WO2019013613A2 - Métodos y kits para determinar el riesgo de cáncer - Google Patents

Métodos y kits para determinar el riesgo de cáncer Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the determination of susceptibility to cancer and, more particularly, to the simultaneous detection and identification of HPV strain genotypes and genetic markers for cancer susceptibility.
  • Cancer is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world representing 14 million new cases and 8.2 million deaths in 2012. Of these, the prostate and cervical are among the most common causes of cancer-related deaths.
  • SNP ' s nucleotide polymorphisms
  • HPVs human papillomavirus
  • Ravinder provides methods for isolating free nucleic acids through the addition of formalin plus the amplification of the site of interest, hybridization, washing, GeneCHIP MR scanning staining and disposition for the detection of genetic disorders associated with chromosomal abnormalities by non-invasive sampling.
  • Q-beta phage amplification, strand displacement amplification, and polymerase chain reaction overlapping splicing amplicon fragmentation by exonuclease digestion and BeadArray Technology.
  • a multiplex PCR a sequencing technique for the detection of SNPs, is described and claims the detection of sequence of different species including humans, although there is no genotyping of HPV and / or any other microorganism. Additionally, there is no description of a method for detecting cancer propensity but a method of prenatal diagnosis comprising analyzing a composition comprising fetal DNA and maternal DNA.
  • microdisposition describes a method for the detection of simultaneous pathogenic and genetic host sequences (WO2009095840). However, genotyping of specific viral HPV types is not described, nor are specific SNPs for cervical cancer, prostate cancer or other specific types of cancer. In addition, the use of microdispositions is a time consuming and cost consuming technology.
  • Giffard et al (WO2007109854), describes methods for SNPs and cell or cell genotyping. These methods are applicable in either eukaryotic cells (including cancer cells) or prokaryotic cells (including various types of bacteria).
  • the only technique claimed in this patent is real-time PCR, where multiplex analysis is limited to the number of fluorophores detected by commercial thermal cyclers.
  • the compatibility between the primers or probes designed for real-time PCR with different platforms (such as sequencing or others) is not claimed.
  • viral genotyping ie, HPV
  • non-invasive methods for sample preparation are not described.
  • Xenomics (W02010051261) claims the use of the El gen fragment of the papilloma virus genome as a specific marker for differential diagnosis by detecting the most common risk HPV genotypes against low risk.
  • the patent indicates several molecular techniques including PCR and real-time PCR but not sequencing or magnetic beads.
  • the use of nucleic acids isolated from urine samples but not the host genome sequences or the identification of SNPs is also described.
  • the present invention seeks to answer this need by the simultaneous detection of several strains of HPV and risk polymorphisms associated with cancer. Not only that, it sets as a goal to do it this way with a non-invasive sample taken from the urine of either men or women.
  • This non-invasive technique would allow a patient to take their own sample safely and painlessly, reducing not only the risk and stress to the patient, but the total cost in the diagnostic procedure.
  • the present invention is directed to methods for simultaneously determining genotypes of the HPV strain and genetic markers for susceptibility to cancer in a sample from a subject.
  • Koninkl (WO2009095840) describes a method for detecting pathogenic and host-specific factors in a liquid sample comprising the steps of extracting DNA from the human or animal body from a tissue sample; solubilizing the DNA to obtain a liquid sample comprising host DNA and / or pathogenic DNA; loading the liquid sample into the chamber of the microdisposition device in order to make contact with the probe nucleotides of the microdisposition device with the liquid sample and detect the interactions between the host DNA and / or the pathogenic DNA comprised in the liquid sample and the probe nucleotides.
  • the DNA is amplified after the extraction step using multiplex PCR with specific primers for the host DNA and pathogen DNA regions.
  • the microdisposition device comprising probe oligonucleotides is capable of binding the Host-specific DNA factors involved in the susceptibility to and / or prognosis of the specific disease, and probe oligonucleotides are capable of binding the DNA pathogens that caused a specific disease and any cancer caused by pathogens such as stomach cancer and cancer cervical.
  • probe oligonucleotides are capable of binding the DNA pathogens that caused a specific disease and any cancer caused by pathogens such as stomach cancer and cancer cervical.
  • up to 20-50 probes can be used to detect pathogenic DNA and up to 30-40 probes can be used to detect markers in the host DNA.
  • the invention does not include genotyping of specific HPV types, nor specific SNPs for cervical cancer, prostate cancer or other specific types of cancer.
  • the present application differs with that work in that genotypes of the specific HPV strain are chosen and by the use of an oligonucleotide ligation assay instead of the time-consuming and costly microdisposition.
  • WO2009 / 095840 discloses that SNPs are detected, which leads to susceptibility to infection by the pathogen in the host DNA, thus sensitivity to the development of cervical cancer or stomach cancer is also mentioned.
  • Rafnar et al. (W02010018601), describes a method for determining the risk of cancer or protection of the identification of one or more polymorphic markers rs401681, rs2736100 and rs2736098.
  • the method comprises the presence of at least one allele of at least one polymorphic marker, either from a human nucleic acid sample or in a genotype data set of the individual.
  • This consistent work calls for methods, software and hardware to determine the susceptibility to cancer in a human individual or is based on data indicative of at least one polymorphic marker. It also calls for a method to evaluate an individual for the likelihood of response to a therapeutic agent cancerous.
  • molecular methods for identification of polymorphisms are based on PCR amplification where genotyping is carried out using a selected process of allele-specific probe hybridization, allele-specific primer extension, allele-specific amplification, nucleic acid sequencing , 5 '-exonuclease digestion, molecular beacon assay, oligonucleotide ligation assay, size analysis, individual strand conformation analysis and microdisposition technology.
  • genotyping is carried out using a selected process of allele-specific probe hybridization, allele-specific primer extension, allele-specific amplification, nucleic acid sequencing , 5 '-exonuclease digestion, molecular beacon assay, oligonucleotide ligation assay, size analysis, individual strand conformation analysis and microdisposition technology.
  • WO2010018601 further describes a method to determine the sensitivity of a human to develop cervical cancer in an infection with HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV45 or any other genotypes of the HPV strain that detect the presence of SNPs in the markers amplifying the DNA extracted from a sample obtained from the patient using PCR and then a hybridization assay, such as oligonucleotide ligation assay.
  • the present invention is based on the seminal discovery of the determination of cancer susceptibility by the simultaneous identification and detection of HPV infection and the genotyping of cancer susceptibility markers.
  • the present invention provides methods for assessing the susceptibility to cancer in a subject by simultaneously identifying one or more cancer susceptibility marker genes and one or more genotypes of the human papilloma virus (HPV) strain, evaluating this way susceptibility to cancer in the subject.
  • the identification of the one or more cancer susceptibility marker genes is by amplifying a DNA sample without cells from the subject using primers for the one or more cancer susceptibility marker genes; and detect the amplified DNA.
  • the amplification of the DNA sample without cells also uses primers for the one or more genotypes of the HPV strain.
  • the cancer is cervical, prostate, colon, pancreatic, gastric, lung, leukemia and breast cancer.
  • the one or more cancer susceptibility marker genes is CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD,
  • CaCuE CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC,
  • CaPD CaPD
  • CaPE CaPF
  • CaPG CaPG
  • CaPH CaPI
  • CaPJ COLA
  • COLB COLC
  • PANB PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG,
  • GENE, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH and / or GENI an individual nucleotide polymorphism (SNP) located within the gene encoding IL10, TGF- ⁇ , CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2, HOXB13, Chr8, SMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2, BRCA1, ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4, TNF-OI, MDM2, LH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2, SRD5A2, EIF3H and / or SH6; and / or SEQ ID NO
  • the one or more cancer susceptibility marker genes is specific for cervical cancer (CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, and / or CaCuJ); specific for prostate cancer (CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, and / or CaPJ); specific for colon cancer (COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, and / or COLG); specific for gastric cancer (GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, and / or GASG); specific for leukemia (LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, and / or LEUF); specific for breast cancer (MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, and / or MAMG), PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF; specific for pancreatic cancer (PANA, PANB, P
  • the one or more genotypes of the HPV strain is HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 , HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-73 and / or SEQ ID NOs: 68-82.
  • the one or more genotypes of the HPV strain is a high risk strain.
  • the genotype of the HPV strain is HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45 and / or HPV-58.
  • the genotype of the HVP strain is determined by detecting HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HPVV, HVPN, and / or VPHO.
  • the detection of the amplified DNA is carried out by the oligo-ligation assay (OLA), PCR, qPCR, DNA sequencing, fluorescence, gel electrophoresis, magnetic beads, extension of allele-specific primer (ASPE) and / or direct hybridization.
  • OLA uses probes for the one or more cancer susceptibility marker genes.
  • the OLA also uses probes for the one or more genotypes of the HPV strain.
  • the sample is a sample of saliva, swab, blood or urine.
  • the present invention is directed to methods for simultaneously determining the genotypes of the HPV strain and genetic markers for cancer susceptibility in a sample from a subject.
  • the methods include a) providing a sample of the subject, b) obtaining the DNA without sample cells, amplifying the DNA without cells with endpoint PCR using primers for one or more genotypes of the HPV strain and primers for one or more marker genes of susceptibility to cancer; d) carry out an oligonucleotide ligation assay (OLA) on the DNA without cells amplified using probes for the one or more genotypes of the HPV strain and probes for the one or more cancer susceptibility markers and e) determine whether the one or more genotypes of the HPV strain and the one or more cancer susceptibility markers are present in the DNA without amplified cells.
  • the sample is a urine sample.
  • the one or more genotypes of the HPV strain may include a plurality of genotypes of the high risk HPV strain.
  • the one or more cancer susceptibility markers may include a plurality of cervical cancer susceptibility markers or a plurality of prostate cancer susceptibility markers.
  • the present invention provides methods carried out by amplifying a DNA sample without cells from a subject using primers for one or more cancer susceptibility marker genes and for one or more genotypes of the strain of human papillomavirus (HPV); and detect the amplified DNA.
  • the one or more cancer susceptibility marker genes are markers for cervical, prostate, colon, pancreatic, lung, breast, gastric, or leukemic cancer.
  • the one or more cancer susceptibility marker genes is CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GAS, GASB, GASC, GASD, GAS, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MOM, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH and / or GENI; an individual nucleic acid,
  • the one or more genotypes of the HPV strain is HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 , HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68 and / or HPV-73.
  • the detection of the amplified DNA is carried out by the oligo-ligation assay, PCR, DNA sequencing, fluorescence, gel electrophoresis, magnetic beads, allele-specific primer extension (ASPE) and / or direct hybridization.
  • the PCR is qPCR, multiplex PCR or nested PCR.
  • the sample is a sample of saliva, swab, blood or urine.
  • the present invention provides a kit that contains at least one primer for one or more cancer susceptibility marker genes; primers for one or more genotypes of the human papillomavirus (HPV) strain; and instructions for use.
  • the one or more cancer susceptibility marker genes is CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH , CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, FAT, GASB, GASC, GASD, GASEO, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MOM, MAMB, MAMC, MAMD , MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC,
  • the one or more genotypes of the HPV strain are HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68 and / or HPV-73 and / or SEQ ID NOs: 68-82.
  • the kit also contains probes for the one or more cancer susceptibility marker genes and / or probes for the one or more genotypes of the HPV strain.
  • the present invention is further improved in the described methods and processes, by presenting an innovative multiplex method for simultaneous HPV genotyping and several different SNP identifications for different types of cancer predisposition.
  • FIGURES 1A, IB, 1C, ID and 1E illustrate the species specificity in the detection of SNPs associated with cervical cancer risk SNPs (CaCu) using synthetic controls, biological control and DNA from 2 uropathogenic microorganisms.
  • FIGURE 1A Detection of A-J SNPs of CaCu risk using synthetic controls of wild type (WT), mutant (MT) and heterozygous (HET) (CS WT, CS MT and CS HET).
  • FIGURE IB Detection of A-J SNPs of CaCu risk using DNA isolated from biological control.
  • FIGURE 1C Detection of A-J SNPs of CaCu risk using DNA isolated from C. lupus famil ⁇ aris.
  • FIGURE ID Detection of A-J SNPs of CaCu risk using DNA isolated from Escherichia coli.
  • FIGURE 1E Detection of A-J SNPs of CaCu risk using DNA isolated from Human Immunodeficiency Virus
  • FIGURES 2A and 2B illustrate the specificity of intraassay with the detection of A-J SNPs of CaCu risk using MI biological control.
  • FIGURE 2A Detection of A-J SNPs of CaCu risk using specific CaCu probes.
  • FIGURE 2B Detection of A-J SNPs of CaCu risk using specific probes for HPV detection.
  • FIGURE 3 illustrates the results of PCR amplifications representative of susceptibility to cervical cancer SNP designated as CaCuH in which AL indicates allelic leader, C indicates no template control, WT indicates positive natural-type DNA control, MT indicates a positive mutant DNA control, B indicates DNA extracted from blood samples. U indicates DNA extracted from the urine samples and CL indicates DNA extracted from the cell lines presenting the SNP.
  • FIGURES 4A, 4B, 4C, 4D and 4E illustrate the species specificity in the detection of SNPs for prostate cancer risk (PCa) using synthetic controls, a biological control sample and DNA from 7 uropathogenic microorganisms.
  • FIGURE 4A Detection of A-J SNPs for CaP risk using synthetic controls (CS WT, CS MT and CS HET).
  • FIGURE 4B Detection of A-J SNPs of CaP risk using DNA isolated from 4 biological control.
  • FIGURE 4C Detection of A-J SNPs of CaP risk using 100 ng of DNA isolated from C. lupus familiaris.
  • FIGURE 4D Detection of A-J SNPs by CaP risk using 100 ng of DNA isolated from Escherichia coli.
  • FIGURE 4E Detection of A-J SNPs of CaP risk using 100 ng of DNA isolated from HIV.
  • FIGURES 5A and 5B illustrate the specificity of intra-assay in the detection of A-J SNPs of CaP risk using the biological control sample M.
  • FIGURE 5A Detection of A-J SNPs of CaP risk using specific CaP probes.
  • FIGURE 5B Detection of A-J SNPs of CaP risk using specific probes for the detection of HPV.
  • FIGURE 6 shows the results of representative PCR amplifications of the prostate cancer susceptibility SNPs designated as CaPG, CaPD and CaPH, in which AL indicates allelic leader, C indicates without template control, WT indicates DNA control of positive natural type, MT indicates positive mutant DNA control, B indicates DNA extracted from blood samples, U indicates DNA extracted from blood samples and CL indicates DNA extracted from the cell line presenting the SNP.
  • FIGURES 7A, 7B, 7C, 7D and 7E illustrate the species specificity in the description of HPV DNA using synthetic controls and positive biological controls for VPHA, HPV, HPV, HPV, HPV and VPHO.
  • FIGURE 7A Detection of HPVs A-0 DNA using synthetic controls.
  • FIGURE 7B Detection of HPV DNA using biological controls.
  • FIGURE 7C Detection of HPV DNA using DNA isolated from C. lupus familiaris.
  • FIGURE 7D Detection of HPV DNA using DNA isolated from Escherichia coli.
  • FIGURE 7E HPV detection using DNA isolated from HIV.
  • FIGURES 8A, 8B, and 8C illustrate the specificity of intra-assay in the detection of HPV DNA using synthetic controls.
  • FIGURE 8A Detection of HPV DNA using specific HPV probes.
  • FIGURE 8B Detection of HPV DNA using specific CaCu probes.
  • FIGURE 8C Detection of HPV DNA using specific CaP probes.
  • FIGURES 9A and 9B illustrate the representative PCR run results identifying two types of HPV in which AL indicates allelic leader, C- indicates without template control, C + l indicates synthetic positive control, C + 2 indicates viral DNA and CL indicates DNA extracted from a cell line known to contain the corresponding virus.
  • FIGURE 9A Representative PCR runs that identify VPHA.
  • FIGURE 9B Representative PCR runs that identify HPVV.
  • FIGURE 10 shows the identification of 20 cancer risk polymorphisms using synthetic controls by the GanPlex MR test (Panel A).
  • the graph shows the MFI values recorded in each of the cancer risk polymorphisms when synthetic controls of natural type (CS WT), Mutants (MT) and Heterozygotes (HET) were used.
  • the bars represent the Average ⁇ 1 D.E. of 2 replicas.
  • FIGURE 11 shows the identified 22 Cancer risk polymorphisms using synthetic controls by the GanPlex MR test (Panel B).
  • the graph shows the MFI values recorded in each of the cancer risk polymorphisms when the synthetic controls of natural type (CS WT), Mutants (MT) and Heterozygous (HET) were used.
  • the bars represent the Average ⁇ 1 SD of 2 replicas.
  • FIGURE 12 illustrates the allelic discrimination assay of a cervical cancer risk SNP showing the fluorescence associated with the wild type allele (WT) on the X axis, the fluorescence associated with a mutant allele (MT) on the Y axis , and the delimitation of the fluorescence areas using a synthetic WT control, a synthetic MT control and a heterozygous synthetic control (WT / MT).
  • WT wild type allele
  • MT mutant allele
  • FIGS. 13A and 13B illustrate exemplary electropherograms according to various embodiments described herein.
  • FIGURE 14 is a flow chart illustrating the detection of target sequences previously amplified by PCR, using qPCR in the presence of SYBR MR Green or TaqMan MR probes labeled with different fluorophores, in which (1) indicates the forward oligonucleotide, (2) ) the reverse oligonucleotide, (5) the probe sequence, (6) the target sequence, (7) the primer end 5, (8) the primer end 3, (100) the denaturation step (95 ° temperature) C), (200) the alignment step, and (300) the extension step (temperature of 72 ° C).
  • FIGURE 15 illustrates an example amplification plot showing the target sequence identified by qPCR using TaqMan MR probes labeled with three different fluorophores.
  • the graph shows the analysis of a biological sample including its respective synthetic controls formed to identify one of the SNPs associated with prostate cancer, in which (29) it indicates the amplification of synthetic positive control of wild type, (30) the amplification of the synthetic positive control Mutant, (31) the amplification of the biological sample Mutant, and (32) The amplification of the Negative control.
  • FIGS. 16A and 16B show the identification and allelic discrimination of risk polymorphisms for CaCu in the biological control sample MI by the Kimera-Test MR test.
  • FIGURE 16A The MFI values recorded in each of the identified CaCu risk polymorphisms of the biological control sample MI are shown. The bars represent Average ⁇ 1 SD of 4 replicas.
  • FIGURE 16B Allele discrimination graph originated from the obtained RA values.
  • the biological control sample MI presents the CACUA, CACUB, CACUD and CACUJ polymorphisms in the genotype Ho.WT, CACUH and CACUG in the genotype Ho.MT, CACUF and CACUC in the genotype HE.
  • FIGURES 17A and 17B show the identification and allelic discrimination of irrigation polymorphisms for CaP in the biological control sample by the Kimera-TestTM test.
  • FIGURE 17A The MFI values recorded in each of the CaP risk polymorphisms identified in the biological control sample M4 are shown. The bars represent the Average ⁇ 1 D.E. of 4 replicas.
  • FIGURE 17B Allele discrimination graph originated from the obtained RA values.
  • the biological control sample M4 presents CAPA, CAPB, CAPC, CACUD, CAPE, CAPF, CAPG and the CAPI polymorphisms in the genotype Ho.WT, CAPH and CAPJ in the genotype HET.
  • FIGURES 18A, 18B, 18C, 18D, 18E, 18F, 18G, 18H, 181, 18J, 18K, 18L, 18M and 18N show the detection of HPV strains.
  • FIGURE 18A sample 5636.
  • FIGURE 18B. sample 1920.
  • FIGURE 18E. sample 1573.
  • FIGURE 18F. shows 2864.
  • FIGURE 18G. shows 1877.
  • FIGURE 18K. shows 1909. FIGURE 18L. sample 1920.
  • FIGURE 18. shows 1933.
  • FIGURE 18N. shows 1939.
  • FIGURES 19A, 19B, 19C, 19D, 19E, 19F, 19G, 19H and 191 show the determination of susceptibility to breast cancer.
  • FIGURE 19A sample 113.
  • FIGURE 19B shows 116.
  • FIGURE 19C. shows 117.
  • FIGURE 19D. shows 118.
  • FIGURE 19E. sample 119.
  • FIGURE 19F shows 120.
  • FIGURE 19G. sample 133.
  • FIGURE 19H. shows 134.
  • FIGURES 20A, 20B, 20C, 20D, 20E, 20F, 20G, 20H, 201, 20J, 20K, 20L, 20M, 20N, 20O, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20U and 20V show the determination of the Susceptibility to colon cancer.
  • FIGURE 20A shows 81.
  • FIGURE 20B shows 82.
  • FIGURE 20C shows 84.
  • FIGURE 20D shows 85.
  • FIGURE 20E. sample 86.
  • FIGURE 20F. sample 87.
  • FIGURE 20G shows 88.
  • FIGURE 20H. shows 89.
  • FIGURE 201 shows 90.
  • FIGURE 20J. shows 92.
  • FIGURE 20L. shows 96.
  • FIGURE 20M. shows 97.
  • FIGURE 20N. shows 100.
  • FIGURE 20O. shows 101.
  • FIGURE 20P. shows 102.
  • FIGURE 20Q. sample 103.
  • FIGURE 20R. shows 104.
  • FIGURE 20S. shows 105.
  • FIGURE 20T. shows 106.
  • FIGURE 20U. shows 107.
  • FIGURE 20V. shows 108.
  • FIGURES 21A, 21B, 21C, 21D and 21E show the results of qPCR of a breast cancer sample for breast cancer-specific gene markers.
  • FIGURE 21A MAMA SNP.
  • FIGURE 2 IB MAMB SNP.
  • FIGURE 21C MAMC SNP.
  • FIGURE 2 ID MAMD SNP.
  • FIGURE 21E MAMD SNP. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the present invention is based on the seminal discovery that the simultaneous detection of HPV infection and the genotyping of cancer susceptibility markers can be used to determine the susceptibility to cancer in a subject.
  • Several embodiments of the present invention are directed to methods and kits for simultaneously determining whether genotypes of the HPV strain and genetic markers for cancer susceptibility are present in a sample from a subject.
  • the present invention provides methods to assess the susceptibility to cancer in a subject by simultaneously identifying one or more cancer susceptibility marker genes and a human papilloma virus (HPV) genotype strain, thereby assessing susceptibility to cancer in the subject.
  • determining a cancer susceptibility and “evaluating a cancer susceptibility” in a patient can be used interchangeably, and refers to the evaluation of the patient's likelihood of developing a certain type of cancer.
  • the risk assessment of cancer development of the present invention includes the detection of DNA from the HPV strain, and the detection of SNPs that are associated with cancer susceptibility.
  • cancer refers to a group of diseases characterized by proliferation of abnormal and uncontrolled cells starting at one site (primary site) with the potential to invade and / or spread to other sites (secondary sites, metastases) that differentiate cancer (malignant tumor) of the benign tumor. Virtually all organs can be affected, leading to more than 100 types of cancer that can affect humans. Cancers can result from many causes including genetic predisposition, viral infection, disposition to ionizing radiation, disposition to environmental pollutants, use of tobacco or alcohol, obesity, poor diet, lack of physical activity or any combination thereof.
  • the particular cancers referred to herein are cervical, prostate, colon, pancreatic, lung or head and neck cancer.
  • the exemplary cancers described by the National Cancer Institute include: Acute, Adult Lymphoblastic Leukemia; Acute Lymphoblastic Leukemia of Childhood; Acute myeloid leukemia, Adult; Adrenocortical carcinoma; Adrenocortical Carcinoma of Childhood; Lymphoma Related to AIDS; Malignant Conditions Related to AIDS; Anal Cancer; Astrocytoma, Cerebellar of Childhood; Astrocytoma, Brain of Childhood; Biliary Duct Cancer, Extrahepatic; Bladder cancer; Bladder, Childhood Cancer; Bone Cancer, Osteosarcoma / Malignant Fibrous Histiocytoma; Cerebral Stem Glioma, of Childhood; Brain Tumor, Adult; Brain Tumor, Brain Stem Glioma, of the Childhood; Brain Tumor, Cerebellar Astrocytoma, Childhood; Brain Tumor, Cerebral Astrocytoma / Malignant Glioma, of Childhood; Brain Tumor, Ependymo
  • subject refers to a mammal and, particularly, a human.
  • cancer susceptibility markers and “genetic cancer susceptibility markers” are used interchangeably and refer to any of the genetic markers that increase the risk of the carrier of such a marker to develop cancer associated with cancer. marker.
  • Genetic markers of cancer susceptibility generally refer to inherited mutations or somatic mutations in tumor suppressor genes or oncogenes, and that are responsible for the increased risk of cancer development.
  • markers of cancer susceptibility in a subject can also be identified as individual nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SNP is A variation of the DNA sequence that occurs when an individual nucleotide - A, T, C, or G - in the genome differs between members of a species.
  • SNP is intended to refer to those DNA sequence variations associated with cancer, in particular, cervical cancer or prostate cancer.
  • SNPs have been reported to be associated with cervical and prostate cancers in patients. In this way, a number of SNPs in identified genes have been reported to be associated with cervical cancer and similarly, a number of SNPs have been reported to be associated with prostate cancer. These SNPs can be targeted in the methods and kits herein to detect the presence of genetic markers that indicate susceptibility to cervical cancer or prostate cancer.
  • SNPs are associated with cancer propensity in different organs, including other organs such as breast, lung, pancreatic, gastric and colon cancers.
  • SNPs have been associated with cancers, including leukemia, and specifically chronic myeloid lymphoblastic leukemia, acute myeloid lymphoblastic leukemia and chronic lymphocytic leukemia.
  • leukemia and specifically chronic myeloid lymphoblastic leukemia, acute myeloid lymphoblastic leukemia and chronic lymphocytic leukemia.
  • the simultaneous detection of HPV infection (genotyping) and the genetic propensity of prostate cancer can be achieved using the methods and kits of the present invention.
  • DNA tests can be used to identify genotypes of the HPV strain as well as markers of cancer susceptibility in a subject.
  • the cancer susceptibility marker gene is CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, FAT, GASB, GASC, GASD, GASEO, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MOM, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH and / or GENI; is a SNP located
  • the cancer susceptibility gene is specific for cervical cancer (CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, and / or CaCuJ); specific for prostate cancer (CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, and / or CaPJ); specific for colon cancer (COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, and / or COLG); specific for gastric cancer (GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, and / or GASG); specific for leukemia (LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, and / or LEUF); specific for breast cancer (MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, and / or MAMG), PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF; specific for pancreatic cancer (PANA, PANB, PANC and / or or prostate
  • the one or more cancer susceptibility genes is CACUA, CACUB, CACUC, CACUD, CACUF, CACUG, CACUH and / or CACUJ; CAPA, CAPB, CAPC, CAPD, CAPE, CAPF, CAPG, CAPI, and / or CAPJ; MAMC, MAMF, MAMG; and / or COLA, COLB, COLC and / or COLF.
  • HPV refers to human papillomavirus, a DNA virus of the human papilloma virus family that includes more than 170 types or strains. HPV infection is spread by sustained direct contact such as skin-to-skin contact. Most HPV infections do not cause symptoms and are resolved spontaneously. However, in some people, HPV infection persists and can result in warts or pre-cancerous lesions that increase the risk of several cancers including cervical, vulvar, vaginal, penile, anus, mouth and throat cancers. HPV strains are classified according to the risk of genital cancer associated with HPV infection.
  • HPV-16, HPV-18, HPV-31 and HPV-45 are the highest risk types of HPV for genital cancers, while HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV -52, HPV-56, HPV-58, and HPV-59 are classified as high-risk HPV types, and HPV-66, HPV-68, and HPV-73 are classified as high risk types of HPV.
  • high risk HPV strains refers to both higher risk and high risk HPV types without further distinction.
  • HPV-16 is also associated with the development of oro-laryngeal-pharyngeal cancers. Almost all cases of cervical cancer are associated with an HPV infection. Table 23 lists the HPV fragment used to identify the strain genotypes.
  • SEQ ID VPHJ Fragment AAATAATAATGTTATAGAAGATAGTAGGGACAATATATC NO: 77 or gene AGTTGATGGCAAGCAAACACAGTTGTGTATTGTTGGATG
  • VPH-16 ATACTGAAAATGCTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATA
  • HPV-16 and HPV-18 cause approximately 80% of cervical cancers in the world, while the remaining 20% of cervical cancers are predominantly associated with another HPV-31, HPV-33, HPV-45 and HPV- 58
  • HPV-16 and HPV-18 cause approximately 80% of cervical cancers in the world, while the remaining 20% of cervical cancers are predominantly associated with another HPV-31, HPV-33, HPV-45 and HPV- 58
  • HPV-16, HPV-31, HPV-33 and HPV-18 along with HPV-58.
  • HPV-11 and HPV-6 to a lesser degree.
  • the DNA test has been used for the identification of HPV strains. In this way, viral DNA can be targeted in the methods and kits herein to detect the presence of high-risk HPV serotypes.
  • HPV infection has also been reported to be associated with higher risks of developing non-genital cancers or gold-laryngopharyngeal cancers.
  • the identification of the one or more cancer susceptibility marker genes is by amplifying a DNA sample without cells from the subject using primers for the one or more cancer susceptibility marker genes; and detect the amplified DNA.
  • the amplification of the DNA sample without cells also uses primers for the one or more genotypes of the HPV strain.
  • sample may include whole blood, plasma, serum, buffy coat, body fluid, lymphocytes, tissue, cultured cells and the like and, in particular, the term “sample” may refer to urine samples, saliva sample , blood sample, DNA without blood cells and specimen of or from the skin, mucous membrane or other body area or surface that is examined by means of a swab.
  • a sample of the patient's urine can be collected at a sample rate of urine collection.
  • the rate can be pre-filled with a suitable liquid to keep the urine sample.
  • the kit may contain a sample rate of urine collection, filled with a conservative liquid.
  • the preservative liquid may include such preservatives as hydrochloric acid, boric acid, acetic acid, toluene or thymol.
  • the urine, blood or saliva sample may be a random sample collected at any time following standard collection methods.
  • DNA without cells can be extracted from the sample, including a urine sample, or any method known in the art including by using organic solvents such as a mixture of phenol and chloroform, or followed by precipitation with ethanol.
  • organic solvents such as a mixture of phenol and chloroform
  • precipitation with ethanol e.g., ethanol
  • one such method includes, for example, using silica particles coated with polylysine.
  • the DNA without cells can be extracted from the urine using a commercially available kit such as, for example, QlAamp MR DNA mini-kit (Qiagen, Germantown, MD).
  • the extracted DNA is amplified by one of the alternative methods for DNA amplification well known in the art, including for example: Luminex Xmap MR technology that allows simultaneous analysis of up to 500 bioassays through the reading of the biological test on the surface of the microscopic polystyrene bead; multiplex PCR that allows the simultaneous amplification of several DNA sequences; multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) for the amplification of multiple targets using a single pair of primers; Quantitative PCR (qPCR), which measures and quantifies amplification in real time; the ligation chain reaction (LCR) that uses primers that cover the entire sequence to amplify, thus preventing the amplification of sequences with a mutation; the rolling circle amplification (RCA), where the two ends of the sequence are joined by a ligase before the amplification of the circular DNA; helicase-dependent amplification (HDA) that depends on a helicase for the separation of double-stranded DNA; loop-mediated is
  • the extracted genomic DNA is for example amplified using the multiplex PCR reaction carried out following the conditions detailed in Table 1. Denaturalizes DisnaturaliAlineaciórJExtension ⁇ Initial Initialization Extension
  • a primer is a short strand of RNA or DNA (generally about 18-22 bases) that serves as a starting point for DNA synthesis.
  • the primers are used in methods to amplify DNA.
  • the primers for the one or more cancer susceptibility marker genes are designed to amplify cancer susceptibility marker genes CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB , CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPH, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GAS, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD , LEUE, LEUF, MOM, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB,
  • amplified DNA or "PCR product” refers to an amplified fragment of DNA of defined size.
  • PCR product detection methods include, but are not restricted to, gel electrophoresis using agarose or polyacrylamide gel and by adding ethidium bromide stain (a DNA intercalator), labeled probes (radioactive or non-radioactive labels, southern blotting), labeled deoxyribonucleotides (for the direct incorporation of radioactive or non-radioactive labels) or silver staining for direct visualization of amplified PCR products; restriction endonuclease digestion, which depends on agarose or polyacrylamide gel or high performance liquid chromatography (HPLC); spot staining, which uses the hybridization of amplified DNA in specific labeled probes (radioactive or non-radioactive labels); high pressure liquid chromatography using ultraviolet detection; electrochemiluminescence coupled with chemical reaction initiated by voltage / photon detection
  • Oligonucleotide ligation assay methods are also well known in the art. Briefly, this method allows the detection of target sequences previously amplified by PCR. The OLA method requires specific probes that include a TAG sequence. The anti-TAG sequence is coupled to the surface of a magnetic microsphere for detection.
  • a "probe” or “OLA probe” refers to the polynucleotide capable of selectively hybridizing to a target sequence of amplified DNA during the oligonucleotide ligation assay.
  • the OLA probe of the invention includes a common region, at the primer end 3, which may include a dye label; a specific region of sequence that selectively recognizes the target sequence and a tag, at the primer end 5, for recognition by the anti-tag sequences linked to the magnetic microspheres.
  • the probes are designed to detect CaCuA, CaCuB,
  • CaPA CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ,
  • COLA COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC,
  • the assay methods and kits herein can be carried out in a multiplexing system for reading magnetic beads such as, for example, MAGPIX MR (Luminex Corp. Madison, WI) or BioCode 2500 Analizer MR (Applied BioCode, Inc. ).
  • MAGPIX MR Luminex Corp. Madison, WI
  • BioCode 2500 Analizer MR Applied BioCode, Inc.
  • the present invention provides a kit that contains at least primers for one or more cancer susceptibility marker genes; primers for one or more genotypes of human papillomavirus (HPV) strain; and instructions for use.
  • the one or more cancer susceptibility marker genes are CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, FAT, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MOM, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, BOW, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND,
  • the one or more genotypes of the HPV strain HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV -56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68 and / or HPV-73.
  • the kit also contains probe for one or more cancer susceptibility marker genes and / or probes for one or more genotypes of the strain.
  • the methods may additionally include a treatment step.
  • treatment refers to both 1) treatments or therapeutic measures that cure or decelerate, reduce the symptoms of, and / or stop the progression of pathological conditions or disorders diagnosed, and 2) and prophylactic / preventive measures.
  • Those in need of treatment may include individuals who already have a particular medical disorder as well as those who may eventually acquire the disorder (ie, those who need preventive measures).
  • Treatment against cancer or “anti-cancer treatments” include surgery, chemotherapy, radiation therapy, targeted therapy, immunotherapy and combination thereof. Specific anti-cancer treatments are defined and administered depending on the type of cancer and the state of the disease. Specific treatments and combinations of cancer are well described in the art.
  • “Chemotherapeutic agents and antineoplastic agents” are well known in the art and include: anti-microtubule agents; anti-metabolite agents; topoisomerase inhibitors; alkylating agents; anthracycline agents; and enzyme inhibiting agents.
  • the DNA without cells was extracted from a sample using organic solvents such as a mixture of phenol and chloroform, followed by ethanol precipitation. DNA without cells can also be obtained using silica particles received with polylysine. Alternatively, the DNA without cells can be extracted from the sample using a commercially available kit such as, for example, QIAamp MR DNA minikit (Qiagen, Germantown, MD).
  • the DNA sample must have a high purity, ie higher than 1.6 (260/280 nm) and its functionality must have been corroborated by the amplification of a general reference sample and with 100 ng of DNA from a multiplex PCR reaction.
  • DNA samples without synthetic DNA cells or isolated from MI, C. lupus familiaris, E. coli and human immunodeficiency virus (HIV) were obtained and prepared for a final concentration of 50 ng / L.
  • Each analysis should include a negative control (water), a positive control - natural type (WT), a mutant positive control (MT) and a heterozygous positive control (HET).
  • HET heterologous synthetic controls
  • PCR reaction mixture Preparation of the PCR reaction mixture.
  • Table 6 indicates that the number of PCR reaction samples was dependent on the total amount of the RNA sample that was analyzed. They included 4 controls per PCR assay of the CaCu panel of 8 oligonucleotides.
  • the mixtures of The reaction was prepared in polypropylene tubes in the following order: water, master mix + oligonucleotides (Ll and L2), and DNA from the samples or from the synthetic controls. PCR amplification was carried out using standard conditions.
  • the PCR products were analyzed by electrophoresis.
  • the PCR products can be further analyzed by multiplex technology or sequencing.
  • target sequences can be identified by qPCR using the SYBR MR Green or TaqMan MR probes labeled with different fluorophores as illustrated in FIGS. 11 and 12.
  • SYBR MR Green or TaqMan MR probes labeled with different fluorophores as illustrated in FIGS. 11 and 12.
  • 8 pairs of oligonucleotides specific for each site of interest were used.
  • the start oligos flanked the site of interest in the genes or in the important sequences of the regulation of the genes (ie IL10, TGF-B1, CYP1A1, ST3GAL4 and IL4).
  • the oligos of initiation had a complementarity with their target sequence of 80%, 90% and 100%.
  • Oligonucleotides "primers” designed for SNPs at risk for cervical cancer had an alignment temperature range (Tm) between 62 ° C and 64 ° C. Oligonucleotides "primers” for the detection of SNPs of cervical cancer risk had a concentration range between 0.2 ⁇ and 0.5 ⁇ (Table 7).
  • FIGURES 1A-1E show that the oligonucleotides
  • FIGURE 1A shows the detection of AJ SNPs of CaCu risk using synthetic controls (CS WT, CS MT and CS HET).
  • FIGURE IB shows the detection of risk AJ SNPs CaCu using DNA isolated from an MI biological control.
  • FIGURES 1C-1E show that the AJ SNPs of CaCu risk were not detected in the isolated DNA of C. lupus familiaris, Escherichia coli, or the Human Immunodeficiency Virus (HIV) (p ⁇ 0.00001).
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • the bars represent the Mean ⁇ Standard Deviation 1 of 4 replicated
  • FIGURES 2A-2B illustrate the specificity of intra-assay in the detection of A-J SNPs of CaCu risk using the MI biological control.
  • FIGURE 2A shows the detection of the A-J SNPs of CaCu risk using specific CaCu probes.
  • FIGURE 2B shows the lack of detection of A-J SNPs of CaCu risk using specific probes for the detection of HPV.
  • target SNP sequences of cancer susceptibility containing DNA were detected in the blood and urine samples.
  • the results of the PCR amplifications of CaCuH showed that both urine (U) and blood (B) samples were suitable for DNA extraction and genotyping of these markers, with the PCR products equivalent to those obtained with either a positive control (WT, wild-type marker), a control DNA comprising the mutant marker (MT), or DNA extracted from a cell line that presented the SNP (CL).
  • oligonucleotides "primers" specific for each site of interest were used.
  • the start oligos flanked the site of interest in the genes or in the important sequences of the regulation of the genes (ie AGTR1, HOXB13, SRD5A2, Chr8, MSMB, RNASEL and CYP19).
  • the oligo "primers” designed for SNPs at risk of prostate cancer had complementarity with their target sequence of 80%, 90% and 100%.
  • Oligonucleotides "primers” for SNPs at risk of prostate cancer had an alignment temperature range (Tm) between 63 ° C and 65 ° C.
  • Oligonucleotides "primers” for SNPs in risk of prostate cancer had a range of concentrations between 0.3 ⁇ and 0.5 ⁇ (Table 8).
  • the primers used for the detection of prostate cancer SNPs (CaP) AJ were suitable for this detection in the synthetic controls (FIGURE 4A) and in the isolated DNA of a biological control (FIGURE 4B). However, there was no detection of the CaP risk SNPs when the primers were used in the DNA isolated from C. lupus familiaris (FIGURE 4C, p ⁇ 0.0001), E. coli (FIGURE 4D, p ⁇ 0.0001) or HIV (FIGURE 4E, p ⁇ 0.0001).
  • Oligonucleotides "primers" designed for the identification of risk SNPs for prostate cancer did not cross-react with other genomic DNA (FIGURES 4A-4E).
  • FIGS. 5A-5B the oligonucleotides "primers" designed for the identification of the prostate cancer SNPs were not cross-reactive with the HPV-specific "OLA reporter probes" (FIGURES 5A-5B).
  • FIGURE 5A shows the detection of CaP irrigation AJ SNPs using specific CaP probes.
  • FIGURE 5B shows the non-detection of the AJ SNPs of CaP risk using specific probes for the detection of HPV.
  • the preparation of the DNA sample, synthetic control mixtures WT, T, and HET and oligonucleotides of sense (Ll) and inverse (L2) of the detection of SNPs of prostate cancer (CaP) CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI and CaPJ were prepared as previously described for the CaCu risk SNPs.
  • CAPG Ll and L2 100 0.5 0.10
  • CAPD Ll and L2 100 0.5 0.10
  • PCR reaction mixture Preparation of the PCR reaction mixture.
  • the components of the PCR reaction were added in the following order: water, Master Mix + oligonucleotides (Ll and L2), and the latter, the DNA of the samples or synthetic controls (see Table 13).
  • PCR was carried out using standard conditions.
  • the PCR products were analyzed by electrophoresis and can be further analyzed by multiplex technology or sequencing.
  • Table 13 The components of each PCR reaction tube for amplification of the panel of 10 CaP oligonucleotides in urine and blood DNA samples. * The indicated volume is taken from the DNA sample which is at an initial concentration of 50 ng ⁇ L. In the case that the sample has a low concentration, the volume must be adjusted to lOOng for the PCR reaction.
  • SNPs of cancer susceptibility are detected in both blood and urine samples.
  • the results of the PCR amplifications of CaPG, CaPD and CaPH show that both urine (U) and blood (B) samples were suitable for DNA extraction and genotyping. of such markers, with the equivalent PCR products those obtained with either a positive control (WT, wild-type marker), a control DNA comprising the mutant marker (MT), or DNA extracted from a cell line that presented the SNP (CL).
  • Oligonucleotides "primers" for the identification of high-risk types of HPV do not cross-react with other genomic DNA other than HPV (FIGURES 7A-7E).
  • each of the high-risk types of HPV was determined by using the specific oligonucleotides "primers" designed for each type of high-risk HPV, containing nucleotide sequences complementary to the region of interest within the HPV gene Ll.
  • the primers were designed to amplify SEQ ID NOs: 67-82.
  • the start oligos flanked the specific region of each type of HPV in the Ll gene.
  • Oligonucleotides "primers” designed for the detection of the 15 high-risk HPV types had complementarity with their target sequence of 80%, 90% and 100%.
  • the degenerate "primer” oligonucleotides were designed to detect the HPV subtypes of interest.
  • the oligonucleotides "primers” for the 15 types of HPV had a range of Alignment Temperature (Tm) between 61 ° C and 63 ° C.
  • the oligonucleotides “primers” had a concentration range between 0.4 ⁇ and 0.6 ⁇ (Table 14).
  • Oligonucleotides "primers" designed for the identification of high-risk HPV types did not cross-designate with other genomic DNA (FIGURES 7A-7E).
  • oligonucleotides "primers” designed for the identification of the 15 high-risk HPV types did not cross-react with the "OLA reporter probes" specific for cervical cancer (FIGURE 8B) and cancer of prostate (FIGURE 8C).
  • the mixtures of the synthetic HPV controls (identified as A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O) , and sense oligonucleotides (Ll) and inverses (L2) CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI and CaPJ, were prepared as previously described for the CaCu risk SNPs. From the 200 ⁇ of the stock solution of the synthetic HPV controls an aliquot was prepared in a final concentration of 30 ⁇ and sequential dilutions were made to obtain a final concentration that would be 0.003 ⁇ .
  • reaction mixtures were prepared in tubes by adding the components of the PCR reaction in the next order: water, mixture of Master Mix + oligonucleotides (Ll and L2), and finally the DNA of the samples of the synthetic controls (Table 18).
  • PCR amplification is carried out under standard conditions.
  • the PCR products were analyzed by electrophoresis. Once the products of interest had been verified, the analysis was carried out using the Luminex platform.
  • the target sequences of HPV viral DNA was detected by multiplex PCR.
  • the results of the PCR amplification of VPHA and HPVB show that the DNA extracted from a line of cells known to contain the corresponding virus (CL) was a suitable sample for the detection of HPV infection, with the PCR products equivalent to those obtained with either a synthetic positive control (C + l), or indicates the viral DNA (C + 2).
  • C + l synthetic positive control
  • C + l indicates the viral DNA
  • a DNA amplification combined with an OLA detected the HPV infection in a patient and thus established whether the patient presented a risk of susceptibility when developing the corresponding cancer.
  • VPHN Ll and L2 200 0.5 0.05
  • Table 18 Components of each PCR reaction tube for 15 HPV oligonucleotides of panel amplification in the DNA samples of the biological samples. * The indicated volume is taken from a sample of DNA that is in an initial concentration of 50 ng / L.
  • the DNA samples were prepared in the same manner as in the previous examples, however, for the detection and amplification of SNPs associated with the risk of any type of cancer and of 7 different types of cancer (including breast cancer, prostate, colon, leukemia, lung, gastric and pancreas), 41 pairs of "primer” oligonucleotides specific for each site of interest were used.
  • the oligos "initiators” flanked the site of interest in the genes or in the important sequences of gene regulation (ie IL10, TGF- ⁇ , CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2, HOXB13, Chr8, MSB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR , EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2, BRCA1, ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4, TNF- ⁇ , MDM2, MLH1, BRAF, TP53 , BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2, SRD5A2, EIF3H and / or MSH6).
  • IL10 TGF- ⁇
  • oligos "initiators" for SNPs at risk of cancer had complementarity with their white sequence of 80%, 90% and 100%.
  • Oligonucleotides "primers” for cancer risk SNPs had a range of Alignment Temperature (Tm) between 62 ° C and 65 ° C as previously described.
  • Oligonucleotides "primers” for SNPs at risk of cancer had a concentration range between 0.2 ⁇ and 0.5 ⁇ .
  • FIGURE 10 shows the identification of 20 cancer risk polymorphisms using the synthetic controls by the GanPlex MR test (Panel A).
  • the graph shows the MFI values recorded in each of the cancer risk polymorphisms when the synthetic controls of natural type (CS WT), Mutants (MT) and Heterozygous (HET) were used.
  • the bars represent the Average ⁇ 1 D.E. of 2 replicas.
  • FIGURE 11 shows the identification of 22 cancer risk polymorphisms using synthetic controls by the GanPlex MR test (Panel B).
  • the graph shows the MFI values recorded in each of the cancer risk polymorphisms when the synthetic controls of natural type (CS WT), Mutants (MT) and Heterozygous (HET) were used.
  • the bars represent the Average ⁇ 1 D.E. of 2 replicas.
  • each sample was subjected to a OLA reaction, where an aliquot of PCR product was used through the OLA reaction.
  • the reaction mixture was carried out from the aliquots that were in a concentration of 10 ⁇ with a final concentration of every 20 ⁇ l. Or 22 ?; 3 ⁇ of markers were added and the volume was adjusted to 20 L (OLA probe mixture).
  • the OLA probe mixture was prepared in a final concentration of 5 ⁇ in 20 ⁇ L.
  • the OLA-2X mixture was prepared considering that each of the components must have the following final concentration: 2X ⁇ ligase buffer, 1 ⁇ M Taq DNA ligase, 0.015 ⁇ OLA-TAG mixture and 0.5 ⁇ OLA probe, in 18 ⁇ L.
  • the 2X OLA mixture should have a final concentration of 1 (?), And the ligation reaction was carried out as described in Table 19.
  • Hybridization assay After the ligation reaction, a hybridization test was carried out using the "TAG distribution" format. The counts were assigned to each marker and resuspended in a buffer solution IX Tm. Mixtures of microspheres were prepared for each panel (40 spheres). Seven reactions per panel were carried out: C. -, C. WT, C. MT, C. HT, saliva DNA, blood DNA and background, according to table 20: mixtures of microspheres for multiple hybridization were prepared with the following final concentration of each of the following components: microspheres WT 1000 microspheres ⁇ L, microsphere WT 1000 microspheres ⁇ L and buffer solution Tm IX and were mixed again by vortex for 30 seconds.
  • Streptavidin conjugate, R-Phycoerythrin (SAPE) was prepared in a final concentration of 2 ⁇ g / mL in Tm IX buffer solution as indicated in Table 21. Once the hybridization was complete it was placed in the 96-well plate in the magnetic plate. The supernatant was removed and rinsed twice with ⁇ of Tm IX buffer. The plate was placed, the 96-well plate on the black metal plate and 75 ⁇ L of the sample was added SAPE at 2 ⁇ g / mL to each well. The plate was incubated for 15 minutes at 37 ° C in the dark and the samples were analyzed.
  • SAPE Streptavidin conjugate, R-Phycoerythrin
  • the risk or susceptibility to cancer of a subject to develop cancer is determined by the identification and simultaneous detection of both HPV infection and SNP genotyping of cancer susceptibility.
  • wild-type and mutant alleles were discriminated by evaluating the fluorescence difference in an allelic discrimination assay.
  • the colored beads were used to carry out the analysis.
  • the accounts included two dyes where A) an excitation wavelength allows the observation of two separate fluorescence emission wavelengths, B) produce approximately 100 unique account sets, in this case 50 different account sets were used, each Set of beads can be put in contact with a nucleic acid capture molecule (antifragment 10-TAG) specific for a particular biological purpose in this case could be SNPs or different types of HPV.
  • A an excitation wavelength allows the observation of two separate fluorescence emission wavelengths
  • B) produce approximately 100 unique account sets, in this case 50 different account sets were used, each Set of beads can be put in contact with a nucleic acid capture molecule (antifragment 10-TAG) specific for a particular biological purpose in this case could be SNPs or different types of HPV.
  • antifragment 10-TAG nucleic acid capture molecule specific for a particular biological purpose in this case could be S
  • This objective if closed by the nucleic acid bound to the surface of the accounts in trademark with SAPE (Ficoeritrina) if not in the sample the researchers will not observe SAPE in that set of accounts.
  • the difference of each objective is made by the sets of accounts.
  • the identification of each objective is done by Ficoeritrina (the same in each objective). fluorescence to identify that the target is in the sample, the parameter is 5 times above the background to consider a positive (same in HPV as in SNPs).
  • the inventors will always find an objective that means that there will always be a positive, it could be WT, MT or HT, but to discriminate and determine if they are WT, MT or HT the inventors use the allelic call, which is calculated by fluorescence proportions. It means that more than 100% of the fluorescence if the ratio of the total fluorescence is about 70% for the WT target and 25% of the MT target is set as a WT sample or participant, the same thing for the MT. But if the ratio is 50/50 both objectives are present and it is considered as a HT. The proportions could be 75/25, 80/20, 90/10 even 70/30 depending on each objective for the homozygotes. For HT it could be 50/50, or even 64/40 in some cases.
  • the allelic discrimination test allows to determine the fluorescence areas: a mutant area, a WT area and a heterozygous area that discriminates the samples based on the genotype of SNPs of cancer susceptibility.
  • a sample is considered WT when the fluorescence of the dye associated with the allele is between 25 and 100% and the fluorescence of the dye is associated with the mutant allele is less than 25%.
  • a sample is considered mutant when the fluorescence of the dye associated with the WT allele is less than 25% and the fluorescence of the dye associated with the mutant allele is between 25 and 100%.
  • a sample is considered heterozygous when the fluorescence of the dye associated with the WT allele is between 25 and 100% and the fluorescence of the dye associated with the mutant allele is between 25 and 100%. If both the fluorescence of the dye associated with the WT allele and the fluorescence of the dye associated with the mutant allele are less than 25% the sample is considered unlabelled and can be further exploited.
  • the assays allow the determination of a fluorescence range that discriminates samples based on the presence or absence of viral DNA.
  • the fluorescence range is different in each HPV assay, the background fluorescence is approximately 200-300 MFI.
  • the fluorescence range for discriminating between positives to the HPV panel is approximately 1500-7000 MFI.
  • the allelic discrimination test is combined with the HPV infection determination test to determine if a sample has a polymorphism of susceptibility to cancer and / or an HPV infection.
  • the combination of both assays in this way is used to determine if a patient presents a risk or a susceptibility to develop the corresponding cancer.
  • FIGS. 20A-20V and 21A-21E Specific examples are shown in FIGS. 20A-20V and 21A-21E.

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Abstract

Se divulgan métodos y equipos para determinar la susceptibilidad del cáncer o diagnosticar un cáncer en un sujeto al realizar una identificación y detección simultáneas de genotipos de cepas del VPH y marcadores genéticos para la susceptibilidad al cáncer en una muestra de un sujeto.

Description

METODOS Y KITS PARA DETERMINAR EL RIESGO DE CANCER
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. §119 (e) de la solicitud Provisional de los Países Bajos No. 1042665, presentada el 10 de Enero de 2018, y también al No. de Serie de E.U.A. 62/530,245, presentada el 9 de Julio de 2017. La descripción de la solicitud anterior se considera parte de y se incorpora a manera de referencia en la descripción de esta solicitud en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la determinación de susceptibilidad al cáncer y, de manera más particular, a detección simultánea e identificación de genotipos de cepa VPH y marcadores genéticos para susceptibilidad cáncer .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer es una de las causas principales de morbidez y mortalidad en el mundo representando 14 millones de nuevos casos y 8.2 millones de muertes en el 2012. De estos, la próstata y cervical son entre las causas más comunes de muertes relacionadas con cáncer.
La etiología de un tipo particular de cáncer se asocia probablemente con un conjunto de variantes genéticas, muchas de las cuales interactúan con factores ambientales. Los estudios epidemiológicos respaldados por evidencia considerable habían mostrado la función de los polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP's) como un componente hereditario en diferentes tipos de cáncer.
La infección con virus de papiloma humano (VPHs) es un factor de riesgo primario en el desarrollo de numerosos cánceres. Como tal, los VPHs son responsables por el desarrollo de casi todos los cánceres cervicales. Además, los VPHs también se han implicado en el desarrollo de cánceres de próstata.
Además del VPH, otros factores de riesgo se pueden implicar en el desarrollo de cánceres cervicales y de próstata. Por ejemplo, las mutaciones pueden desempeñar la función en 5 a 10% de todos los desarrollos de cáncer. De esta manera, las mutaciones en los tejidos cervicales y de próstata también pueden constituir factores de riesgo para el cáncer.
Varios métodos bien conocidos en la técnica se pueden usar para aislar ácido nucleico y para detectar mutaciones en la secuencia de AD . Por ejemplo, Ravinder (WO2004079011) proporciona métodos para aislar ácidos nucleicos libres a través de la adición de formalina más la amplificación del sitio de interés, hibridación, lavado, tinción y disposición GeneCHIPMR de escaneo para la detección de trastornos genéticos asociados con anormalidades cromosómicas mediante el muestreo no invasivo. Bajo un procedimiento complejo que implica la amplificación de fago Q-beta, la amplificación de desplazamiento de hebra, y la reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapante de empalme, fragmentación de amplicones por digestión de exonucleasa y Tecnología BeadArray. Adicionalmente, se describe una PCR multiplex, técnica de secuenciación para la detección de SNPs, y reclama la detección de secuencia de diferentes especies incluyendo humanas, aunque no hay genotipificación de VPH y/o cualquier otro microorganismo. Adicionalmente, no existe descripción de un método para detección de propensión al cáncer sino un método de diagnóstico prenatal que comprende analizar una composición que comprende ADN fetal y ADN materno.
Otra patente basada en microdisposición describe un método para la detección de secuencias patogénicas y genéticas hospederas simultáneas (WO2009095840) . No obstante, no se describe la genotipificación de los tipos virales de VPH específicos, tampoco los SNPs específicos para el cáncer cervical, cáncer de próstata u otros tipos específicos de cáncer. Además, el uso de microdisposiciones es una tecnología consumidora de tiempo y costo.
Giffard y colaboradores (WO2007109854) , describe métodos para los SNPs y genotipificación de célula o células. Estos métodos son aplicables en ya sea células eucariotas (incluyendo células cancerosas) o células procariotas (incluyendo varios tipos de bacterias) . La única técnica reclamada en esta patente es la PCR en tiempo real, donde el análisis multiplex se limita al número de fluoróforos detectados por termocicladores comerciales. Además, la compatibilidad entre los cebadores o sondas diseñadas para la PCR en tiempo real con diferentes plataformas (tal como secuenciación u otras) no se reclama. Además, no se describen la genotipificación viral (es decir VPH) tampoco los métodos no invasivos para la preparación de muestras. Xenomics, (W02010051261 ) reclama el uso del fragmento del gen El del genoma del virus de papiloma como un marcador especifico para la diagnosis diferencial mediante la detección de los genotipos VPH de riesgo más comunes contra el riesgo bajo. La patente indica varias técnica moleculares incluyendo PCR y PCR en tiempo real pero no la secuenciación tampoco cuentas magnéticas. También se describe el uso de ácidos nucleicos aislados de muestra de orina pero no las secuencias de genoma hospedero tampoco la identificación de SNPs .
Existen varias formas para obtener un diagnóstico de cáncer, incluyendo historial del paciente, pruebas físicas, polimorfismos de riesgo de evaluación y finalmente, pruebas de disposición genética. Las pruebas físicas se refieren a formación de imágenes y escaneos, los más comunes de estos son los rayos X, ultrasonidos y MRI's. También pueden incluir escaneos PET y endoscopias. En lo que respecta a la identificación de los polimorfismos, existen pruebas que detectan los analitos específicos asociados con el cáncer tal como proteínas o productos metabólicos. Finalmente, las pruebas genéticas pueden identificar un cambio en el nivel molecular directamente en el ADN o ARN de un individuo. Estos cambios se asocian usualmente con un riesgo incrementado de la formación de neoplasia.
Estas asociaciones con cáncer son de mayor importancia, debido a que todas las pruebas previamente mencionadas, solo las pruebas genéticas son de una naturaleza preventiva. Es decir, pueden detectar una amenaza potencial antes de que se presente. Como resultado, un individuo puede tomar mediciones precautorias tal como un cambio en hábitos, dieta y monitoreo constante. Todo esto se puede hacer antes de que la patología surja y puede ser muy efectivo en prevenir el desarrollo de la enfermedad .
Actualmente, existen diferentes técnicas para detectar los polimorfismos de riesgo genético. Por ejemplo, la secuenciación de genoma, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) , microdisposiciones de ADN y técnica de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLPs) . Estas técnicas se utilizan ampliamente, no solo para la búsqueda de cáncer y técnicas sofisticadas bien conocidas. Sin embargo, tienen desventajas con respecto a su precisión, capacidad de repetición, tiempo de análisis, y costo de realización. También, requieren usualmente una muestra de sangre invasiva tomada por un flebotomista calificado.
Estos precedentes muestran la necesidad de desarrollar nuevas técnicas para la prevención de cáncer cervical y de próstata que sean sensibles, rápidas y económicas. La presente invención busca responder esta necesidad por la detección simultánea de varias cepas del VPH y polimorfismos de riesgo asociados con el cáncer. No sólo eso, fija como objetivo hacerlo de esta manera con una muestra no invasiva tomada de la orina de ya sea hombres o mujeres. Esta técnica no invasiva permitiría que un paciente tome su propia muestra con seguridad y sin dolor reduciendo no solo el riesgo y estrés al paciente, sino el costo total en el procedimiento de diagnóstico.
Este es un cambio importante de las técnicas invasivas de la extracción de sangre o la prueba de Papanicolaou para mujeres, en los cuales los pacientes deben viajar a una clínica autorizada y solicitar un analista especializado. Se ha determinado que la orina puede de hecho ser utilizada como una muestra de fluido aceptable en las prácticas clínicas y aún se ha encontrado que aloja exitosamente la presencia de ADN genómico y viral de VPH cuando una infección está presente. No solo eso, sino una prueba de orina no invasiva es mucho más segura para un paciente que una prueba de Papanicolaou que puede crear ocasionalmente microlesiones alrededor del área infectada de un paciente femenino creando una respuesta inflamatoria.
Por consiguiente, se describe en la presente nuevos métodos y kits para determinar simultáneamente si los genotipos de la cepa VPH y los marcadores genéticos para susceptibilidad al cáncer están presentes en una muestra de un sujeto.
De esta manera, en varias modalidades, la presente invención se dirige a métodos para determinar simultáneamente genotipos de la cepa VPH y marcadores genéticos para la susceptibilidad al cáncer en una muestra de un sujeto.
Koninkl (WO2009095840) describe un método para detección de factores patogénicos y específicos de hospedero simultáneos en una muestra líquida que comprende los pasos de extraer ADN fuera del cuerpo humano o animal de una muestra de tejido; solubilizar el ADN para obtener una muestra líquida que comprende ADN hospedero y/o ADN patógeno; cargar la muestra líquida en la cámara del dispositivo de microdisposición a fin de hacer contacto con los nucleótidos de sonda del dispositivo de microdisposición con la muestra líquida y detectar las interacciones entre el ADN hospedero y/o el ADN patógeno comprendido en la muestra líquida y los nucleótidos de sonda. En este método, el ADN se amplifica después del paso de extracción utilizando PCR multiplex con cebadores específicos para las regiones de ADN hospedero y ADN de patógeno. Y el dispositivo de microdisposición que comprende oligonucleótidos de sonda es capaz de enlazar los factores de ADN específicos de hospedero implicados en la susceptibilidad a y/o prognosis de la enfermedad específica, y los oligonucleótidos de sonda son capaces de enlazar los patógenos de ADN que provocaron una enfermedad específica y cualquier cáncer provocado por patógenos tal como cáncer de estómago y cáncer cervical. En este método se pueden utilizar hasta 20-50 sondas para detectar el ADN patogénico se pueden utilizar y hasta 30-40 sondas para detectar marcadores en el ADN hospedero.
No obstante, la invención no incluye genotipificación de tipos virarles VPH específicos, tampoco SNPs específicos para el cáncer cervical, cáncer de próstata u otros tipos específicos de cáncer. La presente solicitud difiere con ese trabajo en que los genotipo de la cepa VPH específicos se eligen y mediante el uso de un ensayo de ligación de oligonucleótidos en lugar del microdisposición consumidor de tiempo y costoso. WO2009/095840 describe que los SNPs se detectan, lo cual conduce a la susceptibilidad a la infección por el patógeno en el ADN del hospedero, de esta manera la sensibilidad al desarrollo de cáncer cervical o cáncer de estómago también se menciona.
Por otra parte, Rafnar y colaboradores (W02010018601 ) , describe un método para determinar el riesgo de cáncer o protección de la identificación de uno o más marcadores polimórficos rs401681, rs2736100 y rs2736098. El método comprende la presencia de al menos un alelo de al menos un marcador polimórfico, ya sea de una muestra de ácido nucleico de humano o en un conjunto de datos de genotipo del individuo. Este trabajo consistente reclama métodos, software y hardware para determinar la susceptibilidad al cáncer en un individuo humano o se basa en datos indicativos de al menos un marcador polimórfico. También reclama un método para evaluar un individuo para la probabilidad de respuesta a un agente terapéutico canceroso. En los métodos moleculares para identificación de polimorfismos se basan en amplificación por PCR en donde la genotipificación se lleva a cabo utilizando un proceso seleccionado de hibridación de sonda especifica de alelo, extensión de cebadores especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, secuenciación de ácido nucleico, digestión de 5' -exonucleasa, ensayo de baliza molecular, ensayo de ligación de oligonucleótido, análisis de tamaño, análisis de conformación de hebra individual y tecnología de microdisposición . No obstante, las condiciones de PCR multiplex tampoco las cuentas magnéticas se describen y la capacidad multiplex en los métodos clínicos no se especifican. Implica un alcance de tipos de cáncer consistentes incluyendo determinar el riesgo o protección contra cánceres de próstata, cervicales, de mama, de pulmón, de piel, colorectal, y de tiroides de acuerdo con la presencia/ausencia de al menos un alelo de al menos uno de los tres polimorfismos indicados previamente.
WO2010018601 además, describe un método para determinar la sensibilidad de un humano a desarrollar cáncer cervical en una infección con VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH45 o cualquier otro de los genotipos de la cepa VPH que detectan la presencia de SNPs en los marcadores al amplificar el ADN extraído de una muestra obtenida del paciente utilizando PCR y después un ensayo de hibridación, tal como ensayo de ligación de oligonucleótidos .
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se basa en el descubrimiento seminal de la determinación de la susceptibilidad al cáncer mediante la identificación simultánea y detección de la infección por VPH y la genotipificación de marcadores de susceptibilidad al cáncer.
En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para evaluar la susceptibilidad al cáncer en un sujeto al identificar simultáneamente uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y uno o más genotipo de la cepa de virus de papiloma humano (VPH) , evaluando de esta manera la susceptibilidad al cáncer en el sujeto. En un aspecto, la identificación del uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es mediante la amplificación de una muestra de ADN sin células del sujeto utilizando cebadores para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer; y detectar el ADN amplificado. En otro aspecto, la amplificación de la muestra de ADN sin células también usa cebadores para el uno o más genotipos de la cepa VPH. En un aspecto adicional, el cáncer es cáncer cervical, de próstata, de colon, pancreático, gástrico, de pulmón, leucemia y mama. En ciertos aspectos, el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD,
CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC,
CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC,
COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG,
LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD,
MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA,
PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG,
GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI; un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) situado dentro del gen que codifica para IL10, TGF-βΙ, CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2, HOXB13, Chr8, SMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2 , NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8 , BRCA2 , BRCA1, ATM, TCF2 , TGFB1 , KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4 , TNF- Oí , MDM2, LHl, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2 , SRD5A2, EIF3H y/o SH6; y/o SEQ ID NOs:l-67. En algunos aspectos, el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es especifico para el cáncer cervical (CaCuA. CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, y/o CaCuJ) ; específico para cáncer de próstata (CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, y/o CaPJ) ; específico para cáncer de colon (COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, y/o COLG) ; específico para cáncer gástrico (GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, y/o GASG) ; específico para leucemia (LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, y/o LEUF) ; específico para cáncer de mama (MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, y/o MAMG) , PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF; específico para cáncer pancreático (PANA, PANB, PANC y/o PAND) , específico para cáncer de pulmón (PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, y/o PULG) ; y/o GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI. En un aspecto adicional, el uno o más genotipos de la cepa VPH es VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68, VPH-73 y/o SEQ ID NOs:68- 82. En un aspecto, el uno o más genotipos de la cepa VPH es una cepa de alto riesgo. En un aspecto específico, el genotipo de la cepa VPH es VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-45 y/o VPH-58. En un aspecto adicional, el genotipo de la cepa de HVP se determina al detectar VPHA, VPHB, VPHC, VPHD, VPHE, VPHF, VPHG, VPHH, VPHI, VPHJ, VPHK, VPHL, VPHM, HVPN, y/o VPHO. En un aspecto adicional, la detección del ADN amplificado se lleva a cabo por el ensayo de oligo-ligación (OLA) , PCR, qPCR, secuenciación de ADN, fluorescencia, electroforesis en gel, cuentas magnéticas, extensión de cebador específico de alelo (ASPE) e/o hibridación directa. En otro aspecto, el OLA usa sondas para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer. En un aspecto adicional, el OLA también usa sondas para el uno o más genotipos de la cepa VPH . En un aspecto, la muestra es una muestra de saliva, hisopo, sangre u orina. De esta manera, en varias modalidades, la presente invención se dirige a métodos para determinar simultáneamente los genotipos de la cepa VPH y marcadores genéticos para la susceptibilidad al cáncer en una muestra de un sujeto. Los métodos incluyen a) proporcionar una muestra del sujeto, b) obtener el ADN sin células de la muestra amplificar el ADN sin células con PCR de punto final utilizando cebadores para uno o más genotipos de la cepa VPH y cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer; d) llevar a cabo un ensayo de ligación de oligonucleótido (OLA) en el ADN sin células amplificado utilizando sondas para el uno o más genotipos de la cepa VPH y sondas para el uno o más marcadores de susceptibilidad al cáncer y e) determinar si el uno o más genotipos de la cepa VPH y el uno o más marcadores de susceptibilidad al cáncer están presentes en el ADN sin células amplificado. En varias modalidades, la muestra es una muestra de orina. El uno o más genotipos de la cepa VPH pueden incluir una pluralidad de genotipos de la cepa VPH de alto riesgo. El uno o más marcadores de susceptibilidad al cáncer puede incluir una pluralidad de marcadores de susceptibilidad al cáncer cervical o una pluralidad de marcadores de susceptibilidad al cáncer de próstata .
En una modalidad adicional, la presente invención proporciona métodos llevados a cabo al amplificar una muestra de ADN sin células de un sujeto utilizando cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y para uno o más genotipos de la cepa de virus de papiloma humano (VPH) ; y detectar el ADN amplificado. En un aspecto, el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer son marcadores para cáncer cervical, de próstata, de colon, pancreático, de pulmón, de mama, gástrico o leucemia. En un aspecto adicional, el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI; un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) situado dentro del gen que codifica para IL10, TGF-βΙ, CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1 , ERBB2 , HOXB13, Chr8, MSMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2, BRCA1, ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4, TNF-α, MDM2, MLH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2 , SRD5A2, EIF3H y/o MSH6; y/o SEQ ID NOs:l-67. En un aspecto adicional, el uno o más genotipos de la cepa VPH es VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68 y/o VPH-73. En ciertos aspectos, la detección del ADN amplificado se lleva a cabo por el ensayo de oligo-ligación, PCR, secuenciación de ADN, fluorescencia, electroforesis en gel, cuentas magnéticas, extensión de cebador especifico de alelo (ASPE) e/o hibridación directa. En aspectos específicos, la PCR es qPCR, PCR multiplex o PCR anidada. En un aspecto, la muestra es una muestra de saliva, hisopo, sangre u orina.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit que contiene al menos cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer; cebadores para uno o más genotipos de la cepa de virus de papiloma humano (VPH) ; e instrucciones para el uso. En un aspecto, el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH, GENI y/o SEQ ID NO: 1-67; un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) situado dentro del gen que codifica para IL10, TGF-βΙ, CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2, HOXB13, Chr8, MSMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2 , BRCA1, ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4, TNF-α, MDM2 , MLH1, BRAF, TP53, BCARl, STK11, KRAS, FGFR2, SRD5A2, EIF3H y/o MSH6; y/o SEQ ID NOs : 1-67. En otro aspecto, el uno o más genotipos de la cepa VPH son VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68 y/o VPH-73 y/o SEQ ID NOs: 68-82. En un aspecto adicional, el kit también contiene sondas para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y/o sondas para el uno o más genotipos de la cepa VPH.
La presente invención se mejora además en los métodos descritos y procesos, presentando un método multiplex innovador para la genotipificación de VPH simultánea y varias identificaciones de SNPs diferentes para tipos diferentes de predisposición de cáncer.
Estas y otras características, aspectos y ventajas de las presentes enseñanzas se entenderán mejor con referencia a la siguientes descripción, ej emplos y reivindicaciones ad j untas .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Aquellos de experiencia en la técnica entenderán que las figuras, descritas a continuación, son para propósitos ilustrativos solamente. Las figuras no se proponen para limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera .
Las FIGURAS 1A, IB, 1C, ID y 1E ilustran la especificidad de especie en la detección de SNPs asociados con SNPs de riesgo de cáncer cervical (CaCu) utilizando controles sintéticos, control biológico y ADN de 2 microorganismos uropatogénicos . FIGURA 1A. Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando controles sintéticos de tipo natural (WT) , mutante (MT) y heterocigotos (HET) (CS WT, CS MT y CS HET) . FIGURA IB. Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando ADN aislado de MI de control biológico. FIGURA 1C. Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando ADN aislado de C. lupus familíaris . FIGURA ID. Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando ADN aislado de Escherichia colí. FIGURA 1E. Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando ADN aislado del virus de Inmunodeficiencia Humano, VIH.
Las FIGURAS 2A y 2B ilustran la especificidad de intraensayo con la detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando el control biológico MI. FIGURA 2A. Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando sondas CaCu especificas. FIGURA 2B Detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando sondas especificas para la detección de VPH.
La FIGURA 3 ilustra los resultados de las amplificaciones de PCR representativas de la susceptibilidad al cáncer cervical SNP designado como CaCuH en el cual AL indica líder alélico, C indica sin control de plantilla, WT indica control de ADN de tipo natural positivo, MT indica un control de ADN mutante positivo, B indica ADN extraído de las muestras de sangre. U indica ADN extraído de las muestras de orina y CL indica ADN extraído de las líneas de células que presentan el SNP.
Las FIGURAS 4A, 4B, 4C, 4D y 4E ilustran loa especificidad de especie en la detección de SNPs de riesgo de cáncer de próstata (CaP) utilizando controles sintéticos, una muestra de control biológica y ADN de 7 microorganismos uropatogénicos . FIGURA 4A. Detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando controles sintéticos (CS WT, CS MT y CS HET) . FIGURA 4B. Detección SNPs A-J de riesgo CaP utilizando ADN aislado de 4 de control biológico. FIGURA 4C. Detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando 100 ng de ADN aislado de C. lupus familiaris. FIGURA 4D. Detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando 100 ng de ADN aislado de Escherichia coli. FIGURA 4E. Detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando 100 ng de ADN aislado de VIH.
Las FIGURAS 5A y 5B ilustran la especificidad de intra-ensayo en la detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando la muestra de control biológica M . FIGURA 5A. Detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando sondas CaP específicas. FIGURA 5B. Detección de SNPs A-J de riesgo CaP utilizando sondas específicas para la detección de VPH.
La FIGURA 6 muestra los resultados de las amplificaciones por PCR representativas de los SNPs de susceptibilidad al cáncer de próstata designados como CaPG, CaPD y CaPH, en los cuales AL indica líder alélico, C indica sin control de plantilla, WT indica control de ADN de tipo natural positivo, MT indica control de ADN mutante positivo, B indica ADN extraído de las muestras de sangre, U indica ADN extraído de muestras de sangre y CL indica ADN extraído de la línea de células que presentan el SNP.
Las FIGURAS 7A, 7B, 7C, 7D y 7E ilustran la especificidad de especie en la descripción de VPH ADN utilizando controles sintéticos y controles biológicos positivos para VPHA, VPHB, VPHC, VPHF, VPHG y VPHO. FIGURA 7A. Detección de VPHs A-0 ADN utilizando controles sintéticos. FIGURA 7B. Detección de VPH DNA utilizando controles biológicos. FIGURA 7C. Detección de VPH ADN utilizando ADN aislado de C. lupus familiaris . FIGURA 7D. Detección de VPH ADN utilizando ADN aislado de Escherichia coli. FIGURA 7E. Detección de VPH utilizando ADN aislado de VIH.
Las FIGURAS 8A, 8B, y 8C ilustran la especificidad de intra-ensayo en la detección de VPH ADN utilizando controles sintéticos. FIGURA 8A. Detección de VPH ADN utilizando sondas de VPH especificas. FIGURA 8B. Detección de VPH ADN utilizando sondas de CaCu especificas. FIGURA 8C. Detección de VPH ADN utilizando sondas de CaP especificas .
Las FIGURAS 9A y 9B ilustran los resultados de corrida de PCR representativas que identifican dos tipos de VPH en los cuales AL indica líder alélico, C- indica sin control de plantilla, C+l indica control positivo sintético, C+2 indica ADN viral y CL indica ADN extraído de una línea de células conocida por contener el virus correspondiente. FIGURA 9A. Corridas de PCR representativas que identifican VPHA. FIGURA 9B. Corridas de PCR representativas que identifican VPHB.
La FIGURA 10 muestra la identificación de 20 polimorfismos de riesgo de cáncer utilizando controles sintéticos por la prueba GanPlex MR (Panel A) . La gráfica muestra los valores MFI registrados en cada uno de los polimorfismos de riesgo de cáncer cuando se utilizaron controles sintéticos de tipo natural (CS WT) , Mutantes (MT) y Heterocigotos (HET) . Las barras representan el Promedio ± 1 D.E. de 2 réplicas.
La FIGURA 11 muestra la identificaron de 22 polimorfismos de riesgo de cáncer utilizando controles sintéticos por la prueba GanPlex MR (Panel B) . La gráfica muestra los valores MFI registrados en cada uno de los polimorfismos de riesgo de cáncer cuando se utilizaron los controles sintéticos de tipo natural (CS WT) , Mutantes (MT) y Heterocigotos (HET) . Las barras representan el Promedio ± 1 D.E. de 2 réplicas.
La FIGURA 12 ilustra el ensayo de discriminación alélica de un SNP de riesgo de cáncer cervical que muestra la fluorescencia asociada con el alelo de tipo natural (WT) en el eje X, la fluorescencia asociada con un alelo mutante (MT) en el eje Y, y la delimitación de las áreas de fluorescencia utilizando un control WT sintético, un control sintético MT y un control sintético heterocigoto (WT/MT) .
Las FIGURAS 13A y 13B ilustran electroferogramas ejemplares de acuerdo con varias modalidades descritas en la presente.
La FIGURA 14 es una gráfica de flujo que ilustra la detección de secuencias objetivo previamente amplificadas por PCR, utilizando qPCR en presencia de sondas SYBRMR Green o TaqManMR etiquetada con diferentes fluoróforos, en los cuales (1) indica el oligonucleótido delantero, (2) el oligonucleótido inverso, (5) la secuencia de sonda, (6) la secuencia objetivo, (7) el extremo de cebador 5, (8) el extremo de cebador 3, (100) el paso de desnaturalización (temperatura de 95°C), (200) el paso de alineación, y (300) el paso de extensión (temperatura de 72 °C) .
La FIGURA 15 ilustra un ejemplo de gráfica de amplificación que muestra la secuencia objetivo identificadas por qPCR utilizando sondas TaqManMR etiquetadas con tres fluoróforos diferentes. La gráfica muestra el análisis de una muestra biológica incluyendo sus controles sintéticos respectivos formados para identificar uno de los SNPs asociado con cáncer de próstata, en el cual (29) indica la amplificación del control sintético positivo de tipo natural, (30) la amplificación del control sintético positivo Mutante, (31) la amplificación de la muestra biológica Mutante, y (32) la amplificación del control Negativo.
Las FIGURAS 16A y 16B muestran la identificación y la discriminación alélica de polimorfismos de riesgo para CaCu en la muestra de control biológica MI por la prueba Kimera- TestMR. FIGURA 16A: Se muestran los valores MFI registrados en cada uno de los polimorfismos de riesgo CaCu identificados de la muestra de control biológica MI. Las barras representan el Promedio ± 1 D.E. de 4 réplicas. FIGURA 16B: Gráfica de discriminación de alelo originada de los valores RA obtenidos. La muestra de control biológica MI presenta los polimorfismos CACUA, CACUB, CACUD y CACUJ en el genotipo Ho.WT, CACUH y CACUG en el genotipo Ho.MT, CACUF y CACUC en el genotipo HE .
Las FIGURAS 17A y 17B muestran la identificación y discriminación alélica de polimorfismos de riego para CaP en la muestra de control biológica por la prueba Kimera- TestTM. FIGURA 17A: Se muestran los valores MFI registrados en cada uno de los polimorfismos de riesgo CaP identificados en la muestra de control biológica M4. Las barras representan el Promedio ± 1 D.E. de 4 réplicas. FIGURA 17B: Gráfica de discriminación de alelo originada de los valores RA obtenidos. La muestra de control biológica M4 presenta CAPA, CAPB, CAPC, CACUD, CAPE, CAPF, CAPG y los polimorfismos CAPI en el genotipo Ho.WT, CAPH y CAPJ en el genotipo HET.
Las FIGURAS 18A, 18B, 18C, 18D, 18E, 18F, 18G, 18H, 181, 18J, 18K, 18L, 18M y 18N muestran la detección de las cepas de VPH. FIGURA 18A. muestra 5636. FIGURA 18B. muestra 1920. FIGURA 18C. 1929. FIGURA 18D. 1933. FIGURA 18E. muestra 1573. FIGURA 18F. muestra 2864. FIGURA 18G. muestra 1877. FIGURA 18H. muestra 1878. FIGURA 181. muestra 1882. FIGURA 18 J. muestra 1883. FIGURA 18K. muestra 1909. FIGURA 18L. muestra 1920. FIGURA 18 . muestra 1933. FIGURA 18N. muestra 1939.
Las FIGURAS 19A, 19B, 19C, 19D, 19E, 19F, 19G, 19H y 191 muestran la determinación de susceptibilidad al cáncer de mama. FIGURA 19A. muestra 113. FIGURA 19B muestra 116. FIGURA 19C. muestra 117. FIGURA 19D. muestra 118. FIGURA 19E. muestra 119. FIGURA 19F muestra 120. FIGURA 19G. muestra 133. FIGURA 19H. muestra 134.
Las FIGURAS 20A, 20B, 20C, 20D, 20E, 20F, 20G, 20H, 201, 20J, 20K, 20L, 20M, 20N, 20O, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20U y 20V muestran la determinación de la susceptibilidad al cáncer de colon. FIGURA 20A muestra 81. FIGURA 20B muestra 82. FIGURA 20C muestra 84. FIGURA 20D muestra 85. FIGURA 20E. muestra 86. FIGURA 20F. muestra 87. FIGURA 20G muestra 88. FIGURA 20H. muestra 89. FIGURA 201 muestra 90. FIGURA 20J. muestra 92. FIGURA 20K. muestra 93. FIGURA 20L. muestra 96. FIGURA 20M. muestra 97. FIGURA 20N. muestra 100. FIGURA 20O. muestra 101. FIGURA 20P. muestra 102. FIGURA 20Q. muestra 103. FIGURA 20R. muestra 104. FIGURA 20S. muestra 105. FIGURA 20T. muestra 106. FIGURA 20U. muestra 107. FIGURA 20V. muestra 108.
Las FIGURAS 21A, 21B, 21C, 21D y 21E muestran los resultados de qPCR de una muestra de cáncer de mama para marcadores de genes específicos de cáncer de mama. FIGURA 21A. MAMA SNP. FIGURA 2 IB. MAMB SNP. FIGURA 21C. MAMC SNP. FIGURA 2 ID. MAMD SNP. FIGURA 21E. MAMD SNP. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención se basa en el descubrimiento seminal que la detección simultánea de la infección por VPH y la genotipificación de los marcadores de susceptibilidad al cáncer se pueden utilizar para determinar la susceptibilidad al cáncer en un sujeto.
Antes que se describan las presentes descomposiciones y métodos, se va a entender que esta invención no se limita a composiciones particulares, métodos, y condiciones experimentales descritas, ya que estas composiciones, métodos y condiciones pueden variar. También se va a entender que la terminología utilizada en la presente es para propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se proponen para ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención será limitada solo en las reivindicaciones adjuntas.
Como es utiliza en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, las referencias al "el método" incluye uno o más métodos, y/o pasos del tipo descrito en la presente que serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica en la lectura de esta descripción y así sucesivamente. Por ejemplo, el término "un genotipo de la cepa VPH" puede incluir "una pluralidad de genotipos de la cepa VPH". Similarmente, la forma plural puede incluir la forma singular.
Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente a manera de referencia al mismo grado como si cada publicación individual, patente, o solicitud de patente se hubiera indicado específica e individualmente a ser incorporada por referencia.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares y equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la invención, se entenderá que las modificaciones y variaciones son abarcadas dentro del espíritu y alcance de la presente descripción. Ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
El término "aproximadamente" cuando se utiliza antes de una designación numérica, por ejemplo, pH, temperatura, cantidad, concentración, y peso molecular, incluyendo intervalo, indica aproximaciones que pueden variar por ± 5%, ±1% o ±0.1%.
Como se utiliza en la especificación y reivindicaciones, la forma singular "un", "una", "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.
El término "y/o" se propone para referirse a cualquiera o ambos de los dos componentes de la invención.
Varias modalidades de la presente invención se dirigen a métodos y kits para determinar simultáneamente si los genotipos de la cepa VPH y marcadores genéticos para la susceptibilidad al cáncer están presentes en una muestra de un sujeto.
En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para evaluar la susceptibilidad al cáncer en un sujeto al identificar simultáneamente uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y una cepa del genotipo de virus de papiloma humano (VPH) , evaluando de esta manera la susceptibilidad al cáncer en el sujeto. Como es utiliza en la presente "determinar una susceptibilidad al cáncer" y "evaluar una susceptibilidad al cáncer" en un paciente se puede utilizar intercambiablemente, y se refiere a la evaluación de la probabilidad del paciente a desarrollar un cierto tipo de cáncer. La evaluación del riesgo del desarrollo de cáncer de la presente invención incluye la detección de un ADN de la cepa VPH, y la detección de SNPs que se asocian con la susceptibilidad al cáncer.
El término "cáncer" se refiere a un grupo de enfermedades caracterizadas por proliferación de células anormales y descontroladas comenzando en un sitio (sitio primario) con el potencial de invadir y/o propagares a otros sitios (sitios secundarios, metástasis) que diferencian el cáncer (tumor maligno) del tumor benigno. Virtualmente , todos los órganos se pueden afectar, conduciendo a más de 100 tipos de cáncer que pueden afectar humanos. Los cánceres pueden resultar de muchas causas incluyendo predisposición genética, infección viral, disposición a radiación ionizante, disposición a contaminantes ambientales, uso de tabaco o alcohol, obesidad, dieta deficiente, falta de actividad física o cualquier combinación de los mismos. Los cánceres particulares referido en la presente son cáncer cervical, de próstata, de colon, pancreático, de pulmón o cabeza y cuello .
Los cánceres ejemplares descritos por el Instituto de Cáncer Nacional incluyen: Leucemia Linfoblástica Aguda, Adulta; Leucemia Linfoblástica Aguda, de la Niñez; Leucemia mieloide Aguda, Adulta; Carcinoma Adrenocortical ; Carcinoma Adrenocortical , de la Niñez; Linfoma Relacionado con SIDA; Afecciones Malignas Relacionadas con SIDA; Cáncer Anal; Astrocitoma, Cerebelar de la Niñez; Astrocitoma, Cerebral de la Niñez; Cáncer del Conducto Biliar, Extrahepático; Cáncer de Vejiga; Cáncer de Vejiga, de la Niñez; Cáncer Óseo, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno; Glioma de Tallo Cerebral, de la Niñez; Tumor Cerebral, Adulto; Tumor Cerebral, Glioma del Tallo Cerebral, de la Niñez; Tumor Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, de la Niñez; Tumor Cerebral, Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, de la Niñez; Tumor Cerebral, Ependimoma, de la Niñez; Tumor Cerebral, Meduloblastoma, de la Niñez; Tumor Cerebral, Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Suprasensoriales, de la Niñez; Tumor Cerebral, Ruta Visual y Glioma Hipotalámico, de la Niñez; Tumor Cerebral; de la Niñez (Otros); Cáncer de mama; Cáncer de mama y Embarazo; Cáncer de mama, de la Niñez; Cáncer de mama, Masculino; Adenomas
Bronquiales/Carcinoides , de la Niñez; Tumor Carcinoide, de la Niñez; Tumor Carcinoide, Gastrointestinal; Carcinoma, Adrenocortical ; Carcinoma, Célula de Islotes; Carcinoma de Primario Desconocido; Linfoma del Sistema Nervioso Central, Primario; Astrocitoma Cerebelar, de la Niñez; Astrocitoma Cerebral/Glioma Maligno, de la Niñez; Cáncer Cervical; Cánceres de la Niñez; Leucemia linfocitica Crónica; Leucemia Mielogenosa Crónica; Trastornos
Mieloproliferativos Crónicos; Sarcoma de Células Claras de Revestimiento de Tendón; Cáncer de colon; Cáncer Colorectal, de la Niñez; Linfoma de Células T Cutáneo; Cáncer de Endometrio; Ependimoma, de la Niñez; Cáncer Epitelial, Ovárico; Cáncer Esofágico; Cáncer Esofágico, de la Niñez; Familia de Tumores de Ewing; Tumor de Células Germinales Extracraneales , de la Niñez; Tumor de Células Germinales Extragonadales ; Cáncer del Conducto Biliar Extrahepático; Cáncer Ojos, Melanoma Intraocular; Cáncer de Ojos, Retinoblastoma; Cáncer de la Vesícula Biliar; Cáncer Gástrico (Estómago) ; Cáncer Gástrico (Estómago) , de la Niñez; Tumor Carcinoide Gastrointestinal; Tumor de Células Germinales, Extracraneal , de la Niñez; Tumor de Células Germinales, Extragonadal ; Tumor de Células Germinales, Ovárico; Tumor Trofoblástico Gestacional ; Glioma. Tallo Cerebral de la Niñez; Glioma. Ruta Visual de la Niñez e Hipotalámico; Leucemia de Células Pilosas; Cáncer de Cabeza y Cuello; Cáncer Hepatocelular (Hígado), Adulto (Primario); Cáncer Hepatocelular (Hígado), de la Niñez (Primario); Linfoma de Hodgkin, Adulto; Linfoma de Hodgkin, de la Niñez; linfoma de Hodgkin Durante el Embarazo; Cáncer Hipofaríngeo; Glioma Hipotalámico y de la Ruta Visual, de la Niñez; Melanoma Intraocular; Carcinoma de Células de los Islotes (Páncreas Endocrino) ; Sarcoma de Kaposi; Cáncer de Riñon; Cáncer de Laringe; Cáncer de Laringe, de la Niñez; Leucemia, Linfoblástica aguda, Adulta; Leucemia, Linfoblástica Aguda, de la Niñez; Leucemia, Mieloide Aguda, Adulto; Leucemia, Mieloide Aguda, de la Niñez; Leucemia, Linfocítica Crónica; Leucemia, Mielogenosa Crónica; Leucemia, Células Pilosas; Cáncer de Labios y Cavidad Oral; Cáncer de Hígado, Adulto (Primario); Cáncer de Hígado, de la Niñez (Primario) ; Cáncer de pulmón, Células no Pequeñas; Cáncer de Pulmón, Células Pequeñas; Leucemia Linfoblástica, Aguda Adulta; Leucemia Linfoblástica, Aguda de la Niñez; Leucemia linfocítica, Crónica; Linfoma, Relacionado con SIDA; Linfoma, Sistema Nervioso Central (Primario); Linfoma, Células T Cutáneas; Linfoma, de Hodgkin, Adulto; Linfoma, de Hodgkin; de la Niñez; Linfoma, de Hodgkin Durante el Embarazo; Linfoma, no de Hodgkin, Adulto; Linfoma, No de Hodgkin, de la Niñez; Linfoma, No de Hodgkin Durante el Embarazo; Linfoma, Sistema Nervioso Central Primario; Macroglobulinemia, Cáncer de mama Masculino de Waldenstrom; Mesotelioma Maligno, Adulto; Mesotelioma Maligno, de la Niñez; Timoma Maligno; Meduloblastoma, de la Niñez; Melanoma; Melanoma, Infraocular; Carcinoma de Células de Merkel; Mesotelioma, Maligno; Cáncer de Cuello Escamoso Metastásico con Primario Oculto; Síndrome de Neoplasia Endocrina Múltiple, de la Niñez; Mieloma Múltiple/Neoplasma de Células Plasmáticas; Fungoides Micosis; Síndromes de Mielodisplasia; Leucemia Mielogenosa, Crónica; Leucemia Mieloide, Aguda de la Niñez; Mieloma, Múltiple; Trastornos Mieloproliferativos, Crónicos; Cáncer de la Cavidad Nasal y Seno Paranasal; Cáncer Nasofaríngeo; Cáncer Nasofaríngeo, de la Niñez; Neuroblastoma; Linfoma No de Hodgkin, Adulto; Linfoma No de Hodgkin, de la Niñez; Linfoma No Hodgkin Durante el Embarazo; Cáncer de pulmón de Células no Pequeñas; Cáncer Oral, de la Niñez; Cáncer de la Cavidad Oral y Labios; Cáncer Orofaríngeo; Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno de Hueso; Cáncer Ovárico, de la Niñez; Cáncer Epitelial Ovárico; Tumor de Células Germinales de Ovario; Tumor de Potencial Maligno Bajo de Ovario; Cáncer Pancreático; Cáncer Pancreático, de la Niñez, Cáncer Pancreático, Células de Islote; Cáncer del Seno Paranasal y Cavidad Nasal; Cáncer de Paratiroides ; Cáncer de Pene; Feocromocitoma; Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Pineales y Suprasensoriales , de la Niñez; Tumor de la Pituitaria; Neoplasma de Células Plasmáticas/mieloma Múltiple; Blastoma Pleuropulmonar ; Embarazo y Cáncer de Mama; Embarazo y Linfoma de Hodgkin; Embarazo y Linfoma No de Hodgkin; Linfoma del Sistema Nervioso Central Primario; Cáncer de Hígado Primario, Adulto; Cáncer de Hígado Primario, de la Niñez; Cáncer de Próstata; Cáncer Rectal; Cáncer de Células Renales (Riñon) ; Cáncer de Células Renales, de la Niñez; Pelvis y Uréter Renal, Cáncer de Células Transicionales ; Retinoblastoma; Rabdomiosarcoma, de la Niñez; Cáncer de Glándulas Salivales; Cáncer de la Glándula Salivar, de la Niñez; Sarcoma, Familia de Ewing de Tumores; Sarcoma, Sarcoma de Kaposi (Histiocitoma Fibroso Maligno de Osteosarcoma V de Hueso; Sarcoma, Rabdomiosarcoma, de la Niñez; Sarcoma, Tejido Blando, Adulto; Sarcoma, Tejido Blando, de la Niñez; Síndrome de Sezary; Cáncer de Piel; Cáncer de Piel, de la Niñez; Cáncer de Piel (Melanoma) ; Carcinoma de Piel, Células de Merkel; Cáncer de Pulmón de Células Pequeñas; Cáncer de Intestino Delgado; Sarcoma de Tejido Blando, Adulto; Sarcoma de Tejido Blando, de la Niñez; Cáncer de Cuello Escamoso con Primario Oculto, etastásico ; Cáncer de Estómago (Gástrica); Cáncer de Estómago (Gástrica), de la Niñez; Tumores Neuroectodérmicos Primitivos Suprasensoriales, de la Niñez; Linfoma de Células T, Cutáneo; Cáncer Testicular; Timoma, de la Niñez; Timoma, Maligno; Cáncer de la Tiroides; Cáncer de la Tiroides, de la Niñez; Cáncer de Células Transicionales de la Pelvis Renal y Uréter; Tumor Trofoblástico, Gestacional ; Sitio Primario Desconocido, Cáncer de, de la Niñez; Cánceres Inusuales de la Niñez; Uréter y Pelvis Renal, Cáncer de Células Transicionales; Cáncer Uretral; Sarcoma Uterino; Cáncer Vaginal; Glioma de la Ruta Visual e Hipotalámico, de la Niñez; Cáncer Vulvar; Macro-globulinemia de Waldenstrom; y Tumor de Wilms.
Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a un mamífero y, particularmente, a un humano.
Como se utiliza en la presente, "Marcadores de susceptibilidad al cáncer" y "marcadores genéticos de susceptibilidad al cáncer" se utilizan intercambiablemente y se refieren a cualquiera de los marcadores genéticos que incrementan el riesgo del portador de tal marcador para desarrollar el cáncer asociado con el marcador. Los marcadores genéticos de susceptibilidad al cáncer se refieren en general a mutaciones heredadas o mutaciones somáticas en los genes supresores de tumor o en oncogenes, y que son responsables por el mayor riesgo de desarrollo de cáncer. Sin embargo, los marcadores de susceptibilidad al cáncer en un sujeto también se pueden identificar como polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs) . Un SNP es una variación de la secuencia de ADN que se presenta cuando un nucleótido individual - A, T, C, o G - en el genoma difiere entre los miembros de una especie. Como se utiliza en la presente, el término SNP se propone para referirse a aquellas variaciones de secuencia de ADN asociadas con el cáncer, en particular, con cáncer cervical o cáncer de próstata .
Los SNPs se han reportado que se asocian con cánceres cervicales y de próstata en pacientes. De esta manera, un número de SNPs en genes identificados, se ha reportado que se asocia con cáncer cervical y similarmente, a un número de SNPs se ha reportado que se asocia con cáncer de próstata. Estos SNPs se pueden tomar como objetivo en los métodos y kits en la presente para detectar la presencia de marcadores genéticos que indican susceptibilidad a cáncer cervical o cáncer de próstata.
Además, los SNPs se asocian con propensión a cáncer en órganos diferentes, incluyendo otros órganos tal como cánceres de mama, pulmón, pancreáticos, gástricos y de colon. Por otra parte, los SNPs se han asociado con cánceres, incluyendo leucemia, y específicamente leucemia linfoblástica mieloide crónica, leucemia linfoblástica mieloide aguda y leucemia linfocítica crónica. Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que los métodos y kits de la presente invención se pueden utilizar para detectar la presencia de marcadores genéticos indicando susceptibilidad a esos cánceres también. En otro aspecto, la detección simultánea de la infección por VPH (genotipificación) y la propensión genética de cáncer de próstata, y la detección simultánea de detección por VPH ( genotipificación) y la propensión genética de cáncer cervical, se puede lograr utilizando los métodos y kits de la presente invención. Las pruebas de ADN se pueden utilizar para identificar genotipos de la cepa VPH así como marcadores de susceptibilidad al cáncer en un sujeto.
En ciertos aspectos, el gen marcador de susceptibilidad al cáncer es CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI; es un SNP situado en el gen que codifica para IL10, TGF-βΙ, CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2 , HOXB13, Chr8, MSMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1 , ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8 , BRCA2 , BRCAl, ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDHl, IL1B, IL6, TLR4, TNF-OÍ, MDM2 , MLH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2, SRD5A2, EIF3H y/o MSH6; y/o SEQ ID NOs:l-67 *ver Tabla 22). En algunos aspectos el gen de susceptibilidad al cáncer es especifico para cáncer cervical (CaCuA. CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, y/o CaCuJ) ; especifico para cáncer de próstata (CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, y/o CaPJ); especifico para cáncer de colon (COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, y/o COLG) ; especifico para cáncer gástrico (GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, y/o GASG); especifico para leucemia (LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, y/o LEUF) ; especifico para cáncer de mama (MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, y/o MAMG), PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF; especifico para cáncer pancreático (PANA, PANB, PANC y/o PAND), especifico para cáncer de pulmón (PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, y/o PULG) ; y/o GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI. En otros aspectos el uno o más genes de susceptibilidad al cáncer es CACUA, CACUB, CACUC, CACUD, CACUF, CACUG, CACUH y/o CACUJ; CAPA, CAPB, CAPC, CAPD, CAPE, CAPF, CAPG, CAPI, y/o CAPJ; MAMC, MAMF, MAMG; y/o COLA, COLB, COLC y/o COLF.
Tabla 22
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Tabla 22 : Secuencias SNP de susceptibilidad al cáncer
Como se utiliza en la presente, "VPH" se refiere a virus de papiloma humano, virus de ADN de la familia de virus de papiloma humano que incluyen más de 170 tipos o cepas. La infección por VPH se propaga por contacto directo sostenido tal como contacto de piel a piel. La mayoría de infecciones por VPH no provocan síntomas y se resuelven espontáneamente. Sin embargo, en algunas personas la infección por VPH persiste y puede dar por resultado verrugas o lesiones pre-cancerosas que incrementan el riesgo de varios cánceres incluyendo cánceres cervicales, de vulva, de vagina, de pene, de ano, de boca y garganta. Las cepas de VPH se clasifican dependiendo del riesgo de cáncer genital asociado con la infección por VPH. Como tal, VPH-16, VPH-18, VPH-31 y VPH-45 son los tipos de VPH de riesgo más alto para cánceres genitales, mientras que VPH- 33, VPH-35, VPH-39, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58 y VPH-59 se clasifican como tipos de VPH de riesgo alto, y VPH-66, VPH-68 y VPH-73 se clasifican como tipos de VPH probablemente de riesgo alto. Como se utiliza en la presente, "cepas de VPH de riesgo alto" se refiere tanto a tipos de VPH de riesgo más alto como de riesgo alto sin distinción adicional. El VPH-16 también se asocia con el desarrollo de cánceres oro-laringo-faringeos . Casi todos los casos de cáncer cervical se asocian con una infección por VPH. La Tabla 23 lista el fragmento de Ll de VPH utilizado para identificar los genotipos de cepa.
Figure imgf000049_0001
GCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGG AAGATGGTGATATGGT
SEQ ID VPHC Fragment ACACTGAAAACTCTAATAGATATGCCGGTGGTCCTGGCA NO: 70 o de gen CTGATAATAGGGAATGTATATCRATGGATTATAAACAAA
Ll de CACARCTGTGTTTACTTGGTTGCAAACCACCTATTGGAG VPH-31 AGCATTGGGGTAARGGTAGTCCTTGTAGTAAYAATGCTA
TTACCCCTGGTGATTGTCCTCCATTAGAATTAAARAATW CAGTTATACAAGATGGGGATATGGTTGATACAGGCTTTG GAGCTATGGATTTTAC
SEQ ID VPHD Fragment ATGGGCATGTGTAGGCCTTGAAATAGGTAGAGGGCAGCC NO: 71 o de gen ATTAGGCGTTGGCATAAGTGGTCATCCTYTATTAAACAA
Ll de ATTTGATGACACTGAAACCRGTAACARGTATCCTGGACA VPH-33 ACCGGGTGCTGATAATAGGGAATGTTTATCCATGGATTA
TAAACAAACACAGTTATGTTTACTTGGATGTAAGCCTCC AACAGGGGAACATTGGGGTAAAGGTGTTGCTTGTACTAA TGCAGCACCTGCCAAT
SEQ ID VPHE Fragment TAAGGCATGGTGAAGAATATGATTTACAGTTTATTTTTC NO: 72 o de gen AGTTATGTAAAATAACACTAACAGCAGATGTTATGACAT
Ll de ATATTCATAGTATGAACCCGTCCATTTTAGAGGATTGGA VPH-35 ATTTTGGCCTTACACCACCGCCTTCTGGTACCTTAGAGG
ACACATATCGCTATGTAACATCACAGGCTGTAACTTGTC AAAAACCCAGTGCACCAAAACCTAAAGATGATCCATTAA AAAATTATACTTTTTG
SEQ ID VPHF Fragment GTGTATTTGCCTCCACCTTCTGTGGCGAAGGTTGTCAAT NO:73 o de gen ACTGATGATTATGTTACACGCACAGGCATATATTATTAT
Ll de GCTGGCAGCTCTAGATTATTAACAGTAGGACATCCATAT VPH-39 TTTAAAGTGGGTATGAATGGTGGTCGCAAGCAGGACATT
CCAAAGGTGTCTGCATATCAATATAGGGTATTTCGCGTG ACATTGCCCGATCCTAATAAATTCAGTATTCCAGATGCA TCCTTATATAATCCAG SEQ IDVPHG Fragment CGTGGCACTGTTAGRTTTAGTAGATTGGGTCAAAGGGCA NO: 74 o de gen ACCATGTTTACACGTAGTGGTAAACAAATAGGGGGTAGG
Ll de GTACATTTTTACCATGATATAAGCCCCATTGCTGCTACA VPH-45 GAGGAAATTGAATTGCAGCCTTTAMTTAGTGCTACAGAT
GATAGTGACCTGTTTGATGTATATGCAGACTTYCCACCT CCTGCGTCCACTACACCTAGCACTATAAACAAATCATTT ACATATCCAAAGTATT
SEQ ID VPHH Fragment GAGTGGGTTRGGTATATTTTTGGGTGGCCTAGGTATTGG NO: 75 o de gen TACKGGGTCTGGATCTGGGGGGCGTACTGGATATATCCC
Ll de TTTAGGTGGTGGGGGTCGCCCAGGCGTGGTGGATATTGC VPH-51 TCCTGCAAGGCCACCTATTATAATTGAACCTATAGCACC
TACTGAACCTTCTATAGTAAATTTGGTTGAVGACTCTAG TATTATTCAGTCTGGGTCTCCTATACCTACCTTTACTGG TACCGATGGCTTTGAA
SEQ ID VPHI Fragment GTACAAAGCAGTGCTTTTTTTCCTACTCCTAGTGGTTCT NO: 76 o de gen ATGGTAACCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACCGTAC
Ll de TGGTTACAACGTGCGCAGGGCCACAATAATGGCATATGT VPH-52 TGGGGCAATCAGTTGTTTGTCACAGTTGTGGATACCACT
CGTAGCACTAACATGACTTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG GAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAAGGAATACCTT CGTCATGGCGAGGAAT
SEQ ID VPHJ Fragment AAATAATAATGTTATAGAAGATAGTAGGGACAATATATC NO: 77 o de gen AGTTGATGGCAAGCAAACACAGTTGTGTATTGTTGGATG
Ll de TACTCCCGCTATGGGTGAACATTGGACTAAAGGTGCTGT VPH-56 GTGTAAGTCCACACAAGTTACCACAGGGGACTGCCCGCC
TCTTGCATTAGTTAATACACCTATAGAGGATGGGGACAT GATAGACACAGGATTTGGCGCTATGGACTTTAAGGTGTT GCAGGAATCTAAGGCT SEQ IDVPHK Fragment TGCGTCGCAGACGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTGCAG NO: 78 o de gen ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTG
Ll de CCTCCTGTGCCTGTGTCTAAGGTTGTAAGCACTGATGAA VPH-58 TATGTGTCACGCACAAGCATTTATTATTATGCTGGCAGT
TCCAGACTTTTGGCTGTTGGCAATCCATATTTTTCCATC AAAAGTCCCAATAACAATAAAAAAGTATTAGTTCCCAAG GTATCAGGCTTACAGT
SEQ ID VPHL Fragment TTCCTAAGGTGTCTGCATATCAATACAGAGTATTTAGGG NO: 79 o de gen TTAAKTTACCTGATCCYAATAAATTYGGCCTTCCAGATA
Ll de ACACAGTATATGATCCTAACTCTCAACGCYTGGTCWGGG VPH-59 CCTGTGTAGGTGTTGAAATCGGTCGGGGCCAACCTTTAG
GGGTAGGACTYAGTGGTCATCCATTMTATAATAAATTRG ATGACACTGAAAACTCTCATGTAGCATCTGCTGTTGATA MCAAAGATACACGTGA
SEQ ID VPHM Fragment ATATATACAGGGAGCYACATTTGCACTATGGCCTGTATA NO: 80 o de gen TTTTTTTAAACGTAGGCGCCGTAAACGTATTCCCTATTK
Ll de TTTTGCAGATGGCGATGTGGCGGCCTAGTGACAATAAGG VPH-66 TGTACCTACCTCCAACACCTGTTTCAAAGGTTGTGGCAA
CGGATACATATGTAAAACGTACCAGTATATTTTATCATG CAGGTAGCTCTAGGTTGCTTGCTGTTGGCCATCCTTATT ACTCTGTTTCYAAATC
SEQ ID VPHN Fragment ATGGCATTGTGGCGMKCTAGCGACAACATGGTGTATTTG NO: 81 o de gen CCTCCCCCCTCAGTGGCGAAGGTTGTCAATACAGATGAT
Ll de TAYGTRACACGCACTGGCATKTATTAYTATGCTGGTACA VPH-68 TCTAGGTTATTAACTGTAGGCCATCCATATTTTAARGTY
CCTATGTCTGGGRGCCGYAAGCAGGRCATTCCTAAGGTG TCTGCATATCAATAYAGRGTGTTTMGRRTTWCCYTRCCY GATCCTAATAAATTTA
SEQ ID VPHO Fragment CCTTTTATAATCCTGATAAGGAGCGCCTAGTATGGGCCT NO: 82 o de gen GTTCTGGTGTGGAGGTTGGACGTGGACAACCCTTAGGTA
Ll de TAGGTACTAGTGGCAATCCATTTATGAATAAATTRGATG
VPH-16 ATACTGAAAATGCTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATA
CAGATGGTAGAGAATGTATGTCAGTGGATTATAAACAAA
CACAGTTGTGTATTTTAGGTTGTAGGCCTCCCTTAGGGG
AACATTGGGGTCCAGG
Tabla 23: Secuencias de la cepa de VPH
Las infecciones con las cepas de VPH de alto riesgo se han asociado con cánceres. Se ha reportado que VPH-16 y VPH-18 provocan aproximadamente 80% de cánceres cervicales en el mundo, mientras que el 20% restante de cánceres cervicales se asocian predominantemente con otro VPH-31, VPH-33, VPH-45 y VPH-58. Las cepas de VPH de alto riesgo también se han reportado que es asocian con cáncer de próstata. La más común de estas cepas de VPH son VPH-16, VPH-31, VPH-33 y VPH-18 junto con VPH-58. VPH-11 y VPH-6 a un menor grado. La prueba de ADN se h utilizado para la identificación de cepas de VPH. De esta manera, el ADN viral se puede fijar como objetivo en los métodos y kits en la presente para detectar la presencia de serotipos de VPH de alto riesgo.
La infección por VPH también se ha reportado que se asocia con riesgos más altos de desarrollar cánceres no genitales u oro-laringo-faringeos .
En un aspecto, la identificación del uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es al amplificar una muestra de ADN sin células del sujeto utilizando cebadores para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer; y detectar el ADN amplificado. En otro aspecto, la amplificación de la muestra de ADN sin células también usa cebadores para el uno o más genotipos de la cepa VPH. El término "muestra", puede incluir sangre entera, plasma, suero, capa leucocitaria, un fluido corporal, linfocitos, tejido, células cultivadas y similar y, en particular, el término "muestra" puede referirse a muestras de orina, muestra de saliva, muestra de sangre, ADN sin células de sangre y espécimen de o de la piel, membrana mucosa u otra área corporal o superficie que se examina por medio de un hisopo.
Una muestra de orina del paciente se puede recolectar en una tasa de muestra de recolección de orina. La tasa se puede pre-llenar con un liquido adecuado para conservar la muestra de orina. En varias modalidades, el kit puede contener una tasa de muestra de recolección de orina, rellenada con un liquido conservador. El liquido conservador puede incluir tales conservadores como ácido clorhídrico, ácido bórico, ácido acético, tolueno o timol.
La muestra de orina, sangre o saliva puede ser una muestra aleatoria recolectada en cualquier momento siguiendo los métodos estándares de recolección.
El ADN sin células se puede extraer de la muestra, incluyendo una muestra de orina, o cualquier método conocido en la técnica incluyendo al utilizar solventes orgánicos tal como una mezcla de fenol y cloroformo, o seguido por precipitación con etanol. Entre otros métodos para extraer el ADN sin células, un tal método incluye, por ejemplo, utilizar partículas de sílice recubiertas con polilisina. Alternativamente, el ADN sin células se puede extraer de la orina utilizando un kit comercialmente disponible tal como, por ejemplo, mini-kit de ADN QlAampMR (Qiagen, Germantown, MD) .
El ADN extraído se amplifica por uno de los métodos alternativos para amplificación de ADN bien conocido en la técnica, que incluye por ejemplo: la tecnología XmapMR de Luminex que permite el análisis simultáneo de hasta 500 bioensayos a través de la lectura de la prueba biológica sobre la superficie de la cuenta de poliestireno microscópica; la PCR multiplex que permite la amplificación simultánea de varias secuencias de ADN; la amplificación de sonda dependiente de ligación multiplex (MLPA) para la amplificación de múltiples objetivos utilizando un par individual de cebadores; la PCR cuantitativa (qPCR) , que mide y cuantifica la amplificación en tiempo real; la reacción en cadena de ligación (LCR) que utiliza cebadores que cubren la secuencia completa para amplificar, previniendo de esta manera la amplificación de las secuencias con una mutación; la amplificación de circulo rodante (RCA) , en donde los dos extremos de las secuencia se unen por una ligasa antes de la amplificación del ADN circular; la amplificación dependiente de helicasa (HDA) que depende de una helicasa para la separación del ADN de doble hebra; la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que emplea un ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra alta; la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico, específicamente diseñada para objetivos de ARN; la amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) que depende de un ADN polimerasa de desplazamiento de hebra, para iniciar la replicación en hendiduras creada por una endonucleasa de restricción limitada a hebra, o enzima formadora de hendiduras en un sitio contenido en un cebador; y la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) , basada en el uso de la ADN polimerasa de desplazamiento sumamente procesiva y de hebra del bacteriófago 029. Los métodos de PCR como se utilizan en la presente se han utilizado en las pruebas de diagnóstico y son bien conocidos en la técnica.
El ADN genómico extraído es por ejemplo amplificar utilizando la reacción de PCR multiplex llevada siguiendo las condiciones detalladas en la Tabla 1. Desnaturaliza DesnaturaliAlineaciórJExtensión¡ Extensión ción inicial zación Final
1 ciclo 40 ciclos 1 ciclo min. C Seg. C Seg. C Seg C min.
Mama, 95 95 30 61- 60 72 20 72 próstata, 65
pulmón,
colon,
gástrico,
leucemia,
páncreas,
próstata,
cervical
Tabla 1: Condiciones para la amplificación del ADN genómico por PCR multiplex
Un cebador es una hebra corta de ARN o ADN (en general de aproximadamente 18-22 bases) que sirve como un punto de partida para la síntesis de ADN. Los cebadores se utilizan en los métodos para amplificar ADN. En un aspecto, los cebadores para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer se diseñan para amplificar genes marcadores de susceptibilidad al cáncer CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI y/o SEQ ID NOs : 1-67 y los cebadores para el uno o más genotipos de la cepa VPH se diseñan para amplificar VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68, VPH-73 y/o SEQ ID NOs : 68-82. Como se utiliza en la presente "ADN amplificado" o "producto de PCR" se refiere a un fragmento amplificado de ADN de tamaño definido. Varias técnica con disponibles y bien conocidas en el campo para detectar productos de PCR. Los métodos de detección de producto de PCR incluyen, pero no se restringen a, electroforesis en gel utilizando gel de agarosa o poliacrilamida y agregando tinción de bromuro de etidio (un intercalante de ADN) , sondas etiquetadas (etiquetas radioactivas o no radioactivas, análisis de southern blotting) , desoxiribonucleótidos etiquetados (para la incorporación directa de etiqueta radioactivas o no radioactivas) o tinción de plata para la visualización directa de los productos de PCR amplificados; digestión de endonucleasa de restricción, que depende de gel de agarosa o poliacrilamida o cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) ; tinciones de puntos, que utiliza la hibridación del ADN amplificado en las sondas etiquetadas específicas (etiquetas radioactivas o no radioactivas); cromatografía líquida de alta presión utilizando detección ultravioleta; electroquimioluminiscencia acoplada con reacción química iniciada por voltaje/detección de fotones; y secuenciación directa utilizando desoxiribonucleótidos radioactivos o fluorescentemente etiquetados para la determinación del orden preciso de nucleótidos con un fragmento de ADN de interés, ensayo de oligo-ligación (OLA) , PCR, qPCR, secuenciación de ADN, fluorescencia, electroforesis de gel, cuentas magnéticas, extensión de cebador específico de alelo (ASPE) e/o hibridación directa.
Los métodos de ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA) también son bien conocidos en la técnica. Brevemente, este método permite la detección de secuencias objetivo previamente amplificadas por PCR. El método OLA requiere sondas específicas que incluyen una secuencia TAG. La secuencia anti-TAG se acopla a la superficie de una microesfera magnética para la detección.
Como se utiliza en la presente, una "sonda" o "sonda OLA" se refiere al polinucleótido capaz de hibridarse selectivamente a una secuencia objetivo de ADN amplificado durante el ensayo de ligación de oligonucleótidos. La sonda OLA de la invención incluye una región común, en el extremo de cebador 3, que puede incluir una etiqueta de tinte; una región especifica de secuencia que reconoce selectivamente la secuencia objetivo y una etiqueta, en el extremo de cebador 5, para el reconocimiento por las secuencias antietiqueta enlazada a las microesferas magnéticas. En ciertos aspectos, las sondas se diseñan para detectar CaCuA, CaCuB,
CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG , CaCuH, CaCuI, CaCuJ,
CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ,
COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC,
GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, AMB, MAMC, AMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD,
PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PA D, PULA, PULB, PULC, PULD,
PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH, GENI,
VPH-16 , VPH -18, VPH-31, VPH- -33, VPH-35, VPH- 39, VPH-45,
VPH-51 , VPH- 52, VPH-56, VPH-5¡ 8, VPH- -59, VPH-66, VPH-6 8 VPH-
73 y/o SEQ ID NOs : 1-82.
Los métodos de ensayo y kits en la presente se pueden llevar a cabo en un sistema de multiplexación para lectura de cuentas magnéticas tal como, por ejemplo, MAGPIXMR (Luminex Corp. Madison, WI) o BioCode 2500 AnalizerMR (Applied BioCode, Inc) .
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit que contiene al menos cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer; cebadores para uno o más genotipos de cepa del virus de papiloma humano (VPH); e instrucciones para el uso. En un aspecto, el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer son CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI; un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) situado dentro del gen para IL10, TGF-βΙ, CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2 , HOXB13, Chr8, MSMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2, BRCA1, ATM, TCF2 , TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4, TNF-α, MDM2 , MLH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2 , SRD5A2, EIF3H y/o MSH6; y/o SEQ ID NOs : 1-67. En otro aspecto, el uno o más genotipos de la cepa VPH VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68 y/o VPH-73. En un aspecto adicional, el kit también contiene sonda para una o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y/o sondas para uno o más genotipos de la cepa.
Ya que varios cambios se podrían hacer en los métodos y composiciones anteriores sin apartarse del alcance de la invención, se propone que toda la materia contenida en la descripción anterior se debe interpretar como ilustrativa y no en un sentido limitante.
Otras Modalidades
La descripción detallada expuesta en lo anterior se proporciona para ayudar a aquellos expertos en la técnica en practicar la presente invención. Sin embargo, la invención descrita y reclamada en la presente no se va a limitar en alcance por las modalidades específicas en la presente descritas debido a que estas modalidades se proponen como ilustración de varios aspectos de la invención. Cualquiera de las modalidades equivalentes se proponen para estar dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior que no se aparte del espíritu o alcance del presente descubrimiento inventivo. Estas modificaciones también se proponen para estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Adicionalmente, en algunas modalidades los métodos pueden incluir adicionalmente un paso de tratamiento. El término "tratamiento" se refiere tanto 1) tratamientos o medidas terapéuticas que curan o desaceleran, reducen los síntomas de, y/o detienen la progresión de unas afecciones o trastornos patológicas diagnosticadas, y 2) y medidas profilácticas/preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento pueden incluir individuos que ya tienen un trastorno médico particular así como aquellos que pueden adquirir finalmente el trastorno (es decir, aquellos que necesitan medidas preventivas) .
"Tratamientos contra el cáncer" o "tratamientos anticáncer" incluyen cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, terapia orientada, inmunoterapia y combinación de las mismas. Los tratamientos anti-cáncer específicos se definen y se administran dependiendo del tipo de cáncer y el estado de la enfermedad. Los tratamientos y combinaciones específicos de cáncer son bien descritos en la técnica.
"Agentes quimioterapéuticos y agentes antineoplásicos" son bien conocidos en la técnica e incluyen: agentes anti- microtúbulos ; agentes anti-metabolitos ; inhibidores de topoisomerasa ; agentes de alquilación; agentes antraciclinas ; y agentes inhibidores de enzimas.
Se presentan a continuación ejemplos que plantean la detección simultánea de la infección por VPH y la genotipificación de los marcadores de susceptibilidad al cáncer contemplados para las aplicaciones planteadas. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente las modalidades de la presente invención, pero no se limitan para limitar el alcance de la invención. Aunque son típicos de aquellos que podrían ser utilizados, otros procedimientos, metodologías, o técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica se pueden utilizar alternativamente.
Ejemplos
Ejemplo 1
Obtención de ADN sin células de una muestra
El ADN sin células se extrajo de una muestra que utiliza solventes orgánicos tal como una mezcla de fenol y cloroformo, seguido por precipitación con etanol. El ADN sin células también se puede obtener utilizando partículas de sílice recibieras con polilisina. Alternativamente, el ADN sin células se puede extraer de la muestra utilizando un kit comercialmente disponible tal como, por ejemplo, minikit de ADN QIAampMR (Qiagen, Germantown, MD) . La muestra de ADN debe tener una alta pureza, es decir superior a 1.6 (260/280 nm) y su funcionalidad debe haber sido corroborada por la amplificación de una muestra de referencia general y con 100 ng de ADN de una reacción de PCR multiplex.
Ejemplo 2
Preparación de la muestra y evaluación de cebadores para detectar SNPs de riesgo CaCu
La muestras de ADN sin células de ADN sintético o aislado de MI, C. lupus familiaris, E. coli y virus de inmunodeficiencia humano (VIH) se obtuvieron y se prepararon para una concentración final de 50 ng/ L. Cada análisis debe incluir un control negativo (agua) , un control positivo - tipo natural (WT) , un control positivo mutante (MT) y un control positivo heterocigoto (HET) .
Preparación de las mezclas de controles sintéticos para tipo natural (WT) y mutante (MT) para la amplificación por PCR de punto final de alto riesgo a CaCu. Las mezclas de ADN WT y MT de control sintético de oligonucleotido para cáncer cervical (CaCu) SNPs CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, y CaCuJ se prepararon a una concentración de 30 μΜ de la concentración de solución madre de 200 μΜ. Una dilución secuencial se llevó a cabo hasta que una concentración final de 0.03 μΜ se alcanzó para cada uno de los controles sintéticos de SNPs A-J CaCu WT y MT.
Preparación de la mezcla de controles sintéticos heterólogos (HET) . Se prepararon controles sintéticos HET al colocar 5 μΐι de la mezcla de controles sintéticos WT en 0.03 μΜ y 5 μL de la mezcla de controles sintéticos MT a 0.03 μΜ del panel CaCu en un tubo de polipropileno de 0.2mL.
Preparación de los oligonucleótidos de sentido (Ll) e inversos (L2 ) . Separadamente, los oligonucleótidos de sentido (Ll) e inverso (L2) se diluyeron a 100 μΜ de CaCu SNPs A-J de la solución madre en una concentración de 200 μΜ.
Preparación de la mezcla de oligonucleótidos y PCR de punto final de Mezcla Maestra. El volumen de cada oligonucleotido de sentido (Ll) e inverso (L2), como se indica en la Tabla 2, se colocaron en un tubo. Al tubo que contiene los oligonucleótidos de sentido e inversos 15 μL de PCR de punto final 2X de Mezcla Maestra (Thermo Scientific) se agregó como se describe en la Tabla 3. La mezcla se homogenizó con una pipeta y el volumen se ajustó para el número de reacciones requeridas por la amplificación por PCR del panel CaCu de 5 muestras, más una reacción extra (como se describe en la Tabla 4) . La Mezcla Maestra se agregó a la mezcla de oligonucleótidos para la amplificación de PCR de punto final para el panel de 8 oligonucleótidos CaCu para el análisis de 5 muestras, más una reacción extra, como se indica en la Tabla 5.
Figure imgf000063_0001
Tabla 2. Volumen de los oligonucleótidos de sentido (Ll) e inversos (L2) requeridos para la mezcla de reacción de PCR del disposición CaCu
Figure imgf000063_0002
Tabla 3. Volumen de la mezcla maestra agregada a la mezcla de oligonucleótidos para la mezcla de reacción de PCR del disposición CaCu.
Marcad Alícu Clnicial CFinal (μ Volumen 1 Volumen 6 rxn or ota (μΜ) M) rxn ^L) (μΐ
CACUA Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2
CACUB Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2 CACUC Ll y 100 0.2 0.04 0.24
L2
CACUD Ll y 100 0.4 0.08 0.48
L2
CACUF Ll y 100 0.2 0.04 0.24
L2
CACUG Ll y 100 0.2 0.04 0.24
L2
CACUH Ll y 100 0.3 0.06 0.36
L2
CACUJ Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2
Volumen Total de Ll y L2 1.12 ]i 6.72 L (3.36
L de Ll y L2)
Volumen de Reacción Final 20 i 120 μL
Tabla 4: Volumen de oligonucleótidos de sentido (Ll) e inversos (L2)
Reacti C C Final Volume Volumen 6
vo Inicial n 1 rxn ^L)
rxn
( L)
Mezcla 2X 1.5X 15 90
maestr
a
Volumen de Reacción 20 L 120 ]i
Final
Tabla 5. Volumen agregado de Mezcla Maestra
Preparación de la mezcla de reacción de PCR. La Tabla 6 indica que el número de muestras de reacción de PCR fue dependiente de la cantidad total de la muestra de ARN que se analizaron. Incluyeron 4 controles por ensayo de PCR del panel de CaCu de 8 oligonucleótidos. Las mezclas de reacción se prepararon en tubos de polipropileno en el siguiente orden: agua, Mezcla maestra + oligonucleótidos (Ll y L2), y ADN de las muestras o de los controles sintéticos. La amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando condiciones estándares. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis . Lo productos de PCR se pueden analizar adicionalmente por tecnología multiplex o secuenciación .
Figure imgf000065_0001
Tabla 6 componentes de cada tubo de reacción de PCR para la amplificación del panel CaCu en ADN tomado de muestras de orina y sangre. *E1 volumen indicado se mide comenzando con una muestra de ADN a 50 ng^L de concentración inicial. En caso de que la muestra presente en una concentración menor, el volumen se debe ajusfar a 100 ng para la reacción de PCR.
Los productos de PCR se evaluaron por electroforesis . Alternativamente, las secuencias objetivo se pueden identificar por qPCR utilizando las sondas SYBRMR Green o TaqManMR etiquetadas con diferentes fluoróforos como se ilustra en las FIGURAS 11 y 12. Para la detección y amplificación de los SNPs asociados con el riesgo de cáncer cervical, se utilizaron 8 pares de oligonucleótidos específicos para cada sitio de interés. Los oligos de inicio flanquearon el sitio de interés en los genes o en las secuencias importantes de la regulación de los genes (es decir IL10, TGF-B1, CYP1A1, ST3GAL4 e IL4) . Los oligos de inicio tuvieron una complementariedad con su secuencia objetivo de 80%, 90% y 100%. Los oligonucleótidos "cebadores" diseñados para los SNPs en riesgo para cáncer cervical tuvieron un intervalo de temperatura de alineación (Tm) entre 62 °C y 64 °C. Los oligonucleótidos "cebadores" para la detección de SNPs de riesgo de cáncer cervical tuvieron un intervalo de concentración entre 0.2 μΜ y 0.5 μΜ (Tabla 7) .
Figure imgf000066_0001
Tabla 7. Condiciones de cebadores de oligonucleótidos, OLA y sonda reportera OLA
Las FIGURAS 1A-1E muestran que los oligonucleótidos
"cebadores" diseñados para la identificación de los SNPs de riesgo para cáncer cervical no tuvieron reactividad cruzada con otro ADN genómico diferente al H. sapiens. Específicamente, la FIGURA 1A muestra la detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando controles sintéticos (CS WT, CS MT y CS HET) . La FIGURA IB muestra la detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando ADN aislado de un control biológico MI. Las FIGURAS 1C-1E muestran que el SNPs A-J de riesgo CaCu no se detectaron en el ADN aislado de C. lupus familiaris, Escherichia coli, o el virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) (p<0.00001) . Las barras representan la Media ± Desviación Estándar 1 de 4 replicados. El valor P representa la diferencia estadísticamente significativa de los valores MFI registrados en cada prueba con respecto a los valores MFI registrados en la gráfica A y en la gráfica B, determinado por la prueba de Kruskal-Wallis (OÍ = 0.05) . PC = 296.08 MFI (n = 60, 95% CI) .
Los productos de PCR se analizaron para determinar la especificidad intra-ensayo de las sondas CaCu para la detección de SNPs A-J de riesgo CaCu. Las FIGURAS 2A-2B ilustran la especificad de intra-ensayo en la detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando el control biológico MI. La FIGURA 2A muestra la detección de los SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando sondas CaCu específicas. La FIGURA 2B muestra la falta de detección de SNPs A-J de riesgo CaCu utilizando sondas específicas para la detección de VPH. Las barras representan la Media ± Desviación Estándar 1 de 4 replicados, el valor de P representa la diferencia estadísticamente significativa entre los valores registrados en la FIGURA 2B con respecto a los valores MFI registrados en la FIGURA 2A, determinado por la prueba de Kruskal-Wallis (a = 0.05), PC = 296.08 MFI (n = 64, 95% CI) .
Como se ilustra en la FIGURA 3, las secuencias objetivo de SNP de susceptibilidad al cáncer que contiene ADN se detectaron en las muestras de sangre y orina. Los resultados de las amplificaciones de PCR de CaCuH mostraron que ambas muestras de orina (U) y sangre (B) , fueron adecuadas para la extracción de ADN y genotipificación de estos marcadores, con los productos de PCR equivalentes a aquellos obtenidos con ya sea un control positivo (WT, marcador de tipo natural), un ADN de control que comprende el marcador mutante (MT) , o ADN extraído de una línea de células que presentó el SNP (CL) .
Estos análisis mostraron que las muestras de sangre y orina fueron adecuadas para la genotipificación de los marcadores de susceptibilidad al cáncer y que la amplificación de ADN combinada con un OLA detectaron los marcadores de susceptibilidad al cáncer en un paciente y de esta manera establecieron si el paciente presenta un riesgo de susceptibilidad de desarrollar el cáncer correspondiente .
Ejemplo 3
Evaluación de la reactividad cruzada de los cebadores para detectar SNPs de riesgo CaP
El análisis de los cebadores para detectar los polimorfismos de riesgo de cáncer de próstata se llevó a cabo similarmente como es describe en el Ejemplo 3. Se utilizaron diez pares de oligonucleótidos "cebadores" específicos para cada sitio de interés. Los oligos de inicio flanquearon el sitio de interés en los genes o en las secuencias importantes de la regulación de los genes (es decir AGTR1, HOXB13, SRD5A2, Chr8, MSMB, RNASEL y CYP19) . El oligo "iniciadores" diseñados para los SNPs de riesgo al cáncer de próstata tuvieron complementariedad con su secuencia objetivo de 80%, 90% y 100%. Los oligonucleótidos "cebadores" para SNPs en riesgo de cáncer de próstata tuvieron un intervalo de temperatura de alineación (Tm) entre 63°C y 65°C. Los oligonucleótidos "cebadores" para SNPs en riego de cáncer de próstata tuvieron un intervalo de concentraciones entre 0.3 μΜ y 0.5 μ (Tabla 8) .
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Tabla 8. Condiciones de oligonucleótidos cebadores, OLA y sonda reportera OLA
Como se ilustra en las FIGURAS 4A-4E, los cebadores utilizados para la detección de SNPs (CaP) A-J de riesgo de cáncer de próstata fueron adecuados para esta detección en los controles sintéticos (FIGURA 4A) y en el ADN aislado de un control biológico (FIGURA 4B) . Sin embargo, no hubo detección de los SNPs de riesgo CaP cuando los cebadores se utilizaron en el ADN aislado de C. lupus familiaris (FIGURA 4C, p<0.0001), E. coli (FIGURA 4D, p<0.0001) o VIH (FIGURA 4E, p<0.0001). Las barras representan la Desviación Estándar Media ± 1 de 4 replicados, el valor P representa la diferencia estadísticamente significativa de los valores MFI y registrados en cada ensayo con respecto a los valores MFI y registrados en la FIGURA 4A y en la FIGURA 4B, PC = 402.90 MFI (n = 80, 95% CI).
Los oligonucleótidos "cebadores" diseñados para la identificación de SNPs de riesgo para cáncer de próstata no reaccionaron de manera cruzada con otro ADN genómico (FIGURAS 4A-4E) .
Como se ilustra en las FIGURAS 5A-5B, los oligonucleótidos "cebadores" diseñados para la identificación de los SNPs de cáncer de próstata no fueron reactivos de manera cruzada con las "sondas reporteras OLA" específicas de VPH (FIGURAS 5A-5B) . La FIGURA 5A muestra la detección de SNPs A-J de riego CaP utilizando sondas CaP específicas. La FIGURA 5B muestra la no detección de los SNPs A-J de riesgo CaP utilizando sondas específicas para la detección de VPH. Las barras representan la Desactivación Estándar Media ± 1 de 4 replicados, el valor de P representa la diferencia estadísticamente significativa entre los valores MFI registrados en la gráfica B con respecto a los valores MFI registrados en la FIGURA 5A, determinado por la prueba Kruskal-Wallis (a = 0.05), PC = 264.35 MFI (n = 80, 95% CI). Ejemplo 4
Preparación de la muestra y evaluación de productos de PCR SNPs de riesgo CaP
La preparación de la muestra de ADN, mezclas de control sintético WT, T, y HET y oligonucleótidos de sentido (Ll) e inverso (L2) de la detección de SNPs de cáncer de próstata (CaP) CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI y CaPJ se prepararon como se describe previamente para los SNPs de riesgo CaCu.
Preparación de la mezcla de oligonucleótidos y Mezcla
Maestra de punto final de PCR. El volumen de cada oligonucleótido de sentido (Ll) e inverso (L2) se colocó en un nuevo tubo de propileno y estéril como se indica en la Tabla 9. Como se ilustra en la Tabla 10, 15 μL de Mezcla Maestra 2X de punto final de PCR (Thermo Scientific) se agregó. Como se describe y como se indica a continuación, 5 muestras se analizaron (1 muestra de ADN y 4 controles; negativo, WT, MT y HET) más una reacción extra (ver Tabla 11) . La mezcla maestra se agregó a la mezcla de oligonucleótido para la amplificación de punto final de PCR del disposición de 10-oligonucleótidos de SNPs CaP como se describe en la Tabla 12.
Marcado Alícuota C inicial (UM) c Volumen 1 rxn (]L) r Final (uM)
CAPE Ll y L2 100 0.3 0.06
CAPH Ll y L2 100 0.3 0.06
CAPJ Ll y L2 100 0.3 0.06
CAPA Ll y L2 100 0.4 0.08
CAPC Ll y L2 100 0.4 0.08
CAPI Ll y L2 100 0.4 0.08
CAPG Ll y L2 100 0.5 0.10
CAPB Ll y L2 100 0.5 0.10
CAPD Ll y L2 100 0.5 0.10
CAPF Ll y L2 100 0.5 0.10 Volumen total de Ll y L2 1.64 L (0.82 L Ll y L2)
Volumen total de la reacción 20 L
Tabla 9. Volumen de oligonucleótidos de sentido (Ll) e inversos (L2) requeridos para la mezcla de reacción de PCR 10-plex del disposición CaP.
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Tabla 10. Volumen de la mezcla maestra agregada a la mezcla de oligonucleótidos para la mezcla de reacción de 10 oligonucleótidos PCR del disposición CaP
Marcad Alicuo C Inicial c Volumen 1 rxn Volumen 6 or ta (uM) Final (UM) ( L) rxn ( L)
CAPE Ll y 100 0.3 0.06 0.36
L2
CAPH Ll y 100 0.3 0.06 0.36
L2
CAPJ Ll y 100 0.3 0.06 0.36
L2
CAPA Ll y 100 0.4 0.08 0.48
L2
CAPC Ll y 100 0.4 0.08 0.48
L2
CAPI Ll y 100 0.4 0.08 0.48
L2
CAPG Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2
CAPB Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2 CAPD Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2
CAPF Ll y 100 0.5 0.10 0.60
L2
Volumen total de Ll y L2 1.64 pL 9.84 μL
(4.92 μΐ, Ll y L2)
Volumen de reacción final 20 pL 120 pL
Tabla 11. Volumen de oligonucleótidos de sentido (Ll) e inversos (L2) requeridos para la amplificación por PCR del panel de 10 oligonucleótidos de CaP de 5 muestras más una reacción extra
Figure imgf000072_0001
Tabla 12 : Volumen de la mezcla maestra
Preparación de la mezcla de reacción de PCR. Los componentes de la reacción de PCR se agregaron en el siguiente orden: agua, Mezcla Maestra + oligonucleótidos (Ll y L2) , y el último, el ADN de las muestras o controles sintéticos (ver Tabla 13) . La PCR se llevó a cabo utilizando condiciones estándares. Los productos de PCR se analizaron por electrof oresis y se pueden analizar adicionalmente por tecnología multiplex o secuenciación .
Tubo de Reacción Cinicial CFÍTB1 Volumen Volumen Volumen de de de H20 Mezcla
Muestra (pL) Maestra+
(pL) Oligonucle ótidos
(pL) Control Negativo 3.36 16.64
Control 0.03 0.003 2 1.36 16.64 Sintético WT u uM
Control 0.03 0.003 2 1.36 16.64 Sintético MT uM uM
Control 0.03 0.003 2 1.36 16.64 Sintético HET uM uM
ADN de muestra 50 100 ng 2* 1.36 16.64 biológica ng/ L
Volumen de reacción final : 20 L
Tabla 13. Los componentes de cada tubo de reacción de PCR para la amplificación del panel de 10 oligonucleotidos de CaP en muestras de ADN de orina y sangre.* El volumen indicado se toma de la muestra de ADN que está en una concentración inicial de 50 ng^L. En el caso que la muestra presente una baja concentración, el volumen se debe ajustar a lOOng para la reacción de PCR.
Como se ilustra en la FIGURA 6, los SNPs de susceptibilidad al cáncer es detectaron en ambas muestras de sangre y orina. Los resultados de las amplificaciones de PCR de CaPG, CaPD y CaPH (marcadores de susceptibilidad al cáncer de próstata) muestran que las muestras tanto de orina (U) como de sangre (B) , fueron adecuadas para la extracción de ADN y de genotipif icación de tales marcadores, con los productos de PCR equivalentes aquellos obtenidos con ya sea un control positivo (WT, marcador de tipo natural) , un ADN de control que comprende el marcador mutante (MT) , o ADN extraído de una línea de células que presentó el SNP (CL) .
Se determinó que las muestras de sangre y orina fueron adecuadas para la genotipif icación de los marcadores de susceptibilidad al cáncer y que la amplificación de ADN combinada con un OLA detectó los marcadores de susceptibilidad al cáncer en un paciente y estableció de esta manera si el paciente presentó riesgo de susceptibilidad a desarrollar el cáncer correspondiente.
Ejemplo 5
Análisis de PCR de virus de papiloma humano de alto riesgo
Los oligonucleótidos "cebadores" para la identificación de los tipos de alto riesgo de VPH no reaccionan de manera cruzada con otro ADN genómico diferente al VPH (FIGURAS 7A-7E) .
La detección y amplificación de cada uno de los tipos de alto riesgo de VPH se determinó al utilizar los oligonucleótidos "cebadores" específicos diseñados para cada tipo de VPH de alto riesgo, que contienen secuencias de nucleótidos complementarios a la región de interés dentro del gen VPH Ll. Los cebadores se diseñaron para amplificar SEQ ID NOs: 67-82. Los oligos de inicio flanquearon la región específica de cada tipo de VPH en el gen Ll. Los oligonucleótidos "cebadores" diseñados para la detección de los 15 tipos de VPH de alto riesgo tuvieron complementariedad con su secuencia objetivo de 80%, 90% y 100%. Los oligonucleótidos "cebador" degenerados se diseñaron para detectar los subtipos de VPH de interés. Los oligonucleótidos "cebadores" para los 15 tipos de VPH tuvieron un intervalo de Temperatura de Alineación (Tm) entre 61 °C y 63°C. Los oligonucleótidos "cebadores" tuvieron un intervalo de concentración entre 0.4 μΜ y 0.6 μΜ (Tabla 14) .
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Tabla 14. Condiciones de oligonucleótido cebadores, OLA y sonda reportera OLA. Como se ilustra en las FIGURAS 7A-7E, los cebadores utilizados para la detección de picos de alto riesgo de VPH fueron adecuados para tal detección en los controles sintéticos (FIGURA 7A) y en el ADN aislado de un control biológico (FIGURA 7B) . Sin embargo, no hubo detección cuando los cebadores se utilizaron en el ADN aislado de C. lupus familiaris (FIGURA 7C, p<0.0001), E. coli (FIGURA 7D, p<0.0001) o VIH (FIGURA 7E, p<0.0001) . Las barras representan la Media ± Desviación Estándar 1 de 4 replicados, el valor P representa la diferencia estadísticamente significativa de los valores MFI registrados en cada prueba con respecto a los valores MFI registrados en los controles sintéticos y en los controles biológicos determinados por la prueba de Kruskal-Wallis (a = 0.05), PC = 359.38 MFI (n = 60, 95% CI) .
Los oligonucleótidos "cebadores" diseñados para la identificación de tipos de alto riesgo de VPH no designaron de manera cruzada con otro ADN genómico (FIGURAS 7A-7E) .
Como se ilustra en las FIGURAS 8A-8C, los oligonucleótidos "cebadores" diseñados para la identificación de los 15 tipos de VPH de alto riesgo no reaccionaron de manera cruzada con las "sondas reporteras OLA" específicas para cáncer cervical (FIGURA 8B) y cáncer de próstata (FIGURA 8C) . Las barras representan la Media ± Desviación Estándar 1 de 4 replicados, el valor de P representan la diferencia estadísticamente significativa entre los valores MFI registrados en la gráfica B con respecto a los valores MFI registrados en la FIGURA 5A, determinado por la prueba de Kruskal-Wallis (a = 0.05), PC = 440.47 MFI (n = 60, 95% CI) .
Para la preparación de la muestra de ADN, las mezclas de los controles de VPH sintéticos (identificaos como A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O), y los oligonucleótidos de sentido (Ll) e inversos (L2) CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI y CaPJ, se prepararon como se describe previamente para los SNPs de riesgo CaCu. De los 200 μΜ de solución madre de los controles VPH sintéticos se preparó una alícuota en una concentración final de 30 μΜ y de esta concentración se hicieron diluciones secuenciales para obtener una concentración final que sería 0.003 μΜ. Para preparar la mezcla de los controles sintéticos utilizados en el sistema multiplex de panel VPH 1 μL de la dilución 0.003 μΜ de cada control sintético se agregó en un tubo para obtener un volumen final de 15 μΐι. La concentración final de la mezcla de controles sintéticos fue 0.0002 μΜ.
Preparación de la mezcla de oligonucleótido y punto final de PCR de Mezcla Maestra. El volumen de cada oligonucleótido de sentido (Ll) e inverso (L2) como se indica en la Tabla 15 se agregó en un tubo. 15 μΐι de punto final PCR 2X Mezcla Maestra (ThermoScientific) se agregó al tubo que contiene los oligonucleótidos de sentido e inversos y se homogenizó.
Preparación de la mezcla de reacción por PCR. Para este caso 4 reacciones y 1 reacción extra se llevaron a cabo, considerando un control negativo, control sintético: es decir una mezcla de secuencia sintética es idéntica a la región parcial de cada uno de los tipos VPH identificados, muestra de ADN de una muestra biológica A y la muestra de ADN de una muestra biológica B. La cantidad necesaria de la mezcla maestra se colocó en un tubo de 0.6 mi estéril, para 5 reacciones (como se detalla en la Tabla 16) . Para llevar a cabo la amplificación por punto final de PCR del panel VPH en el formato 15-Plex, los oligonucleótidos Ll y L2 deben estar disponibles. La Tabla 16 describe las concentraciones y volúmenes para 5 reacciones, como en la Tabla 17. Las mezclas de reacción se prepararon en tubos al agregar los componentes de la reacción de PCR en el siguiente orden: agua, mezcla de Mezcla Maestra + oligonucleótidos (Ll y L2), y finalmente el ADN de las muestras de los controles sintéticos (Tabla 18) . Se lleva a cabo la amplificación por PCR bajo condiciones estándares. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis . Una vez que los productos de interés se habían verificado se procedió al análisis utilizando la plataforma Luminex.
Como se ilustra en las FIGURAS 9A-9B, las secuencias objetivo de VPH ADN viral se detectó por PCR multiplex. Los resultados de la amplificación por PCR de VPHA y VPHB muestran que el ADN extraído de una línea de células conocida por contener el virus correspondiente (CL) fue una muestra adecuada para la detección de la infección por VPH, con los productos de PCR equivalentes a aquellos obtenidos con ya sea un control positivo sintético (C+l) , o indica el ADN viral (C+2) . Al detectar la presencia del ADN viral de una o más de las cepas de VPH probadas en una muestra recolectadas de un paciente, una amplificación de ADN combinada con un OLA detectó la infección por VPH en un paciente y de esta manera estableció si el paciente presentó un riesgo de susceptibilidad al desarrollar el cáncer correspondiente.
Marcador Alícuota C inicial (UM) C Final (uM) Vol. lrxn ( L)
VPHA Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHB Ll y L2 200 0.4 0.04
VPHC Ll y L2 200 0.6 0.06
VPHD Ll y L2 200 0.4 0.04
VPHE Ll y L2 200 0.4 0.04
VPHF Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHG Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHH Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHI Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHJ Ll y L2 200 0.4 0.04
VPHK Ll y L2 200 0.4 0.04 VPHL Ll y L2 200 0.6 0.06
VPHM Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHN Ll y L2 200 0.5 0.05
VPHO Ll y L2 200 0.4 0.04
Volumen Final de Ll y L2 1.42 yL (0.71 pL de
Ll y L2)
Volumen de reacción final 20 uL
Tabla 15. Volumen de los oligonucleotidos de sentido (Ll) e inverso (L2) requeridos para los oligonucleotidos de panel de 15 VPH de amplificación por PCR para una reacción.
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16. Volumen de la Mezcla maestra requerida para 5 reacciones .
Tabla 17. Volumen de oligonucleotidos de sentido (Ll) e inversos (L2) requeridos para la amplificación por PCR de panel de oligonucleotidos de 15 VPH, 1 reacción.
Marcado Alicuot Cinic CFina Vol . lrx Vol. 5rx ( L) r a ial 1 (VL)
(uM (uM
) )
VPHA Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPHB Ll y 200 0.4 0.04 0.2
L2
VPHC Ll y 200 0.6 0.06 0.3
L2
VPHD Ll y 200 0.4 0.04 0.2 L2
VPHE Ll y 200 0.4 0.04 0.2
L2
VPHF Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPHG Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPHH Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPHI Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPHJ Ll y 200 0.4 0.04 0.2
L2
VPHK Ll y 200 0.4 0.04 0.2
L2
VPHL Ll y 200 0.6 0.06 0.3
L2
VPHM Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPH Ll y 200 0.5 0.05 0.25
L2
VPHO Ll y 200 0.4 0.04 0.2
L2
Volumen de Ll y L2 1.42 μL 7.1 pL (3.55 ]iL
(0.71 μL de Ll y L2) de Ll y
L2)
Volumen de reacción final 20 L 100 L
Oligonucleótidos 15 VPH de panel, reacción
Tubo de Cinicial CFinal Volumen Volumen Volumen de
Reacción de de H20 Mezcla Muestra ( L) Maestrat
(pL) oligonucle ótidos
(uL)
Control 3.58 16.42
Negativo
Control 0.0002 0.000 2 1.58 16.42 sintético uM 02 uM
ADN de la 50 100 2* 1.58 16.42 muestra ng/ L ng
biológica A
ADN de la 50 100 2* 1.58 16.42 muestra ng/uL ng
biológica B
Volumen de reacción final: 20 L
Tabla 18. Componentes de cada tubo de reacción de PCR para oligonucleótidos de 15 VPH de amplificación de panel en las muestras de ADN de las muestras biológicas. *E1 volumen indicado se toma de una muestra de ADN que está en una concentración inicial de 50 ng/ L.
Ejemplo 6
Amplificación por PCR de punto final en el formato multiplex de SNPs asociado con el riesgo de cualquier tipo de cáncer .
Las muestras de ADN se prepararon de la misma manera como en los ejemplos previos, sin embargo, para la detección y amplificación de SNP asociado con el riesgo de cualquier tipo de cáncer y de 7 tipos diferentes de cáncer (incluyendo cáncer de mama, próstata, colon, leucemia, pulmón, gástrico y páncreas), 41 pares de oligonucleótidos "cebador" específicos para cada sitio de interés se utilizaron. Los oligos "iniciadores" flanquearon el sitio de interés en los genes o en las secuencias importantes de la regulación de los genes (es decir IL10, TGF-βΙ , CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTRl , ERBB2 , HOXB13, Chr8, MS B, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1 , ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2 , NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8 , BRCA2 , BRCA1, ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDHl, IL1B, IL6, TLR4, TNF-α, MDM2 , MLH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2, SRD5A2, EIF3H y/o MSH6) . Los oligos "iniciadores" para los SNPs de riesgo a cáncer tuvieron complementariedad con su secuencia blanca de 80%, 90% y 100%. Los oligonucleótidos "cebadores" para los SNPs de riesgo de cáncer tuvieron un intervalo de Temperatura de Alineación (Tm) entre 62 °C y 65°C como se describe previamente. Los oligonucleótidos "cebadores" para SNPs en riesgo de cáncer tuvieron un intervalo de concentración entre 0.2 μΜ y 0.5 μΜ.
La FIGURA 10 muestra la identificación de 20 polimorfismos de riesgo de cáncer utilizando los controles sintéticos por la prueba GanPlex MR (Panel A) . La gráfica muestra los valores MFI registrados en cada uno de los polimorfismos de riego de cáncer cuando se utilizaron los controles sintéticos de tipo natural (CS WT) , Mutantes (MT) y Heterocigotos (HET) . La barras representan el Promedio ± 1 D.E. de 2 réplicas.
La FIGURA 11 muestra la identificación de 22 polimorfismos de riesgo de cáncer utilizando controles sintéticos por la prueba GanPlex MR (Panel B) . La gráfica muestra los valores MFI registrados en cada uno de los polimorfismos de riesgo de cáncer cuando se utilizaron los controles sintéticos de tipo natural (CS WT) , Mutantes (MT) y Heterocigotos (HET) . Las barras representan el Promedio ± 1 D.E. de 2 réplicas.
Ejemplo 7
Análisis ola de los productos de PCR
Después de la PCR multiplex, cada muestra se sometió a una reacción OLA, donde una alícuota de producto de PCR se utilizó a través de la reacción OLA.
Para la reacción de ligación. De los productos de PCR obtenidos en los ejemplos previamente descritos se sometió a reacciones de ligación. La mezcla de reacción se llevó a cabo de las alícuotas que estuvieron en una concentración de 10 μΜ con una concentración final de cada 20? O 22?; 3 μΐ de marcadores se agregaron y el volumen se ajustó a 20 L (mezcla de sonda OLA) . La mezcla de sonda OLA se preparó en una concentración final de 5 μΜ en 20 iL . La mezcla OLA- 2X se preparó considerando que cada uno de los componentes debe tener la siguiente concentración final: Solución amortiguadora de ligasa 2X μΜ, Taq ADN ligasa 1 U μΜ, Mezcla de OLA-TAG 0.015 μΜ y Sonda OLA a 0.5 μΜ, en 18 μL . La mezcla OLA 2X debería tener una concentración final de 1 (?) , y la reacción de ligación se llevó a cabo como se describe en la Tabla 19.
Ensayo de hibridación. Después de la reacción de ligación se llevó a cabo una prueba de hibridación utilizando el formato de "distribución TAG" . Las cuenta se asignaron a cada marcador y se volvieron a suspender en una solución amortiguadora IX Tm. Las mezclas de microesferas se prepararon para cada panel (40 esferas) . Siete reacciones por panel se llevaron a cabo: C. -, C. WT, C. MT, C. HT, ADN de saliva, ADN de sangre y fondo, de acuerdo con la tabla 20: las mezclas de microesferas para la hibridación múltiple se prepararon con la siguiente concentración final de cada uno de los siguientes componentes: microesferas WT 1000 microesferas^L, microesfera WT 1000 microesferas^L y solución amortiguadora Tm IX y se mezclaron nuevamente por vórtice durante 30 segundos. Colocar 22.5 μL de la mezcla de microesferas por pocilio en una placa de fondo en V. 2.5 μL de producto enlazado a agua, se agregaron, como sea apropiado. La placa después se cubrió con una película y la hibridación se llevó a cabo en un ciclador térmico, como en la Tabla 20.
Fabricación de microesferas y lectura en el equipo Magpix . Conjugado de estreptavidina, R-Ficoeritrina (SAPE) se preparó en una concentración final de 2 μg / mL en solución amortiguadora Tm IX como se indica en la Tabla 21. Una vez que la hibridación se completó se colocó en la placa de 96 pocilios en la placa magnética. El sobrenadante se removió y se enjuagó dos veces con ΙΟΟμΙ de solución amortiguadora Tm IX. La placa se colocó, la placa de 96 pocilios en la placa de metal negro y 75 μL de la muestra se agregó SAPE a 2 μg/mL a cada pocilio. La placa se incubó durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad y las muestras se analizaron.
Analizar en el equipo agPix, 50 \i de muestra a 37 °C
Figure imgf000083_0001
Tabla 19. Condiciones de termociclado para la reacción de Ligación Multiplex
Figure imgf000083_0002
Tabla 20. Condiciones de termociclado para la hibridación multiplex
Reactivo C. Inicial C . Final V.lrxn V.16 rxn
( g / L) ( g/mL) ( L) (pL)
SAPE 600 2 0.25 4 Solución IX IX 74.75 1,196
Amortiguadora
Tm
Vol. Final 110 1,200
Tabla 21. Preparación de la solución amortiguadora Tm, para la lectura de 7 muestras en duplicado.
Ejemplo 8
Evaluación de la susceptibilidad al cáncer
El riesgo o susceptibilidad al cáncer de un sujeto a desarrollar cáncer se determina por la identificación y detección simultánea tanto de infección por VPH como genotipificación de SNP de susceptibilidad al cáncer.
Para la genotipificación de SNPs de susceptibilidad al cáncer, alelos de tipo natural y mutantes se discriminaron al evaluar la diferencia de fluorescencia en un ensayo de discriminación alélica. Las cuentas coloreadas se utilizaron para llevar a cabo el análisis. Las cuentas incluyeron dos tintes donde A) una longitud de onda de excitación permite la observación de dos longitudes de onda de emisión de fluorescencia separadas, B) producir aproximadamente 100 conjuntos de cuentas únicas, en este caso se utilizaron 50 conjuntos de cuentas diferentes, cada conjunto de cuentas se puede poner en contacto con una molécula de captura de ácido nucleico (antifigura 10-TAG) especifico para un objetivo biológico particular en este caso podría ser SNPs o diferentes tipos de VPH. Este objetivo si se clausura por el ácido nucleico unido a la superficie de las cuentas en marca con SAPE ( Ficoeritrina) si no en la muestra los investigadores no observarán SAPE en ese conjunto de cuentas. La diferencia de cada objetivo se hace por los conjuntos de cuentas. La identificación de cada objetivo se hace por Ficoeritrina (lo mismo en cada objetivo) . fluorescencia para identificar que el objetivo esté en la muestra, el parámetro es 5 veces sobre el fondo para considerar un positivo (mismo en VPH como en SNPs) . Por otra parte, aproximadamente SNPs, los inventores encontrarán siempre un objetivo que signifique que siempre habrá un positivo, podrá ser WT, MT o HT, pero para discriminar y determinar si son WT, MT o HT los inventores usan la llamada alélica, que se calcula por proporciones de fluorescencia. Significa que más del 100% de la fluorescencia si la proporción de la fluorescencia total es de aproximadamente 70% para el objetivo WT y 25% del objetivo MT se establece como una muestra de WT o participante, la misma cosa para el MT. Pero si la proporción es 50/50 ambos objetivos están presentes y se considera como un HT . Las proporciones podrían ser 75/25, 80/20, 90/10 aún 70/30 depende de cada objetivo para los Homocigotos . Para HT podría ser 50/50, o aún 64/40 en algunos casos.
Como se ilustra en la FIGURA 12, utilizando un control de tipo natural sintético (WT) , un control mutante sintético (MT) y un control heterocigoto sintético (WT/MT) , al graficar el porcentaje de fluorescencia asociado con el alelo de tipo natural (WT) en el eje X, la fluorescencia asociada con un alelo mutante (MT) en el eje Y, el ensayo de discriminación alélica permite determinar las áreas de fluorescencia: un área mutante, un área WT y un área heterocigota que discrimina las muestras basadas en el genotipo de SNPs de susceptibilidad al cáncer. Una muestra se considera WT cuando la fluorescencia del tinte asociado con el alelo, está entre 25 y 100% y la fluorescencia del tinte está asociado con el alelo mutante es menor que 25%. Una muestra se considera mutante cuando la fluorescencia del tinte asociado con el alelo WT es menor que 25% y la fluorescencia del tinte asociado con el alelo mutante es entre 25 y 100%. Una muestra se considera heterocigota cuando la fluorescencia del tinte asociado con el alelo WT es entre 25 y 100% y la fluorescencia del tinte asociado con el alelo mutante es entre 25 y 100%. Si tanto la fluorescencia del tinte asociado con el alelo WT como la fluorescencia del tinte asociado con el alelo mutante son menores que 25% la muestra se considera no etiquetada y se puede explotar adicionalmente .
Al utilizar el VPH ADN viral, y graficar el porcentaje de fluorescencia asociado con el VPH ADN, los ensayos permiten determinar un intervalo de fluorescencia que discrimina las muestras basadas en la presencia o ausencia del ADN viral. El intervalo de fluorescencia es diferente en cada análisis VPH, la fluorescencia de fondo es de aproximadamente 200-300 MFI . El intervalo de fluorescencia para discriminar entre positivos al panel VPH es de aproximadamente 1500-7000 MFI.
Al definir las áreas de fluorescencia MT, WT y heterocigotas , y la presencia de VPH ADN en una muestra, el ensayo de discriminación alélica se combina con el ensayo de determinación de infección por VPH que permite determinar si una muestra presenta un polimorfismo de a susceptibilidad al cáncer y/o una infección VPH. La combinación de ambos ensayos de esta manera se utiliza para determinar si un paciente presenta un riesgo o una susceptibilidad de desarrollar el cáncer correspondiente.
Los ejemplos específicos se muestran en las FIGURAS 20A-20V y 21A-21E. Las muestras obtenidas de los sujetos que tienen cáncer de colon y mama. Se obtuvo ADN sin células de las muestras como se describe en lo anterior y el ADN se sometió a amplificación para los genes marcadores de susceptibilidad al cáncer de colon y mama y la detección de los genes marcadores con sondas específicas como se describe previamente. Lo datos se analizaron y los resultados se muestran en las FIGURAS 20A-20V y 21A-21E.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos anteriores, se entenderá que las modificaciones y variaciones son abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención se limita solo por las siguientes reivindicaciones .
NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para evaluar la susceptibilidad al cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende identificar simultáneamente uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y una o más cepas de genotipo de virus de papiloma humano (VPH) , evaluando de esta manera la susceptibilidad al cáncer en el sujeto.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la identificación del uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer comprende:
a) amplificar una muestra de ADN sin células de sujeto utilizando cebadores para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer; y
b) detectar el ADN amplificado.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende amplificar la muestra de ADN sin células utilizando cebadores para el uno o más genotipos de la cepa VPH.
. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer cervical, de próstata, de colon, pancreático, de mama, de pulmón, leucemia y gástrico.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer se selecciona del grupo que consiste de CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) situado dentro del gen que codifica para IL10, TGF-βΙ , CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1 , ERBB2 , HOXB13, Chr8, MSMB, R ASEL, CYP19, ABO, ABLl , ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHX1, CHRNA3 , IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2, BRCAl , ATM, TCF2, TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDH1, IL1B, IL6, TLR4 , TNF-α, MDM2, MLH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2 , SRD5A2, EIF3H y/o MSH6.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs:l-67.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en el uno o más genotipo de la cepa VPH se selecciona del grupo que consiste de VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68 y/o VPH-73.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el uno o más genotipo de la cepa VPH es una cepa de genotipo VPH de alto riesgo.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cepa VPH de alto riesgo es VPH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-45 y/o VPH-58.
11. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los cebadores para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer se diseñan para amplificar CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH, GENI y/o SEQ ID NOs:l-67.
12. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque los cebadores para el uno o más genotipos de la cepa VPH se diseñan para amplificar VPHA, VPHB, VPHC, HPCD, VPHE, VPHF, VPHG, VPHI, VPHJ, VPHK, VPHL, VPH , VPHN, VPHO y/o SEQ ID NOs: 68-82.
13. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la detección del ADN amplificado se lleva a cabo por el ensayo de oligo ligación (OLA) , PCR, qPCR, secuenciación de ADN, fluorescencia, electroforesis en gel, cuentas magnéticas, extensión de cebador especifico de alelo (ASPE) e/o hibridación directa.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el OLA utiliza sondas para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende utilizar sondas para uno o más genotipos de la cepa VPH.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque las sondas se diseñan para enlazarse a SEQ ID NOs: 1-82.
17. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre u orina .
18. Un método, caracterizado porque comprende:
a) amplificar una muestra de ADN sin células de un sujeto utilizando cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer y para uno o más genotipos de la cepa de virus de papiloma humano (VPH) ; y
b) detectar el ADN amplificado.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el uno o más de genes marcadores de susceptibilidad al cáncer es un marcador para cáncer cervical, de próstata, de colon, pancreático, gástrico, de pulmón, leucemia y/o mama.
20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer se selecciona del grupo que consiste de CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, MAMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB , PULC , PULD , PULE , PUL F , PULG , GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI; un polimorfismo de nucleótido individual (SNP) situado dentro del gen que codifica para IL10, TGF-βΙ, CYP1A1, ST3GAL4, IL4, AGTR1, ERBB2, HOXB13, Chr8, MSMB, RNASEL, CYP19, ABO, ABL1, ARID5B, Chrl3, CCKBR, JAK2, NQOl, EGFR, EPHXl, CHRNA3, IRF4, PIK3CA, CXCL8, BRCA2 , BRCAl, ATM, TCF2 , TGFB1, KiSSl, APC, PGR, MTHFR, MUTYH, CDHl, IL1B, IL6, TLR4, TN F- OÍ, MDM2 , MLH1, BRAF, TP53, BCAR1, STK11, KRAS, FGFR2, SRD5A2, EIF3H y/o MSH6; y/o SEQ ID NOs : 1-67.
21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el uno o más genotipos de la cepa VPH se seleccionan del grupo que consiste de VPH-16, VPH- 18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68 y/o VPH-73.'
22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la detección del ADN amplificado se lleva a cabo por el ensayo de oligo ligación (OLA) , PCR, secuenciación de ADN, fluorescencia, electroforesis en gel, cuentas magnéticas, extensión de cebador especifico de alelo (ASPE) e/o hibridación directa.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la PCR es qPCR.
24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre u orina.
25. Un kit, caracterizado porque comprende:
a) cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer;
b) cebadores para uno o más genotipos de la cepa del virus del papiloma humano (VPH) ; y
c) instrucciones para el uso.
26. El kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque los cebadores para uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer se selecciona del grupo que consiste de CaCuA, CaCuB, CaCuC, CaCuD, CaCuE, CaCuF, CaCuG, CaCuH, CaCuI, CaCuJ, CaPA, CaPB, CaPC, CaPD, CaPE, CaPF, CaPG, CaPH, CaPI, CaPJ, COLA, COLB, COLC, COLD, COLE, COLF, COLG, GASA, GASB, GASC, GASD, GASE, GASG, LEUA, LEUB, LEUC, LEUD, LEUE, LEUF, MAMA, AMB, MAMC, MAMD, MAME, MAMF, MAMG, PROA, PROB, PROC, PROD, PROE, PROF, PANA, PANB, PANC, PAND, PULA, PULB, PULC, PULD, PULE, PULF, PULG, GENA, GENB, GEND, GENE, GENG, GENH y/o GENI, y/o SEQ ID NOs : 1- 67.
27. El kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque los cebadores para uno o más genotipos de la cepa VPH se selecciona del grupo que consiste de VPH- 16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68 y/o VPH-73.
28. El kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque comprende sondas para el uno o más genes marcadores de susceptibilidad al cáncer.
29. El kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque comprende utilizar sondas para el uno o más genotipos de la cepa VPH.
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