WO2019066263A1 - Nckap1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Nckap1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel use of the NCKAP1 gene in a neurodegenerative disease, and more particularly to a marker composition for predicting the prognosis of a neural degenerative disease comprising a NCKAP1 protein or a gene encoding the protein, mRNA level of a neurodegenerative disease, and a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease comprising the protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • Neurodegenerative Disease is a disease that causes movement control ability, cognitive function, cognitive function, sensory function and autonomic dysfunction due to nerve structure and loss of function.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • microglia are the main cells affecting neuroinflammation of neurodegenerative diseases. They are responsible for synapse remodeling, secretion of various nerve growth factors, and various debris accumulated in the brain, neuronal integrity, and death, thereby playing an important role in maintaining the homeostasis of the body.
  • microglia are activated by various unfolded or aggregated proteins (eg, amyloid- ⁇ , ⁇ - synuclein, SOD1 that causes Lou Gehrig's disease, TDP-43 that causes temporal dementia, etc.), as well as numerical changes and dysfunctions act as irritants for inflammatory responses, causing neuroinflammation, affecting the development of neurodegenerative diseases and the progress of disease (Mol Neurobiol. 2016 Nov 9. [Epub ahead of print]).
  • the neuronal degeneration of the neurogenic cells in the neurodegenerative diseases is caused by the loss of microglial cells. Therefore, attention has been focused on the treatment of neurodegenerative diseases by controlling the function of microglial cells in addition to the conventional treatment methods.
  • the present inventors analyzed the functions of microglia derived from patients having different disease progression in representative cases of neurodegenerative diseases such as Lou Gehrig's disease and Alzheimer's disease. As a result, the expression of NCKAP1 was decreased in patient-derived microglia And functional abnormalities, and confirmed that the function of microglial cells was restored by regulating the expression of NCKAP1, thereby completing the present invention.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • gene encoding the protein comprising a NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein.
  • the present invention also provides a composition for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease and a prognosis prediction kit comprising the composition, which comprises an agent for measuring the mRNA level of an NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein Provide for other purposes.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease comprising an NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a marker composition for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease, comprising a NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • the present invention also provides a composition for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease and a prognosis prediction kit comprising the composition, which comprises an agent for measuring the mRNA level of an NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein to provide.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • the NCKAP1 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the NCKAP1 protein may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the neurodegenerative disease may be Amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, or Parkinson's disease.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by the gene.
  • the agent for measuring the mRNA level may be a sense and antisense primer that binds complementarily to the mRNA of the gene, or a probe.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising an NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • the composition may activate the predatory function of the cell through an actin polymerization reaction in microglial cells.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease.
  • the present inventors observed that the expression of NCKAP1 gene was decreased in microglial cells derived from patients with neurodegenerative diseases, which exhibited abnormal phagocytotic function, and that the gene was involved in actin polymerization of microglial cells, The experiment was confirmed. Accordingly, the pharmaceutical composition containing the NCKAP1 protein or the gene encoding the NCKAP1 protein according to the present invention, unlike the conventional therapeutic agent for inducing immunosuppression, selectively controls only specific signal transduction related to the phagocytosis of microglia, The NCKAP1 protein or a gene encoding the NCKAP1 protein may be useful for predicting the disease progression rate and treatment outcome as a marker for predicting prognosis of a neurodegenerative disease.
  • FIG. 1 shows the characteristics of two groups of patients with Lou Gehrig's disease in which the degree of disease progression involved in an embodiment of the present invention is different.
  • FIG. 2A shows the expression patterns of P2ry12, which is a phenotypic marker of microglial cells, by immunocytochemistry in microglia (ALS (S) and ALS (R)) derived from peripheral blood stem cells derived from patients with Lou Gehrig's disease, and the expression of iba-1 protein.
  • FIG. 2B shows mRNA expression levels of P2ry12, iba-1, Olfml3, Tgf-beta r1 and Tmem119, which are phenotypic markers of microglial cells, through qRT-PCR in microglia derived from peripheral blood derived from patients with Lou Gehrig's disease .
  • FIG. 2c shows the results of measurement of expression levels of CD11b and CD45 mRNA, which are phenotypic markers of microglial cells, in the same manner as FIG. 2b.
  • FIG. 3A shows the results of analysis of the predatory function of microglial cells (ALS (slow) and ALS (Rapid)) derived from peripheral blood stem cells derived from patients with Lou Gehrig's disease having slow progression and fast progression through immunostaining.
  • 4A is a transcript analysis result of microglial cells (S / C and R / C) derived from peripheral blood derived from Lou Gehrig's disease patients having slow progression and fast progression, respectively.
  • Figure 4b shows the results of a heat map comparing the expression levels of transcription-related transcripts in the microglial cells (S / C and R / C) derived from peripheral blood mononuclear cells derived from patients with Lou Gehrig's disease, respectively, with slow progression and fast progression .
  • FIG. 5A shows the results of measurement of NCKAP1 mRNA levels by qRT-PCR in microglia (ALS (slow) and ALS (Rapid)) derived from peripheral blood derived from ALS patients having slow progression and fast progression rates respectively.
  • Figure 5b shows the levels of NCKAP1 protein in the microglia (ALS i-MG (S) and ALS i-MG (R)) derived from peripheral blood mononuclear cells derived from ALS patients with slow progression and fast progression, respectively, The results are analyzed.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the expression level of NCKAP1 mRNA in the spinal cord tissues of a mouse model induced by ALS (30, 60, 90 and 120 days).
  • FIG. 7 shows the results of analysis of the phagocytosis of microglia derived from patients with Lou Gehrig's disease according to the regulation of NCKAP1 expression.
  • microglia ALS (S) -iMG and ALS R) -iMG
  • S ALS
  • R ALS R
  • O overexpression
  • Figure 8 shows results of real-time imaging of the predation of microglial cells (AD (S) -iMG and AD (R) -iMG) derived from peripheral blood derived from Alzheimer's disease patients with slow progression and fast progression, respectively .
  • Figure 10b shows the inhibition of the expression of NCKAPl (ALS (S) + NCKAP1) in patient-derived microglia with slow progression or overexpression of NCKAP1 in patient-derived microglia O / E), and the expression of F-actin was analyzed.
  • Fig. 11 shows immunostaining results showing that NCKAP1 is involved in phagocytic cup formation by actin dynamics in microglia derived from patients with Lou Gehrig's disease.
  • NCKAP1 NCKAP1
  • the present invention provides a marker composition for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease, comprising a NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • the present invention also relates to a composition for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease and a prognosis of a neurodegenerative disease comprising the composition, which comprises an agent for measuring an mRNA level of an NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein And provides a prediction kit.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • the NCKAP1 protein may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the gene encoding the protein may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Neurodegenerative disease &quot as a disease to be treated in the present invention means a disease in which exercise control ability, cognitive function, perception function, sensory function and autonomic dysfunction are induced by loss of nerve structure and function. Since nerve cells are damaged or destroyed, it is difficult to recover and regenerate them. Therefore, it is possible to leave a serious aftereffects after the onset, and effective therapeutic agents have not been developed so far. Therefore, it is urgent to develop an effective therapeutic agent which can predict the progress of neurodegenerative diseases and the result of treatment and the risk of useful markers and side effects.
  • the neurodegenerative diseases include, but are not limited to, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer ' s disease, or Parkinson ' s disease.
  • the term " prognosis &quot refers to a prediction of the progression or recovery of a disease, and refers to an outlook or a preliminary evaluation.
  • the prognosis refers to a prediction of the progression, treatment result, or recovery of a neurodegenerative disease, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by the gene, but is not limited thereto.
  • the term " antibody " includes immunoglobulin molecules immunologically reactive with specific antigens and includes both monoclonal and polyclonal antibodies.
  • the antibody also includes forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (e. G., Humanized murine antibodies) and heterologous binding antibodies (e. G., Bispecific antibodies).
  • the agent for measuring the mRNA level may be a sense and antisense primer that binds complementarily to the mRNA of the gene, or a probe.
  • &quot refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA of a length of several hundreds to several hundreds of nucleotides prepared through enzymatic chemical separation purification or synthesis. Radioactive isotopes or enzymes can be labeled to confirm the presence or absence of mRNA and can be designed and modified by known methods.
  • the prognostic prediction kit of the present invention comprises one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit of the present invention includes a genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of a DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer solution and water May be included.
  • the PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2.
  • components necessary for conducting electrophoresis to confirm whether the PCR product is amplified can be further included in the kit of the present invention.
  • kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits can be used for the detection of enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC DEPC-water, sterile water, and the like. It may also contain a primer pair specific for the gene used as a quantitative control.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative structural gene or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • kits of the present invention may be a kit comprising essential elements necessary for performing ELISA.
  • An ELISA kit comprises an antibody specific for a marker protein and comprises an agent that measures said protein level.
  • the ELISA kit may comprise a reagent capable of detecting an antibody that forms an " antigen-antibody complex ", such as a labeled secondary antibody, chromopores, an enzyme, and its substrate.
  • antibodies specific for the quantitation control protein may be included.
  • the term " antigen-antibody complex " refers to a combination of a protein encoded by a gene and an antibody specific thereto.
  • the amount of antigen-antibody complex formed can be determined quantitatively through the size of the signal of the detection label.
  • detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, minerals, ligands, emitters, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for providing information for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease, comprising the step of measuring the mRNA level of the NCKAP1 protein or the gene encoding the protein in a biological sample derived from the subject.
  • the biological sample derived from the subject may include tissues, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid and urine, and more preferably, blood, but is not limited thereto.
  • the term " information providing method for predicting prognosis of neurodegenerative diseases " used in the present invention is a preliminary step for predicting prognosis, which provides objective basic information necessary for predicting the prognosis of neurodegenerative diseases, The findings are excluded.
  • NCKAP1 expression was inhibited in a cell in which dysfunctional dysfunction was observed in microglia derived from patients with Lou Gehrig's disease having different degrees of disease progression, .
  • microglia cells derived from peripheral blood mononuclear cells derived from Lou Gehrig's disease patients having different degrees of disease progression were obtained, respectively.
  • Dysfunction of the predatory action was observed (see Example 3).
  • the mRNA and protein levels of the gene were measured in microglial cells derived from patients with Lou Gehrig's disease, respectively, in order to test the expression level of the NCKAP1 gene. And the mRNA level of the gene in the spinal cord tissues of the mouse model induced by Lou Gehrig's disease was found to be decreased toward the end of the Lou Gehrig's disease See Example 5).
  • NCKAP1 protein or a gene encoding the protein can be used as a molecular marker for predicting the prognosis of a neurodegenerative disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising NCKAP1 (NCK associated protein 1) protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • NCKAP1 NCK associated protein 1
  • &quot prevention &quot
  • &quot treatment " refers to any action that improves or alters the symptoms of a neurodegenerative disease by the administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the effect of regulating the expression level of the NCKAP1 gene in the microglia derived from patients with Lou Gehrig's disease and Alzheimer's disease having predominant dysfunctions was confirmed.
  • microscopic glial cells derived from patients with Lou Gehrig's disease and Alzheimer's disease showing normal function and dysfunction of predation were observed.
  • NCKAP1 gene was knocked down or overexpressed in the cells, It was confirmed that the normal predatory function was lowered by NCKAP1 knockdown and the function of predation was restored by overexpression of the gene (see Examples 6 and 7).
  • NCKAP1 activates the phagocytic function in microglial cells derived from patients with neurodegenerative diseases. Therefore, the NCKAP1 protein or the gene encoding the protein can be effectively used for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain a NCKAP1 protein or a gene encoding the protein as an active ingredient, and may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers are those conventionally used in the field of application and include, but are not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, And may further contain other conventional additives such as antioxidants and buffers as needed.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be suitably formulated according to the respective ingredients using the methods disclosed in Remington's reference.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited to a formulation, but may be formulated into injections, inhalants, external skin preparations, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the intended method, but preferably can be administered orally, Depends on the condition and the weight of the patient, the degree of the disease, the type of the drug, the administration route and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat or diagnose a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, The activity of the compound, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, sequentially or concurrently with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, body weight, the degree of absorption of the active ingredient in the body, the rate of inactivation and the excretion rate, the type of disease, 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight, may be administered daily or every other day, or one to three divided doses per day.
  • the dosage may be varied depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc. Therefore, the dosage is not limited to the scope of the present invention by any means.
  • the present invention of the present invention includes the steps of processing the candidate agent on the cells in vitro; Measuring the expression or activity of the NCKAP1 gene in the cell; And selecting a substance that increases expression or activity of NCKAP1 as a therapeutic substance for a neurodegenerative disease compared with the candidate substance non-treated group.
  • the cell may be a microglia derived from a patient suffering from a neurodegenerative disease, but is not limited thereto.
  • the candidate substance may be selected from the group consisting of a compound, a microorganism culture solution or extract, a natural product extract, a nucleic acid, and a peptide, but is not limited thereto.
  • NCKAP1 The expression or activity of the NCKAP1 gene can be measured by PCR, microarray, northern blotting, western blotting, ELISA, immunoprecipitation immunoprecipitation, immunohistochemistry, and immunofluorescence. < Desc / Clms Page number 7 >
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • &quot refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically refers to a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, Of mammals.
  • the present invention provides a use of the composition for the prevention or treatment of a neurodegenerative disease.
  • a slow-progressing patient was defined as a patient progressing at a rate of 0.5 delta ALSFRS-R score / month at the time of blood collection Respectively.
  • iMG induced microglia-like
  • iMG induced microglia-like
  • peripheral blood mononuclear cells 10 ml of peripheral blood (10 cc) was injected from healthy adult volunteers and 11 patients with Lou Gehrig's disease using the heparin tube Were collected.
  • peripheral blood mononuclear cells were separated from the peripheral blood by density gradient centrifugation of Histopaque-1077 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), and then 10% fetal bovine serum (FBS, (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) medium containing 1% antibiotic / antibacterial agent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
  • FBS fetal bovine serum
  • the cultured peripheral blood mononuclear cells were then placed in a culture chamber at a density of 500,000 cells / ml and cultured overnight under standard culture conditions (37 ° C, 5% CO 2 ). The medium was carefully removed, and 1% antibiotics / (Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA) supplemented with recombinant human GM-CSF (10 ng / ml; R & D Systems, Minneapolis, Minn.) And recombinant human IL-34 (100 ng / ) Monocytes were cultured using an adherent cell culture medium to induce induced microglial cell-like cells (iMG cells). After 14 days of incubation, the culture plates were washed thoroughly to remove floating cells, fresh medium was added, and cells were collected or used for functional analysis up to 21 days.
  • iMG cells induced microglial cell-like cells
  • iMG cells prepared by the method of Example 1-2 had micro-glial cell characteristics
  • P2ry12 and Iba-1 were used as microglial cell phenotype markers. More specifically, iMG cells were washed with PBS, fixed with 4% formaldehyde, and then treated with 0.1% Triton X-100 for 5 minutes to increase the permeability of the cell membrane and incubated with rabbit anti-P2ry12 antibody (# ab86195, 1 : 100, abcam) and mouse anti-Iba-1 antibody (# ab15690, 1: 100, abcam).
  • each antibody was diluted with 0.1% Triton-X 100 diluted with PBS containing 5% normal goat serum, and the cells were treated and incubated overnight at 4 ° C. Cells were then rinsed three times with PBS (-) for 5 minutes and then reacted by treatment with a secondary antibody conjugated with anti-rabbit Alexa 546 and anti-mouse Alexa 488 (Invitrogen, CA, USA). The protein was then visualized using donkey anti-rabbit immunoglobulin G antibody (1: 400 dilution, Invitrogen) conjugated with rhodamine-phalloidin according to the manufacturer's protocol.
  • CDIb Qiagen, Germany, PPH00644F
  • CD45 Qiagen, Germany, PPH01510C
  • P2ry12 SEQ ID NO: 12
  • EcoDryTM cDNA kit Clontech, CA, USA
  • Olfml3 Qiagen, Germany, PPH07681A
  • TGF-beta r1 Qiagen, Germany, PPH00237C
  • CD206 Qiagen, Germany, PPH09939B
  • Tmem119 The expression levels of mNckap1 (Qiagen, Germany, PPM26732A) and GAPDH (Qiagen, Germany, PPH00150F) mRNA were measured.
  • the cDNAs were treated with Power SYBR Green PCR Master Mix and specific primers for each gene, and PCR was carried out using an Applied Biosystems Step One Plus TM system (Life Technologies, USA) at 95 ° C. for 10 minutes, 95 ° C. for 15 seconds, Minute was repeated for 40 cycles to amplify the cDNA.
  • the specificity of the amplification was verified by generating a melting curve during the amplification reaction and the relative standard deviation (RQ) was calculated by the 2 - ⁇ Ct method using GAPDH as an intermittent standard control. The experiment was repeated three times independently to obtain the results.
  • red fluorescent latex beads (2 ⁇ m, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) were added to microglial cell-like cells induced by culturing for 21 days according to the method of Example 1-2. Missouri, USA) and incubated in a 37 ° C incubator for 4 hours. The cells were then washed twice with cold PBS, fixed, and stained with DAPI. Cells were then observed and analyzed with a confocal microscope (TCS SP5, Leica, Wetzlar, Germany) and the number of beads ingested by cellular perturbation was considered to indicate predominant activity.
  • TCS SP5 confocal microscope
  • RNA extracted from the control and test groups a library was prepared using a sense 3 'mRNA-Seq library preparation kit (Lexogen, Inc. Austria) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 500 ng of total RNA was prepared, and the oligo-dT primer containing the Illumina-compatible sequence was hybridized to the 5 'end of the RNA to perform a reverse transcription reaction. After degradation of the RNA template, the second strand synthesis was carried out using a random primer containing an Illumina-compatible linker sequence at its 5 ' end. The double-stranded library was purified using magnetic beads to remove all reaction components. In addition, the library was amplified to add the entire adapter sequence required for cluster creation. The completed library was purified by PCR and high-throughput sequencing was performed with single-ended 75 sequencing using NextSeq 500 (Illumina, Inc., USA).
  • Sense 3 ' mRNA-sequence leads were sorted using Bowtie2 version 2.1.0 (Langmead and Salzberg, 2012).
  • the Bowtie2 index was constructed from the genomic sequence or a representative transcript sequence for genome and transcript alignment. Alignment files were used to collect transcripts, estimate their expression levels, and detect differential expression levels of genes.
  • the differentially expressed genes are R version 3.2.2 (R Development Core Team (2011), R: Language and Environment for Statistical Computing, Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing, using BIOCONDUCTOR version 3.0.) ISBN: 3 -900051-07-0, available online at http://www.R-project.org/), based on the coefficients of the unique and multiple alignments using EdgeR.
  • RT Read Count
  • Genowiz TM version 4.0.5.6
  • Gene classifications were based on results from DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) and the Medline database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • Sample and gene clustering were performed using MeV 4.9.0.
  • Hierarchical cluster analysis was performed by measuring the distance with an average correlation using Euclidean distance correlation. Clusters and heat maps were performed using MeV 4.9.0 Visualization.
  • BGSJL-Tg (SOD1-G93A) 1Gur / J mice were purchased from Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) and cultured according to the protocol of the supplier under the 12 hour light and dark cycle. The presence of the human G93A transgene was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and the number of copies of the transgene was evaluated. In mice with this strain, early and late symptoms of Lou Gehrig appear to be present at about 77 and 136 days, the inventors divided the SOD1-G93A mice into three groups at each time point, namely 60 days (asymptomatic), 90 days (Initial symptoms) and 120 days (late symptoms). B6SJLF1 / J was purchased as a wild-type (WT) mouse and used as a control. All animal experiments were conducted with the approval of the Experimental Animal Management Committee of Hanyang University.
  • NCKAP1, NM_013436 cDNA ORF clone (OriGene Technologies, Rockville, Md., USA) or 2 days before analysis for the overexpression or knockdown of the human NCKAP1 gene in the cell pGFP-C-shLenti-NCKAP1 Human shRNA lentivirus particle (Gene ID 10787, OriGene Technologies) was introduced into the cells. Gene knockdown efficiency was verified by qRT-PCR and protein expression levels.
  • Cultured iMG cells were cultured in imaging dishes (chamber slides Lab-Tek II 4, Fisher) and then imaged with a rhodamine fluorophore and F-actin-conjugated low molecular weight was labeled using 100 nM of SiR-actin dye (Cytoskeleton Inc., North America, USA and CA) based on phalloidin. Cells were then washed twice with PBS, replaced with fresh medium, and then treated with 3 ⁇ l of latex beads (1.1 ⁇ m, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) before analysis to visualize predation . The real - time images were taken one frame every 1 minute and 30 seconds for 4 hours, and were performed using a DeltaVision fluorescence microscope system (Applied Precision) installed at Hanyang University Research Center.
  • a rhodamine fluorophore and F-actin-conjugated low molecular weight was labeled using 100 nM of SiR-actin dye (Cytoskeleton Inc
  • the experimental results are expressed as mean ⁇ standard error (means ⁇ SEM). The significance between groups was assessed using Student's t test and one way ANOVA using Prism Version 7.0 software, and P-value ⁇ 0.05 was considered significant.
  • Example 2 Phenotypic analysis of microglial cells derived from peripheral blood derived from patients with Lou Gehrig's disease
  • immunocytochemical staining and real-time PCR were performed on the iMG cells according to the methods of Examples 1-3 and 1-4, and the core genes of microglial cells P2ry12, iba -1, Olfml3, Tgf-? R1, Tmem119, CD11b, and CD45.
  • microglial cell-like cells derived from peripheral blood derived from Lou Gehrig's disease patients had microglial cell characteristics.
  • Example 3 Analysis of predation of microglial cells derived from peripheral blood derived from patients with Lou Gehrig's disease
  • Example 2 the aim was to analyze the predatory function of microglia cells derived from patients with Lou Gehrig's disease.
  • ALS slow
  • ALS Rapid
  • ALS Rapid
  • ALS Rapid
  • ALS Rapid
  • Fig. 3A immunological staining resulted in severe predation dysfunction in ALS (Rapid). Also, through FIG. 3B, it was confirmed that the red fluorescence was clearly observed only in the case of ALS (slow), and the predatory action actively occurred only in ALS (slow). The above results confirmed the phagocytosis function in microglial cells derived from peripheral blood derived from patients with Lou Gehrig's disease, and observed that this action occurs only in patients with Lou Gehrig's disease with a slow progression rate.
  • RNA sequencing was performed according to the methods of Examples 1-6 and 1-7 To perform transcript analysis of microglial cells derived from patients having different degrees of disease progression.
  • NCKAP1 gene found in Example 4 was found in Example 4 in microglial cells derived from patients with Lou Gehrig's disease having different degrees of disease progression. qRT-PCR and immunocytochemical staining were performed to measure mRNA and protein expression of the gene Respectively.
  • NCKAP1 mRNA was greatly reduced in patient-derived microglia (ALS (Rapid)) having a rapid rate of progression as shown in FIG. 5A.
  • ALS i-MG (R) which has a high rate of progression.
  • the present inventors measured the expression level of NCKAP1 mRNA in the spinal cord tissues of the mouse model of Lou Gehrig's disease prepared by the method of Example 1-8.
  • Example 6 Analysis of the effect of NCKAP1 expression on the phagocytic function of microglia derived from patients with Lou Gehrig's disease
  • NCKAP1 was overexpressed or knocked down in the microglial cells according to the method of Example 1-9, and changes in the predatory function of the cells were photographed and analyzed by real-time imaging.
  • NCKAP1 shNCKAP1
  • S patient-derived microglia
  • ALS (S) -iMG patient-derived microglia
  • Fig. 7 a slow rate of progression as shown in Fig. 7
  • NCKAP1 was overexpressed (O / E) in patient-derived microglia (ALS (R) -iMG) with rapid progression rate, it was confirmed that the predatory function was restored.
  • NCKAP1 gene can regulate the phagocytotic function of microglial cells derived from patients with Lou Gehrig's disease.
  • Example 7 Phagocytosis of microglial cells derived from peripheral blood derived from Alzheimer's disease patients and control function by NCKAP1
  • NCKAP1 gene affects phagocytic function in Alzheimer's disease, another neurodegenerative disease. Specifically, in order to investigate whether phenotypic functions differ depending on the degree of disease progression similar to that in Example 3, it is necessary to determine whether or not the proliferation rate of the progenitor cells derived from peripheral blood derived from Alzheimer's disease patients having slow progression and rapid progression progression In the microglial cells (AD (R) -iMG and AD (S) -iMG), predatory action was observed in real time according to the method of Example 1-9.
  • AD (R) -iMG and AD (S) -iMG microglial cells
  • AD (R) -iMG microglia derived from Alzheimer's disease patients having a rapid progression rate similar to that in the patients with Lou Gehrig's disease.
  • Example 7-1 Based on the results of Example 7-1, we investigated whether the predation function of microglial cells derived from patients with Lou Gehrig's disease changes according to the expression level of NCKAP1.
  • NCKAP1 was overexpressed or knocked down in the microglial cells according to the method of Example 1-9, and the changes in the predatory function of the cells were photographed and analyzed in real time.
  • NCKAP1 was inhibited (shNCKAP1) by shRNA in patient-derived microglia (AD (S) -iMG) having a slow progression rate as shown in Fig. 9, In contrast, it was observed that the predatory action of the cells was remarkably reduced. In contrast, when NCKAP1 was overexpressed (O / E) in patient-derived microglia (AD (R) -iMG) with rapid progression rate, it was confirmed that the predatory function was restored.
  • NCKAP1 gene regulates the phagocytotic function of microglial cells derived from Alzheimer's disease patients.
  • NCKAP1 can regulate the predatory function of microglia derived from patients with Lou Gehrig's disease and Alzheimer's disease through the results of the above examples.
  • the present inventors have found that the gene is involved in actin polymerization of cells and regulates cellular proliferation .
  • NCKAP1 GFP-NCKAP1
  • shNCKAP1 knockdown
  • NCKAP1 regulates phagocytosis by participating in actin polymerization in patient-derived microglia.
  • NCKAP1 function in phagocytic cup formation by actin mechanics
  • Example 8-1 confirm that NCKAP1 is involved in actin polymerization, and furthermore, it is analyzed whether it affects phagocytic cup formation by actin dynamics (actin dynamics).
  • the present invention relates to a technique capable of developing a therapeutic agent for a neurodegenerative disease by selectively controlling only specific signal transduction related to the phagocytosis of microglia using a NCKAP1 protein or a gene encoding the NCKAP1 protein that regulates the phagocytic function in microglia
  • the NCKAP1 gene is a marker for predicting the prognosis of neurodegenerative diseases, and is useful for predicting disease progression rate and treatment outcome.
  • the technique according to the present invention can be widely used in the field of prognosis prediction of neurodegenerative diseases and therapeutic drug development.

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Abstract

본 발명은 신경계 퇴행성질환에서 NCKAP1 유전자의 신규 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예후예측용 마커 조성물, 상기 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 조성물 및 키트, 및 상기 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NCKAP1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 약학적 조성물은 면역억제를 유도하는 기존 치료제와 달리 미세아교세포의 포식작용과 관련된 특정 신호전달만을 선택적으로 조절하므로 안전성 및 효율성이 높은 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이며, 상기 NCKAP1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자는 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커로써 질환의 진행 속도 및 치료 결과를 예측하는데 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

Description

NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 신경계 퇴행성질환에서 NCKAP1 유전자의 신규 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예후예측용 마커 조성물, 상기 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 조성물 및 키트, 및 상기 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경계 퇴행성질환(Neurodegenerative Disease)은 신경구조와 기능 상실에 의해 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 및 자율신경의 기능 이상을 유발하는 질환으로, 전 세계적으로 인구 고령화가 빠르게 진행되면서 루게릭병(근위축성 측삭경화증, Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD) 및 파킨슨병(Parkinson's disease; PD) 등의 신경계 퇴행성질환 환자가 빠르게 증가하고 있다. 이러한 신경계 퇴행성질환은 일단 손상되거나 사멸되고 나면 복구와 재생이 어려운 신경세포의 특성 때문에 중대한 후유증을 남기면서 정상 상태로 회복되지 못하고 계속 악화되면서 진행하는 경우가 많다. 따라서 이를 해결하고자 지난 수십 년 이상 국내외 연구가 활발히 진행되어 왔으나, 치료제 개발은 아직까지 매우 어려울 뿐만 아니라 정확한 원인조차 제대로 파악하지 못하고 있는 실정이다. 이러한 특성 때문에 대부분의 신경계 퇴행성질환들이 현재까지의 치료기술로는 완치가 불가능하며, 주로 진행속도를 조절하여 증상을 완화시키기 위한 신경전달 과정을 표적으로 하는데 초점이 맞춰지고 있다. 따라서, 신경계 퇴행성질환의 신규 치료 표적 및 치료제 개발이 시급한 실정이며, 상기 질환을 보다 조기에 진단하고 예후를 예측할 수 있는 마커의 발굴 또한 중요한 과제이다.
과거에는 신경계 퇴행성질환의 병리소견상 관찰되는 신경교세포(neuroglial cell)의 증식, 면역-염증에 관련된 세포 및 면역매개 물질의 침윤 등은 신경세포의 파괴에 따른 비특이적인 이차적 현상으로만 받아들여져 왔다. 그러나, 분자생물학의 발전으로 면역-염증 기전(immune-inflammatory mechanism)에 중요한 역할을 하는 세포들의 표피지표에 대한 동정이 가능해졌고, 면역-염증매개 물질들의 정체 및 기능들이 규명됨에 따라 면역-염증 기전이 신경계 손상에 대한 비특이적인 이차적 반응만이 아니고 신경계 퇴행성 질환의 진행경과 중 초기부터 관여할 수도 있으며, 병리현상의 완급을 조절하고 신경세포의 생존 및 사멸에 적극적으로 관여할 것이라는 증거들이 제시되고 있다. 따라서 이러한 연구결과들은 면역-염증반응을 조절하고 억제하는 치료가 퇴행성질환의 새로운 치료 전략으로 이용될 수 있는 근거가 된다.
한편, 미세아교세포(Microglia)는 신경계 퇴행성질환의 신경염증에 영향을 주는 주요세포로서 시냅스 리모델링, 다양한 신경성장인자의 분비, 뇌에 축적되는 다양한 찌꺼기(debris)를 제거하여 뇌의 신경세포 보존(neuronal integrity)과 사멸에 관여함으로써 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 최근 논문에 따르면 정상적인 환경에서는 이러한 미세아교세포의 기능이 잘 조절되지만, 신경계 퇴행성질환에서는 다양한 비접힘 또는 응집 단백질에 의해 미세아교세포가 활성화되며(예로, 알츠하이머병을 유발하는 amyloid-β, α-synuclein, 루게릭병을 유발하는 SOD1, 측두엽 치매를 유발하는 TDP-43 등), 더불어 수적 변화와 기능 이상이 염증반응의 자극제로 작용하여 신경염증을 유발하여 신경계 퇴행성질환의 발생 및 질병 진행 정도에 영향을 준다고 밝혀지면서 신경계 퇴행성질환에서 미세아교세포의 손실 또는 기능 이상 현상이 강조되고 있다(Mol Neurobiol. 2016 Nov 9. [Epub ahead of print]). 따라서 기존의 치료방법 이외에 미세아교세포의 기능 조절을 통한 신경계퇴행성 질환 치료에 관심이 집중되고 있다.
이에 본 발명자들은 대표적인 신경계 퇴행성질환인 루게릭병 및 알츠하이머병 환자에서 각각 다른 질병진행 정도를 갖는 환자유래 미세아교세포의 기능을 분석한 결과, 빠른 진행속도를 나타내는 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1의 발현 감소 및 기능 이상을 발견하였고, NCKAP1의 발현 조절에 의해 미세아교세포의 기능이 회복됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 예후 예측용 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 NCKAP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 NCKAP1 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 신경계 퇴행성질환은 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
또한, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 미세아교세포에서 액틴 중합화 반응을 통해 상기 세포의 포식작용 기능을 활성화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명자들은 포식작용 기능 이상을 나타내는 신경계 퇴행성질환 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1 유전자의 발현이 감소되어 있음을 관찰하였고, 상기 유전자가 미세아교세포의 액틴 중합반응에 관여하여 상기 세포의 포식작용 기능을 조절하는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 NCKAP1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 약학적 조성물은 면역억제를 유도하는 기존 치료제와 달리 미세아교세포의 포식작용과 관련된 특정 신호전달만을 선택적으로 조절하므로 안전성 및 효율성이 높은 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이며, 상기 NCKAP1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자는 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커로써 질환의 진행 속도 및 치료 결과를 예측하는데 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 참여한 질병의 진행 정도가 다른 루게릭병 환자 두 그룹의 특성을 보여주는 것이다.
도 2a는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(ALS(S) 및 ALS(R))에서 면역세포화학염색법으로 미세아교세포의 표현형 마커인 P2ry12 및 iba-1 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 2b는 루게릭병 환자 유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포에서 qRT-PCR을 통해 미세아교세포의 표현형 마커인 P2ry12, iba-1, Olfml3, Tgf-βr1 및 Tmem119의 mRNA 발현수준을 측정한 결과이다.
도 2c는 도 2b와 동일한 방법으로 미세아교세포의 표현형 마커인 CD11b 및 CD45 mRNA의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 3a는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(ALS(slow) 및 ALS(Rapid))의 포식작용 기능을 면역염색을 통해 분석한 결과이다.
도 3b는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(ALS(slow) 및 ALS(Rapid))에서 면역염색을 통해 단계별 포식작용 기능을 분석한 결과이다.
도 4a는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(S/C 및 R/C)의 전사체 분석 결과이다.
도 4b는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(S/C 및 R/C)에서 포식기능과 관련된 전사체의 발현수준을 비교한 히트맵 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(ALS(slow) 및 ALS(Rapid))에서 qRT-PCR을 통해 NCKAP1 mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 5b는 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(ALS i-MG(S) 및 ALS i-MG(R))에서 면역염색을 통해 NCKAP1 단백질 수준을 분석한 결과이다.
도 6은 루게릭병이 유발된 마우스 모델의 척수 조직에서 마우스 주령 즉, 루게릭병의 진행(30, 60, 90, 120 일(days))에 따른 NCKAP1 mRNA의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 7은 NCKAP1의 발현조절에 따른 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식작용 변화를 분석한 결과로서, 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(ALS (S)-iMG 및 ALS (R)-iMG)에서 각각 NCKAP1의 발현을 저해(shNCKAP1) 및 과발현(O/E)시킨 후 포식작용 기능 변화를 실시간 이미징을 통해 보여주는 결과이다.
도 8은 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 알츠하이머병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(AD (S)-iMG 및 AD (R)-iMG)의 포식작용을 실시간 이미징을 통해 보여주는 결과이다.
도 9는 NCKAP1의 발현조절에 따른 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포의 포식 기능변화를 분석한 결과로서, 각각 느린 진행 및 빠른 진행 속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(AD (S)-iMG 및 AD (R)-iMG)에서 각각 NCKAP1의 발현을 저해(sh NCKAP1) 및 과발현(O/E)시킨 후 포식작용 기능 변화를 실시간 이미징을 통해 보여주는 결과이다.
도 10a는 Hela 세포에서 NCKAP1의 과발현 또는 발현 저해에 따른 F-actin 단백질의 발현변화를 보여주는 결과이다.
도 10b는 느린 진행 속도를 갖는 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1의 발현을 저해(ALS (S)+shNCKAP1)시키거나 빠른 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1을 과발현(ALS (R)+NCKAP1 O/E)시킨 후 F-actin의 발현변화를 분석한 결과이다.
도 11은 루게릭병 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1이 액틴 역학(actin dynamic)에 의한 식세포 컵 형성(phagocytic cup formation)에 관여함을 보여주는 면역염색 결과이다.
본 발명자들은 신경계 퇴행성질환의 예후 예측 및 치료에 이용할 수 있는 NCKAP1의 신규 용도를 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 NCKAP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 대상으로 하는 질병인 “신경계 퇴행성질환”은 신경구조와 기능의 상실에 의해 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 및 자율신경의 기능 이상이 유발되는 질환을 의미한다. 신경세포는 손상되거나 사멸되면 복구와 재생이 어렵기 때문에 발병 후 중대한 후유증을 남길 수 있으며, 현재까지 효과적인 치료제가 개발되어 있지 않다. 따라서 신경계 퇴행성질환의 진행 경과 및 치료결과를 예측할 수 있는 유용한 마커 및 부작용 위험이 적은 효율적인 치료제 개발이 시급한 실정이다. 본 발명에 있어서 상기 신경계 퇴행성질환은 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예후(prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 신경계 퇴행성질환의 진행, 치료 결과, 또는 회복에 관한 예측을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 예후 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있고 보다 바람직하게는 혈액일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 “신경계 퇴행성질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법”은 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 신경계 퇴행성질환의 예후 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명자들은 질병의 진행 정도가 상이한 루게릭병 환자유래 미세아교세포에서 포식작용의 기능 이상이 관찰된 세포에서 NCKAP1의 발현이 저해되어 있음을 확인함으로써 상기 유전자와 환자유래 미세아교세포의 기능 이상 간에 밀접한 연관성이 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 질병의 진행 정도가 상이한 루게릭병 환자유래 말초혈액에서 유도된 미세아교세포 각각 얻었으며, 이들의 포식작용을 관찰한 결과 빠른 진행 속도를 갖는 환자유래 미세아교세포에서 심각한 포식작용의 기능 이상을 관찰하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 질병의 진행 속도가 느리거나 빠른 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 전사체 분석을 실시함으로써 차등적으로 발현되는 유전자들이 다수 존재함을 확인하였고, 상기 세포의 포식작용과 관련된 유전자들의 발현수준을 비교한 결과 포식 기능의 이상을 나타내는 미세아교세포에서 NCKAP1 유전자의 발현이 크게 감소되어 있는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, NCKAP1 유전자의 발현수준을 다시 검증하기 위해 각각 질병의 진행 정도가 다른 루게릭병 환자 유래 미세아교세포에서 상기 유전자의 mRNA 및 단백질 수준을 측정한 결과 포식작용의 기능 이상을 나타내는 빠른 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포에서 발현수준이 매우 낮은 것을 확인하였으며, 루게릭병을 유발시킨 마우스 모델의 척수조직에서도 상기 유전자의 mRNA 수준이 루게릭병 말기로 갈수록 감소되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
상기 결과들을 통해 NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자가 신경계 퇴행성질환의 예후 예측을 위한 분자 마커로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경계 퇴행성질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경계 퇴행성질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서는 포식작용의 기능 이상을 갖는 루게릭병 및 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1 유전자의 발현수준 조절을 통한 기능 회복 효과를 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 포식작용에 대한 정상 기능 및 기능 이상을 나타내는 루게릭병 및 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포를 관찰하였고, 상기 세포들에서 각각 NCKAP1 유전자의 발현을 넉다운시키거나 과발현시켰을 때, NCKAP1 넉다운에 의해 정상적인 포식기능이 저하되고 상기 유전자의 과발현에 의해 포식작용의 기능이 회복되는 것을 확인하였다(실시예 6 및 7 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, NCKAP1에 의한 포식작용 조절 기능이 어떠한 기전에 의해 일어나는지 분석한 결과, 상기 유전자의 발현수준에 따른 미세아교세포의 F-actin 발현변화를 확인함으로써 액틴 중합반응을 조절하여 포식작용을 조절함을 확인하였으며 또한 상기 유전자가 식세포 컵 형성에 관여함을 확인하였다(실시예 8 참조).
상기 결과들을 통해 NCKAP1이 신경계 퇴행성질환 환자유래 미세아교세포에서 포식작용 기능을 활성화시키는 것을 확인하였으며, 이에 NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 NCKAP1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 in vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 세포의 NCKAP1 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 후보물질 비처리군에 비해 NCKAP1의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 신경계 퇴행성질환의 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 신경계 퇴행성질환 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 세포는 신경계 퇴행성질환 환자유래 미세아교세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 NCKAP1 유전자의 발현 또는 활성 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물의 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 피검자 모집
본 실험은 한양대학교 윤리위원회의 승인을 받은 후 실시하였다. 구체적으로 본 발명자들은 루게릭병 진단기준인 개정된 El Escorial criteria에 따라 고발성 루게릭(sporadic ALS)으로 진단받은 11명의 루게릭병 환자(6명은 느린 진행 및 5명은 빠른 진행) 및 이들과 연령이 일치하는 2명의 건강한 성인 지원자를 등록하였으며, 상기 지원자 및 루게릭병 환자 모두 진행중인 전염병은 없는 것을 확인하였다. 상기 11명의 루게릭병 환자는 임상적으로 초기로 확인되었으며(ALSFRS-R 점수: 29-41), 질병의 진행은 AALS 점수의 변화, 시간의 변화, 초기 평가와 수집 시 평가 또는 분석 종료시의 평가와 비교하여 결정하였다. 질병이 빠르게 진행되는 환자는 1.5 델타 ALSFRS-R 점수/월 이상의 속도로 진행되는 환자로 정의하였고, 느리게 진행되는 환자는 혈액 수집 당시 0.5 델타 ALSFRS-R 점수/월 미만의 속도로 진행되는 환자로 정의하였다. 또한, 유도된 미세아교세포 유사(induced microglia-like; iMG) 세포를 확립하기 위해, 서면 동의서를 받은 후 상기 환자들로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 본 실험에 참가한 상기 환자들의 정보는 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
Patients Age(2016) Sex Age of onset(yr) ALSFRS-R score ALSFRS/mon Site of onset
S1 68 F 63 41 0.18 Lt. U/Ext. distal
S2 63 M 55 37 0.14 Rt. L/Ext.
S3 60 M 56 44 0.2 Axial wk.
S4 49 F 46 39 0.36 Lt. U/Ext. distal
S5 50 M 47 46 0.33 Rt. u/Ext. prox
S6 61 F 56 45 0.11 Rt. u/Ext. distal
R1 57 M 56 42 1.5 both u/Ext. (prox)
R2 49 F 47 39 1.8 Rt. L/Ext.
R3 57 M 55 29 1.73 Dysarthria, Rt. u/Ext. (distal)
R4 76 M - - -
R5 49 M 47 37 1.57 Dysarthria, Lt. U/Ext.
1-2. PBMC로부터 유도 미세아교세포 유사(induced microglia-like; iMG) 세포의 제조
말초혈액단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC)로부터 유도 미세아교세포 유사세포를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1-1의 건강한 성인 지원자와 11명의 루게릭병 환자로부터 헤파린 튜브를 사용하여 10cc의 말초 혈액을 채취하였다. 다음으로, Histopaque-1077(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 밀도 구배 원심분리법을 통해 상기 말초혈액으로부터 말초혈액단핵세포를 분리한 후, 열처리하여 불활성화시킨 10% 소태아혈청(FBS, Endotoxin 5 0.692 EU/ml, Japan Bio Serum, Hiroshima, Japan) 및 1% 항생제/항균제(Invitrogen, Carlsbad, CA)가 포함된 RPMI-1640(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) 배지로 배양하였다. 이후 배양한 말초혈액단핵세포를 500,000 세포/ml의 밀도로 배양 챔버에 분주하고 표준 배양 조건(37℃, 5% CO2)에서 밤새 배양한 다음, 배지를 조심스럽게 제거하고 1% 항생제/항균제, 재조합 인간 GM-CSF(10 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN), 및 재조합 인간 IL-34(100 ng/ml; R&D Systems)가 첨가된 RPMI-1640 Glutamax(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 배지를 이용해 부착세포인 단핵구(monocytes)를 배양하여 유도 미세아교세포 유사세포(iMG cell)가 되도록 하였다. 배양 14일 후 배양 플레이트를 완전히 세척하여 부유 세포를 제거하고 새로운 배지를 첨가한 다음 세포를 회수하거나 21일까지 기능 분석에 이용하였다.
1-3. 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)
상기 실시예 1-2의 방법으로 제조한 iMG 세포가 미세아교세포의 특성을 갖는지 검증하기 위해 P2ry12 및 Iba-1을 미세아교세포 표현형 마커로 이용하였다. 보다 상세하게, iMG 세포를 PBS로 세척하고 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정시킨 다음, 0.1 % Triton X-100을 5분 동안 처리하여 세포막의 투과성을 높이고 토끼 항-P2ry12 항체(#ab86195, 1:100, abcam) 및 마우스 항-Iba-1 항체(#ab15690, 1:100, abcam)를 이용하여 간접적 면역염색법을 실시하였다. 구체적으로, 5% 정상 염소 혈청을 함유한 PBS로 희석된 0.1% Triton-X 100으로 각 항체를 희석한 후 세포에 처리하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음으로 PBS(-)를 이용해 5분 동안 세포를 3회 헹군 다음, 항-토끼 Alexa 546 및 항-마우스 Alexa 488이 접합된 2차 항체(Invitrogen, CA, USA)를 처리하여 반응시켰다. 이후 제조사의 프로토콜에 따라 로다민-팔로이딘(Rhodamine-phalloidin)이 접합된 당나귀 항-토끼 면역글로불린 G 항체(1:400 희석액; invitrogen)를 이용하여 단백질을 시각화하였다. 한편, 세포를 4', 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI; Sigma, MO, USA)로 대조염색한 다음, Fluoromount-G(Cytomation; Dako)로 마운팅하였다. 형광 이미지는 공초점 현미경(TCS SP5, Leica, Wetzlar, Germany)으로 촬영하였다.
1-4. 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real time-polymerase chain reaction; qRT-PCR)
세포에 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 시약을 처리하여 총 RNA를 추출하고, 나노드롭(Thermo Scientific, ND-2000)을 이용해 RNA의 농도와 순도를 측정하였다. 상기 추출한 RNA를이용하여 EcoDryTM cDNA 키트(Clontech, CA, USA)로 cDNA를 합성한 다음, 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 CD11b(Qiagen, Germany, PPH00644F), CD45(Qiagen, Germany, PPH01510C), P2ry12(Qiagen, Germany, PPH02545B), Olfml3(Qiagen, Germany, PPH07681A), TGF-βr1(Qiagen, Germany, PPH00237C), CD206(Qiagen, Germany, PPH09939B), Tmem119(Qiagen, Germany, PPH21875A), Nckap1(Qiagen, Germany, PPH15666A), mNckap1(Qiagen, Germany, PPM26732A), 및 GAPDH(Qiagen, Germany, PPH00150F) mRNA의 발현수준을 측정하였다. 보다 구체적으로, cDNA에 Power SYBR Green PCR Master Mix와 각 유전자에 특이적인 프라이머를 처리하고 Applied Biosystems Step One PlusTM system(Life Technologies, USA)을 이용해 95℃에서 10분, 95℃ 15초 및 60℃ 1분 과정을 40 사이클 반복 수행하여 cDNA를 증폭시켰다. 증폭반응 시 융합 곡선(melting curve)을 생성하여 증폭의 특이성을 검증하였으며, 상대적 표준편차(relative quantity; RQ)는 간헐성 표준 대조군으로써 GAPDH를 사용하여 2-ΔΔCt 방법으로 계산하였다. 상기 방법을 통해 독립적으로 3회 반복 실험하여 결과를 도출하였다.
1-5. 포식작용 분석(Phagocytosis assay)
미세아교세포의 포식작용을 정량화하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 21일 동안 배양하여 유도한 미세아교세포 유사세포에 적색형광 라텍스 비드(2 μm, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 4 ㎕를 처리하고 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 다음으로 2 ml의 차가운 PBS를 처리하여 포식 활성을 중지시킨 후 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 고정시킨 다음 DAPI로 대조염색하였다. 이후 공초점현미경(TCS SP5, Leica, Wetzlar, Germany)으로 세포를 관찰 및 분석하였으며, 세포 당 포식작용에 의해 섭취된 비드의 수가 포식작용 활성을 나타내는 것으로 간주하였다.
1-6. 라이브러리 제조 및 RNA 서열분석
대조군과 시험군에서 추출한 RNA에 대하여, 제조사의 지시에 따라 센스 3 'mRNA-Seq 라이브러리 제조 키트(Lexogen, Inc. Austria)를 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 간단하게, 500 ng의 총 RNA를 각각 준비하고, RNA의 5 '말단에 Illumina 호환 서열을 포함하는 oligo-dT 프라이머를 혼성화시켜 역전사 반응을 실시하였다. RNA 주형의 분해 후, 제 2가닥 합성은 그것의 5' 말단에 Illumina-호환 링커 서열을 포함하는 랜덤 프라이머를 이용해 수행되도록 하였다. 이중가닥 라이브러리는 모든 반응 성분을 제거하기 위해 마그네틱 비드를 사용하여 정제하였다. 또한, 클러스터 생성에 필요한 전체 어댑터 서열을 추가하기 위해 라이브러리를 증폭시켰다. 완성된 라이브러리는 PCR로 정제하였으며, NextSeq 500(Illumina, Inc., USA)을 이용하여 단일-말단 75 시퀀싱으로 고속대량 서열분석(High-throughput sequencing)을 실시하였다.
1-7. 서열분석 결과 분석
센스 3' mRNA-서열 리드를 Bowtie2 버전 2.1.0(Langmead and Salzberg, 2012)을 이용하여 정렬하였다. Bowtie2 지수는 게놈 조립 서열 또는 게놈 및 전사체 정렬을 위한 대표적인 전사체 서열로부터 제조하였다. 정렬(alignment) 파일은 전사체를 모으고, 그 발현량을 추정하고, 유전자의 차등적인 발현 수준을 검출하는데 사용하였다. 차등적으로 발현되는 유전자는 BIOCONDUCTOR version 3.0을 이용하여 R 버전 3.2.2(R Development Core Team (2011), R: 통계 컴퓨팅을 위한 언어 및 환경, 오스트리아 비엔나: 통계 컴퓨팅을 위한 R 재단. ISBN: 3-900051-07-0. http://www.R-project.org/에서 온라인으로 이용 가능)내에서 EdgeR을 이용해 고유 및 다중 정렬의 계수를 기반으로 결정되었다.
RT(Read Count) 결과는 Genowiz™ 버전 4.0.5.6(Ocimum Biosolutions, India)을 이용하는 글로벌 표준화 방법에 기반하여 처리하였다. 유전자 분류는 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)와 Medline 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로 검색된 결과를 기반으로 하였다. 또한 MeV 4.9.0을 사용하여 샘플 및 유전자 클러스터링을 수행하였는데, 계층적 클러스터 분석은 Euclidean 거리 상관관계를 사용하여 평균 연관성을 갖는 거리를 측정하여 실시하였고, 클러스터 및 히트 맵은 MeV 4.9.0을 통해 시각화하였다.
1-8. 형질전환 SOD1-G93A 마우스 제조
B6SJL-Tg(SOD1-G93A) 1Gur/J 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였으며, 실험 전 12시간의 명암주기 하에서 공급자의 프로토콜에 따라 사육 하였다. 인간 G93A 형질전환 유전자의 존재는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 확인하였고 형질전환 유전자 카피 수를 평가하였다. 상기 스트레인을 갖는 마우스에서, 루게릭의 초기 및 말기 증상은 약 77 및 136일째에 나타난다고 알려져 있으므로, 본 발명자들은 SOD1-G93A 생쥐를 3개의 그룹으로 나누어 각 시점 즉, 60일(무증상), 90일(초기 증상) 및 120일(후기 증상)에 평가하였다. 야생형(WT) 마우스로는 B6SJLF1/J을 구입하여 대조군으로 사용하였다. 모든 동물 실험은 한양대학교 실험동물운영위원회의 승인을 받아 진행하였다.
1-9. 세포 내 NCKAP1 유전자의 과발현 및 발현저해 조작
세포 내에서 인간 NCKAP1 유전자를 과발현시키거나 또는 넉다운시키기 위해, 분석 2일 전 pLenti-C-mGFP-Human NCK-associated protein 1(NCKAP1, NM_013436) cDNA ORF 클론(OriGene Technologies, Rockville, MD, USA) 또는 pGFP-C-shLenti-NCKAP1 Human shRNA 렌티바이러스 파티클(Gene ID 10787, OriGene Technologies)을 세포에 도입하였다. 유전자 넉다운 효율은 qRT-PCR 및 단백질 발현수준 측정을 통해 검증하였다.
1-10. 세포의 포식작용 실시간 이미징
배양된 iMG 세포를 이미징 접시(챔버 슬라이드 Lab-Tek II 4, Fisher)에서 배양한 다음, 살아있는 세포의 세포골격을 이미지화 하기 위해 iMG 세포에 실리콘 로다민 형광단(rhodamine fluorophore)과 F-actin 결합 저분자인 팔로이딘(phalloidin)을 기반으로 하여 100 nM의 SiR-액틴 염료(Cytoskeleton Inc., 북미, 미국 및 CA)를 사용하여 표지하였다. 이후 세포를 PBS로 2회 세척하고, 새로운 배지로 교체한 다음 포식작용을 시각화하기 위해 분석 전 세포에 3 ㎕의 라텍스 비드(1.1 μm, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)를 처리하였다. 실시간 영상은 4시간 동안 1분 30초마다 한 프레임씩 촬영하였으며, 한양대학교 연구센터에 설치된 DeltaVision 형광 현미경 시스템(Applied Precision)을 이용하여 진행하였다.
1-11. 통계분석
실험 결과는 평균±표준오차 측정값(means±SEM)으로 나타내었다. 그룹간 유의성은 Prism Version 7.0 소프트웨어를 이용해 Student's t test 및 one way-ANOVA로 평가하였으며, P-value < 0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실시예 2. 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포의 표현형 분석
상기 실시예 1-1 및 1-2의 방법에 따라 질병의 진행 정도(slow/rapid progression)가 다른 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포 유사(iMG) 세포가 미세아교세포의 표현형을 갖는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 iMG 세포에 대하여 상기 실시예 1-3 및 1-4의 방법에 따라 면역세포화학염색법 및 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 실시하여 미세아교세포의 핵심유전자인 P2ry12, iba-1, Olfml3, Tgf-βr1, Tmem119, CD11b, 및 CD45의 발현 수준을 측정하였다.
먼저 면역세포화학염색법을 실시하여 각각 P2ry12 및 iba-1 단백질의 발현여부를 관찰한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 정상 대조군유래 iMG 세포(HC)와 유사하게 느린(slow) 진행 및 빠른(rapid) 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 iMG 세포(ALS(s) 및 ALS(R)) 모두에서 상기 단백질들이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, qRT-PCR을 통해 상기 각 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정한 결과, 도 2b 및 도 2c에 나타낸 바와 같이 단핵구(monocyte)의 발현 값을 기준으로 하여 상대적으로 비교할 때 P2ry12, iba-1, Olfml3, Tgf-βr1, Tmem119, 및 CD11b의 mRNA 수준이 증가하였고 CD45의 mRNA 수준이 감소된 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 상기 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포 유사세포가 미세아교세포의 특성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포의 포식작용 분석
상기 실시에 2의 결과에 더하여, 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식작용 기능을 분석하고자 하였다. 루게릭병의 질병진행 정도에 따라 차이가 나타나는지 알아보기 위해 각각 느린(slow) 진행 및 빠른(rapid) 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(ALS(slow) 및 ALS(Rapid))에서 실시예 1-5의 방법에 따라 포식작용을 분석하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 면역염색 결과 ALS(Rapid)에서 심각한 포식기능 이상이 관찰되었다. 또한, 도 3b를 통해서도 ALS(slow)의 경우에만 적색형광이 선명히 관찰되는 것을 통해 ALS(slow)에서만 포식작용이 활발히 일어난 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 루게릭병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포에서 포식작용 기능을 확인하였으며, 이러한 작용은 느린 진행속도를 갖는 루게릭병 환자에서만 나타나는 것을 관찰하였다.
실시예 4. RNA 서열분석을 통한 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 유전자 발현 차이 분석
상기 실시예 3의 결과를 통해 질병의 진행 정도가 다른 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식작용 활성이 다르게 나타난 것을 확인하였는바, 상기 실시예 1-6 및 1-7의 방법에 따라 RNA 서열분석을 실시하여 상기 질병 진행 정도가 다른 환자유래 미세아교세포의 전사체분석을 실시하였다.
먼저 각각 빠른 진행속도 및 느린 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 미세아교세포(R/C 및 S/C)의 전사체 분석 결과를 벤 다이어그램으로 나타낸 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 차등적으로 발현되는 유전자가 다수 존재하였다. 나아가 포식기능과 관련된 전사체의 발현수준을 비교한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 빠른 진행 속도를 갖는 루게릭병 환자유래 미세아교세포(R/C)에서 NCKAP1 유전자의 발현이 크게 감소되어 있는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 루게릭병에서 상기 유전자가 미치는 영향을 보다 자세히 분석하기 위해 하기 실험들을 진행하였다.
실시예 5. 루게릭병 환자 및 동물모델에서 NCKAP1의 발현수준 분석
5-1. 루게릭병 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1 발현수준 분석
질병의 진행 정도가 다른 루게릭병 환자유래 미세아교세포에서 상기 실시예 4를 통해 발견한 NCKAP1 유전자의 발현수준을 알아보기 위해, qRT-PCR 및 면역세포화학염색법을 실시하여 상기 유전자의 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 빠른 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(ALS(Rapid))에서 NCKAP1 mRNA의 발현수준이 크게 감소되어 있는 것을 관찰하였고, 도 5b에서 볼 수 있듯이 단백질 수준에서도 빠른 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(ALS i-MG (R))에서 단백질 발현수준이 매우 낮은 것을 확인하였다.
5-2. 루게릭병 마우스모델의 척수 조직에서 NCKAP1 mRNA 발현수준 분석
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 1-8의 방법으로 제조한 루게릭병 마우스 모델의 척수 조직에서 NCKAP1 mRNA의 발현수준을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 상기 마우스의 루게릭병 말기에 상기 유전자의 발현수준이 크게 감소되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 6. NCKAP1의 발현조절에 따른 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식작용 기능변화 분석
본 발명자들은 상기 실시예 4 및 5의 결과를 바탕으로 NCKAP1의 발현수준에 따라 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식기능이 변화하는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-9의 방법에 따라 상기 미세아교세포에서 NCKAP1을 과발현시키거나 또는 넉다운 시킨 후 상기 세포의 포식작용 기능 변화를 실시간 영상으로 촬영하여 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 느린 진행 속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(ALS (S)-iMG)에서 shRNA를 이용해 NCKAP1의 발현을 저해(shNCKAP1)한 경우 상기 실시예 3의 결과와 상반되게 상기 세포의 포식작용이 현저히 감소한 것을 관찰하였다. 이에 반해 빠른 진행 속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(ALS (R)-iMG)에서 NCKAP1을 과발현(O/E)시킨 경우 포식작용 기능이 회복된 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 NCKAP1 유전자가 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식작용 기능을 조절할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 알츠하이머병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포의 포식작용 및 NCKAP1에 의한 조절 기능 분석
7-1. 알츠하이머병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포의 포식작용 관찰
본 발명자들은 또 다른 신경계 퇴행성질환인 알츠하이머병에서도 NCKAP1 유전자가 포식작용 기능에 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3과 유사하게 질병의 진행 정도에 따라 포식작용 기능이 다르게 나타나는지 조사하기 위해, 각각 느린(slow) 진행 및 빠른(rapid) 진행 속도를 갖는 알츠하이머병 환자유래 말초혈액으로부터 유도된 미세아교세포(AD(R)-iMG 및 AD(S)-iMG)에 대하여 실시예 1-9의 방법에 따라 실시간으로 포식작용을 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 상기 루게릭병 환자에서와 유사하게 빠른(rapid) 진행 속도를 갖는 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포(AD(R)-iMG)에서 심각한 포식기능 이상이 관찰되었다.
7-2. NCKAP1 발현조절에 따른 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포의 포식기능 변화 분석
상기 실시예 7-1의 결과를 바탕으로 NCKAP1의 발현수준에 따라 루게릭병 환자유래 미세아교세포의 포식기능이 변화하는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-9의 방법에 따라 상기 미세아교세포에서 NCKAP1을 과발현시키거나 또는 넉다운 시킨 후 상기세포의 포식기능의 변화를 실시간 영향으로 촬영하여 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 느린 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(AD(S)-iMG)에서 shRNA를 이용해 NCKAP1의 발현을 저해(shNCKAP1)한 경우 상기 실시예 7-1의 결과와 상반되게 상기 세포의 포식작용이 현저히 감소한 것을 관찰하였다. 이에 반해 빠른 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포(AD(R)-iMG)에서 NCKAP1을 과발현(O/E)시킨 경우 포식작용 기능이 회복된 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 NCKAP1 유전자가 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포의 포식작용 기능을 조절하는 것을 알 수 있었다.
실시예 8. NCKAP1에 의한 포식작용 조절기전 분석
8-1. NCKAP1의 발현조절에 따른 F-actin 발현변화 확인
본 발명자들은 상기 실시예 결과들을 통해 NCKAP1이 루게릭병 및 알츠하이머병 환자유래 미세아교세포의 포식기능을 조절할 수 있음을 확인하였는바, 상기 유전자가 세포의 액틴 중합반응에 관여하여 세포의 포식작용을 조절하는지 알아보기 위해, 먼저 인간 자궁암세포주인 Hela에서 NCKAP1의 발현조절에 따른 F-actin의 발현변화를 분석하였다.
그 결과, NCKAP1를 과발현(GFP-NCKAP1) 또는 넉다운(shNCKAP1) 시킨 경우 F-actin의 발현수준을 알 수 있는 팔로이딘(phalloidin) 이미지를 관찰한 결과 도 10a에 나타낸 바와 같이 NCKAP1을 과발현시켰을 때 F-actin의 발현이 증가하였으며, 이와 반대로 NCKAP1의 발현을 넉다운 시켰을 때는 F-actin의 발현이 감소한 것을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, 루게릭병 환자유래 미세아교세포에서도 NCKAP1의 발현수준에 따라 F-actin의 발현변화가 유도되는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 6의 결과에 근거하여 느린 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1의 발현을 넉다운(ALS (S)+shNCKAP1)시키거나 빠른 진행속도를 갖는 환자유래 미세아교세포에서 NCKAP1을 과발현(ALS (R)+NCKAP1 O/E)시킨 후 F-actin의 발현변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이 ALS (S)+shNCKAP1의 경우에는 F-actin의 발현이 감소한 반면, ALS (R)+NCKAP1 O/E의 경우에는 F-actin의 발현이 증가한 것을 확인하였다.
상기 결과들은 NCKAP1이 환자유래 미세아교세포에서 액틴 중합반응에 관여함으로써 포식작용을 조절한다는 것을 의미하는 것이다.
8-2. 액틴 역학에 따른 식세포 컵 형성에 대한 NCKAP1의 기능 확인
상기 실시예 8-1 결과를 통해 NCKAP1이 액틴 중합반응에 관여함을 확인하였는바, 이에 더하여 액틴 역학(actin dynamic)에 의한 식세포 컵 형성(phagocytic cup formation)에도 영향을 미치는지 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 면역염색 결과 환자유래 미세아교세포의 포식작용에 의해 포식된 비드 위치에 해당하는 식세포 컵 부분에서 F-actin의 발현과 NCKAP1의 발현이 동일하게 나타나는 것을 통해 NCKAP1이 식세포 컵 형성에 관여한다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 미세아교세포에서 포식작용 기능을 조절하는 NCKAP1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 이용하여 미세아교세포의 포식작용과 관련된 특정 신호전달만을 선택적으로 조절함으로써 신경계 퇴행성질환의 치료제로 개발할 수 있는 기술인바, 종래 면역억제를 유도하는 기존치료제에 비해 안전성 및 효율성이 높은 치료제를 개발할 수 있으며, 이에 더하여 상기 NCKAP1 유전자는 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커로써 질환의 진행 속도 및 치료 결과를 예측하는데 유용하게 활용할 수 있는바, 본 발명에 따른 기술은 신경계 퇴행성질환의 예후 예측 및 치료제 개발 분야에서 광범위하게 활용될 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NCKAP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 NCKAP1 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신경계 퇴행성질환은 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  5. NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  8. 제5항의 조성물을 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예후 예측용 키트.
  9. NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 NCKAP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 NCKAP1 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 신경계 퇴행성질환은 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 미세아교세포에서 액틴 중합화 반응을 통해 상기 세포의 포식작용 기능을 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료방법.
  15. NCKAP1(NCK associated protein 1) 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 신경계 퇴행성질환의 예방 또는 치료용도.
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