WO2019045090A1 - インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法 - Google Patents

インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method of producing influenza HA split vaccine.
  • hemagglutinin The current influenza hemagglutinin (hereinafter, hemagglutinin may be described as "HA”) vaccine exerts a protective effect against infection by inducing HA antibody.
  • the HA antibody binds to a portion exposed to the outside from the viral membrane, which is called a head region, and this portion is the region rich in structural change among virus strains. As a result, there are cases where the HA antibody can not bind and the vaccine does not respond to antigen mutation virus infection different from the vaccine strain.
  • Patent Document 1 In order to efficiently induce a stem antibody, an HA stem protein successfully stabilized with an unstable stem portion has been developed by coupling artificial mutations and a linker, and human clinical trials have been conducted.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for producing an influenza HA split vaccine, which produces an antibody that binds to the HA stem region of influenza which is resistant to antigen mutation.
  • the method for producing an HA split vaccine according to the present invention is also directed to an antigen-mutated influenza virus that produces an antibody that binds to LAH (long alpha helix) in the HA stem region by subjecting the influenza HA split vaccine to an acid treatment. It is a method of producing an effective influenza HA split vaccine.
  • the present invention relates to the following.
  • [Item 1] A method for producing an influenza HA split vaccine, which comprises producing an antibody that binds to LAH in the HA stem region by subjecting the influenza HA split vaccine to acidic treatment.
  • [Section 2] Item 2. The method according to Item 1, wherein the influenza HA split vaccine is also effective against an antigen-mutated influenza virus.
  • [Section 3] A method for producing an influenza HA split vaccine against an antigen-mutated influenza virus, which comprises producing an antibody that binds to LAH in the HA stem region by subjecting the influenza HA split vaccine to acidic treatment.
  • [Section 4] The method for producing an influenza HA split vaccine according to any one of claims 1 to 3, wherein the acid treatment is carried out at a pH of 4.4 to 5.8.
  • [Section 5] The method for producing an influenza HA split vaccine according to any one of claims 1 to 4, wherein the influenza HA split vaccine is of H3N2 type or H1N1 type.
  • [Section 6] Influenza HA split vaccine that produces antibodies that bind to LAH in the HA stem region.
  • [Section 7] The influenza HA split vaccine according to Item 6, wherein the influenza HA split vaccine is also effective against an antigen-mutated influenza virus.
  • influenza HA split vaccine according to item 6 or 7, wherein the influenza HA split vaccine is in a form in which the HA stem region is exposed to the outside.
  • the influenza HA split vaccine By exposing the HA stem region of the influenza HA split vaccine antigen to an externally exposed form, the antigenicity of LAH in the HA stem region is enhanced, and an antibody that binds to LAH in the HA stem region can be produced.
  • Item 9. The influenza HA split vaccine according to any one of Items 6 to 8.
  • Influenza HA split vaccine produced by acid treatment of influenza HA split vaccine, producing an antibody that binds to LAH of HA stem region.
  • An influenza HA split vaccine which is also effective against an antigen-mutated influenza virus, which produces an antibody that binds to LAH in the HA stem region, which is produced by acid treatment of the influenza HA split vaccine.
  • an influenza HA split vaccine can be obtained by a simple procedure that produces an antibody that binds to the HA stem region of influenza that is resistant to antigenic mutation. Therefore, an effective influenza HA split vaccine can be obtained against antigen-mutated influenza virus.
  • FIG. 6 shows the increase in LAH antibody titer in the serum of mice inoculated with a membrane-fused HA split vaccine of H3N2 type. It is a figure which shows the improvement of the cross protection ability with respect to the antigen mutant of the mouse
  • FIG. 6 shows the increase in LAH antibody titer in the serum of mice inoculated with a membrane-fused HA split vaccine of H1N1 type. It is a figure which shows the improvement of the cross protection ability with respect to the antigen mutant strain of the mouse
  • FIG. 6 shows that LAH-binding monoclonal antibodies bind more strongly to membrane fusion HA split vaccines than current HA split vaccines.
  • the method for producing the influenza HA split vaccine according to the present embodiment includes the step of acidifying the influenza HA split vaccine.
  • Influenza HA split vaccine is a whole particle vaccine treated with ether to remove pyrogenic lipid components, and the HA protein on the surface of virus particles necessary for immunization is recovered by density gradient centrifugation. HA protein is the main component for production.
  • influenza A virus On the surface of influenza virus, a glycoprotein called spike protein protrudes (Fig. 1).
  • the influenza A virus has two spike proteins, HA and NA (neuraminidase), which play a role in causing the virus to cause infection.
  • HA binds to the cells to be infected and plays the role of taking the virus into the cells.
  • HA frequently mutates the antigen.
  • NA has the role of breaking the binding of HA to infected cells and releasing the replicated virus from the cells.
  • the HA of influenza A virus is divided into two parts, the globular region and the stem region ( Figure 1).
  • the bulb region contains the receptor binding site for the virus to bind to the target cell.
  • the stem region also contains the fusion peptide sequence necessary for membrane fusion of the viral membrane and the cell membrane of the target cell.
  • the acidic treatment of the influenza HA split vaccine changes the HA protein into a structure called membrane fusion.
  • the stem region is exposed to the outside from the viral membrane instead of the spherical region, accompanied by a large structural change of the antigen stem three-dimensional structure.
  • the present inventors have found, as a new finding in vivo, that an antibody that binds to LAH in the stem region is induced when membrane-fused HA is used as a vaccine, and that this antibody has a protective effect against an antigen-mutated virus strain.
  • the present invention was completed based on such facts.
  • the acid treatment is not particularly limited, but the pH is, for example, 3.0 to 6.5, preferably 4.0 to 6.0, and more preferably 4.4 to 5.8.
  • the acid used to perform the acid treatment is not particularly limited, and for example, phosphoric acid, citric acid, maleic acid and the like can be used.
  • influenza HA split vaccine of the present invention It is possible to target subtypes.
  • the method for producing an influenza HA split vaccine according to the present invention not only type A vaccine but also type B vaccine having HA can be produced.
  • influenza HA split vaccine obtained by the production method according to the present invention produces an antibody that binds to LAH with less mutation, it is possible to use influenza virus known as an antigen mutant within the same HA subtype. Cross protection may also be possible. Furthermore, cross-reactivity can be exhibited between HA subtypes (eg, H3 and H7 types) in which the amino acid sequences of LAH are similar.
  • the influenza HA split vaccine obtained by the production method according to the present invention preferably binds to the LAH-binding monoclonal antibody more strongly than the current HA split vaccine.
  • the binding to the LAH-binding monoclonal antibody be 1.05 times or more, preferably 1.1 times or more, more preferably 1.5 times or more, still more preferably 2 times or more stronger than the current HA split vaccine.
  • binding 1.05 times, 1.1 times, 1.5 times, or 2 times or more stronger than the current HA split vaccine means that, for example, the reciprocal of the antibody concentration when the absorbance determined by regression shows 0.7 is the current HA split.
  • the binding of the influenza HA split vaccine of the present invention to the LAH-binding monoclonal antibody of the present invention as compared to the current HA split vaccine is preferably high, and the upper limit is not particularly limited, for example, 1.05 to 200 times, 1.1 to 150 times The range of 1.5 to 100 times and 2 to 50 times is exemplified.
  • the binding range of the influenza HA split vaccine of the present invention to the LAH-binding monoclonal antibody in comparison with the current HA split vaccine is lower than the lower limit selected from 1.05, 1.1, 1.5, 2, 3, 4 and 5 , 150, 100, 50, 30, and 20 in combination with the upper limit value.
  • the method of measuring the binding ability of influenza HA split vaccine to a LAH-binding monoclonal antibody is not particularly limited, and can be performed by a general method known to those skilled in the art, but can be measured according to the method of the present example. .
  • the LAH-binding monoclonal antibody means a monoclonal antibody that binds to LAH, and the method for producing it is not particularly limited, and it can be produced by a general method known to those skilled in the art.
  • the LAH binding monoclonal antibody can bind to a peptide corresponding to at least a part of the LAH of influenza virus from which the influenza HA split vaccine is derived It means that it is a thing.
  • the current HA split vaccine means an entire particle vaccine treated with ether to remove a lipid component which becomes a pyrogen, and can be produced, for example, by the method of the present Example 1.
  • the current HA split vaccine can be an influenza HA split vaccine manufactured without acid treatment, to the influenza HA split vaccine of the present invention manufactured by the method having the following steps of acid treatment.
  • the method for producing the influenza HA split vaccine according to the present invention can include the step of including an adjuvant.
  • the adjuvant is not particularly limited, and, for example, aluminum salts such as aluminum hydroxide and aluminum phosphate, chitosan, oligodeoxynucleotides, oil-in-water emulsions and the like can be used.
  • aluminum hydroxide and the use of aluminum hydroxide as an adjuvant can enhance immunogenicity.
  • the influenza HA split vaccine obtained by the production method according to the present invention can be used, for example, to be boosted after a predetermined period of time after the initial inoculation.
  • the period until primary vaccination after primary vaccination is not particularly limited, and is, for example, 20 days to 3 years, preferably March to 2 years, and more preferably June to 1 year. It is.
  • the amount of the primary vaccination and the booster influenza HA split vaccine is not particularly limited, and is, for example, 1 ⁇ g to 200 ⁇ g, preferably 10 ⁇ g to 30 ⁇ g, more preferably 15 ⁇ g per dose.
  • One dose is, for example, 0.5 mL.
  • the administration method is not particularly limited.
  • intranasal, subcutaneous, intradermal, transdermal, intraocular, mucous membrane, or oral administration is preferable, preferably intramuscular administration. is there.
  • the influenza HA split vaccine obtained by the production method according to the present invention has a protective effect on an antigen mutant virus strain.
  • H3N2 influenza virus particles A / Fujian / 411/02 (H3N2)
  • H3N2 H3N2 influenza virus particles
  • a / Fujian / 411/02 (H3N2) H3N2 influenza virus particles
  • H1N1 influenza virus particles A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1)
  • H1N1N1 influenza virus particles A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1)
  • H1N1N1 influenza virus particles A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1)
  • H1N1N1 influenza virus particles A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1)
  • H1N1N1 A / Narita / 1/09
  • H1N1N1 A / Beijing / 262/95
  • H1N1N1 A / Brazil / 11/78
  • H1N1N1N1 A / Chile / 1/83
  • H1N1N1N1 A / New Jersey / 8/76
  • H1N1N1N1 A / Taiwan / 1/86 (H1N1)
  • Yamagata / 32/89 (H1N1) A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Solomon Islands
  • HA split vaccine The final concentration is 0.2% in H3N2 influenza virus particles (X31 strain) or H1N1 influenza virus particles (A / Puerto Rico / 8/34 strain) suspended in phosphate buffered saline. The mixture was suspended by adding Tween 80. Diethyl ether was added to further suspend, and the mixture was allowed to stand until the aqueous layer and the diethyl ether layer were completely separated, and then the diethyl ether layer was removed. After repeating this ether extraction, the diethyl ether remaining in the collected aqueous layer was distilled off under normal pressure to obtain an HA split vaccine.
  • H3N2 current HA split vaccine or membrane fusion HA split vaccine 10 ⁇ g vaccine + 20 ⁇ g AddaVax adjuvant (InvivoGen) was dissolved in phosphate buffered saline to make a volume of 200 ⁇ l) intraperitoneally.
  • a membrane fusion HA vaccine in which only 10 ⁇ g vaccine is dissolved in phosphate buffered saline to make a volume of 200 ⁇ l was intraperitoneally inoculated. From 14 days after the booster vaccination, blood was collected from the vaccinated mice, and serum was collected.
  • a synthetic peptide (H3; Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNALELLEN QHTIDLTD SEMNKLFEKTRR QRENADKDDDDKC) (SEQ ID NO: 1) corresponding to a part (long alpha helix) of the stem portion is dissolved in phosphate buffered saline (pH 7.3) at 10 ⁇ g / ml, 100 ⁇ l of each was added to the 96-well plate. After standing overnight at 4 ° C., each well was washed 3 times with phosphate buffered saline, and 150 ⁇ l each of phosphate buffered saline containing 1% bovine serum albumin was added.
  • mice serum is serially diluted with phosphate buffer containing 0.05% and 1% bovine serum albumin, and Tween 20, and concentration 100 ⁇ l of known standard monoclonal antibody (H3; clone name V15-5) was added to each well.
  • each well is washed 3 times with phosphate buffered saline (containing 0.05% Tween 20), and phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20 and 1% bovine serum albumin 100 ⁇ l of diluted peroxidase labeled anti-mouse IgG antibody (Southern Biotech) was added to each well.
  • the LAH antibody titer in the serum of BALB / c mice inoculated intraperitoneally with the membrane-fused HA split vaccine was the same as that in the serum of BALB / c mice inoculated intraperitoneally with the current HA split vaccine. It was significantly higher than the antibody titer.
  • H3N type 2 influenza virus (A / Guizhou / 54/89) which is different from the vaccine strain in antigenicity is applied to 5 mice lethal dose 50 (50% of the amount of virus that causes lethal infection in 50% of mice) Virus infection was performed by nasal administration under anesthesia under
  • mice were weighed and observed daily for 21 days after the virus infection, and the changes in weight and survival rates were examined. If mice with 25% weight loss were found, they were euthanized.
  • H1N1 influenza virus particles C57BL / 6 mice ( ⁇ , 6-12 weeks old), H1N1 type current HA split vaccine or membrane fusion type HA split vaccine (10 ⁇ g vaccine + 10 ⁇ g CpG-ODN 1760 was suspended in phosphate buffered saline and mixed with an equal volume of Freund's incomplete adjuvant (ROCKLAND) to make a volume of 200 ⁇ l) intraperitoneally inoculated.
  • ROCKLAND Freund's incomplete adjuvant
  • membrane-fused HA split vaccine (as in the first vaccination, 10 ⁇ g vaccine + 10 ⁇ g CpG-ODN are suspended in phosphate buffered saline, and an equal amount of Freund's incomplete adjuvant (ROCKLAND) Mixed to make a volume of 200 ⁇ l). From 14 days after the booster vaccination, blood was collected from the vaccinated mice, and serum was collected.
  • ROCKLAND Freund's incomplete adjuvant
  • a synthetic peptide (H1; Ac-RIENLNKKVDDVGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNV KNLYEKVRSQLKNNADKDDDDKC) (SEQ ID NO: 2) corresponding to a part of the stem portion (long alpha helix) was used, except that a standard monoclonal antibody (H1; clone name F2) of known concentration was used. The same method as above was used.
  • the LAH antibody titer in the serum of C57BL / 6 mice intraperitoneally inoculated with membrane-fused HA split vaccine is the same as that in the serum of C57BL / 6 mice inoculated intraperitoneally with the current HA split vaccine. It was significantly higher than the antibody titer.
  • H1N1 influenza virus (A / Narita / 1/09), which is different from the vaccine strain in antigenicity, is added to 5 mice lethal dose 50 (50% of the amount of virus that causes lethal infection in 50% of mice) Virus infection was performed by nasal administration under anesthesia under
  • mice were observed daily for 20 days after virus infection to examine their survival rates. As shown in FIG. 5, in C57BL / 6 mice vaccinated with the membrane fusion type HA split vaccine, the decrease in survival rate was significantly suppressed from the 9th day after infection with another H1N1 influenza virus of different antigenicity.
  • each well was washed 3 times with phosphate buffered saline, and 150 ⁇ l each of phosphate buffered saline containing 1% bovine serum albumin was added. After standing for 2 hours at room temperature, each well is washed 3 times with phosphate buffered saline (containing 0.05% Tween 20), and LAH binding ability is serially diluted with phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin 50 ⁇ l of each monoclonal antibody was added.
  • each well is washed 3 times with phosphate buffered saline (containing 0.05% Tween 20), and phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20 and 1% bovine serum albumin 100 ⁇ l of peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Southern Biotech) diluted at step 1 was added to each well.
  • phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20
  • bovine serum albumin 100 ⁇ l of peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Southern Biotech) diluted at step 1 was added to each well.
  • the LAH binding monoclonal antibody bound 1.05 to 21 times more strongly to the membrane fusion HA split vaccine than the current HA split vaccine.

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Abstract

抗原変異を起こしにくいインフルエンザのHA幹領域に結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法を提供する。インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施す。酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生するインフルエンザHAスプリットワクチンが得られる。このインフルエンザHAスプリットワクチンは抗原性の異なる別のインフルエンザウイルス感染に対して優れた防御能を有する。

Description

インフルエンザＨＡスプリットワクチンの製造方法
　本発明は、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法に関する。
　現行のインフルエンザヘマグルチニン（以下、ヘマグルチニンを「HA」と記載することがある。）ワクチンは、HA抗体を誘導することで感染防御効果を発揮する。HA抗体は、球状部領域（head region）と呼ばれるウイルス膜から外側に露出した部分に結合するが、この部分はウイルス株間で最も構造変化に富む領域となる。その結果、ワクチン株と異なる抗原変異ウイルス感染に対して、HA抗体が結合できずワクチンが奏功しないケースがある。
　近年、抗原変異を起こしにくい幹領域（stem region）に結合する抗体の中に、感染防御抗体が含まれることが明らかにされた(特許文献１)。ステム抗体を効率的に誘導するため、人工的な変異やリンカーを結合させることで、不安定なステム部分の安定化に成功したHAステムタンパクが開発され、ヒト臨床試験が実施されている。
　しかし、実用化に向けた製造面での課題も残されており、より簡便にステム抗体を誘導可能なHAワクチン抗原の開発が期待されている。
特表２０１６－５１６０９０号公報
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、抗原変異を起こしにくいインフルエンザのHA幹領域に結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかるHAスプリットワクチンの製造方法は、インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAH(long alpha helix)に結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法である。
　すなわち、本発明は、以下のものに関する。
［項１］
　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項２］
　該インフルエンザHAスプリットワクチンが、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効である、項１に記載の製造方法。
［項３］
　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対するインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項４］
　前記酸性処理はpH4.4～5.8にて処理を行うことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項５］
　前記インフルエンザHAスプリットワクチンはH3N2型又はH1N1型であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項６］
　HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチン。
［項７］
　該インフルエンザHAスプリットワクチンが、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効である、項６に記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
［項８］
　該インフルエンザHAスプリットワクチンが、ＨＡ幹領域が外部に露出した形状である、項６または７に記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
［項９］
　インフルエンザＨＡスプリットワクチン抗原のＨＡ幹領域が外部に露出した形状であることにより、ＨＡ幹領域のＬＡＨの抗原性が高められており、かつ、ＨＡ幹領域のＬＡＨに結合する抗体を産生することができる、項６～８のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
［項１０］
　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチン。
［項１１］
　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチン。
　本発明によれば、簡易な手法により、抗原変異を起こしにくいインフルエンザのHA幹領域に結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンが得られる。そのため抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチンが得られる。
インフルエンザウイルスを説明する模式図である。 H3N2型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの血清中のLAH抗体価の上昇を示す図である。 H3N2型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの抗原変異株に対する交差防御能の向上を示す図である。 H1N1型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの血清中のLAH抗体価の上昇を示す図である。 H1N1型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの抗原変異株に対する交差防御能の向上を示す図である。 LAH結合性モノクローナル抗体が、現行HAスプリットワクチンよりも膜融合型HAスプリットワクチンに対して強く結合することを示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかるインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法では、インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施す工程を有する。
　インフルエンザHAスプリットワクチンは、エーテルで全粒子ワクチンを処理して発熱物質となる脂質成分を除いたものであり、また、免疫に必要なウイルス粒子表面のHA蛋白を密度勾配遠沈法により回収して製造するためHA蛋白が主成分となっている。
　インフルエンザウイルスの表面には、スパイクタンパクという糖タンパク質が突き出ている(図１)。Ａ型インフルエンザウイルスには、HAとNA(ノイラミニダーゼ)の二種類のスパイクタンパクがあり、ウイルスが感染を起こすための役割を果たす。HAは感染しようとする細胞に結合し、ウイルスを細胞の中に取り込む役割をする。HAは頻繁に抗原変異を起こす。NAは、感染した細胞とHAの結合を切って、複製されたウイルスを細胞から放出させる役割を持つ。
　インフルエンザＡ型ウイルスのHAは、球状部領域と幹領域の２つに分けられる(図１)。球状部領域は、ウイルスが標的細胞に結合するためのレセプター結合部位を含んでいる。また幹領域は、ウイルス膜と標的細胞の細胞膜との膜融合に必要な融合ペプチド配列を含んでいる。
　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HAタンパクは膜融合型と呼ばれる構造に変化する。膜融合型HAタンパクでは、抗原ステム立体構造の大きな構造変化を伴いながら、球状部領域に代わり幹領域がウイルス膜から外部に露出した形状となる。本発明者は、膜融合型HAをワクチンとして使用したとき、幹領域のLAHに結合する抗体が誘導され、この抗体が抗原変異ウイルス株への防御効果を有することをin vivoで新知見として見出し、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。
　酸性処理は、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ3.0～6.5、好ましくは4.0～6.0、更に好ましくは4.4～5.8である。酸性処理を施すために使用される酸は、特に限定されるものではないが、例えばリン酸、クエン酸、マレイン酸等を使用することが可能である。
　抗原性の違いからＡ型インフルエンザウイルスのHAは18の亜型(Ｈ１～Ｈ１８)に、NAは９の亜型(Ｎ１～Ｎ９)に分けられるが、本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンはこれら全ての亜型を対象とすることが可能である。また本発明にかかるインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法ではＡ型のみならず、ＨＡを有するＢ型のワクチンも製造可能である。
　本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、変異の少ないLAHに結合する抗体を産生することから、同一のHAの亜型内であれば、抗原変異株として知られるインフルエンザウイルスに対しても交差防御が可能であり得る。さらに、LAHのアミノ酸配列が類似しているHA亜型間（例えば、H3型とH7型）では交差反応性を示しうる。
　本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、LAH結合性モノクローナル抗体に対して、現行HAスプリットワクチンよりも強く結合することが好ましい。例えば、LAH結合性モノクローナル抗体に対して、現行HAスプリットワクチンよりも1.05倍以上、好ましくは1.1倍以上、より好ましくは1.5倍以上、更に好ましくは2倍以上強く結合することが好ましい。ここで、現行HAスプリットワクチンよりも1.05倍、1.1倍、1.5倍、または2倍以上強く結合するとは、例えば、回帰によって求めた吸光度が0.7を示した時の抗体濃度の逆数が、現行HAスプリットワクチンの抗体濃度の逆数の、それぞれ1.05倍、1.1倍、1.5倍、または2倍以上であることをいう。現行HAスプリットワクチンと比較した本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンのLAH結合性モノクローナル抗体に対する結合性は高い方が好ましく、上限は特に限定されるものではないが、例えば1.05～200倍、1.1～150倍、1.5～100倍、2～50倍の範囲が例示される。あるいは現行HAスプリットワクチンと比較した本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンのLAH結合性モノクローナル抗体に対する結合性の範囲は、1.05、1.1、1.5、2、3、4、および5から選択される下限値と200、150、100、50、30、および20から選択される上限値との組合せにより示されうる。LAH結合性モノクローナル抗体に対するインフルエンザHAスプリットワクチンの結合性の測定方法は特に限定されず、当業者に知られる一般的な方法で行うことができるが、例えば本願実施例の方法に従って測定することができる。
　本願において、LAH結合性モノクローナル抗体とは、LAHに結合するモノクローナル抗体を意味し、その製造方法は特に限定されず、当業者に知られる一般的な方法により製造することができる。LAH結合性モノクローナル抗体に対するインフルエンザHAスプリットワクチンの結合性の測定においては、LAH結合性モノクローナル抗体は当該インフルエンザHAスプリットワクチンが由来するインフルエンザウイルスのLAHの少なくとも一部に相当するペプチドに結合することができるものであることを意味する。
　本願において、現行HAスプリットワクチンとは、エーテルで全粒子ワクチンを処理して発熱物質となる脂質成分を除いたものを意味し、例えば本願実施例１の方法により製造することができる。また、現行HAスプリットワクチンは、以下の酸性処理を施す工程を有する方法により製造された本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンに対して、酸性処理を施さずに製造されたインフルエンザHAスプリットワクチンであり得る。
　本発明にかかるインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法では、アジュバントを包含させる工程を有することが可能である。アジュバントとしては、特に限定されるものではないが、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、キトサン、オリゴデオキシヌクレオチド、水中油型エマルジョン等を用いることが可能である。好ましくは水酸化アルミニウムであり、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いることにより、免疫原性を高めることができる。
　本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、例えば、初回接種の後、所定期間の経過後に追加接種するように使用されることが可能である。初回接種の後、追加接種されるまでの期間は、特に限定されるものではないが、例えば20日～３年であり、好ましくは３月～２年であり、より好ましくは６月～１年である。初回接種及び追加接種のインフルエンザHAスプリットワクチンの量は、特に限定されるものではないが、１用量あたり例えば１μｇ～２００μｇであり、好ましくは１０μｇ～３０μｇであり、より好ましくは１５μｇである。１用量は例えば０．５ｍＬである。初回接種及び追加接種では、投与方法は特に限定されるものではないが、例えば経鼻、皮下、皮内、経皮、眼内、粘膜、又は、経口投与であり、好ましくは、筋肉内投与である。
　本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、抗原変異ウイルス株への防御効果を有する。例えば、H3N2型インフルエンザウイルス粒子(A/Fujian/411/02(H3N2))から現行HAスプリットワクチンを調整し、酸性処理を施した場合、A/Fujian/411/02(H3N2)のみならず、例えば、A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/OMS/5389/88(H3N2)、A/Beijing/32/92(H3N2)、A/England/427/88(H3N2)、A/Johannesburg/33/94(H3N2)、A/Leningrad/360/86(H3N2)、A/Mississippi/1/85(H3N2)、A/Philippines/2/82(H3N2)、A/Shangdong/9/93(H3N2)、A/Shanghai/16/89(H3N2)、A/Shanghai/24/90(H3N2)、A/Sichuan/2/87(H3N2)、A/Kitakyushyu/159/93(H3N2)、A/Akita/1/94(H3N2)、A/Panama/2007/99(H3N2)、A/Wyoming/03/03(H3N2)、A/New York/55/2004(H3N2)又はA/Hiroshima/52/2005(H3N2)等に対しても感染防御効果を有しうる。また例えばH1N1型インフルエンザウイルス粒子(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))から現行HAスプリットワクチンを調整し、酸性処理を施した場合、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)のみならず、例えば、A/Narita/1/09（H1N1）、A/Beijing/262/95（H1N1）、A/Brazil/11/78（H1N1）、A/Chile/1/83（H1N1）、A/New Jersey/8/76（H1N1）、A/Taiwan/1/86（H1N1）、A/Yamagata/32/89（H1N1）、A/New Caledonia/20/99（H1N1）、A/Solomon Islands/3/2006（H1N1）、A/Brisbane/59/2007（H1N1）又はA/Mexico/4108/2009（H1N1）等に対しても感染防御効果を有しうる。
　1.HAスプリットワクチンの調整
　リン酸緩衝生理食塩水に懸濁したH3N2型インフルエンザウイルス粒子（X31株）もしくはH1N1型インフルエンザウイルス粒子（A/Puerto Rico/8/34株）に、最終濃度が0.2%になるようTween80を添加し懸濁した。ジエチルエーテルを加えさらに懸濁し、水層とジエチルエーテル層が完全に分離するまで静置した後、ジエチルエーテル層を取り除いた。このエーテル抽出を繰り返した後、回収した水層に残存するジエチルエーテルを常圧で留去し、HAスプリットワクチンとした。
　2.酸性処理
　HAスプリットワクチンをリン酸緩衝生理食塩水で懸濁後、酸性処理として0.15Mクエン酸緩衝液（pH 3.5）を添加しpHを5.0にした。室温で30分静置した後、1M Tris緩衝液 (pH8.0)を加えて、pHを7.3に戻した。その後、遠心分離を行い、膜融合型HAスプリットワクチンとした。作製した膜融合型HAスプリットワクチンに、最終濃度0.05%になるようホルマリンを加えて数日静置した。
　なお、現行HAスプリットワクチンの場合は、1.で調整したHAスプリットワクチンに対して酸性処理を施さない以外は上記と同様の処理を行った。
　3.ELISA法によるLAH抗体価の測定
　3-1.H3N2型インフルエンザワクチンの接種
　BALB/cマウス（♀、6～12週令）に、H3N2型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチン（10 μgワクチン + 20 μg AddaVaxアジュバント（InvivoGen）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、液量200 μlにする）を腹腔内接種した。初回ワクチン接種28日後に、膜融合型HAワクチン（10 μgワクチンのみをリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、液量200 μlにする）を腹腔内接種した。追加ワクチン接種から14日後以降に、ワクチンを接種したマウスより採血を行い、血清を回収した。
　3-2.ELISA法による測定
　下記に示す手法により、ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)にて、H3N2型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したBALB/cマウスの血清中のLAH抗体濃度を測定した。
　即ち、ステム部分の一部（long alpha helix）に相当する合成ペプチド（H3; Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC）（配列番号１）を10 μg/mlにてリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.3）に溶解し、96ウェルプレートに100 μlずつ添加した。4℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を150 μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、Tween20を0.05%と1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて段階希釈したマウス血清と、濃度既知の標準モノクローナル抗体（H3; クローン名V15-5）を各ウェルに100 μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、0.05%Tween20と1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（Southern Biotech）を各ウェルに100 μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、基質としてクエン酸緩衝液（pH 5.0） 60 mlにo-phenylendiamine tablet (シグマ) 30 mgと24 μlの30%過酸化水素水(30%w/w; シグマ)を加えたものを調整し、それを各ウェルに100 μlずつ添加した。発色後50 μlの2N硫酸(和光純薬工業)で反応を止め、Microplate Reader 450型(Biorad)を用いて490 nmの吸光値を測定した。
　図２に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したBALB/cマウスの血清中のLAH抗体価は、現行HAスプリットワクチンを腹腔内接種したBALB/cマウスの血清中のLAH抗体価よりも、有意に上昇していた。
　4.抗原変異株に対する交差防御
　H3N2型ウイルス感染防御実験では、ワクチン非接種マウス、又は、H3N2型の現行HAスプリットワクチン若しくは膜融合型HAスプリットワクチン接種後のマウスより回収した血清を、BALB/cマウス（♀、6～12週令）に200 μlずつ腹腔内投与した。
　血清投与から3時間後、ワクチン株とは抗原性の異なる別のH3N2型インフルエンザウイルス (A/Guizhou/54/89)を5マウスlethal dose50 (50%のマウスに致死性感染をおこすウイルス量の5倍)にて麻酔下において経鼻投与することでウイルス感染を行った。
　ウイルス感染から21日間、毎日マウスの体重測定及び観察を行い、体重の推移と生存率を調べた。25%の体重減少が認められたマウスが生じた場合は、安楽殺処分とした。
　図３に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを接種したBALB/cマウスでは、抗原性の異なる別のH3N2型インフルエンザウイルス感染後９日目から有意に生存率低下を抑制できた。
　5.ELISA法によるLAH抗体価の測定
　5-1.H1N1型インフルエンザウイルス粒子
　C57BL/6マウス（♀、6～12週令）に、H1N1型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチン（10 μgワクチン + 10 μg CpG-ODN1760をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、等量のFreund’s incomplete adjuvant (ROCKLAND) と混合して液量200 μlにする）を腹腔内接種した。初回ワクチン接種28日後に、膜融合型HAスプリットワクチン（初回ワクチン接種と同様に、10 μgワクチン + 10 μg CpG-ODNをリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、等量のFreund’s incomplete adjuvant (ROCKLAND) と混合して液量200 μlにする）を腹腔内接種した。追加ワクチン接種から14日後以降に、ワクチンを接種したマウスより採血を行い、血清を回収した。
　5-2.ELISA法による測定
　下記に示す手法により、ELISA法にて、H1N1型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したC57BL/6マウスの血清中のLAH抗体濃度を測定した。
　ステム部分の一部（long alpha helix）に相当する合成ペプチド（H1; Ac-RIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNADYKDDDDKC）（配列番号２）を使用し、濃度既知の標準モノクローナル抗体（H1; クローン名F2）を使用した以外は、上記と同様の手法を用いた。
　図４に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したC57BL/6マウスの血清中のLAH抗体価は、現行HAスプリットワクチンを腹腔内接種したC57BL/6マウスの血清中のLAH抗体価よりも、有意に上昇していた。
　6.抗原変異株に対する交差防御
　H1N1型ウイルス感染防御実験では、ワクチン非接種マウス、又は、H1N1型の現行HAスプリットワクチン若しくは膜融合型HAスプリットワクチン接種後のマウスより回収した血清を、C57BL/6マウス（♀、6～12週令）に200 μlずつ腹腔内投与した。
　血清投与から3時間後、ワクチン株とは抗原性の異なる別のH1N1型インフルエンザウイルス (A/Narita/1/09)を5マウスlethal dose50 (50%のマウスに致死性感染をおこすウイルス量の5倍)にて麻酔下において経鼻投与することでウイルス感染を行った。
　ウイルス感染から20日間、毎日マウスの観察を行い、生存率を調べた。図５に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを接種したC57BL/6マウスでは、抗原性の異なる別のH1N1型インフルエンザウイルス感染後９日目から有意に生存率低下を抑制できた。
　7.LAH epitopeに対する抗体結合性
　ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)により、X31株を感染させたマウスもしくはヒト末梢血より作製したLAH結合性モノクローナル抗体の、現行HAスプリットワクチンまたは膜融合型HAスプリットワクチンに対する結合を測定した。H3N2型インフルエンザウイルス（X31株）の現行HAスプリットワクチンまたは膜融合型HAスプリットワクチンをリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.3）に溶解し、96ウェルプレートに50 μlずつ添加した。4℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を150 μlずつ添加した。室温で2時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて段階希釈したLAH結合性のモノクローナル抗体を50μlずつ添加した。4℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを3回洗浄し、0.05%Tween20と1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（Southern Biotech）を各ウェルに100μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、基質としてクエン酸緩衝液（pH 5.0） 60 mlにo-phenylendiamine tablet (シグマ) 30 mgと24 μlの30%過酸化水素水(30%w/w; シグマ)を加えたものを調製し、それを各ウェルに50μlずつ添加した。発色後25μlの１mol/L硫酸(和光純薬工業)で反応を止め、Microplate Reader 450型(Biorad)を用いて490 nmの吸光値を測定した。測定した現行HAスプリットワクチンまたは膜融合型HAスプリットワクチンに対するそれぞれの吸光値より、結合性の変化を算出した。
　図６に示されるように、LAH結合性モノクローナル抗体が膜融合型HAスプリットワクチンに対して現行HAスプリットワクチンよりも1.05～21倍強く結合した。これらの結果は、HAスプリットワクチンの酸性処理により、LAH epitopeに対する抗体結合性が亢進することを示すものである。
　インフルエンザワクチンの製造に利用できる。
　配列番号１、２：合成ペプチド

Claims (4)

  1. 　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対するインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
  2. 　前記酸性処理はpH4.4～5.8にて処理を行うことを特徴とする請求項１記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
  3. 　前記インフルエンザHAスプリットワクチンはH3N2型又はH1N1型であることを特徴とする
    請求項１又は２に記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
  4. 　インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対するインフルエンザHAスプリットワクチン。
     
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