WO2019088527A2 - 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법 - Google Patents

산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2019088527A2
WO2019088527A2 PCT/KR2018/012339 KR2018012339W WO2019088527A2 WO 2019088527 A2 WO2019088527 A2 WO 2019088527A2 KR 2018012339 W KR2018012339 W KR 2018012339W WO 2019088527 A2 WO2019088527 A2 WO 2019088527A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
zinc oxide
nanostar
pathogen
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/012339
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2019088527A3 (ko
Inventor
신용
리우후이팡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Original Assignee
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asan Foundation, University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation filed Critical Asan Foundation
Priority to EP18874738.0A priority Critical patent/EP3705581A4/en
Priority to US16/759,366 priority patent/US11603526B2/en
Priority claimed from KR1020180124184A external-priority patent/KR102090877B1/ko
Publication of WO2019088527A2 publication Critical patent/WO2019088527A2/ko
Publication of WO2019088527A3 publication Critical patent/WO2019088527A3/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting pathogenic bacteria and nucleic acids using zinc oxide nanostars.
  • Nucleic acid is an important analytical tool for identifying disease states, and DNA biomarkers, such as single nucleotide polymorphism (SNP), mutation or DNA methylation, And provides an important clue to providing a great opportunity for prognosis and surveillance as well as diagnosing and monitoring the condition of the disease during the early stages of the disease.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • nucleic acids such as DNA are present at very low physiological concentrations compared to other components such as proteins (e.g., tens of nanograms of DNA versus a few tens of micrograms of protein per microliter of whole blood), DNA is effectively extracted from clinical samples Preconcentration is very important for subsequent processes such as amplification and detection.
  • nucleic acids have been increasing in various fields such as biotechnology, diagnostic medicine, pharmacology, and metabolism. Therefore, efforts are being made to separate nucleic acids more rapidly and neatly from various biological samples.
  • nucleic acid adsorbing materials are a carrier that specifically adsorbs only nucleic acid from various kinds of substances contained in the cell lysis solution such as genomic DNA, plasmid DNA, messenger RNA, protein.
  • An object of the present invention is to provide a gentle composition for a pathogen including a zinc oxide nanostar, a pathogen ligation method and kit using the same, A composition for extracting nucleic acid including zinc oxide nanostar, a nucleic acid extraction method and kit using the same, and a kit.
  • the present invention provides a germicidal composition for a pathogen comprising zinc oxide nanostar.
  • the present invention also provides a kit for a pathogen comprising the composition.
  • the present invention provides a pathogen method comprising contacting a zinc oxide nanostar with a sample containing a pathogen.
  • the present invention also provides a composition for extracting nucleic acid comprising zinc oxide nanostar.
  • the present invention also provides a kit for nucleic acid extraction comprising the above composition.
  • the present invention provides a method for producing a zinc nanostructure comprising: a first step of adding a zinc oxide nanostar to a nucleic acid sample and reacting the mixture to prepare a mixture; And a second step of extracting the nucleic acid from the mixture.
  • the present invention provides a method for producing a zinc nanostructure comprising: a first step of adding a zinc oxide nanostar to a nucleic acid sample and reacting the mixture to prepare a mixture; Adding diatomite modified with a silane compound to the mixture and adding the mixture to a mixture of dimethyl adipimidate (DMA), dimethylpimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethylpimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • a second step of preparing a reaction mixture by adding at least one selected from the group consisting of 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP), 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP);
  • DTBP 3,3'-dithiobispropionimidate
  • DTBP 3,3'-dithiobispropionimidate
  • the nucleic acid extraction method using the zinc oxide nanostructure of the present invention can extract the nucleic acid by dissolving the cells of the pathogen without using a lysis buffer and is capable of extracting nucleic acid from a variety of substances including a high concentration of salts contained in the lysis buffer Thereby preventing nucleic acid degradation and fragmentation caused by the nucleic acid degradation.
  • the zinc oxide nanostar (200 to 900 nm) of the present invention is superior to conventional zinc oxide nanoparticles (20 to 50 nm) in cell solubility to increase nucleic acid extraction efficiency and can be extracted at room temperature without heating It can be used as a field diagnostic method.
  • FIG. 3 compares the solubility and nucleic acid extraction efficiency of zinc oxide nanostars using brucella bacteria with zinc oxide nanoparticles and a conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen).
  • FIG. 4 compares the solubility and nucleic acid extraction efficiency of zinc oxide nanostars using Brucella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Bacillus cereus with a conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen).
  • FIG. 5 confirms that nucleic acid extraction is possible by combining zinc oxide nanostar with a column of a conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen).
  • FIG. 6 shows that the zinc oxide nanostar is combined with diatomaceous earth or the same type 2 functional imidoester to extract nucleic acid.
  • FIG. 8 is a graph comparing (A) DNA extraction and (B) RNA extraction efficiency of a conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen), zinc oxide nanostar, and zinc oxide nanoparticles using HCT116 as a colon cancer cell line.
  • the inventors of the present invention have developed an extraction method capable of dissolving a pathogen and extracting a nucleic acid, and the ZnO nanostar (ZnO NS) of the present invention is superior to conventional zinc oxide nanoparticles in dissolving a cell membrane and nucleus of a pathogen
  • the nucleic acid extracting method using the zinc oxide nanostar of the present invention is capable of extracting nucleic acid of high concentration and high concentration without lysis buffer and heating step,
  • the present invention has been accomplished on the basis of the finding that nucleic acid can be extracted and an immediate on-the-spot diagnosis is possible.
  • the present invention provides a mycelial composition for pathogen comprising zinc oxide nanostar.
  • the zinc oxide nanostructure refers to a nanoparticle in which a plurality of sharp projections are annularly arranged.
  • the zinc oxide nanostars have an average particle diameter of 200 to 900 nm, preferably an average particle diameter of 350 to 900 nm, more preferably an average particle diameter of 500 nm, but are not limited thereto Specify.
  • the pathogen is a microorganism and the microorganism may be, but is not limited to, a virus, a bacterium, a fungus, a protozoa, a ricketta or a spirotherte.
  • the present invention also provides a kit for a pathogen comprising the composition.
  • the present invention provides a pathogen method comprising contacting a zinc oxide nanostar with a sample containing a pathogen.
  • the sample containing the pathogenic agent may be used as a sample of a subject suspected of being infected with a pathogen such as feces, urine, tears, saliva, external secretion of skin, external secretion of the respiratory tract, external secretion of the intestinal tract, external secretion of the digestive tract, Spinal fluid, lymph fluid, body fluids, and tissue, but is not limited thereto.
  • a pathogen such as feces, urine, tears, saliva, external secretion of skin, external secretion of the respiratory tract, external secretion of the intestinal tract, external secretion of the digestive tract, Spinal fluid, lymph fluid, body fluids, and tissue, but is not limited thereto.
  • the pathogen is a microorganism and the microorganism may be, but is not limited to, a virus, a bacterium, a fungus, a protozoa, a ricketta or a spirotherte.
  • the present invention also provides a composition for extracting nucleic acid comprising zinc oxide nanostar.
  • the zinc oxide nanostructure refers to a nanoparticle in which a plurality of sharp projections are annularly arranged.
  • the zinc oxide nanostars have an average particle diameter of 200 to 900 nm, preferably an average particle diameter of 350 to 900 nm, more preferably an average particle diameter of 500 nm, but are not limited thereto Specify.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • the present invention also provides a kit for nucleic acid extraction comprising the above composition.
  • the present invention provides a method for producing a zinc nanostructure comprising: a first step of adding a zinc oxide nanostar to a nucleic acid sample and reacting the mixture to prepare a mixture; And a second step of extracting the nucleic acid from the mixture.
  • the present invention provides a method for producing a zinc nanostructure comprising: a first step of adding a zinc oxide nanostar to a nucleic acid sample and reacting the mixture to prepare a mixture; Adding diatomite modified with a silane compound to the mixture and adding the mixture to a mixture of dimethyl adipimidate (DMA), dimethylpimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethylpimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • a second step of preparing a reaction mixture by adding at least one selected from the group consisting of 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP), 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP);
  • DTBP 3,3'-dithiobispropionimidate
  • DTBP 3,3'-dithiobispropionimidate
  • the silane compound may be a compound represented by the following general formula (1), but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may be the same or different and are any one of C 1 to C 4 alkyl or C 1 to C 4 alkoxy
  • R 4 is amino (C 1 to C 10) alkyl, 3- (2 amino (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound may be at least one selected from the group consisting of (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES), (3-aminopropyl) trimethoxysilane, (1-aminomethyl) triethoxysilane, (2-aminoethyl) triethoxysilane, (4-aminobutyl) triethoxysilane, (5-aminopentyl) triethoxysilane, (6-aminohexyl) triethoxysilane, 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane; APDMS), N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine, N- [3- (trimethoxysilyl ) Propyl] diethylenetriamine, [3- (2-aminoethylamino) propyl] trimethoxysilane ([3
  • the present invention also relates to a process for preparing a mixture by adding zinc nitrate hexahydrate and hexadecyltrimethylammonium bromide to water; A second step of heating the mixture at 85 to 95 ⁇ for 30 to 80 minutes to prepare a reaction mixture; And a third step of adding a solution of ammonium hydroxide to the reaction mixture to prepare a colloidal solution.
  • Zinc nitrate hexahydrate Zn NO 3 * 6H 2 O, 98%), ammonium hydroxide solution (28% NH 3 in H 2 O, 99.99% trace metals), (3-aminopropyl (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES, 98%) was purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).
  • Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) C 19 H 42 BrN,> 98%) was purchased from Tokyo Chemical Industry.
  • Commercial zinc oxide nanoparticles (dispersion, 20 wt% in size less than 40 nm in H 2 O) were used as controls.
  • biomaterials of diatomaceous earth were purchased from Sigma-Aldrich.
  • Milli-Q water, 99% ethyl alcohol, phosphate buffered saline (PBS, 10x, pH 7.4) and streptavidin conjugated magnetic beads (Dynabeads® MyOne TM Streptavidin C1) Respectively.
  • FE-SEM field-emission scanning electron microscopy
  • XRD X-ray diffraction
  • FT-IR Fastier transform infrared
  • a centrifuge (CF-5, 100 to 240 Vas, 50/60 Hz, 8 W), Vortex Mixer (T5AL, 60 Hz, 30 W, 250 V) and MSH- .
  • the Ariamx real-time PCR system (Agilent technologies), the Gene Amp PCR system 9700 (LSK), the Submerge-Mini, the gel documentation system and the Nanodrop 2000 (PeqLab) Respectively.
  • the cells used in the experiment were HCT116 (ATCC CCL-247), a colon cancer cell line.
  • Brucella ovis ATCC 25840
  • Escherichia coli E coli, ATCC 25922
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus S. aureus
  • Bacillus cereus B cereus
  • Zno nanostar (Zno NS) crystals were synthesized by hydrothermal method in alkaline medium.
  • reaction temperature, reaction time and stirring speed were controlled for uniform production of zinc oxide nanostars.
  • the reaction flask of the ice box was immediately taken out and centrifuged, dried at room temperature and washed with Milli-Q water. All syntheses were carried out without any special treatment, and finally the samples were stored in ethanol (99%).
  • zinc oxide nanostar has a particle size of 200 to 600 nm on average and shows a particle shape in which a plurality of sharp projections are annularly arranged
  • zinc oxide nanoparticles have an average of 20 ≪ / RTI > to 60 nm and exhibits an irregular spherical particle morphology.
  • the structures of zinc oxide nanostars and zinc oxide nanoparticles are different from each other by the Raman technique.
  • the zinc oxide nanostructure of the present invention has a particle size larger than that of the conventional zinc oxide nanoparticles and has a particle shape in which a plurality of sharp projections are annularly arranged to more easily dissolve cell membranes and nuclei of pathogenic bacteria Respectively.
  • the commercialization kit was used for comparative analysis of dissolution characteristics of zinc oxide nanostars.
  • the amount and purity of the extracted nucleic acid was measured with Ariamx real-time PCR system, Gene Amp PCR system 9700, electrophoresis apparatus, electrophoresis gel recording apparatus and Nanodrop 2000.
  • FIG. 3 and the following Table 1 show the results of using the conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen) + lysis buffer, zinc oxide nanoparticles + dissolution buffer unused, zinc oxide nanostar + dissolution buffer unused, conventional nucleic acid extraction kit
  • Qiagen nucleic acid extraction kit
  • FIG. 3 and the following Table 1 show the results of using the conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen) + lysis buffer, zinc oxide nanoparticles + dissolution buffer unused, zinc oxide nanostar + dissolution buffer unused, conventional nucleic acid extraction kit
  • dissolution characteristics of zinc oxide nanostar were comparatively analyzed using Brucella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus as in the above method.
  • the zinc oxide nanostar of the present invention was superior to the conventional nucleic acid extraction kit in solubility and nucleic acid extraction in all four kinds of bacteria.
  • FIG. 5 is an analysis of whether the zinc oxide nanostar of the present invention is capable of nucleic acid extraction by grafting into a conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen) column. As a result of comparing nucleic acid extraction efficiencies with different conditions as shown in Table 2 below, it was confirmed that zinc oxide nanostar could efficiently extract nucleic acid even at room temperature without heating.
  • Qiagen nucleic acid extraction kit
  • A1 A2 B1 B2 C1 C2 Nucleic acid extract composition Qiagen Qiagen Qiagen + zinc oxide nanostar Qiagen + zinc oxide nanostar Qiagen Qiagen Dissolution buffer use use unused unused unused unused Temperature (°C) 56 Room temperature 56 Room temperature 56 Room temperature Time (minutes) 10 10 10 10 10 10 10
  • the diatomite pore structure can accommodate a variety of molecules, and the high density silanol groups on the walls are beneficial in linking with functional amine groups, so the washed diatomite is functionalized with APTES.
  • the detailed experimental procedure is as follows.
  • diatomite functionalized with APTES was dispersed in distilled water at a concentration of 50 mg / ml.
  • the characteristics of APTES - functionalized diatomite and pure diatomite were analyzed by field emission scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy and Raman microscopy system.
  • nucleic acid was extracted by adding diatomaceous earth functionalized with APTES and an imidoester crosslinking agent (Dimethyl suberimidate. 2 HCl, DMS) to a 5 ml tube containing the prepared biological sample.
  • an imidoester crosslinking agent Dimethyl suberimidate. 2 HCl, DMS
  • RNA extraction 100 ⁇ l of the sample solution was added to a 1.5 ml tube containing 10 ⁇ l of protease K and 10 ⁇ l of a lysis buffer (M-SDS lysis buffer or zinc oxide nanostar solution), mixed using a pipette, Min. ≪ / RTI > 10 [mu] l of DNase was added for RNA extraction.
  • M-SDS lysis buffer or zinc oxide nanostar solution a pipette, Min. ≪ / RTI &gt
  • 10 [mu] l of DNase was added for RNA extraction.
  • the cells were incubated at 56 ° C for 10 minutes for M-SDS lysis or mixed with a pipette for zinc oxide nanostar dissolution and cultured at room temperature for 2 minutes.
  • the amount and purity of the extracted nucleic acid was measured with Ariamx real-time PCR system, Gene Amp PCR system 9700, electrophoresis apparatus, electrophoresis gel recording apparatus and Nanodrop 2000.
  • the zinc oxide nanostar of the present invention is a diatomaceous earth functionalized with APTES and a homobifunctional imidoester [DMA (Dimethyl adipimidate), Dimethyl pimelimidate (DMP) (DMS) or dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP)], as shown in Table 1 below.
  • DMA Dimethyl adipimidate
  • DMP Dimethyl pimelimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate
  • the zinc oxide nanostar of the present invention was grafted together with diatomite and DMS functionalized with APTES and the nucleic acid extraction efficiency was compared according to the conditions as shown in Table 3. As a result, Extraction was possible. In addition, since it does not use a lysis buffer, it can be applied to the detection technique through the final PCR by giving less damage to the nucleic acid.
  • the extraction efficiency of the nucleic acid according to the particle size was compared, and the extraction efficiency of the nucleic acid of the zinc oxide nanostar having the particle size of 350 to 900 nm was the best, Zinc oxide nanostar with particle size of.
  • Example 7 Nucleic acid extraction method using zinc oxide nanostar
  • Zinc oxide nanostar was synthesized by hydrothermal method on alkaline medium.
  • reaction temperature, reaction time and stirring speed were controlled for uniform production of zinc oxide nanostars.
  • the zinc oxide nanostar solution was added to a 1.5 ml tube containing 100 ⁇ ⁇ of brucellosis (CFU: 10 ⁇ 5 / ml), and gently mixed with a pipette within 10 minutes at room temperature.
  • CFU brucellosis
  • the prepared sample was transferred to a Qiagen column, washed, and then the DNA was eluted with 60 Q of Qiagen elution buffer.
  • diatomite-APTES 2 mg / ml 50 mg / ml, 40 [mu] l was added and then 100 [mu] l of a 100 mg / ml DMS solution was added. After mixing, the cells were incubated at 56 ° C for 10 minutes for M-SDS lysis, or mixed with a pipette for zinc oxide nanostar dissolution and cultured at room temperature for 2 minutes.
  • optical strip lid was placed in the well, being careful not to cross-contaminate and stain the surface of the lid.
  • Step 1 95 ° C, 10 min
  • Step 2 95 ⁇ , 10 seconds; 60 ⁇ , 20 seconds; 72 ° C, 20 seconds (40 to 45 cycles)
  • Step 3 72 ° C, 10 min
  • Example 8 Solubility test of zinc oxide nanostar using eukaryotic cells
  • HCT116 cells In order to verify the usefulness of zinc oxide nanostars in eukaryotic cells, HCT116 cells, a colon cancer cell line, were serially diluted to a concentration of 1 to 10 4 cells / 100 ⁇ l, and then zinc oxide nanostar, zinc oxide nano- And extraction efficiency of DNA and RNA was analyzed using a conventional nucleic acid extraction kit (Qiagen).
  • zinc oxide nanostars were able to detect DNA and RNA 1 to 1.5 cycles earlier than zinc oxide nanoparticles (20 nm) .
  • zinc oxide nanostar extracts nucleic acids at a higher concentration and purity than conventional nucleic acid extraction kits, and even in a small number of cells, high concentrations and high purity (3.5 ⁇ 2.3 ng / ⁇ l and 1.73 ⁇ 0.26 at 10 1 cells / ).
  • Zinc oxide nanostars enable rapid cell lysis at room temperature without the use of lysis buffers in various types of cells, making them useful as diagnostic systems in clinical settings.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 산화아연 나노스타를 이용한 핵산 추출 방법은 용해 완충액의 사용 없이 병원체의 세포를 용해하여 핵산을 추출할 수 있으며, 용해 완충액에 함유되어 있는 높은 농도의 염을 비롯한 다양한 물질에 의한 핵산 분해 (degradation) 및 단편화 (fragmentation)를 방지함으로써 고순도 및 고농도의 핵산 추출을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 산화아연 나노스타 (200 내지 900 nm)은 종래 산화아연 나노입자 (20 내지 50 nm)에 비하여 세포 용해능이 우수하여 핵산 추출 효율을 증가시키며, 가열 단계 없이 상온에서 추출이 가능하여 현장 진단 방법으로 활용이 가능하다.

Description

산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법
본 발명은 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법에 관한 것이다.
핵산은 질병 상태를 확인하기 위한 중요한 분석 수단이며, DNA 생체표지자 (biomarker) 예를 들어, 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP), 돌연변이 또는 DNA 메틸화 (DNA methylation)는 연구자가 암의 원인을 찾도록 돕고 질병의 초기 단계 동안 질병의 상태를 진단하고 관찰하는 것은 물론 예후와 감시에 대한 큰 기회를 제공하는 데 중요한 실마리를 제공한다.
DNA와 같은 핵산은 단백질과 같은 다른 성분에 비해 매우 낮은 생리적 농도로 존재하기 때문에 (예를 들어, 전혈 마이크로리터 당 수십 나노그람의 DNA 대 수십 마이크로그람의 단백질), 임상 시료로부터 DNA를 효과적으로 추출하고 예비 농축하는 것은 증폭 및 검출과 같은 이후의 공정에 매우 중요하다.
최근 들어 생명공학을 비롯한 진단의학, 약물의학, 대사의학 등 다양한 분야에서 고순도로 정제된 핵산의 사용량이 늘어남에 따라 다양한 생물 시료로부터 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
그러나 현재까지 핵산의 분리 방법에 있어 가장 크게 발전한 부분은 유전체 DNA, 플라스미드 DNA, 메신저 RNA, 단백질, 세포 잔해 입자 등 세포 용해 용액 내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 특이적으로 핵산만을 흡착시키는 담체에 관한 기술 등 거의 모든 연구의 초점은 핵산을 흡착시키는 물질에 관한 연구와 개발에 집중되어 있는 한계가 있었다.
이에, 다양한 생물 시료로부터 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하기 위하여 무엇보다 세포 잔해 입자와 단백질 변성 응집물, 기타 다양한 세포 분해 물질들로부터 신속하게 원하는 핵산만을 분리할 수 있는 기술의 개발이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 산화아연 나노스타를 포함하는 병원체 용균용 조성물, 이를 이용한 병원체 용균 방법 및 키트; 산화아연 나노스타를 포함하는 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 키트;를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화아연 나노스타를 포함하는 병원체 용균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 병원체 용균용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 병원체가 함유된 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 병원체 용균 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 핵산 시료에 첨가하고 반응시켜 혼합물을 제조하는 제 1단계; 및 상기 혼합물로부터 핵산을 추출하는 제 2단계;를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 핵산 시료에 첨가하고 반응시켜 혼합물을 제조하는 제 1단계; 상기 혼합물에 실란 화합물로 개질된 규조토를 첨가하고, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응 혼합물을 제조하는 제 2단계; 및 상기 반응 혼합물로부터 핵산을 추출하는 제 3단계;를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
본 발명의 산화아연 나노스타를 이용한 핵산 추출 방법은 용해 완충액 (lysis buffer)의 사용 없이 병원체의 세포를 용해하여 핵산을 추출할 수 있으며, 용해 완충액에 함유되어 있는 높은 농도의 염을 비롯한 다양한 물질에 의한 핵산 분해 (degradation) 및 단편화 (fragmentation)를 방지함으로써 고순도 및 고농도의 핵산 추출을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 산화아연 나노스타 (200 내지 900 nm)는 종래 산화아연 나노입자 (20 내지 50 nm)에 비하여 세포 용해능이 우수하여 핵산 추출 효율을 증가시키며, 가열 단계 없이 상온에서 추출이 가능하여 현장 진단 방법으로 활용이 가능하다.
도 1은 (A) 산화아연 나노스타 및 (B) 산화아연 나노입자의 크기 및 형태를 비교한 것이다.
도 2는 산화아연 나노스타 및 산화아연 나노입자의 구조를 라만 기법으로 비교한 것이다.
도 3은 브루셀라균을 이용한 산화아연 나노스타의 용해능 및 핵산 추출 효율을 산화아연 나노입자 및 종래 핵산 추출 키트 (Qiagen)와 비교한 것이다.
도 4는 브루셀라균, 대장균, 황색포도상구균 및 바실러스 세레우스균을 이용한 산화아연 나노스타의 용해능 및 핵산 추출 효율을 종래 핵산 추출 키트 (Qiagen)와 비교한 것이다.
도 5는 산화아연 나노스타를 종래 핵산 추출 키트 (Qiagen)의 컬럼과 접목시켜 핵산 추출이 가능함을 확인한 것이다.
도 6은 산화아연 나노스타를 규조토 또는 동형2기능성 이미도에스터와 접목시켜 핵산 추출이 가능함을 확인한 것이다.
도 7은 대장암 세포주인 HCT116을 이용하여 입자 크기에 따른 산화아연 나노스타의 핵산 추출 효율을 산화아연 나노입자와 비교한 것이다.
도 8은 대장암 세포주인 HCT116을 이용하여 종래 핵산 추출 키트 (Qiagen), 산화아연 나노스타, 산화아연 나노입자의 (A) DNA 추출 및 (B) RNA 추출 효율을 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 병원체 용해 및 핵산을 추출할 수 있는 추출 방법을 개발하였으며, 본 발명의 산화아연 나노스타 (ZnO nanostar; ZnO NS)는 종래 산화아연 나노입자와 비교하여 병원체의 세포막 및 핵의 용해능을 증가시킬 수 있는 크기 및 형태를 가짐으로써 고농도의 핵산을 추출할 수 있으며, 또한, 본 발명의 산화아연 나노스타를 이용한 핵산 추출 방법은 용해 완충액 (lysis buffer) 및 가열 단계 없이 고순도 및 고농도의 핵산을 추출하여 현장 즉시형 진단이 가능함을 밝혀내며 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 산화아연 나노스타를 포함하는 병원체 용균용 조성물을 제공한다.
상기 산화아연 나노스타는 복수 개의 뾰족한 돌기가 환상으로 배열된 나노입자를 의미한다.
상기 산화아연 나노스타는 200 내지 900 nm의 평균 입경을 가지며, 바람직하게는, 350 내지 900 nm의 평균 입경을 가지며, 더욱 바람직하게는 500 nm의 평균 입경을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 병원체는 미생물이며, 상기 미생물은 바이러스, 세균, 진균, 원충, 리케차 또는 스피로헤타일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 병원체 용균용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 병원체가 함유된 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 병원체 용균 방법을 제공한다.
상기 병원체가 함유된 시료는 병원체에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 병원체는 미생물이며, 상기 미생물은 바이러스, 세균, 진균, 원충, 리케차 또는 스피로헤타일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
상기 산화아연 나노스타는 복수 개의 뾰족한 돌기가 환상으로 배열된 나노입자를 의미한다.
상기 산화아연 나노스타는 200 내지 900 nm의 평균 입경을 가지며, 바람직하게는, 350 내지 900 nm의 평균 입경을 가지며, 더욱 바람직하게는 500 nm의 평균 입경을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 핵산 시료에 첨가하고 반응시켜 혼합물을 제조하는 제 1단계; 및 상기 혼합물로부터 핵산을 추출하는 제 2단계;를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 산화아연 나노스타를 핵산 시료에 첨가하고 반응시켜 혼합물을 제조하는 제 1단계; 상기 혼합물에 실란 화합물로 개질된 규조토를 첨가하고, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응 혼합물을 제조하는 제 2단계; 및 상기 반응 혼합물로부터 핵산을 추출하는 제 3단계;를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018012339-appb-I000001
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 질산아연 6수화물 (zinc nitrate hexahydrat) 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (hexadecyltrimethylammonium bromide)를 물에 첨가하여 혼합물을 제조하는 제 1단계; 상기 혼합물을 85 내지 95℃에서 30 내지 80분 동안 가열하여 반응 혼합물을 제조하는 제 2단계; 및 상기 반응 혼합물에 수산화 암모늄을 적가하여 콜로이드 용액을 제조하는 제 3단계;를 포함하는 산화아연 나노스타의 제조방법을 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 화학 물질 및 시약
모든 시약은 분석 등급으로 정제없이 사용하였다. 질산아연 6수화물 (zinc nitrate hexahydrate; Zn NO3 * 6H2O, 98%), 수산화 암모늄 용액 (ammonium hydroxide solution; H2O 중 28% NH3, 99.99% 미량 금속 기준), (3-아미노프로필)트리에톡시실란 ((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES, 98%)은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (hexadecyltrimethylammonium bromide = cetyltrimethylammonium bromide; CTAB) (C19H42BrN, > 98%)는 Tokyo Chemical Industry에서 구매하였다. 상업용 산화아연 나노입자 (분산액, H2O 중 40 nm 미만의 사이즈 20 wt%)는 대조군으로 사용하였다. 새로운 핵산 추출 시스템을 설계하기 위해, Sigma-Aldrich에서 생체 적합성 규조토 (diatomaceous earth) 분말을 구매하였다. 또한, 18 MΩ 보다 큰 저항값을 가지는 Milli-Q 물, 99% 에틸 알코올, 인산완충식염수 (PBS, 10x, pH 7.4) 및 스트랩타비딘 (streptavidin) 결합 자성 비드 (Dynabeads® MyOne ™ Streptavidin C1)를 사용하였다.
실시예 2 : 실험 기기
시료의 형태학 (morphology)은 주사 전자 현미경 (field-emission scanning electron microscopy; FE-SEM, JEOL JSM-7500F)을 이용하여 분석하였다. 산화아연 나노물질의 결정 구조를 분석하기 위해, 연속 스캔 2θ 모드로 40 kV 전압 및 30 mA 전류에서 X-선 회절 (X-ray diffraction; XRD, Scintag-SDS 2000)을 수행하였고, 시료의 화학적 특성을 분석하기 위해, 푸리에 변환 적외선 분광학 (Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, Nicolet 6700)을 수행하였다. 라만 (raman) 측정은 Via 라만 현미경 시스템 (Renishaw, UK)의 Renishaw를 이용하여 수행하였다. 또한, DNA 추출을 위해, 상업용 QIAamp DNA/RNA 미니 키트 (Spin Colum)를 사용하였다. 원심 분리기 (CF-5, 100 내지 240 Vas, 50/60 Hz, 8 W), 볼텍서 (Vortex Mixer, T5AL, 60 Hz, 30 W, 250 V) 및 MSH-30d 교반-가열기는 Dortan Scientific Co에서 구매하였다. Ariamx 실시간 PCR 시스템 (Agilent technologies), Gene Amp PCR 시스템 9700 (LSK), 전기영동 장치 (Submerge-Mini), 전기영동 겔 기록장치 (Gel documentation system) 및 Nanodrop 2000 (PeqLab)은 핵산 검출 실험을 위해 사용하였다.
실시예 3 : 세포 및 병원균
실험에 사용된 세포는 대장암 세포주인 HCT116 (ATCC CCL-247)을 사용하였고, 병원균으로는 브루셀라균 (Brucella ovis, ATCC 25840), 대장균 (Escherichia coli; E coli, ATCC 25922), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus; S. aureus) 및 바실러스 세레우스균 (Bacillus cereus; B cereus)을 사용하였다.
실시예 4 : 산화아연 나노스타의 합성 및 형태학 분석
산화아연 나노스타 (Zno nanostar; Zno NS) 결정체는 알칼리성 배지에서 수열 법 (hydrothermal method)으로 합성하였다.
1 M의 질산아연 6수화물 1 ㎖과 1 M의 CTAB 1 ㎖를 Milli-Q 물 98 ㎖이 담긴 플라스크에 적정한 순서로 첨가하고, 90℃에서 50분 동안 가열하면서 교반 (500 rpm) 하였다. 이후, 안정한 교반 조건 하에서, 수산화 암모늄 용액 2 ㎖를 반응 혼합물에 적가하고, 유백색 콜로이드 용액이 생성될 때까지 몇 분간 교반하였다.
산화아연 나노스타의 균일한 생성을 위해, 반응 온도, 반응 시간 및 교반 속도를 조절하였다. 산화아연 나노스타의 생성을 조절하기 위해, 얼음 상자의 반응 플라스크를 바로 꺼내어 원심 분리하고, 실온에서 건조시킨 후, Milli-Q 물로 세척하였다. 모든 합성은 특별한 처리없이 수행하였고, 마지막으로 시료는 에탄올 (99 %)에 보관하였다.
도 1을 참조하여 보면, (A) 산화아연 나노스타는 평균 200 내지 600 nm의 입자 크기를 가지며 복수 개의 뾰족한 돌기가 환상으로 배열된 입자 형태를 나타내었으며, (B) 산화아연 나노입자는 평균 20 내지 60 nm의 입자 크기를 가지며 불규칙한 구형의 입자 형태를 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 도 2를 참조하여 보면, 산화아연 나노스타와 산화아연 나노입자의 구조가 서로 상이한 것을 라만 기법으로 확인하였다.
따라서, 본 발명의 산화아연 나노스타는 종래의 산화아연 나노입자에 비해 큰 입자 크기를 가지며, 복수 개의 뾰족한 돌기가 환상으로 배열된 모양의 입자 형태를 가져 병원균의 세포막 및 핵을 더 용이하게 용해할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5 : 산화아연 나노스타의 용해능 검증
상용화 키트는 산화아연 나노스타의 용해 특성을 비교 분석하는데 사용하였다.
먼저, 시료 (브루셀라균)를 용해하기 위해, 시료 1.5 ㎖에 AL 완충액을 첨가하고, DNA 추출을 위해 56℃에서 10분 동안 배양한 후, RNA 추출을 위해 상온에서 1분간 배양하였다. 준비된 시료를 Qiagen 컬럼으로 옮기고, 세척 및 용출 단계를 수행하였다.
반면, 본 발명에서는 상용화 AL 완충액 대신 산화아연 나노스타를 이용하여 대량으로 고품질의 핵산을 추출하기 위한 조건을 최적화하였고, 추출 방법을 단순화하였다.
추출된 핵산의 양 및 순도는 Ariamx 실시간 PCR 시스템, Gene Amp PCR 시스템 9700, 전기영동 장치, 전기영동 겔 기록장치 및 Nanodrop 2000으로 측정하였다.
도 3 및 하기 표 1은 브루셀라균의 핵산 추출에 있어서, 종래의 핵산 추출 키트 (Qiagen) + 용해 완충액 사용, 산화아연 나노입자 + 용해 완충액 미사용, 산화아연 나노스타 + 용해 완충액 미사용, 종래 핵산 추출 키트 (Qiagen) + 용해 완충액 미사용 조건으로 핵산을 추출하여 용해능을 비교한 결과로, 본 발명의 산화아연 나노스타의 핵산 추출이 가장 우수한 것을 확인하였다.
Cq (△R) Tm Product 1 (-R'(T)) 10^5 브루셀라균 (RT)
23.74 81.5 Qiagen + 용해 완충액
25.38 81.5 산화아연 나노입자 (RT)
21.5 81.5 산화아연 나노스타 (RT)
25.45 81 Qiagen
35.4 83.5 음성 대조군
또한, 상기 방법과 동일하게, 브루셀라균, 대장균, 황색포도상구균 및 바실러스 세레우스균을 이용하여 산화아연 나노스타의 용해 특성을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 4를 참조하여 보면, 상기 4종류의 균 모두에서 본 발명의 산화아연 나노스타가 종래의 핵산 추출 키트보다 용해능 및 핵산 추출이 우수한 것을 확인하였다.
또한, 도 5는 본 발명의 산화아연 나노스타가 종래의 핵산 추출 키트 (Qiagen) 컬럼에 접목하여 핵산 추출이 가능한지를 분석한 것이다. 하기 표 2와 같이 조건을 달리하여 핵산 추출 효율을 비교한 결과, 산화아연 나노스타는 가열 단계 없이 상온에서도 효율적인 핵산 추출이 가능함을 확인하였다.
A1 A2 B1 B2 C1 C2
핵산 추출 조성물 Qiagen Qiagen Qiagen +산화아연 나노스타 Qiagen +산화아연 나노스타 Qiagen Qiagen
용해 완충액 사용 사용 미사용 미사용 미사용 미사용
온도 (℃) 56 상온 56 상온 56 상온
시간 (분) 10 10 10 10 10 10
실시예 6 : 단일 튜브 핵산 추출을 위한 기능화된 규조토 및 광학 산화아연 나노스타의 용해능 검증
산화아연 나노스타의 용해 특성을 추가적으로 분석하기 위해, 단일 튜브 핵산 추출 시스템을 사용하였으며, 이는 이전 논문 (Biosensors and Bioelectronics 99 (2018) 443-449.)을 참고하여 수행하였다.
간략하게, (1) 규조토의 기공 구조는 다양한 분자를 수용할 수 있고, 벽에 있는 고밀도의 실라놀기 (silanol group)는 기능성 아민기와 연결하는데 유리하기 때문에, 세척한 규조토를 APTES로 기능화하였다. 상세한 실험 과정은 하기와 같다.
i) APTES 2 ㎖를 95% 에탄올 용액 100 ㎖에 적가하고 상온에서 400 rpm으로 3분 동안 교반하였다.
ii) 세척한 규조토 500 ㎎을 상기 용액에 600 rpm으로 4시간 동안 분산시켰다.
iii) 개질 후, 유리 실라놀을 제거하기 위해, 침전물을 에탄올로 2회 세척하였다.
iv) 원심 분리하여 APTES로 기능화된 규조토를 획득하고, 진공 하에 상온에서 밤새 건조시켰다.
v) 마지막으로 APTES로 기능화된 규조토를 증류수에 50 ㎎/㎖ 농도로 분산시켰다.
APTES로 기능화된 규조토 및 순수한 규조토의 특성은 전계 방출 주사 전자 현미경, 푸리에 변환 적외선 분광학 및 라만 현미경 시스템으로 분석하였다.
(2) 상기 개질에 기초하여, APTES로 기능화된 규조토 및 이미도에스터 가교제 (Dimethyl suberimidateㆍ2 HCl, DMS)를 준비된 생물학적 시료가 담긴 5 ㎖ 튜브에 첨가하여 핵산을 추출하였다. 상세한 실험 과정은 하기와 같다.
i) 시료 용액 100 ㎕를 프로테아제 K 10 ㎕와 용해 완충액 (M-SDS 용해 완충액 또는 산화아연 나노스타 용액) 10 ㎕가 담긴 1.5 ㎖ 튜브에 첨가하고, 파이펫을 이용하여 섞어준 후, 상온에서 1분 동안 배양하였다. DNase 10 ㎕는 RNA 추출을 위해 첨가하였다.
ii) 이후, 규조토-APTES 2 ㎎/㎖를 첨가한 다음 100 ㎎/㎖ 농도의 DMS 용액 100 ㎕를 첨가하였다.
iii) 혼합 후, M-SDS 용해를 위해 56℃에서 10분 동안 배양하거나 산화아연 나노스타 용해를 위해 파이펫으로 섞어주며 상온에서 2분 동안 배양하였다.
iv) 배양 후, 상층액을 제거하고 침전물을 PBS 200 ㎕로 2회 세척하였다.
v) 마지막으로, 용출 완충액 (pH ~ 10.6 NaHCO3) 60 ㎕를 첨가하고 실온에서 1분 동안 배양하였다.
vi ) 원심 분리한 후, 상등액을 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고, 추출된 DNA 또는 RNA 는 -20 ℃에서 보관하였다.
추출된 핵산의 양 및 순도는 Ariamx 실시간 PCR 시스템, Gene Amp PCR 시스템 9700, 전기영동 장치, 전기영동 겔 기록장치 및 Nanodrop 2000으로 측정하였다.
도 6은 본 발명의 산화아연 나노스타가 APTES로 기능화된 규조토 및 동형2기능성 이미도에스터 [디메틸 아디프이미데이트 (Dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트 (Dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트 (Dimethyl suberimidate; DMS) 또는 디메틸 3.3'-디티오비스프로피온이미데이트 (Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)]와 접목이 가능한지를 분석한 것이다.
본 발명의 산화아연 나노스타를 APTES로 기능화된 규조토 및 DMS와 함께 접목시키고, 하기 표 3과 같이, 조건을 달리하여 핵산 추출 효율을 비교한 결과, 산화아연 나노스타는 가열 단계 없이 상온에서도 효율적인 핵산 추출이 가능함을 확인하였다. 또한, 용해 완충액을 사용하지 않기 때문에, 핵산에 손상을 적게 주어, 최종적인 PCR 등을 통한 검출 기법에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
Qiagen A1 A2 A3 B1 B2 B3
용해 완충액 사용 사용 산화아연 나노스타 미사용 사용 산화아연 나노스타 미사용
온도(℃) 56 56 56 56 상온 상온 상온
시간(분) 10 10 10 10 2 2 2
또한, 도 7 및 하기 표 4를 참조하여 보면, 입자 크기에 따른 핵산 추출 효율을 비교한 것으로, 350 내지 900 nm의 입자 크기를 가지는 산화아연 나노스타의 핵산 추출 효율이 가장 우수하였으며, 특히 500 nm의 입자 크기를 가지는 산화아연 나노스타가 최적의 조건임을 확인하였다.
Cq (△R) Tm Product 1 (-R'(T)) HCT 116 10^4/ml 100 ㎕ (60 ㎕ DNA)
26.63 85 ∼20 nm 산화아연 나노입자
26.2 85 ∼100 nm 산화아연 나노스타
25.75 90 ∼350 nm 산화아연 나노스타
25.21 85.5 ∼500 nm 산화아연 나노스타
25.25 85.5 ∼900 nm 산화아연 나노스타
27.21 85 ∼1000 nm 산화아연 나노스타
30.78 85 음성 대조군
실시예 7 : 산화아연 나노스타를 이용한 핵산 추출 방법
7-1. 산화아연 나노스타의 합성
산화아연 나노스타는 알칼리성 배지에서 수열 법으로 합성하였다.
i) 1 M의 질산아연 6수화물 1 ㎖과 1M의 CTAB 1 ㎖를 Milli-Q 물 98 ㎖이 담긴 플라스크에 적정한 순서로 첨가하고, 90℃에서 50분 동안 가열하면서 교반 (500 rpm) 하였다.
ii) 이후, 안정한 교반 조건 하에서, 수산화 암모늄 용액 2 ㎖를 반응 혼합물에 적가하고, 유백색 콜로이드 용액이 생성될 때까지 몇 분간 교반하였다.
산화아연 나노스타의 균일한 생성을 위해, 반응 온도, 반응 시간 및 교반 속도를 조절하였다.
iii) 산화아연 나노스타의 생성을 조절하기 위해, 얼음 상자의 반응 플라스크를 바로 꺼내어 원심 분리하고, 실온에서 건조시킨 후, Milli-Q 물로 세척하였다. 모든 합성은 특별한 처리없이 수행하였고, 마지막으로 시료는 에탄올 (99 %)에 보관하였다.
7-2. 산화아연 나노스타 및 Qiagen kit를 이용한 핵산 추출 방법
i) 산화아연 나노스타 용액을 브루셀라균 (CFU: 10^ 5/㎖) 100 ㎕가 담겨 있는 1.5 ㎖ 튜브에 첨가하고, 파이펫을 이용하여 상온에서 10분 이내로 부드럽게 섞어주었다.
ii) 이어서, 준비된 시료를 Qiagen 컬럼에 옮기고, 세척한 후 DNA를 Qiagen 용출 완충액 60 ㎕으로 용출시켰다.
7-3. 산화아연 나노스타, 규조토-APTES 및 이미도에스터를 이용한 핵산 추출 방법
i) 브루셀라균 100 ㎕를 프로테아제 K 10 ㎕와 용해 완충액 (M-SDS 용해 완충액 또는 산화아연 나노스타 용액) 10 ㎕가 담긴 1.5 ㎖ 튜브에 첨가하고, 파이펫을 이용하여 섞어준 후, 상온에서 1분 동안 배양하였다. DNase 10 ㎕는 RNA 추출을 위해 첨가하였다.
ii) 이후, 규조토-APTES 2 ㎎/㎖ (50 ㎎/㎖, 40 ㎕)를 첨가한 다음 100 ㎎/㎖ 농도의 DMS 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 혼합 후, M-SDS 용해를 위해 56℃에서 10분 동안 배양하거나 산화아연 나노스타 용해를 위해 파이펫으로 섞어주며 상온에서 2분 동안 배양하였다.
iii) 배양 후, 상층액을 제거하고 침전물을 PBS 200 ㎕로 2회 세척하였다.
iv) 마지막으로, 용출 완충액 (pH ~ 10.6 NaHCO3) 60 ㎕를 첨가하고 실온에서 1분 동안 배양하였다.
7-4. DNA 추출 효율 분석을 위한 실시간 PCR
템플렛 (NA) 5 ㎕를 이용하여 96 웰 플레이트 (96 Well Plate)에서 수행하였다.
i) 멀티 채널 파이펫을 이용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 master mix 20 ㎕를 분주하였다.
ii) 상기 master mix에 템플렛 (NA) 5 ㎕를 넣고 파이펫으로 잘 섞어주었다.
iii) 교차 오염을 방지하고 뚜껑의 표면을 얼룩지게하지 않도록 주의하면서 웰에 광학 스트립 뚜껑을 놓았다.
iv) 96 웰 플레이트를 2000 rpm으로 1분간 원심 분리하였다.
v) qPCR 기계에 96 웰 플레이트를 올바른 방향으로 놓고 하기 조건으로 실시간 PCR을 수행하였다.
1 단계 : 95℃, 10분
2 단계 : 95℃, 10초; 60℃, 20초; 72℃, 20초 (40 내지 45 사이클)
3 단계 : 72℃, 10분
vi) 데이터 분석을 수행하였다.
실시예 8: 진핵 세포를 이용한 산화아연 나노스타의 용해능 검증
진핵 세포에서 산화아연 나노스타의 유용성을 검증하기 위해, 대장암 세포주인 HCT116 세포를 1~104 세포/100 ㎕의 농도가 되도록 연속 희석 (serial dilution) 한 후, 산화아연 나노스타, 산화아연 나노입자 및 종래 핵산 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 DNA 및 RNA를 추출 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 8을 참조하여 보면, 최적화된 조건으로 본 발명의 산화아연 나노스타를 이용한 경우, DNA 및 RNA가 모두 1 세포/㎖까지 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 산화아연 나노스타의 검출 한계는 종래 핵산 추출 키트보다 DNA의 경우 100배, RNA의 경우 10배 우수하였다.
또한, 산화아연 나노스타와 산화아연 나노입자의 세포 용해능을 비교한 결과, 산화아연 나노스타가 산화아연 나노입자 (20 nm) 보다 DNA 및 RNA를 1~1.5 사이클 더 빨리 검출하는 것을 확인할 수 있었다.
더불어, 산화아연 나노스타는 종래 핵산 추출 키트 보다 고농도 및 고순도로 핵산을 추출하였으며, 심지어 적은 수의 세포에서도 RNA를 고농도 및 고순도(101 세포/100 ㎕에서 3.5 ± 2.3 ng/㎕ 및 1.73 ± 0.26)로 추출하였다.
산화아연 나노스타는 다양한 유형의 세포에서 용해 완충액의 사용 없이 상온에서 신속한 세포 용해를 가능하게 하는 바, 임상 환경에서 진단 시스템으로 유용하게 활용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. 산화아연 나노스타를 포함하는 병원체 용균용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 산화아연 나노스타는 200 내지 900 nm의 평균 입경을 가지는 것을 특징으로 하는 병원체 용균용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 병원체는 미생물인 것을 특징으로 하는 병원체 용균용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 미생물은 바이러스, 세균, 진균, 원충, 리케차 또는 스피로헤타인 것을 특징으로 하는 병원체 용균용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 병원체 용균용 키트.
  6. 산화아연 나노스타를 병원체가 함유된 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 병원체 용균 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 병원체가 함유된 시료는 병원체에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 병원체 용균 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 병원체는 미생물인 것을 특징으로 하는 병원체 용균 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 미생물은 바이러스, 세균, 진균, 원충, 리케차 또는 스피로헤타인 것을 특징으로 하는 병원체 용균 방법.
  10. 산화아연 나노스타를 포함하는 핵산 추출용 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 산화아연 나노스타는 200 내지 900 nm의 평균 입경을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 핵산 추출용 키트.
  14. 산화아연 나노스타를 핵산 시료에 첨가하고 반응시켜 혼합물을 제조하는 제 1단계; 및
    상기 혼합물로부터 핵산을 추출하는 제 2단계;를 포함하는 핵산 추출 방법.
  15. 산화아연 나노스타를 핵산 시료에 첨가하고 반응시켜 혼합물을 제조하는 제 1단계;
    상기 혼합물에 실란 화합물로 개질된 규조토를 첨가하고, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응 혼합물을 제조하는 제 2단계; 및
    상기 반응 혼합물로부터 핵산을 추출하는 제 3단계;를 포함하는 핵산 추출 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산 추출 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018012339-appb-I000002
    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 추출 방법.
PCT/KR2018/012339 2017-10-30 2018-10-18 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법 Ceased WO2019088527A2 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18874738.0A EP3705581A4 (en) 2017-10-30 2018-10-18 PROCESS FOR LYSIS OF PATHOGENS AND EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS USING ZINC OXIDE NANOSTARES
US16/759,366 US11603526B2 (en) 2017-10-30 2018-10-18 Pathogen lysis and nucleic acid extraction method using zinc oxide nanostar

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2017-0142590 2017-10-30
KR20170142590 2017-10-30
KR1020180124184A KR102090877B1 (ko) 2017-10-30 2018-10-18 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법
KR10-2018-0124184 2018-10-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2019088527A2 true WO2019088527A2 (ko) 2019-05-09
WO2019088527A3 WO2019088527A3 (ko) 2019-07-04

Family

ID=66331463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/012339 Ceased WO2019088527A2 (ko) 2017-10-30 2018-10-18 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2019088527A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114988456A (zh) * 2022-06-21 2022-09-02 深圳市尚维高科有限公司 氧化锌复合颗粒及制备方法及其在核酸检测中的病毒裂解应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0918693A2 (pt) * 2008-12-31 2016-07-26 3M Innovative Properties Co dispositivos para amostragem e métodos para concentração de microorganismos
WO2014092653A1 (en) * 2012-12-13 2014-06-19 Agency For Science, Technology And Research Label-free methods for isolation and analysis of nucleic acids on solid phase device
KR20150142492A (ko) * 2014-06-12 2015-12-22 호서대학교 산학협력단 산화아연 나노입자를 포함하는 알레르기 염증 질환 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 99, 2018, pages 443 - 449
See also references of EP3705581A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114988456A (zh) * 2022-06-21 2022-09-02 深圳市尚维高科有限公司 氧化锌复合颗粒及制备方法及其在核酸检测中的病毒裂解应用
CN114988456B (zh) * 2022-06-21 2023-10-03 深圳市尚维高科有限公司 氧化锌复合颗粒及制备方法及其在核酸检测中的病毒裂解应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019088527A3 (ko) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1088110C (zh) 借助于移动的凹液面对大分子进行序列比较的方法及应用
KR102090877B1 (ko) 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법
JP5651011B2 (ja) ポリヌクレオチド捕捉材料およびその使用方法
US20060234251A1 (en) Methods of enhancing isolation of RNA from biological samples
KR20090003205A (ko) Ｒｎａ를 추출하는 방법
WO2021141369A1 (ko) 단일 가닥 dna 탐침 기반 rna 검출 방법
WO2022097984A1 (ko) 3 차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포의 제조방법
WO2010137903A2 (ko) 신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법
WO2022092945A1 (ko) 다중 진단을 위한 핵산 분리 및 검출용 미세입자 프로브
KR20090003219A (ko) 핵산를 추출하는 방법
WO2019088527A2 (ko) 산화아연 나노스타를 이용한 병원체 용균 및 핵산 추출 방법
WO2018131826A1 (ko) 아민-코팅 자성 나노입자를 이용한 플라스미드 dna 정제 방법 및 조성물
WO2018151339A1 (ko) Dcas9/grna 복합체와 형광표지인자를 이용한 표적 유전자 검출 방법
JPWO2016152763A1 (ja) 核酸の回収方法
CN111979142B (zh) 一种同时携带耐药基因cfr和lsa(E)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其检测方法
WO2022177367A1 (ko) 등온증폭 및 형광 링 패턴에 기반한 표적 핵산의 다중 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법
WO2012002597A1 (ko) Β형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 β형 간염 바이러스 진단 방법
WO2022103063A1 (ko) 표적 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 검출 방법
WO2019088429A1 (ko) 동형2기능성 이미도에스터를 이용한 액체생검 유래 생체물질의 추출 방법
WO2022102885A1 (ko) 엑소좀 유래 miRNA를 이용한 아토피성 피부염 상관 스트레스 진단기술
WO2018169307A1 (ko) 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법
WO2017051939A1 (ko) 자성입자를 이용한 핵산의 추출 및 증폭 방법
WO2022145980A1 (ko) 고효율 및 고순도의 엑소좀 분리방법
KR20240069796A (ko) 샘플 분리를 위한 자성 나노입자
CN115184385A (zh) 一种圆头精子跨膜蛋白247鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18874738

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018874738

Country of ref document: EP

Effective date: 20200602

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2018874738

Country of ref document: EP