WO2019176939A1 - 一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ、及びシス型－トランス型判別方法 - Google Patents

一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ、及びシス型－トランス型判別方法 Download PDF

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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide probe for detecting a single nucleotide polymorphism and a method for discriminating whether two kinds of single nucleotide polymorphisms exist in a cis form or a trans form.
  • Epidermal growth factor receptor (EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor) is a transmembrane receptor tyrosine kinase and is known as a factor involved in the control of cell proliferation and growth. Since EGFR is overexpressed in many cancers including lung cancer as an oncogene, it has attracted attention as a molecular target for cancer therapy, and cancer therapeutic drugs such as EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) have been developed.
  • EGFR-TKI EGFR tyrosine kinase inhibitor
  • EGFR tyrosine kinase inhibitors such as gefitinib, erlotinib, and afatinib are known to develop resistance and re-exacerbate in about one year.
  • About half of the cause of this resistance acquisition is a mutation (T790M) in which threonine (T), which is the 790th amino acid of EGFR, is substituted with methionine (M). Therefore, a probe for enabling detection of this T790M has been developed, and polymorphism detection probes designed to hybridize to the sequence of the EGFR gene containing T790M have been reported (Patent Documents 1 and 2). ).
  • osmeltinib an EGFR tyrosine kinase inhibitor effective for T790M, has been developed and used as a therapeutic agent for lung cancer.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • the polymorphism detection probe is simple and inexpensive to synthesize and can accurately detect the presence of the polymorphism.
  • a probe has a reporter region that detects a single nucleotide polymorphism, an anchor region that binds to a target nucleotide sequence regardless of the presence or absence of the single nucleotide polymorphism, and a linker region that links the reporter region and the anchor region.
  • An oligonucleotide probe for detecting a single nucleotide polymorphism which is a probe capable of detecting the presence or absence of a single nucleotide polymorphism based on the fluorescence intensity with a fluorescent dye possessed by a reporter region has been developed (Patent Document 3).
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in cis form. It is an object of the present invention to provide an oligonucleotide probe for detecting a single nucleotide polymorphism for discriminating whether or not it exists in a trans form. The present invention also provides a method for discriminating whether the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in cis form or in trans form using the oligonucleotide probe. With the goal.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in cis form.
  • An oligonucleotide probe for detecting a single nucleotide polymorphism for discriminating whether or not it exists in trans form
  • the target nucleic acid includes a first target base sequence in which the first single nucleotide polymorphism exists, and a second target base sequence in which the second single nucleotide polymorphism exists
  • the probe includes a reporter region for detecting the first single nucleotide polymorphism, an anchor region for detecting the second single nucleotide polymorphism, and a linker region,
  • Have The anchor region has an oligonucleotide having a base sequence that perfectly matches the second target base sequence,
  • the linker region connects the reporter region and the anchor region, and the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleot
  • An oligonucleotide having a non-complementary base sequence with respect to the base sequence between the target base sequence and the second target base sequence Provided is a probe wherein the length of the reporter region oligonucleotide is shorter than the length of the anchor region oligonucleotide.
  • the probe of the present invention has an anchor region for detecting the second single nucleotide polymorphism separately from the reporter region for detecting the first single nucleotide polymorphism, and both regions are linked by a linker region.
  • the length of the reporter region oligonucleotide is shorter than the length of the anchor region oligonucleotide. Therefore, when the binding property of the probe is ensured by hybridizing the anchor region to the second target base sequence, the first single nucleotide polymorphism of the first single nucleotide polymorphism is linked by the reporter region having a fluorescent dye linked by the linker region. Presence or absence can be detected with high sensitivity.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second Whether a single nucleotide polymorphism exists in a cis form or a trans form can be discriminated with good accuracy and detection sensitivity.
  • the linker region is preferably an oligonucleotide having a base sequence that does not contain a universal base. By not using a universal base in the linker region, a probe can be synthesized at a lower cost.
  • the linker region is preferably an oligonucleotide consisting of only one base selected from adenine, guanine, cytosine, and thymine. This reduces the possibility of binding to the target nucleic acid in the linker region of the probe, thereby increasing the degree of freedom of the reporter region and improving the detectability of the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism. Can do. Moreover, a probe can be synthesized at a lower cost by constituting the linker region only with the above base.
  • the linker region is preferably an oligonucleotide composed of 3 to 11 nucleotides.
  • the present invention is also a method for discriminating whether the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in the cis form or in the trans form.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in cis form or in trans form based on the fluorescence intensity. It can be determined whether it exists.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are cis-type. It is possible to easily determine whether it exists in a trans form or in a trans form without using a complicated process.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a mechanism for detecting T790M and C797S existing in a cis form by the probe of this embodiment.
  • the enclosed part indicates a SNP or a part corresponding to the SNP.
  • FIG. 2 shows the results of thermal melting curve analysis when the C797S detection probe was used. 100% indicates that the template DNA is DNA having an EGFR gene sequence including C797S_1, and 50% to 5% indicates that the ratio of DNA having the EGFR gene sequence including C797S_1 in the template DNA is 50% to 5%, respectively.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the synthetic oligonucleotide in which the three probes (1) to (3) designed in Example 3 and a sequence recognizing T790M and a sequence recognizing C797S are linked by a linker.
  • the encircled portion indicates SNP or a portion corresponding to SNP, and the circle bonded to the end opposite to the linker region of each probe indicates QProbe.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the synthetic oligonucleotide in which the three probes (1) to (3) designed in Example 3 and a sequence recognizing T790M and a sequence recognizing C797S are linked by a linker.
  • the encircled portion indicates SNP or a portion corresponding to SNP, and the circle bonded to the end opposite to the linker region of each probe indicates QProbe.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the synthetic oligonucleotide in which the three probes (1) to (3) designed in Example 3 and a sequence recognizing T790M and
  • FIG. 4 shows the results of thermal melting curve analysis using the synthetic oligonucleotide shown in FIG. 3 in which a sequence recognizing T790M and a sequence recognizing C797S are linked by a linker.
  • FIG. 5 shows the results of thermal melting curve analysis when using a cis-type detection linker probe.
  • “Cis (T790M / C797S + wt)” is a template DNA comprising a DNA having an EGFR gene sequence containing T790M and C797S in a cis form (T790M / C797S), and a wild type EGFR gene sequence not containing the mutation as an allele thereof. The case where it has DNA (wt) is shown.
  • cis 50% and cis 25% are: a template DNA containing 50% and 25% of T790M / C797S, respectively (otherwise, DNA having a wild-type EGFR gene sequence), and a wild-type that does not contain the mutation as an allele thereof
  • DNA (wt) having the EGFR gene sequence is included is shown. Therefore, the mutation abundance rate of T790M / C797S in the whole of cis 50% and cis 25% is 25% and 12.5%, respectively.
  • Trans (T790M + C797S) indicates that the template DNA is DNA having an EGFR gene sequence including T790M and C797S in trans form, and wt is the case where the template DNA is all DNA having a wild type EGFR gene sequence.
  • T790M shows the case where the template DNA is a DNA having an EGFR gene sequence containing only T790M
  • C797S shows the case where the template DNA is a DNA having an EGFR gene sequence containing only C797S.
  • the present embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described in detail.
  • this invention is not limited to the following embodiment.
  • single nucleotide polymorphism refers to a polymorphism caused by substitution of a single base on a base sequence.
  • the “target nucleic acid” is a nucleic acid that is a target for confirming the presence or absence of SNP using the probe of the present embodiment.
  • the target nucleic acid includes a first target base sequence that is a region where the first single nucleotide polymorphism exists, and a second target base sequence that is a region where the second single nucleotide polymorphism exists.
  • the first target base sequence and the second target base sequence can be determined in advance from the base sequence of a nucleic acid whose SNP is known.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in either a cis-type or trans-type positional relationship.
  • the cis type means that the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are located on the same chromosome
  • the trans type means the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism. It means that the polymorphism is located on different chromosomes.
  • the cis type is the same as the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism. It means to be located on the allele, and the trans type means that the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are located on different alleles.
  • first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism may exist on the same allele
  • the first single nucleotide polymorphism is C797S
  • the second single nucleotide polymorphism is C790M.
  • the first target base sequence is a region consisting of 3 to 6 nucleotides containing a base that can contain the SNP (first single nucleotide polymorphism) to be detected in the base sequence of a nucleic acid known to have SNP.
  • the first target base sequence is more preferably a region consisting of 3 to 5 nucleotides, and further preferably a region consisting of 4 or 5 nucleotides.
  • the position of the base into which the SNP can enter is not particularly limited, but is preferably near the center of the first target base sequence.
  • the second target base sequence does not overlap with the first target base sequence, and in the base sequence of the nucleic acid in which the presence of SNP is known, the base that can contain the SNP (second single nucleotide polymorphism) to be detected A region consisting of 8 to 20 nucleotides including is preferred.
  • the second target base sequence is more preferably a region consisting of 10 to 18 nucleotides, more preferably a region consisting of 11 to 15 nucleotides, and particularly preferably a region consisting of 14 or 15 nucleotides.
  • the position of the base where the SNP can enter is not particularly limited, but is preferably near the center of the second target base sequence.
  • the second target nucleotide sequence is located on the 3 ′ side or 5 ′ side of the first target nucleotide sequence.
  • the number of nucleotides from the 3 ′ end of the first target base sequence to the 5 ′ end of the second target base sequence Is preferably 0 to 15, more preferably 3 to 12, and still more preferably 4 to 10.
  • the interval between the first target base sequence and the second target base sequence By setting the interval between the first target base sequence and the second target base sequence within the above range, an appropriate distance can be maintained between the reporter region and the anchor region in the probe of the present embodiment. There is a tendency to improve the detection ability.
  • the length of the linker region can be set according to the interval between the first target base sequence and the second target base sequence, it is not necessary to synthesize extra nucleotides and tends to be economically superior. It is in.
  • the second target base sequence is located on the 5 ′ side of the first target base sequence, the number of nucleotides from the 5 ′ end of the first target base sequence to the 3 ′ end of the second target base sequence is calculated.
  • the above range can be set.
  • the target nucleic acid in this embodiment includes DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the origin of the target nucleic acid is not particularly limited as long as it contains DNA or RNA, and examples thereof include animals, plants, fungi, microorganisms, viruses and the like.
  • the method for preparing the target nucleic acid is not particularly limited, and may be prepared directly from an organism or virus, may be prepared from a specific tissue, or artificially cloned from a template nucleic acid. It may be prepared, or an amplification product by PCR method or LAMP method may be used.
  • the term “perfect match” means that the first target base sequence and the reporter region have a sequence that is completely complementary to the first target base sequence in the target nucleic acid. And hybridize.
  • a “mismatch” has a different base sequence in the reporter region with respect to the base sequence in the target nucleic acid, even if only one base is present. Is difficult to hybridize.
  • the probe of the present embodiment includes a reporter region that detects the first single nucleotide polymorphism, an anchor region that detects the second single nucleotide polymorphism, and a linker region.
  • the positional relationship between the reporter region and the anchor region is the first when the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in a cis-type positional relationship in the target nucleic acid. It can be set as appropriate according to the positional relationship between the target base sequence and the second target base sequence. For example, when the second target base sequence is located on the 3 ′ side of the first target base sequence, the anchor region is arranged on the 5 ′ side of the reporter region.
  • the probe of this embodiment includes an anchor region that binds to a target base sequence for detecting the second single nucleotide polymorphism, in addition to the reporter region for detecting the first single nucleotide polymorphism.
  • the reporter region oligonucleotide is shorter than the anchor region oligonucleotide. Therefore, when the anchor region hybridizes to the second target nucleotide sequence and the binding property of the probe is ensured, the reporter region linked by the linker region accurately detects the presence or absence of the first single nucleotide polymorphism. Can be detected well.
  • the method for producing the probe of the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include a normal oligonucleotide synthesis method using a chemical synthesis method. Since the probe of this embodiment is composed of ordinary oligonucleotides, it does not require a complicated synthesis method and can be produced simply and inexpensively.
  • the reporter region is a region for detecting the first single nucleotide polymorphism.
  • the oligonucleotide of the reporter region is a nucleotide consisting of a base sequence complementary to the first target base sequence in which the first single nucleotide polymorphism exists.
  • the reporter region perfectly matches the first target base sequence in which the first single nucleotide polymorphism is present, and is a sequence other than the first target base sequence (other than the absence of the first single base polymorphism, (Including a sequence identical to the target base sequence of 1) is an oligonucleotide having a base sequence that is mismatched.
  • the reporter region has a fluorescent dye that is quenched when the first target base sequence and the reporter region are hybridized.
  • the reporter region has such a fluorescent dye, the single nucleotide polymorphism can be easily detected by measuring the fluorescence intensity.
  • fluorescent dyes having such characteristics include the QProbe series (manufactured by Nippon Steel & Sumikin Environment Co., Ltd.). In QProbe, when guanine is present in the vicinity of a base complementary to a base modified with a fluorescent dye when hybridized, fluorescence resonance energy transfer occurs and the fluorescence is quenched.
  • fluorescent dyes possessed by QProbe include Pacific Blue, ATTO465, BODIPY-FL, Rhodamine 6G, TAMRA, and ATTO655.
  • the fluorescent dye is preferably bound to the end opposite to the linker region in the reporter region.
  • the length of the oligonucleotide in the reporter region is preferably 3 to 6 nucleotides, more preferably 3 to 5 nucleotides, and 4 or 5 nucleotides. More preferred are nucleotides.
  • the length of the oligonucleotide of the reporter region is shorter than the length of the oligonucleotide of the anchor region from the viewpoint of improving the detectability of cis-type SNP.
  • the oligonucleotide of the reporter region has guanine in the first target base sequence within 1 to 3 sites from the binding site of the fluorescent dye. It is preferably designed to exist.
  • the anchor region is a region for detecting the second single nucleotide polymorphism.
  • the oligonucleotide in the anchor region is a nucleotide having a base sequence complementary to the second target base sequence in which the second single nucleotide polymorphism exists.
  • the anchor region perfectly matches the second target nucleotide sequence in which the second single nucleotide polymorphism exists, and other than the second target nucleotide sequence (the first one except that the second single nucleotide polymorphism does not exist) (Including a sequence identical to the target base sequence of 2) is an oligonucleotide having a base sequence that is mismatched.
  • the length of the oligonucleotide in the anchor region is preferably 8 to 20 nucleotides, more preferably 10 to 18 nucleotides, and 11 to 15 More preferred are 14 nucleotides, especially 14 or 15 nucleotides.
  • the linker region is a region for increasing the degree of freedom of the probe.
  • the linker region connects the reporter region and the anchor region.
  • the linker region is relative to the base sequence between the first target base sequence and the second target base sequence in the target nucleic acid when the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in cis form. And an oligonucleotide having a non-complementary base sequence.
  • the linker region preferably does not contain a universal base.
  • Universal bases include universal bases that are bases other than adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, or analogs thereof.
  • Examples of universal bases or analogs thereof include 5-nitroindole, deoxyriboside, 3-nitropyrrole deoxyriboside, 4-nitrobenzimidazole deoxyriboside, deoxynebulaline, deoxyinosine, 2′-OMe inosine, 2′-OMe5 -Nitroindole riboside, 2'-OMe3-nitropyrrole riboside, 2'-F inosine riboside, 2'-F nebulaline, 2'-F5-nitroindole riboside, 2'-F4-nitrobenzimidazole riboside 2'-F3-nitropyrrole riboside, PNA-5-nitroindole, PNA-nebulaline, PNA-inosine, PNA-4-nitrobenzimidazole, PNA-3-nitropyrrole, morpholino-5-nitroindole
  • the linker region is preferably an oligonucleotide consisting of only one base of adenine, guanine, cytosine, or thymine.
  • the length of the oligonucleotide in the linker region is preferably 3 to 11 nucleotides, more preferably 3 to 9 nucleotides, and particularly preferably 7.
  • the length of the oligonucleotide in the linker region is determined from the first target base sequence and the second target in terms of obtaining a degree of freedom in steric structure. Is preferably ⁇ 5 to +5, and more preferably ⁇ 3 to +3.
  • the probe of this embodiment has a fluorescent dye in the reporter region for detecting the first single nucleotide polymorphism, the presence or absence of the first single nucleotide polymorphism in the target nucleic acid can be detected based on the fluorescence intensity. it can.
  • the probe of the present embodiment and the first one Based on the measured fluorescence intensity, a step of mixing target nucleic acids present at different positions of the nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism, preparing a mixture, a step of measuring the fluorescence intensity of the mixture, And a step of determining whether the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in a cis form or in a trans form.
  • FIG. 1 schematically shows the state of the probe of this embodiment and a target nucleic acid when they are mixed when the first single nucleotide polymorphism is C797S and the second single nucleotide polymorphism is T790M.
  • FIG. 1 In the anchor region having a sequence complementary to the second target base sequence in which T790M is present, the probe hybridizes with the target nucleic acid (FIGS. 1 (a) and (b-1)).
  • the reporter region further hybridizes with the first target base sequence in which C797S is present, the fluorescence of the fluorescent dye is quenched (FIG. 1 (a)). In this case, it can be determined that C797S and T790M exist in a cis form.
  • the reporter region when the reporter region is mismatched, the fluorescence of the fluorescent dye continues to be emitted because the reporter region cannot hybridize (FIG. 1 (b-1)). In this case, it can be determined that C797S and T790M exist in a trans form.
  • the nucleotide length of the reporter region is shorter than the nucleotide length of the anchor region, and the binding property of the probe is ensured by the anchor region. Therefore, if the anchor region is mismatched, the reporter region cannot hybridize to the first target base sequence even if the first target base sequence in which C797S exists is present. The fluorescence continues to be emitted (FIG. 1 (b-2)). Also in this case, it can be determined that C797S and T790M exist in a trans form.
  • the probe of this embodiment emits fluorescence when the reporter region does not hybridize with the first target base sequence in the target nucleic acid.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in cis form. It can be determined.
  • the probe and target nucleic acid are mixed and the fluorescence intensity of the mixture is maintained or increased compared to before mixing, the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are trans It can be determined that it exists as a type.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in cis form or trans form. Can be efficiently determined.
  • Tm analysis can be performed by a method commonly used by those skilled in the art.
  • Tm analysis include a method in which a probe and a target nucleic acid are mixed and the fluorescence intensity of the mixed solution at that time is measured while changing the temperature of the mixed solution.
  • the reporter region is mismatched, the thermal stability of the probe and target nucleic acid complex is lower than when the reporter region is completely matched, so the reporter region binds to the target nucleic acid at a lower temperature, and fluorescence quenching is measured. The This temperature is called the quenching start temperature.
  • the reporter region when the reporter region is a perfect match, the probe and target nucleic acid complex is more thermally stable than the mismatch, so that the reporter region binds to the target nucleic acid even at a higher temperature, and fluorescence quenching occurs. Measured. Therefore, for example, the quenching start temperature of the target nucleic acid when the reporter region is mismatched is measured, and when the quenching start temperature is higher than this value, the target nucleic acid used for the measurement has the first single nucleotide It can be determined that the type and the second single nucleotide polymorphism exist in the cis form.
  • the quenching start temperature of the target nucleic acid when the anchor region becomes a mismatch is measured, and the quenching start is higher than this value.
  • the temperature is high, it can be determined that the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in cis form in the target nucleic acid used for the measurement.
  • the method for determining whether the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism of the present embodiment are present in the cis form or in the trans form includes the probe, the first single nucleotide polymorphism and the first single nucleotide polymorphism.
  • a competing oligonucleotide can be further mixed.
  • the competing oligonucleotide may be an oligonucleotide having a sequence that is completely complementary to the wild-type base sequence for the first target base sequence, and a sequence that is completely complementary to the wild-type base sequence for the second target base sequence. It may be an oligonucleotide having a combination thereof, or a combination thereof, but is preferably an oligonucleotide having a sequence that is completely complementary to a wild-type base sequence for the second target base sequence.
  • the nucleotide length of the reporter region for detecting the first single nucleotide polymorphism is extremely shortened. Can do. Therefore, the specificity of the reporter region is increased, and the reporter region is less likely to hybridize to the mismatched sequence even under a low temperature such as room temperature. As a result, the fluorescence intensity of the liquid mixture near room temperature at the time of mismatch does not decrease significantly even when compared with the fluorescence intensity at the quenching start temperature. On the other hand, when the reporter region completely matches, the reporter region hybridizes with the target nucleic acid through the first target base sequence near room temperature.
  • the fluorescence intensity of the liquid mixture near room temperature at the time of perfect match is significantly reduced compared to the fluorescence intensity at the quenching start temperature, and is about 60% or less. Therefore, for example, in the SNP detection method using Tm analysis, when the fluorescence intensity of the mixture near room temperature is 60% or less of the fluorescence intensity at the quenching start temperature, the target nucleic acid used for the measurement is It can be determined that one single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism exist in cis form.
  • an amplification product amplified by a method such as a PCR method or a LAMP method may be used as the target nucleic acid.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in a different positional relationship from the cis type or the trans type, so that the disease symptoms change. It is possible to provide an index for selecting a diagnosis, an appropriate therapeutic agent / treatment method, and the like for a patient having a disease.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism are present in a positional relationship different from that of the cis type or trans type, so that it is appropriate for a patient having a disease whose response to a therapeutic drug is changed.
  • the first single nucleotide polymorphism and the second single nucleotide polymorphism that cause resistance to the therapeutic drug are present in a positional relationship different from that of the cis-type or trans-type, thereby allowing resistance to the therapeutic drug.
  • the strength of the drug is different, it is possible to provide an index for selection of the response to the resistance and development of a therapeutic agent / treatment method for overcoming the resistance.
  • Example 1 Design of probe and primer for LAMP method
  • EGFR Homo sapiens epidermal growth factor receptor
  • LRG_304 RefSeqGene on chromosome 7
  • Mutations in the EGFR gene are as follows.
  • T790M and C797S were targeted.
  • a probe and competing oligo sequence for detecting T790M, a probe and competing oligo sequence for detecting C797S alone, and a probe and competing oligo sequence for detecting when T790M and C797S are present in cis form, 2 was designed.
  • C797S is known to have two mutations, 2389T> A and 2390G> C.
  • a probe for detecting C797S was designed based on 2389T> A, which has a high detection frequency.
  • C797S caused by mutation of 2389T> A is also referred to as C797S_2 due to mutation of C797S_1, 2390G> C.
  • Example 2 Detection of C797S_1 using the LAMP method
  • the detectability of C797S with a probe (C797S detection probe in Table 2) for detecting C797S_1 (2389T> A) designed in Example 1 alone was measured using the LAMP method.
  • Template DNA DNA having an EGFR gene sequence including C797S_1 (2389T> A), DNA having an EGFR gene sequence including C797S_2 (2390G> C), DNA having a wild-type EGFR gene sequence.
  • the template DNA is used alone or in combination.
  • QProbe binding probe a probe in which QProbe is bound to DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 5 (C797S detection probe).
  • LAMP primer a primer having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 7 to 10.
  • a reaction solution was prepared by adding 5 ⁇ l of template DNA (template amount 10000 cps) denatured by heating to 20 ⁇ l of LAMP master mix. Incubate the reaction solution at 65 ° C for 90 minutes with a real-time fluorescence spectrometer LC480 (Roche), heat denature the amplified product at 95 ° C for 5 minutes, and then hybridize the amplified product and the QProbe binding probe at 37 ° C for 5 minutes. Made soy. After the reaction, the temperature of the reaction solution was gradually increased from 37 ° C. to 80 ° C. (acquisition 7 / ° C.), the fluorescence intensity was measured, and the thermal melting curve analysis was performed. The fluorescence intensity was measured at 465/510 (nm) when QProbe had BodipyFL, and was measured at 533/580 (nm) when QProbe had TAMRA.
  • FIG. 2 shows the change in fluorescence intensity when the thermal melting curve analysis is performed.
  • the mutation content means the ratio of the template DNA containing the mutation in the entire template DNA.
  • Example 3 Screening of cis-type linker probe using LAMP method
  • TAMRA QProbe
  • a synthetic oligonucleotide was designed in which a sequence recognizing T790M and a sequence recognizing C797S were linked by a linker.
  • the sequence recognizing C797S and the length of the linker were changed without changing the sequence recognizing T790M, and four types of synthetic oligonucleotides were designed as shown in Table 4.
  • the synthetic oligonucleotides in Table 4 were used as template DNAs, and probes (1) to (3) in FIG. 3 were used as QProbe binding probes, respectively, and hybridized with the following reagent composition.
  • a master mix for screening (30 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% Tween, 1.6 ⁇ M synthetic oligonucleotide, 0.05 ⁇ M probe)
  • a real-time fluorescence analyzer LC480 (Roche)
  • the temperature of the reaction solution was gradually increased from 37 to 80 ° C. (acquisition 7 / ° C.), the fluorescence intensity was measured, and the thermal melting curve analysis was performed.
  • FIG. 4 shows the results of thermal melting curve analysis when a synthetic oligonucleotide in which the sequence recognizing T790M and the sequence recognizing C797S described in FIG. 3 are linked by a linker (TTTTTTTT) is used.
  • Example 4 Detection of cis-type mutation using LAMP method
  • a C797S-1 synthetic oligonucleotide SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 which was able to efficiently detect only a sequence containing cis-type T790M and C797S, was converted into a probe, and a cis-type linker probe for detection was used.
  • an EGFR gene sequence containing cis-type T790M and C797S, an EGFR gene sequence containing trans-type T790M and C797S, an EGFR gene sequence containing only T790M, and An EGFR gene sequence containing only C797S was designed to produce an artificial gene.
  • Hybridization was carried out by the LAMP method in the same manner as in Example 2 using genomic DNAs having the artificial gene and wild type EGFR gene sequences as template DNAs and using the cis-type detection linker probe as a QProbe binding probe. .
  • a competitive oligo (SEQ ID NO: 2) that completely complements the wild type at the T790M sequence site to eliminate the slight observed quenching when using an oligonucleotide having an artificial gene sequence containing only C797S, and to further increase sensitivity was added at 1.2 ⁇ M.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the thermal melting curve by measuring the fluorescence intensity of the LAMP product in the same manner as in Example 2.
  • the mutation content means the ratio of the template DNA containing the mutation in the entire template DNA.

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Abstract

第１の一塩基多型を検出するレポーター領域と、第２の一塩基多型を検出するアンカー領域と、リンカー領域と、を含むプローブを開示する。上記レポーター領域は、上記記第１の標的塩基配列に対して完全マッチする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、上記第１の一塩基多型が存在する第１の標的塩基配列とハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素を有する。上記アンカー領域は、上記第２の一塩基多型が存在する第２の標的塩基配列に対して完全マッチする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。上記レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、上記アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い。

Description

一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ、及びシス型－トランス型判別方法
　一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ、並びに、２種の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法に関する。
　上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は膜貫通型受容体チロシンキナーゼであり、細胞の増殖や成長の制御に関わる因子として知られている。ＥＧＦＲは、癌遺伝子として肺癌を含む多くの癌で過剰発現していることから、癌治療の分子標的として注目され、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ－ＴＫＩ）等の癌治療薬が開発された。
　ところが、ゲフィチニブ、エルロチニブ及びアファチニブ等のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は、一年程度で耐性を生じて再増悪してしまうことが知られている。この耐性獲得の原因のおよそ半分を占めるのが、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に置換された変異（Ｔ７９０Ｍ）である。そのため、このＴ７９０Ｍの検出を可能とするためのプローブが開発され、Ｔ７９０Ｍを含むＥＧＦＲ遺伝子の配列にハイブリダイズするように設計した多型検出用プローブが報告されている（特許文献１、特許文献２）。また、このＴ７９０Ｍに有効であるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬であるオシメルチニブが開発され、肺癌治療薬として使用されている。
　しかしながら、さらなる耐性変異の追加により、臨床応用されたすべてのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の効果がなくなることが報告されている。この耐性の原因の一つとされるのが、ＥＧＦＲの７９７番目のアミノ酸であるシステイン（Ｃ）がセリン（Ｓ）に置換された変異（Ｃ７９７Ｓ）である。このＣ７９７ＳがＴ７９０Ｍに対してトランス型で存在するときには、既存のＥＧＦＲ－ＴＫＩの組み合わせが有効かもしれないとの知見は得られているものの、Ｃ７９７ＳがＴ７９０Ｍに対してシス型で存在するときには、これらの組み合わせを含む臨床応用されたすべてのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬の効果がなくなることが報告されている（非特許文献１）。このように、治療薬への耐性の原因となる異なる２種の一塩基多型（以下「ＳＮＰ（：Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」と省略する場合もある）が、シス型又はトランス型と異なる位置関係で存在することで、治療薬への耐性の強度等が異なる場合には、その耐性への対応の選択及び耐性を克服するための治療薬・治療方法の開発等のため、シス型であるか又はトランス型を判別する方法が重要となる。現状ではシス型であるか又はトランス型であるかを判別するには、次世代シーケンサーやｄｉｇｉｔａｌＰＣＲを用いた複雑な方法しかない。そこで、シス型であるか又はトランス型であるかを簡単に判別するための多型検出用プローブの開発が望まれている。
　多型検出用プローブは、合成が簡便且つ安価であり、多型の存在を正確に感度よく検出できることが好ましい。このようなプローブとして、一塩基多型を検出するレポーター領域と、一塩基多型の有無に関わらず標的塩基配列に結合するアンカー領域と、レポーター領域及びアンカー領域を連結するリンカー領域と、を有する、一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、レポーター領域が有する蛍光色素により、その蛍光強度に基づいて一塩基多型の有無を検出できるプローブが開発されている（特許文献３）。
国際公開第２００６／０８６７７７号 国際公開第２０１１／０５２７５４号 国際公開第２０１６／０９８５９５号
K.Uchibori et al., Brigatinib combined with anti-EGFR antibody overcomes osimertinib resistance in EGFR-mutated non-small-cell lung cancer, Nature communications 8, Article number:14768 (2017)
　本発明は、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸において、上記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別するための一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブを提供することを目的とする。本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドプローブを用いて、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法を提供することを目的とする。
　本発明は、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸において、上記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別するための一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、
　上記標的核酸が、上記第１の一塩基多型が存在する第１の標的塩基配列と、上記第２の一塩基多型が存在する第２の標的塩基配列と、を含み、
　上記プローブが、上記第１の一塩基多型を検出するレポーター領域と、上記第２の一塩基多型を検出するアンカー領域と、リンカー領域と、を含み、
　上記レポーター領域が、上記第１の標的塩基配列に対して完全マッチする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、上記第１の標的塩基配列及び上記レポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素と、を有し、
　上記アンカー領域が、上記第２の標的塩基配列に対して完全マッチする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
　上記リンカー領域が、上記レポーター領域及び上記アンカー領域を連結しており、上記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在する場合の上記標的核酸における上記第１の標的塩基配列及び上記第２の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
　上記レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さが、上記アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い、プローブを提供する。
　本発明のプローブは、第１の一塩基多型を検出するためのレポーター領域とは別に、第２の一塩基多型を検出するためのアンカー領域を備えており、両領域はリンカー領域により連結されている。また、レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い。そのため、第２の標的塩基配列にアンカー領域がハイブリダイズすることによりプローブの結合性が確保されると、リンカー領域により連結された、蛍光色素を有するレポーター領域により、第１の一塩基多型の有無を感度よく検出できる。レポーター領域及びアンカー領域の両方がそれぞれ対応する標的塩基配列にハイブリダイズすることにより蛍光強度が減少するように適宜調整することで、単一のプローブにより、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを良好な正確性及び検出感度により判別することができる。
　上記リンカー領域が、ユニバーサル塩基を含まない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。リンカー領域にユニバーサル塩基を用いないことで、より安価にプローブを合成することができる。
　上記リンカー領域が、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか１種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これにより、プローブのリンカー領域で標的核酸と結合する可能性が低下するため、レポーター領域の自由度が増し、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型の検出能を向上させることができる。また、リンカー領域を上記塩基のみで構成することで、より安価にプローブを合成することができる。
　上記リンカー領域が、３～１１個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これにより、アンカー領域とレポーター領域が一定距離離れるため、レポーター領域の自由度が増し、第１の一塩基多型の検出能を向上させることができ、結果としてシス型ＳＮＰの検出能を向上させることができる。
　本発明はまた、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法であって、上記本発明のプローブ並びに第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、上記混合液の蛍光強度を測定する工程と、上記蛍光強度に基づき、上記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する工程と、を備える方法を提供する。
　本発明の方法によれば、単一のプローブを用いることにより、その蛍光強度に基づいて、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別することができる。
　本発明によれば、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸において、上記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを、単一のプローブを用いて、複雑な工程を必要とすることなく、簡単に判別することが可能となる。
図１は、本実施形態のプローブにより、シス型で存在するＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを検出するメカニズムの模式図である。囲み部分はＳＮＰ又はＳＮＰに対応する部分を示す。 図２は、Ｃ７９７Ｓ検出用プローブを用いたときの熱融解曲線解析の結果を示す。１００％は鋳型ＤＮＡがすべてＣ７９７Ｓ＿１を含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示し、５０％～５％は、鋳型ＤＮＡにおけるＣ７９７Ｓ＿１を含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡの割合がそれぞれ５０％～５％である場合を示し（他は野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ）、０％は鋳型ＤＮＡがすべて野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示し、Ｃ７９７Ｓ＿２は鋳型ＤＮＡがすべてＣ７９７Ｓ＿２を含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示す。 図３は、実施例３において設計した３つのプローブ（１）～（３）、並びにＴ７９０Ｍを認識する配列及びＣ７９７Ｓを認識する配列がリンカーで結合された合成オリゴヌクレオチドの概略図である。囲み部分はＳＮＰ又はＳＮＰに対応する部分、各プローブのリンカー領域とは反対側の末端に結合している丸はＱＰｒｏｂｅをそれぞれ示す。 図４は、Ｔ７９０Ｍを認識する配列及びＣ７９７Ｓを認識する配列がリンカーで結合された図３に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いたときの熱融解曲線解析の結果を示す。 図５は、シス型検出用リンカープローブを用いたときの熱融解曲線解析の結果を示す。「ｃｉｓ（Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ＋ｗｔ）」は鋳型ＤＮＡが、Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓをシス型に含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ（Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）、並びにその対立遺伝子として上記変異を含まない野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ（ｗｔ）を含む場合を示す。ｃｉｓ５０％及びｃｉｓ２５％は、鋳型ＤＮＡが、それぞれ５０％及び２５％のＴ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓを含むＤＮＡ（他は野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ）、並びにその対立遺伝子として上記変異を含まない野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ（ｗｔ）を含む場合を示す。したがって、ｃｉｓ５０％及びｃｉｓ２５％の全体におけるＴ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓの変異存在率はそれぞれ２５％及び１２．５％である。「ｔｒａｎｓ（Ｔ７９０Ｍ＋Ｃ７９７Ｓ）」は鋳型ＤＮＡがすべてＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓをトランス型に含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示し、ｗｔは鋳型ＤＮＡがすべて野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示し、Ｔ７９０Ｍは鋳型ＤＮＡがすべてＴ７９０Ｍのみを含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示し、Ｃ７９７Ｓは鋳型ＤＮＡがすべてＣ７９７Ｓのみを含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡである場合を示す。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
　本明細書において、「一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」とは、塩基配列上の一塩基の置換によって起きる多型のことである。
　本明細書において、「標的核酸」とは、本実施形態のプローブを用いてＳＮＰの有無を確認するための対象となる核酸のことである。標的核酸は、第１の一塩基多型が存在する領域である第１の標的塩基配列と、第２の一塩基多型が存在する領域である第２の標的塩基配列と、を含む。第１の標的塩基配列及び第２の標的塩基配列は、ＳＮＰの存在が知られている核酸の塩基配列から事前に決めることができる。
　第１の一塩基多型と第２の一塩基多型は、シス型又はトランス型のいずれかの位置関係で存在する。シス型とは、第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が同じ染色体上に位置することを意味し、トランス型とは、第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が異なる染色体上に位置することを意味する。第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が同一対立遺伝子上に存在し得る場合には、シス型とは、第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が同一対立遺伝子上に位置することを意味し、トランス型とは、第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が異なる対立遺伝子上に位置することを意味する。第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が同一対立遺伝子上に存在し得る例としては、ＥＧＦＲ遺伝子が挙げられ、第１の一塩基多型としてＣ７９７Ｓ、第２の一塩基多型としてＴ７９０Ｍが挙げられる。
　第１の標的塩基配列は、ＳＮＰの存在が知られている核酸の塩基配列において、検出したいＳＮＰ（第１の一塩基多型）が入りうる塩基を含む３～６個のヌクレオチドからなる領域が好ましい。第１の標的塩基配列は、３～５個のヌクレオチドからなる領域がより好ましく、４又は５個のヌクレオチドからなる領域が更に好ましい。第１の標的塩基配列において、ＳＮＰが入りうる塩基の位置は、特に限定されるものではないが、第１の標的塩基配列の中心付近が好ましい。
　第２の標的塩基配列は、第１の標的塩基配列とは重複せず、ＳＮＰの存在が知られている核酸の塩基配列において、検出したいＳＮＰ（第２の一塩基多型）が入りうる塩基を含む８～２０個のヌクレオチドからなる領域が好ましい。第２の標的塩基配列は、１０～１８個のヌクレオチドからなる領域がより好ましく、１１～１５個のヌクレオチドからなる領域が更に好ましく、１４又は１５個のヌクレオチドからなる領域が特に好ましい。第２の標的塩基配列において、ＳＮＰが入りうる塩基の位置は、特に限定されるものではないが、第２の標的塩基配列の中心付近が好ましい。
　第１の一塩基多型と第２の一塩基多型がシス型の位置関係で存在するときは、第２の標的塩基配列は、第１の標的塩基配列の３’側又は５’側に位置する。第２の標的塩基配列が第１の標的塩基配列の３’側に位置する場合、第１の標的塩基配列の３’末端から第２の標的塩基配列の５’末端までのヌクレオチドの数（インターバル）は、０～１５個が好ましく、３～１２個がより好ましく、４～１０個が更に好ましい。第１の標的塩基配列及び第２の標的塩基配列の間隔を、上記範囲に設定することで、本実施形態のプローブにおけるレポーター領域及びアンカー領域の間で適切な距離を保つことができるため、ＳＮＰの検出能が向上する傾向にある。また、第１の標的塩基配列及び第２の標的塩基配列の間隔に応じて、リンカー領域の長さを設定することができるため、余計なヌクレオチドを合成する必要がなく、経済的にも優れる傾向にある。第２の標的塩基配列が第１の標的塩基配列の５’側に位置する場合は、第１の標的塩基配列の５’末端から第２の標的塩基配列の３’末端までのヌクレオチドの数を上記範囲に設定することができる。
　本実施形態における標的核酸としては、ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられるが、ＤＮＡであることが好ましい。標的核酸の由来としては、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、菌類、微生物、ウイルス等が挙げられる。また、標的核酸の調製方法も、特に限定されるものではなく、生物体又はウイルスから直接調製してもよく、特定の組織から調製してもよく、テンプレートとなる核酸から人工的にクローニングして調製してもよく、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法による増幅産物を用いてもよい。
　本明細書において「完全マッチ」とは、標的核酸中の第１の標的塩基配列に対して、レポーター領域の塩基配列が完全に相補的な配列を有するため、第１の標的塩基配列とレポーター領域とがハイブリダイズすることをいう。これに対し、「ミスマッチ」とは、標的核酸中の塩基配列に対して、レポーター領域の塩基配列が１塩基でも異なる配列を有するため、完全マッチの場合と比較して当該塩基配列とレポーター領域とがハイブリダイズしにくいことをいう。
＜プローブ＞
　本実施形態のプローブは、第１の一塩基多型を検出するレポーター領域と、第２の一塩基多型を検出するアンカー領域と、リンカー領域と、を含む。本実施形態のプローブにおいて、レポーター領域及びアンカー領域の位置関係は、標的核酸において第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型の位置関係で存在するときの、第１の標的塩基配列及び第２の標的塩基配列の位置関係に応じて、適宜設定することができる。例えば、第２の標的塩基配列が第１の標的塩基配列の３’側に位置するときは、アンカー領域はレポーター領域の５’側に配置される。
　本実施形態のプローブは、第１の一塩基多型を検出するためのレポーター領域とは別に、第２の一塩基多型を検出するための標的塩基配列に結合するアンカー領域を備える。レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い。そのため、第２の標的塩基配列にアンカー領域がハイブリダイズすることによりプローブの結合性が確保されると、リンカー領域により連結されたレポーター領域により、第１の一塩基多型の有無を正確に感度よく検出することができる。
　本実施形態のプローブの製造方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、化学合成法を用いた通常のオリゴヌクレオチドの合成方法等が挙げられる。本実施形態のプローブは、通常のオリゴヌクレオチドからなるため複雑な合成方法がいらず、簡便且つ安価に製造することができる。
（レポーター領域）
　レポーター領域は、第１の一塩基多型を検出するための領域である。レポーター領域のオリゴヌクレオチドは、第１の一塩基多型が存在する第１の標的塩基配列と相補的な塩基配列からなるヌクレオチドである。レポーター領域は、第１の一塩基多型が存在する第１の標的塩基配列に対して完全マッチし、第１の標的塩基配列以外の配列（第１の一塩基多型が存在しない以外は第１の標的塩基配列と同一である配列を含む）のときにはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
　また、レポーター領域は、第１の標的塩基配列及びレポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素を有する。レポーター領域がこのような蛍光色素を有することにより、その蛍光強度を測定することで、一塩基多型の検出を簡便に行うことができる。このような特徴を有する蛍光色素としては、例えば、ＱＰｒｏｂｅシリーズ（日鉄住金環境社製）が挙げられる。ＱＰｒｏｂｅは、ハイブリダイズした際に蛍光色素を修飾した塩基に相補する塩基の近傍にグアニンがあるとき、蛍光共鳴エネルギー移動が生じ、蛍光が消光する。ＱＰｒｏｂｅが有する蛍光色素としては、具体的には、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ、ＡＴＴＯ４６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　６Ｇ、ＴＡＭＲＡ及びＡＴＴＯ６５５等が挙げられる。このような蛍光色素を用いることで、レポーター領域及び第１の標的塩基配列がハイブリダイズするか否かによって蛍光特性が変化する。そのため、本実施形態のプローブは、蛍光色素を有するプローブを用いた通常のＳＮＰの検出方法のように消光剤を添加する必要がなく、経済的に優れる。蛍光色素は、レポーター領域において、リンカー領域とは反対側の末端に結合させることが好ましい。
　第１の一塩基多型の検出能をより高める観点から、レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、３～６個のヌクレオチドが好ましく、３～５個のヌクレオチドがより好ましく、４又は５個のヌクレオチドが更に好ましい。また、本実施形態のプローブにおいては、シス型ＳＮＰの検出能を向上させる観点から、レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い。レポーター領域が標的核酸にハイブリダイズし、蛍光色素の蛍光を消光させる観点から、レポーター領域のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素の結合部位から１～３個以内に、第１の標的塩基配列中にグアニンが存在するように設計することが好ましい。
（アンカー領域）
　アンカー領域は、第２の一塩基多型を検出するための領域である。アンカー領域のオリゴヌクレオチドは、第２の一塩基多型が存在する第２の標的塩基配列と相補的な塩基配列からなるヌクレオチドである。アンカー領域は、第２の一塩基多型が存在する第２の標的塩基配列に対して完全マッチし、第２の標的塩基配列以外のとき（第２の一塩基多型が存在しない以外は第２の標的塩基配列と同一である配列を含む）にはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。第２の標的塩基配列に対して良好な結合性を得る観点から、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、８～２０個のヌクレオチドが好ましく、１０～１８個のヌクレオチドでより好ましく、１１～１５個のヌクレオチドが更に好ましく、１４又は１５個のヌクレオチドが特に好ましい。
（リンカー領域）
　リンカー領域は、プローブの自由度を増加させるための領域である。リンカー領域は、レポーター領域及びアンカー領域を連結している。リンカー領域は、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在する場合の標的核酸における第１の標的塩基配列及び第２の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。
　プローブをより安価に合成できるという観点から、リンカー領域は、ユニバーサル塩基を含まないことが好ましい。ユニバーサル塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル以外の塩基であるユニバーサル塩基、又はそのアナログ等が挙げられる。ユニバーサル塩基又はそのアナログとしては、例えば、５－ニトロインドール、デオキシリボシド、３－ニトロピロールデオキシリボシド、４－ニトロベンゾイミダゾールデオキシリボシド、デオキシネブラリン、デオキシイノシン、２’－ＯＭｅイノシン、２’－ＯＭｅ５－ニトロインドールリボシド、２’－ＯＭｅ３－ニトロピロールリボシド、２’－Ｆイノシンリボシド、２’－Ｆネブラリン、２’－Ｆ５－ニトロインドールリボシド、２’－Ｆ４－ニトロベンゾイミダゾールリボシド、２’－Ｆ３－ニトロピロールリボシド、ＰＮＡ－５－ニトロインドール（ｉｎｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）、ＰＮＡ－ネブラリン、ＰＮＡ－イノシン、ＰＮＡ－４－ニトロベンゾイミダゾール、ＰＮＡ－３－ニトロピロール、モルホリノ－５－ニトロインドール、モルホリノ－ネブラリン、モルホリノ－イノシン、モルホリノ－４－ニトロベンゾイミダゾール、モルホリノ－３－ニトロピロール、ホスホラミダイト－５－ニトロインドール、ホスホラミダイト－ネブラリン、ホスホラミダイト－イノシン、ホスホラミダイト－４－ニトロベンゾイミダゾール、ホスホラミダイト－３－ニトロピロール、２’－Ｏ－メトキシエチルイノシン、２’－Ｏ－メトキシエチルネブラリン、２’－Ｏ－メトキシエチル５－ニトロインドールリボシド、２’－Ｏ－メトキシエチル４－ニトロ－ベンゾイミダゾールリボシド、２’－Ｏ－メトキシエチル３－ニトロピロールリボシド、デオキシＲＰＭＰ－５－ニトロインドールダイマー２’－ＯＭｅＲＰＭＰ－５－ニトロインドールダイマー等が挙げられる。
　リンカー領域は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか１種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これにより、リンカー領域で標的核酸に結合する可能性が低下するため、レポーター領域の自由度が増し、シス型ＳＮＰの検出能を向上させやすい。また、リンカー領域を上記塩基のみで構成することで、より安価にプローブを合成することができる傾向にある。
　また、リンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、３～１１個のヌクレオチドが好ましく、３～９個のヌクレオチドがより好ましく、７個であることが特に好ましい。リンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さを上記範囲とすることで、標的核酸に結合するアンカー領域とレポーター領域とが一定距離離れるため、レポーター領域の自由度が増し、シス型ＳＮＰの検出能が向上する傾向にある。また、標的核酸と本実施形態のプローブとがハイブリダイズする際に、立体構造上の自由度を得る観点から、リンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、上述した第１の標的塩基配列及び第２の標的塩基配列の間隔（インターバル）に対して、－５～＋５個が好ましく、－３～＋３個がより好ましい。
＜プローブを用いた第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法＞
　本実施形態のプローブは、第１の一塩基多型を検出するレポーター領域に蛍光色素を有するため、その蛍光強度に基づいて、標的核酸における第１の一塩基多型の有無を検出することができる。
　第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法の一実施形態としては、本実施形態のプローブ並びに第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、この混合液の蛍光強度を測定する工程と、測定した蛍光強度に基づき、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する工程と、を備える方法が挙げられる。
　図１は、第１の一塩基多型がＣ７９７Ｓ、第２の一塩基多型がＴ７９０Ｍである場合の、本実施形態のプローブと、標的核酸とを混合したときの両者の状態を模式的に表した図である。Ｔ７９０Ｍが存在する第２の標的塩基配列に対して相補的な配列を有するアンカー領域において、プローブは標的核酸とハイブリダイズする（図１（ａ）及び（ｂ－１））。そして、さらにレポーター領域が、Ｃ７９７Ｓが存在する第１の標的塩基配列とハイブリダイズすると、蛍光色素の蛍光は消光する（図１（ａ））。この場合、Ｃ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍはシス型で存在すると判断できる。一方、レポーター領域がミスマッチとなる場合、レポーター領域はハイブリダイズできないため、蛍光色素の蛍光は発光し続ける（図１（ｂ－１））。この場合、Ｃ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍはトランス型で存在すると判断できる。また、本実施形態のプローブは、アンカー領域のヌクレオチドの長さよりも、レポーター領域のヌクレオチドの長さが短く、アンカー領域によりプローブの結合性が確保される。そのため、アンカー領域がミスマッチとなる場合には、Ｃ７９７Ｓが存在する第１の標的塩基配列が存在していても、レポーター領域は第１の標的塩基配列にハイブリダイズすることはできないため、蛍光色素の蛍光は発光し続ける（図１（ｂ－２））。この場合も、Ｃ７９７Ｓ及びＴ７９０Ｍはトランス型で存在すると判断できる。
　本実施形態のプローブは、レポーター領域が標的核酸における第１の標的塩基配列とハイブリダイズしないときは蛍光を発している。したがって、例えば、プローブ及び標的核酸を混合した際に、混合前に比べてその混合液の蛍光強度が減少するときには、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在すると判断することができる。逆に、プローブ及び標的核酸を混合した際に、混合前に比べてその混合液の蛍光強度が維持される又は増加するときには、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がトランス型で存在すると判断することができる。上記蛍光強度は、室温（２５℃付近）でも測定できるため、本実施形態の方法によれば、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかの判別を効率的に行うことができる。
　ＳＮＰを検出するための方法の別の実施形態としては、Ｔｍ（融解温度：Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）解析を行う方法が挙げられる。Ｔｍ解析は、当業者が通常用いる方法で行うことができる。Ｔｍ解析としては、例えば、プローブ及び標的核酸を混合し、この混合液の温度を変化させつつ、そのときの混合液の蛍光強度を測定する方法が挙げられる。レポーター領域がミスマッチとなる場合、完全マッチする場合と比較してプローブ及び標的核酸の複合体の熱安定性が低いため、より低い温度でレポーター領域が標的核酸に結合し、蛍光の消光が測定される。この時の温度を消光開始温度と呼ぶ。一方、レポーター領域が完全マッチとなる場合、ミスマッチする場合と比較してプローブ及び標的核酸の複合体の熱安定性が強いため、より高い温度でもレポーター領域が標的核酸と結合し、蛍光の消光が測定される。したがって、例えば、レポーター領域がミスマッチとなるときの標的核酸の消光開始温度を測定し、この値よりも消光開始温度が高温であるときは、測定に用いた標的核酸では、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在すると判断することができる。ただし、レポーター領域の特異性が高く、ミスマッチとなる場合に全く消光が測定されない場合には、例えば、アンカー領域がミスマッチとなるときの標的核酸の消光開始温度を測定し、この値よりも消光開始温度が高温であるときは、測定に用いた標的核酸では、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在すると判断することができる。
　本実施形態の第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法は、プローブ並びに第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程において、さらに、競合オリゴヌクレオチドを混合することができる。競合オリゴヌクレオチドは、第１の標的塩基配列に対する野生型の塩基配列と完全相補する配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよく、第２の標的塩基配列に対する野生型の塩基配列と完全相補する配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよく、またその組み合わせであってもよいが、第２の標的塩基配列に対する野生型の塩基配列と完全相補する配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましい。競合オリゴヌクレオチドをさらに加えることで、シス型ＳＮＰの検出精度を向上することができる。
　本実施形態のプローブは、アンカー領域が第２の標的塩基配列を介して標的核酸にハイブリダイズするため、第１の一塩基多型を検出するレポーター領域のヌクレオチドの長さを非常に短くすることができる。そのため、レポーター領域の特異性が高くなり、室温のような温度が低い条件下でも、レポーター領域はミスマッチの配列に対してハイブリダイズしにくくなる。その結果、ミスマッチの際の室温付近における混合液の蛍光強度は、消光開始温度のときの蛍光強度と比較しても、顕著には低下しない。一方で、レポーター領域が完全マッチするとき、レポーター領域は室温付近で第１の標的塩基配列を介して標的核酸とハイブリダイズする。したがって、完全マッチの際の室温付近における混合液の蛍光強度は、消光開始温度のときの蛍光強度と比較して、顕著に減少し、およそ６０％以下になる。したがって、例えば、Ｔｍ解析を用いたＳＮＰの検出方法において、室温付近における混合液の蛍光強度が、消光開始温度のときの蛍光強度の６０％以下になるとき、測定に用いた標的核酸では、第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在すると判断することができる。
　本実施形態の判別方法において、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の方法により増幅された増幅産物を標的核酸として用いてもよい。
　本実施形態のプローブ及び判別方法によれば、例えば、第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が、シス型又はトランス型と異なる位置関係で存在することで、病徴が変化する疾患を有する患者に対する診断、適切な治療薬・治療方法等を選択する上での指標を提供することができる。また、例えば、第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が、シス型又はトランス型と異なる位置関係で存在することで、治療薬への反応が変化する疾患を有する患者に対する適切な治療薬・治療方法等を選択する上での指標を提供することができる。また、例えば、治療薬への耐性の原因となる第１の一塩基多型と第２の一塩基多型が、シス型又はトランス型と異なる位置関係で存在することで、治療薬への耐性の強度等が異なる場合に、その耐性への対応の選択及び耐性を克服するための治療薬・治療方法の開発等のための指標を提供することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１：プローブ及びＬＡＭＰ法用プライマーの設計］
　リファレンス配列として、Homo sapiens epidermal growth factor receptor (EGFR), RefSeqGene(LRG_304) on chromosome 7（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００７７２６）の配列を用いた。ＥＧＦＲ遺伝子における変異は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施例においては、上記の変異のうち、Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを対象とした。Ｔ７９０Ｍを検出するためのプローブ及び競合オリゴ配列、Ｃ７９７Ｓを単独で検出するためのプローブ及び競合オリゴ配列、並びにＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓがシス型で存在する場合を検出するためのプローブ及び競合オリゴ配列を、表２のように設計した。なお、Ｃ７９７Ｓは２３８９Ｔ＞Ａと２３９０Ｇ＞Ｃの２つの変異があることが知られているが、検出頻度の高い２３８９Ｔ＞Ａに基づきＣ７９７Ｓを検出するプローブを設計した。以下、２３８９Ｔ＞Ａの変異によるＣ７９７ＳをＣ７９７Ｓ＿１、２３９０Ｇ＞Ｃの変異によるＣ７９７ＳをＣ７９７Ｓ＿２とも表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＬＡＭＰ法用にプライマーを以下のように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２：ＬＡＭＰ法を用いたＣ７９７Ｓ＿１の検出］
　実施例１で設計したＣ７９７Ｓ＿１（２３８９Ｔ＞Ａ）を単独で検出するためのプローブ（表２のＣ７９７Ｓ検出用プローブ）による、Ｃ７９７Ｓの検出能を、ＬＡＭＰ法を用いて測定した。
（材料）
　鋳型ＤＮＡ：Ｃ７９７Ｓ＿１（２３８９Ｔ＞Ａ）を含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ、Ｃ７９７Ｓ＿２（２３９０Ｇ＞Ｃ）を含むＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ、野生型のＥＧＦＲ遺伝子配列を有するＤＮＡ。鋳型ＤＮＡは、上記ＤＮＡを単独又は混合して用いる。
　ＱＰｒｏｂｅ結合プローブ：配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡにＱＰｒｏｂｅを結合させたもの（Ｃ７９７Ｓ検出用プローブ）。
　ＬＡＭＰ用プライマー：配列番号７～１０のいずれかの塩基配列を有するプライマー。
　ＬＡＭＰ用マスターミックス：３０ｍＭ　ＫＣｌ、１．８％　Ｄｅｘｔｒａｎ、１４ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ、０．１％　ｎ－ｈｅｐｔｙｌ、０．５％　Ｔｗｅｅｎ、０．３％　ＦＣＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１．７ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰｓ、８ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１．６μＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（ＦＩＰ、配列番号９）、Ｂａｃｋｗａｒｄ　ｉｎｎｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ（ＢＩＰ、配列番号１０）、０．８μＭ　Ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒ（ＬＰ、配列番号１１）、０．２μＭ　Ｆ３（配列番号７）、０．２μＭ　Ｂ３（配列番号８）、１．２μＭ　競合オリゴ、０．０４μＭ　ｐｒｏｂｅ、０．０３７５×　ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ　（ｇｅｌ　ｇｒｅｅｎ）、１９．７Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上は、濃度は２５μＬ時の最終濃度）。
（方法）
　ＬＡＭＰ用マスターミックス２０μｌに対して加熱変性させた鋳型ＤＮＡ５μｌ（鋳型量１００００ｃｐｓ）を添加し反応液を調製した。リアルタイム蛍光測定器ＬＣ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）にて、反応液を６５℃９０分インキュベートし、増幅産物を９５℃５分で熱変性させてから、３７℃５分で増幅産物とＱＰｒｏｂｅ結合プローブをハイブリダイズさせた。反応後、反応液の温度を３７℃～８０℃まで徐々に上昇（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　７／℃）させ、蛍光強度を測定して熱融解曲線解析を行った。蛍光強度は、ＱＰｒｏｂｅがＢｏｄｉｐｙＦＬを有するときには、４６５／５１０（ｎｍ）にて測定し、ＱＰｒｏｂｅがＴＡＭＲＡを有するときには、５３３／５８０（ｎｍ）にて測定した。
（結果）
　熱融解曲線解析を行った際の蛍光強度の変化を図２に示す。実施例１で設計したＣ７９７Ｓ検出用プローブを用いることにより、鋳型量が１００００ｃｐｓのとき、Ｃ７９７Ｓ＿１の変異含有率５％まで検出できることが示された。ここで、変異含有率とは、鋳型ＤＮＡ全体における変異を含む鋳型ＤＮＡの割合を意味する。
［実施例３：ＬＡＭＰ法を用いたシス型リンカープローブのスクリーニング］
　図３のように、長さが同じ３つのプローブ（１）～（３）を作成した。各プローブには、ＱＰｒｏｂｅ（ＴＡＭＲＡ）が結合されている。
（１）Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを含む配列からなるプローブ（配列番号１２）
（２）Ｔ７９０Ｍを含む配列及び野生型の配列からなるプローブ（配列番号１３）
（３）野生型の配列及びＣ７９７Ｓを含む配列からなるプローブ（配列番号１４）
　これに対して、Ｔ７９０Ｍを認識する配列及びＣ７９７Ｓを認識する配列がリンカーで結合された合成オリゴヌクレオチドを設計した。Ｔ７９０Ｍを認識する配列は変えずに、Ｃ７９７Ｓを認識する配列及びリンカーの長さをそれぞれ変化させ、表４のように４種類の合成オリゴヌクレオチドを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして用い、図３のプローブ（１）～（３）をそれぞれＱＰｒｏｂｅ結合プローブとして用いて、以下の試薬組成でハイブリダイズさせた。スクリーニング用マスターミックス（３０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％　Ｔｗｅｅｎ、１．６μＭ　合成オリゴヌクレオチド、０．０５μＭ　プローブ）を混合させた後、リアルタイム蛍光測定器ＬＣ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）にて、反応液の温度を３７～８０℃まで徐々に上昇（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　７／℃）させ、蛍光強度を測定して熱融解曲線解析を行った。蛍光強度を測定して熱融解曲線解析を行った結果、Ｃ７９７Ｓ－１の合成オリゴヌクレオチドを用いたときに、最も効率よくプローブ（１）のみが消光し、シス型のＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを含む配列のみを検出することができた。図３に記載されたＴ７９０Ｍを認識する配列及びＣ７９７Ｓを認識する配列がリンカー（ＴＴＴＴＴＴＴ）で結合された合成オリゴヌクレオチドを用いたときの熱融解曲線解析の結果を図４に示す。
［実施例４：ＬＡＭＰ法を用いたシス型変異の検出］
　実施例３において、効率よくシス型のＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを含む配列のみを検出することができたＣ７９７Ｓ－１の合成オリゴヌクレオチド（配列番号３）をプローブへと変換し、シス型検出用リンカープローブを作製した。
　実施例１のＥＧＦＲ遺伝子リファレンス配列及び表１の変異を参考に、シス型のＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを含むＥＧＦＲ遺伝子配列、トランス型のＴ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓを含むＥＧＦＲ遺伝子配列、Ｔ７９０Ｍのみを含むＥＧＦＲ遺伝子配列、並びにＣ７９７Ｓのみを含むＥＧＦＲ遺伝子配列を設計し、人工遺伝子を作製した。
　上記人工遺伝子及び野生型のＥＧＦＲ遺伝子の配列を有するゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして用い、上記シス型検出用リンカープローブをＱＰｒｏｂｅ結合プローブとして用いて、実施例２と同様にＬＡＭＰ法によりハイブリダイズさせた。Ｃ７９７Ｓのみを含む人工遺伝子の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた場合にわずかに観察される消光を除外し、さらに感度を高めるため、Ｔ７９０Ｍ配列部位の野生型に完全相補する競合オリゴ（配列番号２）を１．２μＭ添加した。ＬＡＭＰ産物について実施例２と同様に蛍光強度を測定して熱融解曲線解析を行った結果を図５に示す。
　上記シス型検出用リンカープローブを用いることにより、Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓがシス型で存在する場合のみを検出することができた。また、変異含有率１２．５％まで検出できることが示された。ここで、変異含有率とは、鋳型ＤＮＡ全体における変異を含む鋳型ＤＮＡの割合を意味する。

Claims (5)

  1. 　第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸において、前記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別するための一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、
    　前記標的核酸が、前記第１の一塩基多型が存在する第１の標的塩基配列と、前記第２の一塩基多型が存在する第２の標的塩基配列と、を含み、
    　前記プローブが、前記第１の一塩基多型を検出するレポーター領域と、前記第２の一塩基多型を検出するアンカー領域と、リンカー領域と、を含み、
    　前記レポーター領域が、前記第１の標的塩基配列に対して完全マッチする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、前記第１の標的塩基配列及び前記レポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素と、を有し、
    　前記アンカー領域が、前記第２の標的塩基配列に対して完全マッチする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
    　前記リンカー領域が、前記レポーター領域及び前記アンカー領域を連結しており、前記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在する場合の前記標的核酸における前記第１の標的塩基配列及び前記第２の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
    　前記レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さが、前記アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短い、プローブ。
  2. 　前記リンカー領域が、ユニバーサル塩基を含まない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブ。
  3. 　前記リンカー領域が、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか１種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のプローブ。
  4. 　前記リンカー領域が、３～１１個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載のプローブ。
  5. 　第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する方法であって、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載のプローブ並びに第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型が異なる位置に存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、
    　前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
    　前記蛍光強度に基づき、前記第１の一塩基多型及び第２の一塩基多型がシス型で存在するか又はトランス型で存在するかを判別する工程と、を備える方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024023510A1 (en) * 2022-07-26 2024-02-01 Mast Group Limited Method and kit for detecting single nucleotide polymorphisms (snp) by loop-mediated isothermal amplification (lamp)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001286300A (ja) * 1999-04-20 2001-10-16 Japan Bioindustry Association 核酸の測定方法、それに用いる核酸プローブ及びその方法によって得られるデータを解析する方法
WO2004000995A2 (en) * 2002-05-22 2003-12-31 Marshall University Methods, probes, and accessory molecules for detecting single nucleotide polymorphisms
WO2006086777A2 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and compositions for detecting a drug resistant egfr mutant
JP2009517054A (ja) * 2005-12-02 2009-04-30 サイモンズ ハプロミクス リミテッド 遺伝子マッピング及びハプロタイプ決定の方法
WO2011052754A1 (ja) 2009-10-30 2011-05-05 アークレイ株式会社 Ｅｇｆｒ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
JP2012523821A (ja) * 2009-03-27 2012-10-11 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット
WO2013145939A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 日本電気株式会社 標的物質の検出方法、検査キット、および検出装置
JP2014526257A (ja) * 2011-09-19 2014-10-06 エピスタム リミテッド 複数の標的領域特異性および三部分的特性を有するプローブ
WO2016098595A1 (ja) 2014-12-19 2016-06-23 栄研化学株式会社 一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び一塩基多型検出方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1430150B1 (en) * 2001-09-24 2015-08-19 One Lambda, Inc. Diagnostic probe detection system
WO2005010201A2 (en) 2003-01-29 2005-02-03 Naxcor, Inc. Methods and compositions for detecting nucleic acid sequences
CN103898207B (zh) * 2003-08-01 2016-09-14 戴诺生物技术有限公司 自杂交多重靶核酸探针及其使用方法
US8673564B2 (en) 2007-06-07 2014-03-18 Haplomic Technologies Pty Ltd In situ methods for gene mapping and haplotyping
US7989465B2 (en) * 2007-10-19 2011-08-02 Avila Therapeutics, Inc. 4,6-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors
US20110207736A1 (en) * 2009-12-23 2011-08-25 Gatekeeper Pharmaceuticals, Inc. Compounds that modulate egfr activity and methods for treating or preventing conditions therewith
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
WO2015071552A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Multi-unit probes with high specificity and a method of designing the same
US20160281166A1 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 Parabase Genomics, Inc. Methods and systems for screening diseases in subjects
JP7511326B2 (ja) 2015-10-09 2024-07-05 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド オリゴヌクレオチド組成物およびその方法
CN107083438A (zh) * 2017-06-12 2017-08-22 上海捷易生物科技有限公司 检测egfr基因20外显子t790m和c797s突变的引物、探针及方法
CN107488710B (zh) 2017-07-14 2020-09-22 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
CN109504777B (zh) * 2018-12-29 2020-05-12 江苏先声医学诊断有限公司 用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统
CN109554444A (zh) * 2018-12-31 2019-04-02 新羿制造科技（北京）有限公司 一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001286300A (ja) * 1999-04-20 2001-10-16 Japan Bioindustry Association 核酸の測定方法、それに用いる核酸プローブ及びその方法によって得られるデータを解析する方法
WO2004000995A2 (en) * 2002-05-22 2003-12-31 Marshall University Methods, probes, and accessory molecules for detecting single nucleotide polymorphisms
WO2006086777A2 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and compositions for detecting a drug resistant egfr mutant
JP2009517054A (ja) * 2005-12-02 2009-04-30 サイモンズ ハプロミクス リミテッド 遺伝子マッピング及びハプロタイプ決定の方法
JP2012523821A (ja) * 2009-03-27 2012-10-11 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット
WO2011052754A1 (ja) 2009-10-30 2011-05-05 アークレイ株式会社 Ｅｇｆｒ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
JP2014526257A (ja) * 2011-09-19 2014-10-06 エピスタム リミテッド 複数の標的領域特異性および三部分的特性を有するプローブ
WO2013145939A1 (ja) * 2012-03-28 2013-10-03 日本電気株式会社 標的物質の検出方法、検査キット、および検出装置
WO2016098595A1 (ja) 2014-12-19 2016-06-23 栄研化学株式会社 一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び一塩基多型検出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. UCHIBORI ET AL.: "Brigatinib combined with anti-EGFR antibody overcomes osimertinib resistance in EGFR-mutated non-small-cell lung cancer", NATURE COMMUNICATIONS, 2017
See also references of EP3766992A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024023510A1 (en) * 2022-07-26 2024-02-01 Mast Group Limited Method and kit for detecting single nucleotide polymorphisms (snp) by loop-mediated isothermal amplification (lamp)

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