WO2019131380A1 - マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法 - Google Patents

マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法 Download PDF

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WO2019131380A1
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macrolide
antibody
acid
tacrolimus
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将也 豊永
佳之 堀田
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Fujirebio Inc
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9493—Immunosupressants
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Definitions

  • the present invention relates to a blood test method for macrolide immunosuppressant and the like.
  • Macrolide immunosuppressants such as tacrolimus (FK506) and cyclosporin A are effective for rejection avoidance after organ transplantation, treatment of autoimmune diseases, etc.
  • tacrolimus FK506
  • cyclosporin A are effective for rejection avoidance after organ transplantation, treatment of autoimmune diseases, etc.
  • blood drug concentration It is necessary to monitor blood drug concentrations during the treatment period, as it is required to keep the concentration within the appropriate therapeutic concentration range.
  • a blood sample such as whole blood contains a binding protein to a drug
  • it is essential to dissociate the drug in the blood sample from the binding protein by appropriate pretreatment.
  • chemicals such as organic solvents, modifiers and surfactants are generally used.
  • US Pat. No. 5,956,015 describes the use of zwitterionic surfactants and saponins.
  • Patent Document 2 describes the use of an extractant consisting of a hemolytic agent containing a nonionic surfactant (eg, saponin) or octylphenoxypolyethoxyethanol, and a bile salt surfactant.
  • Patent Document 3 describes the use of reagents including dimethyl sulfoxide (DMSO), glycols (eg ethylene glycol) and zinc salts (eg zinc sulfate).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycols eg ethylene glycol
  • zinc salts eg zinc sulfate
  • 5,959,067 describes the use of proteases, glycols (eg ethylene glycol) and alcohols (eg methanol).
  • Patent document 5 describes the use of an extraction reagent sample containing glycol (eg ethylene glycol), alcohol (eg methanol) and salt (eg sodium chloride).
  • Patent document 6 describes the use of saponin, methanol, ethylene glycol and zinc sulfate.
  • Patent Document 7 describes the use of hemolytic agents and surfactants (eg, ionic surfactants (eg, SDS), nonionic surfactants (eg, Triton X-405)).
  • U.S. Pat. No. 5,959,095 discloses free agents (e.g.
  • Patent Document 9 describes the use of an extraction reagent composition comprising dimethyl sulfoxide (DMSO), at least one divalent metal salt and water, wherein the concentration of DMSO is 50% by volume or more of the extraction reagent composition.
  • the present invention is as follows.
  • Blood test method for macrolide immunosuppressant including the following: (A) treating a blood sample containing a macrolide immunosuppressant or a metabolite thereof having a macrolide structure with acid or alkali; and (b) using the antibody to detect said macrolide immunity in the blood sample. Measuring the concentration of the inhibitor or said metabolite.
  • the method of [1], wherein the macrolide immunosuppressant is tacrolimus, cyclosporin A, or everolimus.
  • the method of [1] or [2], wherein the blood sample is a human blood sample.
  • [8] The method of any of [1] to [7], which is a method including the following: (A ') treating a blood sample containing the macrolide immunosuppressant or the metabolite with an acid or alkali to prepare an acidic blood sample or an alkaline blood sample; and (b') using an antibody Measuring the concentration of the macrolide immunosuppressant or the metabolite in the acidic blood sample or the alkaline blood sample.
  • a blood test reagent for a macrolide immunosuppressant comprising (1) an acid or an alkali, and (2) a macrolide immunosuppressant, or one or more antibodies against its metabolite having a macrolide structure .
  • the reagent of [11] wherein the acid is an acidic buffer.
  • the reagent of [11] or [12] further including (3) a neutralization solution.
  • the present invention can well perform blood tests for macrolide immunosuppressants.
  • the present invention can realize an inspection that is simple, has high accuracy, and has high processing capability.
  • acidification e.g. mixing of blood sample and acid buffer
  • alkalisization e.g. blood sample and e.g. blood sample
  • concentration of the macrolide immunosuppressant and its metabolite in an acidic blood sample or in an alkaline blood sample can be successfully measured with an antibody by a simple operation (pretreatment) of mixing of alkaline buffers).
  • the concentration by evaporation of the organic solvent can be avoided, and the concentrations of the macrolide immunosuppressant and its metabolite can be measured with high accuracy. it can.
  • FIG. 1-1 shows an immunoassay of tacrolimus dissociated from tacrolimus binding protein under various pH conditions.
  • Solid phase antibody anti-tacrolimus antibody (in-house antibody mouse IgG); detection antibody: anti-tacrolimus chicken IgM.
  • FIG. 1-2 shows an immunoassay of tacrolimus dissociated from tacrolimus binding protein under various pH conditions.
  • Solid phase antibody anti-tacrolimus antibody (mouse IgM which is a commercially available antibody); detection antibody: anti-tacrolimus chicken IgM.
  • FIGS. 1-3 show immunoassays for tacrolimus dissociated from tacrolimus binding protein under various pH conditions.
  • Solid phase antibody anti-tacrolimus antibody (mouse IgG which is a commercially available antibody); detection antibody: anti-tacrolimus chicken IgM.
  • FIG. 2 shows the correlation between the tacrolimus concentration measured and tacrolimus spike concentration in the sample when a blood sample containing tacrolimus (a calibration standard substance) and its binding protein is pretreated with an acid.
  • FIG. 3 shows an immunoassay of cyclosporin A dissociated from cyclosporin A binding protein under various pH conditions.
  • Solid phase antibody anti-tacrolimus antibody (in-house antibody mouse IgG); detection antibody: anti-tacrolimus chicken IgM.
  • FIG. 4 is a diagram showing the correlation between the measured value of cyclosporin A concentration and the spiked concentration of cyclosporin A in the sample when a blood sample containing cyclosporin A (a calibration standard substance) and its binding protein is pretreated with acid. is there.
  • FIG. 5-1 is a diagram showing the binding rate (%) of anti-tacrolimus antibody and biotin-labeled tacrolimus according to the concentration of various tacrolimus analogs in a neutral solution.
  • FIG. 5-2 is a diagram showing the binding rate (%) of anti-tacrolimus antibody and biotin-labeled tacrolimus according to the concentration of various tacrolimus analogues in an acidic solution.
  • FIG. 5-1 is a diagram showing the binding rate (%) of anti-tacrolimus antibody and biotin-labeled tacrolimus according to the concentration of various tacrolimus analogues in an acidic solution.
  • FIG. 6 shows the coexistence of dissociation of tacrolimus and its specific binding protein binding, and binding of dissociated tacrolimus to antibody in an acidic solution.
  • FIG. 7 shows the results of an immunoassay of tacrolimus dissociated from tacrolimus binding protein when using an alkaline solution for pretreatment of whole blood samples.
  • Solid phase antibody anti-tacrolimus antibody (in-house antibody mouse IgG); detection antibody: anti-tacrolimus chicken IgM.
  • FIG. 8-1 is a diagram showing the results of an immunoassay according to each tacrolimus concentration in a sample obtained by treating a whole blood sample with acid treatment and then treating with a urea-containing neutralization solution.
  • FIG. 8-1 is a diagram showing the results of an immunoassay according to each tacrolimus concentration in a sample obtained by treating a whole blood sample with acid treatment and then treating with a urea-containing neutralization solution.
  • FIG. 8-2 is a diagram showing the results of an immunoassay according to each tacrolimus concentration in a sample obtained by treating a whole blood sample with acid treatment and then treating with a guanidine hydrochloride-containing neutralization solution.
  • FIG. 9 is a graph showing the percent binding of anti-everolimus antibody to everolimus-BSA conjugate according to the concentration of each everolimus in a sample in which a whole blood sample was treated with acid followed by treatment with guanidine hydrochloride-containing neutralization solution. It is.
  • the present invention provides a blood test method for macrolide immunosuppressants, including: (A) treating a blood sample containing a macrolide immunosuppressant or a metabolite thereof having a macrolide structure with acid or alkali; and (b) using the antibody to detect said macrolide immunity in the blood sample. Measuring the concentration of the inhibitor or said metabolite.
  • the blood sample used in the present invention is an animal blood sample containing a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having a macrolide structure.
  • Such blood samples can be collected from animals to which the macrolide immunosuppressant has been administered.
  • the animal blood sample contains a macrolide immunosuppressant, or a binding protein for its metabolite having macrolide structure, and the macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having macrolide structure, and a conjugate thereof
  • the proteins can be linked together to form a complex.
  • the animal from which such a blood sample is derived is preferably a mammal (eg, primates such as humans, monkeys and chimpanzees; rodents such as mice, rats and rabbits; and cattle, pigs, horses, goats, sheep etc. Livestock and service animals), more preferably primates, and particularly preferably humans.
  • Blood samples also include, for example, whole blood, serum, plasma, and other blood fractions.
  • the macrolide immunosuppressant, or the metabolite having the macrolide structure, and most of the binding proteins therefor, are present in a predetermined blood fraction (eg, the red blood cell fraction).
  • Such a blood fraction, or a blood sample (eg, whole blood) containing such a blood fraction can be used to measure the blood concentration of the metabolite having the macrolide structure or the macrolide structure.
  • a blood sample eg, whole blood
  • the use of whole blood as a blood sample is preferred from the viewpoint of simply measuring the concentration by omitting the fractionation operation.
  • Blood samples may also be used to treat diseases for which suppression of immunity is desired (eg, autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, Crohn's disease, lupus nephritis, active ulcerative colitis, polymyositis, graft host disease (GVDH), mammals suffering from dermatomyositis and interstitial pneumonia), or transplantation of organs, tissues or cells (eg, heart transplantation, kidney transplantation, bone marrow transplantation, lung transplantation, liver transplantation, pancreas transplantation, Preferably, they are obtained from a mammal that has received a small intestine transplantation). Blood samples collected from such mammals may be subjected to pretreatment (eg, filtration, heating, hemolysis).
  • pretreatment eg, filtration, heating, hemolysis
  • Macrolide immunosuppressants are compounds containing macrolide structures (cyclic lactone structures composed of 12 or more atoms) and having the action of reducing or inhibiting the activity of the immune system.
  • Macrolide-based immunosuppressants include tacrolimus (FK506), cyclosporin A, sirolimus (rapamycin) and derivatives thereof (eg, everolimus, temsirolimus), zotarolimus, biolimus, novolimus, pimecrolimus, myolimus, myolimus, and deforolimus.
  • Metabolites of macrolide immunosuppressants having a macrolide structure vary depending on the type of macrolide immunosuppressant, but in particular, as long as they can bind to binding proteins depending on the type of macrolide immunosuppressant It is not limited.
  • the macrolide immunosuppressant is tacrolimus
  • a tacrolimus metabolite having a macrolide structure for example, 13-O-desmethyl tacrolimus (MI), 31-O-desmethyl tacrolimus (MII), 15 -O-desmethyl tacrolimus (MIII), 12-O-hydroxy tacrolimus (MIV), 15,31 -O-didesmethyl tacrolimus (MV), 13,31 -O-dides methyl tacrolimus (MVI), 13 ,, 15-O-didesmethyl tacrolimus (MVII), MVIII tacrolimus, C22 oxime tacrolimus, C24 succinate tacrolimus, C32 succinate tacrolimus (Clin.
  • MI 13-O-desmethyl tacrolimus
  • MII 31-O-desmethyl tacrolimus
  • MIII 15 -O-desmethyl tacrolimus
  • MVII 12-O-hydroxy tacrolimus
  • MV 13,31 -O-didesmethyl tacrol
  • cyclosporin A examples of cyclosporin A metabolites having a macrolide structure include cyclosporin AM1, cyclosporin AM9, cyclosporin AM4N, cyclosporin AM1c, and cyclosporin AM19 (Br. J. J. Med. Clin. Pharmacol., 2003 Feb, 55 (2), 203-11), and such cyclosporin A metabolites have been reported to be capable of forming complexes with cyclosporin A binding proteins (Clin. Biochem). , 1991 Feb, 24 (1), 71-4; CLIN. CHEM., 37 (3), 403-410 (1991)).
  • sirolimus metabolite having a macrolide structure for example, 16-O-demethyl sirolimus, 24-hydroxy sirolimus, 25-hydroxy sirolimus, 46-hydroxy sirolimus, 39-O- demethyl sirolimus, 7-O-demethyl Sirolimus, 32-O-demethyl sirolimus, 41-O-demethyl sirolimus, hydroxysirolimus, seco-sirolimus, 11-hydroxy sirolimus, 3,4-dihydrodiol sirolimus, 5,6-dihydrodiol sirolimus Mon. (Ther. Drug.
  • Everolimus metabolites having a macrolide structure include, for example, 46-hydroxyeverolimus, 24-hydroxyeverolimus, 25-hydroxyeverolimus, 45-hydroxyeverolimus, 2-hydroxyeverolimus, 11-hydroxyeverolimus, 14-hydroxyeverolimus, 39- O-desmethyl everolimus, 27-O-desmethyl everolimus, 40-O-desethylhydroxyeverolimus (sirolimus) may be mentioned (Ther. Drug Monit., 2007 Dec, 29 (6), 743-9).
  • macrolide-based immunosuppressants and metabolites of macrolide-based immunosuppressants with macrolide structure should take into account factors such as individual differences, they are present in the blood of animals such as humans at a predetermined ratio. It can.
  • blood tests for macrolide immunosuppressants can also be performed indirectly by measuring the concentration of metabolites in the blood sample.
  • the blood test can be performed by measuring the concentration of macrolide immunosuppressant.
  • binding proteins to macrolide immunosuppressants or their metabolites having macrolide structure contained in blood samples More specifically, specific binding proteins for tacrolimus (FK506) or a metabolite thereof having a macrolide structure include, for example, FK506 binding protein (FKBP) (eg, FKBP12, FKBP13, FKBP14, FKBP2, FKBP3) It can be mentioned.
  • FKBP FK506 binding protein
  • Specific binding proteins to cyclosporin A or its metabolite having a macrolide structure include, for example, cyclophilin A and cyclophilin B.
  • Specific binding proteins to sirolimus (rapamycin) and derivatives thereof or their metabolites having macrolide structure include, for example, FKBP12. Such specific binding proteins are mainly present in the red blood cell fraction.
  • non-specific binding proteins to macrolide immunosuppressants or their metabolites having macrolide structure include, for example, albumin, lipoproteins and ⁇ 1-acid glycoprotein.
  • any acid capable of acidifying a blood sample can be used.
  • Such acids include, for example, inorganic acids (eg, phosphoric acid, boric acid, carbonic acid, hydrochloric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid), and organic acids (eg, acetic acid, citric acid, glycine, tartaric acid, 2-morpholinoethanesulfonic acid) (MES), formic acid, oxalic acid, lactic acid, maleic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, and mixtures of two or more thereof (e.g., two, three, four or five).
  • inorganic acids eg, phosphoric acid, boric acid, carbonic acid, hydrochloric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid
  • organic acids eg, acetic acid, citric acid, glycine, tartaric acid, 2-morpholinoethanesulfonic acid) (MES)
  • MES 2-
  • any alkali capable of making the blood sample alkaline can be used.
  • an alkali for example, a hydroxide of an inorganic base (eg, metal such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide etc.
  • bicarbonates of metals such as sodium, potassium hydrogen carbonate and calcium hydrogen carbonate (eg, monovalent metals and divalent metals), metals such as sodium carbonate, potassium carbonate and calcium carbonate (eg, monovalent metals and divalent metals)
  • Salts of metals such as sodium phosphate and potassium phosphate (eg, phosphates of monovalent metals), metals such as sodium borate and potassium borate (eg, borate salts of monovalent metals), and ammonia Organic bases (eg, amines such as trimethylamine and triethylamine, nitrogen-containing heterocyclic compounds such as pyridine), and two or more thereof (eg, two, three, four or five) Compounds, and the like.
  • amines such as trimethylamine and triethylamine, nitrogen-containing heterocyclic compounds such as pyridine
  • the treatment of the blood sample may be either acid or alkali, but from the viewpoint of detection sensitivity of the macrolide immunosuppressant in the blood sample, the treatment of the blood sample is carried out with acid. Is more preferred.
  • the treatment with acid or alkali is described in detail below.
  • a macrolide immunosuppressant, or a macrolide immunosuppressant as the acid or alkali treatment of a blood sample containing a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having a macrolide structure, or a metabolite thereof having a macrolide structure It is particularly limited as long as it is a treatment that can enhance the acidity of the blood sample (in other words, can lower the pH) or enhance the alkalinity (in other words, can raise the pH) to the extent that proteins can be dissociated.
  • a mixture of a blood sample and an acidic solution eg, acidic buffer solution, non-buffering acidic solution
  • an alkaline solution eg, alkaline buffer solution, non-buffering alkaline solution
  • And dilution of the acid (solid) or alkali (solid) in the blood sample is preferred.
  • the volume of the blood sample to be treated is not particularly limited as long as the macrolide immunosuppressant or the metabolite having the macrolide structure can be measured by the method of the present invention, and is, for example, 0.1 to 500 ⁇ L, preferably It is 0.5 to 400 ⁇ L, more preferably 1.0 to 300 ⁇ L, and even more preferably 2.0 to 200 ⁇ L.
  • the volume of the acidic solution or alkaline solution to be mixed with the blood sample is that of the blood sample to the extent that the macrolide immunosuppressant or its metabolite having macrolide structure and the binding protein therefor can be dissociated.
  • the degree of alkalinity or alkalinity is, for example, 0.5 to 5,000 ⁇ L, preferably 1.0 to 3,000 ⁇ L, more preferably 2.0 to 1,000 ⁇ L, and further More preferably, it is 5.0 to 500 ⁇ L.
  • the mixing ratio of the blood sample to the acidic solution or alkaline solution is not particularly limited as long as it can enhance the acidity or alkalinity of the blood sample, for example 1/100 to 100 And preferably 1/50 to 50, more preferably 1/30 to 30, and still more preferably 1/20 to 20.
  • the blood sample is an animal-derived sample as described above and exhibits neutral character.
  • the macrolide immunosuppressive agent contained therein or its metabolite having macrolide structure can be dissociated from its binding protein. Therefore, such treatment can prepare an acidic or alkaline blood sample containing a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having macrolide structure, which is dissociated from the binding protein. .
  • an acidic or alkaline blood sample containing a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having macrolide structure which is dissociated from the binding protein.
  • an acidic or alkaline blood sample containing a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having macrolide structure, which is dissociated from the binding protein.
  • sufficient time for dissociation under predetermined temperature conditions. (Eg, leaving) is preferred.
  • the temperature is preferably not high temperature and not long time .
  • a temperature is, for example, 5 to 45 ° C., preferably 15 to 40 ° C.
  • time is, for example, 10 seconds to 60 minutes, preferably 20 seconds to 30 minutes, and more preferably 30 seconds to 15 minutes.
  • the treatment comprises the blood sample and the acidic buffer solution from the viewpoint of simple and rapid preparation of the acidic blood sample, and application of a certain acidity to the acidic blood sample.
  • the acidic buffer a buffer containing any acid capable of exhibiting a buffering capacity in the acidic region can be used.
  • Such acids include, for example, inorganic acids (eg, phosphoric acid, boric acid, carbonic acid), and organic acids (eg, acetic acid, citric acid, glycine, tartaric acid, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), trifluoro Acetic acid, phthalic acid), and mixtures of two or more thereof (eg, two, three, four or five) can be mentioned.
  • inorganic acids eg, phosphoric acid, boric acid, carbonic acid
  • organic acids eg, acetic acid, citric acid, glycine, tartaric acid, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), trifluoro Acetic acid, phthalic acid
  • the pH of an acidic solution such as an acidic buffer may vary depending on factors such as the type and concentration of macrolide immunosuppressant or its metabolite having macrolide structure, and its binding protein, for example, 1.0 It is ⁇ 5.0.
  • a buffer capable of exhibiting a buffering capacity in such an acidic region of pH is preferable.
  • Such buffers include, for example, phosphate buffer, tartrate buffer, citrate buffer, acetate buffer, trifluoroacetic acid buffer, phthalate buffer, glycine buffer, carbonate-bicarbonate buffer, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer is mentioned.
  • the pH is preferably 1.5 or more, more preferably 2.0 or more, and even more preferably 2.5 or more from the viewpoint of eliminating the influence of the above-described factors as much as possible to improve versatility. Good.
  • the pH may also be preferably 4.8 or less, more preferably 4.5 or less. More specifically, the pH is preferably 1.5 to 4.8, more preferably 2.0 to 4.8, still more preferably 2.5 to 4.8, particularly preferably 2.5 to 4 .5 may be used.
  • the measurement of pH can be performed using methods known in the art. Preferably, pH can adopt a value measured at 25 ° C. using a pH meter having a glass electrode.
  • the treatment is carried out with a blood sample and an alkaline buffer solution from the viewpoint of simple and rapid preparation of the alkaline blood sample, and provision of a constant alkalinity to the alkaline blood sample.
  • a buffer containing any base capable of exhibiting a buffering capacity in the basic region can be used. Such bases are similar to those described above.
  • the pH of an alkaline solution such as an alkaline buffer may vary depending on factors such as the type and concentration of the macrolide immunosuppressant or its metabolite having a macrolide structure, and its binding protein, for example, 8.0 ⁇ 13.0.
  • an alkaline solution of pH 8.0 to 13.0 a buffer capable of exhibiting a buffering capacity in such a basic region of pH is preferable.
  • Such buffers include, for example, phosphate buffer, carbonate-bicarbonate buffer, borate buffer, MES buffer, N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer, piperazine-1 , 4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) buffer, N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES) buffer, colamin hydrochloride buffer, N, N-bis (2- Hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES) buffer, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) buffer, 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1 -Piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, acetamidoglycine buffer, tricine buffer, glycinamide buffer, bicine buffer, tris buffer It is.
  • the pH may be preferably 9.0 or more.
  • the pH may also be preferably less than or equal to 12.0, particularly preferably less than or equal to 11.0. More specifically, the pH may be preferably pH 9.0 to 12.0, particularly preferably pH 9.0 to 11.0.
  • the measurement of pH is as described above.
  • An acidic solution such as an acidic buffer or an alkaline solution such as an alkaline buffer may or may not contain an antibody against a macrolide immunosuppressant or its metabolite having a macrolide structure.
  • the acidic solution or the alkaline solution contains such an antibody, measurement of the concentration of the macrolide immunosuppressant or its metabolite having a macrolide structure can be performed using the antibody.
  • the acidic solution or alkaline solution may also contain other substances.
  • Such other substances include, for example, water-miscible organic solvents (eg, alcohols, ethers, esters), modifiers (eg, chaotropic agents), surfactants (eg, cationic surfactants, anions) Substances such as anionic surfactants, zwitterionic surfactants, nonionic surfactants, bile salt surfactants), hemolytic agents, competitors (eg, analogues) etc. (eg, the patents mentioned above) References 1 to 9).
  • water-miscible organic solvents eg, alcohols, ethers, esters
  • modifiers eg, chaotropic agents
  • surfactants eg, cationic surfactants, anions
  • Substances such as anionic surfactants, zwitterionic surfactants, nonionic surfactants, bile salt surfactants), hemolytic agents, competitors (eg, analogues) etc. (eg, the patents mentioned above) References 1 to 9).
  • the pH of an acidic blood sample or alkaline blood sample prepared by treatment of a blood sample with acid or alkali is similar to that described above for an acidic solution such as an acidic buffer or an alkaline solution such as an alkaline buffer. Therefore, for examples and preferred examples of the pH of such acidic blood samples or alkaline blood samples, reference can be made to those of the above-mentioned acidic solution or alkaline solution.
  • the antibody used in the present invention is an antibody against a macrolide immunosuppressant or its metabolite having a macrolide structure.
  • Such antibodies may be either polyclonal or monoclonal antibodies.
  • the antibody may be any isotype of immunoglobulin (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY).
  • the antibodies may also be full length antibodies.
  • a full-length antibody refers to an antibody (for example, an antibody containing two Fab portions and an Fc portion) containing heavy and light chains each containing a variable region and a constant region.
  • the antibodies may also be antibody fragments derived from such full-length antibodies.
  • the antibody fragment is a part of a full-length antibody, for example, a constant region deleted antibody (eg, F (ab ') 2 , Fab', Fab, Fv).
  • the antibody may also be a modified antibody such as a single chain antibody.
  • the antibody may be an IgG, an IgM, or an antibody fragment thereof.
  • not only one type of antibody but also two or more types (for example, two or three types) of antibodies can be used.
  • a macrolide immunosuppressant or an antibody that recognizes only a metabolite having a macrolide structure can be used.
  • a macrolide immunosuppressant or a macrolide in addition to a macrolide immunosuppressant or an antibody that recognizes only its metabolite having a macrolide structure, a macrolide immunosuppressant or a macrolide An antibody that recognizes a complex of its metabolite having a structure and an antibody thereto can be used as a macrolide immunosuppressant, or an antibody against its metabolite having a macrolide structure (e.g., WO2004 /). 11644; International Publication No. 2013/042426; Nucleic Acids Res. (Feb 2011) vol. 39, no. 3, e14).
  • Antibodies against macrolide immunosuppressants or their metabolites with macrolide structure can be made using any method known in the art. For example, antibodies can be produced using a macrolide immunosuppressant or a metabolite thereof having a macrolide structure as an antigen. In addition, since antibodies against macrolide immunosuppressants or their metabolites having macrolide structure are commercially available, such commercially available products can also be used.
  • one or more (e.g., one or two) antibodies to a macrolide immunosuppressant or a metabolite thereof having a macrolide structure can be used.
  • a secondary antibody to the antibody can also be used.
  • the antibody may be immobilized on a solid phase.
  • an antibody immobilized on a solid phase may be simply referred to as a solid phase antibody.
  • a solid phase antibody for example, a solid phase capable of containing or loading a liquid phase (eg, well plate, microchannel, glass capillary, nanopillar, monolith column, vessel such as tube; tube; support such as plate, membrane, filter paper etc.
  • solid phases eg, solid carriers such as particles
  • the material of the solid phase include glass, plastic, metal, and carbon.
  • a nonmagnetic material or a magnetic material can also be used as the material of the solid phase, a magnetic material is preferable for the solid phase carrier from the viewpoint of ease of operation, etc.
  • a method for immobilizing the antibody on a solid phase any method known in the art can be used. Such methods include, for example, physical adsorption methods, covalent bonding methods, methods using affinity substances (eg, biotin, streptavidin), and ion binding methods.
  • the antibody may be labeled with a labeling substance.
  • labeling substances include enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (eg, streptavidin, biotin), fluorescent substances or proteins (eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green color) Fluorescent proteins, red fluorescent proteins), luminescent or light absorbing substances (eg, luciferin, aequorin, acridinium), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I) can be mentioned.
  • enzymes eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase
  • affinity substances eg, streptavidin, biotin
  • fluorescent substances or proteins eg, fluorescein, fluorescein isothiocyan
  • Measurement of the concentration of a macrolide immunosuppressant with an antibody or a metabolite thereof having a macrolide structure can be performed by an immunoassay.
  • an immunoassay for example, enzyme immunoassay (EIA) [eg, chemiluminescence EIA (CLEIA), enzyme adsorption EIA (ELISA)], fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay Methods include agglutination, immunostaining, flow cytometry, biolayer interferometry, in situ PLA method, chemically amplified luminescence proximity proximity assay, line blot, and Western blot.
  • the present invention is carried out by a method comprising: (A) treating a blood sample containing a macrolide immunosuppressant or a metabolite thereof having a macrolide structure with acid or alkali; and (b) using the antibody to detect said macrolide immunity in the blood sample. Measuring the concentration of the inhibitor or said metabolite.
  • Steps (a) and (b) may be performed in parallel or separately.
  • the blood sample with acid or alkali when using an acid buffer or alkaline buffer containing an antibody against macrolide immunosuppressant or its metabolite having macrolide structure, the blood sample with acid or alkali Processing and measurement of concentration by antibodies can be performed in parallel.
  • a macrolide-based immunosuppressant, or a second antibody (eg, a labeled antibody) against its metabolite having a macrolide structure may further be used.
  • steps (a) and (b) can be carried out continuously or discontinuously. If steps (a) and (b) are performed discontinuously, the acid-treated blood sample may be subjected to further processing.
  • treatment for example, treatment similar to the pretreatment as described above (eg, filtration, heating, hemolysis), change of pH, treatment with a predetermined chemical substance can be mentioned.
  • the present invention may be practiced by a method comprising: (A ') treating a blood sample containing the macrolide immunosuppressant or the metabolite with an acid or alkali to prepare an acidic blood sample or an alkaline blood sample; and (b') using an antibody Measuring the concentration of the macrolide immunosuppressant or the metabolite in the acidic blood sample or the alkaline blood sample.
  • Steps (a ') and (b') may be performed in parallel or separately. Also, steps (a ') and (b') can be carried out continuously or discontinuously. For example, if steps (a ') and (b') are performed sequentially, the acidic blood sample or alkaline blood sample prepared in step (a ') can be subjected as it is to step (b'). If steps (a ') and (b') are performed non-continuously, the acidic or alkaline blood sample may be subjected to further processing. Such treatment is, for example, similar to that described above in the description of steps (a) and (b).
  • the present invention measures the concentration of a dissociated macrolide substance with an antibody while dissociating the binding of a macrolide substance used as an immunosuppressant and its binding protein in a blood sample under acidic conditions or alkaline conditions It is based on the finding that it can be done and moreover it is excellent in quantitativeness in measurement.
  • Such macrolide substances have a specific cyclic structure (relatively rigid structure, lack of flexibility), and a high molecular weight (molecular weight of about 800 to 1300) having a relatively high degree of hydrophobicity. It is a compound.
  • the invention may be practiced by a method comprising: (A ′ ′) A blood sample containing the macrolide immunosuppressant or the metabolite described above is treated with acid or alkali to prepare an acidic blood sample or an alkaline blood sample, followed by neutralization, and then a neutral blood sample. And (b ′ ′) measuring the concentration of the macrolide immunosuppressant, or the metabolite, in the neutral blood sample using an antibody.
  • step (b ′ ′) After the blood sample is treated with acid or alkali, neutralization may be performed.
  • the neutralization solution used for the neutralization treatment is particularly limited as long as it has a composition capable of bringing the pH of the acidic blood sample or alkaline blood sample generated by the treatment with acid or alkali to about 6.5 to 7.5. It is not a thing.
  • the neutralizing solution for the acidic blood sample contains, for example, the substance shown as the above-mentioned alkali, and the pH is preferably 8.0 to 13.0.
  • the neutralizing solution for the alkaline blood sample contains, for example, the substance shown as the above-mentioned acid, and the pH is preferably 1.0 to 6.5.
  • the neutralization liquid may contain a chaotropic modifier.
  • a chaotropic modifier urea, thiourea, guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, sodium salicylate, sodium thiocyanate, sodium perchlorate, acetamide, formamide and the like can be mentioned.
  • the final concentration of the chaotropic modifier is preferably 0.5 M to 8.0 M.
  • Treating a blood sample with acid or alkali followed by neutralization can reduce the risk of decreasing the activity of the low acid or alkali resistant antibody, while dissociating macrolide immunosuppressants and binding proteins There is a concern about the risk that the sensitivity will fall due to the recombination with the By adding a chaotropic modifier to the neutralization solution, the influence of the recombination can be reduced.
  • the chaotropic modifier may be added to the acidic solution or the alkaline solution instead of the neutralization solution. Alternatively, it may be added to both the neutralization solution and the acidic solution or alkaline solution.
  • the invention also relates to blood for macrolide immunosuppressants comprising (1) an acid or an alkali, and (2) a macrolide immunosuppressant, or one or more antibodies against its metabolite having a macrolide structure.
  • macrolide immunosuppressants comprising (1) an acid or an alkali, and (2) a macrolide immunosuppressant, or one or more antibodies against its metabolite having a macrolide structure.
  • the acid or alkali is as described above.
  • the acid or alkali may be solid or liquid, but is preferably liquid. Therefore, the reagent of the present invention may be one or more (eg, 1 or 2) of (1 ') acidic solution or alkaline solution, and (2') macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having a macrolide structure. Preferably, the antibody of the species) is included.
  • the acidic solution or alkaline solution and its pH are as described above.
  • the acidic solution or alkaline solution may be an acidic buffer or alkaline buffer or an acid solution or alkaline solution having no buffer capacity, but is preferably an acidic buffer or alkaline buffer.
  • the reagent of the present invention comprises (1 ′ ′) an acidic buffer or alkaline buffer, and (2 ′ ′) macrolide immunosuppressant, or one or more antibodies against its metabolite having macrolide structure. It is preferable to include.
  • the acidic or alkaline buffer and their pH are as described above.
  • An acidic solution such as an acidic buffer or an alkaline solution such as an alkaline buffer can be provided in the form of a liquid or a frozen product.
  • the acidic buffer or alkaline buffer may be contained in a container as described above, or in a large container such as a bottle.
  • One or more antibodies against a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having a macrolide structure, in a form dissolved in a liquid such as a buffer, or in the form of a frozen product thereof, or a lyophilizate of the antibody Can be provided in the form of One or more antibodies against a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having a macrolide structure, in a free form (eg, solution, frozen product) or in a form immobilized on a solid phase as described above Can be provided.
  • the reagent of the present invention is one or more of (1 ′ ′) acidic buffer or alkaline buffer, and (2 ′ ′) macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having macrolide structure
  • the antibody of (1) may be a composition in which the antibodies of (1) or (2) are integrated with each other, an acid buffer solution or an alkaline buffer solution containing one or more antibodies against macrolide immunosuppressants or their metabolites having macrolide structure.
  • the reagent of the present invention may be added to an acid buffer solution or alkaline buffer solution containing one or more antibodies against macrolide immunosuppressant or its metabolite having macrolide structure, It may comprise different macrolide immunosuppressants, or one or more antibodies against its metabolite having macrolide structure and / or secondary antibodies against the antibody.
  • Such reagents can be suitably used in immunoassays using two or more antibodies.
  • the reagent of the present invention is (1 ′ ′) an acidic buffer or alkaline buffer, and (2 ′ ′) a macrolide immunosuppressant, or one type thereof for a metabolite having a macrolide structure
  • It may be a kit containing the above antibodies in a isolated form.
  • one or more antibodies against macrolide immunosuppressant or its metabolite having macrolide structure and an acidic buffer solution or alkaline buffer are sequestered, so macrolide immunosuppression is carried out.
  • the performance of one or more antibodies against the agent or its metabolite having macrolide structure can be maintained over time.
  • the reagent of the present invention is excellent in storage stability.
  • the reagent of the present invention is added to (1) an acid or an alkali, and (2) a macrolide immunosuppressant, or one or more antibodies against its metabolite having macrolide structure. , (3) including a neutralizing solution.
  • the neutralization solution and its pH are as described above.
  • the reagent of the present invention may also contain a macrolide immunosuppressant, or a metabolite (preparatory product) having a macrolide structure.
  • a macrolide immunosuppressant, or a metabolite thereof having a macrolide structure can be used, for example, as a positive control and / or for the creation of a standard curve for quantification.
  • the reagent of the present invention may further contain components necessary for immunoassay using a macrolide immunosuppressant, or an antibody against its metabolite having macrolide structure.
  • Such components include substrates for labeling substances and enzymes as described above, and diluents, secondary antibodies, and stabilizers for antibodies, devices capable of collecting samples from mammals (eg, syringes, biopsy needles) Can be mentioned.
  • Example 1 Tacrolimus detection ELISA in whole blood samples by acid treatment
  • the materials used in Example 1 are as follows.
  • 96-well immunoplate Nunc Maxisorp C96 immunoplate (Thermo, Cat # 430341)
  • Anti-tacrolimus solid phase antibody 1 (mouse IgG): Tac 5-26-8 (in-house antibody)
  • Anti-tacrolimus solid phase antibody 2 (mouse IgM): FK1 (HyTest, catalog number: 4FK42)
  • Anti-tacrolimus solid phase antibody 3 (mouse IgG): FK2 (Biorbyt, catalog number: orb79532) Washing solution: 0.5% by volume Tween 20 / PBS Blocking solution: 1 wt% BSA / PBS Sample: Lyphocheck (registered trademark) Whole Blood Immunosuppressant Control (BIO-RAD) Levels 1, 2, 3, 4 and 5.
  • tacrolimus, cyclosporin A, and everolimus are spiked into whole blood samples, and the measured values by various measurement systems are disclosed.
  • the measurement values of tacrolimus by HPLC-MS adopted in the present example were 4.75 ng / mL (Level 1), 8.44 ng / mL (Level 3), 15.8 ng / mL (Level 4), 23.6 ng / mL. It is mL (Level 5).
  • the measured values of cyclosporin A by HPLC-MS adopted in the present example are 87 ng / mL (Level 1), 152 ng / mL (Level 2), 354 ng / mL (Level 3), 755 ng / mL (Level 4), 1211 ng / ML (Level 5).
  • the concentrations and the number of the samples were appropriately changed and used according to the purpose of the assay.
  • Anti-tacrolimus antibody-containing culture supernatant (detection antibody): Anti-tacrolimus chicken IgM-containing CHO culture supernatant (in-house antibody) Culture supernatant dilution: 1% by weight BSA / PBS ALP labeled antibody: Alkaline phosphatase labeled mouse anti-chicken IgM mAb (in-house antibody) Labeled antibody dilution: 1 wt% BSA / TBS Luminescent substrate solution: Luminescent luminescent substrate (AMPPD)
  • Example 1 the following acidic buffer was used.
  • Phosphate buffer solution pH 1.0 to pH 3.0 is prepared by mixing phosphoric acid (H 3 PO 4 ) and aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O) Prepared.
  • Citrate buffer pH 3.5 was prepared by mixing aqueous citric acid (C 6 H 8 O 7 ) solution and aqueous sodium citrate (Na 3 C 6 H 8 O 7 ) solution.
  • Acetate buffer (pH 4.0 to pH 5.5) was a commercial product for Biacore.
  • Phosphate buffer (pH 6.0 to pH 8.0) includes sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O), and disodium hydrogen phosphate 12 hydrate (Na 2) It was prepared by mixing HPO 4 ⁇ 12 H 2 O) aqueous solution.
  • Borate buffer (pH 8.5) was a commercial product for Biacore.
  • the pH and type of the acidic buffer used in Example 1 are as follows.
  • Example 1 was performed in the following procedure. (1) Dilute anti-tacrolimus solid phase antibody 1, anti-tacrolimus solid phase antibody 2 and anti-tacrolimus solid phase antibody 3 respectively to 3 ⁇ g / mL with PBS, add 50 ⁇ L per well to a 96-well immunoplate, 37 The reaction was allowed to proceed for 1 hour at. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5) The sample was diluted 10-fold with an acidic buffer solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the culture supernatant diluted with the culture supernatant was diluted to 0.2 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ L per well was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the ALP-labeled antibody was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with a labeled antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution. (11) 50 ⁇ L of luminescent substrate was added per well, and after reacting for 5 minutes at room temperature, luminescence was detected.
  • Example 2 Quantitative ELISA of tacrolimus in whole blood samples by acid treatment
  • Acidic buffer 100 mM phosphate buffer / pH 2.0
  • Calibration curve substance tacrolimus (1 mg / mL in DMSO)
  • Standard curve dilution 0.5% Tween 20 / PBS
  • Other materials used in Example 2 are the same as in Example 1.
  • Example 2 was performed in the following procedure. (1) Anti-tacrolimus solid phase antibody 1 was diluted to 3 ⁇ g / mL with PBS, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5A) The sample was diluted 10-fold with phosphate buffer (pH 2.0), 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • phosphate buffer pH 2.0
  • the culture supernatant diluted with the culture supernatant was diluted to 0.2 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ L per well was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the ALP-labeled antibody was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with a labeled antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the tacrolimus measurement value was calculated based on the count at the time of sample measurement using the linear approximation formula of the calibration curve.
  • the tacrolimus spiked concentration showed a very high correlation with the tacrolimus spike concentration when the blood sample containing tacrolimus and its specific binding protein and nonspecific binding protein was pretreated with acid ( Figure 2). From the above, it has been shown that when the blood sample containing tacrolimus and its specific binding protein and nonspecific binding protein is pretreated with an acid, the quantitativeness of tacrolimus in the blood sample is excellent.
  • Example 3 Detection ELISA of cyclosporin A in whole blood samples by acid treatment
  • the materials used in Example 3 are as follows.
  • Anti-cyclosporin solid phase antibody 1 (mouse IgG): CS5-12-27 (in-house antibody)
  • Acidic buffer 10 mM acetate buffer / pH 4.0
  • Anti-cyclosporin antibody-containing culture supernatant CHO-culture supernatant of anti-cyclosporin chicken IgM (in-house antibody)
  • Other materials used in Example 3 are the same as in Examples 1 and 2.
  • Example 3 was performed in the following procedure. (1) The anti-cyclosporin solid phase antibody 1 was diluted with PBS so as to be 2.5 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5) The sample was diluted 10-fold with an acidic buffer solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. (6) The wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the culture supernatant was diluted to 0.2 ⁇ g / mL with the culture supernatant dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and the reaction was allowed to react at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the ALP-labeled antibody was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with a labeled antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution. (11) 50 ⁇ L of luminescent substrate was added per well, and after reacting for 5 minutes at room temperature, luminescence was detected.
  • Example 4 Quantitative ELISA of cyclosporin A in whole blood samples by acid treatment
  • Acidic buffer 10 mM acetate buffer / pH 4.0
  • Calibration curve substance cyclosporin A (1 mg / mL in DMSO)
  • Standard curve dilution 0.5% Tween 20 / PBS
  • Other materials used in Example 4 are the same as in Examples 1 to 3.
  • Example 4 was performed in the following procedure. (1) The anti-cyclosporin solid phase antibody 1 was diluted with PBS so as to be 2.5 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5A) The sample was diluted 10-fold with acetic acid buffer solution (pH 4.0), 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • acetic acid buffer solution pH 4.0
  • the ALP-labeled antibody was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with a labeled antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • 50 ⁇ L of luminescent substrate was added per well, and after reacting for 5 minutes at room temperature, luminescence was detected.
  • the cyclosporin A measurement value was calculated based on the count at the time of sample measurement.
  • Example 5 Confirmation of Influence on Specificity of Solid Phase Antibody in Measurement in Acidic Solution
  • Materials used in Example 5 are as follows.
  • Detergent-containing acidic buffer 0.5% Tween 20/10 mM acetate buffer / pH 4.0
  • Neutral buffer solution with surfactant 0.5% Tween 20 / PBS / pH 6.8
  • Biotin-labeled tacrolimus Tac-PEG2-Biotin (1 mg / mL in DMSO, in-house preparation)
  • Tacrolimus analogue compound 1 Sirolimus tacrolimus analogue compound 2: Everolimus tacrolimus analogue compound 3: temsirolimus tacrolimus analogue compound 4: pimecrolimus tacrolimus analogue compound 5: Dihydro FK 506 Tacrolimus: tacrolimus (1 mg / mL in DMSO)
  • ALP labeled Streptavidin Alkaline phosphatase labeled Streptavidin (Calbiochem
  • Example 5 was performed in the following procedure.
  • A Preparation of mixed solution of biotin-labeled tacrolimus and tacrolimus analogue
  • Biotin-labeled tacrolimus was diluted to 10 ng / mL with a surfactant-containing acidic buffer solution or a surfactant-containing neutral buffer solution.
  • (B) Inhibition Assay (1) The anti-tacrolimus solid phase antibody 1 was diluted with PBS to 3 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5) A mixture of the biotin-labeled tacrolimus and the tacrolimus analogue prepared in (A) was added at 50 ⁇ L per well, and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour.
  • the binding inhibition mode in the acidic solution is that in the neutral solution ( Figures 5-1 and 5-2). This indicates that the acidic conditions do not affect the specificity of the antibody. From the above, it was shown that the specificity of the antibody is maintained in an acidic solution.
  • Example 6 Confirmation of Dissociation of Macrolide Immunosuppressive Agent from Specific Binding Protein in Acid Treatment
  • FKBP12 recombinant FKBP12 (Sino Biological Inc, catalog number: 10268-H08E)
  • Tacrolimus tacrolimus (1 mg / mL in DMSO) Tacrolimus ⁇
  • FKBP Dilution 1 0.5% Tween 20 / PBS Tacrolimus
  • FKBP Dilution Solution 2 0.5% Tween 20/200 mM phosphate buffer / pH 2.0
  • Other materials used in Example 6 are the same as in Examples 1-5.
  • Example 6 was performed according to the following procedure.
  • A Binding of tacrolimus and FKBP12
  • Tacrolimus is diluted with tacrolimus / FKBP Dilution Solution 1, 240 ng / mL, 80 ng / mL, 26.6 ng / mL, 8.89 ng / mL, 1.48 ng / mL, 0
  • a dilution series of .49 ng / mL, 0.165 ng / mL, 0 was prepared.
  • (2) FAKBP12 was diluted to 100 ⁇ g / mL with tacrolimus / FKBP Dilution Solution 1.
  • a mixture of tacrolimus and FKBP12 prepared in (A) was diluted 10-fold with tacrolimus / FKBP dilution 1 or tacrolimus / FKBP dilution 2 and then 50 ⁇ L per well was added and allowed to react at 37 ° C. for 1 hour .
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the culture supernatant diluted with the culture supernatant was diluted to 0.2 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ L per well was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the ALP-labeled antibody was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with a labeled antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • 50 ⁇ L of luminescent substrate was added per well, and after reacting for 5 minutes at room temperature, luminescence was detected.
  • Example 7 Tacrolimus detection ELISA in whole blood samples by alkali treatment
  • the materials used in Example 7 such as the 96-well immunoplate, anti-tacrolimus solid phase antibody 1, washing solution, blocking solution and the like are the same as the materials used in Examples 1-6.
  • Example 7 was performed according to the following procedure. (1) Anti-tacrolimus solid phase antibody 1 was diluted to 3 ⁇ g / mL with PBS, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C.
  • the alkaline phosphatase-labeled anti-chicken IgM antibody was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with a labeled antibody diluent, and 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • 50 ⁇ L of luminescent substrate was added per well, and after reacting for 5 minutes at room temperature, luminescence was detected.
  • Example 8 Tacrolimus detection ELISA in whole blood samples by acid treatment and neutralization treatment
  • the materials used in Example 8 are as follows. Acidic buffer: 50 mM phosphate buffer / pH 2.0 Neutral buffer: 200 mM phosphate buffer / pH 7.0 Neutralization solution 1: 8 M urea / 200 mM phosphate buffer / pH 8.0 Neutralization solution 2: 4 M guanidine hydrochloride / 200 mM phosphate buffer / pH 8.0
  • Other materials used in Example 8 are the same as in Examples 1 to 7.
  • Example 8 was performed according to the following procedure. (1) Anti-tacrolimus solid phase antibody 1 was diluted to 3 ⁇ g / mL with PBS, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5) 24 ⁇ L of an acid buffer solution was added to 6 ⁇ L of the sample and reacted, and then 30 ⁇ L of Neutralization Solution 1 or Neutralization Solution 2 was added to neutralize the pretreated sample.
  • the sample with neutral buffer A 10-fold dilution was also prepared.
  • 50 ⁇ L / well of the treated sample was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the anti-tacrolimus IgM antibody was diluted to 0.5 ⁇ g / mL with anti-tacrolimus IgM antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Example 9 Everolimus detection ELISA in whole blood samples by acid treatment and neutralization treatment
  • Conjugate solid phase Everolimus-BSA conjugate (in-house antibody)
  • Anti-everolimus antibody rabbit polyclonal antibody
  • EVER antibody solution 1 everolimus kit Nanopia TDM Everolimus (Sekisui Medical Co., Ltd.)
  • Washing solution Lumipulse washing solution
  • ClinCal registered trademark
  • Whole Blood Calibrator Set Lyophilised RECIPE
  • the measured values of everolimus by HPLC-MS adopted in the present example were 0 ng / mL (Level 0), 1.45 ng / mL (Level 1), 2.86 ng / mL (Level 2), 5.27 ng / mL (Level 2). Level 3), 11.7 ng / mL (Level 4), 23.2 ng / mL (Level 5), 48.0 ng / mL (Level 6).
  • ALP-labeled antibody alkaline phosphatase-labeled pig anti-rabbit Ig polyclonal antibody (DAKO, catalog number: D0306)
  • Antibody Diluent 0.5% by volume Tween 20 / PBS
  • Other materials used in Example 9 are the same as in Examples 1-8.
  • Example 9 was performed according to the following procedure. (1) The everolimus-BSA conjugate was diluted with PBS to a concentration of 5 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L per well was added to a 96-well immunoplate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (2) The wells were washed 3 times with a washing solution. (3) 150 ⁇ L of blocking solution was added per well and allowed to react overnight at 4 ° C. (4) The wells were washed 3 times with a washing solution. (5) A 6 ⁇ L sample was reacted with 48 ⁇ L of an acid buffer solution, and 18 ⁇ L of Neutralization Solution 2 or an acid buffer solution was added to prepare a pretreatment solution.
  • This pretreatment solution and a 5-fold diluted antibody solution are mixed at a volume ratio of 1: 1, and 50 ⁇ L per well is added to a 96-well immunoplate immobilized with everolimus-BSA conjugate, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • the antibody was diluted with 0.2 ⁇ g / mL of ALP-labeled antibody in antibody dilution solution, 50 ⁇ L per well was added, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the wells were washed 3 times with a washing solution.
  • 50 ⁇ L of luminescent substrate was added per well, and after reacting for 5 minutes at room temperature, luminescence was detected.
  • the present invention is useful, for example, for the therapeutic drug monitoring (TDM) of a macrolide immunosuppressant.

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Abstract

本発明は、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査を簡便および／または高精度に行うことを提供する。具体的には、本発明は、以下を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法を提供する： （ａ）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理すること；ならびに （ｂ）抗体を用いて、血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。

Description

マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法
　本発明は、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法などに関する。
　タクロリムス（ＦＫ５０６）、シクロスポリンＡをはじめとするマクロライド系免疫抑制剤は、臓器移植後の拒絶反応回避、自己免疫疾患の治療等に有効であるが、適切な治療のためには血中薬物濃度を適切な治療濃度域に保つことが求められるため、治療期間中は血中薬物濃度を監視する必要がある。
　投与されたタクロリムスおよびシクロスポリンＡの大部分は、患者血中の赤血球画分に存在している。したがって、ＴＤＭ（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）における血液試料としては、赤血球画分を含む全血が用いられている。
　ところで、全血等の血液試料が薬物に対する結合タンパク質を含む場合、血液試料中の薬物濃度を測定するためには、適切な前処理により血液試料中の薬物をその結合タンパク質から解離させることが必須である。このような前処理では、一般的に、有機溶媒、変性剤、界面活性剤等の化学物質が用いられている。
　例えば、このような前処理を記載する先行技術として、以下を挙げることができる。
　特許文献１には、両イオン性界面活性剤およびサポニンの使用が記載されている。
　特許文献２には、ノニオン系界面活性剤（例、サポニン）またはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含む溶血剤、および胆汁酸塩界面活性剤からなる抽出剤の使用が記載されている。
　特許文献３には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリコール（例、エチレングリコール）および亜鉛塩類（例、硫酸亜鉛）を含む試薬の使用が記載されている。
　特許文献４には、プロテアーゼ、グリコール（例、エチレングリコール）およびアルコール（例、メタノール）の使用が記載されている。
　特許文献５には、グリコール（例、エチレングリコール）、アルコール（例、メタノール）および塩（例、塩化ナトリウム）を含む抽出試薬試料の使用が記載されている。
　特許文献６には、サポニン、メタノール、エチレングリコールおよび硫酸亜鉛の使用が記載されている。
　特許文献７には、溶血剤および界面活性剤〔例、イオン性界面活性剤（例、ＳＤＳ）、非イオン性界面活性剤（例、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－４０５）〕の使用が記載されている。
　特許文献８には、遊離剤（例、疎水性薬物の類似体）、および選択的可溶化剤（例、エチレングリコール、グリセロール、１－メトキシ－２－プロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルスルホン又はジメチルホルムアミド）の使用が記載されている。
　特許文献９には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、少なくとも１つの二価金属塩および水を含む抽出試薬組成物であって、ＤＭＳＯ濃度が抽出試薬組成物の５０容量％以上のものの使用が記載されている。
　また、このような前処理の多くは、薬物をその結合タンパク質から解離させた後、薬物をその結合性タンパク質から分離するために、タンパク質成分の沈殿操作（遠心分離）を必要とする。
特表２００８－５３８００１号公報 特許第５１２４４６７号 特許第５１３４６９２号 特許第５４５００９２号 特許第４９６８６１１号 特許第５１７４８９８号 特許第５６９０８８８号 特許第４９４０４３８号 特許第５１３４６９２号
　上述したような先行技術では、特殊な物質による試料の前処理および沈澱操作を要し、アッセイ全体として複雑になり易いことから、アッセイの簡便化が難しいという課題がある。
　また、揮発性の高い有機溶媒を用いる方法では、抽出の各段階やアッセイ中のインキュベーションの間に有機溶媒の蒸発が起こるため、薬物の濃度の測定値がみかけ上高い値を示し、精度に欠けるという課題もある。
　したがって、本発明の目的は、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査について、簡便および／または高精度に行い得る代替的な方法を提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査を抗体で行う場合、酸またはアルカリ（塩基）による血液試料の前処理が有効であること、ならびにこのような前処理により上記課題を解決できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法：
（ａ）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理すること；ならびに
（ｂ）抗体を用いて、血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
〔２〕マクロライド系免疫抑制剤が、タクロリムス、シクロスポリンＡ、またはエベロリムスである、〔１〕の方法。
〔３〕血液試料がヒト血液試料である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記血液試料の処理が、酸による処理である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記酸による処理が、前記血液試料と酸性緩衝液との混合により行われる、〔４〕の方法。
〔６〕酸性緩衝液のｐＨが１．０～５．０である、〔５〕の方法。
〔７〕免疫抑制剤に対する抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはそれらの抗体断片である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕以下を含む方法である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法：
（ａ’）前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理して、酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製すること；ならびに
（ｂ’）抗体を用いて、前記酸性血液試料または前記アルカリ性血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
〔９〕以下を含む方法である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法：
（ａ’’）前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理して酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製した後、中和を行い、中性血液試料を調製すること；ならびに
（ｂ’’）抗体を用いて、前記中性血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
〔１０〕前記中和が、カオトロピック変性剤を含む中和液を前記酸性血液試料またはアルカリ性血液試料と混合して行われる、〔９〕の方法。
〔１１〕（１）酸またはアルカリ、および（２）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査試薬。
〔１２〕酸が酸性緩衝液である、〔１１〕の試薬。
〔１３〕さらに（３）中和液を含む、〔１１〕または〔１２〕の試薬。
　本発明は、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査を良好に行うことができる。
　例えば、本発明は、簡便かつ高精度であり、しかも処理能力の高い検査を実現することができる。
　より具体的には、本発明によれば、マクロライド系免疫抑制剤およびその代謝物を含む血液試料の酸性化（例、血液試料および酸性緩衝液の混合）またはアルカリ性化（例、血液試料およびアルカリ性緩衝液の混合）という簡便な操作（前処理）により、酸性血液試料中またはアルカリ性血液試料中のマクロライド系免疫抑制剤およびその代謝物の濃度を抗体で首尾よく測定することができる。これにより、個人の技術習熟度に応じた測定値の変動を回避することができ、また、検査の処理能力（ハイスループット）を改善することができる。
　また、本発明によれば、有機溶媒の使用が必須でないため、有機溶媒の蒸発による濃縮を回避することができ、マクロライド系免疫抑制剤およびその代謝物の濃度を高精度に測定することができる。
図１－１は、種々のｐＨ条件下における、タクロリムス結合タンパク質から解離したタクロリムスのイムノアッセイを示す図である。固相抗体：抗タクロリムス抗体（自社抗体であるマウスＩｇＧ）；検出抗体：抗タクロリムスニワトリＩｇＭ。 図１－２は、種々のｐＨ条件下における、タクロリムス結合タンパク質から解離したタクロリムスのイムノアッセイを示す図である。固相抗体：抗タクロリムス抗体（市販抗体であるマウスＩｇＭ）；検出抗体：抗タクロリムスニワトリＩｇＭ。 図１－３は、種々のｐＨ条件下における、タクロリムス結合タンパク質から解離したタクロリムスのイムノアッセイを示す図である。固相抗体：抗タクロリムス抗体（市販抗体であるマウスＩｇＧ）；検出抗体：抗タクロリムスニワトリＩｇＭ。 図２は、タクロリムス（検量線物質）およびその結合タンパク質を含む血液試料を酸により前処理した場合におけるタクロリムス濃度の測定値と、検体におけるタクロリムスのスパイク濃度との相関性を示す図である。 図３は、種々のｐＨ条件下における、シクロスポリンＡ結合タンパク質から解離したシクロスポリンＡのイムノアッセイを示す図である。固相抗体：抗タクロリムス抗体（自社抗体であるマウスＩｇＧ）；検出抗体：抗タクロリムスニワトリＩｇＭ。 図４は、シクロスポリンＡ（検量線物質）およびその結合タンパク質を含む血液試料を酸により前処理した場合におけるシクロスポリンＡ濃度の測定値と、検体におけるシクロスポリンＡのスパイク濃度との相関性を示す図である。 図５－１は、中性溶液における、各種タクロリムス類似化合物の濃度に応じた抗タクロリムス抗体とビオチン標識タクロリムスとの結合率（％）を示す図である。 図５－２は、酸性溶液における、各種タクロリムス類似化合物の濃度に応じた抗タクロリムス抗体とビオチン標識タクロリムスとの結合率（％）を示す図である。 図６は、酸性溶液における、タクロリムスおよびその特異的結合タンパク質の結合の解離、ならびに解離したタクロリムスの抗体に対する結合の両立を示す図である。 図７は、全血検体の前処理にアルカリ性溶液を使用した場合の、タクロリムス結合タンパク質から解離したタクロリムスのイムノアッセイの結果を示す図である。固相抗体：抗タクロリムス抗体（自社抗体であるマウスＩｇＧ）；検出抗体：抗タクロリムスニワトリＩｇＭ。 図８－１は、全血検体を酸処理後に尿素含有中和液で処理した検体における、各タクロリムス濃度に応じたイムノアッセイの結果を示す図である。 図８－２は、全血検体を酸処理後にグアニジン塩酸塩含有中和液で処理した検体における、各タクロリムス濃度に応じたイムノアッセイの結果を示す図である。 図９は、全血検体を酸処理後にグアニジン塩酸塩含有中和液で処理した検体における、各エベロリムスの濃度に応じた抗エベロリムス抗体とエベロリムス－ＢＳＡコンジュゲートとの結合率（％）を示す図である。
　本発明は、以下を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法を提供する：
（ａ）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理すること；ならびに
（ｂ）抗体を用いて、血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
　本発明で用いられる血液試料は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む動物血液試料である。このような血液試料は、マクロライド系免疫抑制剤が投与された動物から採取することができる。動物血液試料には、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する結合タンパク質が含まれており、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物、および結合タンパク質は、互いに結合して複合体を形成することができる。このような血液試料が由来する動物は、好ましくは哺乳動物（例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ならびにウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜および使役動物）であり、より好ましくは霊長類であり、特に好ましくはヒトである。また、血液試料としては、例えば、全血、血清、血漿、およびその他の血液画分が挙げられる。マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物、およびそれに対する結合タンパク質の大部分は所定の血液画分（例、赤血球画分）中に存在するため、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物の血中濃度の測定では、このような血液画分、またはこのような血液画分を含む血液試料（例、全血）を用いることができる。分画操作を省略して簡便に濃度を測定する観点から、血液試料として全血の使用が好ましい。血液試料はさらに、免疫の抑制が所望される疾患（例、自己免疫疾患、関節リウマチ、重症筋無力症、クローン病、ループス腎炎、活動期潰瘍性大腸炎、多発性筋炎、移植片宿主病（ＧＶＤＨ）、皮膚筋炎に合併する間質性肺炎）に罹患している哺乳動物、または臓器、組織もしくは細胞の移植（例、心移植、腎移植、骨髄移植、肺移植、肝移植、膵移植、小腸移植）を受けた哺乳動物から採取されるものであることが好ましい。このような哺乳動物から採取される血液試料は、予備処理（例、ろ過、加熱、溶血）に付されてもよい。
　マクロライド系免疫抑制剤は、マクロライド構造（１２個以上の原子から構成される環状ラクトン構造）を含み、かつ免疫系の活動を低下させるか、または阻害する作用を有する化合物である。マクロライド系免疫抑制剤としては、タクロリムス（ＦＫ５０６）、シクロスポリンＡ、シロリムス（ラパマイシン）およびその誘導体（例、エベロリムス、テムシロリムス）、ゾタロリムス、バイオリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、ミオリムス、マイオリムス、ならびにデフォロリムスが挙げられる。
　マクロライド構造を有するマクロライド系免疫抑制剤の代謝物は、マクロライド系免疫抑制剤の種類に応じて異なるが、マクロライド系免疫抑制剤の種類に応じた結合タンパク質に対して結合できる限り特に限定されない。例えば、マクロライド系免疫抑制剤がタクロリムスである場合、マクロライド構造を有するタクロリムス代謝物としては、例えば、１３－Ｏ－デスメチルタクロリムス（ＭＩ）、３１－Ｏ－デスメチルタクロリムス（ＭＩＩ）、１５－Ｏ－デスメチルタクロリムス（ＭＩＩＩ）、１２－Ｏ－ヒドロキシルタクロリムス（ＭＩＶ）、１５，３１－Ｏ－ジデスメチルタクロリムス（ＭＶ）、１３，３１－Ｏ－ジデスメチルタクロリムス（ＭＶＩ）、１３，１５－Ｏ－ジデスメチルタクロリムス（ＭＶＩＩ）、ＭＶＩＩＩ　タクロリムス、Ｃ２２オキシムタクロリムス、Ｃ２４スクシネートタクロリムス、Ｃ３２スクシネートタクロリムスが挙げられること（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２０１４　Ａｐｒ，６０（４），６２１－３０）、およびこのようなタクロリムス代謝物は、タクロリムス結合タンパク質と結合して複合体を形成できることが報告されている（Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｏｎｉｔ．，１９９９　Ｊｕｎ，２１（３），２７４－８０；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９４　Ｊｕｌ，１５，２０２（１），４３７－４３；Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９９３，２１（６），９７１－９７７）。マクロライド系免疫抑制剤がシクロスポリンＡである場合、マクロライド構造を有するシクロスポリンＡ代謝物としては、例えば、シクロスポリンＡＭ１、シクロスポリンＡＭ９、シクロスポリンＡＭ４Ｎ、シクロスポリンＡＭ１ｃ、シクロスポリンＡＭ１９が挙げられること（Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００３　Ｆｅｂ，５５（２），２０３－１１）、およびこのようなシクロスポリンＡ代謝物は、シクロスポリンＡ結合タンパク質と結合して複合体を形成できることが報告されている（Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１　Ｆｅｂ，２４（１），７１－４；ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．，３７（３），４０３－４１０（１９９１））。マクロライド構造を有するシロリムス代謝物としては、例えば、１６－Ｏ－デメチルシロリムス、２４－ヒドロキシシロリムス、２５－ヒドロキシシロリムス、４６－ヒドロキシシロリムス、３９－Ｏ－デメチルシロリムス、７－Ｏ－デメチルシロリムス、３２－Ｏ－デメチルシロリムス、４１－Ｏ－デメチルシロリムス、ヒドロキシシロリムス、セコ（ｓｅｃｏ）－シロリムス、１１－ヒドロキシシロリムス、３，４－ジヒドロジオールシロリムス、５，６－ジヒドロジオールシロリムスが挙げられること（Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｏｎｉｔ．，２０１５　Ｊｕｎ，３７（３），３９５－９；ラパリムス　１ｍｇ製造販売承認申請書添付資料　第２部（モジュール　２）２．４　非臨床試験の概括評価）、およびこのようなシロリムス代謝物は、シロリムス結合タンパク質と結合して複合体を形成できることが報告されている（Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６　Ａｕｇ，２９（４），３０９－１３）。マクロライド構造を有するエベロリムス代謝物としては、例えば、４６－ヒドロキシエベロリムス、２４－ヒドロキシエベロリムス、２５－ヒドロキシエベロリムス、４５－ヒドロキシエベロリムス、２－ヒドロキシエベロリムス、１１－ヒドロキシエベロリムス、１４－ヒドロキシエベロリムス、３９－Ｏ－デスメチルエベロリムス、２７－Ｏ－デスメチルエベロリムス、４０－Ｏ－デスエチルヒドロキシエベロリムス（シロリムス）が挙げられる（Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ　Ｍｏｎｉｔ．，２００７　Ｄｅｃ，２９（６），７４３－９）。マクロライド系免疫抑制剤、およびマクロライド構造を有するマクロライド系免疫抑制剤の代謝物は、個体差等の因子を考慮するべきであるが、ヒト等の動物の血液中において所定の比率で存在し得る。したがって、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査は、血液試料中の代謝物の濃度の測定によっても間接的に行うことができる。好ましくは、血液検査は、マクロライド系免疫抑制剤の濃度の測定により行うことができる。
　血液試料に含まれる、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する結合タンパク質としては、ヒト等の哺乳動物に対して内因性である種々のタンパク質が知られている。より具体的には、タクロリムス（ＦＫ５０６）、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する特異的結合タンパク質としては、例えば、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ１４、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３）が挙げられる。シクロスポリンＡ、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する特異的結合タンパク質としては、例えば、シクロフィリンＡ、シクロフィリンＢが挙げられる。シロリムス（ラパマイシン）およびその誘導体、またはマクロライド構造を有するそれらの代謝物に対する特異的結合タンパク質としては、例えば、ＦＫＢＰ１２が挙げられる。このような特異的結合タンパク質は、赤血球画分に主に存在する。また、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する非特異的結合タンパク質としては、例えば、アルブミン、リポタンパク質、α１－酸性糖タンパク質が挙げられる。
　本発明の方法に用いられる酸としては、血液試料を酸性化できる任意の酸を利用することができる。このような酸としては、例えば、無機酸（例、リン酸、ホウ酸、炭酸、塩酸、硫酸、硝酸）、および有機酸（例、酢酸、クエン酸、グリシン、酒石酸、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ギ酸、シュウ酸、乳酸、マレイン酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸）、ならびにそれらの２種以上（例、２種、３種、４種または５種）の混合物が挙げられる。
　また、本発明の方法に用いられるアルカリとしては、血液試料をアルカリ性化できる任意のアルカリを利用することができる。このようなアルカリとしては、例えば、無機塩基（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等の金属（例、一価金属、二価金属）の水酸化物、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム等の金属（例、一価金属、二価金属）の炭酸水素塩、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム等の金属（例、一価金属、二価金属）の炭酸塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の金属（例、一価金属）のリン酸塩、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等の金属（例、一価金属）のホウ酸塩、アンモニア）、有機塩基（例、トリメチルアミンおよびトリエチルアミン等のアミン、ピリジン等の含窒素複素環化合物）、ならびにそれらの２種以上（例、２種、３種、４種または５種）の混合物が挙げられる。
　本発明の方法において、血液試料の処理は、酸またはアルカリのいずれも使用できるが、血液試料中のマクロライド系免疫抑制剤の検出感度の観点から、血液試料の処理としては酸による処理を行うことがより好ましい。以下、酸またはアルカリによる処理について詳述する。
　マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む血液試料の酸またはアルカリによる処理としては、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物、およびそれに対する結合タンパク質を解離させることができる程度に血液試料の酸性度を増強できる（換言すれば、ｐＨを低下できる）またはアルカリ性度を増強できる（換言すれば、ｐＨを上昇できる）処理である限り特に限定されず、例えば、血液試料と酸性溶液（例、酸性緩衝液、緩衝能を有しない酸性溶液）またはアルカリ性溶液（例、アルカリ性緩衝液、緩衝能を有しないアルカリ性溶液）との混合（換言すれば、血液試料の希釈）、および血液試料中への酸（固体）またはアルカリ（固体）の溶解が挙げられるが、操作の簡便性等の観点から、血液試料と酸性溶液またはアルカリ性溶液との混合が好ましい。
　処理される血液試料の容量は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を本発明の方法により測定できる限り特に限定されないが、例えば０．１～５００μＬであり、好ましくは０．５～４００μＬであり、より好ましくは１．０～３００μＬであり、さらにより好ましくは２．０～２００μＬである。血液試料と混合されるべき酸性溶液またはアルカリ性溶液の容量は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物、およびそれに対する結合タンパク質を解離させることができる程度に血液試料の酸性度またはアルカリ性度を増強できる限り特に限定されないが、例えば０．５～５，０００μＬであり、好ましくは１．０～３，０００μＬであり、より好ましくは２．０～１，０００μＬであり、さらにより好ましくは５．０～５００μＬである。血液試料と酸性溶液またはアルカリ性溶液との混合比率（血液試料／酸性溶液または血液試料／アルカリ性溶液）は、血液試料の酸性度またはアルカリ性度を増強できる限り特に限定されないが、例えば１／１００～１００であり、好ましくは１／５０～５０であり、より好ましくは１／３０～３０であり、さらにより好ましくは１／２０～２０である。血液試料は上述したような動物由来試料であり、中性の性質を示す。このような血液試料を酸により処理すると、それに含まれるマクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を、その結合タンパク質から解離させることができる。したがって、このような処理により、結合タンパク質から解離している状態にある、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製することができる。マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を結合タンパク質から十分に解離させるためには、混合または溶解後、所定の温度条件下で、十分な解離のための時間を設けること（例、放置）が好ましい。一方で、酸による成分（例、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物）の加水分解を極力回避するためには、温度は高温ではなく、時間は長期でないことが好ましい。このような温度は、例えば５～４５℃であり、好ましくは１５～４０℃である。このような時間としては、例えば１０秒～６０分であり、好ましくは２０秒～３０分であり、より好ましくは３０秒～１５分である。
　血液試料の処理を酸性溶液で行う場合、好ましくは、処理は、酸性血液試料の簡便かつ迅速な調製、および酸性血液試料に対する一定の酸性度の付与等の観点から、血液試料と酸性緩衝液との混合である。酸性緩衝液としては、酸性領域において緩衝能を示すことができる任意の酸を含む緩衝液を用いることができる。このような酸としては、例えば、無機酸（例、リン酸、ホウ酸、炭酸）、および有機酸（例、酢酸、クエン酸、グリシン、酒石酸、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリフルオロ酢酸、フタル酸）、ならびにそれらの２種以上（例、２種、３種、４種または５種）の混合物が挙げられる。
　酸性緩衝液等の酸性溶液のｐＨは、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物、およびその結合タンパク質の種類および濃度等の因子によって変動し得るが、例えば、１．０～５．０である。ｐＨ１．０～５．０の酸性溶液としては、このようなｐＨの酸性領域において緩衝能を示すことができる緩衝液が好ましい。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリフルオロ酢酸緩衝液、フタル酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液が挙げられる。上述した因子の影響を極力排除して汎用性を向上させる等の観点から、ｐＨは、好ましくは１．５以上、より好ましくは２．０以上、さらにより好ましくは２．５以上であってもよい。ｐＨはまた、好ましくは４．８以下、より好ましくは４．５以下であってもよい。より具体的には、ｐＨは、好ましくは１．５～４．８、より好ましくは２．０～４．８、さらにより好ましくは２．５～４．８、特に好ましくは２．５～４．５であってもよい。ｐＨの測定は、当該分野における公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、ｐＨは、ガラス電極を有するｐＨ計を用いて２５℃で測定された値を採用することができる。
　血液試料の処理をアルカリ性溶液で行う場合、好ましくは、処理は、アルカリ性血液試料の簡便かつ迅速な調製、およびアルカリ性血液試料に対する一定のアルカリ性度の付与等の観点から、血液試料とアルカリ性緩衝液との混合である。アルカリ性緩衝液としては、塩基性領域において緩衝能を示すことができる任意の塩基を含む緩衝液を用いることができる。このような塩基は、上述したものと同様である。
　アルカリ性緩衝液等のアルカリ性溶液のｐＨは、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物、およびその結合タンパク質の種類および濃度等の因子によって変動し得るが、例えば、８．０～１３．０である。ｐＨ８．０～１３．０のアルカリ性溶液としては、このようなｐＨの塩基性領域において緩衝能を示すことができる緩衝液が好ましい。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸―重炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝液、コラミン塩酸緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、アセトアミドグリシン緩衝液、トリシン緩衝液、グリシンアミド緩衝液、ビシン緩衝液、トリス緩衝液が挙げられる。上述した因子の影響を極力排除して汎用性を向上させる等の観点から、ｐＨは、好ましくは９．０以上であってもよい。ｐＨはまた、好ましくは１２．０以下、特に好ましくは１１．０以下であってもよい。より具体的には、ｐＨは、好ましくはｐＨ９．０～１２．０、特に好ましくはｐＨ９．０～１１．０であってもよい。ｐＨの測定は、上述のとおりである。
　酸性緩衝液等の酸性溶液またはアルカリ性緩衝液等のアルカリ性溶液は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体を含んでいても、含んでいなくてもよい。酸性溶液またはアルカリ性溶液がこのような抗体を含んでいる場合、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物の濃度の測定は、当該抗体を利用して行うことができる。酸性溶液またはアルカリ性溶液はまた、他の物質を含んでいてもよい。このような他の物質としては、例えば、水と混和可能な有機溶媒（例、アルコール、エーテル、エステル）、変性剤（例、カオトロピック剤）、界面活性剤（例、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、胆汁酸塩界面活性剤）、溶血剤、競合剤（例、類似体）等の物質が挙げられる（例、上述した特許文献１～９）。
　血液試料の酸またはアルカリによる処理により調製される酸性血液試料またはアルカリ性血液試料のｐＨは、酸性緩衝液等の酸性溶液またはアルカリ性緩衝液等のアルカリ性溶液について上述したｐＨと同様である。したがって、このような酸性血液試料またはアルカリ性血液試料のｐＨの例および好ましい例については、上述した酸性溶液またはアルカリ性溶液のものを参照することができる。
　本発明で用いられる抗体は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体である。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはそれらの抗体断片であってもよい。本発明では、１種の抗体のみならず、２種以上（例、２種、３種）の抗体を用いることができる。
　抗体としては、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物のみを認識する抗体を用いることができる。あるいは、２種以上の抗体が本発明で用いられる場合、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物のみを認識する抗体に加えて、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物およびそれに対する抗体の複合体を認識する抗体を、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体として用いることができる（例、国際公開第２００４／１１６４４号；国際公開第２０１３／０４２４２６号；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（Ｆｅｂ　２０１１）　ｖｏｌ．３９，ｎｏ．３，ｅ１４）。
　マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体は、当該分野において公知である任意の方法を用いて作製することができる。例えば、抗体は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を抗原として用いて作製することができる。また、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。
　本発明では、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上（例、１種、２種）の抗体を用いることができる。本発明では、抗体に対する２次抗体を用いることもできる。
　抗体は、固相に固定されていてもよい。本明細書において、固相に固定された抗体を、単に固相抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、ウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム、チューブ等の容器；およびプレート、メンブレン、ろ紙等の支持体）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、固相担体については、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。抗体を固相に固定する方法としては、当該分野において公知である任意の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、およびイオン結合法が挙げられる。
　抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識された抗体を、単に標識抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。
　抗体によるマクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物の濃度の測定は、イムノアッセイにより行うことができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）〔例、化学発光ＥＩＡ（ＣＬＥＩＡ）、酵素吸着ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）〕、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、凝集法、免疫染色、フローメトリー法、バイオレイヤー干渉法、Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　ＰＬＡ法、化学増幅型ルミネッセンス・プロキシミティ・ホモジニアス・アッセイ、ラインブロット法、ウエスタンブロット法が挙げられる。
　本発明は、以下を含む方法により行われる。
（ａ）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理すること；ならびに
（ｂ）抗体を用いて、血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
　工程（ａ）および（ｂ）は、並行して、または別々に行われてもよい。例えば、酸またはアルカリによる血液試料の処理において、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体を含む酸性緩衝液もしくはアルカリ性緩衝液を用いる場合、酸またはアルカリによる血液試料の処理および抗体による濃度の測定は、並行して行うことができる。この場合、抗体による濃度の測定において、酸性緩衝液もしくはアルカリ性緩衝液に含まれるマクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する第１抗体（例、固相抗体）と異なる、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する第２抗体（例、標識抗体）がさらに用いられてもよい。一方、例えば、酸またはアルカリによる血液試料の処理において、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体を含む酸性緩衝液もしくはアルカリ性緩衝液を用いない場合、酸またはアルカリによる血液試料の処理および抗体による濃度の測定は、別々に行うことができる。この場合、工程（ａ）および（ｂ）は、連続的または非連続的に行うことができる。工程（ａ）および（ｂ）が非連続的に行われる場合、酸で処理された血液試料は、さらなる処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、上述したような予備処理と同様の処理（例、ろ過、加熱、溶血）、ｐＨの変更、所定の化学物質による処理が挙げられる。
　特定の実施形態では、本発明は、以下を含む方法により行われてもよい：
（ａ’）前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理して、酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製すること；ならびに
（ｂ’）抗体を用いて、前記酸性血液試料または前記アルカリ性血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
　工程（ａ’）および（ｂ’）は、並行して、または別々に行われてもよい。また、工程（ａ’）および（ｂ’）は、連続的または非連続的に行うことができる。例えば、工程（ａ’）および（ｂ’）が連続して行われる場合、工程（ａ’）で調製された酸性血液試料またはアルカリ性血液試料をそのまま、工程（ｂ’）に付すことができる。工程（ａ’）および（ｂ’）が非連続的に行われる場合、酸性血液試料またはアルカリ性血液試料は、さらなる処理に付されてもよい。このような処理は、例えば、工程（ａ）および（ｂ）に関する説明において上述したようなものと同様である。
　本発明は、酸性条件下またはアルカリ性条件下の血液試料において、免疫抑制剤として用いられるマクロライド系物質およびその結合タンパク質の結合を解離させつつ、解離したマクロライド系物質の濃度を抗体で測定することができ、しかも測定において定量性に優れるという知見に基づく。このようなマクロライド系物質は、特定の環状構造（比較的リジッドな構造であり、フレキシビリティーに欠ける）を有し、かつ比較的高い疎水度を有する高分子量（分子量８００から１３００程度）の化合物である。本説明により本発明の範囲の限定を意図するものではないが、酸性条件またはアルカリ性条件という相対的に過酷な条件下で行われるにもかかわらず本発明が定量性に優れる一因は、このような特徴を有するマクロライド系物質の使用に起因する可能性がある。
　他の実施形態では、本発明は、以下を含む方法により行われてもよい：
（ａ’’）前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理して酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製した後、中和を行い、中性血液試料を調製すること；ならびに
（ｂ’’）抗体を用いて、前記中性血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
　すなわち、本発明の方法において、血液試料を酸またはアルカリで処理した後、中和処理を行ってもよい。中和処理を行うことで、後段の抗体を用いてマクロライド系免疫抑制剤等の濃度を測定する工程（工程（ｂ’’）で使用する抗体について、酸またはアルカリに対する耐性の低い抗体を選択することも可能となる。
　中和処理に使用する中和液としては、酸またはアルカリによる処理で生成された酸性血液試料またはアルカリ性血液試料のｐＨを６．５～７．５程度にできる組成であれば、特に限定されるものではない。酸性血液試料に対する中和液は、例えば、上述のアルカリとして示した物質を含み、ｐＨは、ｐＨ８．０～１３．０のものを好適に使用できる。アルカリ性血液試料に対する中和液は、例えば、上述の酸として示した物質を含み、ｐＨは、ｐＨ１．０～６．５のものを好適に使用できる。
　また、中和液は、アルカリ性物質または酸性物質の他に、カオトロピック変性剤を含んでいてもよい。カオトロピック変性剤としては、尿素、チオ尿素、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミドおよびホルムアミド等が挙げられる。カオトロピック変性剤の終濃度は、０．５Ｍ～８．０Ｍとすることが好ましい。
　血液試料を酸またはアルカリで処理した後、中和を行うと、酸またはアルカリへの耐性の低い抗体の活性が低下するリスクを低減できる一方で、解離させたマクロライド系免疫抑制剤と結合タンパク質との再結合により感度が低下するリスクが懸念される。中和液にカオトロピック変性剤を添加することにより、前記再結合の影響を低減することができる。なお、カオトロピック変性剤は、前述のように、中和液ではなく、酸性溶液またはアルカリ性溶液に添加してもよい。あるいは、中和液と酸性溶液もしくはアルカリ性溶液の両方に添加してもよい。
　本発明はまた、（１）酸またはアルカリ、および（２）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査試薬を提供する。
　酸またはアルカリは、上述したとおりである。酸またはアルカリは、固体であっても液体であってもよいが、好ましくは液体である。したがって、本発明の試薬は、（１’）酸性溶液またはアルカリ性溶液、および（２’）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上（例、１種、２種）の抗体を含むことが好ましい。酸性溶液またはアルカリ性溶液およびそのｐＨは、上述したとおりである。
　酸性溶液またはアルカリ性溶液は、酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液であっても、緩衝能を有しない酸性溶液またはアルカリ性溶液であってもよいが、好ましくは酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液である。したがって、本発明の試薬は、（１’’）酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液、および（２’’）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を含むことが好ましい。酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液およびそれらのｐＨは、上述したとおりである。
　酸性緩衝液等の酸性溶液またはアルカリ性緩衝液等のアルカリ性溶液は、液体または凍結物の形態において提供することができる。酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液は、上述したような容器、またはボトル等の大型の容器に収納されていてもよい。マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体は、緩衝液等の液体中に溶解した形態において、またはその凍結物の形態において、もしくは抗体の凍結乾燥物の形態において提供することができる。マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体は、遊離した形態（例、溶液、凍結物）において、または上述したような固相に固定された形態において提供することができる。
　一実施形態では、本発明の試薬は、（１’’）酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液、および（２’’）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体が互いに一体となった組成物である、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を含む酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液であってもよい。このような酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液を用いる場合、酸またはアルカリによるマクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物のその結合タンパク質からの解離、および解離したマクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物の濃度の抗体による測定を、並行して簡便に行うことができる。このような場合、本発明の試薬は、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を含む酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液に加えて、当該抗体とは異なるマクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体および／または抗体に対する２次抗体を含んでいてもよい。このような試薬は、２種以上の抗体を用いるイムノアッセイにおいて好適に用いることができる。
　別の実施形態では、本発明の試薬は、（１’’）酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液、および（２’’）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を、隔離した形態で含むキットであってもよい。このような形態であれば、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体および酸性緩衝液またはアルカリ性緩衝液が隔離されているので、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体の性能を長期にわたり維持することができる。このような場合、本発明の試薬は、保存性に優れる。
　さらに別の実施形態では、本発明の試薬は、（１）酸またはアルカリ、および（２）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体、に加えて、（３）中和液を含む。中和液およびそのｐＨは、上述したとおりである。
　本発明の試薬はまた、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物（標品）を含んでいてもよい。マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物は、例えば、ポジティブコントロールとして、および／または定量のための検量線の作成に用いることができる。
　本発明の試薬はさらに、マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する抗体を用いるイムノアッセイに必要な構成要素を含んでいてもよい。このような構成要素としては、上述したような標識物質および酵素の基質、ならびに希釈液、２次抗体、および抗体の安定化剤、哺乳動物から試料を採取し得る器具（例、注射器、生検針）が挙げられる。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：酸処理による全血検体中のタクロリムス検出ＥＬＩＳＡ
　実施例１で用いた材料は、以下のとおりである。
　９６穴イムノプレート：Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　Ｃ９６イムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｃａｔ＃４３０３４１）
　抗タクロリムス固相抗体１（マウスＩｇＧ）：Ｔａｃ５－２６－８（自社抗体）
　抗タクロリムス固相抗体２（マウスＩｇＭ）：ＦＫ１（ＨｙＴｅｓｔ，カタログ番号：４ＦＫ４２）
　抗タクロリムス固相抗体３（マウスＩｇＧ）：ＦＫ２（Ｂｉｏｒｂｙｔ，カタログ番号：ｏｒｂ７９５３２）
　洗浄液：０．５容量％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
　ブロッキング溶液：１重量％　ＢＳＡ／ＰＢＳ
　検体：Ｌｙｐｈｏｃｈｅｃｋ（登録商標）　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）　Ｌｅｖｅｌｓ　１，２，３，４および５。本検体では、タクロリムス、シクロスポリンＡ、およびエベロリムスが全血試料中にスパイクされており、それぞれ種々の測定システムによる測定値が開示されている。本願実施例で採用したＨＰＬＣ－ＭＳによるタクロリムスの測定値は、４．７５ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　１）、８．４４ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　３）、１５．８ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　４）、２３．６ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　５）である。本願実施例で採用したＨＰＬＣ－ＭＳによるシクロスポリンＡの測定値は、８７ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　１）、１５２ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　２）、３５４ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　３）、７５５ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　４）、１２１１ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　５）である。以下の実施例では、検体の濃度および数を、アッセイの目的に応じて適宜変更して用いた。
　抗タクロリムス抗体含有培養上清（検出抗体）：抗タクロリムスニワトリＩｇＭ含有ＣＨＯ培養上清（自社抗体）
　培養上清希釈液：１重量％　ＢＳＡ／ＰＢＳ
　ＡＬＰ標識抗体：アルカリホスファターゼ標識マウス抗ニワトリＩｇＭ　ｍＡｂ（自社抗体）
　標識抗体希釈液：１重量％　ＢＳＡ／ＴＢＳ
　発光基質液：ルミパルス用発光基質（ＡＭＰＰＤ）
　実施例１において、以下の酸性緩衝液を用いた。
　リン酸緩衝液（ｐＨ１．０～ｐＨ３．０）は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、およびリン酸二水素ナトリウム・二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）水溶液を混合して調製した。
　クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）は、クエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）水溶液、およびクエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ８Ｏ７）水溶液を混合して調製した。
　酢酸緩衝液（ｐＨ４．０～ｐＨ５．５）は、Ｂｉａｃｏｒｅ用の市販品を使用した。
　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０～ｐＨ８．０）は、リン酸二水素ナトリウム・二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、およびリン酸水素二ナトリウム・１２水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）水溶液を混合して調製した。
　ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）は、Ｂｉａｃｏｒｅ用の市販品を使用した。
　すなわち、実施例１で用いた酸性緩衝液のｐＨおよび種類は、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例１は、以下の手順で行った。
（１）抗タクロリムス固相抗体１、抗タクロリムス固相抗体２および抗タクロリムス固相抗体３をそれぞれ３μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）酸性緩衝液で検体を１０倍希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）培養上清希釈液で抗タクロリムス抗体含有培養上清を０．２μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）標識抗体希釈液でＡＬＰ標識抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１０）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１１）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　その結果、３種類の抗体を用いた実験で共通して、酸性のｐＨ領域において、タクロリムスの濃度に応じた発光カウントが認められた（図１－１～１－３）。このことは、酸性のｐＨ領域において、タクロリムスをその特異的結合タンパク質（ＦＫＢＰ）および非特異的結合タンパク質（アルブミン等）から解離させつつ、解離したタクロリムスを抗体で検出できることを示す。
　以上より、タクロリムスおよびその特異的結合タンパク質を含む血液試料中のタクロリムスを抗体で検出する場合、酸による血液試料の前処理が有効であることが示された。
実施例２：酸処理による全血検体中のタクロリムスの定量ＥＬＩＳＡ
　実施例２で用いた材料は、以下のとおりである。
　酸性緩衝液：１００ｍＭ　リン酸緩衝液／ｐＨ２．０
　検量線物質：タクロリムス（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）
　検量線希釈液：０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
　実施例２で用いた他の材料は、実施例１と同様である。
　実施例２は、以下の手順で行った。
（１）抗タクロリムス固相抗体１を３μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５Ａ）リン酸緩衝液（ｐＨ２．０）で検体を１０倍希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（５Ｂ）検量線物質であるタクロリムス（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）を検量線希釈液で希釈し４０，１３，４．４，１．５，０．４９，０．１６，０．０５０，０ｎｇ／ｍＬの希釈系列を調製して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃１０分間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）培養上清希釈液で抗タクロリムス抗体含有培養上清を０．２μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）標識抗体希釈液でＡＬＰ標識抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１０）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１１）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
（１２）検量線の線形近似式を用いて、検体測定時のカウントをもとにタクロリムス測定値を算出した。
　その結果、タクロリムスおよびその特異的結合タンパク質および非特異的結合タンパク質を含む血液試料を酸により前処理した場合におけるタクロリムス濃度の測定値は、タクロリムスのスパイク濃度と非常に高い相関性を示した（図２）。
　以上より、タクロリムスおよびその特異的結合タンパク質および非特異的結合タンパク質を含む血液試料を酸により前処理した場合、当該血液試料中のタクロリムスの定量性に優れることが示された。
実施例３：酸処理による全血検体中のシクロスポリンＡの検出ＥＬＩＳＡ
　実施例３で用いた材料は、以下のとおりである。
　抗シクロスポリン固相抗体１（マウスＩｇＧ）：ＣＳ５－１２－２７（自社抗体）
　酸性緩衝液：１０ｍＭ　酢酸緩衝液／ｐＨ４．０
　抗シクロスポリン抗体含有培養上清：抗シクロスポリンニワトリＩｇＭ含有ＣＨＯ培養上清（自社抗体）
　実施例３で用いた他の材料は、実施例１、２と同様である。
　実施例３は、以下の手順で行った。
（１）抗シクロスポリン固相抗体１を２．５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）酸性緩衝液で検体を１０倍希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）培養上清希釈液で抗シクロスポリン抗体含有培養上清を０．２μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）標識抗体希釈液でＡＬＰ標識抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１０）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１１）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　その結果、抗体を用いた実験について、酸性のｐＨ領域において、高い発光カウントが認められた（図３）。このことは、酸性のｐＨ領域において、シクロスポリンＡをその特異的結合タンパク質（シクロフィリン）および非特異的結合タンパク質（アルブミン等）から解離させつつ、解離したシクロスポリンＡを抗体で検出できることを示す。
　以上より、シクロスポリンＡおよびその特異的結合タンパク質を含む血液試料中のシクロスポリンＡの検出では、酸による血液試料の前処理が有効であることが示された。
実施例４：酸処理による全血検体中のシクロスポリンＡの定量ＥＬＩＳＡ
　実施例４で用いた材料は、以下のとおりである。
　酸性緩衝液：１０ｍＭ　酢酸緩衝液／ｐＨ４．０
　検量線物質：シクロスポリンＡ（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）
　検量線希釈液：０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
　実施例４で用いた他の材料は、実施例１～３と同様である。
　実施例４は、以下の手順で行った。
（１）抗シクロスポリン固相抗体１を２．５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５Ａ）酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で検体を１０倍希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（５Ｂ）シクロスポリンＡ（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）を検量線希釈液で希釈し２００，１００，５０．０，２５．０，１２．５，６．２５，３．１３，０ｎｇ／ｍＬの希釈系列を調製して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃１０分間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）培養上清希釈液で抗シクロスポリン抗体含有培養上清を０．３μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）標識抗体希釈液でＡＬＰ標識抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１０）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１１）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
（１２）検量線の線形近似式を用いて、検体測定時のカウントをもとにシクロスポリンＡ測定値を算出した。
　その結果、シクロスポリンＡおよびその特異的結合タンパク質および非特異的結合タンパク質を含む血液試料を酸により前処理した場合におけるシクロスポリンＡ濃度の測定値は、シクロスポリンＡのスパイク濃度と非常に高い相関性を示した（図４）。
　以上より、シクロスポリンＡおよびその特異的結合タンパク質および非特異的結合タンパク質を含む血液試料を酸により前処理した場合、当該血液試料中のシクロスポリンＡの定量性に優れることが示された。
実施例５：酸性溶液中での測定における固相抗体の特異性への影響の確認
　実施例５で用いた材料は、以下のとおりである。
　界面活性剤入り酸性緩衝液：０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／１０ｍＭ　酢酸緩衝液／ｐＨ４．０
　界面活性剤入り中性緩衝液：０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ／ｐＨ６．８
　ビオチン標識タクロリムス：Ｔａｃ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ，自家調製品）
　タクロリムス類似化合物１：シロリムス
　タクロリムス類似化合物２：エベロリムス
　タクロリムス類似化合物３：テムシロリムス
　タクロリムス類似化合物４：ピメクロリムス
　タクロリムス類似化合物５：ジヒドロＦＫ５０６
　タクロリムス：タクロリムス（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）
　ＡＬＰ標識ストレプトアビジン：アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
　希釈液：１重量％　ＢＳＡ／ＴＢＳ
　実施例５で用いた他の材料は、実施例１～４と同様である。
　実施例５は、以下の手順で行った。
（Ａ）ビオチン標識タクロリムスとタクロリムス類似化合物混合液の調製
（１）ビオチン標識タクロリムスを界面活性剤入り酸性緩衝液もしくは界面活性剤入り中性緩衝液で１０ｎｇ／ｍＬになるように希釈した。
（２）（１）で調製したビオチン標識タクロリムス入りの溶液に対して、タクロリムスもしくはタクロリムス類似化合物（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）を最終濃度で１００，０００ｎｇ／ｍＬから１０倍希釈ずつになるように添加して希釈系列を作製した。
（Ｂ）阻害アッセイ
（１）抗タクロリムス固相抗体１を３μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）（Ａ）で調製したビオチン標識タクロリムスとタクロリムス類似化合物の混合液を１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）希釈液でＡＬＰ標識ストレプトアビジンを０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　その結果、抗タクロリムス固相抗体およびビオチン標識タクロリムス、ならびにそれらの結合の阻害剤である各種タクロリムス類似化合物を用いた結合阻害実験において、酸性溶液中での結合阻害様式は、中性溶液中のものと同様であった（図５－１および５－２）。このことは、酸性条件が抗体の特異性に影響しないことを示す。
　以上より、抗体の特異性が、酸性溶液中で維持されていることが示された。
実施例６：酸処理における特異的結合タンパク質からのマクロライド系免疫抑制剤の解離の確認
　実施例６で用いた材料は、以下のとおりである。
　ＦＫＢＰ１２：リコンビナントＦＫＢＰ１２（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ，カタログ番号：１０２６８－Ｈ０８Ｅ）
　タクロリムス：タクロリムス（１ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＳＯ）
　タクロリムス・ＦＫＢＰ希釈液１：０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
　タクロリムス・ＦＫＢＰ希釈液２：０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／２００ｍＭ　リン酸緩衝液／ｐＨ２．０
　実施例６で用いた他の材料は、実施例１～５と同様である。
　実施例６は、以下の手順で行った。
（Ａ）タクロリムスとＦＫＢＰ１２の結合
（１）タクロリムス・ＦＫＢＰ希釈液１でタクロリムスを希釈し、２４０ｎｇ／ｍＬ，８０ｎｇ／ｍＬ，２６．６ｎｇ／ｍＬ，８．８９ｎｇ／ｍＬ，１．４８ｎｇ／ｍＬ，０．４９ｎｇ／ｍＬ，０．１６５ｎｇ／ｍＬ，０の希釈系列を作製した。
（２）タクロリムス・ＦＫＢＰ希釈液１でＦＫＢＰ１２を１００μｇ／ｍＬに希釈した。
（３）希釈したタクロリムスと希釈したＦＫＢＰ１２を等量ずつ混合した（例：最終濃度：タクロリムス１２０μｇ／ｍＬ＋ＦＫＢＰ１２　５０μｇ／ｍＬ、タクロリムス　４０μｇ／ｍＬ＋ＦＫＢＰ１２　５０μｇ／ｍＬ）。
（４）タクロリムスとＦＫＢＰ１２を溶液中において室温で１時間反応させた。
（Ｂ）結合させたタクロリムスとＦＫＢＰ１２の解離実験
（１）抗タクロリムス固相抗体１を３μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）（Ａ）で調製したタクロリムスとＦＫＢＰ１２の混合液をタクロリムス・ＦＫＢＰ希釈液１またはタクロリムス・ＦＫＢＰ希釈液２で１０倍希釈した後に１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）培養上清希釈液で抗タクロリムス抗体含有培養上清を０．２μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）標識抗体希釈液でＡＬＰ標識抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１０）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１１）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　その結果、タクロリムスとＦＫＢＰ１２を混合し、次いで混合液を中性溶液で希釈することにより中性条件下で抗原抗体反応を実施すると、タクロリムス濃度依存的なシグナルは認められなかった（図６における０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳの条件）。一方、タクロリムスとＦＫＢＰ１２を混合し、次いで混合液を酸性溶液で希釈することにより酸性溶液中で抗原抗体反応を実施すると、タクロリムス濃度依存的なシグナルが認められた（図６における０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／２００ｍＭ　ＰＢ／ｐＨ２．０の条件）。このことは、酸性条件下では、タクロリムスおよびＦＫＢＰ１２の結合を解離させつつ、解離したタクロリムスの濃度を抗体で測定することができることを示す。
　本実施例の結果を実施例１～５の結果と併せて考慮すると、マクロライド系物質（マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物）およびその特異的結合タンパク質を含む血液試料中の免疫抑制剤の濃度を抗体により測定する場合、酸による血液試料の前処理が有効であることが示された。
実施例７：アルカリ処理による全血検体中のタクロリムス検出ＥＬＩＳＡ
　実施例７で用いた９６穴イムノプレート、抗タクロリムス固相抗体１、洗浄液、ブロッキング溶液等の材料は、実施例１～６で用いた材料と同様である。
　実施例７は、以下の手順で行った。
（１）抗タクロリムス固相抗体１を３μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）タクロリムス濃度既知の４検体について、中性緩衝液（５０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）もしくは塩基性緩衝液（５０ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ１０．０）で１０倍希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）抗タクロリムスＩｇＭ抗体希釈液で抗タクロリムスＩｇＭ抗体を０．５μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）標識抗体希釈液でアルカリホスファターゼ標識抗ニワトリＩｇＭ抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１０）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１１）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　各条件における発光カウントの結果を図７に示す。全血検体をアルカリ性の緩衝液と混合して処理した場合、中性の緩衝液と混合した場合と比して、得られる発光カウントがタクロリムス濃度に依存して高く検出された。
　以上より、タクロリムスを含む血液試料をアルカリにより前処理した場合、当該血液試料中のタクロリムスを高感度で測定できることが示された。
実施例８：酸処理および中和処理による全血検体中のタクロリムス検出ＥＬＩＳＡ
　実施例８で用いた材料は、以下のとおりである。
　酸性緩衝液：５０ｍＭ　リン酸緩衝液／ｐＨ２．０
　中性緩衝液：２００ｍＭ　リン酸緩衝液／ｐＨ７．０
　中和液１：８Ｍ　尿素／２００ｍＭ　リン酸緩衝液／ｐＨ８．０
　中和液２：４Ｍ　グアニジン塩酸塩／２００ｍＭ　リン酸緩衝液／ｐＨ８．０
　実施例８で用いた他の材料は、実施例１～７と同様である。
　実施例８は、以下の手順で行った。
（１）抗タクロリムス固相抗体１を３μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）検体６μＬに対し、酸性緩衝液２４μＬを添加して反応させたのち、中和液１または中和液２を３０μＬ添加して前処理済検体を中和した。比較のため、中性緩衝液で検体を５倍希釈した後、８Ｍ尿素または４Ｍグアニジン塩酸塩を含む中性緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍に希釈したもの、検体を中性緩衝液で１０倍に希釈したものも用意した。
（６）処理済みのサンプルを１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（７）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（８）抗タクロリムスＩｇＭ抗体希釈液で抗タクロリムスＩｇＭ抗体を０．５μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μL添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（９）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１０）標識抗体希釈液でアルカリホスファターゼ標識抗ニワトリＩｇＭ抗体を０．１μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（１１）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（１２）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　各条件における発光カウントの結果を図８に示す。検体を酸処理後、カオトロピック変性剤（特にグアニジン塩酸塩）を含有する中和液で中和した場合、中性緩衝液で希釈のみを行った場合と比して、カウントが顕著に上昇することが示された。一方で、酸による処理を行わず、カオトロピック変性剤のみを添加した場合も、カウント上昇が見られた。
実施例９：酸処理および中和処理による全血検体中のエベロリムス検出ＥＬＩＳＡ
　実施例９で使用された材料は以下の通りである。
　コンジュゲート固相：エベロリムス－ＢＳＡコンジュゲート（自社抗体）
　抗エベロリムス抗体（ウサギ　ポリクローナル抗体）：ＥＶＥＲ抗体液１（エベロリムスキット　ナノピア　ＴＤＭ　エベロリムス（積水メディカル社製））
　洗浄液：ルミパルス洗浄液
　検体：ＣｌｉｎＣａｌ（登録商標）Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｓｅｔ　Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ　（ＲＥＣＩＰＥ）。本願実施例で採用したＨＰＬＣ－ＭＳによるエベロリムスの測定値は、０ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　０）、１．４５ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　１）、２．８６ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　２）、５．２７ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　３）、１１．７ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　４）、２３．２ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　５）、４８．０ｎｇ／ｍＬ（Ｌｅｖｅｌ　６）である。　
　ＡＬＰ標識抗体：アルカリホスファターゼ標識ブタ抗ウサギＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ，カタログ番号：Ｄ０３０６）
　抗体希釈液：０．５容量％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
　実施例９で用いた他の材料は、実施例１～８と同様である。
　実施例９は、以下の手順で行った。
（１）エベロリムス－ＢＳＡコンジュゲートを５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。
（２）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（３）ブロッキング溶液を１ウェル当たり１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。
（４）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（５）６μＬの検体に４８μＬの酸性緩衝液を反応させ、１８μＬの中和液２または酸性緩衝液を添加し、前処理液を調製した。この前処理液と５倍希釈した抗体溶液を体積比１：１で混合し、エベロリムス－ＢＳＡコンジュゲートを固相化した９６穴イムノプレートに１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（６）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（７）抗体希釈液でＡＬＰ標識抗体を０．２μｇ／ｍＬになるように希釈して１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（８）ウェルを洗浄液で３回洗浄した。
（９）発光基質を１ウェル当たり５０μＬ添加し、室温で５分間反応させた後、発光を検出した。
　各条件における発光カウントの結果を図９に示す。全血検体を酸で処理した後、中和を行わなかった検体については、酸により抗エベロリムス抗体が失活したためか、発光カウントが得られなかった（データ示さず）。全血検体をｐＨ２．０の酸性緩衝液処理後、クアニジン含有の中和液で中和した前処理液は、酸性緩衝液に代えて中性緩衝液を加えた検体よりも高感度でエベロリムスを検出できた。このことは、酸性緩衝液は効率よく全血検体からエベロリムスを抽出することを示す。
　以上より、エベロリムスおよびその特異的結合タンパク質を含む血液試料中のエベロリムスを抗体で検出する場合、酸による血液試料の前処理が有効であることが示された。また、酸に対する耐性の低い抗体を使用する場合においても、検体の酸処理の後、抗原抗体反応の前に中和工程を行うことで、効率的なエベロリムス検出が可能であることが示された。
　本発明は、例えば、マクロライド系免疫抑制剤のＴＤＭ（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）に有用である。

Claims (13)

  1. 　以下を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査方法：
    （ａ）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理すること；ならびに
    （ｂ）抗体を用いて、血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
  2. 　マクロライド系免疫抑制剤が、タクロリムス、シクロスポリンＡ、またはエベロリムスである、請求項１記載の方法。
  3. 　血液試料がヒト血液試料である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　前記血液試料の処理が、酸による処理である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　前記酸による処理が、前記血液試料と酸性緩衝液との混合により行われる、請求項４記載の方法。
  6. 　酸性緩衝液のｐＨが１．０～５．０である、請求項５記載の方法。
  7. 　免疫抑制剤に対する抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはそれらの抗体断片である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　以下を含む方法である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法：
    （ａ’）前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理して、酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製すること；ならびに
    （ｂ’）抗体を用いて、前記酸性血液試料または前記アルカリ性血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
  9. 　以下を含む方法である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法：
    （ａ’’）前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物を含む血液試料を酸またはアルカリで処理して酸性血液試料またはアルカリ性血液試料を調製した後、中和を行い、中性血液試料を調製すること；ならびに
    （ｂ’’）抗体を用いて、前記中性血液試料中の前記マクロライド系免疫抑制剤、または前記代謝物の濃度を測定すること。
  10. 　前記中和が、カオトロピック変性剤を含む中和液を前記酸性血液試料またはアルカリ性血液試料と混合して行われる、請求項９記載の方法。
  11. 　（１）酸またはアルカリ、および（２）マクロライド系免疫抑制剤、またはマクロライド構造を有するその代謝物に対する１種以上の抗体を含む、マクロライド系免疫抑制剤についての血液検査試薬。
  12. 　酸が酸性緩衝液である、請求項１１記載の試薬。
  13. 　さらに（３）中和液を含む、請求項１１または１２記載の試薬。
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