WO2020022541A1 - 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간부전의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간부전의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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exosomes
liver failure
acute liver
composition
stem cells
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설재훈
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김은애
조용우
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Sungkyunkwan University
Exostemtech Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of acute liver failure, including exosomes (Exosome) as an active ingredient.
  • liver function impairment In healthy people without a history of liver disease, acute hepatic insufficiency is associated with rapid progression of hepatic encephalopathy and coagulation disorders within 26 weeks after the initial symptoms of liver function impairment.
  • hepatic encephalopathy a neurological syndrome called hepatic encephalopathy, often with symptoms of convulsions and delirium, and dangerous enough to progress rapidly into coma. Cerebral edema can occur with hepatic encephalopathy, which causes hernia of the brainstem due to a sharp rise in brain pressure, which threatens the patient's condition.
  • liver transplantation Treatment of acute liver failure can be divided into treatment of liver transplantation and various complications.
  • Liver transplantation is the final treatment of acute liver failure and is the only way to improve survival. Nevertheless, acute hepatic failure is accompanied by various serious complications including hepatic encephalopathy, and thus, the course of the disease and the outcome of treatment are very poor.
  • hepatic fibrosis is a chronic and progressive disease in which hepatic cells are destroyed and normal tissues are replaced by scar tissues, and thus the basic structural changes and liver functions are lost.
  • the present invention is to increase the survival rate of patients and improve liver numbers through the inhibition of apoptosis and inflammatory response alleviation, so it is clear that there is a big difference from the conventional pharmaceutical composition for preventing liver fibrosis.
  • mesenchymal stem cells one of the adult stem cells, are pluripotent cells that can differentiate into mesenchymal tissues such as bone, cartilage, muscle, and liver under specific culture conditions.
  • the advantage is that a sufficient amount can be secured without.
  • the use value is very high by helping to settle cells and prolong the survival of transplanted cells.
  • mesenchymal stem cells have been shown to secrete a variety of substances (secretomes) that induce neurons, angiogenesis and anti-inflammatory responses. Research has shown that these secretions can be used to alleviate diseases such as cancer and heart disease. Therefore, the possibility of cell-free therapy with secreto has been suggested in the field of tissue therapy and regeneration.
  • secretomes substances that induce neurons, angiogenesis and anti-inflammatory responses.
  • exosomes containing the secreto are known as important mediators for transporting certain components from one cell to another and can cause changes in the gene expression of the cells that receive them.
  • Exosomes are 40-200 nm sized particles that act as extracellular vesicles and are secreted from various cells, including stem cells, present in blood, biological fluids, urine and cell culture fluids. Confirmed. These exosomes are produced through the fusion of late plasma endosome and plasma membrane generated through intracellular endosomal trafficking process.
  • Exosomes not only contain specific proteins and mRNA transcripts expressed in the cell, but also importantly, various small non-coding RNAs (microRNA, piRNA, etc.) that regulate gene expression as RNA itself. Therefore, exosomes are known to reflect the genetic properties of the cells of origin.
  • compositions for treating skin wounds or chronic lung diseases using exosomes are already known, but there is no research for treating acute liver failure using exosomes as in the present invention, and more studies on these are required.
  • the inventors of the present invention showed that acute liver failure-induced animal model administered with exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells had a higher survival rate and improved aspartate aminotransferase (AST) and ALT (Apart). It was confirmed experimentally that the alanine aminotransaminase) value and also inhibits apoptosis and anti-inflammatory effect, the present invention was completed based on this.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating acute liver failure comprising a exosome (Exosome) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a food composition for preventing or improving acute liver failure (Exosome), including acute liver failure (Exosome).
  • Another object of the present invention includes administering a composition comprising an exosome (Exosome) as an active ingredient, a method for treating a subject having acute liver failure (Acute liver failure) or to improve acute liver failure of the subject To provide a way.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating acute liver failure (Acute liver failure) comprising an exosome (Exosome) as an active ingredient.
  • the exosomes may be derived from adipose derived mesenchymal stem cells.
  • composition may inhibit the expression of Bcl-2-associated X protein (BAX), or inhibit the activity of Caspase-3.
  • BAX Bcl-2-associated X protein
  • the composition may inhibit the inactivation of PARP ⁇ Poly (ADP-ribose) polymerase ⁇ .
  • the composition may alleviate the inflammatory response.
  • the inflammatory response may be an inflammatory response by immune cell infiltration.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving acute liver failure, comprising a exosome (Exosome).
  • the present invention is a composition for the prevention, improvement or treatment of acute liver failure using exosomes, animal models in which exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells in acute liver failure-induced animal model compared to the animal model not administered
  • the survival rate was high, aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransaminase (ALT) levels were improved, and apoptosis inhibitory and anti-inflammatory effects were found.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical for the prevention, improvement or treatment of acute liver failure. It can be usefully used as a composition, a food composition.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • GalN D-(+)-Galactosamine
  • FIG. 2 shows the results of comparing AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransaminase) values in mouse serum administered with LPS / GalN alone and mouse serum administered with exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells together with LPS / GalN. to be.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the expression of protein factors associated with apoptosis in mice treated with only LPS / GalN and mouse liver tissues administered with exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells with LPS / GalN. .
  • Figure 4 shows the difference between the hematoxylin and eosin inflammatory response due to immune cell invasion in mice administered only LPS / GalN and mice administered with exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells together with LPS / GalN ( Hematoxylin & Eosin) staining.
  • the inventors of the present invention showed that acute liver failure-induced animal model administered with exosomes derived from adipose-derived mesenchymal stem cells had a higher survival rate than acute liver failure-induced animal models not administered with exosomes. It was experimentally confirmed that the aminotransaminase) value was improved and the anti-apoptotic and anti-inflammatory effects were obtained, and thus the present invention was completed.
  • mice administered with exosomes derived from adipose derived mesenchymal stem cells were found to have significantly increased survival rates compared to mice not administered with the exosomes (Example 3 Reference).
  • ADP-ribose) polymerase PARP
  • mice administered with exosomes derived from adipose derived mesenchymal stem cells through hematoxylin & eogine staining have an inflammatory response compared to those without the exosomes. It was confirmed to be inhibited (see Example 6).
  • Exosome derived from the adipose-derived mesenchymal stem cells according to the present invention through the results of the embodiment of the present invention as described above increases the survival rate of acute liver failure-induced mice and AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransaminase) values It was confirmed that there is an improvement, apoptosis inhibitory and anti-inflammatory effect, the exosomes can be used for the prevention, improvement or treatment of acute liver failure.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating acute liver failure, comprising a exosome (Exosome) as an active ingredient.
  • prevention means any action that inhibits or delays the development of acute liver failure by administration of a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms caused by acute liver failure by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Exosome refers to a small vesicle of the membrane structure secreted from various cells and vesicles are released into the extracellular environment by fusion of the polycystic body and the plasma membrane. Exosomes contain a genetic factor and serve to transfer information of the genetic factor from one cell to another, the diameter of which is approximately 30-200 nm, but is not limited thereto.
  • acute liver failure used in the present invention refers to a case of rapidly progressing to hepatic encephalopathy and blood coagulation disorder within 26 weeks after the initial symptom due to liver function impairment in a healthy person without a history of liver disease. Hepatic encephalopathy within 7 days is classified as acute hepatic insufficiency, acute hepatic insufficiency within 7 to 3 weeks, and acute hepatic insufficiency within 3 to 26 weeks.
  • the causes of acute liver failure vary, but are most commonly caused by viral infections and medications or toxins.
  • the most characteristic clinical symptoms are neurological syndromes called hepatic encephalopathy, which often lead to convulsions and delirium, and rapidly coma. It is dangerous enough to proceed to the road.
  • Treatment can be divided into liver transplantation and treatment of various complications.
  • Liver transplantation is the final treatment for acute liver failure and is the only way to improve survival.
  • Treatment of various complications should be carried out through careful diagnosis and examination in the intensive care unit of a hospital where liver transplantation is possible.
  • Acute hepatic insufficiency is accompanied by various serious complications including hepatic encephalopathy.
  • Exosomes in the present invention may be derived from adipose derived mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • stem cell refers to a cell that has the ability to differentiate into two or more different types of cells while having an ability to self-replicate as an undifferentiated cell.
  • the stem cells may be autologous or allogeneic stem cells, derived from any type of animal, including humans and non-human mammals, and are not limited to whether the stem cells are derived from adults or embryos.
  • mesenchymal stem cell has the ability to differentiate into ectoderm cells such as various mesodermal cells or neurons, including bone, cartilage, fat, and muscle cells. It is a multipotent stem cell.
  • MSCs from a variety of sources including fat, bone marrow, and cord blood, are known to have different therapeutic potentials (Jin et al., Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, Int J Mol Sci. 2013 Sep; 14 (9): 17986-18001).
  • Exosomes used as an active ingredient of the present invention is a signal carrier that contains a genetic factor and transmits information of the genetic factor from one cell to another cell, and has different characteristics depending on the state of the cell from which the exosome is extracted. Indicates.
  • adipose-derived stem cells (Stem-EXO) extracted from adipose derived stem cells, human epidermal keratinocytes (K-EXO) and exosomes (Human foreskin fibroblasts) extracted from skin fibroblasts (F-EXO) was confirmed that the bioactive factors contained therein are different from each other (WO2016-072821 A1).
  • exosomes have different characteristics depending on the source of stem cells such as adipose derived stem cells, bone marrow derived stem cells, and cord blood derived stem cells.
  • Exosomes used in the present invention may be derived from adipose-derived mesenchymal stem cells, preferably may be derived from proliferating adipose-derived mesenchymal stem cells. Exosomes derived from proliferating stem cells can be extracted in the process of culturing stem cells.
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are similar to mesenchymal stem cells derived from bone marrow or umbilical cord blood in cell morphology and immune phenotype, but have different therapeutic potentials and yield higher cell populations than cord blood-derived mesenchymal stem cells. This has a high advantage.
  • adipose tissue is extracted from autologous fat, there is no risk of immune rejection reaction, etc., and there is no ethical problem, and adipose tissue extraction or inhalation procedure may cause pain and burden to an individual when extracting mesenchymal stem cells. Compared to the bone marrow puncture to obtain bone marrow-derived mesenchymal stem cells, it seems to be relatively small.
  • adipose derived stem cells are obtained from abundant adipose tissue, it can be easily used as a raw material for exosome extraction.
  • the adipose tissue can be obtained from adipose tissue such as human, rat, mouse, dog, cow, etc., but is not limited thereto.
  • the adipose tissue is derived from human adipose tissue, more preferably, the patient's self It can be obtained from adipose tissue.
  • the composition may inhibit the expression of BAX (Bcl-2-associated X protein) or inhibit the activity of Caspase-3 (Caspase-3).
  • BAX Bcl-2-associated X protein
  • Bcl-2-associated X protein means one of the Bcl-2 family proteins, also referred to as bcl-2-like protein 4.
  • the Bax plays a role in promoting apoptosis of cells, and is mainly bound to the outer membrane of the mitochondria, and four residues of its C-terminus protrude in the intermembrane space between the mitochondrial inner membrane and the outer membrane. Exists in a state.
  • This protein is known to interact with the mitochondrial voltage dependent anion channel (VDAC) and to increase the opening of the VDAC resulting in loss of membrane potential and release of cytochrome c.
  • VDAC mitochondrial voltage dependent anion channel
  • apoptosis used in the present invention is a form of a cell in which a cell is controlled by a gene and dies, and is distinguished from necrosis, which is necrosis or pathological death of a cell. Apoptosis is responsible for shaping the body during development, and in adults it is responsible for renewing normal cells or removing abnormal cells. Cell loss in cancer cells, viral infections, drugs, and radiation are different from the similar process of programmed cell death (PCD).
  • PCD programmed cell death
  • caspase refers to the major factor that actually causes cell death by breaking down nucleoproteins and intracellular proteins at the end of apoptosis.
  • cysteine is present at the active site of the enzyme, and it is an enzyme that specifically recognizes aspartic acid in the amino acid sequence of a protein to be a substrate and then cleaves amino acid bonds.
  • Caspase-3 a 32kDa cysteine protease, is an effector caspase that plays an important role during morphogenetic cell death in the mammalian brain, and breaks down into 17kDa and 12kDa subunits. Is activated.
  • the composition may alleviate the inflammatory response.
  • the term "inflammatory reaction" used in the present invention is a reaction in which the wound is opened, reddened, swollen and painful. The inflammatory response is initiated by cytokines secreted by activated macrophages, which feed on bacteria that enter the wound, including histamine from the mast cells in the wound.
  • immune cell refers to a cell involved in innate and acquired immunity. Immune cells are cells that recognize various substances not derived from themselves and protect our bodies from pathogens, viruses, and parasites. Innate immunity is the immunity involving skin barrier, inflammatory response, complement system, cell barrier, natural killer cells, etc., and acquired immunity is immunity involving killer T cells, helper T cells, and B lymphocytes.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes an exosome as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the preparation, and include, but are not limited to, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and the like. If necessary, other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to formulate injectable formulations, pills, capsules, granules, or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be preferably formulated according to the individual components using methods disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection, inhalant, external preparation for skin, or oral ingestion, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, skin, nasal, airways) according to the desired method, and the dosage is determined by the condition and weight of the patient, disease Depending on the degree, drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • composition according to the invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level means the type of disease, the severity, and the activity of the drug. , Drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the composition according to the present invention may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex and weight of the patient. However, the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving acute liver failure, comprising a exosome (Exosome).
  • the food composition comprises a health functional food composition.
  • improvement means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, for example, the extent of symptoms.
  • the active ingredient may be added to the food as it is, or may be used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the compositions of the invention are added in amounts of up to 15% by weight, preferably up to 10% by weight relative to the raw materials. However, for long term intakes for health and hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be below this range.
  • the food composition of the present invention in addition to containing the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratio, there is no particular limitation to other ingredients, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of those skilled in the art.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • these components can be used independently or in combination.
  • the proportion of such additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Human adipose stem cell derived exosomes were extracted during the process of culturing human adipose stem cells.
  • human adipose stem cells were cultured in a Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose (DMEM) culture medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% penicillin / streptomycin (FMEM). 24 hours before extracting the exosomes, the cells were replaced with serum-free, antibiotic-free, phenol-free medium, and cultured for 24 hours, and then cell culture supernatants were recovered. After the supernatant was recovered, normal culture medium was added to the stem cells and cultured. This process was repeated until passage 7.
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose
  • FBS fetal bovine serum
  • FMEM penicillin / streptomycin
  • the recovered cell culture supernatant was removed by centrifugation at 2,000 ⁇ g, 4 ° C. for 10 minutes and filtering using a bottle top filter (pore size; 0.22 ⁇ m) to remove cell debris and waste products.
  • tangential flow filtration THF
  • MWCO Molecular Weight Cut-Off 300 kDa or 500 kDa was used as the filter specification.
  • the exosomes were washed 1 to 3 times with phosphate buffered saline (PBS).
  • the extracted exosomes were checked for concentration and protein level of exosomes through nanoparticle tracking analysis (NTA) and protein quantitative analysis.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the exosomes were measured to have 20 or more nanoparticles identified on a screen per frame, and the extracted exosomes had an average concentration of 1.78 ⁇ 10 10 particles / mL and an average size of 211.6. It was confirmed that the nm is around.
  • the average protein concentration of 185.8 ⁇ g / mL was confirmed through the BCA protein quantification method.
  • the animal model of blast liver disease was first used in three weeks old ICR male rats for one week. I was. At 4 weeks of age, after 18 hours of fasting the day before, 20 ⁇ g / kg of LPS (Lipopolysacharride) and 800 mg / kg of GalN (D-(+)-Galactosamine) were intraperitoneally administered. Exo get the preventive purpose of the LPS / GalN administered two days before every shot twice veins were injected administered some 10 7, 10 8-exo, the therapeutic purpose behind the 3 hours after LPS / GalN administered 10 7 10 Eight exosomes were administered.
  • LPS Lipopolysacharride
  • GalN D-(+)-Galactosamine
  • Example 3 Increased mouse survival following exosome administration in acute liver failure-induced animal model
  • liver levels blood was collected from the hepatic portal vein or left ventricle at 5 hours after LPS / GalN alone and LPS / GalN and 10 8 exosomes. The collected blood was incubated at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 1500g, 10 minutes, and 4 ° C. Serum was collected only from the supernatant. The collected serum was analyzed by AST and ALT levels through a liver water analyzer. As a result, the control group compared to LPS / GalN only did administration significantly increased in the rat AST, ALT levels are a mouse administered with a bit 10 8 exo to LPS / GalN has decreased significantly again.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes were 5 hours after administration of LPS / GalN alone and LPS / GalN and 10 8 exosomes to determine the degree of inhibition of apoptosis in liver tissues of mice receiving exosomes.
  • liver tissue was removed.
  • the gallbladder was removed, and Caudate Lobe was isolated from liver tissue and used as sample tissue for Western blot.
  • the isolated Caudate Lobe was placed in a Lysis buffer containing a protease inhibitor and a phosphatase inhibitor, which was then replaced by a homogenizer. After 30 minutes incubation on ice, centrifuged at 13,000rpm, 10 minutes, 4 °C, and collected only the supernatant.
  • Protein concentration was quantified by BCA quantification. 4x sample buffer containing 2-mercaptoethanol was mixed with the sample and boiled at 95 ° C. for 10 minutes. Immunoblotting was used to quantitatively and qualitatively analyze the protein levels of Active caspase-3, PARP, and BAX. As a result, active caspase-3, BAX, and cleaved PARP proteins, which are markers for cell death, were increased in liver tissues of mice treated with LPS / GalN only, but decreased in mice treated with LPS / GalN and 10 8 exosomes.
  • liver tissues were extracted at 5 hours after LPS / GalN alone administration and LPS / GalN and 10 8 exosomes. After washing with PBS, the gallbladder was removed, and the left lobe of the liver tissue was separated and used as a sample tissue for hematoxylin and eosin staining. Liver tissue was cross-sectioned with paraffin sections and hematoxylin eosin stained with a thickness of 5 ⁇ m. A 40x magnification optical microscope was used to identify immune cells infiltrating sinusoids and central veins.
  • LPS / GalN the sinusoid and the central vein of the million administered mice, but the immune cell infiltration, including neutrophils and mononuclear cells observed, in the LPS / GalN and 10 treated with a little eight exo mouse decreased infiltration of immune cells.

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Abstract

본 발명은 엑소좀을 이용한 급성 간부전의 예방 또는 치료용 조성물로, 본 발명자들은 급성 간부전 동물 모델에서 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 생존률이 높았고, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치가 개선되었으며 세포사멸 억제효과 및 항염증 효과가 우수한 것을 실험적으로 확인하였는 바, 본 발명의 조성물은 급성 간부전을 예방, 증상을 개선 또는 치료하기 위한 의약품 및 식품 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간부전의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는 급성 간부전의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간질환의 병력이 없는 건강한 사람에게서 간기능 손상으로 인한 최초 증상 발생 후 26주 이내에 급격한 간성뇌증으로 진행과 혈액 응고 장애가 함께 나타나는 경우를 급성 간부전이라고 한다.
급성 간부전의 원인은 다양하지만, 흔히 바이러스 감염에 의한 경우와 약제 또는 독소에 의한 경우가 가장 흔하다. 가장 특징적인 임상 증상은 간성뇌증이라고 불리는 신경학적인 증후군으로 흔히 경련과 섬망과 같은 증상을 보이며, 급격히 혼수로까지 진행할 수 있을 정도로 위험하다. 간성뇌증과 함께 뇌부종이 나타날 수 있는데, 이는 급격한 뇌압의 상승으로 인한 뇌간의 헤르니아(hernia; 장기의 일부가 원래 있어야 할 장소에서 벗어난 상태)를 유발하여 환자의 상태를 위협하게 된다.
급성 간부전의 치료의 경우, 간이식 치료와 각종 합병증의 치료로 구분할 수 있는데 간이식이란 급성 간부전의 최종적인 치료법이며 생존율을 높일 수 있는 유일한 방법이다. 그럼에도 급성 간부전의 경우 간성뇌증을 포함하는 다양한 심각한 합병증이 동반되기 때문에 병의 경과 및 치료 결과가 매우 좋지 않은 문제가 있다.
반면에, 간섬유화는 간세포가 파괴되고 정상조직이 반흔조직으로 대치되면서 간의 기본구조 변화 및 간기능이 상실되는 만성적이며 진행적인 질환이라는 점에서 본 발명의 급성 간부전과는 큰 차이가 있는 질병이며, 본 발명은 세포사멸의 억제와 염증반응 완화 효과를 통해 환자의 생존률을 높이고 간수치를 개선하는 것이므로 기존의 간섬유화 방지를 위한 약학적 조성물 등과는 큰 차이가 있음이 분명하다.
한편, 성체줄기세포의 하나인 중간엽 줄기세포는 특정 배양 조건에서 뼈, 연골, 근육 및 간 등의 중간엽 조직들로 분화할 수 있는 다능성 세포로서, 쉽게 분리할 수 있으며 일반 배지 조건에서도 분화 없이 충분한 양을 확보할 수 있다는 장점이 있다. 이외에도 동종 간 세포치료에서 세포 정착을 도와 이식된 세포의 생존기간을 연장시켜줌으로써 그 이용가치가 매우 높다.
최근에 조직재생 분야에서 중간엽 줄기세포를 이용한 세포 대체 치료뿐 만 아니라 중간엽 줄기세포로부터 생성되는 물질의 근거리분비(paracrine)에 의한 치료 효과들이 보고되고 있다. 실제로 중간엽 줄기세포는 신경, 혈관생성 및 항염증반응 등을 유도하는 다양한 물질들(세크레톰; secretome)을 분비하는 것으로 확인되었다. 이러한 세크레톰을 이용해 암이나 심장 질환 같은 질병을 완화할 수 있다는 연구들이 보고되고 있다. 따라서 조직치료 및 재생 분야에서 세크레톰을 이용한 무세포치료(cell-free therapy)의 가능성이 제시되었으나, 치료 효과를 보이는 세크레톰에 구체적으로 어떠한 성분들이 포함되어 있는지에 대한 연구는 많이 부족하며, 또한 그들이 특정 질환에서 어떤 기전 및 조절 네트워크를 통해 손상 조직의 회복에 영향을 주는지에 대한 이해가 매우 미흡하여 이를 보완할 추가 연구가 반드시 필요하다.
세크레톰을 내포한 엑소좀은 한 세포로부터 다른 세포로 특정 성분을 운반하는 중요한 매개체로서, 이를 받아들이는 세포의 유전자 발현 변화를 야기할 수 있다고 알려져 있다. 엑소좀은 40-200 nm의 크기를 지닌 입자로, 세포외 운반체 (extracellular vesicles)로서 역할을 하며 줄기세포를 비롯한 다양한 세포로부터 분비되어 혈액, 체액(biological fluid), 뇨 및 세포배양액에 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 엑소좀은 세포내 엔도좀 트래피킹 과정을 통해 생성된 후기 엔도좀과 원형질막의 융합을 통해 생성된다.
엑소좀은 해당 세포에서 발현하고 있는 특정 단백질과 mRNA 전사체를 포함하고 있을 뿐만 아니라 중요하게도 RNA 자체로서 유전자의 발현을 조절하는 다양한 small non-coding RNA(microRNA, piRNA 등)들도 함유되어 있다. 따라서 엑소좀은 기원한 해당 세포의 유전적 특성을 반영하고 있다고 알려져 있다.
<선행기술문헌>
대한민국특허등록공보 10-1860266
대한민국특허등록공보 10-1843634
엑소좀을 이용하여 피부상처나 만성 폐질환 치료하는 조성물은 이미 알려져 있으나 본 발명과 같이 엑소좀을 이용하여 급성 간부전을 치료하는 연구는 전무하여 이에 대한 보다 많은 연구가 요구되고 있다.
본 발명자들은 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 동물 모델의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 급성 간부전 유발 동물 모델 보다 생존율이 높았고 개선된 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치를 보였으며 세포사멸(apoptosis) 억제 및 항염증 효과도 나타난다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간부전(Acute liver failure) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀(Exosome)을 포함하는, 급성 간부전(Acute liver failure) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 급성 간부전(Acute liver failure)을 갖는 대상체를 치료하는 방법 또는 상기 대상체가 갖는 급성 간부전을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 급성 간부전을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 엑소좀(Exosome)의 의약 또는 식품 용도를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간부전(Acute liver failure) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 BAX(Bcl-2-associated X protein)의 발현을 억제, 또는 카스파제-3(Caspase-3)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 PARP{(Poly (ADP-ribose) polymerase}의 불활성화를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 염증반응을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증반응은 면역세포 침윤에 의한 염증반응일 수 있다.
또한, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 포함하는, 급성 간부전(Acute liver failure) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 엑소좀을 이용한 급성 간부전의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로, 급성 간부전 유발 동물 모델에서 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 동물 모델의 경우 투여하지 않은 동물 모델에 비해 생존률이 높았으며, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치가 개선되었고 세포사멸 억제효과 및 항염증 효과가 우수한 것으로 밝혀진 바 본 발명의 조성물은 급성 간부전의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물, 식품 조성물 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 LPS(Lipopolysaccharide)/GalN(D-(+)-Galactosamine)만 투여한 마우스(mouse)와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함께 투여한 마우스의 생존율을 비교한 결과이다.
도 2는 LPS/GalN만 투여한 마우스와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함께 투여한 마우스 혈청에서 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치를 비교한 결과이다.
도 3은 LPS/GalN만 투여한 마우스와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 투여한 마우스 간 조직에서 세포사멸(Apoptosis)와 관련된 단백질 인자들의 발현을 분석한 결과이다.
도 4는 LPS/GalN만 투여한 마우스와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함께 투여한 마우스에서 면역세포 침윤에 의한 염증반응의 차이를 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 관찰한 결과이다.
본 발명자들은 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 동물 모델의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 급성 간부전 유발 동물 모델보다 생존율이 증가되었고 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치가 개선되었으며 세포사멸 억제 및 항염증 효과가 나타난다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 생존율이 유의하게 증가함을 확인하였다(실시예3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 개선된 AST 및 ALT수치가 나타남을 확인하였다(실시예4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 세포사멸과 관련된 인자인 BAX (Bcl-2-associated X protein)의 발현이 억제되고 카스파제-3(caspase-3)의 활성이 억제되었으며 끊어진 PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase) C-term이 적게 나타나는 것을 통하여 세포사멸이 억제됨을 확인하였다(실시예5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 헤마톡실린 & 에오진 염색을 통해 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 염증반응이 억제됨을 확인하였다(실시예6 참조).
상기와 같은 본 발명의 실시예 결과를 통해 본 발명에 따른 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 급성 간부전이 유도된 마우스의 생존율을 증가시키고 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치의 개선, 세포사멸 억제 및 항염증 효과가 있음을 확인하였는 바, 상기 엑소좀은 급성 간부전의 예방, 개선 또는 치료용도로 이용될 수 있다.
이에, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간부전(Acute liver failure) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 급성 간부전을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 급성 간부전에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하고 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀은 유전적 인자를 내포하여 한 세포에서 다른 세포로 그 유전적 인자의 정보를 전달하는 역할을 하고, 그 직경은 대략 30-200 nm이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "급성 간부전"이란 간질환의 병력이 없는 건강한 사람에게서 간기능 손상으로 인한 최초 증상 발생 후 26주 이내에 급격히 간성뇌증과 혈액 응고장애로 진행하는 경우를 말하며, 황달이 생긴 지 7일 이내 간성뇌증이 발생하는 경우를 초급성 간부전, 7일~3주 내에 발생하는 경우 급성 간부전, 3주~26주 내에 발생하는 경우는 급성 간부전으로 분류한다. 급성 간부전의 원인은 다양하지만, 흔히 바이러스 감염에 의한 경우와 약제 또는 독소에 의한 경우가 가장 흔하며 가장 특징적인 임상 증상은 간성뇌증이라고 불리는 신경학적인 증후군으로 흔히 경련과 섬망과 같은 증상을 보이며, 급격히 혼수로까지 진행할 수 있을 정도로 위험하다. 치료는 간이식 치료와 각종 합병증의 치료로 구분할 수 있으며 간이식이란 급성 간부전의 최종적인 치료법이며 생존율을 높일 수 있는 유일한 방법이다. 각종 합병증의 치료는 간이식이 가능한 병원의 중환자실에서 면밀한 진단 및 검사를 통해 시행되어야 한다. 급성 간부전의 경우 간성뇌증을 포함하는 다양한 심각한 합병증이 동반되기 때문에 병의 경과 및 치료 결과가 매우 좋지 않다.
본 발명에서 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포이다.
지방, 골수, 제대혈 등 다양한 출처로부터 유래한 MSC는 서로 상이한 치료적 잠재력을 갖는 것으로 알려져 있다(Jin et al., Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, Int J Mol Sci. 2013 Sep; 14(9): 17986-18001).
본 발명의 유효성분으로 사용하는 엑소좀은 유전적 인자를 내포하여 한 세포에서 다른 세포로 그 유전적 인자의 정보를 전달하는 신호전달체로서, 엑소좀이 추출된 세포의 상태에 의존하여 상이한 특성을 나타낸다.
예컨대 지방유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Human adipose-derived stem cells; Stem-EXO), 피부각질세포로부터 추출한 엑소좀(Human epidermal keratinocytes; K-EXO) 및 피부섬유아세포로부터 추출한 엑소좀(Human foreskin fibroblasts; F-EXO)은 내부에 포함되어 있는 생체활성인자가 서로 상이함이 확인되었다(WO2016-072821 A1).
또한 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포 등 줄기세포의 출처에 따라서도 엑소좀이 상이한 특성을 가짐이 확인되었다.
본 발명에 사용되는 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells)로부터 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 증식하는 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 것일 수 있다. 증식하는 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 줄기세포를 배양하는 과정에서 추출할 수 있다.
지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 골수 또는 제대혈에서 유래된 중간엽 줄기세포와 세포형태와 면역 표현형에서 비슷하지만, 상이한 치료적 잠재력을 가지며, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포보다 세포 군집형성 빈도가 높으므로 수율이 높은 이점이 있다.
또한, 지방조직은 자가 지방에서 추출하므로 면역거부 반응 등의 위험이 없으며, 윤리적으로도 문제가 없고, 지방조직 추출 또는 흡입 시술은 중간엽 줄기세포를 추출할 때 개체에게 줄 수 있는 통증 및 부담감이 골수유래 중간엽 줄기세포를 얻기 위한 골수 천자와 비교할 때 상대적으로 적을 것으로 판단된다.
또한 환자로부터 얻을 수 있는 골수 및 혈액의 양은 크게 제한되어 있는 반면, 지방 유래 줄기세포는 풍부한 지방조직으로부터 얻어지므로, 엑소좀 추출을 위한 원재료로서 용이하게 이용할 수 있다.
상기 지방조직은 인간, 렛트(rat), 마우스(mouse), 개, 소 등의 지방조직으로부터 수득할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간의 지방조직으로부터, 더 바람직하게는 환자의 자가지방조직으로부터 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 BAX(Bcl-2-associated X protein)의 발현을 억제, 또는 카스파제-3(Caspase-3)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "BAX (Bcl-2-associated X protein)"는 bcl-2-like protein 4라고도 호칭되는 Bcl-2 패밀리 단백질 중의 하나를 의미한다. 상기 Bax는 세포의 세포사멸(apoptosis)를 촉진시키는 역할을 수행하는데, 주로 미토콘드리아의 외막에 결합된 상태로 존재하며, 그의 C-말단의 4개 잔기는 미토콘드리아 내막과 외막 사이의 막간 공간에 돌출된 상태로 존재한다. 이 단백질은 미토콘드리아 전압 의존적 음이온체널(VDAC)과 상호작용하고, 막 전위의 손실 및 시토크롬 c의 방출을 초래하는 VDAC의 개방을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "세포사멸(apoptosis)"란 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로 세포의 괴사나 병적인 죽음인 네크로시스(Necrosis)와는 구별된다. 아포토시스는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다. 암 세포 내의 세포 소실, 바이러스 감염과 약물, 방사선 등에서 일어난다는 점은 유사한 과정인 프로그램 세포사(PCD:programmed cell death)와 다른 점이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "카스파제(caspase)"란 세포사멸의 마지막 단계에서 핵단백질과 세포내 단백질을 분해하여 실제로 세포 사망을 일으키는 주된
단백분해 효소로서 효소의 활성 부위에 시스테인(cystene)이 있으며, 기질이 되는 단백질의 아미노산 서열 중 아스파트산(aspartic acid)을 특이적으로 인식하여 그 다음 아미노산 결합을 절단하는 효소이다. 카스파제-3는 32kDa의 시스테인 프로테아제로서 포유동물의 뇌에서 형태유전학적(morphogenetic) 세포 죽음 동안 중요한 역활을 하는 이펙터 카스파제로 불활성인 효소전구체(zymogen) 상태로 존재하다가 17kDa와 12kDa 서브 유닛으로 끊어지면서 활성화 된다.
본 발명에서 상기 조성물은 염증반응을 완화시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "염증반응"이란 상처가 난 곳이 열나고 붉게 되고 부어오르며 통증을 느끼게 되는 반응이다. 염증반응은 상처부위의 비만세포로부터 나온 히스타민을 포함하여 상처를 통해 들어온 박테리아를 포식하면서 활성화된 대식세포가 분비한 사이토카인 등에 의해 시작된다.
본 발명에서 사용하는 용어 "면역세포(Immune cell)"란 선천성 면역과 후천성 면역에 관여하는 세포를 말한다. 면역세포는 자기 자신으로부터 유래되지 않은 다양한 물질을 인식하여 병원체 및 바이러스, 기생물 등으로부터 우리 몸을 방어하는 역할을 하는 세포이다. 선천성 면역에는 피부장벽, 염증반응, 보체계, 세포장벽, 자연살해세포 등이 관여하는 면역이고, 후천성 면역에는 킬러 T 세포, 도움 T 세포, B 림프구 등이 관여하는 면역이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 포함하는, 급성 간부전(Acute liver failure) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예1. 지방 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 분리 및 특성 분석
인간지방 줄기세포유래 엑소좀은 인간지방줄기세포를 배양하는 과정에서 추출하였다.
구체적으로, 인간지방줄기세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배양 배지에서 배양하였다. 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드인 배지로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 상층액을 회수한 이후에는 다시 일반 배양배지를 줄기세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정은 계대 7까지 반복하였다.
회수한 세포배양 상층액은 2,000 ×g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하는 단계와 바틀탑 필터(Bottle top filter, 공극크기; 0.22 μm)를 이용한 필터링 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 1차 정제단계를 거친 다음, 엑소좀 농축 및 추가정제를 위해 접선유동여과 시스템(Tangential flow filtration; TFF)을 이용하였다. 이 때, 사용한 필터규격은 MWCO(Molecular Weight Cut-Off) 300 kDa 혹은 500 kDa을 사용하였다. 필터 단계에서 엑소좀은 인산완충용액(Phosphate buffered saline, PBS)로 1~3회 세척하였다.
추출된 엑소좀은 나노입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis, NTA)와 단백질 정량분석을 통해 엑소좀의 농도와 단백질량을 확인하였다. 엑소좀의 농도를 평가하기 위해서 엑소좀은 하나의 프레임 당 화면으로 확인되는 나노입자수가 20 개 이상 되도록 측정하였으며, 이때 추출한 엑소좀 농도는 평균적으로 1.78 × 1010 particle/mL이고, 평균 크기는 211.6 nm 내외임을 확인하였다. 또한 BCA 단백질 정량 방법을 통해 평균 185.8 μg/mL의 단백질 농도를 확인하였다.
실시예2. 급성 간부전 유발 동물 모델 제작
전격성 간질환 동물 모델은 먼저 3주령 ICR male 쥐를 한 주 동안 habituation 시켰다. 4주령이 되었을 때 전 날 18시간 금식 후, LPS(Lipopolysacharride) 20 μg/kg, GalN(D-(+)-Galactosamine) 800 mg/kg를 복강 내 투여하였다. 엑소좀은 예방목적으로는 LPS/GalN 투여 2일 전부터 매일 총 두 번 정맥 내 주사로 107, 108개 엑소좀을 투여하였으며, 치료목적으로는 LPS/GalN 투여 후 3시간 뒤에 107, 108개 엑소좀을 투여하였다.
실시예3. 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 마우스 생존율 증가 확인
마우스 생존율 측정은 LPS/GalN 투여 후 24시간 동안 측정하였으며, LPS/GalN 투여 후부터 사망까지의 시간 및 사망한 마우스의 마리 수를 측정하였다. 생존율 그래프는 GraphPad Prism 프로그램을 이용하여 그래프를 그린 후, Kaplan-Meier curves와 log-rank test를 통해 통계적으로 처리하였다. 그 결과 LPS/GalN만 투여한 쥐 11마리 중 36.36%인 4마리가 죽었으며, 각각 LPS/GalN 투여 후 6시간 35분, 7시간 30분, 8시간 20분, 10시간 6분에서 사망하였으나, LPS/GalN과 107 혹은 108개 엑소좀을 투여한 마우스에서는 11마리 모두 LPS/GalN 투여 후 24시간 동안 100% 생존하였다. Kaplan-Meier curves와 log-rank test를 통해 통계적으로 생존율에 대한 차이를 분석하였을 때 LPS/GalN만 투여한 군에서 유의미하게 생존율이 감소하였지만, LPS/GalN과 107 혹은 108개 엑소좀을 함께 처리한 군에서는 다시 생존율이 유의미하게 증가하였다.
실시예4. 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 간수치 개선 확인
간 수치를 측정하기 위해 LPS/GalN 단독 투여 및 LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여 후 5시간이 되었을 때, 간문맥 혹은 좌심실에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에서 10분간 incubation 후, 1500g, 10분, 4℃ 원심분리 하였고, 상층액만 따서 혈청을 모았다. 모은 혈청은 간수치 분석업체를 통해 AST, ALT 수치 결과를 분석 받았다. 그 결과 대조군 대비 LPS/GalN만 투여한 쥐에서 유의미하게 증가했던 AST, ALT 수치가 LPS/GalN에 108개 엑소좀을 함께 투여한 마우스에는 다시 유의미하게 감소하였다.
실시예5. 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 세포사멸 억제 확인
지방 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀이 엑소좀을 투여한 마우스의 간 조직에서 세포사멸 억제 정도를 확인하기 위해 LPS/GalN 단독 투여 및 LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여 후 5시간이 되었을 때 간 조직을 적출하였다. PBS로 washing 후 담낭을 제거하였고, 간 조직 중 Caudate Lobe를 분리하여 Western blot용 샘플 조직으로 사용하였다. 분리한 Caudate Lobe를 프로테이즈 억제제, 포스파테이즈 억제제가 포함된 Lysis buffer에 넣고 호모게나이저로 갈았다. 얼음에서 30분 incubation 후 13,000rpm, 10분, 4℃ 원심분리 하였고, 상층액만 모았다. BCA정량으로 단백질 농도를 정량 하였다. 2-Mercaptoethanol이 들어가 있는 4x 샘플 버퍼와 샘플을 섞은 후 95℃, 10분 끓였다. Immunoblotting을 통해 Active caspase-3, PARP, BAX의 단백질양을 정량 및 정성 분석하였다. 그 결과 LPS/GalN만 처리한 마우스의 간 조직에서 세포사멸의 마커인 Active Caspase-3, BAX, Cleaved PARP 단백질이 증가하였고, LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여한 마우스에서는 감소하였다.
실시예6. 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 항염증 효과 확인
Liver sinusoid와 중심정맥에 염증세포의 침윤정도를 확인하기 위해 LPS/GalN 단독 투여 및 LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여 후 5시간에서 마우스 간 조직을 적출하였다. PBS로 washing 후 담낭을 제거하였고, 간 조직 중 Left Lobe를 분리하여 헤마톡실린과 에오진 염색용 샘플 조직으로 사용하였다. 간조직은 파라핀 섹션으로 단면화 하였고, 두께는 5μm로 단면화 하여 헤마톡실린 에오진 염색을 하였다. 40x 배율 광학현미경을 통해 sinusoid와 중심정맥에 침윤 되어있는 면역세포를 확인하였다. 그 결과 LPS/GalN만 투여한 마우스의 sinusoid와 중심정맥에 호중구와 단핵구 등의 면역세포 침윤이 관찰되었으나, LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여한 마우스에서는 면역세포의 침윤이 감소하였다.

Claims (9)

  1. 엑소좀(exosomes)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간부전(acute liver failure) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 조성물을 투여 받을 환자의 자가 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 지방세포 유래 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 추출된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 BAX(Bcl-2-associated X protein)의 발현을 억제, 또는 카스파제-3(Caspase-3)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 염증반응을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염증반응은 면역세포에 의한 염증반응인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 엑소좀(exosomes)을 포함하는, 급성 간부전(acute liver failure) 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 엑소좀(exosomes)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 급성 간부전(acute liver failure)을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
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