WO2020027575A1 - 다층 세포 시트의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다층 세포 시트 - Google Patents

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    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to the field of tissue engineering and regenerative medicine, and more particularly, to a method for preparing a multilayer cell sheet and a multilayer cell sheet prepared using the same.
  • biodegradable polymer scaffolds have a problem that an inflammatory reaction occurs due to the production of acidic substances when implanted in the body (Ronneberger B et al., J Biomed Mater Res, 30 (1) (1996), 31-40). .
  • a cell sheet has been developed as a means for transplanting cells without biodegradable polymers (Yang J et al. Biomaterials. 2005 Nov; 26 (33): 6415-22).
  • a process of stacking the cell sheet in multiple layers is required, but there is a problem in that it is not economically due to an excessively complicated process and a long manufacturing time.
  • the present invention is to provide a method for producing a multi-layered cell sheet in a simple process and a multi-layered cell sheet prepared using the same.
  • One embodiment of the present invention (a) forming a first cell layer on a first substrate having a melting point at a temperature of any point of 0 °C to 30 °C or converted from hydrophobic to hydrophilic; (b) forming a second cell layer on a second substrate degraded by an enzyme; (c) contacting said first cell layer with said second cell layer; (d) optionally removing the first substrate by providing a temperature below the melting point of the first substrate or a temperature at which the first substrate is converted to hydrophilic; And (e) selectively removing the second substrate by contacting the second substrate with a solution containing an enzyme.
  • Another embodiment of the present invention provides a multi-layered cell sheet manufactured using the above production method.
  • the multi-layered cell sheet according to the present invention has the advantage of producing a multi-layered cell sheet in a simple and economical manner.
  • FIG. 1 illustrates a method of manufacturing a multilayer cell sheet according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows an enlarged image of the Pluronic hydrogel sheet prepared according to the embodiment.
  • Figure 4 shows the results of confirming the cell viability of the cell sheet of the cotton pluronic hydrogel sheet removed in the embodiment through staining.
  • Figure 5 shows an enlarged image of the cell sheet of the side from which the alginate hydrogel sheet was removed in the example.
  • Figure 6 shows the results confirmed by staining the cell survival of the cell sheet of the side from which the alginate hydrogel sheet is removed in the embodiment.
  • Figure 7 shows a photograph of the cell sheet from which both the pluronic hydrogel sheet and the alginate hydrogel sheet were removed according to the embodiment.
  • the "additional first substrate” may include all of the contents of the first substrate and may be the same as the first substrate.
  • the "additional second substrate” may include all of the contents of the second substrate and may be the same as the second substrate.
  • the "additional first cell layer” may include all of the contents for the first cell layer, and may also be the same as the first cell layer.
  • the "additional second cell layer” may include all of the contents for the second cell layer, and may also be the same as the second cell layer.
  • One embodiment of the present invention (a) forming a first cell layer on a first substrate having a melting point at a temperature of any point of 0 °C to 30 °C or converted from hydrophobic to hydrophilic;
  • the method for producing a multilayer cell sheet according to the present invention has the advantage of manufacturing a cell sheet in which multilayer cell layers are stacked in a simple manner.
  • the method for producing a multilayer cell sheet includes a first substrate having a melting point at a temperature of any one of 0 ° C. to 30 ° C. or converted from hydrophobic to hydrophilic; And using a second substrate decomposed by the enzyme, one of the substrates can be selectively removed after the cell layers are laminated. This can be used to deposit additional cell layers on cell layers that are exposed by the substrate that has been selectively removed.
  • the cell layer laminated on the substrate that has not been removed is provided, it can be easily transferred, and after the transfer, the remaining substrate can be selectively removed to transplant the multilayer cell layer.
  • steps (d) and (e) are performed sequentially, and between steps (d) and (e), (d ') the exposed first cell layer and the additional agent
  • the additional first substrate is selectively provided by providing a temperature below the melting point of the first substrate or a temperature at which the first substrate is converted to hydrophilic.
  • Removing may further include.
  • the laminate structure of "first substrate / first cell layer / second cell layer / second substrate" formed by step (c) is referred to as "additional first cell layer” by step (d) and (d ').
  • / First cell layer / second cell layer / second substrate may be formed.
  • step (d ') may be repeatedly performed two or more times to form a plurality of additional first cell layers on the first cell layer. Specifically, step (d ') may be repeated a plurality of times, thereby allowing " additional first cell layer /.../ additional first cell layer / first cell layer / second cell layer / second substrate ".
  • the laminated structure of can be formed. The number of additional first cell layers can be appropriately adjusted according to the use and purpose of the multilayer cell sheet.
  • steps (e) and (d) are performed sequentially, and between steps (e) and (d), (e ') the exposed second cell layer and the additional agent Contacting the additional second cell layer provided on the second substrate, and then selectively removing the additional second substrate by contacting the additional second substrate with a solution containing an enzyme.
  • the laminate structure of "first substrate / first cell layer / second cell layer / second substrate” formed by step (c) is referred to as "first substrate / agent" by step (e) and (d ').
  • a stack structure of "one cell layer / second cell layer / additional second cell layer” may be formed.
  • step (e ') may be repeated two or more times to form a plurality of additional second cell layers on the second cell layer. Specifically, step (e ') may be repeated a plurality of times, thereby allowing " first substrate / first cell layer / second cell layer / additional second cell layer /.../ additional second cell layer " The laminated structure of can be formed. The number of additional second cell layers can be appropriately adjusted according to the use and purpose of the multilayer cell sheet.
  • the first substrate may have a solid state or hydrophobicity in a temperature atmosphere of more than 30 °C.
  • the first substrate can be converted to liquid or hydrophilic at a temperature of 30 °C or less, by using this can be selectively removed from the first cell layer.
  • steps (a) and (c) may be performed in an atmosphere of 35 ° C. to 40 ° C., specifically in an atmosphere of 36 ° C. to 38 ° C., more specifically in an atmosphere of 36 ° C. to 37 ° C. Can be.
  • the first base material has a melting point at a temperature of any point of 0 ° C. to 30 ° C. or has a property of converting from hydrophobic to hydrophilic, so that the first base material is in the atmosphere of the temperature range (ie, 35 ° C. to 40 ° C.).
  • step (d ') since the additional first substrate of step (d ') has the same properties as the first substrate, the formation of the additional first cell layer and the stacking of the additional first cell layer are performed in an atmosphere of 35 ° C. to 40 ° C. Can be performed. Furthermore, step (b) may also be performed in an atmosphere of 35 ° C. to 40 ° C., specifically, 36 ° C. to 38 ° C., and more specifically 36 ° C. to 37 ° C., to promote cell layer formation.
  • step (c) may be to contact the first cell layer and the second cell layer by pressing.
  • the pressurization conditions may be appropriately adjusted so that the contacting cell layer is not destroyed and the material exchange is possible.
  • the additional first cell layer and the additional second cell layer of steps (d ') and (e') can be pressed and stacked on the cell layer.
  • the first substrate, the second substrate, the additional first substrate and the additional second substrate may each be a hydrogel substrate containing a hydrogel as a main component.
  • the "hydrogel” is a material that can contain a large amount of water, a material capable of easily infecting and transferring substances, wastes, etc. necessary for cell survival, such as oxygen, water, water-soluble nutrients, enzymes and polypeptides such as cytokines, or It can mean a form.
  • the hydrogel may be a hydrogel particle formed by solidifying an aqueous solution containing colloidal particles.
  • the hydrogel is, for example, poly (acrylamide), poly (acrylic acid), polyhydroxyethyl methacrylate (poly (hydroxyethyl methacrylate)), polyvinyl alcohol (poly (vinyl) water-soluble, hydrophilic, or water absorbent synthetic polymers such as alcohol)), poly (lactic acid), polyglycolic acid); And hydrogels chemically crosslinked with polysaccharides, proteins, and nucleic acids.
  • the polysaccharides include, but are not limited to, glycosaminoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, starch, glycogen, agar, pectin, fiber, and the like.
  • collagen and its hydrolysates gelatin, proteoglycan, fibronectin, vitronectin, laminin, enactin, tenascin, thrombospondin , Von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, and the like, but are not limited thereto.
  • the first substrate may include at least one of polyphosphazene hydrogel, pluronic hydrogel, and poly (N-isopropylacrylamide).
  • the first substrate and the additional first substrate may each be a polyphosphazene hydrogel substrate, a pluronic hydrogel substrate or a poly (N-isopropylacrylamide) substrate.
  • the additional first substrate may be the same as the content of the first substrate.
  • the polyphosphazene-based hydrogel may include a temperature-sensitive polyphosphazene-based compound, and a melting point thereof may be adjusted to about 4 ° C. to about 10 ° C.
  • a temperature sensitive and crosslinkable phosphazene hydrogel disclosed in Korean Laid-Open Publication No. 10-2017-0061530 a phosphazene system having an ionic group capable of controlling the decomposition rate disclosed in Korean Laid-Open Publication No. 10-2014-0016521.
  • the biodegradable temperature sensitive polyphosphazene hydrogel disclosed in the polymer, Korean Patent Publication No. 10-2007-0076386 may be included in the polyphosphazene hydrogel of the present invention.
  • the pluronic hydrogel may control the temperature of the melting point to about 0 ° C. to 30 ° C. using a pluronic polymer.
  • the pluronic polymer may be used as long as the polymer has a structure (PEO-PPO-PEO) of polyethylene oxide (PEO) -polypropylene oxide (PPO) -polyethylene oxide (PEO).
  • PEO polyethylene oxide
  • PPO polypropylene oxide
  • the fluoric polymer can be used F68 having a molecular weight of about 8,700 Daltons and F127 having a molecular weight of about 12,600 Daltons approved by the US Food and Drug Administration (FDA).
  • the first substrate is not limited to polyphosphazene-based hydrogels and pluronic hydrogels, and the first substrate and / or the first additional substrate may be a hydrogel having a melting point at a temperature of 30 ° C. or less. It can be applied as a substrate.
  • the first substrate may be a poly (N-isopropylacrylamide) substrate.
  • the first substrate and / or the additional first substrate may be surface treated with poly (N-isopropylacrylamide).
  • the first substrate and / or the additional first substrate may be a poly (N-isopropylacrylamide) creep bonded or surface coated on the surface. Since the poly (N-isopropylacrylamide) is converted from hydrophobic to hydrophilic in an atmosphere of 30 ° C. or lower, specifically from about 20 ° C.
  • the first substrate is poly (N-isopropylacrylamide)
  • the first substrate may be easily removed using physiological saline of about 20 ° C to about 30 ° C.
  • the poly (N-isopropylacrylamide) can also be easily separated from the cell layer.
  • the present invention is not limited thereto, and any material having a property of converting hydrophobicity to hydrophilicity at a temperature of 30 ° C. or lower may be applied in the same manner as the poly (N-isopropylacrylamide).
  • step (d) comprises contacting the first substrate with a solution having a temperature below the melting point of the first substrate or a temperature at which the first substrate is converted into hydrophilic, or surrounding
  • the temperature may be lowered to a temperature below the melting point of the first substrate or to a temperature at which the first substrate is converted into hydrophilicity.
  • the process of selectively removing the first substrate of step (d) is carried out by the stacking structure of "first substrate / first cell layer / second cell layer / second substrate" formed by step (c) It may be to selectively remove the first substrate by immersing in a solution having a temperature below the melting point of the or the first substrate is converted to hydrophilic.
  • the step of selectively removing the first substrate of step (d) is carried out by the ambient temperature (atmosphere) of the laminate structure of "first substrate / first cell layer / second cell layer / second substrate" formed by step (c) Temperature) may be lowered to a temperature below the melting point of the first substrate or to a temperature at which the first substrate is converted into hydrophilic to selectively remove the first substrate.
  • the solution having a temperature below the melting point of the first substrate may be physiological saline having a temperature of about 4 °C to about 30 °C.
  • the ambient temperature (atmosphere temperature) may be about 4 °C to about 30 °C.
  • selectively removing the additional first substrate of step (d ') may optionally remove the additional first substrate by immersing the laminate structure in physiological saline having a temperature of about 4 ° C to about 30 ° C,
  • the ambient temperature atmosphere temperature
  • the ambient temperature may be lowered to a temperature below the melting point of the first substrate or to a temperature at which the first substrate is converted to hydrophilic.
  • the first substrate may be selectively removed at 20 ° C. to 30 ° C. using a substrate surface treated with poly (N-isopropylacrylamide).
  • the second substrate may be a hydrogel substrate including an enzyme-susceptible peptide.
  • the second substrate may be a hydrogel substrate including an enzyme sensitive peptide and a poly (ethylene glycol) (PEG) gel.
  • the second substrate may be a hydrogel substrate attached with an amino acid sequence capable of being degraded by matrix metallopro teinases (MMPs), elastase and / or plasmin.
  • MMPs matrix metallopro teinases
  • the second substrate is based on a PEG-succinimidyl propionate hydrogel with an amino acid sequence attached, for example, synthetic tetrapeptide Ala-Pro-Gly-Leu (4armPEG10k-LGPA).
  • the second substrate may comprise an amine reactive PEG-monoacrylate and a collagenase sensitive peptide (Gly-Gly-Leu'Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys), or an integrin binding domain peptide. It may be based on PEG-hydrogel to which (integrin-binding domain peptide) (Tyr-Ile-Shy-Ser-Arg) is attached.
  • the second substrate may be a hydrogel substrate including carboxymethyl cellulose (CMC) or alginate (Al).
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • Al alginate
  • the carboxymethyl cellulose or alginate may be conjugated with tyramine. That is, the second substrate and / or the additional second substrate may be a hydrogel substrate comprising carboxymethyl cellulose conjugated with tyramine (CMC-ty). In addition, the second substrate and / or the additional second substrate may be a hydrogel substrate comprising alginate conjugated with tyramine.
  • CMC-ty carboxymethyl cellulose conjugated with tyramine
  • the second substrate and / or the additional second substrate may be a hydrogel substrate comprising alginate conjugated with tyramine.
  • the second substrate and / or the further second substrate may be a hydrogel substrate comprising at least 0.5% CMC-ty or Al-ty.
  • the second substrate and / or the additional second substrate may be a hydrogel substrate comprising between 0.5% and 4% CMC-ty or Al-ty.
  • The% may be wt% or vol%.
  • the enzyme may be carboxymethyl cellulose degrading enzyme or alginate degrading enzyme.
  • the enzyme when the second substrate and / or the additional second substrate is a carboxymethyl cellulose substrate, the enzyme may be a carboxymethyl cellulose degrading enzyme.
  • the enzyme when the second substrate and / or the further second substrate is an alginate substrate, the enzyme may be an alginate degrading enzyme.
  • the enzyme can be selectively cleaved off and removed in the step (e) and / or (e ') the second substrate and / or the further second substrate.
  • the enzyme may not degrade other components (eg, the first substrate, the first cell layer, the second cell layer, etc.) except for the second substrate and the additional second substrate.
  • the enzyme may not degrade the cells and extracellular matrix of the first cell layer and the second cell layer.
  • the first substrate and the second substrate may have a predetermined pattern suitable for implementing the characteristics of the first cell layer and the second cell layer, respectively.
  • the pattern of the substrate required may vary according to the type of cells constituting each cell layer, and the culture and characteristics of the cells may be well implemented on the substrate having a pattern suitable for the cells. For example, when forming a cell layer using muscle cells, the muscle cell layer can be formed more quickly on a substrate having a pattern similar to that of muscle tissue, and the characteristics of the muscle cells can be more easily expressed.
  • the first substrate and the second substrate may include a predetermined pattern to better implement the characteristics of the cell layer to be cultured.
  • the first substrate and the second substrate may include an uneven pattern on one surface, or may have various thicknesses according to a predetermined pattern over the entire substrate.
  • the patterning method of the first substrate and / or the second substrate may use methods known in the art. For example, patterning may be performed using soft lithography, self-assembly, vapor deposition, photolithography, and the like.
  • the first substrate and the second substrate may have a predetermined strength suitable for implementing the characteristics of the first cell layer and the second cell layer, respectively.
  • the strength (modulus) of the substrate required may vary according to the type of cells constituting each cell layer, and the culture and properties of the cells may be well implemented on the substrate having a strength suitable for the cells.
  • the first cell layer and the second cell layer may be formed by culturing on the first substrate and the second substrate, respectively.
  • the additional first cell layer can be formed by culturing on an additional first substrate
  • the additional second cell layer can be formed by culturing on an additional second substrate.
  • the first cell layer and the second cell layer are mesenchymal stem cells (MSCs), myocyte precursor cells, myocytes, and fibroblasts, respectively. ), Chondrocytes, endothelial cells, epithelial cells, embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, adhesion-dependent cell precursors precursors), induced pluripotent stem cells (iPSCs), and cardiomyocytes.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • cardiomyocytes cardiomyocytes.
  • the first cell layer, the second cell layer, the additional first cell layer and the additional second cell layer may be formed by culturing at least one of the cells.
  • the first cell layer and the second cell layer may be cultured cells that are the same as each other, or different cells may be cultured.
  • the multilayer cell sheet can implement a three-dimensional structure similar to the site of implantation.
  • the multilayer cell sheet may be manufactured by stacking cell layers formed using a substrate having a predetermined pattern, and thus may have a three-dimensional structure similar to a desired tissue.
  • the multi-layered cell sheet has the advantage of high cell survival after transplantation, and further effective in tissue regeneration.
  • the multi-layered cell sheet can implement a structure and properties similar to human tissue, and thus can be used for drug testing. Specifically, in order to examine the tissue response to the new drug, the multilayer cell sheet can be used.
  • FIG. 1 illustrates a method of manufacturing a multilayer cell sheet according to an exemplary embodiment of the present invention. Specifically, FIG. 1 shows that the first base material A on which the first cell layer is formed is brought into contact with each cell layer of the second base material B on which the second cell layer is formed (C), and then the temperature is lowered to remove the first base material. To produce a cell sheet with two layers of cells. As a subsequent step of FIG. 1, additional cell layers may be further stacked, and the second substrate may also be removed to obtain a cell sheet consisting of two cell layers.
  • the present invention is not limited to FIG. 1 and may further include additional configurations and / or steps.
  • a gelatin mold was prepared and the bottom of the mold formed a micro pattern.
  • aqueous Pluronic f-127 (Simga) solution was placed in the gelatin mold.
  • a nitrocellulose membrane was covered, and a plastic mesh and a glass plate for fixing it were laminated.
  • the temperature was then raised to about 37 [deg.] C. and hydrogelized by curing only Pluronic f-127 (Simga) aqueous solution in the mold.
  • a washing buffer Saline, PBS, ddH 2 O
  • FIG. 2 shows an enlarged image of the Pluronic hydrogel sheet prepared according to the embodiment. Since the Pluronic hydrogel sheet is transparent, a pattern formed through a bright field image using an electron microscope can be confirmed as shown in FIG. 2. As confirmed in Figure 2, the produced Pluronic hydrogel sheet can be seen that the stripe pattern is formed at regular intervals.
  • a gelatin mold was prepared and the bottom of the mold formed a micro pattern.
  • an alginate solution containing alginate was placed in the gelatin mold in an MES buffer of pH 6-7 in an amount of about 2 wt%.
  • a nitrocellulose membrane was covered, and a plastic mesh and a glass plate for fixing it were laminated.
  • the alginate crosslinking aqueous solution was added dropwise to hydrogelize the alginate solution in the mold.
  • a washing buffer Saline, PBS, ddH 2 O
  • C2C12 skeletal muscle cells were cultured on the surface on which the pattern of the prepared Pluronic hydrogel sheet was formed to form a cell layer, and C2C12 skeletal muscle cells were cultured on one surface of the alginate hydrogel sheet to form a cell layer. Formed. Then, after contacting the cell layer, the temperature was lowered to about 10 ° C. to dissolve and remove the Pluronic hydrogel sheet, thereby preparing a 2-stack cell sheet. Then, the temperature was raised to about 37 ° C. again for the activation of the cell layer.
  • FIG. 3 shows an enlarged image of the cell sheet of the side from which the Pluronic hydrogel sheet was removed in the Example. Specifically, FIG. 3 is a bright field image of the surface from which the pluronic hydrogel sheet is removed using an electron microscope.
  • Figure 4 shows the results of confirming the cell viability of the cell sheet of the cotton pluronic hydrogel sheet removed in the embodiment through staining.
  • the staining in Figure 4 was used for Thermofisher's Live / Dead mammalian cell kit, live cells are stained with calcein AM and stained green, dead cells stained with ethidium homodimer-1 and stained red appear.
  • Figure 4 even if you remove the Pluronic hydrogel sheet can be confirmed that more than 99% of the cells alive.
  • the alginate hydrogel sheet was removed using a solution containing alginate degrading enzyme.
  • FIG. 5 shows an enlarged image of the cell sheet of the side from which the alginate hydrogel sheet was removed in the example.
  • FIG. 5 is a bright field image of the surface from which the alginate hydrogel sheet is removed using an electron microscope.
  • some of the recessed regions were found to shrink some region of the cell sheet while the alginate hydrogel sheet was separated from the cell sheet.
  • Figure 6 shows the results confirmed by staining the cell survival of the cell sheet of the side from which the alginate hydrogel sheet is removed in the embodiment.
  • the staining in FIG. 6 was used by Thermofisher's Live / Dead mammalian cell kit, and live cells were stained with calcein AM and stained green, and dead cells were stained with ethidium homodimer-1 and stained red. appear.
  • Figure 6 even if you remove the alginate hydrogel sheet can be confirmed that more than 99% of the cells alive.
  • Figure 7 shows a photograph of the cell sheet from which both the pluronic hydrogel sheet and the alginate hydrogel sheet were removed according to the embodiment. As can be seen in Figures 4, 6 and 7, it can be seen that the cell sheets prepared as in Example can be prepared with high viability in intact form.

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Abstract

본 명세서는 (a) 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지거나 소수성에서 친수성으로 변환되는 제1 기재 상에 제1 세포층을 형성하는 단계; (b) 효소에 의하여 분해되는 제2 기재 상에 제2 세포층을 형성하는 단계; (c) 상기 제1 세포층과 상기 제2 세포층을 접촉시키는 단계; (d) 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 제1 기재를 선택적으로 제거하는 단계; 및 (e) 효소를 포함하는 용액에 상기 제2 기재를 접촉시켜 상기 제2 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는, 다층 세포 시트의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다층 세포 시트에 관한 것이다.

Description

다층 세포 시트의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다층 세포 시트
본 명세서는 2018년 7월 31일에 한국특허청에 제출된 한국 특허 출원 제 10-2018-0089461호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용 전부는 본 발명에 포함된다.
본 발명은 조직 공학 및 재생 의학 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 다층 세포 시트의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다층 세포 시트에 관한 것이다.
재생의학 분야에서 조직공학적 치료는 생분해성 고분자 지지체를 기반으로 세포를 배양하여 조직을 재건한 후, 손상된 부위에 이식하여 정상적인 기능이 유도되도록 하는 방향으로 발전하고 있다. 다만, 생분해성 고분자 지지체는 체내에 이식되었을 때 산성 물질의 생성에 의한 염증 반응이 발생되는 문제가 있다(Ronneberger B et al., J Biomed Mater Res, 30 (1) (1996), 31-40).
이와 다른 방향의 접근법으로서, 세포를 생분해성 고분자 용액과 섞어 손상된 부위에 주입하는 방법이 제안된 바 있으나, 이는 세포외기질(ECM; Extra Cellular Matrix)의 손상으로 인하여 이식 부위에서의 세포 재생 효율이 크게 저하되는 문제점이 있다(Canavan H et al.,J Biomed Mater Res A. 2005 Oct 1;75(1):1-13).
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 생분해성 고분자 없이 세포를 이식하기 위한 수단으로, 세포 시트가 개발되었다(Yang J et al. Biomaterials. 2005 Nov;26(33):6415-22). 다만, 세포 시트를 제작하였더라도, 이를 임상적으로 적용하기 위하여는 세포 시트를 다층으로 적층하는 과정이 필요하지만, 현재 알려진 방법으로는 지나치게 복잡한 과정 및 장기간의 제조 시간으로 인하여 경제적이지 못한 문제점이 있다.
본 발명은 간단한 공정으로 다층 구조의 세포 시트를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 다층 세포 시트를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시상태는, (a) 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지거나 소수성에서 친수성으로 변환되는 제1 기재 상에 제1 세포층을 형성하는 단계; (b) 효소에 의하여 분해되는 제2 기재 상에 제2 세포층을 형성하는 단계; (c) 상기 제1 세포층과 상기 제2 세포층을 접촉시키는 단계; (d) 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 제1 기재를 선택적으로 제거하는 단계; 및 (e) 효소를 포함하는 용액에 상기 제2 기재를 접촉시켜 상기 제2 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는, 다층 세포 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시상태는, 상기 제조방법을 이용하여 제조된 다층 세포 시트를 제공한다.
본 발명에 따른 다층 세포 시트는 간단하고 경제적인 방법으로 다층의 세포 시트를 제조할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시상태에 따른 다층 세포 시트의 제조방법을 도시한 것이다.
도 2는 실시예에 따라 제조된 플루로닉 하이드로겔 시트의 확대 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예에서의 플루로닉 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 확대 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예에서의 플루로닉 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 세포 생존 여부를 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예에서의 알지네이트 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 확대 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예에서의 알지네이트 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 세포 생존 여부를 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예에 따른 플루로닉 하이드로겔 시트 및 알지네이트 하이드로겔 시트가 모두 제거된 세포 시트를 촬영한 것을 나타낸 것이다.
본 명세서에서 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "추가의 제1 기재"는 제1 기재에 대한 내용을 모두 포함할 수 있으며, 또한 제1 기재와 동일한 것일 수 있다.
본 명세서에서 "추가의 제2 기재"는 제2 기재에 대한 내용을 모두 포함할 수 있으며, 또한 제2 기재와 동일한 것일 수 있다.
본 명세서에서 "추가의 제1 세포층"은 제1 세포층에 대한 내용을 모두 포함할 수 있으며, 또한 제1 세포층과 동일한 것일 수 있다.
본 명세서에서 "추가의 제2 세포층"은 제2 세포층에 대한 내용을 모두 포함할 수 있으며, 또한 제2 세포층과 동일한 것일 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시상태는, (a) 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지거나 소수성에서 친수성으로 변환되는 제1 기재 상에 제1 세포층을 형성하는 단계;
(b) 효소에 의하여 분해되는 제2 기재 상에 제2 세포층을 형성하는 단계;
(c) 상기 제1 세포층과 상기 제2 세포층을 접촉시키는 단계;
(d) 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 제1 기재를 선택적으로 제거하는 단계; 및
(e) 효소를 포함하는 용액에 상기 제2 기재를 접촉시켜 상기 제2 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는, 다층 세포 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다층 세포 시트의 제조방법은 간단한 방법으로 다층의 세포층이 적층된 세포 시트를 제조할 수 있는 장점이 있다. 상기 다층 세포 시트의 제조방법은, 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지거나 소수성에서 친수성으로 변환되는 제1 기재; 및 효소에 의하여 분해되는 제2 기재를 사용하여, 세포층을 적층한 후 선택적으로 어느 하나의 기재를 제거할 수 있다. 이를 이용하여, 선택적으로 제거된 기재에 의하여 노출되는 세포층 상에 추가의 세포층을 적층할 수 있다. 또한, 제거되지 않은 기재 상에 적층된 세포층이 구비되어 있으므로 쉽게 전사할 수 있으며, 전사 후 선택적으로 나머지 기재를 제거하여 다층 세포층의 이식을 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, (d) 단계 및 (e) 단계가 순차적으로 수행되고, (d) 단계와 (e) 단계 사이에, (d') 노출된 상기 제1 세포층과 추가의 제1 기재 상에 구비된 추가의 제1 세포층을 접촉시킨 후, 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 추가의 제1 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, (c) 단계에 의하여 형성되는 "제1 기재/제1 세포층/제2 세포층/제2 기재"의 적층 구조체는 (d) 단계 및 (d') 단계에 의하여 "추가의 제1 세포층/제1 세포층/제2 세포층/제2 기재"의 적층 구조체가 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, (d') 단계는 2회 이상 반복 수행되어 상기 제1 세포층 상에 복수의 추가의 제1 세포층을 형성할 수 있다. 구체적으로, (d') 단계는 복수회에 걸쳐 반복 수행될 수 있으며, 이를 통하여 "추가의 제1 세포층/.../추가의 제1 세포층/제1 세포층/제2 세포층/제2 기재"의 적층 구조체가 형성될 수 있다. 상기 추가의 제1 세포층의 수는 상기 다층 세포 시트의 용도 및 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, (e) 단계 및 (d) 단계가 순차적으로 수행되고, (e) 단계와 (d) 단계 사이에, (e') 노출된 상기 제2 세포층과 추가의 제2 기재 상에 구비된 추가의 제2 세포층을 접촉시킨 후, 효소를 포함하는 용액에 상기 추가의 제2 기재를 접촉시켜 상기 추가의 제2 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, (c) 단계에 의하여 형성되는 "제1 기재/제1 세포층/제2 세포층/제2 기재"의 적층 구조체는 (e) 단계 및 (d') 단계에 의하여 "제1 기재/제1 세포층/제2 세포층/추가의 제2 세포층"의 적층 구조체가 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, (e') 단계는 2회 이상 반복 수행되어 상기 제2 세포층 상에 복수의 추가의 제2 세포층을 형성할 수 있다. 구체적으로, (e') 단계는 복수회에 걸쳐 반복 수행될 수 있으며, 이를 통하여 "제1 기재/제1 세포층/제2 세포층/추가의 제2 세포층/.../추가의 제2 세포층" 의 적층 구조체가 형성될 수 있다. 상기 추가의 제2 세포층의 수는 상기 다층 세포 시트의 용도 및 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 기재는 30 ℃ 초과의 온도 분위기에서 고상 또는 소수성을 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 기재는 30 ℃ 이하의 온도에서 액상 또는 친수성으로 전환될 수 있으며, 이를 이용하여 제1 세포층으로부터 선택적 제거를 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, (a) 단계 및 (c) 단계는 35 ℃ 내지 40 ℃의 분위기, 구체적으로 36 ℃ 내지 38 ℃의 분위기, 보다 구체적으로 36 ℃ 내지 37 ℃의 분위기에서 수행될 수 있다. 이는 상기 제1 기재는 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지거나 소수성에서 친수성으로 변환되는 성질을 가지므로, 상기 온도 범위(즉, 35 ℃ 내지 40 ℃)의 분위기에서 제1 기재가 고상의 형태 또는 소수성을 유지하도록 하고, 세포가 활발하게 활동하도록 하여 세포층의 형성을 촉진시키기 위함이다. 마찬가지로, (d') 단계의 추가의 제1 기재도 제1 기재와 동일한 성질을 가지므로, 추가의 제1 세포층의 형성 및 추가의 제1 세포층을 적층하는 과정은 35 ℃ 내지 40 ℃의 분위기에서 수행될 수 있다. 나아가, (b) 단계 또한 세포층의 형성을 촉진시키기 위하여, 35 ℃ 내지 40 ℃의 분위기, 구체적으로 36 ℃ 내지 38 ℃의 분위기, 보다 구체적으로 36 ℃ 내지 37 ℃의 분위기에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, (c) 단계는 가압하여 상기 제1 세포층과 상기 제2 세포층을 접촉시키는 것일 수 있다. 이때 가압 조건은 접촉되는 세포층이 파괴되지 않고, 물질 교환이 가능하도록 밀착되도록 적절하게 조절될 수 있다. 마찬가지로, (d') 단계 및 (e') 단계의 추가의 제1 세포층 및 추가의 제2 세포층을 가압하여 세포층 상에 적층할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 기재, 상기 제2 기재, 추가의 제1 기재 및 추가의 제2 기재는 각각 하이드로겔을 주성분으로 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다.
상기 "하이드로겔"은 물을 대량으로 포함할 수 있는 물질로서, 산소, 물, 수용성 영양물, 효소 및 사이토카인 등의 폴리펩티드 등의 세포 생존에 필요한 물질, 노폐물 등을 쉽게 전염 이동시킬 수 있는 재료 또는 형태인 것을 의미할 수 있다. 상기 하이드로겔은 콜로이드 입자를 함유하는 수용액을 고상화하여 형성되는 하이드로겔 입자일 수 있다. 상기 하이드로겔은 예를 들어, 폴리아크릴아미드(poly(acrylamide)), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트(poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리비닐 알코올(poly(vinyl alcohol)), 폴리유산(poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid)) 등의 수용성, 친수성, 또는 물 흡수성 합성 고분자; 및 다당류, 단백질, 및 핵산 등을 화학 가교한 하이드로겔로 이루어진 입자일 수 있다. 상기 다당류로는 히알루론산(hyaluronic acid) 및 콘드로이친 황산(chondroitin sulfate) 등의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 전분, 글리코겐, 아가, 펙틴, 섬유소 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 단백질로 콜라겐 및 그 가수 분해물인 젤라틴, 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin), 엔탁틴(entactin), 테나신(tenascin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor), 오스테오폰틴(osteopontin), 피브리노겐(fibrinogen) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 기재는 폴리포스파젠계 하이드로겔, 플루로닉계 하이드로겔 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 중 적어도 1종을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 기재 및 상기 추가의 제1 기재는 각각 폴리포스파젠계 하이드로겔 기재, 플루로닉계 하이드로겔 기재 또는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재일 수 있다. 또한, 상기 추가의 제1 기재는 상기 제1 기재의 내용과 동일할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 폴리포스파젠계 하이드로겔은 온도 감응성의 폴리포스파젠계 화합물을 포함하여, 녹는점이 약 4 ℃ 내지 약 10 ℃로 조절될 수 있다. 예를 들어, 대한민국 공개 공보 제10-2017-0061530호에 개시된 온도 감응성 및 가교성 포스파젠계 하이드로젤, 대한민국 공개 공보 제10-2014-0016521호에 개시된 분해 속도 조절이 가능한 이온기를 가지는 포스파젠계 고분자, 대한민국 공개 공보 제10-2007-0076386호에 개시된 생분해성 온도 감응성 폴리포스파젠계 하이드로젤이 본 발명의 폴리포스파젠계 하이드로겔에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 플루로닉계 하이드로겔은 플루로닉 고분자를 이용하여, 녹는점의 온도를 약 0 ℃ 내지 30 ℃로 조절할 수 있다. 상기 플루로닉 고분자는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조(PEO-PPO-PEO)를 갖는 고분자라면 모두 사용 가능하다. 예를 들어, F로 시작하는 F38, F68, F77, F77, F98, F108, F127 유도체 등과, L로 시작하는 L31, L42, L43, L44, L62, L72, L101 유도체 등과, P로 시작하는 P75, P103, P104 유도체 등(모두 상품명)이 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 플루오닉 고분자 중 미국 식품의약국(FDA)의 허가를 받은 분자량이 약 8,700 달톤인 F68과 분자량이 약 12,600 달톤인 F127을 사용할 수 있다.
다만, 상기 제1 기재는 폴리포스파젠계 하이드로겔, 플루로닉계 하이드로겔에 한정되는 것은 아니며, 30 ℃ 이하의 온도에서 녹는점을 가지는 하이드로겔 이라면, 상기 제1 기재 및/또는 추가의 제1 기재로 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 기재는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재일 수 있다. 또한, 상기 제1 기재 및/또는 상기 추가의 제1 기재는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)로 표면 처리된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 기재 및/또는 상기 추가의 제1 기재는 표면에 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)가 크리프팅 결합되거나, 표면 코팅된 것일 수 있다. 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 30 ℃ 이하의 분위기, 구체적으로 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 분위기에서 소수성에서 친수성으로 전환되므로, 상기 제1 기재가 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재 또는 이로 표면 처리된 기재인 경우, 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 생리 식염수를 이용하여 제1 기재를 손쉽게 선택적으로 제거할 수 있다. 또한, 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)를 통하여, 상기 제1 기재 및/또는 상기 추가의 제1 기재 상에서 세포층이 보다 잘 형성될 수 있으며, 상기 제1 기재 및/또는 상기 추가의 제1 기재의 제거 시 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)도 함께 세포층에서 쉽게 분리될 수 있다. 다만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 30 ℃ 이하의 온도에서 소수성에서 친수성으로 변환하는 특성을 가진 물질이라면 상기 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)과 마찬가지로 적용할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, (d) 단계는 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 가지는 용액에 상기 제1 기재를 접촉시키거나, 또는 주변 온도를 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도로 낮추는 것일 수 있다. 구체적으로, (d) 단계의 제1 기재를 선택적으로 제거하는 과정은 (c) 단계에 의하여 형성되는 "제1 기재/제1 세포층/제2 세포층/제2 기재"의 적층 구조체는 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 가지는 용액에 침지하여 제1 기재를 선택적으로 제거하는 것일 수 있다. 또한, (d) 단계의 제1 기재를 선택적으로 제거하는 과정은(c) 단계에 의하여 형성되는 "제1 기재/제1 세포층/제2 세포층/제2 기재"의 적층 구조체의 주변 온도(대기 온도)를 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도로 낮추어 제1 기재를 선택적으로 제거하는 것일 수 있다. 이때, 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도를 가지는 용액은 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도를 가지는 생리 식염수일 수 있다. 또한, 상기 주변 온도(대기 온도)는 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃일 수 있다. 마찬가지로, (d') 단계의 추가의 제1 기재를 선택적으로 제거하는 과정은 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도를 가지는 생리 식염수에 적층 구조체를 침지하여 선택적으로 추가의 제1 기재를 제거하거나, 주변 온도(대기 온도)를 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도로 낮추는 것일 수 있다. 상기 제1 기재 또는 추가의 제1 기재의 녹는점 이하의 온도를 가지는 용액, 또는 주변 온도가 20 ℃ 미만에서 적층 구조물의 세포층이 손상될 가능성이 있는 경우, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 기재 또는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)로 표면 처리된 기재를 이용하여, 20 ℃ 내지 30 ℃에서 상기 제1 기재를 선택적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제2 기재는 효소 감응성 펩타이드(enzyme-susceptible peptide)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 예를 들면, 상기 제2 기재는 효소 감응성 펩타이드와 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)겔을 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 또한, 상기 제2 기재는 MMPs(matrix metallopro teinases), 엘라스타제 및/또는 플라스민에 의하여 분해될 수 있는 아미노산 서열이 부착된 하이드로겔 기재일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 기재는 아미노산 서열이 부착된 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트 하이드로겔(PEG-succinimidyl propionate hydrogel) 기재, 예를 들어 합성 테트라펩타이드 Ala-Pro-Gly-Leu(4armPEG10k-LGPA)로 기능화된 PEG-아민이 부착된 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트 하이드로겔 기재일 수 있다. 또는, 상기 제2 기재는 아민 반응성 PEG-모노아크릴레이트와 콜라게나아제 감응성 펩타이드(collagenase sensitive peptide)(Gly-Gly-Leu'Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys), 또는 인테그린 결합 도메인 펩타이드(integrin-binding domain peptide)(Tyr-Ile-Shy-Ser-Arg)가 부착된 PEG-하이드로겔 기재일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제2 기재는 카르복실메틸 셀룰로오스(CMC) 또는 알지네이트(Al)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 카르복실메틸 셀룰로오스 또는 알지네이트는 티라민으로 컨쥬게이션된 것일 수 있다. 즉, 상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재는 티라민으로 컨쥬게이션된 카르복실메틸 셀룰로오스(CMC-ty)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 또한, 상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재는 티라민으로 컨쥬게이션된 알지네이트(Al-ty)를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다.
상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재는 적어도 0.5 %의 CMC-ty 또는 Al-ty를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재는 0.5 % 내지 4 %의 CMC-ty 또는 Al-ty를 포함하는 하이드로겔 기재일 수 있다. 상기 %는 wt% 또는 vol%일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 효소는 카르복실메틸 셀룰로오스 분해효소 또는 알지네이트 분해효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재가 카르복실메틸 셀룰로오스 기재인 경우, 상기 효소는 카르복실메틸 셀룰로오스 분해효소일 수 있다. 또한, 상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재가 알지네이트 기재인 경우, 상기 효소는 알지네이트 분해효소일 수 있다.
상기 효소는 (e) 단계 및/또는 (e') 단계에서, 상기 제2 기재 및/또는 상기 추가의 제2 기재를 선택적으로 분해하여 제거할 수 있다. 또한, 상기 효소는 상기 제2 기재 및 상기 추가의 제2 기재를 제외한 나머지 구성(예를 들어 제1 기재, 제1 세포층 및 제2 세포층 등)을 분해하지 않을 수 있다. 구체적으로, 상기 효소는 상기 제1 세포층 및 상기 제2 세포층의 세포 및 세포외기질을 분해하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 기재 및 상기 제2 기재는 각각 제1 세포층 및 제2 세포층의 특성을 구현하기 적합한 소정의 패턴을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 각각의 세포층을 구성하는 세포의 종류에 따라 요구되는 기재의 패턴이 다를 수 있으며, 세포에 적합한 패턴이 구비된 기재 상에서 세포의 배양 및 특성이 잘 구현될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 이용하여 세포층을 형성하는 경우, 근육 조직과 유사한 패턴을 가지는 기재 상에서 보다 빠르게 근육 세포층이 형성될 수 있고, 근육 세포의 특성도 보다 용이하게 발현될 수 있다.
그러므로, 상기 제1 기재 및 상기 제2 기재는 배양되는 세포층의 특성이 보다 잘 구현되도록 소정의 패턴을 포함할 수 있다. 상기 제1 기재 및 상기 제2 기재가 소정의 패턴을 가지는 경우, 일면 상에 요철 패턴을 포함할 수 있고, 또는 기재 전체에 걸쳐 소정의 패턴에 따른 다양한 두께를 가질 수 있다. 상기 제1 기재 및/또는 상기 제2 기재의 패턴화 방법은 당업계에서 알려진 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 소프트 리소그라피, 자기 조립, 기상 증착, 포토 리소그라피 등을 이용하여 패터닝을 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 기재 및 상기 제2 기재는 각각 제1 세포층 및 제2 세포층의 특성을 구현하기 적합한 소정의 강도를 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 각각의 세포층을 구성하는 세포의 종류에 따라 요구되는 기재의 강도(모듈러스)가 다를 수 있으며, 세포에 적합한 강도를 가지는 기재 상에서 세포의 배양 및 특성이 잘 구현될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 세포층 및 상기 제2 세포층은 각각 상기 제1 기재 및 상기 제2 기재 상에 배양되어 형성될 수 있다. 마찬가지로, 상기 추가의 제1 세포층은 추가의 제1 기재 상에서 배양되어 형성될 수 있고, 상기 추가의 제2 세포층은 추가의 제2 기재 상에서 배양되어 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 제1 세포층 및 상기 제2 세포층은 각각 중간엽줄기세포(MSCs; mesenchymal stem cells), 근조직 전구세포(myocyte precursor cells), 근세포(myocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 연골세포(chondrocytes), 내피세포(endothelial cells), 상피세포(epithelial cells), 배성간세포(ESCs; embryonic stem cells), 조혈간세포(hematopoietic stem cells), 부착 의존성 세포 프리커서(anchorage-dependent cell precursors), 유도된 전분화능 줄기세포 (iPSCs; induced pluripotent stem cells), 및 심근세포(cardiomyocytes)로 이루어진 군에서 선택되는 세포를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 세포층, 상기 제2 세포층, 상기 추가의 제1 세포층 및 상기 추가의 제2 세포층은 상기 세포 중 적어도 1종이 배양되어 형성된 것일 수 있다. 또한, 상기 제1 세포층 및 상기 제2 세포층은 서로 동일한 세포가 배양된 것일 수 있으며, 또는 서로 상이한 세포가 배양된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시상태는, 상기 제조방법을 이용하여 제조된 다층 세포 시트를 제공한다. 상기 다층 세포 시트는 이식 대상 부위와 유사한 3차원적 구조를 구현할 수 있다. 구체적으로, 상기 다층 세포 시트는 소정의 패턴을 가지는 기재를 사용하여 형성된 세포층을 적층하여 제조될 수 있으므로, 목적하는 조직과 유사한 형태의 3차원적 구조를 가질 수 있다. 이를 통하여, 상기 다층 세포 시트는 이식 후 세포 생존률이 높고, 나아가 조직 재생에 효과적인 장점이 있다.
또한, 상기 다층 세포 시트는 인체 조직과 유사한 구조 및 특성을 구현할 수 있으므로, 약물 검사에 사용될 수 있다. 구체적으로, 신약에 대한 조직 반응을 검사하기 위하여, 상기 다층 세포 시트를 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시상태에 따른 다층 세포 시트의 제조방법을 도시한 것이다. 구체적으로, 도 1은 제1 세포층이 형성된 제1 기재(A)를 제2 세포층이 형성된 제2 기재(B)의 각 세포층을 서로 접하도록 한 후(C), 온도를 낮추어 제1 기재를 제거하여 2층의 세포층이 구비된 세포 시트를 제조하는 것을 도시한 것이다. 도 1의 후속 단계로서, 추가의 세포층을 더 적층할 수도 있고, 또한 제2 기재를 제거하여 2층의 세포층으로 이루어진 세포 시트를 수득할 수도 있다. 다만, 본 발명은 도 1에 한정되지 않으며, 추가의 구성 및/또는 단계가 더 포함될 수 있다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실시예]
플루로닉 하이드로겔 시트(제1 기재)의 제조
하이드로겔 시트를 제조하기 위하여, 젤라틴 몰드를 준비하고 몰드의 바닥은 마이크로 패턴을 형성하였다. 약 25 ℃의 분위기에서, 상기 젤라틴 몰드 내에 약 10 wt%의 플루로닉 f-127 (Simga) 수용액을 넣었다. 그리고, 제조되는 하이드로겔 시트의 상면을 평평하게 하기 위하여 니트로셀룰로오스막을 덮고, 이를 고정하기 위한 플라스틱 메쉬 및 유리판을 적층하였다. 그리고 나서, 온도를 약 37 ℃로 상승시켜 몰드 내 플루로닉 f-127 (Simga) 수용액만을 경화시켜 하이드로겔화 하였다. 이후, 약 37 ℃의 washing buffer (Saline, PBS, ddH2O)를 이용하여 젤라틴 몰드를 녹이는 방법으로 제거하여 플루로닉 하이드로겔 시트를 제조하였다.
도 2는 실시예에 따라 제조된 플루로닉 하이드로겔 시트의 확대 이미지를 나타낸 것이다. 상기 플루로닉 하이드로겔 시트는 투명하기 때문에, 도 2와 같이 전자현미경을 이용한 bright field image를 통하여 형성된 패턴을 확인할 수 있다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 제조된 플루로닉 하이드로겔 시트는 일정한 간격으로 스트라이프 패턴이 형성된 것을 확인할 수 있다.
알지네이트 하이드로겔 시트(제2 기재)의 제조
하이드로겔 시트를 제조하기 위하여, 젤라틴 몰드를 준비하고 몰드의 바닥은 마이크로 패턴을 형성하였다. 약 25 ℃의 분위기에서, pH 6-7의 MES 버퍼에 약 2 wt%의 함량으로 알지네이트가 포함된 알지네이트 용액을 상기 젤라틴 몰드 내에 넣었다. 그리고, 제조되는 하이드로겔 시트의 상면을 평평하게 하기 위하여 니트로셀룰로오스막을 덮고, 이를 고정하기 위한 플라스틱 메쉬 및 유리판을 적층하였다. 그리고 나서, 알지네이트 가교 수용액을 적가하여 몰드 내의 알지네이트 용액을 하이드로겔화 하였다. 이후, 약 37 ℃의 washing buffer (Saline, PBS, ddH2O)를 이용하여 젤라틴 몰드를 녹이는 방법으로 제거하여 알지네이트 하이드로겔 시트를 제조하였다.
다층 세포 시트의 제조
약 37 ℃의 분위기에서, 상기 제조된 플루로닉 하이드로겔 시트의 패턴이 형성된 면 상에 C2C12 골격근 세포를 배양하여 세포층을 형성하고, 알지네이트 하이드로겔 시트의 일면 상에 C2C12 골격근 세포를 배양하여 세포층을 형성하였다. 그리고 나서, 세포층이 접하도록 한 후, 온도를 약 10 ℃로 낮추어 플루로닉 하이드로겔 시트를 녹여 제거하여, 2-스택의 세포 시트를 제조하였다. 그리고 나서, 세포층의 활성을 위하여 다시 온도를 약 37 ℃로 상승시켰다.
도 3은 실시예에서의 플루로닉 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 확대 이미지를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 3은 전자현미경을 이용하여 플루로닉 하이드로겔 시트가 제거된 면의 bright field image를 촬영한 것이다.
도 4는 실시예에서의 플루로닉 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 세포 생존 여부를 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 4에서의 염색은 Thermofisher사의 Live/Dead mammalian cell kit를 이용하였으며, 살아 있는 세포는 calcein AM으로 염색되어 녹색으로 염색되고, 죽은 세포는 ethidium homodimer-1로 염색되어 붉은색으로 염색되어 나타난다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 플루로닉 하이드로겔 시트를 제거하더라도 99 % 이상의 세포가 살아있는 것을 확인할 수 있다.
나아가, 알지네이트 분해 효소가 포함된 용액을 이용하여, 알지네이트 하이드로겔 시트를 제거하였다.
도 5는 실시예에서의 알지네이트 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 확대 이미지를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 5는 전자현미경을 이용하여 알지네이트 하이드로겔 시트가 제거된 면의 bright field image를 촬영한 것이다. 도 5에 있어서, 일부 패인 영역은 알지네이트 하이드로겔 시트가 세포 시트와 분리되면서 세포 시트의 일부 영역이 수축된 것으로 확인된다.
도 6은 실시예에서의 알지네이트 하이드로겔 시트가 제거된 면의 세포 시트의 세포 생존 여부를 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 6에서의 염색은 Thermofisher사의 Live/Dead mammalian cell kit를 이용하였으며, 살아 있는 세포는 calcein AM으로 염색되어 녹색으로 염색되고, 죽은 세포는 ethidium homodimer-1로 염색되어 붉은색으로 염색되어 나타난다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, 알지네이트 하이드로겔 시트를 제거하더라도 99 % 이상의 세포가 살아있는 것을 확인할 수 있다.
도 7은 실시예에 따른 플루로닉 하이드로겔 시트 및 알지네이트 하이드로겔 시트가 모두 제거된 세포 시트를 촬영한 것을 나타낸 것이다. 도 4, 6 및 7에서 확인할 수 있듯이, 실시예와 같이 제조된 세포 시트는 온전한 형태로 높은 생존력을 나타내며 제조될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (17)

  1. (a) 0 ℃ 내지 30 ℃ 중 어느 한 지점의 온도에서 녹는점을 가지거나 소수성에서 친수성으로 변환되는 제1 기재 상에 제1 세포층을 형성하는 단계;
    (b) 효소에 의하여 분해되는 제2 기재 상에 제2 세포층을 형성하는 단계;
    (c) 상기 제1 세포층과 상기 제2 세포층을 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 제1 기재를 선택적으로 제거하는 단계; 및
    (e) 효소를 포함하는 용액에 상기 제2 기재를 접촉시켜 상기 제2 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    (d) 단계 및 (e) 단계가 순차적으로 수행되고, (d) 단계와 (e) 단계 사이에,
    (d') 노출된 상기 제1 세포층과 추가의 제1 기재 상에 구비된 추가의 제1 세포층을 접촉시킨 후, 상기 추가의 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 추가의 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 제공하여, 상기 추가의 제1 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    (d') 단계는 2회 이상 반복 수행되어 상기 제1 세포층 상에 복수의 추가의 제1 세포층을 형성하는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    (e) 단계 및 (d) 단계가 순차적으로 수행되고, (e) 단계와 (d) 단계 사이에,
    (e') 노출된 상기 제2 세포층과 추가의 제2 기재 상에 구비된 추가의 제2 세포층을 접촉시킨 후, 효소를 포함하는 용액에 상기 추가의 제2 기재를 접촉시켜 상기 추가의 제2 기재를 선택적으로 제거하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    (e') 단계는 2회 이상 반복 수행되어 상기 제2 세포층 상에 복수의 추가의 제2 세포층을 형성하는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    (d) 단계는 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도를 가지는 용액에 상기 제1 기재를 접촉시키거나, 또는 주변 온도를 상기 제1 기재의 녹는점 이하의 온도 또는 상기 제1 기재가 친수성으로 변환되는 온도로 낮추는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 세포층 및 상기 제2 세포층은 각각 상기 제1 기재 및 상기 제2 기재 상에 배양되어 형성되는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    (a) 단계 및 (c) 단계는 35 ℃ 내지 40 ℃의 분위기에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 기재는 폴리포스파젠계 하이드로겔, 플루로닉계 하이드로겔 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 중 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 기재는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)로 표면 처리된 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 기재는 카르복실메틸 셀룰로오스 또는 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 기재인 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 카르복실메틸 셀룰로오스 또는 알지네이트는 티라민으로 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 효소는 카르복실메틸 셀룰로오스 분해효소 또는 알지네이트 분해효소인 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 기재 및 상기 제2 기재는 각각 제1 세포층 및 제2 세포층의 특성을 구현하기 적합한 소정의 패턴을 가지는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 기재 및 상기 제2 기재는 각각 제1 세포층 및 제2 세포층의 특성을 구현하기 적합한 소정의 강도를 가지는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 세포층 및 상기 제2 세포층은 각각 중간엽줄기세포(MSCs; mesenchymal stem cells), 근조직 전구세포(myocyte precursor cells), 근세포(myocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 연골세포(chondrocytes), 내피세포(endothelial cells), 상피세포(epithelial cells), 배성간세포(ESCs; embryonic stem cells), 조혈간세포(hematopoietic stem cells), 부착 의존성 세포 프리커서(anchorage-dependent cell precursors), 유도된 전분화능 줄기세포 (iPSCs; induced pluripotent stem cells), 및 심근세포(cardiomyocytes)로 이루어진 군에서 선택되는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다층 세포 시트의 제조방법.
  17. 청구항 1에 따른 제조방법을 이용하여 제조된 다층 세포 시트.
PCT/KR2019/009544 2018-07-31 2019-07-31 다층 세포 시트의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다층 세포 시트 Ceased WO2020027575A1 (ko)

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US17/264,148 US20220080083A1 (en) 2018-07-31 2019-07-31 Method for fabricating multi-layered cell sheet and multi-layered sheet fabricated by using the same
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