WO2019064807A1 - コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法並びに当該方法により得られたコラーゲンビトリゲル及びその精製物 - Google Patents

コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法並びに当該方法により得られたコラーゲンビトリゲル及びその精製物 Download PDF

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vitrigel
collagen vitrigel
gelling agent
purified
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彩子 西村
翔平 宮内
俊明 竹澤
歩 宮崎
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Yutoku Pharmaceutical Industries Co Ltd
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Yutoku Pharmaceutical Industries Co Ltd
National Agriculture and Food Research Organization
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing collagen vitrigel and its purified product. More specifically, the present invention relates to collagen vitrigel usable for medical use etc., fibrillizing collagen, purified collagen vitrigel and methods for producing them.
  • Collagen is one of the proteins present in vivo. In humans, it accounts for about 30% of the whole-body protein and is particularly abundant in skin, bone, cartilage, tendon and blood vessel wall.
  • the molecular weight of collagen is about 300,000, forming a triple helix structure consisting of three polypeptide chains with a molecular weight of about 100,000.
  • This collagen has a large number of molecular species that differ in amino acid sequence order and amino acid composition ratio depending on the animal from which they are derived and their tissues.
  • Collagen plays a role as a scaffold for cells as an extracellular matrix in vivo and is known to affect proliferation, differentiation and morphogenesis, and has been used as a carrier for cell culture since ancient times, and in recent years it has been used as a living graft. It is also applied as a material.
  • various culture petri dishes and flasks coated with a collagen coating are commercially available as a cell culture carrier, and an embedded culture method is known in which cells are dispersed in collagen gel and cultured.
  • a biograft material there are a collagen gel material carrying cells, an injectable gel which is transplanted in a solution state and gelated in vivo, and a material obtained by drying collagen gel and processing it into a membrane or sponge.
  • Non-Patent Document 1 discloses a cartilage graft material
  • Patent Document 1 discloses a gelling material for in-vivo injection
  • Patent Document 2 discloses an artificial skin material and the like.
  • shape of the biograft material which consists of collagens varies, there are many materials processed and shape
  • Such a collagen gel can be obtained by placing a collagen solution under physiological salt concentration, hydrogen ion concentration and temperature conditions, and as a gelling agent therefor, various cell cultures are generally used.
  • a solution, a saline solution, or a buffer solution having a buffer capacity in the neutral region is used.
  • collagen vitrigel is a novel collagen material expected to be applied as a biograft material.
  • “Vitrigel (registered trademark) (registered trademark) 5602094" is a new scientific term named by Takezawa et al., Obtained by vitrification of a hydrogel such as conventional extracellular matrix and rehydration. It is defined as a gel in a stable state (non-patent document 2).
  • Collagen vitrigel which is formed from collagen which is one of the extracellular matrix, consists of high density collagen fibers.
  • a thin film using this collagen vitrigel is characterized by being thinner and higher in strength than conventional plate-like collagen gel materials, and its application as a biograft material is expected, for example, in Non-Patent Document 3
  • a cartilage graft material consisting of a collagen vitrigel thin film starting from pig skin-derived atelocollagen.
  • a dried collagen vitrigel thin film starting from bovine skin-derived native collagen has already been commercialized as a substrate for cell culture (Kanto Chemical Co., Ltd. # ad-MED Vitrigel (trade name)).
  • Non-Patent Document 4 discloses a method of preparing collagen vitrigel from pig skin-derived atelocollagen using DMEM to which HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) is added as a gelling agent. There is.
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid
  • the method of obtaining collagen gel by using DMEM as a gelling agent is a preparation method conventionally used in the embedded culture method of in vitro test, it is not preferable as a preparation method of a biograft material. Because DMEM contains more than 30 compounds, only a few of them are involved in collagen gelation, and DMEM is used to prepare collagen vitrigel as a biograft material. For this reason, it is necessary to confirm the safety of more than 30 compounds and to set the residual tolerance limit, which causes a great burden on the manufacturer.
  • the said nonpatent literature 4 is disclosing the collagen vitrigel obtained using the phosphate buffer solution (PBS) which added HEPES as a gelatinizer.
  • PBS phosphate buffer solution
  • HEPES HEPES
  • a method of compensating for the low strength of collagen vitrigel a method of enhancing film strength by chemical crosslinking by addition of a crosslinking agent or physical crosslinking by irradiation of ultraviolet rays or gamma rays is known as a method of compensating for the low strength of collagen vitrigel.
  • cross-linking with a compound may cause biotoxicity of the added compound, and irradiation of ultraviolet light and gamma rays may cause denaturation of collagen, so these cross-linking treatments are not performed. Is desirable.
  • a compound with high safety is selected as a component of the gelling agent, and while the composition is as simple as possible, development of a method capable of finally preparing a collagen vitrigel having sufficient strength Is required.
  • Patent No. 6071468 gazette Patent No. 4674211
  • An object of the present invention is to develop a gelling agent having a simple composition consisting only of a compound having high safety to the living body in consideration of the above situation, and from collagen, the membrane strength is high without crosslinking treatment, and industrial Manufacturing a collagen vitrigel which is easy to manufacture, easy to process, and easy to handle, and its purified product.
  • an object of the present invention is a collagen vitrigel obtained by fibrillating collagen, a purified product of the same, and a method for producing the same, using a gelling agent of a simple composition consisting only of a compound highly safe to the living body.
  • the inventors of the present invention conducted intensive studies on a gelling agent used for producing a collagen gel, and as a result, at least one compound of inorganic carbonates such as inorganic carbonates and inorganic hydrogen carbonates, and inorganic chlorides and inorganics
  • a solution containing at least one compound of phosphate as a gelling agent
  • collagen gel can be produced without using conventional medium components and organic buffer components, and obtained
  • the collagen gel was found to be highly safe because it contains no components other than the above-mentioned inorganic components.
  • the present inventors have found that collagen vitrigel derived from this collagen gel and purified products thereof have high membrane strength, are easy to manufacture and process, and are easy to handle.
  • the present invention gelates collagen with a gelling agent containing an inorganic carbonate and a compound selected from the group consisting of an inorganic chloride and an inorganic phosphate, and then drying the obtained collagen gel. It is a method of producing collagen vitrigel characterized by vitrifying and further subjecting it to hydration treatment.
  • the present invention is further characterized in that purified collagen vitrigel (hydrated form) characterized by desalting and equilibrating collagen vitrigel prepared by the above-mentioned production method, and further drying and revitrifying it. It is a manufacturing method of purified collagen vitrigel (dried form) to be
  • the present invention is a collagen vitrigel obtained by the above method and a purified collagen vitrigel.
  • the inorganic salts are used without mixing the organic compound such as the medium component and the organic type buffer component into the gelling agent of collagen, the remaining component in the gel produced is small, and the composition thereof Is clear and a collagen gel is obtained which is less prone to problems caused by contaminants.
  • collagen vitrigel produced from this collagen gel and purified collagen vitrigel derived therefrom are highly safe for the living body, and can be advantageously used, for example, in medical applications including living transplantation. is there.
  • collagen vitrigel means rehydrated collagen dry body (collagen xerogel) which has been vitrified by drying collagen gel.
  • purified collagen vitrigel means one obtained by equilibrating this collagen vitrigel after desalting treatment, one obtained by further drying and revitrifying it, and its rehydrate.
  • the collagen vitrigel of the present invention is prepared by mixing collagen with an aqueous solution containing an inorganic carbonate and a compound (inorganic salt) selected from the group consisting of an inorganic chloride and an inorganic phosphate, Then, the collagen gel dried obtained by vitrification by drying is obtained by further hydration.
  • collagen vitrigel is produced as follows. That is, first, an aqueous solution containing a collagen solution, the inorganic carbonate salt, and a compound selected from the group consisting of inorganic chloride and inorganic phosphate (hereinafter sometimes abbreviated as "gelling agent") A collagen sol is obtained by mixing, and the collagen sol is heated to be fibrillated to give a collagen gel. Then, this is dried and vitrified to obtain a collagen vitrigel by hydration treatment of the collagen gel dried product.
  • gelling agent a compound selected from the group consisting of inorganic chloride and inorganic phosphate
  • purified collagen vitrigel can be obtained by further desalting (washing) and equilibrating the collagen vitrigel obtained as described above, and further drying and re-vitrifying it, if necessary, again. It is obtained by hydration.
  • the collagen used in the present invention is not particularly limited for the animal species from which it is derived, and various types can be used.
  • mammalian origin collagen for example, bovine origin collagen, pig origin collagen, goat origin collagen, sheep origin collagen, or monkey origin collagen
  • avian origin collagen for example, chicken origin collagen, geese origin collagen, duck
  • Origin collagen or ostrich origin collagen fish origin collagen (eg salmon origin collagen, Thailand origin collagen, tuna origin collagen, tilapia origin collagen or shark origin collagen) reptile origin collagen (eg crocodile origin collagen) amphibian origin Collagen (eg, frog-derived collagen), invertebrate-derived collagen (eg, jellyfish-derived collagen)
  • part from which the said collagen is derived For example, skin, a bone, a cartilage, a muscle, or an eyelid can be mentioned.
  • collagen which is preferably used is collagen which is not denatured and stable at 37 ° C. or less which is a human living body temperature.
  • the denaturation temperature of collagen is related to the habitat of the organism from which it is derived, and collagen of aquatic organisms such as fish has a denaturation temperature in the low temperature zone compared to that of human. Therefore, it is preferable to use terrestrial living organism-derived collagen in which the denaturation temperature of collagen is close to that of human being, and in terms of industrially stable supply, it is preferable to obtain collagen from livestock animals.
  • livestock animals cattle and pigs are mentioned, but cattle are not preferable because they have a risk of holding pathogens such as BSE (bovine spongiform encephalopathy), and pigs are preferable.
  • the collagen used in the present invention is not limited as to molecular structure as long as it is fibrillar collagen, and as molecular species (type), for example, type I collagen, type II collagen, type III collagen, or Examples include type V collagen.
  • type I collagen, type II collagen, type III collagen, or Examples include type V collagen.
  • collagen composed mainly of type I collagen or type III collagen is preferable from the viewpoint of high industrial yield and relatively low cost and stable supply.
  • telopeptide non-helical structure region present at the end of the collagen molecule has antigenicity, it is more preferable to use atelocollagen in which this telopeptide is removed (atherated) by enzyme treatment.
  • the collagen is preferably used in the form of a solution dissolved in a solvent such as water for gelation, and more preferably an acid solubilized collagen solution having a pH of 2.0 to 6.0. If the pH is lower than 2.0, there is a possibility of hydrolysis of collagen molecules, and if the pH is higher than 6.0, collagen may not be sufficiently solubilized, which is not preferable.
  • the final concentration after mixing with the gelling agent is preferably in the range of 0.05 w / v% to 5.0 w / v%, and more preferably 0.2 w / v% to 2.%. It is in the range of 0 w / v%.
  • the gelling agent used for gelation of collagen is a compound selected from the group consisting of inorganic carbonates (inorganic carbonates, inorganic bicarbonates), inorganic chlorides and inorganic phosphates ( Hereinafter, it is an aqueous solution containing "inorganic salts" (it may abbreviate abbreviated).
  • the inorganic carbonate used as a component of the gelling agent is not limited as to molecular structure as long as it is easily soluble in water, and, for example, inorganic carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate Salts and inorganic hydrogen carbonates such as sodium hydrogen carbonate and potassium hydrogen carbonate can be used.
  • inorganic salts used as another component of the gelling agent belong to inorganic chlorides and inorganic phosphates, and as long as they are easily soluble in water, the molecular structure is not limited, and for example, , Inorganic chlorides such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride and calcium chloride, sodium phosphate, potassium phosphate, disodium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate Inorganic phosphoric acids such as calcium dihydrogen phosphate can be used.
  • Inorganic chlorides such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride and calcium chloride
  • sodium phosphate, potassium phosphate disodium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate
  • Inorganic phosphoric acids such as calcium dihydrogen phosphate can be used.
  • Types of inorganic carbonates and inorganic salts (inorganic chloride or inorganic phosphate) or combinations thereof in this gelling agent can cause collagen fibrosis (self-assembly) when mixed with collagen solution
  • the solution (collagen sol) after mixing the gelling agent and the collagen solution preferably has a pH of 6.2 to 9.8 at 25 ° C., and is 6.8 to 9.0. More preferable.
  • the concentration of inorganic carbonates and inorganic salts in the gelling agent the ionic strength in the collagen sol is preferably in the range of 0.07 to 0.22, preferably 0.07 to 0.18. It is more preferable to be in the range.
  • a collagen sol prepared by mixing a gelling agent and a collagen solution is heated to fibrillate collagen to form a collagen gel.
  • the temperature at that time is the denaturation temperature of the collagen used. It is preferable to determine on the basis of Collagen fibrosis is triggered near the denaturation temperature of collagen, and fibrosis is not triggered at temperatures well below the denaturation temperature. That is, it is preferable that the temperature is ⁇ 20 ° C. or higher with respect to the denaturation temperature, and the range is equal to or lower than the denaturation temperature. For example, since the denaturation temperature of pig-derived collagen is 41 ° C., the range of 21 ° C. to 41 ° C. is preferable.
  • the collagen gel obtained as described above is then dried and vitrified to give a collagen gel dry body (collagen xerogel).
  • This "vitrification” is, for example, by drying a hydrogel of a heat-denatured protein such as chicken egg protein (white body) and removing water sufficiently to form a hard, highly transparent glass-like substance. It means the phenomenon to convert (Takushi Eisei, "Edible eyeballs from fish", Nature , 1990, Vol 345, p. 298-299).
  • air drying is preferably used as a drying method for vitrifying collagen gel, and the temperature thereof is preferably equal to or less than the denaturation temperature of collagen.
  • a collagen gel is allowed to stand for 2 days under conditions of temperature and humidity of 10 ° C. and about 40% rh to vitrify the collagen gel. It is preferred to do.
  • the dried collagen gel thus obtained can then be rehydrated to form collagen vitrigel.
  • the solution used for rehydration of the dried collagen gel contains a component contained in the gelling agent of the present invention, and the pH range is neutral (for example, saline, phosphate buffer, purified water, etc.
  • aqueous solution having a pH of about 6.0 to 8.0 can be mentioned.
  • the solution used for this rehydration does not need to have the same composition and concentration as the gelling agent at the time of collagen gel production, and is not limited thereto.
  • the temperature of the aqueous solution used for hydration is preferably a temperature significantly below the denaturation temperature of the collagen to be used, and is preferably -20 ° C. or less with respect to the denaturation temperature.
  • collagen vitrigel is prepared as a hydrate.
  • This collagen vitrigel has high strength of itself, is industrially and mechanically easy to manufacture and process, and is easy to handle.
  • this collagen vitrigel is conventionally used only as a gelling agent used in its production process and as an ingredient of rehydrating agents, only inorganic compounds such as inorganic carbonates, inorganic chlorides and inorganic phosphates. Since such medium components and organic substances are not used, they can be used, for example, as a medically safe collagen gel biogel having high safety.
  • the collagen vitrigel may be further subjected to a desalting treatment, an equilibration treatment, and then dried to form a purified collagen vitrigel (dry matter).
  • the inorganic compound contained in the gelling agent to be used may be concentrated by drying and precipitated as crystals if it is included. Since crystals are deposited unevenly on the surface of collagen vitrigel dry body, the appearance is impaired and there may be a problem in product uniformity.
  • the desalting treatment carried out here is carried out by immersing collagen vitrigel in an aqueous solution in which the pH is in a neutral range (for example, about pH 6.0 to 8.0), but in D-PBS (-) It is preferable to carry out by immersion. Specifically, for example, the dried collagen gel is soaked in 1 mL or more of D-PBS (-) per 10 mg to be hydrated to form collagen vitrigel, and then D-PBS (-) around collagen vitrigel is used. Desalting of collagen vitrigel and equilibration with D-PBS (-) can be carried out by removing and immersing in D-PBS (-) two more times.
  • the temperature of the aqueous solution in this operation is preferably a temperature greatly below the denaturation temperature of the collagen to be used, and is preferably ⁇ 20 ° C. or less with respect to the denaturation temperature.
  • air drying as the drying for revitrification of the purified collagen vitrigel (hydrated form), and the temperature thereof is preferably equal to or less than the denaturation temperature of collagen. More specifically, it is preferable to use a constant temperature and humidity chamber for air drying, for example, leaving purified collagen vitrigel (hydrated body) in a temperature and humidity condition of 10 ° C and a constant temperature and humidity chamber of 40% rh for 1 day It is preferable to carry out drying.
  • the collagen vitrigel and the purified collagen vitrigel prepared by the above-described method, as described above, have sufficient strength per se and high safety, and therefore, the cell carrier for regenerative medicine especially for medical use.
  • the shape can also be processed into arbitrary shapes, for example, plate shape, film shape, rod shape, thread shape, cylindrical shape, tubular shape, bag shape etc. according to the use.
  • This collagen gel was dried for 2 days in a constant temperature and humidity chamber (temperature and humidity conditions 10 ° C., 40% rh) for vitrification to obtain a collagen gel dried body. Furthermore, this collagen gel dried body was hydrated by immersion in 1 mL of D-PBS ( ⁇ ) per 10 mg to obtain collagen vitrigel.
  • Excess salt is removed by washing the above collagen vitrigel twice with D-PBS (-) to equilibrate the collagen vitrigel to D-PBS (-), and then the temperature and humidity chamber (temperature and humidity again) It was dried at 10 ° C. and 40% rh) for 2 days to obtain a purified collagen vitrigel (dry matter).
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • Collagen vitrigel and purified collagen vitrigel (dry matter) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the gelling agent was changed to the above gelling agent.
  • the collagen gel was dried by a constant temperature and humidity oven and vitrified to obtain a dried collagen gel. Furthermore, this collagen gel dried body was hydrated by immersion in 1 mL of D-PBS ( ⁇ ) per 10 mg to obtain collagen vitrigel. After washing collagen vitrigel twice with D-PBS (-) to remove excess salts and other components, the collagen vitrigel is equilibrated to D-PBS (-), dried again, The corresponding dried form of vitrigel was obtained.
  • PH measurement The pH was measured on the collagen gel before gelation of Examples 1 to 29 and Comparative Examples 1 to 10. The pH was measured by placing 0.5 mL of each collagen sol into a measuring electrode dish of a pH meter (Horiba, Ltd. #LAQUAtwin AS-712) and measuring the pH.
  • Example 1 Examples 1 to 3, Example 8, Example 10, Example 12, Example 18, Example 23 to 25, Example 27, Example 29 to 31 and Comparative Example 1
  • Purified Collagen Vitrigel Water Hydrate Film strength was measured.
  • the membrane strength of the purified collagen vitrigel (hydrate) was measured by the following method. That is, purified collagen vitrigel (dry matter) having a diameter of 34.8 mm was immersed in 8 ml of D-PBS (-) and rehydrated for 1 hour. The purified collagen vitrigel (hydrated form) obtained by hydration was sandwiched and fixed between two 50 mm diameter acrylic plates with a 5 mm diameter hole in the center.
  • a stainless steel needle with a diameter of 1.0 mm is vertically pierced at a speed of 3.0 mm / min against the membrane fixed through the hole of 5 mm in diameter, and the needle penetrates the purified collagen vitrigel (hydrated body)
  • the maximum stress (N) up to the end was measured using a small bench test machine (Shimadzu Corporation # EZ-SX, load cell maximum load 5 N). The measurement was carried out at three places for each purified collagen vitrigel (hydrate), and the average value was taken as the maximum stress (N). This operation was performed on three purified collagen vitrigels (hydrates), and the average value of the three maximum stresses was taken as the membrane strength (N).
  • the purified collagen vitrigel obtained by the method of the present invention has sufficient membrane strength and is substantially free of residual components other than inorganic salts, and is biologically safe. It was highly practical and practical.
  • collagen vitrigel and its purified product with high biosafety can be easily obtained at low cost.
  • the obtained collagen vitrigel and purified collagen vitrigel have sufficient membrane strength, are industrially and mechanically easy to manufacture and process, are easy to handle, and have high safety.
  • the biograft material of the present invention is useful as, for example, a cell carrier for regenerative medicine, a wound covering material, an artificial skin, an adhesion preventing material and the like.

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Abstract

コラーゲンから、架橋処理をせずとも膜強度が高く、工業的、機械的に製造、加工が容易であり、かつ取扱いやすく安全性の高いコラーゲンビトリゲル及びその精製物を製造することを目的とする。　この目的達成のための、コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩からなる群より選ばれる化合物とを含有するゲル化剤でゲル化し、次いで得られたコラーゲンゲルをガラス化し、更にこれを水和処理に付すことを特徴とするコラーゲンビトリゲルの製造方法およびこのコラーゲンビトリゲルを、脱塩、平衡化し、更に乾燥することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲルの製造方法並びにこれらの方法で得られたコラーゲンビトリゲルおよび精製コラーゲンビトリゲルである。

Description

コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法並びに当該方法により得られたコラーゲンビトリゲル及びその精製物
　本発明は、コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法に関する。さらに詳しく言えば、コラーゲンを線維化する、医療用等に利用可能なコラーゲンビトリゲル、精製コラーゲンビトリゲル及びそれらの製造方法に関する。
　コラーゲンは生体内に存在するタンパク質のひとつである。ヒトにおいては全身のタンパク質の約３０％を占め、特に皮膚、骨、軟骨、腱及び血管壁に多く存在する。コラーゲンの分子量は約３０万であり、分子量約１０万のポリペプチド鎖３本から成る三重らせん構造を形成している。このコラーゲンはその由来となる動物及びその組織によってアミノ酸配列順序及びアミノ酸組成比が異なる多数の分子種が存在する。
　コラーゲンは生体内で細胞外マトリックスとして細胞の足場としての役割を果たすと同時に、増殖、分化及び形態形成に影響を与えることが知られており、古くより細胞培養担体として利用され、近年では生体移植材料としても応用されている。
　このうち、細胞培養担体としてはコラーゲンコートが施された各種培養シャーレやフラスコが市販されており、またコラーゲンゲル中に細胞を分散させて培養する包埋培養法が知られている。一方、生体移植材料としては細胞を担持したコラーゲンゲル材料、溶液状態で移植し生体内でゲル化させるインジェクタブルゲル、コラーゲンゲルを乾燥して膜状あるいはスポンジ状に加工した材料などが存在する。
　また、コラーゲンから成る生体移植材料として、非特許文献１には軟骨移植用材料、特許文献１には生体内注入用ゲル化材料、特許文献２には人工皮膚材料などが開示されている。このようにコラーゲンから成る生体移植材料の形状はさまざまであるが、コラーゲンゲルを応用して加工、成形された材料が多い。
　このようなコラーゲンゲルは、コラーゲン溶液を生理的な塩濃度、水素イオン濃度及び温度条件下におくことで得られることが知られており、そのためのゲル化剤としては、一般的に各種細胞培養液、生理食塩水、中性域に緩衝能を持つ緩衝液が用いられる。
　ところで、生体移植材料としての応用が期待される新規なコラーゲン材料として、「コラーゲンビトリゲル」がある。「ビトリゲル（Vitrigel）（登録第５６０２０９４号商標）」とは竹澤らにより命名された新しい学術用語で、従来の細胞外マトリックス等のハイドロゲルをガラス化（vitrification）した後に再水和して得られる安定した状態にあるゲルと定義されている（非特許文献２）。細胞外マトリックスの一つであるコラーゲンから形成されるコラーゲンビトリゲルは、高密度のコラーゲン線維から成るものである。
　このコラーゲンビトリゲルを利用した薄膜は、従来の板状のコラーゲンゲル材料に比して薄く、強度が高い特徴を持ち、生体移植材料としての応用が期待されており、例えば、非特許文献３には、ブタ皮膚由来アテロコラーゲンを原料としたコラーゲンビトリゲル薄膜から成る軟骨移植用材料が開示されている。また、ウシ皮膚由来ネイティブコラーゲンを原料としたコラーゲンビトリゲル乾燥体薄膜はすでに細胞培養用基材として製品化されている（関東化学(株)＃ａｄ－ＭＥＤビトリゲル（商標名））。
　このコラーゲンビトリゲルの製造には、まず、コラーゲンゲルの調製が必要である。従来、コラーゲンゲルの調製には、上記したように一般の細胞培養液、例えばダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）がゲル化剤として用いられている。また、非特許文献４には、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）を加えたＤＭＥＭをゲル化剤とし、ブタ皮膚由来アテロコラーゲンからコラーゲンビトリゲルを調製する方法が開示されている。
　しかしながら、ＤＭＥＭをゲル化剤としてコラーゲンゲルを得る方法はイン・ビトロ（ in vitro ）試験の包埋培養法において従来用いられてきた調製方法ではあるが、生体移植材料の調製方法としては好ましくない。なぜなら、ＤＭＥＭには３０種を超える化合物が含まれているが、このうちコラーゲンのゲル化に関与している化合物はごく一部であり、生体移植材料としてのコラーゲンビトリゲルの調製にＤＭＥＭを用いるためには、３０種を超える化合物の安全性の確認及び残留許容限度値の設定が必要であり、製造者にとって多大な負担となるためである。
　上記問題の解決方法の一例として、前記非特許文献４では、ＨＥＰＥＳを加えたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をゲル化剤に使用して得られるコラーゲンビトリゲルが開示されている。しかしながら、この溶液をゲル化剤として調製したコラーゲンビトリゲルは強度が低く、生体移植材料には適さないという問題があるとともに、ＨＥＰＥＳ自体にも安全性の懸念があることが指摘されている。
　また、上記方法で得たものに限らず、コラーゲンビトリゲルの低い強度を補う方法として、架橋剤の添加による化学架橋、紫外線やガンマ線の照射による物理架橋で膜強度を高める方法が知られている。しかし、生体移植材料として用いることを想定した場合、化合物による架橋はその添加した化合物の生体毒性が懸念され、また紫外線やガンマ線の照射はコラーゲンの変性が懸念されるため、これら架橋処理は行わないことが望ましい。
　以上のようなことから、ゲル化剤の成分として安全性の高い化合物を選定し、かつ組成は可能な限り簡素にしながら、最終的に十分な強度のあるコラーゲンビトリゲルを調製しうる方法の開発が求められている。
特許第６０７１４６８号公報 特許第４６７４２１１号公報
菅原桂、"培養軟骨による軟骨欠損治療の最近の進歩"、人工臓器、日本人工臓器学会、２０１３年、４２巻、３号、Ｐ.１９８‐２００ Toshiaki Takezawa、"Collagen Vitrigel: A Novel Scaffold That Can Facilitate a Three‐Dimensional Caluture for Reconstructing Organoids"、 Cell Transplantaion、 (2004)、Vol13、p.463‐473 Hideaki Maruki、"Effects of a cell-free method using collagen vitrigel incorporating TGF-β1 on articular cartilage repair in a rabbit osteochondral defect model"、Journal of Biomedical Materials Research B、(2016) "医薬品作物、医療用素材等の開発 研究成果第５６１集"、農林水産省農林水産技術会議事務局、２０１６年、Ｐ.３１５‐３２２
　本発明の課題は、上記の状況を考慮し、生体への安全性が高い化合物のみから成る簡素な組成のゲル化剤を開発し、コラーゲンから、架橋処理をせずとも膜強度が高く、工業的、機械的に製造、加工が容易であり、取扱いやすいコラーゲンビトリゲル及びその精製物を製造することである。
　すなわち、本発明の目的は、生体への安全性が高い化合物のみから成る簡素な組成のゲル化剤を用い、コラーゲンを線維化して成るコラーゲンビトリゲル、その精製物及びそれらの製造方法であって、膜強度が高く、工業的、機械的に製造、加工が容易であり、取扱いやすく、生体的に安全性の高い、医療用としても使用可能なコラーゲンビトリゲル及びその精製物とそれらの低コストな製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、コラーゲンゲルの製造に用いるゲル化剤に関し、鋭意研究を重ねた結果、無機炭酸塩、無機炭酸水素塩等の無機炭酸塩類のうち少なくとも１つの化合物と、無機塩化物、無機リン酸塩のうち少なくとも１つの化合物を含有する溶液をゲル化剤として用いることで、従来の培地成分や有機系緩衝成分を使用しなくてもコラーゲンゲルを製造することができ、しかも得られたコラーゲンゲルは、上記無機成分以外の成分を含有しないため、安全性が高いものであることを知った。しかも、このコラーゲンゲルから導かれるコラーゲンビトリゲルや、その精製物は膜強度が高く、製造、加工が容易であり、取扱いやすいものであることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩よりなる群から選ばれる化合物とを含有するゲル化剤でゲル化し、次いで得られたコラーゲンゲルを乾燥することによりガラス化し、更にこれを水和処理に付すことを特徴とするコラーゲンビトリゲルの製造方法である。
　また本発明は、上記製造方法で調製したコラーゲンビトリゲルを、脱塩、平衡化することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル（水和体）およびこれを更に乾燥して再ガラス化することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）の製造方法である。
　更に本発明は、上記方法で得られるコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルである。
　本発明方法では、コラーゲンのゲル化剤中に培地成分や有機系緩衝成分等の有機化合物を配合せず、無機塩類のみを使用するため、生成したゲル中での残存成分が少なく、しかもその組成が明確で、夾雑物に起因する問題が生じにくいコラーゲンゲルが得られる。
　従って、このコラーゲンゲルから製造されるコラーゲンビトリゲルや、更にこれから誘導される精製コラーゲンビトリゲルは生体に対する安全性が高いものであり、例えば、生体移植を含む医療用用途に有利に使用できるものである。
本発明のコラーゲンビトリゲルおよび精製コラーゲンビトリゲルについて、その製法、関係等を簡単に示した図面である。
　本明細書において、コラーゲンビトリゲルとは、図１に示すように、コラーゲンゲルを乾燥することでガラス化させたコラーゲンゲル乾燥体（コラーゲンキセロゲル）を再水和したものを意味する。また、精製コラーゲンビトリゲルとは、このコラーゲンビトリゲルを脱塩処理後平衡化したもの、これを更に乾燥して再ガラス化したものおよびその再水和物を意味する。
　本発明のコラーゲンビトリゲルは、コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩よりなる群から選ばれる化合物（無機塩）とを含有する水溶液と混合してコラーゲンゲルを調製し、次いでこれを乾燥することによりガラス化して得られるコラーゲンゲル乾燥体を、更に水和することにより得られる。
　より詳しくは、コラーゲンビトリゲルは、次のようにして製造される。すなわち、まずコラーゲン溶液と、前記無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩よりなる群から選ばれる化合物とを含有する水溶液（以下、「ゲル化剤」と略称することがある）とを混合することでコラーゲンゾルとし、そのコラーゲンゾルを加温して線維化させてコラーゲンゲルとする。次いでこれを乾燥、ガラス化することにより得られるコラーゲンゲル乾燥体を水和処理することでコラーゲンビトリゲルが得られる。
　また、精製コラーゲンビトリゲルは、上記のようにして得られたコラーゲンビトリゲルを、更に脱塩（洗浄）、平衡化することで得られ、更にはこれを乾燥、再ガラス化させ、必要により再水和することにより得られる。
　本発明方法により、コラーゲンビトリゲルを調製するには、まず、コラーゲンを、ゲル化剤と混合してコラーゲンゲルを調製することが必要である。
　本発明に用いられるコラーゲンは、その由来となる動物種について特に限定されるものではなく、種々のものを使用できる。例えば、その由来としては、哺乳類由来コラーゲン（例えば、ウシ由来コラーゲン、ブタ由来コラーゲン、ヤギ由来コラーゲン、ヒツジ由来コラーゲン、又はサル由来コラーゲン）、鳥類由来コラーゲン（例えば、ニワトリ由来コラーゲン、ガチョウ由来コラーゲン、アヒル由来コラーゲン、又はダチョウ由来コラーゲン）、魚類由来コラーゲン（例えば、サケ由来コラーゲン、タイ由来コラーゲン、マグロ由来コラーゲン、テラピア由来コラーゲン、又はサメ由来コラーゲン）、爬虫類由来コラーゲン（例えば、ワニ由来コラーゲン）、両生類由来コラーゲン（例えば、カエル由来コラーゲン）、無脊椎動物由来コラーゲン（例えば、クラゲ由来コラーゲン）を利用することができる。また前記コラーゲンの由来となる部位についても特に限定されるものではなく、例えば、皮膚、骨、軟骨、筋肉、又は鱗を挙げることができる。
　本発明において、好ましく用いられるコラーゲンは、ヒトの生体温度である３７℃以下で変性せず安定なコラーゲンである。コラーゲンの変性温度はその由来となる生物の生息域に関係し、魚類等水生生物のコラーゲンはヒトのそれと比べて低温域に変性温度がある。したがって、コラーゲンの変性温度がヒトに近い陸生生物由来コラーゲンが好ましく、工業的な安定供給の面から畜産動物からコラーゲンを得ることが好ましい。畜産動物としては、ウシやブタが挙げられるが、ウシはＢＳＥ（牛海綿状脳症）等の病原体を保有する危険性があるため好ましくなく、ブタが好ましい。
　更に本発明に用いられるコラーゲンは、線維性コラーゲンであればその分子構造についても限定されるものではなく、分子種（型）としては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、又はV型コラーゲンが挙げられる。特にＩ型コラーゲンあるいはＩＩＩ型コラーゲンを主成分として構成されるコラーゲンは工業的に収量が多く、比較的安価で安定的に供給可能である点から好ましい。また、コラーゲン分子の末端に存在する非らせん構造領域（テロペプチド）は抗原性を有するため、このテロペプチドを酵素処理により除去（アテロ化）したアテロコラーゲンを用いることがより好ましい。
　このコラーゲンは、ゲル化にあたっては水等の溶媒に溶解した溶液の状態で使用することが好ましく、ｐＨ２.０～６.０の酸可溶化コラーゲン溶液であることがより好ましい。ｐＨが２.０よりも低い場合、コラーゲン分子の加水分解の可能性があり、ｐＨが６.０よりも高い場合はコラーゲンが十分に可溶化されない可能性があり、共に好ましくない。
　また、ゲル化にあたってのコラーゲン溶液のコラーゲン濃度については、コラーゲンの溶解性、コラーゲン溶液の粘性がコラーゲンゲルの製造に支障がなく、得られるコラーゲンビトリゲルの物性がその用途において十分であれば、限定されるものではないが、ゲル化剤と混合後の終濃度が０.０５ｗ／ｖ％～５.０ｗ／ｖ％の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは０.２ｗ／ｖ％～２.０ｗ／ｖ％の範囲である。
　一方、コラーゲンのゲル化にあたって使用されるゲル化剤は、上記した通り、無機炭酸塩類（無機炭酸塩、無機炭酸水素塩）と、無機塩化物及び無機リン酸塩よりなる群から選ばれる化合物（以下、「無機塩類」と略称することがある）とを含有する水溶液である。
　本発明において、ゲル化剤の成分として用いられる無機炭酸塩類は、水に対して易溶性なものであればその分子構造について限定されるものではなく、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の無機炭酸塩や、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の無機炭酸水素塩を利用することができる。
　また、ゲル化剤の別の成分として用いられる無機塩類は、無機塩化物や無機リン酸塩に属し、水に対して易溶性なものであればその分子構造について限定されるものではなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩化物や、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム等の無機リン酸類を利用することができる。
　このゲル化剤における、無機炭酸塩類および無機塩類（無機塩化物、または無機リン酸塩）の種類やその組み合わせは、コラーゲン溶液を混合した際にコラーゲンの線維化（自己組織化）を惹起できるものであれば特に限定されるものではないが、無機炭酸塩類のうち少なくとも１つと、無機塩化物、無機リン酸塩の少なくとも１つの化合物を含有することが必要である。
　また、ゲル化剤とコラーゲン溶液を混合後の溶液（コラーゲンゾル）は、２５℃におけるｐＨが６.２～９.８の範囲にあることが好ましく、６.８～９.０であることがより好ましい。更に、ゲル化剤中での無機炭酸塩類および無機塩類の濃度としては、コラーゲンゾル中でのイオン強度が０.０７～０.２２の範囲にあることが好ましく、０.０７～０.１８の範囲にあることがより好ましい。
　本発明においては、ゲル化剤とコラーゲン溶液を混合して調製したコラーゲンゾルを加温してコラーゲンを線維化させ、コラーゲンゲルとするのであるが、その際の温度は、使用するコラーゲンの変性温度を基準にして決定することが好ましい。コラーゲンの線維化はコラーゲンの変性温度付近で惹起され、変性温度を大きく下回る温度では線維化が惹起されない。すなわち、変性温度に対して－２０℃以上であり、変性温度以下の範囲であることが好ましい。例えば、ブタ由来コラーゲンの変性温度は４１℃であるため、２１℃～４１℃の範囲が好ましい。
　上記のようにして得られたコラーゲンゲルは、次いで乾燥に付され、ガラス化されてコラーゲンゲル乾燥体（コラーゲンキセロゲル）とされる。この「ガラス化（vitrification）」とは、例えば、鶏卵のタンパク質（白身）等の熱変性タンパク質のハイドロゲルを乾燥し、水分を十分に除去することで、硬質で透明度の高いガラス様の物質に変換する現象を意味する（Takushi Eisei、“Edible eyeballs from fish”、Nature、1990年、Vol345、p.298‐299）。
　本発明方法において、コラーゲンゲルをガラス化するための乾燥方法としては、風乾を用いることが好ましく、また、その温度としてはコラーゲンの変性温度以下であることが好ましい。
　より具体的には、好ましくは、風乾に恒温恒湿機を用い、例えば、温湿度条件１０℃、４０％ｒｈ程度の条件下にコラーゲンゲルを２日間静置させて、コラーゲンゲルのガラス化を行うことが好ましい。
　このようにして得られたコラーゲンゲル乾燥体は、次いで再水和することでコラーゲンビトリゲルとすることができる。コラーゲンゲル乾燥体の再水和に用いる溶液は、本発明のゲル化剤に含まれている成分を含有する、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、精製水等のｐＨが中性域（例えば、ｐＨ６．０～８．０程度）にある水溶液を挙げることができる。この再水和に用いる溶液はコラーゲンゲル製造時のゲル化剤とその組成、濃度が同一である必要はなく、これに限定されるものではない。
　上記再水和にあたっては、コラーゲンゲル乾燥体１０ｍｇあたり１ｍＬ以上のＤ‐ＰＢＳ（－）に３０分以上浸漬して水和させることが好ましい。水和に用いる水溶液の温度は、使用するコラーゲンの変性温度を大きく下回る温度であることが好ましく、変性温度に対して－２０℃以下が好ましい。
　以上のようにして、水和物としてコラーゲンビトリゲルが調製される。このコラーゲンビトリゲルは、それ自体の強度が高く、工業的、機械的に製造、加工が容易であり、取扱いやすいものである。そして、このコラーゲンビトリゲルは、その製造工程で使用するゲル化剤、再水和剤の成分として無機炭酸塩類、無機塩化物、無機リン酸塩等の無機化合物しか使用せず、従来使用されていた培地成分や有機物は使用しないため、例えば、生体的に安全性の高い医療用コラーゲンビトリゲルとして利用可能である。
　なお、上記コラーゲンビトリゲルは、更に脱塩処理、平衡化処理を施し、その後乾燥させることで精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）とすることができる。
　前記したコラーゲンゲル乾燥体（コラーゲンキセロゲル）はコラーゲンゲルを乾燥して得られるため、ややもすると使用するゲル化剤に含有される無機化合物が乾燥により濃縮され結晶として析出することがある。結晶はコラーゲンビトリゲル乾燥体の表面に不均一に析出するため、見た目を損なうとともに、製品の均一性に問題を生じるおそれがある。
　これに対し、コラーゲンビトリゲルを脱塩処理、平衡化処理を行うことにより、均一性が高く外見の良い精製コラーゲンビトリゲル（水和体）を得ることができる。ここで行われる脱塩処理は、コラーゲンビトリゲルを、ｐＨが中性域（例えば、ｐＨ６．０～８．０程度）にある水溶液に浸漬することにより行われるが、Ｄ‐ＰＢＳ（－）に浸漬して行うことが好ましい。具体的には、例えば、コラーゲンゲル乾燥体を、１０ｍｇあたり１ｍＬ以上のＤ‐ＰＢＳ（－）に浸漬して水和させコラーゲンビトリゲルとした後に、コラーゲンビトリゲル周囲のＤ‐ＰＢＳ（－）を除去し、さらに２回以上Ｄ‐ＰＢＳ（－）に浸漬することでコラーゲンビトリゲルの脱塩、Ｄ‐ＰＢＳ（－）による平衡化を行うことができる。
　この操作における水溶液の温度は、使用するコラーゲンの変性温度を大きく下回る温度であることが好ましく、変性温度に対して－２０℃以下が好ましい。
　更に、精製コラーゲンビトリゲル（水和体）の再ガラス化のための乾燥は、風乾を用いることが好ましく、また、その温度としてはコラーゲンの変性温度以下であることが好ましい。より具体的には、風乾には恒温恒湿機を用いることが好ましく、例えば、温湿度条件１０℃、４０％ｒｈの恒温恒湿機内に精製コラーゲンビトリゲル（水和体）を１日間静置させて、乾燥を行うことが好ましい。
　以上説明した方法で調製されるコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルは、上記したようにそれ自体が十分な強度があり、安全性が高いものであるため、特に医療用の、再生医療用細胞担体、創傷被覆材、人工皮膚、癒着防止材等のデバイスとして、利用可能である。また、その形状も、その用途に応じて任意の形状、例えば、板状、膜状、棒状、糸状、筒状、管状、袋状等に加工することができる。
　以下、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
　　（　コラーゲン溶液の調製　）
　ブタ皮膚由来アテロコラーゲン（日本ハム(株)＃ＮＭＰコラーゲンＰＳ）２ｇを滅菌水２００ｍＬに溶解し、１ｗ／ｖ％コラーゲン溶液を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ‐ＰＢＳ（－）；和光純薬工業(株)＃０４５‐２９７９５）５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業(株)＃１９１‐０１３０５）１.８５ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　５０ｍＬ容量のコニカルチューブ（コーニング＃３５２０７０）に、ゲル化剤と１ｗ／ｖ％コラーゲン溶液をそれぞれ２０ｍＬ採り、均一に混和し、これをコラーゲンゾルとした。コラーゲンゾルの調製は氷冷下で行った。次いで、ポリスチレン角型シャーレ（アズワン(株)＃Ｄ２１０‐１６）にアクリル円筒鋳型（(株)コスモスビード、外径３８.８ｍｍ×内径３４.８ｍｍ×高さ３０.０ｍｍ）を置き、この鋳型内にコラーゲンゾル１０ｍＬを充填した。３７℃の恒温機内に２時間静置してコラーゲンを線維化させ、コラーゲンゲルを得た。
　このコラーゲンゲルを恒温恒湿機（温湿度条件１０℃、４０％ｒｈ）で２日間乾燥し、ガラス化させてコラーゲンゲル乾燥体を得た。さらにこのコラーゲンゲル乾燥体を、１０ｍｇあたり１ｍＬのＤ‐ＰＢＳ（－）に浸漬して水和させ、コラーゲンビトリゲルを得た。
　上記コラーゲンビトリゲルをＤ‐ＰＢＳ（－）で２回洗浄することで過剰な塩を除去し、コラーゲンビトリゲル内をＤ‐ＰＢＳ（－）に平衡化した後、再度恒温恒湿機（　温湿度条件１０℃、４０％ｒｈ）で２日間乾燥させ、精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を得た。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム（和光純薬工業(株)＃１９１‐０１６６５）３.２１ｇ、リン酸二水素カリウム（和光純薬工業(株)＃１６９‐０４２４５）３.４０ｇ、炭酸水素ナトリウム１.８５ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、炭酸水素ナトリウム１.８５ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム０．４２ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム２．２７ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム０．４２ｇと炭酸ナトリウム（和光純薬工業(株)＃１９６‐０１５９５）０．５３ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム１．８５ｇと炭酸ナトリウム０．５３ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム２．９４ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、炭酸水素ナトリウム０．４６ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、炭酸水素ナトリウム２．５２ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
塩化ナトリウム３.２１ｇ、炭酸水素ナトリウム２．９４ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、炭酸水素ナトリウム３．３６ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム（和光純薬工業(株)＃１６３‐０３５４５）０．１０ｇ、塩化カルシウム（和光純薬工業(株)＃０３９‐００４７５）０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物（Millipore#10049-21-5）０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．４２ｇ、炭酸ナトリウム０．５３ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム１．８５ｇ、炭酸ナトリウム１．５９ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム１．１７ｇ、炭酸水素ナトリウム４．６２ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．４２ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム１．６８ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム２．５２ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム３．３６ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム４．２０ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸ナトリウム０．５３ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸ナトリウム１．０６ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．８４ｇ、炭酸ナトリウム０．２７ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．８４ｇ、炭酸ナトリウム０．５３ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．８４ｇ、炭酸ナトリウム１．０６ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　リン酸緩衝生理食塩水５００ｍＬに炭酸水素ナトリウム０．２１ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ（－）；和光純薬工業(株)＃０８５‐０９３５５）５００ｍＬに炭酸ナトリウム０．８５ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸ナトリウム０．２７ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を調製した。
比較例１
　　（　ゲル化剤の調製　）
　ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）４９０ｍＬに１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）；Thermo Fisher Scientific#15630‐080）１０ｍＬを加え、均一に混和し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲル及びコラーゲンビトリゲル乾燥体の調製　）
　５０ｍＬ容量のコニカルチューブに上記ゲル化剤と実施例１の１ｗ／ｖ％コラーゲン溶液をそれぞれ２０ｍＬ採り、均一に混和し、これをコラーゲンゾルとした。コラーゲンゾルの調製は氷冷下で行った。次いでポリスチレン角型シャーレにアクリル円筒鋳型を置き、この鋳型内にコラーゲンゾル１０ｍＬを充填した。３７℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ２　５％）内に２時間静置してコラーゲンを線維化させ、コラーゲンゲルを得た。
　このコラーゲンゲルを恒温恒湿機で乾燥し、ガラス化させ、コラーゲンゲル乾燥体を得た。さらにこのコラーゲンゲル乾燥体を、１０ｍｇあたり１ｍＬのＤ‐ＰＢＳ（－）に浸漬して水和させ、コラーゲンビトリゲルを得た。コラーゲンビトリゲルをＤ‐ＰＢＳ（－）で２回洗浄することで過剰な塩や他の成分を除去し、コラーゲンビトリゲル内をＤ‐ＰＢＳ（－）に平衡化した後、再度乾燥させ、コラーゲンビトリゲルの対応乾燥体を得た。
比較例２
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤をＤ‐ＰＢＳ（－）に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、一度はゲル化したコラーゲンゲルがその後の工程において溶解、ゾル化したためにコラーゲンゲル乾燥体として回収できず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例３
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム８.７７ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、一度はゲル化したコラーゲンゲルがその後の工程において溶解、ゾル化したためにコラーゲンゲル乾燥体として回収できず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例４
　　（　ゲル化剤の調製　）
　　塩化ナトリウム１．７５ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．１４ｇ、リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業(株)＃１９７‐０２８６５）１．３５ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、一度はゲル化したコラーゲンゲルがその後の工程において溶解、ゾル化したためにコラーゲンゲル乾燥体として回収できず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例５
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤をＨＢＳＳ（－）に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例６
　　（　ゲル化剤の調製　）
　ＨＢＳＳ（－）５００ｍＬに炭酸ナトリウム２．１２ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例７
　　（　ゲル化剤の調製　）
　ＨＢＳＳ（－）５００ｍＬに炭酸ナトリウム４．２４ｇを加えて溶解しゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例８
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例９
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸水素ナトリウム０．２１ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
比較例１０
　　（　ゲル化剤の調製　）
　塩化ナトリウム３.２１ｇ、塩化カリウム０．１０ｇ、塩化カルシウム０．１０ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０７ｇ、炭酸ナトリウム２．１２ｇを採り、滅菌水５００ｍＬに溶解し、これをゲル化剤とした。
　　（　コラーゲンビトリゲルの調製　）
　ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例１の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
試験例１
　　　物性測定：
　実施例１～３１及び比較例１～１０のコラーゲンゾルに含まれる無機化合物の濃度とそのイオン強度及びｐＨ、実施例１～３、実施例８、実施例１０、実施例１２、実施例１８、実施例２３～２５、実施例２７、実施例２９～３１及び比較例１の精製コラーゲンビトリゲル（水和体）の膜強度測定を下記方法により行った。この結果を表１～表７に示す。
　　（　ｐＨ測定　）
　ｐＨは、実施例１～２９及び比較例１～１０の、ゲル化前のコラーゲンゾルについて測定した。ｐＨ測定は、各コラーゲンゾル０.５ｍＬをｐＨメーター（(株)堀場製作所＃ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ　ＡＳ－７１２）の測定電極皿に入れ、そのｐＨを測定することで行った。
　　（　イオン強度算出　）
　コラーゲンゾルに含まれる化合物（コラーゲンを除く）のイオン種Ａ、Ｂ、Ｃ．．．それぞれのモル濃度（mol/L）をｍＡ、ｍＢ、ｍＣ．．．、それぞれの電荷数をＺＡ、ＺＢ、ＺＣ．．．とするとき、そのコラーゲンゾルのイオン強度Ｉは下式で定義される。
式１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　　　（　膜強度測定　）
　実施例１～３、実施例８、実施例１０、実施例１２、実施例１８、実施例２３～２５、実施例２７、実施例２９～３１及び比較例１の精製コラーゲンビトリゲル（水和体）の膜強度を測定した。精製コラーゲンビトリゲル（水和体）の膜強度は以下の方法により測定した。すなわち、直径３４．８ｍｍの精製コラーゲンビトリゲル（乾燥体）を８ｍｌのＤ‐ＰＢＳ（－）に浸漬して１時間再水和した。水和により得られた精製コラーゲンビトリゲル（水和体）を中央に直径５ｍｍの穴の開いた直径５０ｍｍのアクリル板２枚で挟み固定した。この直径５ｍｍの穴から覗く固定された膜に対して、直径１.０ｍｍのステンレス製針を垂直に、３.０ｍｍ／ｍｉｎの速度で突き刺し、針が精製コラーゲンビトリゲル（水和体）を貫通するまでの最大応力（Ｎ）を小型卓上試験機（(株)島津製作所＃ＥＺ‐ＳＸ、ロードセル最大荷重５Ｎ）を用いて測定した。精製コラーゲンビトリゲル（水和体）１つにつき３ヵ所について測定を行い、その平均値を最大応力（Ｎ）とした。この操作を３つの精製コラーゲンビトリゲル（水和体）に対して行い、３つの最大応力の平均値を膜強度（Ｎ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表１～表６から明らかなように、本発明方法により得られた精製コラーゲンビトリゲルは、十分な膜強度を有し、かつ無機塩以外の残留成分を実質的に含まず、生体的な安全性が高く、実用的なものであった。
　以上のように、本発明の製造方法によれば、簡単に、低コストで、生体的に安全性が高いコラーゲンビトリゲル及びその精製物が得られる。
　しかも、得られたコラーゲンビトリゲルや精製コラーゲンビトリゲルは、十分な膜強度を有し、工業的、機械的に製造、加工が容易であり、取扱いやすく、安全性が高いものであるため、種々の生体移植材料、例えば、再生医療用細胞担体、創傷被覆材、人工皮膚、癒着防止材等として有用なものである。

 

Claims (26)

  1. 　コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩よりなる群から選ばれる化合物とを含有するゲル化剤でゲル化し、次いで得られたコラーゲンゲルをガラス化し、更にこれを水和処理に付すことを特徴とするコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  2. 　前記コラーゲンがブタ皮膚由来アテロコラーゲンである、請求項１に記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  3. 　コラーゲンとゲル化剤の混合物の２５℃におけるｐＨが、６.２～９.８である、請求項１または２記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  4. 　コラーゲンとゲル化剤の混合物中に含まれる化合物のイオン強度が、０.０７～０.２２である、請求項１ないし３のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  5. 　前記無機炭酸塩類が無機炭酸塩または無機炭酸水素塩である請求項１ないし４のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  6. 　前記無機炭酸塩が、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムである、請求項５記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  7. 　前記無機炭酸水素塩が、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムである、請求項５または６記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  8. 　前記無機塩化物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項１ないし７のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
  9. 　前記無機リン酸塩が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸二水素カルシウムよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項１ないし８のいずれかの項に記載のコラーゲンビトリゲル製造方法。
  10. 　前記ゲル化剤が、培地成分および有機緩衝剤成分由来の有機成分を含まないものである請求項１ないし９のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲル製造方法。
  11. 　請求項１ないし１０のいずれかの項記載の製造方法で調製したコラーゲンビトリゲルを、脱塩、平衡化することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル水和体の製造方法。
  12. 　請求項１１の製造方法で調製した精製コラーゲンビトリゲル水和体を、更に乾燥して再ガラス化することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル乾燥体の製造方法。
  13. 　請求項１２の製造方法で調製した精製コラーゲンビトリゲル乾燥体を、更に再水和することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル水和体の製造方法。
  14. 　請求項１ないし１０のいずれかの項記載の方法により得られるコラーゲンビトリゲル。
  15. 　少なくとも請求項１４記載のコラーゲンビトリゲルを含む生体移植材料。
  16. 　使用前に細胞を担持しないものである、請求項１５に記載の生体移植材料。
  17. 　少なくとも請求項１４記載のコラーゲンビトリゲルを含む医療用人工皮膚。
  18. 　請求項第１１項または請求項第１３項のいずれかの項記載の方法により得られる精製コラーゲンビトリゲル水和体。
  19. 　少なくとも請求項１８記載の精製コラーゲンビトリゲル水和物を含む生体移植材料。
  20. 　使用前に細胞を担持しないものである、請求項１９に記載の生体移植材料。
  21. 　少なくとも請求項１８記載の精製コラーゲンビトリゲル水和物を含む医療用人工皮膚。
  22. 　請求項第１２項記載の方法により得られる精製コラーゲンビトリゲル乾燥体。
  23. 　少なくとも請求項２２記載の精製コラーゲンビトリゲル乾燥体を含む生体移植材料。
  24. 　使用前に細胞を担持しないものである、請求項２３に記載の生体移植材料。
  25. 　少なくとも請求項２２記載の精製コラーゲンビトリゲル乾燥体を含む医療用人工皮膚。
  26. 　コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩からなる群より選ばれる化合物とを含有するゲル化剤でゲル化し、次いで得られたコラーゲンゲルをガラス化することにより得られるコラーゲンゲル乾燥体。

     
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