WO2019160284A1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 뇌졸중 진단방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 뇌졸중 진단방법 Download PDF

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    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing stroke through bacterial metagenome analysis, and more specifically, to diagnose stroke by analyzing bacterial metagenomic analysis using a sample derived from a subject, analyzing the increase or decrease in the content of specific bacterial-derived extracellular vesicles. It is about how to.
  • Stroke apoplexy
  • CVA cerebrovascular accident
  • Stroke is largely classified into cerebral infarction and cerebral hemorrhage.
  • the brain takes up only 2% of the body's weight by weight, but the blood flow to the brain is 15% of cardiac output, and oxygen consumption is 20% of the body's total oxygen.
  • the brain uses only glucose as an energy source, so necrosis easily occurs even if the energy supply is interrupted for a while. Therefore, abnormalities in cerebral blood flow are closely related to brain damage.
  • the risk factors for stroke are known to be diverse, and are known as invariant risk factors for the elderly, men, family history of stroke, and African and Asian races, and transient risk factors such as transient ischemic attack, history of stroke, hypertension, and coronary artery stenosis.
  • Stroke is a disease with high mortality, expensive and time-consuming treatments, and easy treatment, even with treatment. Stroke also recurs largely after treatment. Therefore, prevention is important above all.
  • the symbiosis of the human body reaches 100 trillion times 10 times more than human cells, the number of genes of the microorganism is known to be more than 100 times the number of human genes.
  • a microbiota is a microbial community that includes bacteria, archaea, and eukarya that exist in a given settlement.
  • the intestinal microbiota plays an important role in human physiology.
  • it is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells.
  • the symbiotic bacteria secrete nanometer-sized vesicles to exchange information about genes and proteins in other cells.
  • the mucous membrane forms a physical protective film that particles larger than 200 nanometers (nm) in size can't pass through, so that the symbiotic bacteria cannot pass through the mucosa, but bacterial-derived vesicles are usually less than 100 nanometers in size. It freely speaks to the mucous membrane and is absorbed by our body.
  • Metagenomics also called environmental genomics, is an analysis of metagenomic data obtained from samples taken from the environment. Recently, it has become possible to list the bacterial composition of the human microflora by a method based on 16s ribosomal RNA (16s rRNA) sequencing. Next generation sequencing of 16s rDNA sequencing gene of 16s ribosomal RNA is performed. , NGS) platform.
  • NGS Next generation sequencing of 16s rDNA sequencing gene of 16s ribosomal RNA
  • the present inventors extracted the genes from the extracellular vesicles derived from bacteria present in the blood, which is a sample derived from the sample, and performed a metagenome analysis on them in order to diagnose the cause of the stroke and the risk of developing the disease in advance. To identify a bacterial-derived extracellular vesicle that can act as a bar, the present invention was completed based on this.
  • an object of the present invention is to provide a method for providing an information for diagnosing a stroke through a metagenome analysis of bacterial extracellular vesicles.
  • the present invention provides an information providing method for stroke diagnosis, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for diagnosing stroke, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for predicting the risk of stroke, comprising the following steps:
  • step (c) Deferribacteres (Deferribacteres), Woomi (Verrucomicrobia), Tenericutes (Tenericutes), Cyanobacteria, Bacteroidetes, Free archaeology
  • Deferribacteres Deferribacteres
  • Woomi Verymicrobia
  • Tenericutes Tenericutes
  • Cyanobacteria Bacteroidetes
  • Free archaeology The increase or decrease in the content of one or more phylum bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Euryarchaeota, TM7, Planctomycetes, GN02, and OD1 can be compared.
  • halobacteria Halobacteria
  • deferribacteres Verrucomicrobiae
  • chloroplast Chloroplast
  • Mollicutes erypsifel
  • erypsifel At least one class bacterium selected from the group consisting of Erysipelotrichi, Methanobacteria, Flavoacteriia, and Planctomycetia, TM7-1, and ZB2
  • the increase or decrease in the content of the derived extracellular vesicles can be compared.
  • halobacteriales Halobacteriales
  • Deferribacterales Streptophyta, Streptophyta, Rhodocyclales
  • Verrucomicrobiales Verrucomicrobiales
  • the increase or decrease in the content of one or more order bacterial-derived extracellular vesicles selected can be compared.
  • Termaccoccaceae Termaccoccaceae, Deferribacteraceae, Fuzobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rhodocyclaceae in step (c).
  • Verrucomicrobiaceae Oxalobacteraceae, Nocardioidaceae, Propionibacteriaceae, Pasteurellaaceae, Erie Erysipelotrichaceae, Corynebacteriaceae, Prevotellaceae, Comamonadaceae, Rikennellaceae, Odoribacteraceae, Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Alcaligenaceae, Methanobacteriaceae, Flavobacteriaceae, and Crio At least one selected from the group consisting of the Pacific (Cryomorphaceae) and (family) bacteria can be compared to increase or decrease the amount of cells derived from outside the package.
  • step (c) Ralstonia (Ralstonia), Zeobacillus (Geobacillus), Psychrobacter, Cupriavidus (Cupriavidus), Chromohalobacter (Chromohalobacter) , Dermacoccus, Enterobacter, Zeotgalicoccus, Mucispirillum, rc4-4, Fusobacterium, Citrobacter, Cicobacter (Citrobacter) Kocuria, Lactobacillus, Akkermansia, Adlercreutzia, Veillonella, Propionibacterium, Haemophilus, and Catenibacterium Catenibacterium, Klebsiella, Corynebacterium, Acinetobacter, Prevotella, Collinsella, Micrococcus, Methanobrevibacter ), Sutterella, Lacno Bacterium (Lachnobacterium), Limnohabitans, Polynucleobacter, Rhodobacter, Flavobacterium, Fluviicola
  • step (c) in the step (c), compared to the sample derived from normal,
  • Extracellular vesicles derived from one or more phylum bacteria selected from the group consisting of Bacteroidetes, Euryarchaeota, TM7, Planctomycetes, GN02, and OD1,
  • One or more class bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Methanobacteria, Flavoacteriia, and Planctomycetia, TM7-1, and ZB2,
  • Prevotellaceae Comamonadaceae, Rikennellaceae, Odoribacteraceae, Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Alkalizenash Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Alcaligenaceae, Methanobacteriaceae, Flavobacteriaceae, and Cryomorphaceae, or
  • Prevotella Collinsella, Micrococcus, Methanobrevibacter, Sutterella, Lachnobacterium, Limnohabitans, Polymnolbitans
  • At least one genus selected from the group consisting of Polynucleobacter, Rhodobacter, Flavobacterium, Flaviicola, and Candidatus Aquiluna Stroke can be diagnosed if the content of bacterial-derived extracellular vesicles is increased.
  • step (c) in the step (c), compared to the sample derived from normal,
  • Extracellular vesicles derived from one or more phylum bacteria selected from the group consisting of Deferribacteres, Verrucomicrobia, Tenericutes, and Cyanobacteria,
  • Halobacteriales Deferribacterales, Streptophyta, Rhodocyclales, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Pasteurales, and Pasteurellales, and Pasteurellales Extracellular vesicles derived from one or more order bacteria selected from the group consisting of Erysipelotrichales,
  • Dermacoccaceae Deferribacteraceae, Fuzobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rhodocyclaceae, Verrucomicrobiaceae, Oxalobactera Oxalobacteraceae, Nocardioidaceae, Propionibacteriaceae, Pasteurellaaceae, Erysipelotrichaceae, and Corynebacteria Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Corynebacteriaceae, or
  • a stroke can be diagnosed when the content of one or more genus bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Corynebacterium) and Acinetobacter is reduced.
  • step (c) in the step (c), compared to the sample derived from normal
  • Lactobacillus and propionibacterium genus bacteria can be diagnosed as a stroke if the contents of the vesicles are reduced.
  • step (c) in the step (c), compared to the sample derived from normal
  • Extracellular vesicles derived from one or more phylum bacteria selected from the group consisting of Bacteroidetes, Euryarchaeota, and Planctomycetes,
  • One or more class bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Methanobacteria, Flavoacteriia, and Planctomycetia,
  • Prevotellaceae Comamonadaceae, Rikennellaceae, Odoribacteraceae, Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Alkalizenash Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Alcaligenaceae, Methanobacteriaceae, Flavobacteriaceae, and Cryomorphaceae, or
  • step (c) in the step (c), compared to the sample derived from normal
  • Extracellular vesicles derived from one or more phylum bacteria selected from the group consisting of Deferribacteres, Verrucomicrobia, Tenericutes, and Cyanobacteria,
  • Halobacteriales Deferribacterales, Streptophyta, Rhodocyclales, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Pasteurales, and Pasteurellales, and Pasteurellales Extracellular vesicles derived from one or more order bacteria selected from the group consisting of Erysipelotrichales,
  • Dermacoccaceae Deferribacteraceae, Fuzobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rhodocyclaceae, Verrucomicrobiaceae, Oxalobactera Oxalobacteraceae, Nocardioidaceae, Propionibacteriaceae, Pasteurellaaceae, Erysipelotrichaceae, and Corynebacteria Extracellular vesicles derived from one or more family bacteria selected from the group consisting of Corynebacteriaceae, or
  • the subject sample may be blood.
  • the blood may be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes.
  • Extracellular vesicles secreted from the bacteria present in the environment can be absorbed directly into the body and have a direct effect on the development of inflammation, stroke is difficult to diagnose early because symptoms are difficult to efficiently treat the human-derived sample according to the present invention
  • Metagenome analysis of extracellular vesicles derived from bacteria can be used to diagnose the cause of stroke and the risk of developing disease in advance, so that the risk group of stroke can be diagnosed early, and proper management can be delayed or prevented. Early diagnosis can reduce the incidence of stroke and increase the therapeutic effect.
  • metagenome analysis in patients diagnosed with stroke may improve the course of the disease or prevent recurrence by avoiding causal agent exposure.
  • Figure 1a is a photograph of the distribution of bacteria and vesicles by time after the oral administration of enteric bacteria and bacteria-derived vesicles (EV) to the mouse
  • Figure 1b is 12 hours after oral administration, blood And several organs were extracted to evaluate the distribution of bacteria and vesicles in the body.
  • Figure 2 is a result of showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level by separating bacteria-derived vesicles from stroke patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • Figure 3 is a result of showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the class level by separating bacteria-derived vesicles from stroke patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • Figure 4 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the order (neck) level after separation of bacteria-derived vesicles in stroke patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 5 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level by separating the bacteria-derived vesicles from stroke patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 6 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at genus levels after isolation of bacteria-derived vesicles from stroke patients and normal blood.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • the present invention relates to a method for diagnosing stroke through bacterial metagenome analysis.
  • the present inventors extracted a gene from a bacterial-derived extracellular vesicle using a sample derived from a subject, and performed a metagenome analysis on it.
  • Bacterial-derived extracellular vesicles that can act as
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the extracellular vesicles isolated from the subject sample;
  • (C) provides an information providing method for diagnosing a stroke comprising the step of comparing the increase and decrease of the content of bacteria and archaea-derived extracellular vesicles and the normal-derived sample through the sequencing of the PCR product.
  • stroke diagnosis refers to determining whether a stroke is likely to develop, whether the stroke is relatively high, or whether a stroke has already occurred.
  • the method of the present invention can be used to prevent or delay the onset of the disease through special and appropriate management as a patient at high risk of stroke for any particular patient.
  • the methods of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of stroke and selecting the most appropriate treatment regimen.
  • metagenome used in the present invention, also referred to as “metagenome”, refers to the total of the genome including all viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated area such as soil, animal intestine, It is mainly used as a concept of genome explaining the identification of many microorganisms at once using sequencer to analyze microorganisms which are not cultured.
  • metagenome does not refer to one species of genome or genome, but refers to a kind of mixed dielectric as the genome of all species of one environmental unit. This is a term from the point of view of defining a species in the course of the evolution of biology in terms of functional species as well as various species that interact with each other to create a complete species.
  • rapid sequencing is used to analyze all DNA and RNA, regardless of species, to identify all species in one environment, and to identify interactions and metabolism.
  • metagenome analysis was preferably performed using bacterial-derived extracellular vesicles isolated from serum.
  • bacterial vesicle includes, but is not limited to, extracellular vesicles secreted by bacteria and archaea.
  • the subject sample may be blood, and the blood may preferably be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes, but is not limited thereto.
  • the metagenome analysis of the bacterial-derived extracellular vesicles was performed, and analyzed at the phylum, class, order, family, and genus levels, respectively. We identified bacterial vesicles that could actually act as a cause of stroke.
  • the bacterial metagenome of the vesicles present in the blood samples from the subject at the gate level Deferribacteres, Verrucomicrobia, Tenericutes, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Euryarchaeota, TM7, Planctomycetes, GN02, And the content of extracellular vesicles derived from OD1 bacteria was significantly different between stroke patients and normal individuals (see Example 4).
  • TM7-1, and ZB2 strong bacteria-derived extracellular vesicles were significantly different between stroke patients and normal individuals (see Example 4).
  • the bacterial metagenome was analyzed at the neck level for vesicles present in a blood sample derived from a subject, Halobacteriales, Deferribacterales, Streptophyta, Rhodocyclales, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Pasteurellales, Erysipelotrichales, Methanobacteriales, There was a significant difference in the content of Legionellales, Flavobacteriales neck bacteria-derived extracellular vesicles between stroke patients and normal individuals (see Example 4).
  • the present invention as a result of analyzing the bacterial metagenome at the excessive level for the vesicles present in the blood samples derived from the subject, Dermacoccaceae, Deferribacteraceae, Fusobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rhodocyclaceae, Verrucomicrobiaceae, Oxalobacteraceae, Nocardioidaceae, Propionibacteriaceae, Pasteurellaceae, Erysipelotrichaceae, Corynebacteriaceae, Prevotellaceae, Comamonadaceae, Rikenellaceae. 4).
  • the fluorescently labeled 50 ⁇ g of bacteria and bacteria-derived vesicles were administered in the same manner as above 12 hours.
  • Blood, Heart, Lung, Liver, Kidney, Spleen, Adipose tissue, and Muscle were extracted from mice.
  • the intestinal bacteria (Bacteria) were not absorbed into each organ, whereas the intestinal bacteria-derived extracellular vesicles (EV) were detected in the tissues, as shown in FIG. And distribution in liver, kidney, spleen, adipose tissue, and muscle.
  • the blood was first placed in a 10 ml tube and centrifuged (3,500 ⁇ g, 10 min, 4 ° C.) to settle the suspended solids to recover only the supernatant and then transferred to a new 10 ml tube. After removing the bacteria and foreign substances from the recovered supernatant using a 0.22 ⁇ m filter, transfer to centripreigugal filters (50 kD) and centrifuged at 1500 xg, 4 °C for 15 minutes to discard the material smaller than 50 kD and 10 ml Concentrated until.
  • centripreigugal filters 50 kD
  • PCR was performed using the 16S rDNA primer shown in Table 1 to amplify the gene and perform sequencing (Illumina MiSeq sequencer). Output the result as a Standard Flowgram Format (SFF) file, convert the SFF file into a sequence file (.fasta) and a nucleotide quality score file using GS FLX software (v2.9), check the credit rating of the lead, and window (20 bps) The part with mean base call accuracy of less than 99% (Phred score ⁇ 20) was removed.
  • SFF Standard Flowgram Format
  • the Operational Taxonomy Unit performed UCLUST and USEARCH for clustering according to sequence similarity. Specifically, the clustering is based on 94% genus, 90% family, 85% order, 80% class, and 75% sequence similarity. OTU's door, river, neck, family and genus level classifications were performed, and bacteria with greater than 97% sequence similarity were analyzed using BLASTN and GreenGenes' 16S DNA sequence database (108,453 sequences) (QIIME).
  • Example 3 By the method of Example 3, vesicles were isolated from blood of 115 stroke patients and 109 healthy subjects who matched age and gender, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test, and then the logistic regression analysis method is used for AUC (area). under curve), sensitivity, and specificity.
  • Bacterial-derived vesicles in the blood were analyzed at the phylum level, resulting in strokes when developing diagnostic models with Deferribacteres, Verrucomicrobia, Tenericutes, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Euryarchaeota, TM7, Planctomycetes, GN02, and OD1 door bacterial biomarkers Diagnostic performance was significant (see Table 2 and FIG. 2).
  • Veillonella Propionibacterium, Haemophilus, Catenibacterium, Klebsiella, Corynebacterium, Acinetobacter, Prevotella, Collinsella, Micrococcus, Methanobrevibacter, Sutterella, Lachnobacterium, Limnohabitans, Polynucleobacter, Rhodobacter, Flavobacola luna, and Flumobacterium, , Diagnostic performance for stroke was significant (see Table 6 and FIG. 6).
  • the method for providing information on stroke diagnosis through bacterial metagenomic analysis performs bacterial metagenomic analysis using a subject-derived sample to analyze the increase and decrease of specific bacterial-derived extracellular vesicles to determine the risk of stroke. It can be used to predict and diagnose stroke.

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Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것이다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 뇌졸중은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 뇌졸중의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 뇌졸중의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 뇌졸중 진단방법
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것이다.
뇌졸중(腦卒中, stroke, apoplexy)은 뇌혈류 이상으로 인해 갑작스레 유발된 국소적인 신경학적 결손 증상을 통칭하는 말이다. 뇌졸중은 증상에 대한 용어로서, 의학적인 질병으로 칭할 때에는 뇌혈관질환(腦血管疾患, cerebrovascular accident, 줄여서 CVA)이라고 한다. 미국에서는 cerebrovascular stroke이라고 한다. 한의학적인 표현을 빌려, 흔히 중풍(中風)이라고 부르기도 하지만, 중풍이라는 말은 좀 더 광의의 표현이다. 뇌졸중은 크게 뇌경색과 뇌출혈로 분류된다.
뇌는 몸 전체에서 무게로는 체중의 2%만 차지하지만, 뇌로 가는 혈류량은 심박출량의 15%나 되고, 산소 소모량은 몸 전체 산소 소모량의 20%나 된다. 게다가 뇌는 에너지원으로 포도당만을 사용하므로 에너지 공급이 잠시만 중단되어도 쉽게 괴사가 일어난다. 따라서 뇌혈류의 이상은 뇌손상과 밀접한 관련이 있다. 뇌졸중의 위험인자는 다양하다고, 알려져 있는데, 불변성 위험인자로서 고령, 남성, 뇌졸중의 가족력, 및 아프리카 및 아시아계 인종 등이 알려져 있고, 가변성 위험인자로서 일과성 허혈성 발작, 뇌졸중의 병력, 고혈압, 관상동맥 협착, 당뇨병, 흡연, 심근 경색, 심방 세동, 울혈성 심부전의 병력, 좌심실 부전, 과도한 알코올 섭취, 혈액응고질환 등이 거론된다. 뇌졸중은 사망률이 높고, 치료에 많은 비용과 시간이 들어가며, 치료한다고 하여도 장애를 남기기 쉬운 질환이다. 또한 뇌졸중은 치료 후에도 상당수가 재발한다. 따라서 무엇보다도 예방이 중요하다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다. 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다. 그러나 뇌졸중 발병에 있어서, 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중의 원인인자를 동정하고 뇌졸중을 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 뇌졸중의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 피검체 유래 샘플인 혈액에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 뇌졸중의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌졸중 진단방법을 제공한다:
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌졸중의 발병 위험도 예측방법을 제공한다:
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 탈철간균문(Deferribacteres), 우미균문(Verrucomicrobia), 테네리쿠테스(Tenericutes), 남세균문(Cyanobacteria), 의간균문(Bacteroidetes), 유리고세균문(Euryarchaeota), TM7, 부유균문(Planctomycetes), GN02, 및 OD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 할로박테리아(Halobacteria), 탈철간균강(Deferribacteres), 우미균강(Verrucomicrobiae), 클로로플라스트(Chloroplast), 몰리쿠테스(Mollicutes), 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi), 메타노박테리아(Methanobacteria), 플라보박테리아(Flavobacteriia), 및 플란크토마이세티아(Planctomycetia), TM7-1, 및 ZB2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 할로박테리아레스(Halobacteriales), 탈철간균목(Deferribacterales), 스트렙토피타(Streptophyta), 로도사이클러스(Rhodocyclales), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케치아레스(Rickettsiales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales), 메타노박테리아레스(Methanobacteriales), 레지오넬라레스(Legionellales), 및 플라보박테리아레스(Flavobacteriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 테르마코카시에(Dermacoccaceae), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 푸조박테리아시에(Fusobacteriaceae), 유산균과(Lactobacillaceae), 로도사이클라시에(Rhodocyclaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 프로피오니박테리아시에(Propionibacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프레보텔라과(Prevotellaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 오도리박테라시에(Odoribacteraceae), 마이크로코카시에(Micrococcaceae), 마이크로박테리아시에(Microbacteriaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 메타노박테리아시에(Methanobacteriaceae), 플라보박테리아시에(Flavobacteriaceae), 및 크리오모파시에(Cryomorphaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 랄스토니아(Ralstonia), 제오바실러스(Geobacillus), 사이크로박터(Psychrobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 크로모하로박터(Chromohalobacter), 데르마코커스(Dermacoccus), 엔테로박터(Enterobacter), 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus), 무시스피릴룸(Mucispirillum), rc4-4, 푸조박테리움(Fusobacterium), 시트로박터(Citrobacter), 코쿠리아(Kocuria), 유산균속(Lactobacillus), 아케르만시아(Akkermansia), 아들러크레우치아(Adlercreutzia), 베일로넬라(Veillonella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 프레보텔라(Prevotella), 콜린셀라(Collinsella), 마이크로코커스(Micrococcus), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 수테렐라(Sutterella), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 림노하비탄스(Limnohabitans), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter), 로도박터(Rhodobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium), 플루비콜라(Fluviicola), 및 캔디다투스 아쿠일루나(Candidatus Aquiluna)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
의간균문(Bacteroidetes), 유리고세균문(Euryarchaeota), TM7, 부유균문(Planctomycetes), GN02, 및 OD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
메타노박테리아(Methanobacteria), 플라보박테리아(Flavobacteriia), 및 플란크토마이세티아(Planctomycetia), TM7-1, 및 ZB2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
메타노박테리아레스(Methanobacteriales), 레지오넬라레스(Legionellales), 및 플라보박테리아레스(Flavobacteriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
프레보텔라과(Prevotellaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 오도리박테라시에(Odoribacteraceae), 마이크로코카시에(Micrococcaceae), 마이크로박테리아시에(Microbacteriaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 메타노박테리아시에(Methanobacteriaceae), 플라보박테리아시에(Flavobacteriaceae), 및 크리오모파시에(Cryomorphaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
프레보텔라(Prevotella), 콜린셀라(Collinsella), 마이크로코커스(Micrococcus), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 수테렐라(Sutterella), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 림노하비탄스(Limnohabitans), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter), 로도박터(Rhodobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium), 플루비콜라(Fluviicola), 및 캔디다투스 아쿠일루나(Candidatus Aquiluna)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 뇌졸중으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
탈철간균문(Deferribacteres), 우미균문(Verrucomicrobia), 테네리쿠테스(Tenericutes), 및 남세균문(Cyanobacteria)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
할로박테리아(Halobacteria), 탈철간균강(Deferribacteres), 우미균강(Verrucomicrobiae), 클로로플라스트(Chloroplast), 몰리쿠테스(Mollicutes), 및 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
할로박테리아레스(Halobacteriales), 탈철간균목(Deferribacterales), 스트렙토피타(Streptophyta), 로도사이클러스(Rhodocyclales), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케치아레스(Rickettsiales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
테르마코카시에(Dermacoccaceae), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 푸조박테리아시에(Fusobacteriaceae), 유산균과(Lactobacillaceae), 로도사이클라시에(Rhodocyclaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 프로피오니박테리아시에(Propionibacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), 및 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
랄스토니아(Ralstonia), 제오바실러스(Geobacillus), 사이크로박터(Psychrobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 크로모하로박터(Chromohalobacter), 데르마코커스(Dermacoccus), 엔테로박터(Enterobacter), 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus), 무시스피릴룸(Mucispirillum), rc4-4, 푸조박테리움(Fusobacterium), 시트로박터(Citrobacter), 코쿠리아(Kocuria), 유산균속(Lactobacillus), 아케르만시아(Akkermansia), 아들러크레우치아(Adlercreutzia), 베일로넬라(Veillonella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 및 아시네토박터(Acinetobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌졸중으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
콜린셀라(Collinsella) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
유산균속(Lactobacillus) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌졸중으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
콜린셀라(Collinsella) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
유산균속(Lactobacillus) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있으며;
의간균문(Bacteroidetes), 유리고세균문(Euryarchaeota), 및 부유균문(Planctomycetes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
메타노박테리아(Methanobacteria), 플라보박테리아(Flavobacteriia), 및 플란크토마이세티아(Planctomycetia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
메타노박테리아레스(Methanobacteriales),레지오넬라레스(Legionellales), 및 플라보박테리아레스(Flavobacteriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
프레보텔라과(Prevotellaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 오도리박테라시에(Odoribacteraceae), 마이크로코카시에(Micrococcaceae), 마이크로박테리아시에(Microbacteriaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 메타노박테리아시에(Methanobacteriaceae), 플라보박테리아시에(Flavobacteriaceae), 및 크리오모파시에(Cryomorphaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
프레보텔라(Prevotella), 마이크로코커스(Micrococcus), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 수테렐라(Sutterella), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 림노하비탄스(Limnohabitans), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter), 로도박터(Rhodobacter), 플루비콜라(Fluviicola), 및 캔디다투스 아쿠일루나(Candidatus Aquiluna)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 뇌졸중으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
콜린셀라(Collinsella) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
유산균속(Lactobacillus) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있으며;
탈철간균문(Deferribacteres), 우미균문(Verrucomicrobia), 테네리쿠테스(Tenericutes), 및 남세균문(Cyanobacteria)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
할로박테리아(Halobacteria), 탈철간균강(Deferribacteres), 우미균강(Verrucomicrobiae), 클로로플라스트(Chloroplast), 몰리쿠테스(Mollicutes), 및 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
할로박테리아레스(Halobacteriales), 탈철간균목(Deferribacterales), 스트렙토피타(Streptophyta), 로도사이클러스(Rhodocyclales), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케치아레스(Rickettsiales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
테르마코카시에(Dermacoccaceae), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 푸조박테리아시에(Fusobacteriaceae), 유산균과(Lactobacillaceae), 로도사이클라시에(Rhodocyclaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 프로피오니박테리아시에(Propionibacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), 및 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
랄스토니아(Ralstonia), 제오바실러스(Geobacillus), 사이크로박터(Psychrobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 크로모하로박터(Chromohalobacter), 데르마코커스(Dermacoccus), 엔테로박터(Enterobacter), 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus), 무시스피릴룸(Mucispirillum), 푸조박테리움(Fusobacterium), 시트로박터(Citrobacter), 코쿠리아(Kocuria), 아케르만시아(Akkermansia), 아들러크레우치아(Adlercreutzia), 베일로넬라(Veillonella), 헤모필루스(Haemophilus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 및 아시네토박터(Acinetobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 뇌졸중으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피검체 샘플은 혈액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 뇌졸중은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 뇌졸중의 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 뇌졸중의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 뇌졸중으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.
도 1a는, 마우스에 장내 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 혈액 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 뇌졸중환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 뇌졸중환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 뇌졸중환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 뇌졸중환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 뇌졸중환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 뇌졸중의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 및 고세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 뇌졸중을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "뇌졸중 진단" 이란 환자에 대하여 뇌졸중이 발병할 가능성이 있는지, 뇌졸중이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 뇌졸중이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 뇌졸중 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 뇌졸중을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "세균 유래 소포"란 세균 및 고세균에서 분비되는 세포밖 소포를 포함하나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 피검체 샘플은 혈액일 수 있고, 상기 혈액은 바람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 뇌졸중 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Deferribacteres, Verrucomicrobia, Tenericutes, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Euryarchaeota, TM7, Planctomycetes, GN02, 및 OD1 문 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌졸중환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Halobacteria, Deferribacteres, Verrucomicrobiae, Chloroplast, Mollicutes, Erysipelotrichi, Methanobacteria, Flavobacteriia, Planctomycetia, TM7-1, 및 ZB2 강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌졸중환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Halobacteriales, Deferribacterales, Streptophyta, Rhodocyclales, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Pasteurellales, Erysipelotrichales, Methanobacteriales, Legionellales, 및 Flavobacteriales 목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌졸중환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Dermacoccaceae, Deferribacteraceae, Fusobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rhodocyclaceae, Verrucomicrobiaceae, Oxalobacteraceae, Nocardioidaceae, Propionibacteriaceae, Pasteurellaceae, Erysipelotrichaceae, Corynebacteriaceae, Prevotellaceae, Comamonadaceae, Rikenellaceae, Odoribacteraceae, Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Alcaligenaceae, Methanobacteriaceae, Flavobacteriaceae, 및 Cryomorphaceae 과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌졸중환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Ralstonia, Geobacillus, Psychrobacter, Cupriavidus, Chromohalobacter, Dermacoccus, Enterobacter, Jeotgalicoccus, Mucispirillum, rc4-4, Fusobacterium, Citrobacter, Kocuria, Lactobacillus, Akkermansia, Adlercreutzia, Veillonella, Propionibacterium, Haemophilus, Catenibacterium, Klebsiella, Corynebacterium, Acinetobacter, Prevotella, Collinsella, Micrococcus, Methanobrevibacter, Sutterella, Lachnobacterium, Limnohabitans, Polynucleobacter, Rhodobacter, Flavobacterium, Fluviicola, 및 Candidatus Aquiluna 속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 뇌졸중환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 뇌졸중 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 혈액(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 혈액으로부터 소포 분리 및 DNA 추출
혈액으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
실시예 3. 혈액에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 4. 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 뇌졸중 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 뇌졸중환자 115명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 109명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Deferribacteres, Verrucomicrobia, Tenericutes, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Euryarchaeota, TM7, Planctomycetes, GN02, 및 OD1 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌졸중에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).
　 대조군 뇌졸중 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
p__Deferribacteres 0.0020 0.0041 0.0001 0.0007 0.0000 0.03 0.66 0.31 0.89 0.61 0.53 0.89
p__Verrucomicrobia 0.0314 0.0441 0.0057 0.0185 0.0000 0.18 0.85 0.70 0.86 0.77 0.59 0.81
p__Tenericutes 0.0016 0.0036 0.0004 0.0015 0.0015 0.23 0.67 0.53 0.77 0.48 0.34 0.67
p__Cyanobacteria 0.0281 0.0622 0.0073 0.0298 0.0020 0.26 0.64 0.40 0.75 0.48 0.38 0.58
p__Bacteroidetes 0.0823 0.0642 0.1912 0.1502 0.0000 2.32 0.69 0.81 0.58 0.70 0.84 0.58
p__Euryarchaeota 0.0009 0.0026 0.0032 0.0077 0.0029 3.48 0.61 0.58 0.52 0.40 0.50 0.33
p__TM7 0.0021 0.0048 0.0083 0.0167 0.0002 3.99 0.61 0.75 0.44 0.68 0.66 0.56
p__Planctomycetes 0.0001 0.0006 0.0024 0.0064 0.0003 20.57 0.68 0.75 0.47 0.50 0.59 0.42
p__GN02 0.0000 0.0000 0.0005 0.0020 0.0099 111.46 0.64 0.62 0.52 0.38 0.53 0.25
p__OD1 0.0000 0.0002 0.0077 0.0129 0.0000 196.93 0.83 0.96 0.61 0.75 1.00 0.58
혈액 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Halobacteria, Deferribacteres, Verrucomicrobiae, Chloroplast, Mollicutes, Erysipelotrichi, Methanobacteria, Flavobacteriia, Planctomycetia, TM7-1, 및 ZB2 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌졸중에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).
　 대조군 뇌졸중 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
c__Halobacteria 0.0005 0.0020 0.0000 0.0000 0.0069 0.00 0.59 0.15 1.00 0.47 0.03 1.00
c__Deferribacteres 0.0020 0.0041 0.0001 0.0007 0.0000 0.03 0.71 0.32 0.99 0.61 0.21 1.00
c__Verrucomicrobiae 0.0311 0.0439 0.0053 0.0184 0.0000 0.17 0.84 0.55 0.90 0.84 0.56 0.91
c__Chloroplast 0.0269 0.0622 0.0062 0.0296 0.0020 0.23 0.71 0.35 0.93 0.68 0.47 0.88
c__Mollicutes 0.0016 0.0036 0.0004 0.0015 0.0017 0.24 0.65 0.29 0.88 0.69 0.38 0.91
c__Erysipelotrichi 0.0056 0.0104 0.0018 0.0054 0.0010 0.33 0.61 0.29 0.86 0.69 0.41 0.94
c__Methanobacteria 0.0004 0.0017 0.0032 0.0077 0.0002 7.88 0.60 0.83 0.31 0.55 0.88 0.26
c__Flavobacteriia 0.0057 0.0082 0.0688 0.0915 0.0000 12.12 0.71 0.89 0.54 0.61 0.94 0.47
c__Planctomycetia 0.0001 0.0006 0.0021 0.0063 0.0008 21.55 0.61 0.97 0.25 0.57 0.94 0.24
c__TM7-1 0.0000 0.0004 0.0068 0.0166 0.0000 174.14 0.71 0.95 0.37 0.81 0.91 0.59
c__ZB2 0.0000 0.0001 0.0063 0.0112 0.0000 530.99 0.81 0.97 0.53 0.75 1.00 0.50
혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Halobacteriales, Deferribacterales, Streptophyta, Rhodocyclales, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Pasteurellales, Erysipelotrichales, Methanobacteriales, Legionellales, 및 Flavobacteriales 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌졸중에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).
　 대조군 뇌졸중 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
o__Halobacteriales 0.0005 0.0020 0.0000 0.0000 0.0069 0.00 0.60 0.43 0.70 0.48 0.44 0.44
o__Deferribacterales 0.0020 0.0041 0.0001 0.0007 0.0000 0.03 0.66 0.31 0.89 0.61 0.53 0.89
o__Streptophyta 0.0263 0.0622 0.0025 0.0132 0.0002 0.10 0.75 0.40 0.89 0.68 0.41 0.92
o__Rhodocyclales 0.0015 0.0045 0.0002 0.0010 0.0056 0.15 0.61 0.48 0.67 0.43 0.38 0.47
o__Verrucomicrobiales 0.0311 0.0439 0.0053 0.0184 0.0000 0.17 0.87 0.71 0.89 0.80 0.59 0.78
o__Rickettsiales 0.0019 0.0058 0.0004 0.0015 0.0068 0.18 0.61 0.40 0.71 0.44 0.34 0.67
o__Pasteurellales 0.0046 0.0070 0.0012 0.0037 0.0000 0.27 0.72 0.44 0.84 0.62 0.50 0.81
o__Erysipelotrichales 0.0056 0.0104 0.0018 0.0054 0.0010 0.33 0.72 0.53 0.80 0.46 0.31 0.67
o__Methanobacteriales 0.0004 0.0017 0.0032 0.0077 0.0002 7.88 0.64 0.66 0.52 0.43 0.56 0.33
o__Legionellales 0.0001 0.0003 0.0006 0.0018 0.0033 10.46 0.63 0.66 0.47 0.45 0.56 0.36
o__Flavobacteriales 0.0057 0.0082 0.0688 0.0915 0.0000 12.12 0.75 0.88 0.51 0.66 0.84 0.56
혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Dermacoccaceae, Deferribacteraceae, Fusobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rhodocyclaceae, Verrucomicrobiaceae, Oxalobacteraceae, Nocardioidaceae, Propionibacteriaceae, Pasteurellaceae, Erysipelotrichaceae, Corynebacteriaceae, Prevotellaceae, Comamonadaceae, Rikenellaceae, Odoribacteraceae, Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Alcaligenaceae, Methanobacteriaceae, Flavobacteriaceae, 및 Cryomorphaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌졸중에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).
　 대조군 뇌졸중 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
f__Dermacoccaceae 0.0009 0.0025 0.0000 0.0001 0.0002 0.01 0.69 0.40 0.85 0.53 0.44 0.81
f__Deferribacteraceae 0.0020 0.0041 0.0001 0.0007 0.0000 0.03 0.66 0.31 0.89 0.61 0.53 0.89
f__Fusobacteriaceae 0.0018 0.0064 0.0001 0.0008 0.0071 0.06 0.69 0.34 0.89 0.54 0.34 0.83
f__Lactobacillaceae 0.0369 0.0355 0.0047 0.0225 0.0000 0.13 0.90 0.69 0.94 0.94 0.66 1.00
f__Rhodocyclaceae 0.0015 0.0045 0.0002 0.0010 0.0056 0.15 0.61 0.48 0.67 0.43 0.38 0.47
f__Verrucomicrobiaceae 0.0311 0.0439 0.0053 0.0184 0.0000 0.17 0.87 0.71 0.89 0.80 0.59 0.78
f__Oxalobacteraceae 0.0148 0.0348 0.0025 0.0062 0.0004 0.17 0.66 0.48 0.76 0.55 0.34 0.83
f__Nocardioidaceae 0.0010 0.0023 0.0002 0.0012 0.0013 0.20 0.67 0.42 0.81 0.59 0.50 0.75
f__Propionibacteriaceae 0.0264 0.0325 0.0060 0.0110 0.0000 0.23 0.76 0.49 0.86 0.75 0.63 0.86
f__Pasteurellaceae 0.0046 0.0070 0.0012 0.0037 0.0000 0.27 0.72 0.45 0.84 0.62 0.50 0.81
f__Erysipelotrichaceae 0.0056 0.0104 0.0018 0.0054 0.0010 0.33 0.72 0.53 0.80 0.46 0.31 0.67
f__Corynebacteriaceae 0.0504 0.0848 0.0225 0.0305 0.0016 0.45 0.65 0.48 0.71 0.53 0.38 0.69
f__Prevotellaceae 0.0174 0.0471 0.0407 0.0561 0.0010 2.34 0.63 0.61 0.57 0.51 0.47 0.47
f__Comamonadaceae 0.0082 0.0136 0.0234 0.0344 0.0000 2.86 0.66 0.74 0.49 0.49 0.63 0.39
f__Rikenellaceae 0.0018 0.0048 0.0060 0.0119 0.0007 3.35 0.61 0.65 0.54 0.42 0.41 0.36
f__Odoribacteraceae 0.0007 0.0022 0.0023 0.0058 0.0060 3.45 0.61 0.55 0.57 0.39 0.41 0.28
f__Micrococcaceae 0.0133 0.0156 0.0484 0.0539 0.0000 3.62 0.72 0.81 0.56 0.67 0.78 0.61
f__Microbacteriaceae 0.0022 0.0155 0.0099 0.0153 0.0002 4.58 0.71 0.74 0.56 0.57 0.59 0.44
f__Alcaligenaceae 0.0006 0.0020 0.0037 0.0105 0.0022 6.62 0.60 0.58 0.52 0.44 0.53 0.33
f__Methanobacteriaceae 0.0004 0.0017 0.0032 0.0077 0.0002 7.88 0.64 0.66 0.52 0.43 0.56 0.33
f__Flavobacteriaceae 0.0011 0.0024 0.0628 0.0883 0.0000 58.92 0.80 0.94 0.54 0.67 0.84 0.53
f__Cryomorphaceae 0.0000 0.0000 0.0029 0.0068 0.0000 >100 0.73 0.92 0.41 0.56 0.81 0.39
혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Ralstonia, Geobacillus, Psychrobacter, Cupriavidus, Chromohalobacter, Dermacoccus, Enterobacter, Jeotgalicoccus, Mucispirillum, rc4-4, Fusobacterium, Citrobacter, Kocuria, Lactobacillus, Akkermansia, Adlercreutzia, Veillonella, Propionibacterium, Haemophilus, Catenibacterium, Klebsiella, Corynebacterium, Acinetobacter, Prevotella, Collinsella, Micrococcus, Methanobrevibacter, Sutterella, Lachnobacterium, Limnohabitans, Polynucleobacter, Rhodobacter, Flavobacterium, Fluviicola, 및 Candidatus Aquiluna 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 뇌졸중에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).
　 대조군 뇌졸중 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
g__Ralstonia 0.0014 0.0049 0.0000 0.0000 0.0022 0.00 0.67 0.42 0.85 0.49 0.31 0.75
g__Geobacillus 0.0014 0.0044 0.0000 0.0000 0.0015 0.00 0.69 0.32 0.92 0.42 0.19 0.92
g__Psychrobacter 0.0005 0.0017 0.0000 0.0000 0.0025 0.00 0.63 0.26 0.89 0.52 0.34 0.86
g__Cupriavidus 0.0099 0.0310 0.0001 0.0006 0.0013 0.01 0.74 0.48 0.90 0.60 0.31 0.92
g__Chromohalobacter 0.0024 0.0059 0.0000 0.0002 0.0001 0.01 0.64 0.25 0.94 0.56 0.41 0.92
g__Dermacoccus 0.0009 0.0025 0.0000 0.0001 0.0002 0.01 0.69 0.40 0.85 0.53 0.44 0.81
g__Enterobacter 0.0037 0.0140 0.0000 0.0002 0.0073 0.01 0.72 0.40 0.94 0.57 0.44 0.94
g__Jeotgalicoccus 0.0006 0.0017 0.0000 0.0001 0.0004 0.01 0.70 0.36 0.91 0.41 0.09 0.94
g__Mucispirillum 0.0020 0.0041 0.0001 0.0007 0.0000 0.03 0.66 0.31 0.89 0.61 0.53 0.89
g__rc4-4 0.0017 0.0055 0.0001 0.0008 0.0024 0.04 0.67 0.25 0.99 0.57 0.31 1.00
g__Fusobacterium 0.0018 0.0064 0.0001 0.0008 0.0072 0.06 0.69 0.34 0.89 0.54 0.34 0.83
g__Citrobacter 0.0078 0.0112 0.0005 0.0025 0.0000 0.06 0.82 0.55 0.90 0.71 0.44 1.00
g__Kocuria 0.0007 0.0017 0.0001 0.0007 0.0005 0.11 0.67 0.30 0.92 0.59 0.31 0.94
g__Lactobacillus 0.0361 0.0354 0.0046 0.0225 0.0000 0.13 0.89 0.68 0.94 0.94 0.69 1.00
g__Akkermansia 0.0311 0.0439 0.0050 0.0184 0.0000 0.16 0.88 0.71 0.90 0.81 0.63 0.78
g__Adlercreutzia 0.0019 0.0039 0.0003 0.0020 0.0002 0.16 0.74 0.38 0.95 0.51 0.25 0.94
g__Veillonella 0.0062 0.0181 0.0011 0.0035 0.0047 0.17 0.70 0.45 0.82 0.49 0.31 0.83
g__Propionibacterium 0.0264 0.0325 0.0060 0.0110 0.0000 0.23 0.76 0.49 0.86 0.75 0.63 0.86
g__Haemophilus 0.0041 0.0067 0.0010 0.0032 0.0000 0.25 0.72 0.43 0.84 0.61 0.50 0.81
g__Catenibacterium 0.0030 0.0071 0.0008 0.0042 0.0054 0.26 0.67 0.60 0.70 0.42 0.31 0.47
g__Klebsiella 0.0068 0.0125 0.0019 0.0059 0.0003 0.27 0.72 0.52 0.85 0.53 0.31 0.83
g__Corynebacterium 0.0504 0.0848 0.0225 0.0305 0.0016 0.45 0.65 0.48 0.71 0.53 0.38 0.69
g__Acinetobacter 0.0594 0.0803 0.0280 0.0573 0.0010 0.47 0.66 0.47 0.68 0.49 0.41 0.67
g__Prevotella 0.0174 0.0471 0.0407 0.0561 0.0010 2.34 0.63 0.61 0.57 0.51 0.47 0.47
g__Collinsella 0.0027 0.0061 0.0083 0.0221 0.0091 3.13 0.62 0.58 0.54 0.41 0.50 0.33
g__Micrococcus 0.0061 0.0092 0.0418 0.0513 0.0000 6.89 0.75 0.88 0.54 0.67 0.75 0.67
g__Methanobrevibacter 0.0004 0.0017 0.0032 0.0077 0.0002 8.10 0.64 0.66 0.52 0.44 0.53 0.33
g__Sutterella 0.0004 0.0016 0.0031 0.0086 0.0011 8.71 0.62 0.62 0.51 0.44 0.50 0.33
g__Lachnobacterium 0.0001 0.0003 0.0018 0.0067 0.0066 25.14 0.62 0.66 0.49 0.35 0.53 0.22
g__Limnohabitans 0.0000 0.0002 0.0006 0.0025 0.0087 33.61 0.63 0.68 0.47 0.41 0.56 0.28
g__Polynucleobacter 0.0000 0.0001 0.0015 0.0041 0.0002 100.77 0.71 0.75 0.54 0.36 0.63 0.19
g__Rhodobacter 0.0000 0.0002 0.0033 0.0065 0.0000 140.13 0.76 0.99 0.44 0.57 0.88 0.42
g__Flavobacterium 0.0004 0.0015 0.0626 0.0883 0.0000 140.16 0.82 0.94 0.54 0.69 0.81 0.53
g__Fluviicola 0.0000 0.0000 0.0028 0.0066 0.0000 >100　 0.73 0.92 0.41 0.56 0.81 0.39
g__Candidatus Aquiluna 0.0000 0.0000 0.0005 0.0019 0.0059 　>100 0.63 0.74 0.46 0.43 0.56 0.28
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 세균 메타게놈 분석을 통해 뇌졸중 진단에 대한 정보를 제공하는 방법은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 뇌졸중의 발병 위험도를 예측하고 뇌졸중을 진단하는데 이용할 수 있다.

Claims (16)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 탈철간균문(Deferribacteres), 우미균문(Verrucomicrobia), 테네리쿠테스(Tenericutes), 남세균문(Cyanobacteria), 의간균문(Bacteroidetes), 유리고세균문(Euryarchaeota), TM7, 부유균문(Planctomycetes), GN02, 및 OD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 할로박테리아(Halobacteria), 탈철간균강(Deferribacteres), 우미균강(Verrucomicrobiae), 클로로플라스트(Chloroplast), 몰리쿠테스(Mollicutes), 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi), 메타노박테리아(Methanobacteria), 플라보박테리아(Flavobacteriia), 플란크토마이세티아(Planctomycetia), TM7-1, 및 ZB2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 할로박테리아레스(Halobacteriales), 탈철간균목(Deferribacterales), 스트렙토피타(Streptophyta), 로도사이클러스(Rhodocyclales), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케치아레스(Rickettsiales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales), 메타노박테리아레스(Methanobacteriales), 레지오넬라레스(Legionellales), 및 플라보박테리아레스(Flavobacteriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 테르마코카시에(Dermacoccaceae), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 푸조박테리아시에(Fusobacteriaceae), 유산균과(Lactobacillaceae), 로도사이클라시에(Rhodocyclaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 프로피오니박테리아시에(Propionibacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프레보텔라과(Prevotellaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 오도리박테라시에(Odoribacteraceae), 마이크로코카시에(Micrococcaceae), 마이크로박테리아시에(Microbacteriaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 메타노박테리아시에(Methanobacteriaceae), 플라보박테리아시에(Flavobacteriaceae), 및 크리오모파시에(Cryomorphaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 랄스토니아(Ralstonia), 제오바실러스(Geobacillus), 사이크로박터(Psychrobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 크로모하로박터(Chromohalobacter), 데르마코커스(Dermacoccus), 엔테로박터(Enterobacter), 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus), 무시스피릴룸(Mucispirillum), rc4-4, 푸조박테리움(Fusobacterium), 시트로박터(Citrobacter), 코쿠리아(Kocuria), 유산균속(Lactobacillus), 아케르만시아(Akkermansia), 아들러크레우치아(Adlercreutzia), 베일로넬라(Veillonella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 프레보텔라(Prevotella), 콜린셀라(Collinsella), 마이크로코커스(Micrococcus), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 수테렐라(Sutterella), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 림노하비탄스(Limnohabitans), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter), 로도박터(Rhodobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium), 플루비콜라(Fluviicola), 및 캔디다투스 아쿠일루나(Candidatus Aquiluna)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 하기의 단계를 포함하는, 뇌졸중 진단방법:
    (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 탈철간균문(Deferribacteres), 우미균문(Verrucomicrobia), 테네리쿠테스(Tenericutes), 남세균문(Cyanobacteria), 의간균문(Bacteroidetes), 유리고세균문(Euryarchaeota), TM7, 부유균문(Planctomycetes), GN02, 및 OD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 할로박테리아(Halobacteria), 탈철간균강(Deferribacteres), 우미균강(Verrucomicrobiae), 클로로플라스트(Chloroplast), 몰리쿠테스(Mollicutes), 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi), 메타노박테리아(Methanobacteria), 플라보박테리아(Flavobacteriia), 플란크토마이세티아(Planctomycetia), TM7-1, 및 ZB2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 할로박테리아레스(Halobacteriales), 탈철간균목(Deferribacterales), 스트렙토피타(Streptophyta), 로도사이클러스(Rhodocyclales), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케치아레스(Rickettsiales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales), 메타노박테리아레스(Methanobacteriales), 레지오넬라레스(Legionellales), 및 플라보박테리아레스(Flavobacteriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 테르마코카시에(Dermacoccaceae), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 푸조박테리아시에(Fusobacteriaceae), 유산균과(Lactobacillaceae), 로도사이클라시에(Rhodocyclaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 프로피오니박테리아시에(Propionibacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프레보텔라과(Prevotellaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 오도리박테라시에(Odoribacteraceae), 마이크로코카시에(Micrococcaceae), 마이크로박테리아시에(Microbacteriaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 메타노박테리아시에(Methanobacteriaceae), 플라보박테리아시에(Flavobacteriaceae), 및 크리오모파시에(Cryomorphaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 랄스토니아(Ralstonia), 제오바실러스(Geobacillus), 사이크로박터(Psychrobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 크로모하로박터(Chromohalobacter), 데르마코커스(Dermacoccus), 엔테로박터(Enterobacter), 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus), 무시스피릴룸(Mucispirillum), rc4-4, 푸조박테리움(Fusobacterium), 시트로박터(Citrobacter), 코쿠리아(Kocuria), 유산균속(Lactobacillus), 아케르만시아(Akkermansia), 아들러크레우치아(Adlercreutzia), 베일로넬라(Veillonella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 프레보텔라(Prevotella), 콜린셀라(Collinsella), 마이크로코커스(Micrococcus), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 수테렐라(Sutterella), 라크노박테리움(Lachnobacterium), 림노하비탄스(Limnohabitans), 폴리뉴클레오박터(Polynucleobacter), 로도박터(Rhodobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium), 플루비콜라(Fluviicola), 및 캔디다투스 아쿠일루나(Candidatus Aquiluna)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 뇌졸중 진단방법.
PCT/KR2019/001618 2018-02-14 2019-02-11 세균 메타게놈 분석을 통한 뇌졸중 진단방법 Ceased WO2019160284A1 (ko)

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