WO2019132738A1 - Моноклональные антитела и способы их применения - Google Patents

Моноклональные антитела и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
WO2019132738A1
WO2019132738A1 PCT/RU2018/050168 RU2018050168W WO2019132738A1 WO 2019132738 A1 WO2019132738 A1 WO 2019132738A1 RU 2018050168 W RU2018050168 W RU 2018050168W WO 2019132738 A1 WO2019132738 A1 WO 2019132738A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
antibody
ser
amino acid
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2018/050168
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ольга Владимировна БРИТАНОВА
Марк Александрович ИЗРАЕЛЬСОН
Сергей Анатольевич ЛУКЬЯНОВ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocad JSC
Original Assignee
Biocad JSC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to MA50128A priority Critical patent/MA50128B1/fr
Priority to CN201880090210.0A priority patent/CN111801354B/zh
Priority to NZ766247A priority patent/NZ766247B2/en
Priority to MX2020006736A priority patent/MX2020006736A/es
Priority to CA3086849A priority patent/CA3086849A1/en
Priority to PE2020000858A priority patent/PE20200927A1/es
Priority to JP2020535637A priority patent/JP7339948B2/ja
Priority to KR1020207021655A priority patent/KR102867660B1/ko
Priority to AU2018398341A priority patent/AU2018398341B2/en
Priority to EP18895626.2A priority patent/EP3733705A4/en
Priority to US16/957,328 priority patent/US11597767B2/en
Application filed by Biocad JSC filed Critical Biocad JSC
Priority to CR20200324A priority patent/CR20200324A/es
Priority to BR112020012959-3A priority patent/BR112020012959A2/pt
Priority to EA202091569A priority patent/EA202091569A1/ru
Publication of WO2019132738A1 publication Critical patent/WO2019132738A1/ru
Priority to JOJO/P/2020/0161A priority patent/JOP20200161B1/ar
Priority to ZA2020/03858A priority patent/ZA202003858B/en
Priority to PH12020551012A priority patent/PH12020551012A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US18/103,194 priority patent/US12514923B2/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology and biomedicine, namely to antibodies or their antigen-binding fragments, as well as their application. More specifically, the present invention relates to monoclonal antibodies that specifically bind to the family of human T-cell receptors.
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody or antigen-binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing an antibody, and the use of an antibody for treating diseases or disorders associated with the human T-cell receptor family.
  • ankylosing spondylitis ankylosing spondylitis
  • monoclonal antibodies an effective drug has not yet been obtained that allows selectively and long-term suppression of the autoimmune response and stopping the progression of AS.
  • an urgent task is the creation of antibodies, which allow to remove autoreactive T-lymphocyte clones from the patient’s AS, which are associated with the development of the disease.
  • TCR antigen recognition T-cell receptor
  • MHC main histocompatibility complex
  • One of the possible mechanisms for the occurrence of an autoimmune reaction is the presentation by the histocompatibility complex complex of peptides from proteins of bacterial or viral origin homologous to the body’s own peptides, which can lead to an immune response against its own antigens due to cross-reactivity.
  • TCR T cell sequence. receptor
  • variable (V) gene segments that make up the variable domain of TCR
  • the T-cell receptors are divided into different families. According to the IMGT nomenclature, 26 different families are distinguished for the beta chain, and 41 families for the alpha chain (Turner SJ et al., Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883-894).
  • TKRs belong to the TRBV9 family (according to the IMGT nomenclature).
  • T cell receptors carrying the beta chains of the TRBV9 family are also involved in the development of such an autoimmune disease as pillars (Petersen J et al., J Immunol. 2015; 194 (12): 6112-22). They are also found on the surface of T cells, which are subject to glueing in the case of T-cell lymphomas and T-cell leukemias, including T-cell lymphoma caused by the Epstein-Barr virus (EBV) (Toyabe S et al., Clin Exp Immunol. 2003; 134 (1): 92-97).
  • EBV Epstein-Barr virus
  • the closest analogues of the present invention are the monoclonal antibodies W112 and 2D1 to the beta segments of the human variable T-receptor domains belonging to the TRBV5-3 TRBV8-1 families, which were described in patent application (W09006758) as a tool for the diagnosis and therapy of rheumatoid arthritis .
  • These monoclonal antibodies recognize, respectively, 0.3-5% of peripheral T lymphocytes carrying TRBV5-3 and 0.5-13% of peripheral T lymphocytes carrying TRBV8-1.
  • the basis for the use of monoclonal antibodies specific to the sites of the beta chains of T receptors was the results of many studies demonstrating the involvement of T lymphocytes in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
  • Monoclonal antibodies specifically recognizing the beta chain of the 13th family of TRK rats are also described.
  • VB13 + T cells Monoclonal antibodies specifically recognizing the beta chain of the 13th family of TRK rats.
  • this procedure has been shown to protect against the development of type I diabetes in rats of the predisposed line, and also significantly reduces the risk of developing virus-induced diabetes (Zhijun Liu et al, Diabetes. 2012 May; 61 (5): 1160-1168.).
  • the depletion of T cells, whose T-receptor contains another family of beta chains (VB16) does not differ in the result from the control groups. It is important to note that already the first injection of monoclonal antibodies against VB13 leads to a 60% reduction in the number of VB13 + T cells in the spleen of rats.
  • the invention is directed to the creation of antibodies that can be used for the elimination of T cells bearing the TCR family of the TRBV9 family, in particular, for the treatment of AS, celiac disease and malignant blood diseases, in the pathogenesis of which TCR family of the TRBV9 family are involved.
  • the present invention relates to monoclonal antibodies and their antigen-binding fragments, which have the ability to specifically bind to the beta region of the human TRBV9 T family.
  • Antibodies according to the invention can be used as a drug for the treatment of autoimmune and oncological diseases, in the pathogenesis of which TCRs are involved, belonging to the TRBV9 family, for example, the AU, celiac disease and some T-cell lymphomas and T-cell leukemias.
  • VH variable domain contains 3 hypervariable regions HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where
  • HCDR 1 (according to Rabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • HCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • HCDR 3 has an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO: 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6;
  • variable domain of their light chain contains 3 hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:
  • LCDR 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
  • LCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
  • LCDR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • Antibodies according to the invention can be chimeric, humanized or human antibodies.
  • the antibodies of the present invention contain human-specific constant regions and structural components, but have a variable domain characteristic of a rat.
  • variable domain of the light chain of the antibody has the amino acid sequence of SEQ ID No: 11
  • variable domain of the heavy chain of an antibody of the present invention has an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 19.
  • amino acid sequence of the variable domain of the light chain of which is essentially similar (for example, identical, at least 90%) with the sequence shown in SEQ ID No: 11.
  • the amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain is essentially similar (for example, identical to at least 90%) with a sequence selected from the group SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 19.
  • the antibody according to the invention includes a light chain, the amino acid sequence of which is essentially similar to SEQ ID NO: 29, and the heavy chain, the amino acid sequence of which is essentially similar to the sequence selected from the group SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 23 , SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 27.
  • the monoclonal bodies of the invention are full-length human IgG antibodies, for example, IgGl or IgG2 or IgG3 or IgG4.
  • nucleic acids that encode the variable domains of the heavy and light chains of an antibody of the invention, nucleic acids encoding the heavy and light chains of antibodies of the invention, and functional antibody fragments.
  • expression cassettes and expression vectors comprising the nucleic acid of the present invention and the regulatory elements necessary for the expression of the nucleic acid in the selected host cell.
  • the expression vector or cassette may be located in the host cell as an extrachromosomal element or integrated into the cell genome as a result of the introduction (by transfection) of the said expression cassette or vector into the cell.
  • cells and stable cell lines, including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention, and methods for their preparation are provided.
  • the method includes the subsequent isolation and purification of the resulting antibody.
  • a pharmaceutical composition is also provided for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by the beta section of the human TRBV9 T family of the receptor, containing the above antibody or antigen-binding fragment thereof, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition is intended for the prevention or treatment of a disease or disorder selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • a pharmaceutical combination is also provided for preventing or treating a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor, carrying the beta chain of the TRBV9 family, containing the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof and at least one other therapeutically active compound.
  • the pharmaceutical combination is designed to prevent or treat a disease or disorder selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • the pharmaceutical combination includes another therapeutically active compound that is selected from a small molecule, an antibody, or steroid hormones, such as corticosteroids.
  • another therapeutically active compound that is selected from a small molecule, an antibody, or steroid hormones, such as corticosteroids.
  • a method of inhibiting the biological activity of a T-cell receptor, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, in a subject in need of such inhibition comprising administering to the subject an effective amount of the above antibody or its antigen-binding fragment.
  • a method of treating a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor carrying a beta chain of the TRBV9 family comprising administering to the subject in need of such treatment the above antibody or its antigen-binding fragment or the above pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount.
  • the disease or disorder is selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • the disease is selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • the technical result of the present invention is to obtain new antibodies that specifically bind to TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family and can be used for the treatment of autoimmune and oncological diseases whose pathogenesis involves TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family. Also, the technical result consists in increasing the effectiveness of therapy for AS and / or celiac disease, which is provided by the production of antibodies capable of to act directly on autoimmune T-lymphocytes, and to be able to achieve long-term remission in AS.
  • Figures 1-4 show two-parameter histograms of the distribution of cells of the mononuclear blood fraction using monoclonal antibodies against CD3 (ordinate axis) labeled with eFluor 405 and monoclonal antibodies against TRBV9 (abscissa axis) labeled with FITC: anti- TRBV9-1 ( Figure 1) , aHTH-TRBV9-2 (FIG. 2), aHTH-TRBV9-3 (FIG. 3), anti-TRBV9-4 (FIG. 4).
  • Each variant of monoclonal antibodies against TRBV9 was used in two concentrations of 270 ng (upper graph) or 27 ng (lower graph) per test.
  • the specific CD3 + population of TRBV9 + is indicated by a small rectangle.
  • Figure 5 shows two-parameter histograms of the distribution of cells of the mononuclear blood fraction using monoclonal antibodies against CD3 (ordinate axis) labeled with eFluor 405, and monoclonal antibodies against TRBV9 (abscissa axis) labeled with FITC, after the cytotoxic test: incubation with aHTH-TRBV9 2 experience) and remikade (control).
  • the present invention relates to isolated monoclonal antibodies and their functional fragments, which have the ability to specifically bind to the beta site of the human TRBV9 T family. Also provided are nucleic acids encoding antibodies and fragments thereof according to the invention, expression cassettes and expression vectors comprising the nucleic acid of the present invention and the regulatory elements necessary for the expression of the nucleic acid in the selected host cell. Besides, cells and stable cell lines are provided, including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention.
  • T-cell receptor also referred to as “TRK”, “T-receptor” or “TCR”
  • TRK T-receptor
  • TCR is a heterodimeric protein complex located on the surface of a T lymphocyte. This receptor is present only on T lymphocytes.
  • the main function of TCR is the specific recognition of processed antigens associated with molecules of the major histocompatibility complex (HLA).
  • HLA major histocompatibility complex
  • Human TKR consists of two subunits, a and b, or g and d chains connected by a disulfide bond and fixed in the cell membrane.
  • Each TCR chain has an N-terminal variable (V) domain, a connecting domain, and a constant (C) domain connected to transmembrane domain, fixing the receptor in the plasma membrane of T-lymphocyte.
  • the length of the constant domain alpha and beta chains is 91 and 129 amino acid residues, respectively.
  • the length of the connecting and transmembrane domain of the alpha chain is 30 and 17 amino acid residues (ao), while in the beta chain it is 21 and 22 aa.
  • the length of the variable domains of T-receptors varies from 104 to 125 amino acid residues.
  • T-lymphocytes A small fraction of T-lymphocytes has g / d receptors. They are similar in structure to a / b receptors, but differ in their primary structure and have a number of functional features. Their variability is much lower (limited clon specificity), they recognize antigens in combination with “non-classical” (not MHC) antigen-presenting molecules, or even free antigens.
  • the T-receptor interacts with the MHC-antigen complex in six regions that determine its complementarity (CDR): three regions of the alpha chain and three beta chains. These CDRs are hypervariable regions, the loops of the variable domains of the T-cell receptor are Walf and Ubet.
  • TRBV9 or "TRBV9 family” refer to the ninth family of beta chains of T-cell receptors, allocated according to the IMGT nomenclature, which is characterized by the fact that the amino acid sequence of their variable domain includes unique motifs CDR1 (sequence of amino acids - SGDLS) and CDR2 (sequence Amino Acids - YYNGEE).
  • TCR of the TRBV9 family means a T-cell receptor, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family.
  • T-lymphocytes or TCR means that a given TCR or T-lymphocyte carrying it is associated with a disease or pathology and / or causes the disease and / or contributes to the development of the disease.
  • autoimmune in relation to TCR means that the TCR is involved in the development of an autoimmune disease.
  • antibody is intended to identify an immunoglobulin molecule consisting of four polypeptide chains (two heavy (H) chains and two light (L) chains) linked by disulfide bonds.
  • Light chains are classified as kappa or lambda.
  • Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon, and they define the isotype of an antibody, such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively, and several of them can be further divided into subclasses (isotypes), for example, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2.
  • Each type of heavy chain is characterized by a specific constant region.
  • Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated here as HCVR or VH) and a heavy chain constant region.
  • the heavy chain constant region contains three domains CHI, CH2 and CH3.
  • Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated here as LCVR or VL) and a light chain constant region.
  • the light chain constant region contains one domain CL.
  • the VH and VL segments can be further subdivided into hypervariability regions, called complementarity determining regions (CDRs), surrounded by regions that are more conservative, called skeletal regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR skeletal regions
  • Each of the VH and VL consists of three CDRs and four FR sections, located from the amino to carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • CDRH1, CDRH2, and CDRH3 3 CDRs of the heavy chains are designated as “CDRH1, CDRH2, and CDRH3”
  • 3 CDRs of the light chain are designated as “CDRF1, CDRF2, and CDRF3”.
  • CDRs contain most of the residues that form specific interactions with the antigen.
  • the numbering and positioning of CDR-amino acid residues within the HCVR and FCVR regions of the antibodies according to the invention is carried out with well-known Kabat nomenclature, unless otherwise noted. In this application is used, unless otherwise indicated, generally accepted letter symbols of amino acids.
  • anti-TRBV9 antibody refers to an antibody, which specifically binds to the epitope of the beta chain of the TRBV9 family of the human T-cell receptor.
  • antibody and “monoclonal antibody” for the purposes of this application refer to a monoclonal antibody against TCR of the TRBV9 family.
  • monoclonal antibody refers to a rodent, primate, or Camelidae, preferably a mouse, macaque, camel, or llama, chimeric antibody, humanized antibody, or fully human antibody, unless otherwise indicated.
  • variable regions of each of the light / heavy chain pairs form the antigen-binding sites of the antibody.
  • the “antigen-binding portion” or “antigen-binding region”, or “antigen-binding domain” or “antigen-binding center” refers, interchangeably, to that portion of an antibody molecule that contains amino acid residues that interact with the antigen and give the antibody its specificity and affinity for the antigen. This part of the antibody includes the "frame" amino acid residues necessary to maintain proper conformation of antigen-binding residues.
  • human antibody means an antibody in which the variable and constant domain sequences are derived from human sequences.
  • Human antibodies according to the invention may include residues amino acids that are uncharacteristic for humans (for example, mutations introduced by omnidirectional or site-specific mutagenesis in vitro or somatic mutation in vivo), for example, in the CDR and especially in CDR3.
  • humanized in relation to antibodies is used to refer to antibodies that are characterized by the presence of human-specific constant regions and structural components, but have areas of complementarity (CDR) that are characteristic of immunoglobulins of other origin or corresponding fragments of modified antibodies.
  • CDR complementarity
  • chimeric in relation to the antibodies of the present invention is used to refer to antibodies that are characterized by the presence of constant regions characteristic of humans, but have variable domains of a different origin.
  • variable domains of light and / or heavy chains that are of nonhuman origin are operatively linked to the constant domains of the corresponding chains of human origin.
  • operably linked refers to polypeptide sequences that are in physical (covalent, unless otherwise indicated) and functional relationship with one another. In the most preferred embodiments, the functions of the polypeptide components of the chimeric molecule are not altered compared with the functional properties of the isolated polypeptide components.
  • operably linked or similar to it when describing nucleic acids means that the nucleic acids are covalently linked in such a way that there are no “binding” reading frames and stop codons in the places of their connection.
  • nucleotide sequences encoding a chimeric protein including "operatively linked” components (proteins, polypeptides, linker sequences, protein domains, etc.) consist of fragments encoding these components, where these fragments are covalently linked in such a way that during translation and transcription of the nucleotide sequence is produced by a full-length chimeric protein, for example, a chimeric antibody according to the invention.
  • isolated and “isolated” mean a molecule or cell that is in a medium other than the medium in which the molecule or cell is in vivo.
  • antibodies of the present invention are recombinant, that is, obtained using recombinant DNA techniques.
  • recombinant antibody includes all antibodies that are obtained, expressed, created or isolated by recombinant means, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector introduced into a host cell, antibodies isolated from a set of known recombinant human combinatorial antibodies, antibodies isolated from an animal that is transgenic to the human immunoglobulin genes (see, for example, Taylor LD et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295).
  • recombinant human antibodies are subjected to mutagenesis in vitro (or, if you use an animal transgenic for human lg sequences, somatic mutagenesis in vivo) and, thus, the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that isolated from human germline VH and VL sequences and close to them; they cannot exist in vivo in human embryonic antibody set in vivo under natural conditions.
  • the antigen-binding domain of an antibody of the invention is specific for a particular epitope that is carried by a number of antigens, in which case the specific antibody having the antigen-binding domain will be capable of specifically binding different antigens carrying the epitope.
  • the monoclonal antibody of the invention specifically binds an epitope of the beta T chain of a human cell receptor belonging to the TRBV9 family, while it does not specifically bind the TCR beta chain of other families and the TCR alpha chain.
  • epitope refers to that portion of the molecule that is able to be recognized and bound to an antibody in one or more antigen-binding sites of an antibody. Epitopes often consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics.
  • epitope also refers to the part of the polypeptide that has antigenic and / or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, for example, a mouse, rat or human.
  • antigenic epitope as used in this application, is defined as part of a polypeptide with which an antibody can specifically bind, determined by any method well known in the art, for example, by conventional immune assay. Antigenic epitopes need not be immunogenic, but may also be immunogenic. "Immunogenic epitope ", as used in this application, is defined as part of the polypeptide that causes the antibody response in an animal, as established by any method known from the prior art.
  • a “non-linear epitope” or “conformational epitope” contains non-adjacent polypeptides (or amino acids) within the antigenic protein with which an antibody specific for the epitope binds.
  • biological property or “biological characteristic” or the terms “activity” or “bioactivity with respect to an antibody and its functional fragments according to the invention are used interchangeably in this application and include, but are not limited to, epitope / antigenic affinity and specificity, ability inhibit or antagonize TCR activity, which includes a beta chain belonging to the TRBV9 family.
  • the remaining biological properties or characteristics of the antibody identified in the prior art include, for example, cross-reactivity (i.e., non-human homologues of the target peptide or other proteins or targets in general) and the ability to maintain high levels of protein expression in mammalian cells.
  • cross-reactivity i.e., non-human homologues of the target peptide or other proteins or targets in general
  • the above properties or characteristics may be monitored, measured, or evaluated using techniques recognized in the art, including, but not limited to, ELISA, competitive ELISA, BIACORE, or KINEXA surface plasmon resonance analysis, in vitro or in vivo inhibition assays restrictions, receptor binding, production and / or secretion of cytokine or growth factor, signal transduction and immunohistochemistry of tissue sections obtained from various sources, including human, primate or Juba another source.
  • inhibitor or “neutralize”, as used in this application, in relation to the activity of the antibodies of the invention, means the ability to largely resist, inhibit, prevent, limit, slow down, interrupt, destroy, stop, reduce, for example, development or the severity of what is inhibited, including, but not limited to, the biological activity of the antibody or property, disease, or condition.
  • mutant refers to an antibody disclosed in the present invention in which one or more amino acids are added and / or substituted and / or deleted (deleted) and / or inserted (inserted) into the N-terminus. and / or the C-terminus, and / or within the native amino acid sequences of the antibodies of the present invention or fragments thereof.
  • mutant also refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutant protein.
  • mutant refers to any variant that is shorter or longer than a protein or nucleic acid.
  • homology is used to describe the relationship of nucleotide or amino acid sequences with other nucleotide or amino acid sequences, which is determined by the degree of identity and / or similarity between the indicated compared sequences.
  • amino acid or nucleotide sequences are “substantially similar” or “substantially the same” as the reference sequence if the amino acid or nucleotide sequences have at least 70% identity with the specified sequence within the region chosen for comparison.
  • essentially similar sequences include those that have, for example, at least 75% identity, for example, at least at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity (eg, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 98% or 99% identity).
  • Two sequences that are identical to one another are also essentially similar.
  • the identity of the sequences is determined based on the reference sequence.
  • Algorithms for sequence analysis are known in the art, such as IgBLAST, described in Ye et al. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40.
  • IgBLAST a comparison of nucleotide and amino acid sequences produced by the IgBLAST software package provided by the National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih) can be used to determine the level of identity and similarity between nucleotide sequences and amino acid sequences. .gov / igblast /) using an alignment-containing gap with standard parameters.
  • To calculate the percent identity use the full length of the reference sequence, for example, a variable region.
  • nucleotide sequence of a “coding” polypeptide means that the polypeptide is produced from the nucleotide sequence during translation and transcription of mRNA. In this case, both a coding chain identical to mRNA and commonly used in the sequence list, or a complementary chain, which is used as a template for transcription, can be indicated. As is obvious to anyone skilled in the art, the term also includes any degenerate nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence.
  • the nucleotide sequences encoding the polypeptide include sequences containing Nitrons. Antibodies
  • the present invention relates to isolated monoclonal antibodies and their functional fragments, which are capable of specifically binding to the beta region of the human TRBV9 T family.
  • variable domain of their heavy chain contains 3 hypervariable regions HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where
  • variable domain of their heavy chain contains 3 hypervariable regions HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where
  • HCDR1 has (according to Kabat nomenclature) the amino acid sequence DYLVH (SEQ IN No 1);
  • HCDR2 has an amino acid sequence
  • HCDR3 has an amino acid sequence selected from the group SWRRGLRGLGFDY (SEQ ID No 3), SWRRGLRGIGFDY (SEQ ID No 4), SWRRGIRGFGFDY (SEQ ID No 5), SWRRGIRGIGFDY (SEQ ID No 6); b) the variable domain of their light chain (VF) contains 3 hypervariable regions FCDR1, FCDR2 and FCDR3, in which:
  • FCDR1 has the amino acid sequence KASKSINKYFA (SEQ ID No 7);
  • FCDR2 has the amino acid sequence DGSTFQS (SEQ ID No 8);
  • FCDR3 has the amino acid sequence QQHNEYPPT (SEQ ID No 9).
  • Antibodies according to the invention can be chimeric, humanized or human antibodies, or antigen-binding fragments thereof, and can be used as medicines for the treatment of ankylosing spondylitis and other diseases in the pathogenesis of which TCRs are related to the TRBV9 family, for example celiac disease or T-cell lymphoma.
  • the monoclonal antibodies of the invention can be obtained using, for example, hybridoma techniques well known in the art, as well as recombinant technology, phage display technology, synthetic technology, or combinations of such technology or other technology well known in the art.
  • the term “monoclonal antibody,” as used herein, refers to an antibody obtained from a single copy or clone, including, for example, any eukaryotic, prokaryotic, or phage clone, and not to a method for its preparation.
  • Humanized and chimeric antibodies can be obtained by peptide synthesis or using recombinant DNA techniques as described below in the “Nucleic Acids” section.
  • the antibodies of the present invention are chimeric and are characterized by the fact that they have variable domains of light and heavy chains of non-human origin (for example, rat or mouse), and constant domains characteristic of humans.
  • the antibodies of the present invention are characterized in that they have the amino acid sequence of the heavy chain variable domain selected from the group of SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19, and the amino acid sequence of the light chain variable domain shown in SEQ ID No. 11.
  • the antibody contains a constant region of the heavy chain, such as the constant region IgGl, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, human IgD.
  • the constant region of the heavy chain is the constant region of the human IgGl heavy chain.
  • the antibody may contain either a light chain constant region or a kappa constant light region. chains, or lambda constant region of the light chain.
  • the antibody contains a kappa constant region of the light chain.
  • Examples of the heavy chain amino acid sequences of aHTH-TRBV9-l, aHTH-TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3 or affra-TRBV9-4 antibodies of the invention are shown in SEQ ID NO: 21, 23, 25 and 27, respectively.
  • An example of the amino acid sequence of the light chain of the antibodies is shown in SEQ ID No: 29.
  • the amino acid sequences of the framework regions of the antibody variable domains, or portions thereof are primarily human in origin and, therefore, "humanized antibodies.” This “humanization” is considered to be useful in reducing the immunogenicity of the indicated antibody during therapeutic administration to patients. Certain selected amino acid residues in the framework sites remain rat, and not human.
  • the antibodies of the present invention and their anti-binding fragments include the light chain variable domains, the amino acid sequences of which are substantially similar to the amino acid sequence of SEQ ID No 11, for example, at least 90% identical, more often at least 93%. typically, 94% or more (preferably 95% or more, 96% or more; 97% or more, 98% or more, 99% or more or 99.5% or more).
  • the antibodies of the present invention and their antigen-binding fragments include heavy chain variable domains, the amino acid sequences of the variable domains of which are substantially similar to the amino acid sequence selected from the group SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19.
  • they have amino acid a sequence identical to the sequence selected from group SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19, at least by 90%, more often by at least 93%, usually by 94% or more (preferably 95% or more, 96% or more; 97% or more, 98% or more, 99% or more or 99.5% or more).
  • the antibody of the present invention includes a heavy chain having an amino acid sequence of at least 90% identical (for example, 93% identical or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher; 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher or 99.5% or higher) of a sequence selected from the group SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 27 and a light chain having an amino acid sequence of at least 90% identical (for example, 93% identical or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher; 97% yl above 98% or higher, 99% or higher or 99.5% or more) sequence SEQ ID NO: 29.
  • Antibodies of the present invention may also contain additional mutations that do not result in the loss of the ability of an antibody to bind to the beta chain of TCR of the TRBV9 family, but may lead to a decrease in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or an increase in affinity or other biological properties of antibodies.
  • conservative amino acid substitutions can be made to antibody sequences.
  • conservative substitution in the context of an application is meant a substitution in which the amino acid residue is replaced with another amino acid residue having a close side chain.
  • Families of amino acid residues having similar side chains are defined in the prior art, including basic side chains (for example, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (for example, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (for example, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), b-branched side chains (for example , threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (for example, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • basic side chains for example, lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains for example, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains for
  • no more than five conservative amino acid substitutions are made in the VL and / or VH domains in the CDR3 domains, more often no more than three conservative substitutions.
  • conservative substitutions are not made at the positions of amino acids that are critical for binding the epitope of the beta chain of the TRBV9 family.
  • variants (mutants) of the antibodies according to the invention described above can be obtained by peptide synthesis or using recombinant DNA techniques as described below in the section “Nucleic Acids”.
  • Antigen-binding antibody fragments of the present invention are also provided.
  • binding fragments encompassed by the term "antigen-binding fragment" of an antibody include (a) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (b) F (ab ′) 2 fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the loop region; (c) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (g) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody; (e) a dAb fragment (Ward et al.
  • Diabodies are bivalent, bispecific antibodies in which the VH and VL domains are expressed on the same polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow the pairing of two domains on the same chain, which causes the domains to pair with the complementary domains of the other chain and create two antigen-binding sites (see, for example, Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak RJ et al. (1994) Structure 2: 1121- 1123).
  • Antibody fragments such as Fab F (ab ') 2
  • Fab F (ab ') 2 can be obtained from whole antibodies using accepted methods, such as the decomposition of papain or pepsin, respectively, of whole antibodies.
  • antibodies, antibody fragments and immunoadhesion molecules can be obtained using standard recombinant DNA techniques.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be part of larger immunoadhesion molecules formed by a covalent or non-covalent bond of the antibody or antibody fragment to one or more protein or peptide.
  • immunoadhesion molecules include the use of a streptavidin nucleus site to produce a tetrameric scFv molecule (Kipriyanov SM et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) and the use of a cysteine residue, a marker peptide and a C-terminal polyhistidine tag to produce bivalent and reduced scFv biomolecules (Kipriyanov SM et al. (1994) Mol. Immunol., 31: 1047-1058).
  • Other chemical binding of antibody fragments are also well known in the art.
  • the antibodies and their functional fragments according to the invention are in isolated form, that is, this means that the protein is essentially free from the presence of other proteins or other natural biological molecules, such as oligosaccharides, nucleic acids and their fragment, etc., where the term “Substantially free” in this case means that less than 70%, usually less than 60%, and more often less than 50% of said composition containing the isolated protein is another natural biological molecule.
  • said proteins are present in substantially the purified form, where the term “substantially purified form” means purity equal to at least 95%, usually equal to at least 97%, and more often equal to at least 99%.
  • purification can be carried out by chromatography (for example, ion exchange, affinity, especially affinity for specific antigens — protein A or protein G, and column chromatography of sizes), centrifugation, differential solubility, or any other standard protein purification technique.
  • chromatography for example, ion exchange, affinity, especially affinity for specific antigens — protein A or protein G, and column chromatography of sizes
  • centrifugation differential solubility
  • differential solubility differential solubility
  • antibodies according to the technology of the present invention, or fragments thereof may be fused with heterologous polypeptide sequences (eg, a histidine tag) to facilitate purification.
  • heterologous polypeptide sequences eg, a histidine tag
  • KD dissociation constant
  • kd the experimentally calculated dissociation rate constant
  • kon the experimentally calculated association rate constant of the antitelo-antigen complex.
  • Preferred antibodies are those that bind a human antigen to a KD value of no more than about 1 c 10 7 M; preferably not more than about 1 s 10 8 M; more often no more than approximately 1 x 10 -9 M; more preferably not more than about 1 x 10 -10 M, and most preferably not more than about 1 c 10 11 M, for example, not more than about 1 c 10 12 M.
  • Preferred antibodies include aHTH-TRBV9-l, anti-TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3 or aHTH-TRBV9-4 antibodies, characterized by the CDR3 sequence and described in detail in the experimental part below.
  • Antibodies and fragments thereof that can be used in the present compositions and methods are biologically active antibodies and fragments, i.e., are capable of binding the desired antigenic epitopes and exhibiting a biological effect directly or indirectly.
  • Antibodies and their functional fragments according to the invention are capable of specifically binding an epitope (region) of the beta chain of the TRBV9 family.
  • TCR activity is inhibited, including the indicated beta chain.
  • the inhibition is preferably at least about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% or higher.
  • the implementation of the antibody against the beta chain of the TRBV9 family according to the invention or its fragment can eliminate T-lymphocytes carrying TER, containing the beta chain of the TRBV9 family.
  • the implementation of the antibody or its fragment according to the invention can provide at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, or about 100% elimination of T-lymphocytes.
  • the present invention provides nucleic acid molecules encoding the heavy and light chains of the antibodies of the present invention, their functional fragments and variable domains, which can be used to produce chimeric antibodies, including the variable domains of the invention, operatively fused to known human constant domains of antibodies.
  • the nucleic acid of the invention encodes a heavy chain of an antibody, the variable domain of which contains 3 hypervariable regions HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where
  • HCDR1 (according to Rabat nomenclature) has the amino acid sequence SEQ IN No 1;
  • HCDR2 has the amino acid sequence SEQ IN No 2;
  • HCDR3 has an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6.
  • the nucleic acid of the invention encodes a light chain of an antibody, the variable domain of which contains 3 hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:
  • LCDR1 has the amino acid sequence of SEQ ID No 7;
  • LCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID No 8;
  • LCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID No 9.
  • nucleic acid molecules encoding the homologues and mutants of these antibody chains, their functional fragments and domains are also within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid encodes a light chain of an antibody, the variable domain of which contains the amino acid sequence substantially similar to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; for example, at least 90% identical, more often at least 93%, typically 94% or higher (preferably 95% or higher, 96% or higher; 97% or higher, 98% % or higher, 99% or higher or 99.5% or higher).
  • the nucleic acid encodes a heavy chain of an antibody, the variable domain of which contains the amino acid sequence substantially similar to the amino acid sequence selected from the group of SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19; for example, at least 90% identical, more often at least 93%, typically 94% or higher (preferably 95% or higher, 96% or higher; 97% or higher, 98% % or higher, 99% or higher or 99.5% or higher).
  • nucleic acids encode a light chain of an antibody containing a variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID No 11 and a heavy chain of an antibody containing the variable domain, the amino acid sequence of which is selected from the group SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19.
  • the nucleic acid encodes the variable domains, the amino acid sequences of which are represented in SEQ ID NO 11,11,15,19, which can be used for operational fusion with nucleic acids encoding the corresponding constant domains of antibodies.
  • nucleic acid molecule is a DNA molecule, such as a genomic DNA or a DNA molecule, or an RNA molecule, such as an mRNA molecule.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a DNA (or DNA) molecule containing an open reading frame that encodes an antibody or antibody fragment of the present invention and is capable of under suitable conditions (for example, physiological intracellular conditions) to be used for expression in heterologous expression system.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is genetically engineered.
  • Methods for producing nucleic acids are well known in the art. For example, the availability of amino acid sequence information or nucleotide sequence information makes it possible to manufacture isolated nucleic acid molecules of the present invention using oligonucleotide synthesis. In the case of amino acid sequence information, several nucleic acids that differ from each other due to the degeneracy of the genetic code can be synthesized. Methods for selecting codon variants for a desired host are well known in the art.
  • Synthetic oligonucleotides can be prepared using the phosphoramidite method, and the resulting constructs can be purified using methods well known in the art, such as high performance liquid chromatography (HPLC) or other methods as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and no instructions described in, for example, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the long double-stranded DNA molecules of the present invention can be synthesized as follows: several smaller fragments with the required complementarity, which contain suitable ends capable of cohesion with the adjacent fragment. Adjacent fragments can be crosslinked using DNA ligase or PCR based method.
  • nucleic acid molecules of the present invention can also be cloned from biological sources.
  • the present invention also encompasses nucleic acids that are homologous, substantially similar, identical, or derived from nucleic acids encoding the polypeptides of the present invention.
  • nucleic acids of the invention are in an environment other than the environment in which they are in vivo, for example, they are isolated, are present in increased amounts, are or are expressed in in vitro systems or in cells or organisms other than those in which they are located. in natural conditions.
  • Changes or differences in nucleotide sequence between highly similar nucleotide sequences can represent nucleotide substitutions in the sequence that occur during normal replication or duplication. Other substitutions can be specifically calculated and inserted into the sequence for specific purposes, such as changing the codons of certain amino acids or the nucleotide sequence of a regulatory region. Such special replacements can be made in vitro using various mutagenesis technologies or obtained in host organisms under specific breeding conditions that induce or select these changes. Such specially derived sequence variants may be referred to as "mutants" or "derivatives" of the original sequence.
  • Mutant or derived nucleic acids can be obtained on a matrix nucleic acid selected from the above nucleic acids, by modifying, deleting, or adding one or more nucleotides in a template sequence or a combination thereof, to produce a template nucleic acid variant. Modifications, additions or deletions can be made by any method known in the art (see, for example, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; and Colicelli et al. , Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.
  • Modifications, additions, or deletions can also be performed using a method that includes recombination, recursive recombination of sequences, a phosphothioate-modified DNA mutagenesis, mutagenesis on a uracil-containing matrix, double-gap mutagenesis, point-based mismatch mutagenesis, strain mutagenesis, deficient recovery, deficiency repair, deficient recovery, repair deficiency repair, point deficiency recovery mutation.
  • mutagenesis radioactive mutagenesis, deletion mutagenesis, restriction-selective mutagenesis, restriction mutagenesis with purification, synthesis of artificial g new, multiple mutagenesis, creation of multiple chimeric nucleic acids, and combinations thereof.
  • degenerate variants of nucleic acids that encode the proteins of the present invention.
  • Degenerate nucleic acid variants include the replacement of nucleic acid codons with other codons encoding the same amino acids.
  • degenerate variants of nucleic acids are created to increase expression in the host cell.
  • nucleic acid codons that are not preferred or less preferred in the host cell genes are replaced by codons that are abundantly represented in the coding sequences of the genes in the host cell, where these replaced codons encode the same amino acid. Optimization of the genetic code buried known from the prior art.
  • the claimed nucleic acids can be isolated and obtained essentially in purified form.
  • Essentially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, usually at least about 90% pure and usually "recombinant", that is, flanked by one or more nucleotides with which it is usually not linked in the chromosome found naturally in its natural host organism.
  • nucleic acids that encode fusion proteins comprising the protein of the present invention, or fragments thereof, which are discussed in more detail below.
  • the nucleic acids encoding the variable domains of the invention can be operatively fused with nucleic acids encoding the corresponding constant domains of the antibody light and heavy chains.
  • Nucleic acids encoding the light and heavy chains of an antibody can be promptly fused with nucleic acids encoding a leader peptide, transporting expression products from the host cell. The leader peptide is subsequently cleaved during maturation of the polypeptide.
  • a vector and other nucleic acid constructs containing the claimed nucleic acids are also provided.
  • the term "vector” includes a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid with which it is operatively associated. Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced, while the remaining vectors can be integrated into the genome of the host cell and, thus, replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are able to direct the expression of genes with which they are operatively linked. Such vectors have the name “recombinant expression vectors” (or, simply, “expression vectors” or “expression vectors”) in this application, and illustrative vectors are well known in the art.
  • Suitable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplifying, expressing, transferring, etc., the nucleic acid sequence of the present invention in a suitable host.
  • the choice of a suitable vector is understandable for a qualified specialist in this field.
  • a full-length nucleic acid or part thereof is usually inserted into a vector by attaching a DNA ligase to a site digested with restriction enzymes in the vector.
  • the desired nucleotide sequence can be inserted by homologous recombination in vivo, usually by attaching the homologous regions to a vector on the flanks of the desired nucleotide sequence. Homologous sites are added by ligating oligonucleotides or by polymerase chain reaction, using primers including, for example, as homologous plots, and part of the desired nucleotide sequence.
  • the vector as a rule, has the origin of replication, ensuring its reproduction in host cells as a result of its introduction into the cell as an extrachromosomal element.
  • the vector may also contain regulatory elements that ensure the expression of the nucleic acid in the host cell and the production of the target polypeptide.
  • said nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence, which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inductors, as well as a start codon of the polypeptide.
  • a regulatory sequence which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inductors, as well as a start codon of the polypeptide.
  • the nucleic acid of the invention is also operably linked to a leader peptide, allowing the expression product to be released from the host cell into the extracellular space.
  • expression cassettes or systems used inter alia to produce claimed polypeptides (for example, the light and heavy chains of an antibody of the invention) based on them or to replicate the claimed nucleic acid molecules.
  • the expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the cell genome as a result of the introduction of the expression cassette into the cell.
  • the protein product encoded by the nucleic acid of the invention is expressed in any convenient expression system, including, for example, bacterial systems, yeast, plants, insects, amphibians, or mammalian cells.
  • the target nucleic acid is operably linked to regulatory sequences, which may include promoters, enhancers, termination sequences, operators, repressors and inductors, as well as the start codon of the polypeptide.
  • regulatory sequences may include promoters, enhancers, termination sequences, operators, repressors and inductors, as well as the start codon of the polypeptide.
  • the nucleic acid according to the invention the nucleic acid is also operatively associated with a leader peptide, providing the selection of the expression product from host cells into the extracellular space.
  • Host cells such as E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or higher organism cells that are not human embryonic cells, such as yeast, plants, vertebrates, for example, CHO cells (for example, ATCC CRL-9096), NS0 cells, SP2 / 0 cells, HEK293 cells, COS cells (for example, ATCC CRL-1650, CRL-1651) and HeLa (ATCC CCL-2).
  • Host cells such as E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or higher organism cells that are not human embryonic cells, such as yeast, plants, vertebrates, for example, CHO cells (for example, ATCC CRL-9096), NS0 cells, SP2 / 0 cells, HEK293 cells, COS cells (for example, ATCC CRL-1650, CRL-1651) and HeLa (ATCC CCL-2).
  • the host cell is co-transformed with an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody light chain and an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody heavy chain.
  • an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody light chain and an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody heavy chain.
  • a single expression vector is used in which nucleic acids are inserted that encode both the light and heavy chains of the antibody.
  • the expression vector (s) encoding the heavy and light chains is transformed (co-transformed) into the host cell so that the light and heavy chains are expressed in the host cell and, preferably, are released on Wednesday, which cultured host cells, antibodies can be isolated from this medium.
  • transformation is intended to include a wide range of methods commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, for example, electroporation, calcium phosphate precipitation, transfection with DEAE-dextran, etc., as described by Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989; Ausubel FM et al. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).
  • antibodies are formed by culturing host cells for a period of time sufficient to express the antibody in the host cell, or (more preferably) secreting the antibody into the culture medium, in which grow host cells.
  • Antibodies can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods. The culture conditions for various cells are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Current Protocols in Cell Biology, ed. Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J..B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada K.M., ed. John Wiley & Sons, Inc., 2000.
  • the resulting replicated nucleic acid, expressed protein or polypeptide is within the scope of the invention as a product of the host cell or organism.
  • the product can be isolated by a suitable method known in the art.
  • Cell lines that stably express the proteins of the present invention can be selected by methods known in the art (eg, co-transfection with a selectable marker, such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to detect and isolate transfected cells that contain gene included in the genome).
  • a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin
  • the nucleic acid molecules of the present invention can also be used to determine the expression of a gene in a biological sample.
  • DNA or mRNA is isolated from a cell sample.
  • mRNA can be amplified by RT-PCR, using reverse transcriptase to form a complementary strand of DNA, followed by amplification using polymerase chain reaction using primers specific for the claimed DNA sequences.
  • the mRNA sample is separated by gel electrophoresis, transferred to a suitable carrier, for example, nitrocellulose, nylon, etc., and then tested with a fragment of the claimed DNA as a sample.
  • oligonucleotide crosslinking assays such as in situ hybridization, and hybridization with DNA samples immobilized on a solid chip. Detection of mRNA hybridizing with the claimed sequence indicates gene expression in the sample.
  • the antibody or active fragment thereof of the present invention is used in the treatment of disorders that are associated with the activity of abnormal T-lymphocytes that carry on the surface of the TCR of the TRBV9 family, for example, with the activity of autoimmune T-lymphocytes in AC, celiac disease, T-cell lymphomas.
  • the term "patient” in this application refers to a mammal, including, but not limited to, mice, monkeys, humans, mammals, farm animals, mammalian sports animals, and mammals of domestic animals; preferably the term refers to people.
  • the patient is additionally characterized by a disease or disorder, or a condition mediated by the presence of TCR in his body, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family.
  • TCR beta chain which belongs to the family of TRBV9, associated with AS and celiac disease.
  • TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family may be associated with the development of a number of blood disorders, such as T-cell lymphoma, caused by Epstein-Barr virus.
  • co-administration refers to or include:
  • an antibody of the invention (for example, aHTH-TRBV9-l, anti-TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3, or aHTH-TRBV9-4) can be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy.
  • treatment with an antibody of the invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).
  • the antibody may be co-administered or formulated with another drug / drug for an autoimmune or oncologic disease, in the pathogenesis of which TCRs containing the TRBV9 beta chain are involved, for example, AC, celiac disease, T-cell lymphoma, T-cell leukemia.
  • An antibody of the invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.
  • a therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the particular condition being treated, the age, sex and weight of the patient, and whether the administration of the antibody is an independent treatment or it is carried out in combination with one or more additional immunosuppressive or anti-inflammatory methods. treatment.
  • Drug regimens can be adjusted to provide the optimum desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered for a period of time, or the dose may be proportionally reduced or increased in depending on the severity of the therapeutic situation. Particularly useful is the manufacture of parenteral compositions in a standard dosage form for ease of administration and uniformity of dosing.
  • the unit dosage form when used in this document, refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients / subjects to be treated; each unit contains a given amount of active compound calculated to obtain the desired therapeutic effect in combination with the desired pharmaceutical carrier.
  • dosages and dosage regimens are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field. This means that a maximum tolerated dose can be easily established and an effective amount can also be determined that provides a detectable therapeutic effect for the patient, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • a maximum tolerated dose can be easily established and an effective amount can also be determined that provides a detectable therapeutic effect for the patient, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • dosage values may vary, depending on the type and severity of the condition, which should be alleviated, and may include one or more doses.
  • the specific regimens should be adjusted over time according to the individual need and at the discretion of the medical professional who administers or controls the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this description are only as an example, and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.
  • the dosage regimen with the compositions of this invention may be based on various factors, including the type of disease, age, weight, gender, patient health conditions, the severity of the condition, the route of administration, and the specific antibody used.
  • the dosing regimen can vary widely, but can be determined regularly using standard methods.
  • doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects, such as toxic effects or laboratory values.
  • the present invention encompasses an individual dose increase, which is determined by a qualified technician. Determining the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to the person skilled in the art after becoming acquainted with the ideas disclosed in this document.
  • a suitable dose of the antibody according to this invention will be in the range of 0.1-200 mg / kg, preferably 0.1-100 mg / kg, including about 0.5-50 mg / kg, for example, about 1 - 20 mg / kg.
  • the antibody can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg / kg, for example, at least 0.5 mg / kg, including at least 1 mg / kg, for example, at least 1, 5 mg / kg, for example, as well as at least 2 mg / kg, for example, at least 3 mg / kg, including at least 4 mg / kg, for example, at least 5 mg / kg; and, for example, up to a maximum of 50 mg / kg, including up to a maximum of 30 mg / kg, for example, up to a maximum of 20 mg / kg, including up to a maximum of 15 mg / kg.
  • the introduction will usually be repeated at suitable intervals, for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks or once every four weeks, and for as long as deemed appropriate by the responsible doctor, who may in some cases increase or reduce the dose if necessary.
  • the antibody according to the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for administration to a patient.
  • the antibodies of the invention may be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or vehicle in single or multiple doses.
  • Pharmaceutical compositions for administration are designed to correspond to the chosen mode of administration, and pharmaceutically acceptable diluents, carriers and / or excipients, such as dispersing agents, buffers, surfactants, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizers, etc. . used properly.
  • These compositions have been developed in accordance with conventional methods, as given in, for example, Remington, The Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, which describes various methods for preparing the compositions, in general known to specialists.
  • Drug (drug) a substance or mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules, powders, lyophilisates, injections, infusions, ointments and other ready-made forms, designed to restore, correct or change the physiological functions in humans and animals , as well as for the treatment and prevention of disease, diagnosis, anesthesia, contraception, cosmetology and other things. Any method of administration of peptides, proteins or antibodies, adopted in this area, can appropriately be used for antibodies according to this invention.
  • pharmaceutically acceptable means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.
  • excipient or “excipient” is used in this document to describe any component that is different from the previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin used in the production process, the manufacture of medicines to give them the necessary physicochemical properties.
  • buffer means a solution capable of maintaining the pH value due to the interaction of the acidic and alkaline components that make up its composition, which allows the antibody preparation to be resistant to changes in pH.
  • pH values of the pharmaceutical composition are from 4.0 to 8.0.
  • buffering agents for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate, etc. can be used. buffer solutions, but not limited to them.
  • tonic agent refers to an excipient that can bring the osmotic pressure of a liquid antibody preparation.
  • "Isotonic” drug is a drug that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic preparations usually have an osmotic pressure of from about 250 to 350 mOsm / kg.
  • isotonic agents can be polyols, mono- and disahars, amino acids, metal salts, for example, sodium chloride, etc., are used, but not limited to them.
  • stabilizer an excipient or a mixture of two or more excipients that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • amino acids can be used, for example, arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline, but not limited to them; surfactants such as polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxamer (Poloxaner), Pluronic (Pluronic)), sodium dodecyl sulfate (SDS ), but not limited to them; antioxidants, for example, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, salts of sulfurous acids, etc., but not limited to; chelating agents, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid
  • the pharmaceutical composition is “stable” if the active agent retains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the stated shelf life at storage temperature, for example, at 2-8 ° C.
  • the active agent maintains both physical and chemical stability, as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of stability studies for accelerated and natural storage.
  • a pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody of the invention can be administered to a patient with a pathology as described in this application, using standard administration methods, including oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, pulmonary, transdermal, intramuscular, intranasal, buccal, sublingual or with the help of suppositories.
  • the pharmaceutical composition of the invention preferably contains or is a "therapeutically effective amount" of an antibody of the invention.
  • a “therapeutically effective amount” refers to an amount effective at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired therapeutic result.
  • a therapeutically effective amount of the antibody may vary depending on such factors as the condition of the disease, the age, sex and weight of the individual, and the ability of the antibody or part of the antibody to cause the desired reaction in the individual.
  • a therapeutically effective amount is also an amount at which the therapeutically beneficial effect of the antibody prevails over the toxic or detrimental effect.
  • a “prophylactically effective amount” refers to an amount effective at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired prophylactic result. Since the prophylactic dose is used for individuals before or at an early stage of the disease, typically, a prophylactically effective amount may be less than the therapeutically effective amount.
  • a therapeutically effective or prophylactically effective amount is at least the minimum dose, but less than the toxic dose of the active agent necessary to provide therapeutic benefit to the patient.
  • a therapeutically effective amount of an antibody of the invention is an amount that in mammals, preferably humans, reduces the biological activity of autoimmune clones, for example, by binding TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, where the presence of these clones causes pathological effects, or a decrease in TKR levels, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, causes a favorable therapeutic effect in a mammal, preferably a human.
  • the route of administration of an antibody of the invention may be oral, parenteral, by inhalation or local.
  • the antibodies of the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration.
  • parenteral includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal, or intraperitoneal administration. It is advantageous to administer by intravenous or intraperitoneal or subcutaneous injection. Suitable carriers for such injections are directly known in the art.
  • the pharmaceutical composition must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage in a container that is provided, including, for example, a hermetically sealed vial (ampoule) or syringe. Therefore, the pharmaceutical compositions can be sterile filtered after preparation of the formulation, or otherwise made microbiologically suitable.
  • a typical composition for intravenous infusion may have a volume of 250-1000 ml of fluid, such as sterile Ringer's solution, saline, dextrose solution, and Hank's solution, and a therapeutically effective dose (for example, 1-100 mg / ml or more) of antibody concentration. The dose may vary depending on the type and severity of the disease.
  • the dosages for any patient depend on many factors, including the size of the patient, the surface area of the body, the age, the specific compound to be administered, the gender, the time and route of administration, general health, and other medications. which enter at the same time.
  • a typical dose may be, for example, in the range of 0.001-1000 ⁇ g; however, doses are foreseen that are below or above this illustrative range, especially given the above factors.
  • the dosage regimen of daily parenteral administration can range from 0.1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg of total body weight, preferably from 0.3 ⁇ g / kg to 10 mg / kg and more preferably from 1 ⁇ g / kg to 1 mg / kg even more preferably from 0.5 to 10 mg / kg of body weight per day.
  • the treatment process can be monitored by periodically assessing the patient’s condition. For repeated administration over several days or longer, depending on the condition of the patient, the treatment is repeated until the desired response or suppression of the symptoms of the disease is achieved. However, other dosage regimens that are not described in this application may also be used.
  • the desired dosage can be administered by single-pole administration, multiple bolus administrations, or by continuous infusion of the antibody, depending on the pharmacokinetic disintegration sample that the practitioner wants to achieve.
  • the key factor in choosing the appropriate dose and regimen is the desired result.
  • the factors considered in this context include the particular disease being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of administration of the antibody, the specific type of antibody, the route of administration, the mode of administration, and other factors known to medical practitioners. .
  • the therapeutic agents of the invention may be frozen or lyophilized and reconstituted before use in a suitable sterile vehicle. Lyophilization and repair can result in varying degrees of loss of antibody activity. Dosages can be adjusted to compensate for this loss. In general, Preferred are the pH values of the pharmaceutical composition from 6 to 8.
  • the next embodiment of the invention is a product that contains products used to treat autoimmune diseases and related conditions and malignant blood diseases, in the pathogenesis of which TCRs are involved that carry the beta chain of the TRBV9 family.
  • diseases include, for example, AU, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma, and others.
  • the product is a container with a label and leaflet, which can be placed in a blister and / or package.
  • Suitable containers are, for example, vials, ampoules, syringes, etc.
  • Containers can be made of various materials, such as glass or polymeric materials.
  • the container contains a composition that is effective for treating a particular condition, and may have a sterile inlet channel. At least one active ingredient in the composition is an antibody according to the invention.
  • the label and leaflet in the package indicates that the drug is used to treat a particular condition.
  • the label and / or package leaflet in the package should additionally contain instructions for administering the antibody composition to the patient, including information about the indications, use, dose, route of administration, contraindications and / or precautions regarding the use of such therapeutic products.
  • the composition is used for the treatment to indicate what.
  • the product may include other products necessary from a commercial and consumer point of view, for example, solvents, thinners, filters, needles and syringes, but not limited to them.
  • kits that can be used for various purposes, for example, to assess the ability to destroy T-cells that carry the TCR of the TRBV9 family, for cleaning or immunoprecipitating the TRBV9 receptor from cells.
  • the kit may contain an antibody bound to granules (for example, sepharose granules).
  • the kit contains a container and a label and leaflet package.
  • Antibodies of the present invention are also used for diagnostic purposes (eg, in vitro, ex vivo).
  • an antibody can be used to detect or measure the level of T-lymphocytes containing TCRs of the TRBV9 family in samples obtained from a patient, such as a tissue sample or body fluid sample, such as inflammatory exudate, blood, intestinal fluid, saliva, or urine.
  • Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescence analysis, radioimmunoassay and immunohistology.
  • the invention further includes kits, for example, diagnostic kits containing the antibodies described herein.
  • Nucleic acids (SEQ ID No 10, 12, 14, 16, 18) encoding the variable domains of the antibody heavy and light chains were obtained by amplifying DNA fragments using overlapping primers and high-precision Q5 polymerase (NEB, USA). The obtained nucleic acids were purified on Quagen columns (Germany) using a reagent kit (# 28104) and sent to commercially available pFuse vectors containing the constant regions of the human heavy (IgGl) and light (kappa) human chains (Invivogen, USA). The sequences of the cloned fragments were confirmed by sequencing using the Sanger method.
  • HV aHTH-TRBV9-l the nucleotide and amino acid sequences of which are shown in SEQ ID No: 20 and 21;
  • HV aHTH-TRBV9-2 the nucleotide and amino acid sequences of which are shown in SEQ ID No: 22 and 23;
  • HV aHTH-TRBV9-3 the nucleotide and amino acid sequences of which are shown in SEQ ID No: 24 and 25
  • HV aHTH-TRBV9-3 the nucleotide and amino acid sequences of which are shown in SEQ ID No: 26 and 27;
  • the degree of humanization of the antibody heavy chain is 72%, and that of the light chain is 69%.
  • Plasmids containing the heavy and light chains of immunoglobulins were dissolved in water tested for endotoxins (Quagen, USA)
  • the resulting reaction mixtures were incubated at 37 ° C on a rocking chair for a week.
  • the cell supernatant was harvested, which was used to isolate antibodies.
  • the supernatant was centrifuged three times at 10,000 rpm for 10 minutes, and the liquid fraction was purified using a 1 ml HiTrap PrG column (Thermo Fisher scientific, USA).
  • 0.1 M glycine buffer, pH 2.5 was used, brought in HCl.
  • the quality of excretion was assessed using 12% PAAT-electrophoresis under denaturing conditions. Quantitative evaluation was performed using a measurement on a NanoDrop2000 microspectrophotometer at 280 A. The resulting product was stored at + 4 ° C.
  • the affinity of anti-TRB V9 antibodies was determined on an OctetRed 96 device (from ForteBio). Second-generation amino-reactive sensors (from AR2G) nonspecifically immobilized antigens (Table 1) according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions for the preparation and immobilization of AR2G sensors. Analysis was performed at 30 ° C using phosphate-saline buffer (PBS) containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as a working buffer. Analysis of the binding affinity of anti-TRBV9 antibodies was performed using a working buffer from a concentration of 126 nM to 2 nM in increments of 2. The binding curves with the deduction of the reference signal were analyzed using the Octet Data Analysis software (version 7.0) according to the standard procedure using the 1: 1 interaction model. The results are summarized in Table 2.
  • TRBV7 + TRAV38 antigens When using TRBV7 + TRAV38 antigens, no interaction with antibodies was observed. The best characteristics showed antibodies TRBV9-2 and TRBV9-4.
  • Example 2 The use of monoclonal antibodies anmu-TRBV9 for labeling T-lymphocytes expressing the beta-chain of TCR, belonging to the family of TRBV9.
  • Monoclonal antibodies (aimi-TRBV9-l, airra-TRBV9-2, anti-T1TVU-3, aHTH-TRBV9-4, characterized by the heavy chain CDR3 sequence) were prepared as described in Example 1. To visualize the antibodies, they were labeled with fluorescein reagent fluorescein isothiocyanate (Sigma, USA) according to the manufacturer's protocol. The amount of fluorophores reacted with the antibody molecules was monitored by the ratio of the absorption spectrum at wavelengths of 495/280 nm. Labeled antibodies were used to identify T-lymphocytes expressing the TCR beta-chain of the TRBV9 family in the mononuclear fraction of human blood.
  • peripheral blood from 5 healthy donors was used. Blood was collected in Vacuette tubes with EDTA (2x9 ml each), mononuclear fraction according to the standard procedure described in (Kovalchuk L.V. et al. Immunology: practical work — 2010. - 176 p.). After isolation, the cells were transferred to phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 2 mM EDTA. The total number of cells and their viability were determined by the trypan blue staining method as described by Lang N.P. (Stimulation of lymphocyte M.: Medicine, 1976.-288 c).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • T-lymphocytes To label T-lymphocytes in each test, an aliquot of a mononuclear fraction containing 500 thousand cells each (per test) was added in PBS buffer with the addition of 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 2 Mm EDTA antibodies T1TVU9-2, anti-T1TVU9-3, anti-T1TVU9-4 to a final concentration of 5 ng / ⁇ l and 0.5 ng / ⁇ l, as well as monoclonal antibody against CD3-eFluor405 ((clone OKTZ, eBioscience);) at a concentration recommended by the manufacturer.
  • BSA bovine serum albumin
  • anti-TRBV9-2 anti-T1TVU9-3, anti-TRB V9-4
  • anti-TRBV9-2 showed staining of different proportions of TRBV9 + lymphocytes at the same concentrations.
  • specificity of the work of anti-T1TVU9-2 was determined by the absence of slightly stained nonspecific CD3 negative cells, which is present when using other options, and a significant separation of a specific cell population from other CD3 positive lymphocytes negative for TRBV9 receptor.
  • anti-T1TVU9-2 shows the most effective and highly specific staining of T lymphocytes TRBV9 +.
  • This antibody can be used for diagnostic purposes for the detection of TRBV9 + T lymphocytes at a concentration of 0.6 ng / ⁇ l.
  • the reaction mixtures were incubated at room temperature for 30 min, the cells were washed with PBS buffer with 0.5% BSA and sorted on a cell sorter (FACSARIA III, USA), isolating the population of CD3 + TRBV9 + cells, as well as CD3 + TRBV9-.
  • a cell sorter FACSARIA III, USA
  • the isolated RNA was synthesized to DNA and the T receptor beta chain fragments were amplified according to the protocol described by Britanova et al (J Immunol, 2016, 196 (12) 5005-5013) using the Mint cDNA synthesis kit (Evrogen, Russia).
  • the Illumina adapters (USA) were ligated to the accumulated amplicons and sequenced on the MiSeq Illumina platform according to the protocol of the manufacturer of the sequencer.
  • Monoclonal antibodies (anti-T1TVU9-1, anti-T1TVU9-2, anti-TMZU9-3, anti-TRB V9-4, characterized by the heavy chain CDR3 sequence) were obtained as described in Example 1.
  • the mononuclear fraction of human blood was obtained as described in Example 2.
  • NK cells were isolated using a set of reagents for isolating human NK cells # 130-092-657 (Miltenyi biotec, USA). Used the manufacturers protocol. The quality of the release of NK cells was assessed using cytofluometry (BD FACS ARIA III, USA) using labeled CD16-FITC, CD56-PE, CD3-VioBlue antibodies. The enrichment of NK cells was 85-95%.
  • antibodies (aHTH-TRBV9-1, aHTH-TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3, or aHTH-TRBV9-4) were added to a final concentration of 5 ⁇ g / ml.
  • Remikade antibodies were used in the same concentration as aHTH-TRBV9. No antibodies were added to the control aliquot of the cells (positive control).
  • 105 NK cells were added to all reaction mixtures. The final reaction volume was 100 ⁇ l.
  • reaction mixtures were incubated at room temperature for one hour, then the cells were washed several times from the antibodies and spread through the wells of a 96-well round-the-bottom plate, on a table.
  • T lymphocytes After 6 days, cells were harvested from the wells and used for immunophenotypic analysis using flow cytometry. The following antibodies were used for the detection of T lymphocytes: anti-CD3-eFluor450 (clone OKTZ, eBioscience); anti-CD8-PC7 (clone SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, USA); our antibodies aHTH-TRBV9-l, 2,3,4, labeled Fite. After staining, the cells were washed and analyzed on a BD FACSARIA III instrument. CD3 + TRBV9 + T lymphocytes are not detectable in samples incubated with the aHTH-TRBV9 antibodies of the present invention.
  • a stable cell line producing monoclonal antibodies anti-TRBV9-2 was obtained by transfecting the suspension cell line CHO-S with vector constructs containing the light and heavy chains of the antibody in an optimized ratio.
  • High level clonal lines (> 100 mg / l) were obtained using the ClonePix robotic platform (Molecular Devices).
  • the analysis of the productivity of the selected clones was carried out on the basis of the automated system Biomek FX robotics (Beckman Coulter) and the analytical system Octet RED96 (Pall Life Sciences). For the cultivation of the producer used serum-free medium, not containing animal protein.
  • Preparation of the BCD085 preparation for preclinical studies was carried out in a HyClone single-use bioreactor (Thermoscientific) fermenter with a working volume of 200 liters.
  • Example 5 Obtaining a pharmaceutical composition containing the antibody according to the invention
  • the components of the pharmaceutical composition are shown in Table 3. Table 3. The concentration of the components of the pharmaceutical composition
  • Example 6 A kit containing a pharmaceutical composition with antibodies
  • the pharmaceutical composition prepared according to Example 5 is sealed in ampoules or 1 ml syringes under sterile conditions, labeled and packaged in containers of plastic or cardboard material.
  • mutant HV anti-T1TVU9-1 sequences site-directed mutagenesis was performed using "overlap extention" of PCR products as described by Wurch et al., Methods in Molecular Biology. 12 (9), 653-657 (2004).
  • high-precision polymerase Q5 NEB, USA
  • the obtained fragments were purified using electrophoresis in 1% agarose gel and further extraction.
  • DNA fragments isolated from the gel containing mutations were combined into the whole structure by the method of “overlap extention” PCR (denaturation of 95 ° C — 12 sec; annealing at 55 ° C — 2 min; elongation 72 ° C — 1 min, 8 cycles of PCR).
  • This method implies that as a matrix and seeds used in the reaction mixture fragments with complementary parts of each other.
  • Amplification of the whole structure was performed by standard PCR with the addition of primers complementary to the ends of the amplified fragment.
  • the obtained nucleic acids were purified on Quagen columns (Germany) using the reagent kit (# 28104) and cloned into the pFuse vector as described in Example 1.
  • the mutant DNA sequences were checked by sequencing according to the Sanger method.
  • variant 1 - in SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 The nucleotide and amino acid sequences of the resulting variable domains are shown: variant 1 - in SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31; option 2 in SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33.
  • mutant antibodies to bind to T-lymphocytes expressing the TCR beta-chain belonging to the TRBV9 family was tested as described in Example 2. It was shown that the substitutions made affect the binding specificity.
  • Gly Trp lie Asn Thr Thr Thr Sly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
  • Leu gin lie ser asn leu lys asn glu asp thr ala thr tyr phe cys
  • 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с семейством TRBV9 Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с семейством Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение направлено на создание антител, которые могут быть использованы для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9, в частности, для терапии АС, целиакии и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР семейства TRBV9.

Description

Моноклональные антитела и способы их применения
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и биомедицины, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с семейством Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с семейством Т-клеточных рецепторов человека.
Предшествующий уровень техники
В терапии аутоиммунных заболеваний человека в последнее время широкое распространение находит применение препаратов на основе антител против основных медиаторов воспалительного процесса, таких как TNF alpha, IL1 , IL6, IL17, IL23 (van der Heijde D et al, Ann Rheum Dis. 2011 Jun;70(6):905- 8, Baeten D, et al, N Engl J Med. 2015 Dec 24;373(26):2534-48). На стадии клинических исследований для лечения аутоиммунных заболеваний находятся обладающие иммуномодулирующими свойствами моноклональные антитела к рецепторным комплексам CD3 и CD4, (Kuhn С. and Weiner L., Immunotherapy 2016 Jul;8(8):889-906; Helling B. et al., Immunology and Cell Biology 2015 Apr;93(4):396-405; Konig M. et al., Front Immunol 2016 Jan 25;7: 11). Однако, показано, что применение таких препаратов хотя и приводит к снижению воспаления, но не останавливает развитие заболевания и не влияет непосредственно на причину заболевания - аутореактивные Т лимфоциты (Haroon N et al., Arthritis Rheum. 2013 Oct;65(10):2645-54., Duarte J. et al., PloS One 2010 May 10;5(5):el0558; Konig M. et al., Front Immunol 2016 Jan 25;7 : 11).
Несмотря на успехи в симптоматической терапии анкилозирующего спондилита (АС, болезнь Бехтерева) с использованием моноклональных антител, до сих пор не получено эффективного препарата, позволяющего избирательно и долговременно подавить аутоиммунный ответ и остановить прогрессию АС. Таким образом, актуальной задачей является создание антител, позволяющих удалить из организма больных АС аутореактивные клоны Т-лимфоцитов, с появлением которых связано развитие заболевания.
Известно, что важнейшую роль в появлении аутореактивных клонов Т- лимфоцитов играет взаимодействие антигенраспознающего Т-клеточного рецептора (ТКР) с белками главного комплекса гистосовместимости (МНС, HLA), которые представляют на своей поверхности процессированные пептиды внутриклеточных белков или белков патогенных организмов. Ряд аутоиммунных заболеваний ассоциирован с наличием у человека определенного варианта гена HLA. Так, аллель HLA-B27 ассоциирован с АС, реактивным артритом и болезнью Крона. Риск развития аутоиммунных заболеваний у носителей определенных аллельных вариантом HLA может объясняться предпочтительной презентацией этими аллелями определенных пептидов, являющихся аутоантигенами, иммунный ответ против которых инициирует развитие аутоиммунного заболевания. Одним из возможных механизмов возникновения аутоиммунной реакции является презентация молекулами комплекса гистосовместимости пептидов из белков бактериального или вирусного происхождения, гомологичных собственным пептидам организма, что может приводить к возникновению иммунного ответа против собственных антигенов за счет кросс-реактивности.
Из уровня техники известно, что маркером, позволяющим идентифицировать клон Т-лимфоцитов, вовлеченный в патогенез аутоиммунного заболевания, является последовательность Т клеточного рецептора (ТКР). Субъединицы Т-клеточных рецепторов структурно относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и формируются из нескольких генных сегментов. Вариабельные участки ТКР образуют антигенсвязывающий центр ТКР. Это означает, что они клоноспецифичны, т.е. отличаются у Т-лимфоцитов, реагирующих на разные антигены.
По аминокислотной гомологии вариабельных (V) генных сегментов, входящих в состав вариабельного домена ТКР, Т-клеточные рецепторы подразделяют на различные семейства. Согласно номенклатуре IMGT для бета цепи выделяют 26 различных семейств, а для альфа цепи - 41 семейство (Turner SJ et al., Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883-894). Для определения семейства цепи ТКР используют множественное выравнивание тестируемой аминокислотной последовательности с известными последовательностями цепей ТКР, информация о которых суммирована в базе данных IMGT («The international ImMunoGeneTics information system», Lefranc М-Р., Nucl Acids Res 2001 ; 29:207-209), доступной в сети Интернет по адресу
Figure imgf000004_0001
выравнивание и определение семейства цепи ТКР может быть осуществлено с помощью пакета программ IgBlast.
Описан консенсусный вариант аутоиммунных ТКР при АС, показано, что он представлен у больных АС в синовиальной жидкости и периферической крови и отсутствует при той же глубине анализа у здоровых доноров независимо от статуса по аллелю HLA*B27 (Faham М. et al, Arthritis Rheumatol. 2017;69(4):774-784; Komech E et al. 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference; 2016 Sep 3-7; Strbske Pleso, Slovakia. Abstract book p. 39). Указанные ТКР относятся к TRBV9 семейству (согласно номенклатуре IMGT).
Показано, что Т клеточные рецепторы, несущие бета цепи семейства TRBV9, вовлечены также в развитие такого аутоиммунного заболевания как целикиа (Petersen J et al., J Immunol. 2015; 194(12): 6112-22). Также они обнаруживаются на поверхности Т клеток, подверженных маглинизации в з случае Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий, в том числе Т клеточной лимфомы, вызванной вирусом Эпштейн-Барр (EBV) (Toyabe S et al., Clin Exp Immunol. 2003; 134(1): 92-97).
Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются моноклональные антитела W112 и 2D1 к участкам бета цепи вариабельных доменов Т-рецептора человека, относящихся к семействам TRBV5-3 TRBV8- 1, которые были описаны в патентной заявке (W09006758) в качестве инструмента для диагностики и терапии ревматоидного артрита. Данные моноклональные антитела узнают соответственно 0.3-5% периферических Т лимфоцитов, несущих TRBV5-3 и 0.5-13% периферических Т лимфоцитов, несущих TRBV8-1. Основанием для использования моноклональных антител специфичных к участкам бета цепей Т-рецепторов послужили результаты многих исследований, демонстрирующие вовлеченность Т лимфоцитов в патогенез ревматоидного артрита. В частности, данные статьи F.M. Brennan et al., Clin Exp Immunol. 1988 Sep; 73(3): 417-423, где было продемонстрировано увеличение процентного содержания Т лимфоцитов, несущих TRBV5 TRBV8 в синовиальных образцах пациентов, страдающих ревматоидным артритом по сравнению со здоровыми донорами.
Так же для диагностики и терапии ревматоидного артрита описаны моноклональные антитела, взаимодействующие с эпитопом вариабельной области VB3.1 Т-клеточного рецептора человека (W09405801), которые взаимодействуют с подсемейством ТКР У(бета)3.1.
Основным недостатком описанных в патентах W09405801 и W09006758 подходов лечения ревматоидного артрита является отсутствие убедительных доказательств связи между патогенезом и конкретным семейством вариабельного сегмента бета цепи.
Так же описаны моноклональные антитела, специфично узнающие бета цепь 13-го семейства ТРК крысы. На модельных животных показано, что с помощью этих антител возможно превентивное удаление небольшой популяции T клеток, Т-рецептор которых содержит бета цепь VB13 (VB13+ Т клетки), и показано, что такая процедура защищает от развития диабета I типа у крыс предрасположенной к этому заболеванию линии, а также значительно снижает риск развития вирус-индуцированного диабета (Zhijun Liu et al, Diabetes. 2012 May; 61(5): 1160-1168.). В то же время, деплеция Т клеток, Т- рецептор которых содержит другое семейство бета цепи (VB16), не отличается по результату от контрольных групп. Важно отметить, что уже первое введение моноклонального антитела против VB13 приводит к 60% снижению количества VB13+ Т клеток в селезенке крыс.
Все описанные аналоги не связываются с ТКР, которые относятся к TRBV9 семейству, и не пригодны для терапии АС и других заболеваний, ассоциированных с ТКР, которые относятся к TRBV9 семейству.
Моноклональных антител, пригодных для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9, которые могут быть использованы при терапии АС и целиакии не описано.
Краткое описание изобретения
Изобретение направлено на создание антител, которые могут быть использованы для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9, в частности, для терапии АС, целиакии и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР семейства TRBV9.
Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам и их антиген-связывающим фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т рецептора человека. Антитела согласно изобретению могут использоваться в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, АС, целиакии и некоторых Т- клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий.
Антитела и антиген-связывающие фрагменты настоящего изобретения характеризуются тем, что
1) вариабельный домен их тяжелой цепи (VH) содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1 , HCDR2 и HCDR3, где
HCDR 1 (согласно номенклатуре Rabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность ательностью SEQ ID NO: 2
HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6;
2) вариабельный домен их легкой цепи (VE) содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,
LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8,
LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
Здесь и далее при определнии CDR антител используется известная номенклатура Rabat, если отдельно не оговорено иное.
Антитела согласно изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами. В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения содержат свойственные человеку константные области и структурные компоненты, но имеют вариабельный домен, свойственный крысе.
В некоторых воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No: 11 , а вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 19. Так же обеспечивается антитело, аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи которого по существу сходна (например, идентична, по крайней мере, на 90%) с последовательностью, показанной в SEQ ID No: 11.
Так же обеспечивается антитело, аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи которого по существу сходна (например, идентична, по крайней мере, на 90%) с последовательностью, выбранной из группы SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 19.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает легкую цепь, аминокислотная последовательность которой по существу сходна с SEQ ID NO: 29, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой по существу сходна с последовательностью, выбранной из группы SEQ ID No: 21 , SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 27.
В некоторых воплощениях моноклональные тела по изобретению являются полноразмерными антителами IgG человека, например, IgGl или IgG2 или IgG3 или IgG4.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела согласно изобретению, нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител согласно изобретению и функциональные фрагменты антител.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Вектор или кассета экспрессии могут находиться в клетке- хозяине как внехромосомный элемент или интегрироваться в геном клетки в результате введения (путем трансфекции) указанной кассеты экспрессии или вектора в клетку. Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения, и способы их получения.
Также обеспечивается способ получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, заключающийся в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела. В некоторых воплощениях способ включает последующее выделение и очистку полученного антитела.
Также обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета цепи семейства TRBV9 Т рецептора человека, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
В одном из вариантов фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, выбранного из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т- клеточная лимфома.
Также обеспечивается фармацевтическая комбинация для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и, по меньшей мере, одно другое терапевтически активное соединение.
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, выбранного из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т- клеточная лимфома.
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация включает другое терапевтически активное соединение, которое выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов, например, кортикостероидов. Также обеспечивается способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Также обеспечивается способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции, в терапевтически эффективном количестве.
В одном из вариантов способа лечения заболевания или нарушения, заболевание или нарушение выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Также обеспечивается применение вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9.
В одном из вариантов применения, заболевание выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Технический результат настоящего изобретения состоит в получении новых антител, которые специфически связываются с ТКР, бета цепь которых относится к TRBV9 семейству и могут быть использованы для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, бета цепь которых относится к TRBV9 семейству. Также технический результат состоит в повышении эффективности терапии АС и/или целиакии, которое обеспечивается получением антител, способных воздействовать непосредственно на аутоиммунные Т-лимфоциты, и в возможности достигать продолжительной ремиссии при АС.
Краткое описание фигур
Фигуры 1-4 показывают двухпараметрические гистограммы распределения клеток мононуклеарной фракции крови с использованием моноклонального антитела против CD3 (ось ординат), меченных eFluor 405, и моноклональных антител против TRBV9 (ось абсцисс), меченых FITC: анти- TRBV9-1 (Фиг.1), aHTH-TRBV9-2 (Фиг.2), aHTH-TRBV9-3 (Фиг.З), анти- TRBV9-4 (Фиг.4). Каждый вариант моноклонального антитела против TRBV9 был использован в двух концентрациях 270 нг (верхний график) или 27 нг (нижний график) на тест. Специфическая популяция CD3+TRBV9+ обозначена маленьким прямоугольником.
Фигура 5 показывает двухпараметрические гистограммы распределения клеток мононуклеарной фракции крови с использованием моноклонального антитела против CD3 (ось ординат), меченных eFluor 405, и моноклональных антител против TRBV9 (ось абсцисс), меченых FITC, после цитотоксического теста: инкубация с aHTH-TRBV9-2 (опыт) и ремикейд (контроль).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т рецептора человека. Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их фрагменты по изобретению, кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. Также обеспечиваются способ получения моноклонального антитела или его функционального фрагмента, фармацевтическая композиция и фармацевтическая комбинация, содержащая в эффективном количестве антитело настоящего изобретения, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями и способы диагностики и терапии АС и иных заболеваний с использованием антител настоящего изобретения.
Определения
С целью более легкого понимания изобретения сначала определяются некоторые термины.
Следует понимать, что материалы и способы, предлагаемые в данном документе, не ограничиваются конкретными композициями или этапами способа, поскольку они могут варьироваться. Указано, что, как используется в данном описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают и соответствующие формы во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное.
«Т-клеточный рецептор», так же указанный как «ТРК», «Т-рецептор» или «TCR» человека представляет собой гетеродимерный белковый комплекс, расположенный на поверхности Т лимфоцита. Этот рецептор присутствует только на Т лимфоцитах. Основная функция ТКР заключается в специфическом распознавание процессированных антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (HLA).
ТКР человека состоит из двух субъединиц, а и b, либо g и d цепей, связанных между собой дисульфидной связью и закрепленных в клеточной мембране. Каждая из цепей ТКР имеет N-концевой вариабельный (V) домен, соединительный домен и константный (С) домен, соединенный с трансмембранным доменом, закрепляющим рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита. Протяженность константного домена альфа и бета цепей составляет 91 и 129 аминокислотных остатков, соответственно. Длина соединительного и трансмембранного домена альфа цепи - 30 и 17 аминокислотных остатков (а.о.), а у бета цепи - 21 и 22 а.о. Протяженность вариабельных доменов Т-рецепторов варьирует от 104 до 125 а.о.
Небольшая фракция Т-лимфоцитов располагает рецепторами типа g/d. По своему устройству они аналогичны a/b рецепторам, но отличаются по первичной структуре и имеют ряд функциональных особенностей. Их вариабельность гораздо ниже (ограниченная клоноспецифичность), они распознают антигены в комплексе с «неклассическими» (не МНС) антигенпредставляющими молекулами или даже свободные антигены.
Т-рецептор взаимодействует с комплексом МНС-антиген шестью участками, определяющими его комплементарность (CDR): три участка альфа цепи и три бета цепи. Эти CDR представляют собой гипервариабельные участки, петли вариабельных доменов Т-клеточного рецептора - Уальфа и Убета.
Термины «TRBV9» или «семейство TRBV9» относятся к девятому семейству бета-цепей Т-клеточных рецепторов, выделяемому согласно номенклатуре IMGT, которое характеризуется тем, что аминокислотная последовательность их вариабельного домена включает уникальные мотивы CDR1 (последовательность аминокислот - S-G-D-L-S) и CDR2 (последовательность аминокислот - Y-Y-N-G-E-E). Термин «ТКР семейства TRBV9» обозначает Т-клеточный рецептор, бета-цепь которого относится к TRBV9 семейству.
Термин «патологический» по отношению к Т-лимфоцитам или ТКР означает, что данное ТКР или Т-лимфоцит, его несущий, ассоциированы с заболеванием или патологией и/или являются причиной заболевания и/или способствуют развитию заболевания. Термин «аутоиммунный» по отношению к ТКР означает, что данное ТКР вовлечено в развитие аутоиммунного заболевания.
Термин «антитело», используемый здесь, предназначен для определения молекулы иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgGl , IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком.
Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенный здесь как HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена CHI, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенный здесь как LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен CL. Участки VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), окруженные участками, которые являются более консервативными, называемыми скелетными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR участков, расположенных от амино- до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
В данной заявке 3 CDR тяжелые цепи обозначены как "CDRH1, CDRH2 и CDRH3", а 3 CDR легкой цепи обозначены как "CDRF1, CDRF2 и CDRF3". CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Нумерацию и позиционирование CDR- аминокислотных остатков в пределах HCVR и FCVR участков антител согласно данному изобретению осуществляют с хорошо известной номенклатурой Kabat, если не указано иного. В настоящей заявке используется, если не указано иного, общепринятые буквенные обозначения аминокислот.
Термины « анти- TRBV9- антитело», «антитело к TRBV9», «антитело, специфически связывающееся с бета цепью семейства TRB V9» или «антитело против бета цепи семейства TRBV9» и им подобные являются взаимозаменяемыми в контексте настоящей заявки и относятся к антителу, которое специфически связывается с эпитопом бета цепи семейства TRBV9 Т- клеточного рецептора человека.
Термины «антитело» и «моноклональное антитело» для нужд настоящей заявки относятся к моноклональному антителу против ТКР семейства TRBV9. Как используется в настоящей заявке «моноклональное антитело» относится к антителу грызуна, семейства приматов или Camelidae, предпочтительно к антителу мыши, макаки, верблюда или ламы, химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иное.
Вариабельные участки каждой из пар легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Как используется в данной заявке, "антигенсвязывающая часть", или "антигенсвязывающий участок", или "антигенсвязывающий домен" или «антигенсвязывающий центр» относятся, взаимозаменяемо, к такой части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность по отношению к антигену. Эта часть антитела включает "каркасные" аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков.
Термин "человеческое антитело", используемый здесь, означает антитело, в котором последовательности вариабельных и константных доменов происходят от человеческих последовательностей. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут включать остатки аминокислот, нехарактерные для человека (например, мутации, интродуцированные ненаправленным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и особенно в CDR3.
Термин «гуманизированные» по отношению к антителам используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей и структурных компонентов, но имеют обусловливающие комплементарность участки (CDR), которые свойственны иммуноглобулинам иного происхождения или соответствующим фрагментам модифицированных антител.
Термин «химерные» по отношению к антителам настоящего изобретения используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей, но имеют вариабельные домены иного происхождения. В таких антителах вариабельные домены легких и/или тяжелых цепей, имеющие нечеловеческое происхождение (например, взятые из крысы), оказываются оперативно связаны с константными доменами соответствующих цепей человеческого происхождения .
Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании антител относиться к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической (ковалентной, если не указано иного) и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Термин "оперативно связанный" или ему подобный при описании нуклеиновых кислот означает, что нуклеиновые кислоты ковалентно связаны таким образом, что в местах их соединения отсутствуют «сбойки» рамки считывания и стоп-кодоны. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий "оперативно связанные" компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок, например, химерное антитело согласно изобретению.
Как здесь используется, термины «изолированный» и «выделенный» означают молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.
В преимущественных воплощениях антитела настоящего изобретения являются рекомбинантными, то есть полученными с помощью техники рекомбинантных ДНК. Термин «рекомбинантное антитело», используемый здесь, включает все антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в клетку-хозяин, антитела, выделенные из набора известных рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295). В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям lg человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, поскольку они выделены из последовательностей зародышевых VH и VL человека и близки к ним, не могут в естественных условиях существовать в зародышевом наборе антител человека in vivo. Термин «специфически связывает», как используется в данной заявке, относится к той ситуации, при которой один участник пары специфического связывания не связывает в значительной степени молекулы, отличные от его партнера (партнеров) по специфическому связыванию. Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который переносится рядом антигенов, в таком случае специфическое антитело, имеющее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, несущих эпитоп. Соответственно, моноклональное антитело по изобретению специфически связывает эпитоп бета цепи Т клеточного рецептора человека, относящегося к семейству TRBV9, в то время как оно специфически не связывает бета-цепи ТКР других семейств и альфа цепи ТКР.
Термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая способна распознаваться и связываться с антителом в одном или более антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими зарядовыми характеристиками.
Термин «эпитоп», как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например, мыши, крысы или человека. Термин «антигенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным из уровня техники, например, при помощи традиционного иммунного анализа. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут также быть имуногенными. «Иммуногенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, который вызывает отклик антитела у животного, как устанавливается любым способом, известным из уровня техники. «Нелинейный эпитоп» или "конформационный эпитоп" содержат несмежные полипептиды (или аминокислоты) в пределах антигенного протеина, с которым антитело, специфическое к эпитопу, связывается.
Выражения «биологическое свойство» или «биологическая характеристика» или термины «активность» или «биоактивность по отношению к антителу и его функциональным фрагментам по изобретению используются в данной заявке как взаимозаменяемые и включают, но не ограничиваются приведенными, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность ингибировать или быть антагонистом активности ТКР, в состав которого входит бета цепь, принадлежащая к семейству TRBV9.
Остальные идентифицируемые из уровня техники биологические свойства или характеристики антитела включают, например, перекрестную реактивность (т.е. с нечеловеческими гомологами пептида- мишени или с остальными протеинами или мишенями, в общем), и способность сохранять высокие уровни экспрессии протеина в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться, измеряться или оцениваться с использованием методик, признанных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь, приведенными, анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, BIACORE или анализ поверхностного плазмонного резонанса KINEXA, анализы ингибирования in vitro или in vivo без ограничений, рецепторного связывания, продуцирования и/или секреции цитокина или фактора роста, сигнальную трансдукцию и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник. Термины «ингибировать» или «нейтрализовать», как используется в данной заявке, по отношению к активности антитела по изобретению, означают способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, уничтожать, прекращать, уменьшать, например, развитие или тяжесть того, что ингибируют, включая, но, не ограничиваясь вышеприведенными, биологическую активность антитела или свойство, заболевание или состояние.
Как здесь используется, термин «мутант» или «вариант» относятся к антителу, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей антител настоящего изобретения или их фрагментов. Как здесь используется, термин «мутант» также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант» относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Термин "гомология" используется для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями .
Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности «по существу сходны» или «по существу такие же» как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют, по крайней мере, 70% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 75% идентичности, например, по крайней мере, 80% идентичности, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности (например, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности). Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны.
Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как IgBLAST, описанный в Ye et al. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40. Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ IgBLAST, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Для вычисления процента идентичности используется полная длина рефенсной последовательности, например, вариабельного региона.
Ссылка на нуклеотидную последовательность "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин так же включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидная последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие нитроны. Антитела
Как указано выше, настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т рецептора человека.
Антитела согласно изобретению характеризуются тем, что
а) вариабельный домен их тяжелой цепи (VH) содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
Антитела настоящего изобретения характеризуются тем, что
а) вариабельный домен их тяжелой цепи (VH) содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
HCDR1 имеет (согласно номенклатуре Kabat) аминокислотную последовательность DYLVH (SEQ IN No 1);
HCDR2 имеет аминокислотную последовательность
WINT YT GTPT YADDFEG (SEQ IN No 2);
HCDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SWRRGLRGLGFDY (SEQ ID No 3), SWRRGLRGIGFDY (SEQ ID No 4), SWRRGIRGFGFDY (SEQ ID No 5), SWRRGIRGIGFDY (SEQ ID No 6); б) вариабельный домен их легкой цепи (VF) содержит 3 гипервариабельных участка FCDR1, FCDR2 и FCDR3, в которых:
FCDR1 имеет аминокислотную последовательность KASKSINKYFA (SEQ ID No 7);
FCDR2 имеет аминокислотную последовательность DGSTFQS (SEQ ID No 8);
FCDR3 имеет аминокислотную последовательность QQHNEYPPT (SEQ ID No 9).
Антитела согласно изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами, или их антигенсвязывающими фрагментами и могут использоваться в качестве лекарственного средства для лечения болезни Бехтерева и других заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, целиакии или Т -клеточной лимфомы.
Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных методик, хорошо известных из уровня техники, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных из уровня техники. Термин «моноклональное антитело», используемый в данной заявке, относится к антителу, полученному из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу его получения.
Гуманизированные и химерные антитела могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК как описано ниже в разделе «Нуклеиновые кислоты».
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения являются химерными и характеризуются тем, что имеют вариабельные домены легкой и тяжелой цепей нечеловеческого происхождения (например, крысиного или мышиного), а константные домены, характерные для человека. В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения характеризуются тем, что имеют аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из группы SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19 и аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, показанную в SEQ ID No 11. При этом в предпочтительных воплощениях антитело содержит константный участок тяжелой цепи, такой как константный участок IgGl, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD человека. Предпочтительно константным участком тяжелой цепи является константный участок тяжелой цепи IgGl человека. Более того, антитело может содержать как константный участок легкой цепи либо каппа-константный участок легкой цепи, либо лямбда-константный участок легкой цепи. Предпочтительно антитело содержит каппа-константный участок легкой цепи.
Примеры аминокислотных последовательностей тяжелых цепей антител aHTH-TRBV9-l, aHTH-TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3 или affra-TRBV9-4 согласно изобретению показаны в SEQ ID No 21, 23, 25 и 27, соответственно. Пример аминокислотной последовательности легкой цепи антител показан в SEQ ID No: 29.
В некоторых воплощениях аминокислотные последовательности каркасных участков вариабельных доменов антитела или их части являются главным образом человеческими по происхождению и, следовательно, «гуманизированными антителами». Эта «гуманизация» считается полезной в снижении иммуногенности указанного антитела при терапевтическом назначении пациентам. Определенные выбранные аминокислотные остатки в каркасных участках остаются крысиными, а не человеческими.
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения и их антегенсвязывающие фрагменты включают вариабельные домены легких цепей, аминокислотные последовательности которых по существу сходны с аминокислотной последовательностью SEQ ID No 11 , например, идентичны с ней по крайней мере, на 90%, чаще по крайней мере на 93%, как правило на 94% или выше (предпочтительно на 95% или выше, на 96% или выше; на 97% или выше, на 98% или выше, на 99% или выше или на 99,5% или выше).
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения и их антегенсвязывающие фрагменты включают вариабельные домены тяжелых цепей, аминокислотные последовательности вариабельных доменов которых по существу сходны с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19. Например, имеют аминокислотную последовательность идентичную последовательности, выбранной из группы SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19, по крайней мере, на 90%, чаще по крайней мере на 93%, как правило на 94% или выше (предпочтительно на 95% или выше, на 96% или выше; на 97% или выше, на 98% или выше, на 99% или выше или на 99,5% или выше).
В некоторых воплощениях антитело настоящего изобретения включает тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную (например на 93% идентичную или выше, на 94% или выше, на 95% или выше, на 96% или выше; на 97% или выше, на 98% или выше, на 99% или выше или на 99,5% или выше) последовательности, выбранной из группы SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 27 и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную (например на 93% идентичную или выше, на 94% или выше, на 95% или выше, на 96% или выше; на 97% или выше, на 98% или выше, на 99% или выше или на 99,5% или выше) последовательности SEQ ID NO: 29.
Из уровня техники известно, что в последовательности антител, включая вариабельные домены, могут быть внесены мутации, которые не затрагивают по существу способность антитела связываться с антигеном. Антитела согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные мутации, которые не приводят к потере способности антитела связывать бета цепь ТКР семейства TRBV9, но могут приводить к снижению антитело- зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или увеличению аффинности или других биологических свойств антител. В частности, из уровня техники хорошо известно, что в последовательности антител могут быть внесены консервативные замены аминокислот. Под "консервативной заменой" в контексте заявки подразумевается замена, при которой остаток аминокислоты замещается другим остатком аминокислоты, имеющим близкую боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих близкие боковые цепи, определены в уровне техники, в том числе основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), b- разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предпочтительно в участки CDR3 в доменах VL и/или VH делают не более пяти консервативных замен аминокислот, чаще не более трех консервативных замен. Как правило, консервативные замены не делают в положениях аминокислот, критических для связывания эпитопа бета цепи семейства TRBV9.
Описанные выше варианты (мутанты) антител согласно изобретению могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК как описано ниже в разделе «Нуклеиновые кислоты».
Так же обеспечиваются антигенсвязывающие фрагменты антител настоящего изобретения. Термин "антиген-связывающий фрагмент" антитела (или «функциональный фрагмент антитела» или «активный фрагмент антитела»), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген. Показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела включают (а) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1 ; (б) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли; (в) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1 ; (г) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (д) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 341 :544-546), который состоит из домена VH, и (е) выделенный участок (CDR), определяющий комплементарность. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть рекомбинантными способами связаны с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как Fv одной цепи (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела. К ним относятся также другие формы антител из одной цепи, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген- связывающих сайта (см., например, Holliger Р. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
Фрагменты антител, такие как Fab F(ab')2, могут быть получены из целых антител с использованием принятых способов, таких как разложение папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Более того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК.
Антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование участка ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С- концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и уменьшенных биомолекул scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994) Mol. Immunol., 31 : 1047-1058). Другие химические связывания фрагментов антител также хорошо известны из уровня техники.
Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению находятся в изолированной форме, то есть это означает, что данный белок по существу свободен от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагмента и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу. В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную, по меньшей мере, 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.
Способы очистки антитела, полученного путем рекомбинантной или гибридомной хорошо известны из уровня техники, например, очистка может быть осуществлена путем хроматографии (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной для специфичных антигенов - белка А или белка G, и колоночной хроматографией размеров), центрифугирования, дифференциальной растворимости, или любой другой стандартной методикой для очистки белков. Кроме того, антитела по технологии в соответствии с настоящим изобретением или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями (например, гисти диновой меткой) для облегчения очистки.
Аффинность антитела можно определять с применением стандартного анализа через определение константы диссоциации (KD). KD вычисляется через уравнение KD=kd/kon, где kd - экспериментально вычисляемая константа скорости диссоциации и kon - экспериментально вычисляемая константа скорости ассоциации комплекса аньтитело-антиген. Предпочтительными антителами являются те, которые связывают антиген человека со значением KD не более чем приблизительно 1 c 10 7 М; предпочтительно не более чем приблизительно 1 c 10 8 М; чаще не более чем приблизительно 1 x 10-9 М; более предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10-10 М, и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1 c 10 11 М, например, не более чем приблизительно 1 c 10 12 М.
К предпочтительным антителам относятся антитела aHTH-TRBV9-l , анти- TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3 или aHTH-TRBV9-4, отличающиеся последовательностью CDR3 и описанные в деталях в экспериментальной части, ниже.
Антитела и их фрагменты, которые можно использовать в настоящих композициях и способах, являются биологически активными антителами и фрагментами, то есть способны связывать желаемые антигенные эпитопы и проявлять биологический эффект непосредственно или опосредованно.
Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению способны специфически связывать эпитоп (участок) бета цепи семейства TRBV9. В преимущественных воплощениях в результате их специфического связывания с бета цепью семейства TRBV9 происходит ингибирование активности ТКР, включающих указанную бета цепь. Как правило, ингибирование составляет предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или выше.
В некоторых вариантах осуществления антитело против бета цепи семейства TRBV9 согласно изобретению или его фрагмент может элиминировать Т-лимфоциты, несущие ТЕР, содержащий бета-цепь семейства TRBV9. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент согласно изобретению может обеспечивать, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50%, по меньшей мере, приблизительно 60%, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или приблизительно 100% элиминацию Т- лимфоцитов.
Нуклеиновые кислоты
Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела настоящего изобретения, их функциональные фрагменты и вариабельные домены, которые могут быть использованы для получения химерных антител, включающих вариабельные домены по изобретению, оперативно слитые с известными константными доменами антител человека.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
HCDR1 (согласно номенклатуре Rabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ IN No 1 ;
HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ IN No 2;
HCDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 7;
LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 8;
LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 9.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гомологи и мутанты указанных цепей антител, их функциональных фрагментов и доменов также находятся в рамках настоящего изобретения. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит аминокислотную последовательность по существу сходную с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11 ; например, идентичны с ней по крайней мере, на 90%, чаще по крайней мере на 93%, как правило на 94% или выше (предпочтительно на 95% или выше, на 96% или выше; на 97% или выше, на 98% или выше, на 99% или выше или на 99,5% или выше).
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит аминокислотную последовательность по существу сходную с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19; например, идентичны с ней по крайней мере, на 90%, чаще по крайней мере на 93%, как правило на 94% или выше (предпочтительно на 95% или выше, на 96% или выше; на 97% или выше, на 98% или выше, на 99% или выше или на 99,5% или выше).
В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты, кодируют легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No 11 и тяжелую цепь антитела, содержащую вариабельный домен, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельные домены, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID No 11 , 13,15,19, которые могут быть использованы для оперативного слияния с нуклеиновыми кислотами, кодирующие соответствующие константные домены антител.
Примеры специфических типов молекул нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, раскрывается более детально ниже в экспериментальной части. Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или к ДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. В некоторых воплощениях, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или к ДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии в гетерологической системе экспрессии.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения получена методами генной инженерии. Способы получения нуклеиновых кислот хорошо известны из области техники. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот, может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.
Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и no инструкции, описанной в, например, United States Dept of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы следующим образом: могут быть синтезированы несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фргменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящего изобретения могут быть также клонированы из биологических источников.
Настоящее изобретение так же охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны, или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды настоящего изобретения.
Нуклеиновые кислоты изобретения находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которой они находятся в естественных условиях.
Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей таких, как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах -хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.
Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генная реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.
Также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке- хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. Оптимизация генетического кода хороню известна из уровня техники.
Вышеуказанные модификации не изменяют по существу свойства антител и их функциональных фрагментов, но могут облегчать белковый фолдинг в клетке-хозяине, снижать способность к агрегации или модулировать другие биохимические свойства белков, например, полупериод распада. В некоторых воплощениях, эти модификации не изменяют биохимические свойства белка. Все виды модификаций и мутаций, указанные выше, осуществляются на уровне нуклеиновой кислоты.
Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются, по меньшей мере, приблизительно на 50% чистыми, обычно, по меньшей мере, приблизительно на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть, фланкированы одним или более нуклеотидами, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые белки, включающие белок настоящего изобретения, или их фрагменты, которые ниже рассматриваются более детально. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные домены по изобретению могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими соответствующие константные домены легкой и тяжелой цепи антитела. Нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими лидерный пептид, обеспечивающий транспорт продуктов экспрессии из клетки-хозяина. Лидерный пептид впоследствии отщепляется во время созревания полипептида.
Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Термин "вектор" включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она оперативно связана. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицированы наряду с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы имеют в данной заявке название "векторы рекомбинантной экспрессии" (или, упрощенно, «векторы экспрессии» или «экспрессионные векторы»), а иллюстративные векторы хорошо известны из уровня техники. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области. Полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности. Вектор, как правило, имеет ориджин репликации, обеспечивающий его размножение в клетках-хозяевах в результате его введения в клетку как внехромосомного элемента. Вектор также может содержать регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине и получение целевого полипептида. В экспрессионном векторе, указанная нуклеиновая кислота является оперативно связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению нуклеиновая кислота также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки- хозяина во внеклеточное пространство.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных полипептидов (например, легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению) на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжи, растения, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В кассете экспрессии целевая нуклеиновая кислота оперативно соединяется с регуляторными последовательностями, которые могут включать промоторы, энхансеры, терминирующие последовательности, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению нуклеиновая кислота также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство. Способы получения кассет или систем экспрессии, способных экспрессировать желательный продукт, известны специалистам в данной области.
Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, не являющиеся эмбриональными клетками человека, такие как дрожжи, растения, позвоночные, например, СНО клетки (например, АТСС CRL-9096), NS0 клетки, SP2/0 клетки, НЕК293 клетки, COS клетки (например, АТСС CRL-1650, CRL-1651) и HeLa (АТСС CCL-2).
Для получения антитела по изобретению клетка-хозяин ко- трансформируется экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела. В некоторых воплощениях используется один экспрессионный вектор, в который внедрены нуклеиновые кислоты, кодирующие и легкую, и тяжелую цепи антитела.
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионным вектором(ами), кодирующим тяжелую и легкую цепи, трансформируют (ко-трансформируют) в клетку-хозяина таким образом, что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, предпочтительно, выделяются в среду, в которой культивируют клетки-хозяина, из этой среды могут быть выделены антитела. Различные трактовки термина "трансформация" предназначены для включения широкого ряда способов, обычно используемых при интродукции экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяина, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана и др., как описано Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989; Ausubel F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).
Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты антитела, интродуцируют в клетки-хозяева, антитела образуются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, который достаточен для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или (более предпочтительно) секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяина. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков. Условия культивирования различных клеток хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott- Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.
Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.
Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).
Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР, с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например, нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью указывает на экспрессию гена в образце.
Терапевтическое применение антител по изобретению
В одном аспекте антитело или его активный фрагмент по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые связаны с активностью патологических Т-лимфоцитов, несущих на поверхности ТКР семейства TRBV9, например, с активностью аутоиммунных Т-лимфоцитов при АС, целиакии, Т-клеточных лимфомах.
Термин "пациент" в данной заявке относится к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь приведенными, мышей, обезьян, людей, млекопитающих сельскохозяйственных животных, млекопитающих спортивных животных и млекопитающих комнатных животных; предпочтительно термин относится к людям. В определенном из вариантов осуществления пациент дополнительно характеризуется заболеванием или расстройством, или состоянием, опосредованными наличием в его организме ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9. Из уровня техники известно, что ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, ассоциированы с АС и целиакией. Также ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, могут быть связаны с развитием ряда заболеваний крови, таких как Т клеточная лимфома, вызванная вирусом Эпштейн-Барр.
Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относящиеся антителу с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, ссылаются или включают:
1) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
3) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.
Антитело по данному изобретению (например, aHTH-TRBV9-l , анти- TRBV9-2, aHTH-TRBV9-3 или aHTH-TRBV9-4) могут назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение антителом по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия). В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для аутоиммунного или онкологического заболевания, в патогенез которого вовлечены ТКР, содержащие бета-цепь TRBV9, например, АС, целиакия, Т-клеточная лимфома, Т-клеточный лейкоз.
Дозы и пути введения
Антитело по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных иммуносупрессивных или противовоспалительных методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, также как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.
Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза антитела по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1 -20 мг/кг. Антитело может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере, 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере, 1 ,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере, 5 мг/кг; и, например, вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.
Фармацевтическая композиция
Антитело по изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, пригодную для введения пациенту. Антитела по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или наполнителем в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному режиму введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или наполнители, такие как диспергирующие агенты, буфера, поверхностно- активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п. использованы должным образом. Указанные композиции разработаны в соответствии с традиционными методами, приведенными в, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где описаны различные методы получения композиций, в общем известных специалистам.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела по данному изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату антитела проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно- активные вещества, например, полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен- полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по изобретению, может быть введена пациенту, имеющему патологии, как описано в данной заявке, с использованием стандартных методов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит или является "терапевтически эффективным количеством" антитела по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желательную реакцию у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезный эффект антитела преобладает над токсическим или вредным эффектом. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желательного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют для индивидуумов до или на ранней стадии заболевания, то, типично, профилактически эффективное количество может быть меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой, по крайней мере, минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимую для обеспечения терапевтической пользы пациенту. С другой стороны, терапевтически эффективное количество антитела по изобретению представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, снижает биологическую активность аутоиммунных клонов, например, через связывание ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, где присутствие этих клонов вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам, или снижение уровней ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, вызывает благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека.
Путь введения антитела по изобретению может быть пероральным, парентеральным, путем ингаляции или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин "парентеральный", как используется в данной заявке, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Преимущественным является введение путем внутривенной или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны из уровня техники.
Фармацевтическая композиция, как указано в соответствующих руководствах, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в контейнере, который обеспечивается, включая, например, герметично закрытый флакон (ампула) или шприц. Поэтому фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованными после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем в 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1-100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно из уровня техники в области медицины, дозировки для любого из пациентов зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001 -1000 мкг; однако, предвидятся дозы, находящиеся ниже или выше этого иллюстративного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Режим дозировок ежедневного парентерального введения может составлять от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно от 0,3 мкг/кг до 10 мг/кг и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день. Процесс лечения можно контролировать путем периодической оценки состояния пациента. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния пациента лечение повторяют до достижения желаемого ответа или подавления симптомов болезни. Однако также могут применяться другие режимы дозировок, которые не описаны в данной заявке. Желаемая дозировка может быть введена путем одноболюсного введения, множественных болюсных введений или путем непрерывного инфузионного введения антитела в зависимости от образца фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист.
Эти предположительные количества антитела в сильной степени зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима является желаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место введения антитела, конкретный вид антитела, способ введения, режим введения и остальные факторы, известные практикующим специалистам-медикам .
Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены либо лиофилизированы и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизирование и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировки могут быть скорректированы для компенсации этой потери. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 6 до 8.
Изделие (продукты) и наборы
Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения аутоиммунных заболеваний и родственных состояний и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР, несущие бета-цепь семейства TRBV9. К таким заболеваниям относятся, например, АС, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома и другие.
Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и листовкой- вкладышем, которые могут быть размещены в блистере и/или пачке. Приемлемыми контейнерами являются, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело, предлагаемое в изобретении. На этикетке и листовке-вкладыше в упаковке указано, что лекарственное средство применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка и/или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, в том числе информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке- вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения указать чего. Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, растворители, разбавители, фильтры, иглы и шприцы, но не ограничиваясь ими.
Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например, для оценки способности уничтожать Т-клетки, несущие ТКР семейства TRBV9, для очистки или иммунопреципитации рецептора TRBV9 из клеток. Для выделения и очистки набор может содержать антитело связанное с гранулами (например, сефарозными гранулами). Набор содержит контейнер и этикетку и листовку-вкладыш в упаковке.
Диагностическое использование
Антитела по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo). Например, антитело может использоваться для обнаружения или измерения уровня Т-лимфоцитов, содержащих ТКР семейства TRBV9 в образцах, полученных от пациента, например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например, диагностические наборы, содержащие антитела, описанные в данном документе.
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме. Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Экспериментальная часть
Пример 1. Продукция и очистка антитела
Нуклеиновые кислоты (SEQ ID No 10, 12, 14, 16, 18), кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, были получены путем амплификации ДНК фрагментов с использованием перекрывающихся праймеров и высокоточной полимеразы Q5 (NEB, USA). Полученные нуклеиновые кислоты были очищены на колонках Quagen (Германия) с использованием набора реагентов (# 28104) и направлено клонированы в коммерчески доступные вектора pFuse, содержащие константные области генов тяжелой (IgGl) и легкой (kappa) цепи человека (Invivogen, США). Последовательности клонированных фрагментов подтверждались путем секвенрования по методу Сэнгера.
В результате были получены плазмиды, содержащие кодирующие последовательности для четырех вариантов тяжелой цепи антитела:
HV aHTH-TRBV9-l , нуклеотидная и аминокислотная последовательности которого показаны в SEQ ID No: 20 и 21 ;
HV aHTH-TRBV9-2, нуклеотидная и аминокислотная последовательности которого показаны в SEQ ID No: 22 и 23;
HV aHTH-TRBV9-3, нуклеотидная и аминокислотная последовательности которого показаны в SEQ ID No: 24 и 25; HV aHTH-TRBV9-3, нуклеотидная и аминокислотная последовательности которого показаны в SEQ ID No: 26 и 27;
и для одного варианта легкой цепи антитела LV анти-TRB V9 (SEQ ID No: 28 и 29).
Степень гуманизации тяжелой цепи антитела составляет 72%, а легкой цепи - 69%.
Для получения антител плазмиды трансфецировали в суспензионную линию клеток HEK293F. Для трансфекции использовали реагент 293fectine (Thermo Fisher scientific, USA # 1234701). По 30 млн. клеток помещали в 30 мл среды FreeStyle, добавляли к ним 30 мкг плазмиды pFuse, кодирующей один из вариантов тяжелой цепи антитела, и 30 мкг плазмиды pFuse, кодирующей легкую цепь антитела, и 60 мкл 293fectine (Thermo Fisher scientific, USA # 12347019). Плазмиды, содержащие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, были растворены в воде, проверенной на содержания эндотоксинов (Quagen, USA)
Полученные реакционные смеси инкубировали при 37°С на качалке в течение недели. Через неделю собирали клеточный супернатант, который использовали для выделения антител. Для этого супернатант центрифугировали три раза при 10000 об/мин по 10 мин, и очищали жидкую фракцию с помощью колонки на 1 мл HiTrap PrG (Thermo Fisher scientific, USA). Для э люции использовали 0,1M глициновый буфер рН2.5, доводится НС1. Качество выделения оценивали с помощью 12% ПААТ -электрофореза в денатурирующих условиях. Количественную оценку проводили с помощью измерения на микроспектрофотометре NanoDrop2000 при 280 А. Полученное продукт хранили на +4°С.
Характеристики выделенных белков приведены в таблице 1. Таблица! . Характеристики антител.
Figure imgf000055_0001
Определение аффинности анти-TRB V9 антител проводили на приборе OctetRed 96 (от ForteBio). На поверхность аминореактивных сенсоров второго поколения (от AR2G) неспецифически иммобилизовали антигены (табл.1) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя, для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ был произведен при 30°С с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. Анализ аффинности связывания анти- TRBV9 антител производили с использованием рабочего буфера от концентрации 126 нМ до 2 нМ с шагом 2. Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 : 1. Результаты суммированы в таблице 2.
Таблица 2. Оценка аффинности антител
Figure imgf000056_0001
При использовании антигенов TRBV7+TRAV38 взаимодействия с антителами не наблюдалось. Лучшие характеристики проявляли антитела TRBV9-2 и TRBV9-4. Пример 2. Использование моноклональных антител anmu-TRBV9 для мечения Т-лимфоцитов, экспрессирующих бета-цепь ТКР, принадлежащую к семейству TRBV9.
Моноклональные антитела (aimi-TRBV9-l, airra-TRBV9-2, анти-Т1ТВУ9- 3, aHTH-TRBV9-4, отличающиеся последовательностью CDR3 тяжелой цепи) получали как описано в Примере 1. Для визуализации работы антител проводили их мечение флуоресциином с помощью реагента флуоресциин изотиоцианат (Sigma, США) по протоколу производителя. Контроль количества флуорофоров, вступивших в реакцию с молекулами антитела, осуществляли по соотношению спектра поглощения при длинах волн 495/280 нм. Меченые антитела использовали для выявления Т-лимфоцитов, экспрессирующих бета-цепь ТКР семейства TRBV9, в мононуклеарной фракции крови человека.
Для получения указанной фракции использовали периферическую кровь 5 здоровых доноров. Кровь собирали в пробирки Vacuette с EDTA (по 2x9 мл), мононуклеарную фракцию согласно стандартной методике, описанной в (Ковальчук Л. В. и др. Иммунология: практикум - 2010. - 176 с.). После выделения клетки перенесли в фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.5% бычий сывороточный альбумин (БСА) и 2 шМ ЭДТА. Суммарное количество клеток и их жизнеспособность определяли по методу окрашивания с трипановым синим как описано Лангом Н.Р. (Стимуляция лимфоцитов М.:Медицина, 1976.-288 с).
Для мечения Т-лимфоцитов в каждом тесте к аликвоте мононуклеарной фракции, содержащей по 500 тысяч клеток (на тест), добавляли в буфере PBS с добавлением 0.5% бычий сывороточного альбумина (БСА) и 2 Mm ЭДТА антитела анти-Т1ТВУ9-1 , анти-Т1ТВУ9-2, анти-Т1ТВУ9-3, анти-Т1ТВУ9-4 до конечной концентрации 5 нг\мкл и 0,5 нг\мкл, а также моноклональное антитело против CD3-eFluor405 ((клон ОКТЗ, eBioscience);) в концентрации рекомендуемой производителем.
Полученные реакционные смеси объемом 50 мкл PBS с 0.5% БСА 2m М ЭДТА инкубировали при комнатной температуре 30 мин, после этого клетки промывали буфером PBS с 0.5% БСА 2m М ЭДТА и анализировали результаты окрашивания с помощью проточной цитометрии (FACSARIA III, USA, фиг. 1 - 4). Было показано, что все полученные варианты моноклональных антител специфически узнают фракцию СЭЗ+позитивных клеток. Однако вариант TRBV9-2 показал наиболее стабильное окрашивание, которое составляло 2,9% от CD3 -позитивной фракции, при концентрациях антитела как 5 нг\мкл, так и при концентрации 0.5 нг\мкл. Тогда как другие варианты антител (анти- TRBV9-2, анти-Т1ТВУ9-3, анти-TRB V9-4) продемонстрировали окрашивание различной доли TRBV9+ лимфоцитов при тех же концентрациях. Также специфичность работы анти-Т1ТВУ9-2 определялось отсутствием слабоокрашенных неспецифических CD3 -негативных клеток, что присутствует при использовании других вариантов, и значительным отделением специфической популяции клеток от других CD3 -позитивных лимфоцитов негативных по TRBV9 рецептору.
Таким образом, было установлено, что второй вариант (анти-Т1ТВУ9-2) показывает наиболее эффективное и высоко специфичное окрашивание Т лимфоцитов TRBV9+. Данное антитело может быть использовано в диагностических целях для детекции Т лимфоцитов TRBV9+ в концентрации 0,6 нг\мкл.
Для оценки специфичности работы антител анти-TRB V9- 1 , анти-TRB V9- 2, анти-Т1ТВУ9-3, анти-Т1ТВУ9-4 мононуклеарные фракции крови, полученные как описано выше из 5 образцов периферической крови, окрашивали aHTH-TRBV9-FITC антителом и anti-CD3-eFluor450 (eBioscience, USA) антителом как описано выше, используя следующие соотношения: к Змлн клеток мононуклеарной фракции крови добавляли 5 мкл (1мкг) anti-CD3-eFluor 450 (eBioscience, USA) и 30 иг (0.5 нг\мкл) anti-TRBV9-2 FITC. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре 30 мин, клетки отмывали буфером PBS с 0.5% БСА и сортировали на клеточном сортере (FACSARIA III, USA), выделяя популяцию клеток CD3+TRBV9+, а также CD3+TRBV9-. Для контроля качества сортинга проводили ре-сортировку популяции CD3+TRBV9+, которая показала, что обогащение целевой популяцией клеток составило 95%.
Полученные фракции клеток помещали в RLT-буфер (Quagen, Германия) и выделяли из них РНК с помощью набора реактивов Quiagen RNAeasy mini kit #217004 (Quagen) согласно протоколу производителя. На матрице выделенной РНК синтезировали к ДНК и амплифицировали фрагменты бета цепи Т-рецептора по протоколу, описанному Britanova et al (J Immunol, 2016, 196 (12) 5005-5013) с использованием набора реактивов Mint cDNA synthesis kit (Евроген, Россия). К наработанным ампликонам лигировали адапторы Illumina (США) и секвенировали на платформе MiSeq Illumina согласно протоколу производителя секвенатора. Данные секвенирования анализировали с помощью программ MiGEC, MiXCR и VDJtools, представленных на сайте в сети HHTepHeT:https://milaboratory.com. Анализ данных показал, что 90% последовательностей из фракции CD3+TRBV9+ относятся к семейству генов вариабельных сегментов бета цепей TRBV9. В то же время во фракции CD3+TRBV9- фрагментов, содержащих последовательность вариабельного сегмента TRBV9, обнаружено не было. Таким образом, анти-Т1ТВУ9-1 , анти-Т1ТВУ9-2, анти-Т1ТВУ9-3, анти-Т1ТВУ9- 4 специфически связываются с бета цепью семейства TRBV9.
Пример 3. Функциональная активность антител
Моноклональные антитела (анти-Т1ТВУ9-1, анти-Т1ТВУ9-2, анти-ТМЗУ9- 3, анти-TRB V9-4, отличающиеся последовательностью CDR3 тяжелой цепи) получали как описано в Примере 1. Мононуклеарную фракцию крови человека получали как описано в Примере 2.
Дополнительно из части мононуклеарной фракции осуществляли выделение естественных киллеров с помощью набора реагентовдля выделения NK клеток человека # 130-092-657 (Miltenyi biotec, USA). Использовали протокол производителей. Качество выделения NK клеток оценивали с помощью цитофлуометрии (BD FACS ARIA III, USA) с использованием меченных антител CD16- FITC, CD56-PE, CD3-VioBlue. Обогащение NK клетками составляло 85-95%.
Для оценки цитотоксичности к аликвоте мононуклеарной фракции, содержащей 1 х 106 клеток добавляли антитела (aHTH-TRBV9-l , aHTH-TRBV9- 2, aHTH-TRBV9-3, или aHTH-TRBV9-4) до конечной концентрации 5 мкг/мл. В качестве негативного контроля использовали антитела ремикэйд в такой же концентрации, как и aHTH-TRBV9. К контрольной аликвоте клеток (положительный контроль) антитела не добавляли. Также во все реакционные смеси добавляли по 105 NK клеток. Конечный объем реакции составлял 100 мкл.
Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре один час, далее клетки отмывали несколько раз от антител и разносили по лункам 96- лун очного кругло донного планшета, на столе.
Через 6 дней клетки собирали из лунок и использовали для иммунофенотипического анализа с помощью проточной цитометрии. Для детекции Т лимфоцитов были использованы следующие антитела: anti-CD3- eFluor450 (клон ОКТЗ, eBioscience); anti-CD8-PC7 (клон SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, USA); полученные нами антитела aHTH-TRBV9-l ,2,3,4, меченые Fite. После окрашивания клетки отмывали и анализировали на приборе BD FACSARIA III. Т-лимфоциты CD3+TRBV9+ в образцах, подвергшихся инкубации с aHTH-TRBV9 антителами настоящего изобретения, не обнаруживаются. В то же время в контрольном образце без добавления антитела (“ноль-контроль”) airra-TRBV9, а также с добавлением терапевтических антител ремикейд детекция двойных позитивных Т лимфоцитов по маркерам CD3+TRBV9+ сохраняется, что подтверждает специфическую элиминацию Т клеток TRBV9+ при добавлении антител против TRBV9. Типичный результат проточной цитометрии представлен на фиг. 5. В дополнительном негативном контроле, где вместо анти-Т1ТВУ9 антител настоящего изобретения использовались нецитотоксические антитела против CD6, целевая популяция CD3+CD6+ не менялась по сравнению с “ноль-контролем”. Это указывает, что экранирования эпитопа не меченными антителами на 6 день не происходит и подтверждает способность антител aHTH-TRBV9 элиминировать клетки, несущие ТКР семейства TRBV9.
Пример 4. Создание стабильной клеточной линии
Стабильная клеточная линия продуцент моноклонального антитела анти- TRBV9-2 была получена путем трансфекции суспензионной клеточной линии CHO-S векторными конструкциями, содержащими легкие и тяжелые цепи антитела в оптимизированном соотношении. Клональные линии с высоким уровнем (более 100 мг/л) были получены с использованием роботизированной платформы ClonePix (Molecular Devices). Анализ продуктивности отобранных клонов проводился на базе автоматизированной системы Biomek FX robotics (Beckman Coulter) и аналитической системы Octet RED96 (Pall Life Sciences). Для культивирования продуцента использовали бессывороточные среды, не содержащие белков животного происхождения. Наработку препарата BCD085 для предклинических исследований проводили в ферментере HyClone single- use bioreactor (Thermoscientific) рабочим объемом 200 л.
Пример 5. Получение фармацевтической композиции , содержащей антитело согласно изобретению
Компоненты фармацевтической композиции показаны в Таблице 3. Таблица 3. Концентрации компонентов фармацевтической композиции
Figure imgf000062_0001
Пример 6. Набор, содержащий фармацевтическую композицию с антителами
Для выпуска наборов с лекарственной формой, содержащей композицию с антителами анти-Т1ТВУ9-2, фармацевтическую композицию, полученную согласно примеру 5 запаивают в ампулы или шприцы объемом 1 мл в стерильных условиях, маркируют и упаковывают в контейнеры из пластикового или картонного материала.
Также в контейнер с ампулой вкладывают инструкцию по применению.
Пример 7. Варианты антител по изобретению
Для получения мутантных последовательностей HV анти-Т1ТВУ9-1 проводили сайт-направленный мутагенез с использованием "overlap extention" продуктов ПЦР как описано Wurch et al., Methods in Molecular Biology. 12 (9), 653 - 657 (2004). Для ПЦР использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, USA), согласно рекомендациям производителя. После амплификации полученные фрагменты очищали при помощи электофореза в 1 % агарозном геле и дальнейшей экстракцией. Выделенные из геля фрагменты ДНК, содержащие мутации, объединяли в целую конструкцию методом «overlap extention» ПЦР (денатурация 95°С - 12 сек; отжиг 55°С - 2 мин; элонгация 72°С - 1 мин, 8 циклов ПЦР). Этот метод подразумевает, что в качестве матрицы и затравки применяют присутствующие в реакционной смеси фрагменты с комплементарными друг другу участками. Амплификацию всей конструкции производили методом стандартной ПЦР с добавлением праймеров, комплементарным концам амплифицируемого фрагмента. Полученные нуклеиновые кислоты были очищены на колонках Quagen (Германия) с использованием набора реагентов (# 28104) и клонированы в вектор pFuse как описано в Примере 1. Последовательности мутантной ДНК проверяли секвенированием по методу Сэнгера. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности полученных вариабельных доменов показаны: вариант 1 - в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31 ; вариант 2 - в SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33. Способность мутантных антител связываться с Т-лимфоцитами, экспрессирующими бета-цепь ТКР, принадлежащую к семейству TRBV9, проверяли как описано в Примере 2. Было показано, что внесенные замены не оказывают влияния на специфичность связывания.
Перечень последовательностей
<110> ЗАО "БИОКАД"
<120> Моноклональное антитело и способы его применения
<130? TCRB9. docx
<16 > 33
< 1?0> Patentln version 3.5
210 1
<211? 5
<212> PRT
< 213? Artificial
220
<223> аминокислотная последовательность HCDR1 (согласно номенклатуре Rabat)
400 1
Asp Туг Leo Val His
1 5
< 21q> 2
<211> 17
212 PRT
<213? Artificial
220
<223 ? аминокислотная последовательность HCDR2 ( согласно номенклатуре Rabat)
<408? 2
Тгр Не Asn Thr Ту Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Giu 1 5 10 15
Gly
Figure imgf000064_0001
<213? Artificial
<220?
<223? аминокислотная последовательность HCDR3 ( согласно номенклатуре Rabat)
<40q> 3
Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210? 4
<211? 13
<212> PRT
<213? artificial
1 <22q>
<223> аминокислотная последовательность HCDR3 (согласно номенклатуре Kabat:)
<488> 4
Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly lie Gly Phe Asp Туг
1 5 10
<210> S
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> аминокислотная последовательность HCDR3 (согласно номенклатуре Kabat}
<400> 5
Ser Trp Arg Arg Gly lie Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr
1 5 10 210 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> аминокислотная последовательность HCOR3 (согласно номенклатуре Kabat)
<400> 6
Ser Trp Arg Arg Gly He Arg Gly lie Gly Phe Asp Tyr
l 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> аминокислотная последовательность LCORl (согласно номенклатуре Kabat)
<400> 7
Lys Ala Ser tys Ser lie Asn lys Tyr Leu Ala
1 5 10 210 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> аминокислотная последовательность LCDR2 (согласно номенклатуре Kabat)
2 <400> 8
Asp Gly Ser Thr Leu Gin Ser
1 5
<210> 9
<2ll> 9
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> аминокислотная последовательность LCDR3 (согласно номенклатуре Kabat)
<400> 9
Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro Pro Thr
1 5
<2ie> 18
<211> 321
<212> DMA
<213> Artificial
<22@>
<223> Нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела
<40q> 1Q
gacgtgcaga tgacccagtc cccctacaac ctggccgcct cccccggcga gtccgtgtcc 6Q atcaactgca aggcctccaa gtccatcaac aagtacctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaagccca acaagctgct gatctacgac ggctccaccc tgcagtccgg catcccctcc 180 aggttctccg gctccggctc cggcaccgac tfcaccctga ccatcagggg cctggagccc 240 gaggacttcg gcctgtacta ctgccagcag cacaacgagt acccccccac cttcggcgcc 3Q8 ggcaccaagc tggagctgaa g 321
<218> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой
цепи антитела
<400> 11
Asp Val Gin Met Thr Gin Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 1Q 15
Glu Ser Val Ser lie Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser lie Asn Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu lie
35 40 45
3 Туг Asp Gly Ser Thr Leu Gin Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 68
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Arg Gly Leu Glu Pro
65 78 75 80
Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro Pro
85 ' 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 12
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
220
<223> Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400> 12
cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 128 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacetac 188 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 248 ctgcagatct ccaacctgaa gaaegaggac accgccacct acttctgcgc caggtcotgg 308 sggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgacogtg 360 tcctcc 366
<21Q> 13
211 122
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400> 13
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu
1 5 18 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
28 25 38
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 48 45
4 Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
6S 70 75 80
Leu Gin He Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 98 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser
115 120
<218> 14
<211 > 366
<212> DMA
<213 > Artificial
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400 > 14
cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caecttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240 ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggt ctgg 380 aggaggggec tgaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctcc 366
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400> 15
Gin l ie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
5 Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr Туг Thr Sly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 88 leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Slu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly lie Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser
115 129
<210> 16
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
220
<223> Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400> 16
cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcetc caccgccaac 240 ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 3QQ aggaggggca tcaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 36Q tcctcc 366
<210> 17
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400> 17
Gin Не Gin Leu val Sin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu
1 5 18 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
6 28 25 30
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 48 45
Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala 5er Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 80
Leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly He Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp
180 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжело цепи антитела
<400> 18
cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ecggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gaetacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgtte tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240 ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccaect acttctgcgc caggtcctgg 3Q0 aggaggggca tcaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctcc 366
<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<408> 19
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
7 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 38
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 48 45
Gly Tnp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 . 55 60
Gly Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 88
Leu Gin lie Ser Asn Leu lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly lie Arg Gly He Gly Phe Asp Tyr Trp
160 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2Q
<211> 1365
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела
анти-Т8ВУ9~1
<4@е> 28
cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 188 gccgacgaet tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 248 ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300 aggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 428 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 608 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660 gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 728 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaecca aggacaccct catgatctcc 780
8 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 9Q0 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagcc cga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg gga agcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc sgcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365
<210> 21
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела
анти-Т8ВУ9-1
<400> 21
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 4Q 45
Gly Trp He Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 8Q
Leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp
10Q 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
9 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gl Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 178 175
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
21Q 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 28Q 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 318 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
3SS 368 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
10 385 398 395 4QQ
Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
485 410 415
Val Asp lys 5er Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
428 425 438
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
435 448 445
Ser Pro Gly Lys
458 210 22
<211> 1365
<212> DMA
<213> Artificial
220
<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела
анти-ТЯВУ9-2
<4Q0> 22
cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 68 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240 ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggec accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300 aggaggggcc tgaggggcat cggcttcgac tacfggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 680 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagft 668 gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgeccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 848 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacasgtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1880
11 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365
<210> 23
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела
aHTH-TRBV9-2
<400> 23
Gin He Gin Leu Val Gin $er Gly Pro Glu leu Arg Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 38
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly leu Lys Trp Met
35 4Q 45
Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 80
Leu Gin He Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly He Gly Phe Asp Tyr Trp
100 185 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
12 Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220
Cys Asp lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
26Q 265 27Q
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Тут Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 33Q 335
He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
340 345 350
Val Tyr Thr leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
4Q5 41Q 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
13 Met His Glu Ala Leu His Asn His Туг Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
435 448 445
Ser Pro Gly Lys
450
<2l8> 24
<211> 1365
<212> ОНА
<213> Artificial
220
<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела
анти-ТИВУЭ-З
<480> 24
cagatecagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctecgcctc caecgccaac 24Q ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 360 aggaggggca tcaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660 gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg a gtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 980 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1088 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac egtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365
14 <210> 25
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела анти-ТРВУ9-3
<408 > 25
Gin Не Gin Leu \/al Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Туг Thr Phe Thr Asp Туг
20 25 38 leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp He Asn Thr Туг Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 6Q
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 88
Leu Gin He Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly He Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 12S
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 138 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
1S0 185 198
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220
15 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser V3l Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335 lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 460
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 418 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450 210 26
211 1365
<212> DNA
16 <213> Artificial
<228>
<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела
aHTH-TRBV9-4
<408> 26
cagstccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240 ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 3Q0 aggaggggca tcaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 6Q0 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660 gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 9QQ cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1028 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1088 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1148 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1208 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1268 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1328 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365
<210 > 27
<211> 452
<212> PftT
<213> Artificial
220
<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела
aHTK-TR8V9-4
<480> 27
17 Gin lie Gin leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 38
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp He Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 68
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 88
Leu Gin He Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 9Q 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly He Arg Gly He Gly Phe Asp Tyr Trp
108 105 110
Gly Gin Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 128 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 158 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 178 175
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Sen Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn 195 200 285
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 21:5 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
18 268 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
298 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val
379 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 418 41S
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 43Q
Met His Glu Ala teu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
458
<210> 28
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность легкой цепи антитела анти-ТРВУ9 <408> 28
gacgtgcaga tgacccagtc cccctacaac ctggccgcct cccccggcga gtccgtgtcc 60 atcaactgca aggcctccaa gtccatcaac aagtacctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaagccca acaagctgct gatctacgac ggctccaccc tgcagtccgg catcccctcc 180
19 aggttctccg gctccggetc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagggg cctggagccc 240 gaggacttcg gcctgtacta ctgccagcag cacaacgagt acccccccac cttcggcgcc 300 ggcaccaagc tggagctgaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgtcgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgtcctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagag 639
<210> 29
<2И> 214
<:212> PRT
<213> Artificial ·
<220>
<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела амти -Т8ВУ9 <400> 29
Asp Val Gin Met Thr Gin 5er Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly
I 5 10 15
Glu Ser Val Ser He Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser He Asn Lys Tyr
28 25 ' 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gin Ser Gly He Pro Ser Arg Phe Ser Gly
58 55 68
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Arg Gly Leu Glu Pro
65 7Q 75 80
Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
1QQ 1Q5 11Q
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 128 125
Thr Ala Ser val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
20 145 15q 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
18Q 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 2QQ 285
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial
<228>
<223> Нуклеотидная последовательность варианта вариабельного домена
тяжелой цепи антитела
< 480 30
cagatccagt tggtgcagtc cggccccgag ctgaaggagc ccggcgagtc cgtgaagatc 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120 cccggcaagg gcatcaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180 gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccatcgagg cctccgcctc caccgccaac 240 ctgeagatct ccaacatcaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300 aggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tac 333
<218> 31
211 111
<212> PRT
<213> Artificial
220
<223> Аминокислотная последовательность варианта вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<408> 31
Gin Не GXn Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
Figure imgf000084_0001
28 25
Figure imgf000084_0002
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly lie Lys Trp Met
35 48 45
21 6ly Trp He Asn Thr Туг Thr Gly Thr Pro Thr Туг Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser He Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 80
Leu Gin He Sen Asn He Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr
1Q0 105 110
<210> 32
<211> 333
<212> DMA
<213> Artificial
<22q>
<223> Нуклеотидная последовательность варианта вариабельного домена
тяжелой цепи антитела
<40q> 32
cagatccagt tggtgcagtc cggccccgag ataaaggagc ccggcgagtc cgtgaagatc 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaageaggcc 120 cccggcaagg gcatcaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 188 gccgacgaet tcgagggcag gttcgtgttc tccatcgagg cctccgcctc caccgccaac 240 ctgcagatct ccaacatcaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 3Q0 sggeggggcc tgaggggcct gggcttcgac tac 333
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> Аминокислотная последовательность варианта вариабельного домена тяжелой цепи антитела
<400> 33
Gin Не Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu He Lys Glu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 3Q
Leu Val His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly lie Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp He Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
59 55 60
22 Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser lie Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80
Leu Gin He Ser As ti lie Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 98 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr
100 105 110
23

Claims

Формула изобретения:
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV9 Т клеточного рецептора человека, включающее:
1) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотные последовательности HCDR 1-3, где
HCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2,
HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6;
2) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотные последовательности LCDR 1-3, где
LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,
LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8,
LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по и. 1, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19.
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID No 13, SEQ ID No 15, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19.
4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID No 11.
63
5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, где вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 11.
6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающее:
1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную последовательности, выбранной из группы SEQ ID No: 21 , SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 27;
2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 29.
7. Моноклональное антитело по п. 6, включающее:
1) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID No: 21 , SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 27;
2) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
8. Моноклональное антитело по любому из пп. 1-7, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG.
9. Моноклональное антитело по п. 8, где антитело относится к изотипу человека, выбранному из группы: IgGl , IgG2, IgG3, IgG4.
10. Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV9 Т клеточного рецептора человека.
11. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 10.
12. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, включающий ^трансформирование клетки вектором по п. 1 1, содержащим нуклеиновую кислоту по п. 10.
64
13. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пи. 1-9, содержащая нуклеиновую кислоту по и. 10.
14. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пи. 1-9, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по и. 13 в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
15. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека, содержащая в эффективном количестве антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пи. 1-9, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами .
16. Фармацевтическая композиция по и. 15, где указанные заболевание или нарушение выбирают из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
17. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, содержащая в эффективном количестве антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пи. 1-9 и, в эффективном количестве, по меньшей мере, одно другое терапевтически активное соединение.
18. Фармацевтическая композиция по и. 17, где указанные заболевание или нарушение выбирают из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
19. Фармацевтическая композиция по любому из пи. 17-18, где другое терапевтически активное соединение выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов.
65
20. Способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9.
21. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т- клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1 -9 или фармацевтической композиции по п. 15 в терапевтически эффективном количестве.
22. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 21 , где заболевание или нарушение выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т- клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
23. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9 или фармацевтической композиции по и. 15 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9.
24. Применение по п. 23, где заболевание выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
66
PCT/RU2018/050168 2017-12-25 2018-12-25 Моноклональные антитела и способы их применения Ceased WO2019132738A1 (ru)

Priority Applications (18)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/957,328 US11597767B2 (en) 2017-12-25 2018-12-25 Monoclonal antibodies that bind TRBV9 and methods for using same for inhibiting the T cell receptor for treatment
NZ766247A NZ766247B2 (en) 2018-12-25 Monoclonal antibodies and methods for using same
MX2020006736A MX2020006736A (es) 2017-12-25 2018-12-25 Anticuerpos monoclonales y metodos para utilizar los mismos.
CA3086849A CA3086849A1 (en) 2017-12-25 2018-12-25 Monoclonal antibodies and methods for using same
PE2020000858A PE20200927A1 (es) 2017-12-25 2018-12-25 Anticuerpos monoclonales que se unen a la region de la cadena beta de la familia trbv9 del receptor de las celulas t humanas
JP2020535637A JP7339948B2 (ja) 2017-12-25 2018-12-25 モノクローナル抗体およびその使用法
KR1020207021655A KR102867660B1 (ko) 2017-12-25 2018-12-25 단일클론 항체 및 그 이용 방법
AU2018398341A AU2018398341B2 (en) 2017-12-25 2018-12-25 Monoclonal antibodies and methods for using same
CR20200324A CR20200324A (es) 2017-12-25 2018-12-25 Anticuerpos monoclonales y método para utilizar los mismos
MA50128A MA50128B1 (fr) 2017-12-25 2018-12-25 Anticorps monoclonaux liants le recepteur trbv9 des lymphocytes t et procédés de leur utilisation
CN201880090210.0A CN111801354B (zh) 2017-12-25 2018-12-25 单克隆抗体及其使用方法
EP18895626.2A EP3733705A4 (en) 2017-12-25 2018-12-25 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEM
BR112020012959-3A BR112020012959A2 (pt) 2017-12-25 2018-12-25 anticorpos monoclonais e métodos para usar o mesmo
EA202091569A EA202091569A1 (ru) 2017-12-25 2018-12-25 Моноклональные антитела и способы их применения
JOJO/P/2020/0161A JOP20200161B1 (ar) 2017-12-25 2020-06-25 أجسام مضادة أحادية النسيلة وطرق استخدامها
ZA2020/03858A ZA202003858B (en) 2017-12-25 2020-06-25 Monoclonal antibodies and methods for using same
PH12020551012A PH12020551012A1 (en) 2017-12-25 2020-06-25 Monoclonal antibodies and methods for using same
US18/103,194 US12514923B2 (en) 2017-12-25 2023-01-30 Methods of inhibiting the T cell receptor by administering a monoclonal antibody that binds TRBV9

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017145662A RU2694412C9 (ru) 2017-12-25 2017-12-25 Моноклональные антитела и способы их применения
RU2017145662 2017-12-25

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/957,328 A-371-Of-International US11597767B2 (en) 2017-12-25 2018-12-25 Monoclonal antibodies that bind TRBV9 and methods for using same for inhibiting the T cell receptor for treatment
US18/103,194 Continuation US12514923B2 (en) 2017-12-25 2023-01-30 Methods of inhibiting the T cell receptor by administering a monoclonal antibody that binds TRBV9

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019132738A1 true WO2019132738A1 (ru) 2019-07-04

Family

ID=67002533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050168 Ceased WO2019132738A1 (ru) 2017-12-25 2018-12-25 Моноклональные антитела и способы их применения

Country Status (21)

Country Link
US (2) US11597767B2 (ru)
EP (1) EP3733705A4 (ru)
JP (1) JP7339948B2 (ru)
KR (1) KR102867660B1 (ru)
CN (1) CN111801354B (ru)
AU (1) AU2018398341B2 (ru)
BR (1) BR112020012959A2 (ru)
CA (1) CA3086849A1 (ru)
CL (1) CL2020001726A1 (ru)
CR (1) CR20200324A (ru)
EA (1) EA202091569A1 (ru)
EC (1) ECSP20039728A (ru)
JO (1) JOP20200161B1 (ru)
MA (1) MA50128B1 (ru)
MX (1) MX2020006736A (ru)
NI (1) NI202000051A (ru)
PE (1) PE20200927A1 (ru)
PH (1) PH12020551012A1 (ru)
RU (1) RU2694412C9 (ru)
WO (1) WO2019132738A1 (ru)
ZA (1) ZA202003858B (ru)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022515820A (ja) * 2018-12-25 2022-02-22 ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” ヒトｔｒｂｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体
EP3907239A4 (en) * 2018-12-25 2022-10-05 Joint Stock Company "Biocad" MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE BETA CHAIN REGION OF HUMAN TRBV9
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
US12358982B2 (en) 2019-02-21 2025-07-15 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
US12384842B2 (en) 2019-02-21 2025-08-12 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
US12486326B2 (en) 2020-01-03 2025-12-02 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2694412C9 (ru) * 2017-12-25 2019-09-18 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Моноклональные антитела и способы их применения
EP3927745A1 (en) * 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
PE20251393A1 (es) * 2022-08-18 2025-05-22 Biocad Joint Stock Co Metodo de tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por linfocitos t portadoras del segmento trbv9 dentro del receptor de celulas t

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006758A1 (en) 1988-12-15 1990-06-28 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
WO1994005801A1 (en) 1992-08-31 1994-03-17 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
RU2539032C2 (ru) * 2009-06-25 2015-01-10 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Способ измерения искусственного иммунитета
WO2017137453A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Polybiocept Ab T-cell receptor sequences for active immunotherapy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6952225B2 (ja) * 2016-03-18 2021-10-20 北海道公立大学法人 札幌医科大学 Ｔ細胞レセプターとその利用
EP3472208B9 (en) 2016-06-17 2023-10-04 Medigene Immunotherapies GmbH T cell receptors and uses thereof
RU2694412C9 (ru) * 2017-12-25 2019-09-18 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Моноклональные антитела и способы их применения
RU2712251C1 (ru) * 2018-12-25 2020-01-27 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения
AR117735A1 (es) * 2018-12-25 2021-08-25 Joint Stock Company “Biocad” ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE SE UNEN ESPECÍFICAMENTE A LA REGIÓN b DE LA FAMILIA TRBV-9 DEL RECEPTOR DE CÉLULAS T HUMANO, Y LOS MÉTODOS PARA SU USO

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006758A1 (en) 1988-12-15 1990-06-28 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
WO1994005801A1 (en) 1992-08-31 1994-03-17 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
RU2539032C2 (ru) * 2009-06-25 2015-01-10 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Способ измерения искусственного иммунитета
WO2017137453A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Polybiocept Ab T-cell receptor sequences for active immunotherapy

Non-Patent Citations (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Cell Biology", 2000, JOHN WILEY & SONS, INC.
"Remington, The Science and Practice of Pharmacy", 1995, MACK PUBLISHING CO.
BAETEN D ET AL., N ENGL J MED., vol. 373, no. 26, 24 December 2015 (2015-12-24), pages 2534 - 48
BARANY, GENE, vol. 37, 1985, pages 111 - 123
BIRD ET AL., SCIENCE, vol. 242, 1988, pages 423 - 426
BRENNAN ET AL., CLIN EXP IMMUNOL., vol. 73, no. 3, September 1988 (1988-09-01), pages 417 - 423
BRITANOVA ET AL., J IMMUNOL, vol. 196, no. 12, 2016, pages 5005 - 5013
COLICELLI ET AL., MOL. GEN. GENET., vol. 199, 1985, pages 537 - 539
DUARTE J. ET AL., PLOS ONE, vol. 5, no. 5, 10 May 2010 (2010-05-10), pages e10558
FAHAM M. ET AL., ARTHRITIS RHEUMATOL., vol. 69, no. 4, 2017, pages 774 - 784
GUSTIN ET AL., BIOTECHNIQUES, vol. 14, 1993, pages 22
HAROON N ET AL., ARTHRITIS RHEUM., vol. 65, no. 10, October 2013 (2013-10-01), pages 2645 - 54
HELLING ET AL., IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY, vol. 93, no. 4, April 2015 (2015-04-01), pages 396 - 405
HOLLIGER P. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6444 - 6448
HUSTON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 5879 - 5883
KIPRIYANOV S.M. ET AL., HUMAN ANTIBODIES AND HYBRIDOMAS, vol. 6, 1995, pages 93 - 101
KIPRIYANOV S.M. ET AL., MOL. IMMUNOL., vol. 31, 1994, pages 1047 - 1058
KOMECH E ET AL.: "12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference", 3 September 2016, pages: 39
KONIG M. ET AL., FRONT IMMUNOL, vol. 7, 25 January 2016 (2016-01-25), pages 11
KOVALCHUK L. V. ET AL., IMMUNOLOGY: WORKSHOP, 2010, pages 176
KUHN C.WEINER L., IMMUNOTHERAPY, vol. 8, no. 8, July 2016 (2016-07-01), pages 889 - 906
LANG N.R., STIMULATION OF LYMPHOCYTES M.: MEDICINE, 1976, pages 288
LEFRANC M-P.: "The international ImMunoGeneTics information system", NUCL ACIDS RES, vol. 29, 2001, pages 207 - 209
PETERSEN J ET AL., J IMMUNOL., vol. 194, no. 12, 2015, pages 6112 - 22
POLJAKR.J. ET AL., STRUCTURE, vol. 2, 1994, pages 1121 - 1123
SAMBROOK ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, GREEN PUBLISHING ASSOCIATES, pages: 15.3 - 15.108
TAYLOR L.D. ET AL., NUCL. ACIDS RES., vol. 20, 1992, pages 6287 - 6295
TOYABE S ET AL., CLIN EXP IMMUNOL., vol. 134, no. 1, 2003, pages 92 - 97
TOYABE S ET AL.: "Biclonal expansion of T cells infected with monoclonal Epsteinvirus (EBV) in a patient with chronic, active EBV infection", CLINICAL & EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, vol. 134, no. 1, October 2003 (2003-10-01), pages 92 - 97, XP055622974 *
TURNER SJ ET AL., NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, vol. 6, 2006, pages 883 - 894
VAN DER HEIJDE D ET AL., ANN RHEUM DIS., vol. 70, no. 6, June 2011 (2011-06-01), pages 905 - 8
WARD ET AL., NATURE, vol. 341, 1989, pages 544 - 546
WURCH ET AL., METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 12, no. 9, 2004, pages 653 - 657
YE ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., 2013, pages W34 - 40
ZHIJUN LIU ET AL., DIABETES, vol. 61, no. 5, May 2012 (2012-05-01), pages 1160 - 1168

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
US11965025B2 (en) 2018-07-03 2024-04-23 Marengo Therapeutics, Inc. Method of treating solid cancers with bispecific interleukin-anti-TCRß molecules
US12286477B2 (en) 2018-07-03 2025-04-29 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
US12351632B2 (en) 2018-07-03 2025-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
JP2022515820A (ja) * 2018-12-25 2022-02-22 ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” ヒトｔｒｂｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体
JP7507160B2 (ja) 2018-12-25 2024-06-27 ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” ヒトｔｒｂｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体
EP3907239A4 (en) * 2018-12-25 2022-10-05 Joint Stock Company "Biocad" MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE BETA CHAIN REGION OF HUMAN TRBV9
US12227572B2 (en) 2018-12-25 2025-02-18 Joint Stock Company “Biocad” Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9
EP3904387A4 (en) * 2018-12-25 2022-09-07 Joint Stock Company "Biocad" MONOCLONAL ANTIBODIES THAT BIND SPECIFICALLY TO HUMAN TRBV9
US12297269B2 (en) 2018-12-25 2025-05-13 Joint Stock Company “Biocad” Monoclonal antibodies that bind specifically to human TRBV9
US12358982B2 (en) 2019-02-21 2025-07-15 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
US12384842B2 (en) 2019-02-21 2025-08-12 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
US12486326B2 (en) 2020-01-03 2025-12-02 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018398341A1 (en) 2020-07-30
JP2021509274A (ja) 2021-03-25
JP7339948B2 (ja) 2023-09-06
RU2017145662A (ru) 2019-06-25
RU2017145662A3 (ru) 2019-06-25
RU2694412C2 (ru) 2019-07-12
EA202091569A1 (ru) 2021-02-11
US11597767B2 (en) 2023-03-07
ZA202003858B (en) 2021-07-28
BR112020012959A2 (pt) 2020-12-01
RU2694412C9 (ru) 2019-09-18
ECSP20039728A (es) 2020-08-31
US20200332003A1 (en) 2020-10-22
JOP20200161A1 (ar) 2022-10-30
CA3086849A1 (en) 2019-07-04
MA50128B1 (fr) 2022-09-30
EP3733705A4 (en) 2021-09-01
CN111801354B (zh) 2024-08-30
KR102867660B1 (ko) 2025-10-15
PE20200927A1 (es) 2020-09-14
MA50128A1 (fr) 2021-07-29
AU2018398341B2 (en) 2025-10-23
US12514923B2 (en) 2026-01-06
CR20200324A (es) 2020-10-08
US20230357396A1 (en) 2023-11-09
CN111801354A (zh) 2020-10-20
JOP20200161B1 (ar) 2024-04-18
NZ766247A (en) 2025-05-02
MX2020006736A (es) 2020-08-24
NI202000051A (es) 2021-12-16
PH12020551012A1 (en) 2021-09-01
KR20200103774A (ko) 2020-09-02
CL2020001726A1 (es) 2021-03-05
EP3733705A1 (en) 2020-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111801354B (zh) 单克隆抗体及其使用方法
CN113646333B (zh) 针对人TRBV9的β链区域的单克隆抗体
CN113692412B (zh) 特异性地结合人trbv9的单克隆抗体
EA041880B1 (ru) Моноклональные антитела и способы их применения
HK40039968A (en) Monoclonal antibodies and methods for using same
HK40039968B (zh) 单克隆抗体及其使用方法
EA041932B1 (ru) Моноклональные антитела, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства trbv-9 т-клеточного рецептора человека, и способы их применения
HK40063875A (en) Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9
HK40064423A (en) Monoclonal antibodies that bind specifically to human trbv9
HK40064423B (zh) 特异性地结合人trbv9的单克隆抗体
HK40063875B (zh) 针对人TRBV9的β链区域的单克隆抗体
HK40070180A (en) Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9
EA042982B1 (ru) Моноклональные антитела против участка бета-цепи trbv9 человека

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18895626

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3086849

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020535637

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: NC2020/0007783

Country of ref document: CO

Ref document number: P6000961/2020

Country of ref document: AE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DZP2020000347

Country of ref document: DZ

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: NC2020/0007783

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20207021655

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018398341

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20181225

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018895626

Country of ref document: EP

Effective date: 20200727

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112020012959

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112020012959

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20200625

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: NC2020/0007783

Country of ref document: CO

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 766247

Country of ref document: NZ