산]
실시예 14에서 제작한 2,3-부탄다이올 생산 균주의 산업적 응용 가능성을 알아보기 위하여 회분식, 유가식 배양방법을 통하여 고농도 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 균주는 BD5_T2nox_dGPD1dGPD2_CtPDC1를 이용하였고, 초기 세포 접종 농도는 3.4 gDCW/L였다. 발효 온도는 30℃를 유지하였다. YP배지에 회분식 배양의 경우, 초기 300 g/L의 포도당을 넣어주었고, 유가식 배양의 경우, 100 g/L의 포도당을 넣고, 발효 중반에 150 g/L의 포도당을 추가하였다. 발효 초기 산소 공급은 2 vvm, 400 rpm으로 해 주었고, 발효 중반에 산소 공급을 1 vvm, 200 rpm과 2 vvm 300 rpm으로 낮추어 주었다.
실험 결과는 도 17 및 표 8과 같았다.
회분식 배양의 결과, 300 g/L의 포도당 중 237.9 g/L의 포도당을 소모하였으며, 이로부터 99.4 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이때, 2,3-부탄다이올 수율은 0.418 g2,3- Butanediol/gGlucose였으며, 생산성은 0.62 g2,3- Butanediol/L/h였다.
유가식 배양의 결과, 70시간의 배양 동안 108.6 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이때, 2,3-부탄다이올 수율은 0.495로, 이론 수율의 99%의 값을 나타내었다. 글리세롤, 아세트산, 에탄올의 부산물은 전혀 생성되지 않았으며, 아세토인이 3.5 g/L 생산되었다. 유가식 배양을 통하여 Gpd가 제거된 균주의 고농도의 포도당에 의한 저해 효과를 최소화하여, 2,3-부탄다이올 생산성을 향상시킬 수 있었다. 또한, 배지 내로 공급되는 산소의 양을 통해 NADH 옥시다아제 활성을 조절하여 균주의 성장을 돕고 아세토인의 부산물 생성을 최소화할 수 있었다.
도 17은 BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주를 이용한 고농도 2,3-부탄다이올 생산 발효 프로파일이다. A, 회분식 배양; B, 유가식 배양.
BD5_T2nox_dGPD1dGPD2 균주의 고농도 2,3-부탄다이올 생산 발효 결과
Condition Glucose consumed Glycerol Acetoin 2,3-BD Acetate Ethanol Glycerol yield 2,3-BD yield 2,3-BDproductivity
(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/g) (g/g) (g/L·h-1)
Batch 237.9 0.5 11.3 99.4 1.3 0.2 0.002 0.418 0.62
Dumping 235.1 0.2 3.5 108.6 0.1 0 0.001 0.495 1.55

Claims (20)

  1. 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되며,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고,
    아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며,
    아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고,
    부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환하는 것은,
    사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체로부터,
    피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하고,
    피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)를 암호화하는 PDC5 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거하며,
    피루베이트 데카르복실라아제 6 (pyruvate decarboxylase 6)을 암호화하는 PDC6 유전자의 일부를 파쇄하거나 전체를 제거함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  3. 제1항에 있어서,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환하는 것은,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC1 유전자를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균체 내로 도입함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  4. 제3항에 있어서,
    상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는,
    GPD2 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 2) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  5. 제3항에 있어서,
    상기 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 PDC1 유전자는,
    균체 내로 1 카피(copy) 도입되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
  6. 제1항의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 배양은,
    글루코스를 함유하는 배지를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 배양은,
    산소를 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 배양은,
    글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  10. 2,3-부탄다이올 생산용 사카로마이세스 세레비지애에 있어서,
    글리세롤 생합성에 관여하는 GPD1 유전자 및 GPD2 유전자가 모두 제거되고,
    NADH 옥시다아제 (NADH oxidase)를 암호화하는 유전자가 도입되며,
    자체 보유의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되고,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae).
  11. 제10항에 있어서,
    상기 2,3-부탄다이올 생산용 사카로마이세스 세레비지애는,
    아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되어 있으며,
    아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되어 있고,
    부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환하는 것은 알파-아세토락테이트 신타아제 (alpha-acetolactate sythase)를 암호화하는 유전자 alsS를 도입함으로써 달성되며,
    상기 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환하는 것은 알파-아세토락테이트 데카르복실라아제 (alpha-acetolactate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 alsD를 도입함으로써 달성되고,
    상기 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 하는 것은 사카로마이세스 세레비지애 자체 보유의 2,3-부탄다이올 데하드로지나아제 (2,3-butanediol dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 BDH1를 과발현함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능 소실은,
    피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1, PDC5, PDC6 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 일부 파쇄하거나, 전부 제거함으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 피루베이트 데카르복실라아제를 암호화하는 유전자 PDC1은,
    GPD2 프로모터 하에서 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 NADH 옥시다아제는,
    락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) 유래의 NADH 옥시다아제인 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 NADH 옥시다아제를 암호화하는 유전자는,
    다중 카피 플라스미드 (multi copy plasmid)인 p426GPD 플라스미드에 삽입되어 있고, 프로모터로 TDH3 유전자의 프로모터를 사용하는 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애.
  17. 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되어 있고,
    아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되어 있으며,
    부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환되어 있고,
    글리세롤 생합성에 관여하는 GPD1 유전자 및 GPD2 유전자가 제거되고,
    NADH 옥시다아제 (NADH oxidase)를 암호화하는 유전자가 도입되며,
    자체 보유의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되고,
    캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)를 암호화하는 유전자 PDC1이 도입된; 재조합 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 포도당이 첨가되어 있는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 2,3-부탄다이올의 생산방법은,
    산소를 지속적으로 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 산소의 지속적 공급은,
    발효 중간에 공급되는 산소의 양을 발효 초기에 비해 낮추어 지속적으로 공급하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 배양은,
    포도당을 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
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KIM, S. ET AL.: "Efficient Production of 2,3-butanediol in Saccharomyces Cerevisiae by Eliminating Ethanol and Glycerol Production and Redox Rebalancing", METABOLIC ENGINEERING, vol. 31, 2015, pages 94 - 101, XP055212598, DOI: doi:10.1016/j.ymben.2015.07.006 *
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