WO2020055187A1 - 유전자가 변이된 세포의 사멸 유도 조성물 및 상기 조성물을 이용한 유전자가 변형된 세포 사멸 유도 방법 - Google Patents

유전자가 변이된 세포의 사멸 유도 조성물 및 상기 조성물을 이용한 유전자가 변형된 세포 사멸 유도 방법 Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified cell death-inducing composition comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor, and a method for inducing genetically modified cell death.
  • Cells with damaged genes or genomes cause problems for living organisms or organs of life. There may be various methods for selectively inducing the death of these cells, but it is true that most of them damage the normal cells together, so there is a problem in clinical use.
  • Cells with damaged genes or genomes are the most representative cancer cells that cause problems with the organism's survival or organs. Even if DNA damage accounts for a very small portion of the entire human genome, if DNA damage occurs to a proto-oncogene or a suppressor gene, the likelihood of cancer ultimately increases. (Molecular Cell Biology. 4th edition. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. New York: W. H. Freeman; 2000, “Section 12.4DNA Damage and Repair and Their Role in Carcinogenesis”).
  • cancer-specific mutations can be said to be the main basis for the development of cancer therapeutics.
  • studies on cancer mutations can develop therapeutic agents that target specific genetic variations, and also confirm the correlation between mutation profiles and drug responsiveness.
  • Cancer is caused by accumulation of genetic mutations, which are inherited through germ cells or acquired within somatic cells during the cell cycle. Changes in these oncogenes, oncogenes, and DNA repair genes cause cells to escape growth and regulatory mechanisms to develop cancer.
  • DNA double chain truncation is one of the most serious damages at the cellular level, and the damaged DNA is repaired by non-homologous end joining and homologous recombination, but the unrepaired DNA is genetic information. Apoptosis can be induced by damage or rearrangement.
  • CRISPR / Cas is a gene correction tool through an RNA guide, using a bacterial-induced endonuclease Cas9 (or mutant nickase) and a guide RNA, to match the sequence between the guide RNA and genomic DNA, to a specific position in the genome.
  • a double (or single) strand brake can be introduced.
  • CRISPR / Cas-mediated gene knockout is expected to be more efficient than RNA interference-mediated gene knockdown, and provides a useful experimental tool for studying gene function.
  • CRISPR-Cas system can operate in mammalian cells, and gene editing techniques derived from the adaptive immunity of microorganisms include Cas9 (CRISPR associated protein 9: RNA-guided DNA endonuclease enzyme) and guide RNA (gRNA). ).
  • the guide RNA includes crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA), and binds to Cas9 to guide to the desired genomic sequence through base pairing to the target sequence, thereby making double strand break (DSB) ) Is generated.
  • the only criterion for defining a target sequence is the presence or absence of a PAM (protospacer adjacent motif), and the PAM (protospacer adjacent motif) has different characteristics depending on the Cas protein that recognizes it, for example, Cas9 from S. pyogenes Silver 5'-NGG-3 '(N is one of A, T, G, C); Cas9 from S. thermophilus is 5'-NNAGAAW-3 '; Cas9 from C jejuni is known as 5'-NNNNRYAC-3 ', and since the sequences are arranged at regular intervals on the human genome, it can be used for gene editing.
  • Cas9 from S. thermophilus is 5'-NNAGAAW-3 '
  • Cas9 from C jejuni is known as 5'-NNNNRYAC-3 ', and since the sequences are arranged at regular interval
  • the inventors of the present application have a genetically modified cell-specific INDEL sequence in a genetically modified cell such as all cancer cells, and a DSB (a specific DNA site) using a cleavage factor and a nucleic acid cleavage enzyme prepared therefrom. Double strand break) was induced, and when several DNA DSBs occurred in the cell, it was confirmed that the genetically modified cell could be killed, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a composition for inducing apoptosis of a genetically modified cell comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor.
  • An object of the present invention is to provide a composition for treating cancer comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor.
  • An object of the present invention is to provide a method for inducing apoptosis of a genetically modified cell comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor.
  • An object of the present invention is to provide a method of treating cancer using a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor.
  • the present invention provides a composition for inducing genetically modified cell death comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor specifically recognizing a genetically modified cell-specific variant sequence.
  • the present invention also provides a composition for treating cancer comprising a cleavage factor that specifically recognizes a nucleic acid sequence including a nucleic acid cleavage enzyme and cancer specific insertion and / or deletion.
  • the present invention also provides a method of inducing genetically modified cell death comprising the step of processing a nucleic acid sequence that specifically recognizes a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a genetically modified cell-specific mutation sequence in a genetically modified cell. to provide.
  • the present invention also, the step of performing a whole genome sequencing (WGS) of the genetically modified cells and normal cells;
  • WGS whole genome sequencing
  • a method of inducing apoptosis of a genetically modified cell comprising the step of applying a composition comprising a nucleic acid cleaving enzyme and a cleavage factor to the genetically modified cell.
  • the present invention also, the step of performing a whole genome sequencing (WGS) of the genetically modified cells and normal cells;
  • WGS whole genome sequencing
  • a method of inducing apoptosis of a genetically modified cell comprising the step of applying a composition comprising a nucleic acid cleaving enzyme and a cleavage factor to the genetically modified cell.
  • the present invention also provides a method of treating cancer comprising administering to a subject a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid cleavage enzyme and cancer specific insertion and / or deletion. do.
  • the present invention furthermore, treats a cancer cell with a vector comprising an expression cassette of a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cancer specific insertion and / or deletion. It provides a method for treating cancer, including.
  • the present invention further relates to a composition for the treatment of a patient-specific cancer comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising a patient's own cancer cell insertion and / or deletion. .
  • the present invention is to select a cancer cell-specific indel from a cancer cell of a patient, prepare a cutting factor that recognizes it, and deliver a composition comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cutting factor to a patient, thereby treating a patient-specific cancer. It is about.
  • FIG. 1 shows the results of confirming whether cells are killed when DNA double strand break (DSB) occurs simultaneously.
  • Figure 2 shows the results confirming whether the DNA is cut by the CRIPSR system using a guide RNA.
  • Figure 3 is a colon cancer and osteosarcoma cells by transfecting 30 specific RNP (ribonucleotide protein) complex (transplex) to induce DNA DSB and then the cell growth rate through a colony forming assay (colony forming assay) It shows the confirmed result.
  • RNP ribonucleotide protein
  • Figure 4 shows the results of measuring the cell infection rate of AAV, using immunofluorescence (immunofluorescence) and flow cytometry (flow cytometry).
  • Figure 5 shows the results confirming that the AAV particles were transfected by immunofluorescence.
  • FIG. 6 shows the results of U2OS specific crRNA dependent apoptosis using 30 U2OS cell line specific crRNAs.
  • Figure 7 confirms whether the U2OS cell-specific saCAS9 AAV system works or not, and apoptosis results in U2OS cells.
  • Figure 8 shows the results of measuring the apoptosis-based cell survival rate by cancer-specific INDEL.
  • Figure 10 shows the results confirming whether selective cancer cell death occurs in glioblastoma.
  • FIG. 11 shows the results of confirming the difference in apoptosis effect when using AAV particles with or without ATM kinase inhibitor.
  • Figure 12 shows the results confirming the effect of lung cancer specific INDEL induced apoptosis (CINDELA).
  • the present invention relates to a composition for inducing genetically modified cell death comprising a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a genetically modified cell-specific mutation sequence.
  • the present invention relates to a composition for the treatment of cancer comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including cancer specific insertion and / or deletion.
  • the present invention is a method for inducing genetically modified cell death comprising the step of processing a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including a nucleic acid cleaving enzyme and a genetically modified cell-specific mutation sequence in a genetically modified cell. It is about.
  • the genetically modified cell means a cell whose cell activity is different from that of a normal cell by genetic modification, and for example, a cell in a disease onset state due to genetic modification, specifically, a cancer cell.
  • the cancer is, for example, melanoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, glioma, liver cancer, thyroid tumor, stomach cancer, prostate cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, glioblastoma , Endometrial cancer, kidney cancer, colon cancer, pancreatic cancer, esophageal carcinoma, head and neck cancer, mesothelioma, sarcoma, osteosarcoma, bile duct cancer or epidermal cancer, but is not limited thereto.
  • DNA sequences not found in normal cells are inserted into all cancer cells (Insertion: IN), or a part of the DNA of normal cells is cut (Deletion: Del), and many cancer cells are specifically inserted / deleted. DNA sequences can be present.
  • Cells have a mechanism for repairing DNA damage that attempts to repair a DNA double helix when it is cut.
  • this damage repair mechanism effectively repairs when the number of DNA double helix breaks is small, but dies as the number increases. It is known that bacteria can kill bacteria with a single DNA double helix break, but more DSBs are required for animal cells.
  • a genetically modified cell for example, an InDel of a cancer cell is found and a cleavage factor capable of recognizing it is produced, and the genetically modified cell using a nucleic acid cleaving enzyme, for example, Cancer cells and the like can be induced to specifically kill.
  • a nucleic acid cleaving enzyme for example, Cancer cells and the like
  • the nucleic acid cleavage enzyme which is a means of DNA double helix cleavage, may be a restriction enzyme, zinc finger nuclease (ZNFN), transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN), or Cas protein, but is not limited thereto.
  • the Cas protein may be Cas3, Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), Cas6, C2c12 or C2c2, but is not limited thereto.
  • the Cas protein is Corynebacter, Suterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus: Streptococcus pyogenes , Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviiivola, Flavobacterium, Azospirillum, Gluconacetobacter , Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus (Staphylococcus aureus), Nitratifractor, Corynebacterium, and Campylobacter (Campylobacter) ) Is derived from a microorganism genus containing an ortholog of a Cas protein selected from the group consisting of, and may be a simple isolate or a recombinant one.
  • the present invention comprises the steps of performing WGS (whole genome sequencing) of the genetically modified cells and normal cells; Comparing the WGS of the genetically modified cells and normal cells to select the cell-specific mutation sequence genetically modified; Preparing a truncation factor recognizing the selected variant sequence; Combining the cleavage factor with a nucleic acid cleavage enzyme; And applying a composition comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor to the genetically modified cells.
  • WGS whole genome sequencing
  • the present invention comprises the steps of performing WGS (whole genome sequencing) of genetically modified cells, for example, cancer cells and normal cells; Comparing the WGS of the genetically modified cells with normal cells to select the cell-specific indels that have been genetically modified; Preparing a cutting factor recognizing the selected indel; Combining the cleavage factor with a nucleic acid cleavage enzyme; And applying a composition comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cleavage factor to the genetically modified cells.
  • WGS whole genome sequencing
  • the mapping of InDel can be performed through the method of whole genome sequencing (WGS), or subtractive hybridization and sequencing.
  • WGS whole genome sequencing
  • the guide RNA is directly prepared in the case of the insertion found in the cancer.
  • a guide RNA including the break point can be prepared and used.
  • WGS refers to a method of reading the genome in multiples of 10 X, 20 X, and 40 X in full-length genome sequencing by next generation sequencing.
  • Next generation sequencing refers to a technology that fragments the full-length genome in a chip-based and PCR-based paired end format, and performs the sequencing at a high speed based on a chemical reaction. do.
  • Subtracted hybridization is a method used for cloning genes with differences in expression between different tissues or cells.
  • the DNA sample specific gene of the cell to be tested can be detected.
  • the DNA of the cell under test is denatured with one-stranded DNA, and then annealed. By controlling the annealing conditions, the cell-specific DNA sequence to be tested can be separated into two-stranded DNA.
  • a nucleic acid sequence including InDel unique to cancer cells which is a type of genetically modified cell, refers to a gene region in which DSB of DNA in a nucleic acid sequence occurs by a nucleic acid cleavage enzyme by targeting InDel, for example, a nucleic acid sequence.
  • Sequences specifically recognized by the nucleic acid cleavage enzyme for example, when the nucleic acid cleavage enzyme is Cas9, a nucleic acid of about 17 bp to 23 bp located adjacent to the 5 'end and / or 3' end of the PAM sequence recognized by the Cas9 protein Can mean sequence.
  • the nucleic acid sequence including InDel unique to the cancer cell which is a genetically modified cell, is represented by the nucleic acid sequence of the strand in which the PAM sequence is located among the two DNA strands of the corresponding sequence region.
  • the DNA strand to which the guide RNA actually binds is a complementary strand of the strand where the PAM sequence is located, so the targeting sequence included in the guide RNA includes InDel, except that T is changed to U due to RNA characteristics. It will have the same nucleic acid sequence as the nucleic acid sequence.
  • the PAM sequence is 5'-NGG-3 '(N is A, T, G, or C), and the genetically modified cell is unique.
  • the nucleic acid sequence comprising the InDel of is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NGG-3 'sequence in the sequence, for example, a gene region having a maximum length of about 50 bp or about 40 bp.
  • the PAM sequence is 5'-NNAGAAW-3 '(N is A, T, G, or C), and the genetically modified cell is unique.
  • the nucleic acid sequence comprising the InDel of is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNAGAAW-3 'sequence in the sequence, for example, a gene region having a maximum length of about 50 bp or about 40 bp.
  • the PAM sequence is 5'-NNGRRT-3 '(N is A, T, G, or C, R is A or G)
  • a nucleic acid sequence comprising a cell-specific InDel genetically modified is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNGRRT-3 'sequence in the sequence, e.g., the maximum length is about It may be a gene site that is 50 bp or about 40 bp.
  • the PAM sequence is 5'-NNNNRYAC-3 '(N is A, T, G, or C, R is A or G, Y is C or T), and the nucleic acid sequence comprising the cell-specific InDel genetically modified is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNNNRYAC-3 'sequence in the sequence. For example, it may be a gene site having a maximum length of about 50 bp or about 40 bp.
  • the cleavage factor refers to a nucleotide sequence that recognizes and cleaves a mutated portion of a nucleic acid sequence of a genetically modified cell compared to a normal cell.
  • the cleavage factor should be a sufficient number to induce cell death compared to the base sequence of normal cells, preferably 1 to 30, more preferably 10 to 30, more preferably The number may be 16 to 30, but the number may vary depending on the cell type or cutting factor.
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising InDel unique to a genetically modified cell, such as a cancer cell may be, for example, guide RNA.
  • the guide RNA may be, for example, one or more selected from the group consisting of CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), and single guide RNA (sgRNA), specifically crRNA and tracrRNA. It may be a double-stranded crRNA: tracrRNA complex bound to each other, or a single-stranded guide RNA (sgRNA) in which a crRNA or a part thereof and a tracrRNA or part thereof are connected by an oligonucleotide linker.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • sgRNA single guide RNA
  • the guide RNA specifically recognizing the nucleic acid sequence containing the genetically modified cell-specific InDel is 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% of the nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA strand in which the PAM sequence is located. It means a nucleotide sequence having a sequence complementarity of at least 98%, at least 99%, or at 100%, and is capable of binding to the nucleotide sequence of the complementary strand.
  • the guide RNA can be produced through the following steps: Compare the WGS result data of cancer cells and normal cells to find cancer cell-specific InDel. Based on this, a cancer cell specific guide RNA that satisfies the conditions for producing guide RNA is designed. Then, considering the length of the InDel site, random ranking is given, and guide RNAs can be designed evenly on all chromosomes to complete the final guide RNA combination.
  • Guide RNA production conditions are as follows.
  • the guide RNA prepared based on this may include, for example, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 163.
  • the number of guide RNAs capable of inducing cancer cell death may be about 1 to 40, about 15 to 25, or about 10 to 20 specifically.
  • the guide RNA may be, for example, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 30, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 to 60, and one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 61 to 90.
  • the above sequence may include one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 91 to 120, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 121 to 136, and one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 137 to 163. .
  • the cancer is colorectal cancer
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including colorectal cancer specific insertion and / or deletion is a sequence of SEQ ID NOs: 1 to 30. It may be a guide RNA comprising one or more sequences selected from the group consisting.
  • the cancer is osteosarcoma
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising osteosarcoma specific insertion and / or deletion is, for example, SEQ ID NOs: 31-60. It may be a guide RNA comprising at least one sequence selected from the group consisting of sequences or a guide RNA comprising at least one sequence selected from the group consisting of sequences of SEQ ID NOs: 91 to 120.
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising insertion and / or deletion unique to a normal cell is one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 61-90 It may be a guide RNA comprising a.
  • the cancer is glioblastoma
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising glioblastoma specific insertion and / or deletion is, for example, SEQ ID NO: 121 to It may be a guide RNA comprising one or more sequences selected from the group consisting of 136.
  • the cancer is lung cancer
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including lung cancer specific insertion and / or deletion is, for example, SEQ ID NOs: 137 to 163. It may be a guide RNA comprising one or more sequences selected from the group consisting.
  • cancer-specific InDel is identified in each cell line REP1 cell immortalized colon cancer cell line HCT116, osteosarcoma cell line U2OS, glioblastoma cell line GBL-67, lung cancer tissue and normal cells, and specific
  • REP1 cell immortalized colon cancer cell line HCT116 osteosarcoma cell line U2OS
  • glioblastoma cell line GBL-67 glioblastoma cell line GBL-67
  • lung cancer tissue and normal cells and specific
  • the guide RNA specifically recognizing the InDel of the colorectal cancer cell line HCT116 includes the sequence of SEQ ID NOs: 1 to 30, and the guide RNA specifically recognizing the InDel of the osteosarcoma cell line U2OS: SEQ ID NO: 31 to 60 or
  • the guide RNA comprising the sequence of SEQ ID NO: 91 to 120, and specifically recognizing the InDel of glioblastoma, Glioblastoma includes one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 121 to 136, and specific for InDel of lung cancer tissue.
  • the guide RNA to be recognized comprises one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 137 to 163, and the guide RNA to specifically recognize InDel of the normal cell line REP1 includes the sequences of SEQ ID NOs: 61 to 90.
  • guide RNA After confirming the cell line specific InDel through full-length genome translation (WGS), guide RNA is designed to be included in the region of the PAM site that strongly binds the region.
  • the designed guide RNA is identified in the normal human standard genome to confirm that there is no non-specific response. After that, a random ranking is given considering the length of the InDel site, and based on this, a guide RNA can be designed by golgo in all chromosomes to complete the final guide RNA combination. In the present example, 30 guide RNAs were used, but this number can be adjusted according to the type of cancer cell and the experimental method of causing DSB.
  • Nucleic acid cleavage enzymes and cleavage factors according to the present invention include (a) one or more guide RNAs and a vector comprising a nucleic acid sequence expressing a nucleic acid cleavage enzyme, eg, Cas protein, (b) one or more guide RNAs And a nucleic acid cleavage enzyme, for example, a ribonucleoprotein (RNP) or RNA-guided engineered nuclease (RGEN) composed of a Cas protein, or (c) one or more guide RNAs and nucleic acid cleavage enzymes, for example, mRNA encoded in a Cas protein It can be delivered in the cell in the configuration of, but is not limited to.
  • the vector may be a viral vector.
  • the viral vector is a retrovirus, adenovirus parvovirus (e.g., adenoassociated virus (AAV)), coronavirus, orthomyxovirus (orthomyxovirus) negative strand RNA viruses (e.g., influenza virus), lab diagram Positive strand RNA viruses such as viruses (rhabdoviruses, such as rabies and vesicular stomatitis viruses), paramyxoviruses (e.g., measles and Sendai, alphaviruses, and picornaviruses) And double-stranded DNA, including herpesvirus (e.g., Herpes Simplex virus types 1 and 2, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus), adenovirus Viruses, poxviruses (e.g. vaccinia, fowlpox or canarypox) Etc.
  • herpesvirus e.g., Herpes Simple
  • the vectors may be delivered in vivo or intracellularly through electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, as well as protein translocation domain (PTD) fusion protein methods, respectively.
  • PTD protein translocation domain
  • At least one selected ATR (Ataxia telangiectasia mutated) inhibitor, Schisandrin B, NU6027, NVP-BEZ235, VE-821, VE-822 (VX-970), AZ20, AZD6738 selected from the group consisting of at least one ATR (Ataxia telangiectasia and Rad- 3 mutated) inhibitor, or DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) may further include a DNA double helix repair inhibitor.
  • the present invention relates to a composition for the treatment of cancer comprising a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising a nucleic acid cleavage enzyme and a cancer cell-specific insertion and / or deletion.
  • the present invention relates to a cancer treatment method comprising administering to a subject a cutting factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including nucleic acid cleavage enzyme and cancer cell-specific insertion and / or deletion. It is about.
  • a patient-specific composition for treating cancer comprising a cleavage factor and a nucleic acid cleavage enzyme specifically recognizing a nucleic acid sequence including insertion and / or deletion specific to a patient's cancer cells will be.
  • Patient tailoring means that cancer can be effectively treated by sufficiently reflecting the patient's unique characteristics or the patient's disease characteristics. Through a patient-specific composition for cancer treatment, it can be useful for screening of therapeutic agents and selection of treatment methods.
  • the genetically modified cell means a cell whose cell activity is different from that of a normal cell by genetic modification, and for example, a cell in a disease onset state due to genetic modification, specifically, a cancer cell.
  • the cancer is, for example, melanoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, glioma, liver cancer, thyroid tumor, stomach cancer, prostate cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, glioblastoma , Endometrial cancer, kidney cancer, colon cancer, pancreatic cancer, esophageal carcinoma, head and neck cancer, mesothelioma, sarcoma, osteosarcoma, bile duct cancer or epidermal cancer, but is not limited thereto.
  • DNA sequences not found in normal cells are inserted into all cancer cells (Insertion: IN), or a part of the DNA of normal cells is cut (Deletion: Del), and many cancer cells are specifically inserted / deleted. DNA sequences can be present.
  • Cells have a mechanism for repairing DNA damage that attempts to repair a DNA double helix when it is cut.
  • this damage repair mechanism effectively repairs when the number of DNA double helix breaks is small, but dies as the number increases. It is known that bacteria can kill bacteria with a single DNA double helix break, but more DSBs are required for animal cells.
  • a genetically modified cell for example, an InDel of a cancer cell is found and a cleavage factor capable of recognizing it is produced, and the genetically modified cell using a nucleic acid cleaving enzyme, for example, Cancer cells and the like can be induced to specifically kill.
  • a nucleic acid cleaving enzyme for example, Cancer cells and the like
  • the nucleic acid cleavage enzyme which is a means of DNA double helix cleavage, may be a restriction enzyme, zinc finger nuclease (ZNFN), transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN), or Cas protein, but is not limited thereto.
  • the Cas protein may be Cas3, Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), Cas6, C2c12 or C2c2, but is not limited thereto.
  • the Cas protein is Corynebacter, Suterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus: Streptococcus pyogenes , Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviiivola, Flavobacterium, Azospirillum, Gluconacetobacter , Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus (Staphylococcus aureus), Nitratifractor, Corynebacterium, and Campylobacter (Campylobacter) ) Is derived from a microorganism genus containing an ortholog of a Cas protein selected from the group consisting of, and may be a simple isolate or a recombinant one.
  • a nucleic acid sequence including InDel unique to cancer cells which is a type of genetically modified cell, refers to a gene region in which DSB of DNA in a nucleic acid sequence occurs by a nucleic acid cleavage enzyme by targeting InDel, for example, a nucleic acid sequence.
  • Sequences specifically recognized by the nucleic acid cleavage enzyme for example, when the nucleic acid cleavage enzyme is Cas9, a nucleic acid of about 17 bp to 23 bp located adjacent to the 5 'end and / or 3' end of the PAM sequence recognized by the Cas9 protein Can mean sequence.
  • the nucleic acid sequence including InDel unique to the cancer cell which is a genetically modified cell, is represented by the nucleic acid sequence of the strand in which the PAM sequence is located among the two DNA strands of the corresponding sequence region.
  • the DNA strand to which the guide RNA actually binds is a complementary strand of the strand where the PAM sequence is located, so the targeting sequence included in the guide RNA includes InDel, except that T is changed to U due to RNA characteristics. It will have the same nucleic acid sequence as the nucleic acid sequence.
  • the PAM sequence is 5'-NGG-3 '(N is A, T, G, or C), and the genetically modified cell is unique.
  • the nucleic acid sequence comprising the InDel of is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NGG-3 'sequence in the sequence, for example, a gene region having a maximum length of about 50 bp or about 40 bp.
  • the PAM sequence is 5'-NNAGAAW-3 '(N is A, T, G, or C), and the genetically modified cell is unique.
  • the nucleic acid sequence comprising the InDel of is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNAGAAW-3 'sequence in the sequence, for example, a gene region having a maximum length of about 50 bp or about 40 bp.
  • the PAM sequence is 5'-NNGRRT-3 '(N is A, T, G, or C, R is A or G)
  • a nucleic acid sequence comprising a cell-specific InDel genetically modified is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNGRRT-3 'sequence in the sequence, e.g., the maximum length is about It may be a gene site that is 50 bp or about 40 bp.
  • the PAM sequence is 5'-NNNNRYAC-3 '(N is A, T, G, or C, R is A or G, Y is C or T), and the nucleic acid sequence comprising the cell-specific InDel genetically modified is a gene region located adjacent to the 5 'end and / or the 3' end of the 5'-NNNNRYAC-3 'sequence in the sequence. For example, it may be a gene site having a maximum length of about 50 bp or about 40 bp.
  • the cleavage factor refers to a nucleotide sequence that recognizes and cleaves a mutated portion of a nucleic acid sequence of a genetically modified cell compared to a normal cell.
  • the cleavage factor should be a sufficient number to induce cell death compared to the base sequence of normal cells, preferably 1 to 30, more preferably 10 to 30, more preferably The number may be 16 to 30, but the number may vary depending on the cell type or cutting factor.
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising InDel unique to a genetically modified cell, such as a cancer cell may be, for example, guide RNA.
  • the guide RNA may be, for example, one or more selected from the group consisting of CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), and single guide RNA (sgRNA), specifically crRNA and tracrRNA. It may be a double-stranded crRNA: tracrRNA complex bound to each other, or a single-stranded guide RNA (sgRNA) in which a crRNA or a part thereof and a tracrRNA or part thereof are connected by an oligonucleotide linker.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • sgRNA single guide RNA
  • the guide RNA specifically recognizing the nucleic acid sequence containing the genetically modified cell-specific InDel is 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% of the nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA strand in which the PAM sequence is located. It means a nucleotide sequence having a sequence complementarity of at least 98%, at least 99%, or at 100%, and is capable of binding to the nucleotide sequence of the complementary strand.
  • the guide RNA can be produced through the following steps: Compare the WGS result data of cancer cells and normal cells to find cancer cell-specific InDel. Based on this, a cancer cell specific guide RNA that satisfies the conditions for producing guide RNA is designed. Then, considering the length of the InDel site, random ranking is given, and guide RNAs can be designed evenly on all chromosomes to complete the final guide RNA combination.
  • Guide RNA production conditions are as follows.
  • the guide RNA prepared based on this may include, for example, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 163.
  • the number of guide RNAs capable of inducing cancer cell death may be about 1 to 40, about 15 to 25, or about 10 to 20 specifically.
  • the guide RNA may be, for example, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 30, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 to 60, and one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 61 to 90.
  • the above sequence may include one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 91 to 120, one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 121 to 136, and one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 137 to 163. .
  • the cancer is colorectal cancer
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including colorectal cancer specific insertion and / or deletion is a sequence of SEQ ID NOs: 1 to 30. It may be a guide RNA comprising one or more sequences selected from the group consisting.
  • the cancer is osteosarcoma
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising osteosarcoma specific insertion and / or deletion is, for example, SEQ ID NOs: 31-60. It may be a guide RNA comprising at least one sequence selected from the group consisting of sequences or a guide RNA comprising at least one sequence selected from the group consisting of sequences of SEQ ID NOs: 91 to 120.
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising insertion and / or deletion unique to a normal cell is one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 61-90 It may be a guide RNA comprising a.
  • the cancer is glioblastoma
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising glioblastoma specific insertion and / or deletion is, for example, SEQ ID NO: 121 to It may be a guide RNA comprising one or more sequences selected from the group consisting of 136.
  • the cancer is lung cancer
  • a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence including lung cancer specific insertion and / or deletion is, for example, SEQ ID NOs: 137 to 163. It may be a guide RNA comprising one or more sequences selected from the group consisting.
  • Nucleic acid cleavage enzymes and cleavage factors according to the present invention include (a) one or more guide RNAs and a vector comprising a nucleic acid sequence expressing a nucleic acid cleavage enzyme, eg, Cas protein, (b) one or more guide RNAs And a nucleic acid cleavage enzyme, for example, a ribonucleoprotein (RNP) or RNA-guided engineered nuclease (RGEN) composed of a Cas protein, or (c) one or more guide RNAs and nucleic acid cleavage enzymes, for example, mRNA encoded in a Cas protein It can be delivered in the cell in the configuration of, but is not limited to.
  • the vector may be a viral vector.
  • the viral vector is a retrovirus, adenovirus parvovirus (e.g., adenoassociated virus (AAV)), coronavirus, orthomyxovirus (orthomyxovirus) negative strand RNA viruses (e.g., influenza virus), lab diagram Positive strand RNA viruses such as viruses (rhabdoviruses, such as rabies and vesicular stomatitis viruses), paramyxoviruses (e.g., measles and Sendai, alphaviruses, and picornaviruses) And double-stranded DNA, including herpesvirus (e.g., Herpes Simplex virus types 1 and 2, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus), adenovirus Viruses, poxviruses (e.g. vaccinia, fowlpox or canarypox) Etc.
  • herpesvirus e.g., Herpes Simple
  • the vectors may be delivered in vivo or intracellularly through electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, as well as protein translocation domain (PTD) fusion protein methods, respectively.
  • PTD protein translocation domain
  • At least one selected ATR (Ataxia telangiectasia mutated) inhibitor, Schisandrin B, NU6027, NVP-BEZ235, VE-821, VE-822 (VX-970), AZ20, AZD6738 selected from the group consisting of at least one ATR (Ataxia telangiectasia and Rad- 3 mutated) inhibitor, or DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) may further include a DNA double helix repair inhibitor.
  • a method for treating a patient-specific cancer comprising screening a cancer cell-specific indel from a patient's cancer cell, preparing a truncation factor that recognizes it, and delivering the composition comprising the nucleic acid cleavage enzyme and the truncation factor to the patient It is about.
  • compositions, methods and uses of the invention can be administered in sufficient or effective amounts to a subject in need thereof.
  • An 'effective amount' or 'sufficient amount' alone or in multiple doses, alone or in combination with one or more other therapeutic compositions, protocols, or treatment regimes, will benefit the subject for any period of time or provide the subject with expected or desired results. It shows the amount. It can be variously prescribed by factors such as the formulation method, the mode of administration, the patient's age, weight, sex, morbidity, time of administration, route of administration, rate of discharge, and response sensitivity.
  • a vector comprising an expression cassette of a cleavage factor specifically recognizing a nucleic acid sequence comprising an insertion and / or deletion of a nucleic acid cleavage enzyme and a genetically modified cell, e.g., a cancer cell, e.g.
  • viral vectors, plasmid vectors, or Agrobacterium vectors can be used for delivery.
  • a viral vector, Adeno-associated virus (AAV) vector can be used for delivery.
  • the AAV vector dose to achieve a therapeutic effect can be provided as a vector genome dose / kg body weight (vg / kg), but (a) the route of administration, (b) the expression level of the therapeutic gene required to achieve a therapeutic effect , (c) any host immune response to the AAV vector, (d) stability of the expressed protein.
  • AsiSI restriction enzyme When AsiSI restriction enzyme is treated with 4-OHT, it enters the nucleus and recognizes a specific sequence to make a DNA double strand break (DSB), and approximately 100 DSBs are produced. Cell viability according to the production of DSB was confirmed through a colony forming assay. After 200 cells were seeded, 4-OHT was periodically treated from 2 days later (treated in the culture medium once every 2-3 days) to make DSBs and methylene blue stained to see if colonies formed after 2 weeks ( methylene blue staining). In addition, since the size of the colonies differed for each cell, it was found that the stained samples were destained, and the relative cell survival was also similar to the results obtained during staining.
  • the in vitro cleavage assay was performed using the crRNA prepared in Example 1 to determine whether the CRISPR system works. First, through PCR, the DNA of the front and rear parts of the insertion sequence was amplified to a size of 500 bp and purified, and then it was confirmed whether the DNA was cut by the CRIPSR system using the produced crRNA.
  • Genomic DNA was extracted from RPE1, U2OS, and HCT116 cells using the Qiamp DNA mini kit, and a bidirectional primer that was about 500 bp long around the guide RNA was custom-made. After amplifying genomic DNA by adjusting the annealing temperature using iProof High-Fidelity DNA polymerase, the amplified DNA was cut from a 1% agarose gel and then extracted using Qiagen QiAquick gel extraction kit.
  • 10X Cas9 Nuclease Reaction Buffer 200mM HEPES, 1M Nacl, 50mM Mgcl (2), 1mM EDTA pH 6.5), 1uM Cas9 RNP, 100nM DNA substrate, and Nuclease-Free Water were mixed for digestion reaction at 37 ° C for 3 hours. After 3 hours, in order to release the DNA substrate from Cas9 endonulcease, 1ul of 20mg / ml Proteinase K was added and incubated at 56 °C for 10 minutes. The cleaved genomic DNA was confirmed on a 1% agarose gel.
  • a transfection complex is prepared by placing 30 ml of 25 mL volume of RNP complex, 30 times of RNAimax transfection reagent 1.2ul, and 30 times of 23.8ul of Opti-MEM medium at room temperature for 20 minutes at room temperature.
  • colon cancer cells were transfected with RNP complexes unique to osteosarcoma cells, and similarly, osteosarcoma cells were transfected with RNP complexes specific to colon cancer.
  • an ATM inhibitor (inhibitor) 2uM KU 55933 was treated together.
  • HCT116 and U2OS gRNAs will be transfected into RPE1 cells to confirm crRNA specificity, and the minimum number of gRNAs will be titrated to about 20 for each cancer cell.
  • a novel U2OS cell line specific crRNA for saCas9 was designed and packaged in AAV through whole genome sequencing (WGS).
  • the specific sequence of the U2OS cell line specific crRNA is as follows.
  • HA Intracellular staining of HA contained 0.1M cells in a 60mm dish (0 day), HA was not included, or 0.25ml, 0.5ml, 1ml HA was included to infect AAV (2day), cells were harvested and stained. (3day).
  • HA (1: 300) was placed at room temperature for 2 hours
  • mouse 488 (1: 500) was placed at room temperature for 1 hour
  • Rnase A was placed at 37 ° C. for 30 min and PI room temperature for 10 min.
  • the results are shown in FIG. 4. The percentage of nuclear HA tag positive cells appeared at about 80% on day 1, and the percentage further decreased on days 2 and 3.
  • the fixing solution was removed, 1 ml of 100% methanol was added, and then incubated for 10 minutes at -20 ° C. Cells were washed twice with 1 ml PBS.
  • Each drop of mounting reagent was applied to each sample and covered with a cover glass. It was dried in that state, and the slide was completely closed. Focus was detected and visualized using LSM 880 (ZEISS) and ZEN software (ZEISS).
  • U2OS cell line specific crRNAs Using 30 U2OS cell line specific crRNAs, a saCAS9 AAV system was developed and AAV particles were transduced into U2OS cells. 8 * 10 4 U2OS cells were plated in a 6 well plate and incubated overnight, so that 9 * 10 9 AAV particles were respectively transduced into the cells. According to FIG. 6, U2OS specific crRNA dependent apoptosis was observed through the EVOS cell imaging system after 24 hours. However, non-specific crRNA, HCT116 cell-specific crRNA could not induce apoptosis. From the results of Figure 6, it was confirmed that cell line-specific selective apoptosis can be induced by the AAV system.
  • CINDELA Cancer specific INsertion-DELetions induced Apoptosis
  • apoptosis by INDEL was confirmed.
  • the cells were tested in the same manner as in Example 4, except that the cells were cultured in a hypoxic chamber. Only 16 sequences could be used for glioblastoma. Identifying selective apoptosis through 16 glioblastoma specific sequences means that only 16 DNA DSBs can be produced.
  • AAV particles with or without ATM kinase inhibitor were transduced into glioblastoma cells of Example 5 and tested in the same manner as in Examples 4 and 5. After 24 hours of transduction, cells were stained with 1% methylene blue for 10 minutes at room temperature. Cells were washed 3 times with PBS for 10 minutes and dried at room temperature. Cells were bleached with 500ul of 10% acetic acid solution and OD was measured. The results are shown in FIG. 11.
  • lung cancer tissue derived from a patient was used for mouse xenograft.
  • Patient-derived lung cancer tissues were inserted into mice, and AAV particles containing 28 lung cancer tissue-specific crRNAs were continuously injected into mice.
  • AAV particles were injected every 2 days and tumor size was measured. The results are shown in FIG. 12. According to Figure 12, normal cells grew time-dependent, but cancer cells did not grow during the second AAV injection.

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Abstract

본 발명은 핵산절단효소 및 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도 조성물, 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법에 관한 것이다.

Description

유전자가 변이된 세포의 사멸 유도 조성물 및 상기 조성물을 이용한 유전자가 변형된 세포 사멸 유도 방법
본 발명은 핵산절단효소 및 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도 조성물, 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법에 관한 것이다.
유전자 또는 유전체가 손상된 세포는 생물체 또는 생물의 기관이 살아가거나 작동하는데 있어 문제를 야기한다. 이러한 세포를 선택적으로 사멸을 유도하는 방법은 여러가지가 있을 수 있으나 대부분 정상세포까지 함께 손상을 주는 경우가 많기 때문에 임상적으로 사용하는데 문제점이 있는 것이 사실이다.
유전자 또는 유전체가 손상된 세포로서 생물체의 생존이나 생물의 기관에 문제를 야기하는 가장 대표적인 것이 암 세포이다. DNA 손상(DNA damage)이 인간 전체 게놈에 비해 매우 적은 부분을 차지하더라도, DNA 손상이 원종양 유전자(proto-oncogene) 또는 억제유전자(suppressor gene)에 일어나게 되면 궁극적으로 암이 생길 가능성이 높아지게 된다. (Molecular Cell Biology. 4th edition. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. New York: W. H. Freeman; 2000, “Section 12.4DNA Damage and Repair and Their Role in Carcinogenesis”).
암 특이적 변이에 대한 연구 및 분석은 암 치료제 개발의 주요 기반이라 할 수 있다. 예를 들어, 암 변이에 대한 연구를 통해 특이 유전적 변이를 타겟하는 치료제가 개발될 수 있있고, 변이 프로필과 약물 반응성 사이의 상관성도 확인할 수 있었다.
암은 유전자 변이의 축적에 의해 발생하고 이것은 생식세포를 통해 유전되거나 세포 주기동안 체세포 내에 획득되게 된다. 이러한 종양유전자, 종양억제유전자, DNA 복구 유전자들의 변화는 세포가 성장과 조절 메커니즘에서 벗어나 암을 발생시키도록 한다.
이러한 과정에 의해 발생된 암에서는 정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰된다. 이러한 암세포 DNA에 나타나는 특이적 삽입 또는 삭제 DNA(INDEL)는 정상세포에 존재하지 않는 DNA 서열이기 때문에 이들을 정상세포와 암세포의 차별적 공격 타겟으로 설정할 수 있다.
한편, DNA 이중사슬절단은 세포 수준에서 가장 심각한 손상 중의 하나로, 손상된 DNA는 비상동 말단 연결(non-homologous end joining), 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 복구되지만, 복구되지 못한 DNA는 유전 정보의 손상 또는 재배열을 일으켜 세포사(apoptosis)가 유도될 수 있다.
CRISPR/Cas는 RNA 가이드를 통한 유전자 교정 도구로, 박테리아 유도 엔도뉴클레아제 Cas9 (또는 돌연변이 니케이즈)와 가이드 RNA를 사용하여, 가이드 RNA와 게놈 DNA 사이의 서열을 매칭시켜, 게놈 내 특정 위치에 이중 (또는 단일) 가닥 브레이크를 도입할 수 있다. CRISPR/Cas 매개 유전자 녹아웃은 RNA 간섭 매개 유전자 녹다운 (RNA interference-mediated gene knockdown) 보다 더 효율적인 것으로 예상되고, 유전자 기능을 연구하기 위한 유용한 실험 도구를 제공하고 있다.
포유동물 세포에서 CRISPR-Cas 시스템이 작동할 수 있다는 연구들이 보고되었고, 미생물의 적응면역에서 비롯된 유전자 편집 기술은 Cas9(CRISPR associated protein 9 : RNA-guided DNA endonuclease enzyme) 및 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)를 포함한다. 가이드 RNA는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 포함하며, Cas9에 결합하여 타겟 서열에 대한 염기 쌍결합을 통해 목적하는 게놈 서열로 안내하여, 이중나선절단 (Double strand break, DSB)이 생성된다. 타겟 서열을 정의하는 유일한 기준은 PAM (protospacer adjacent motif)의 존재 여부로, PAM(protospacer adjacent motif)은 이를 인식하는 Cas 단백질에 따라 서열이 다른 특징이 있으며, 예를 들어, S. pyogenes 유래의 Cas9은 5'-NGG-3'(N은 A, T, G, C 중 하나); S. thermophilus 유래의 Cas9은 5'-NNAGAAW-3'; C jejuni 유래의 Cas9은 5'-NNNNRYAC-3'로 알려져 있으며, 인간의 게놈 상에 상기 서열이 일정간격으로 배열되어 있기 때문에, 유전자 편집에 활용할 수 있다.
한편, CRISPR/Cas 시스템을 인간의 암 치료에 적용할 수 있음이 보고되고 있다 (Oncotarget. 2016 Mar 15;7(11):12305-17). 그러나, 이는 암의 유발과 상관성 있는 복수의 유전자 변이에 기초하여, 게놈 중 하나 이상의 부분을 수정 또는 절제하는 것이 암에 대한 강력한 치료를 제공할 가능성을 높일 수 있음을 제시하고 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 모든 암세포와 같은 유전자 변이된 세포에는 유전자 변이된 세포 고유의 INDEL 서열이 있고, 이를 바탕으로 제작된 절단인자 및 핵산절단효소를 이용하여 특정 DNA 부위에 DSB (double strand break)를 유도하고, 세포 내에 여러군데의 DNA DSB가 일어나면 유전자 변이된 세포가 사멸될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 핵산절단효소 및 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 및 절단인자를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 및 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 핵산절단효소 및 절단인자를 이용하여 암 치료방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 핵산절단효소 및 암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 유전자 변이된 세포에 처리하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS (whole genome sequenceing)를 수행하는 단계;
유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS를 비교하여 유전자 변이된 세포 특이적인 변이 서열을 선별하는 단계;
상기 선별된 변이 서열을 인식하는 절단인자를 제조하는 단계;
상기 절단인자와 핵산절단효소를 결합하는 단계; 및
핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 유전자 변이된 세포에 인가하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS (whole genome sequenceing)를 수행하는 단계;
유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS를 비교하여 유전자 변이된 세포 특이적인 indel을 선별하는 단계;
상기 선별된 indel을 인식하는 절단인자를 제조하는 단계;
상기 절단인자와 핵산절단효소를 결합하는 단계; 및
핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 유전자 변이된 세포에 인가하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 핵산절단효소 및 암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 핵산절단효소 및 암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 암 세포에 처리하는 것을 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 핵산절단효소 및 환자의 암세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 환자 맞춤형 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 환자의 암세포에서 암세포 특이적인 indel을 선별하고, 이를 인식하는 절단인자를 제조하여 핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 환자에 전달하는 것을 포함하는 환자 맞춤형 암의 치료방법에 관한 것이다.
도 1은 DNA DSB (double strand break)가 동시 다발적으로 발생하였을 시 세포가 사멸되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 가이드 RNA를 이용하여 CRIPSR 시스템에 의한 DNA의 절단이 이루어지는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 대장암과 골육종세포에 30개의 특위적 RNP (ribonucleotide protein) 복합체 (complex)를 형질감염 (transfection)하여 DNA DSB를 유도한 후 세포의 생장률을 콜로니 형성 어세이 (colony forming assay)를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 면역형광 (immunofluorescence) 및 유세포분석 (flow cytometry)을 이용하여, AAV의 세포 감염율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 면역형광법을 통해 AAV 입자가 형질감염되었음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 30개의 U2OS 세포주 특이적 crRNA를 사용하여 U2OS 특이적 crRNA 의존성 세포사멸 결과를 확인한 것이다.
도 7은 U2OS 세포 특이적 saCAS9 AAV 시스템 작동 여부, U2OS 세포에서 세포사멸 결과를 확인한 것이다.
도 8은 암 특이적 INDEL에 의한 세포사멸 기반 세포생존 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 AAV 의존성 세포사멸이 crRNA 특이적 세포주에서만 유도되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 교모세포종에서 선택적 암세포 사멸이 일어나는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 ATM 카이네이즈 억제제를 포함하거나 포함하지 않는 AAV 입자를 사용하는 경우 세포사멸 효과 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 폐암 특이적 INDEL 유도 세포사멸 (CINDELA) 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 핵산절단효소 및 암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 유전자 변이된 세포에 처리하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도 방법에 관한 것이다.
상기 유전자 변이된 세포는 유전자 변형에 의해 세포의 활성이 정상세포와 다르게 된 세포를 의미하고, 예를 들어 유전자 변이에 의한 질환 발병 상태의 세포, 구체적으로 암세포를 의미할 수 있다.
상기 암은 예를 들어, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 골육종, 담관암 또는 표피암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
모든 암세포에는 정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되며, 각 암세포마다 특이적으로 삽입/결실된 DNA 서열이 존재할 수 있다.
세포는 DNA 이중나선이 절단되면, 이를 복구하려는 DNA 손상 복구 기작이 있다. 그러나, 이러한 손상 복구 기작은 DNA 이중나선 절단의 수가 적은 경우 효과적으로 복구하나, 그 수가 많아지면 사멸하게 된다. 박테리아의 경우 한 개의 DNA 이중나선 절단으로 박테리아가 사멸될 수 있으나, 동물 세포의 경우 그보다 많은 DSB가 필요하다고 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 위 사실을 기초로 유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포의 InDel을 찾아내어 이를 인식할 수 있는 절단인자를 제작하고, 핵산절단효소를 이용하여 유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포 등을 특이적으로 사멸하도록 유도할 수 있다.
이러한 DNA 이중나선 절단의 수단인 핵산절단효소는 제한효소 (restriction enzyme), ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), Cas6, C2c12 또는 C2c2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus: Streptococcus pyogenes), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus: Staphylococcus aureus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 단순 분리된 것 또는 재조합된 것일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS (whole genome sequenceing)을 수행하는 단계; 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS를 비교하여 유전자 변이된 세포 특이적인 변이 서열을 선별하는 단계; 상기 선별된 변이 서열을 인식하는 절단인자를 제조하는 단계; 상기 절단인자와 핵산절단효소를 결합하는 단계; 및 핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 유전자 변이된 세포에 인가하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포와 정상세포의 WGS (whole genome sequenceing)을 수행하는 단계; 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS를 비교하여 유전자 변이된 세포 특이적인 indel을 선별하는 단계; 상기 선별된 indel을 인식하는 절단인자를 제조하는 단계; 상기 절단인자와 핵산절단효소를 결합하는 단계; 및 핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 유전자 변이된 세포에 인가하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법에 관한 것이다.
InDel의 매핑은 WGS (whole genome sequencing), 또는 차감 혼성화 (subtractive hybridization) 및 시퀀싱의 방법을 통하여 수행될 수 있고, 이 때 도출된 InDel의 경우 암에서 발견된 삽입의 경우에는 바로 가이드 RNA를 제작하고, 결실의 경우에는 절단 지점 (break point)을 매핑한 후에 절단 지점을 포함하는 가이드 RNA를 제작하여 사용할 수 있다.
WGS는 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing)에 의한 전장 유전체 시퀀싱을 10 X, 20 X, 40 X 형식으로 여러 배수로 유전체를 읽는 방법을 의미한다. "차세대 시퀀싱"은 칩 (Chip) 기반, 그리고 PCR 기반 페어드 엔드 (paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응 (hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다.
차감 혼성화는 여러 조직 또는 세포 간에 발현의 차이가 있는 유전자의 클로닝에 이용되는 방법이다. 시험하는 세포의 DNA 시료 특이적 유전자가 검출될 수 있다. 시험하는 세포의 DNA를 한 가닥 DNA로 변성시킨 후에 어닐링(annealing)시킨다. 어닐링 조건을 조절함으로써, 시험하는 세포 특이적 DNA 서열을 2 가닥 DNA로 분리할 수 있다.
유전자 변이된 세포의 한 종류인 암 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 예를 들어, InDel을 타겟으로 하여 핵산절단효소에 의해 핵산 서열 내 DNA의 DSB가 일어나는 유전자 부위를 의미하는 것으로, 핵산 서열 내 핵산절단효소가 특이적으로 인식하는 서열 예를 들어 핵산절단효소가 Cas9인 경우 Cas9 단백질이 인식하는 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 약 17bp 내지 23bp 길이의 핵산 서열을 의미할 수 있다.
유전자 변이된 세포인, 암 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 해당 서열 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때, 실제로 가이드 RNA가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥이므로, 상기 가이드 RNA에 포함된 표적화 서열은, RNA 특성상 T를 U로 변경하는 것을 제외하고, InDel을 포함하는 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 갖게 된다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NNAGAAW-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5’-NNGRRT-3' (N은 A, T, G, 또는 C이고, R은 A 또는 G)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5’-NNGRRT-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNRYAC-3' (N은 A, T, G, 또는 C이고, R은 A 또는 G 이고, Y는 C 또는 T임)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NNNNRYAC-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
본 발명에서 절단인자란, 정상세포와 비교하여 유전자 변이된 세포의 핵산서열 중에서 변이되어 달라진 부분을 인식하여 절단할 수 있도록 하는 염기서열을 말한다.
본 발명에서 상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 숫자여야 하고, 바람직하게는 1개 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10개 내지 30개, 더욱 바람직하게는 16개 내지 30개일 수 있으나, 세포의 종류나 절단인자에 따라 숫자가 달라질 수 있다.
유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어 가이드 RNA일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 PAM 서열이 위치하는 DNA 가닥의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 결합 가능하다.
상기 가이드 RNA는 다음과 같은 단계를 통해 제작할 수 있다: 암 세포와 일반 세포의 WGS 결과 데이터를 비교하여 암세포 특이적인 InDel을 찾는다. 이를 바탕으로 가이드 RNA 제작 조건에 충족한 암 세포 특이적인 가이드 RNA를 설계한다. 그 후 InDel 사이트의 길이를 고려하여 임의적 순위를 부여하고 모든 염색체(chromosome)에 골고루 가이드 RNA가 설계될 수 있도록 하여 최종 가이드 RNA 조합을 완성한다.
가이드 RNA 제작 조건은 다음과 같다. (a) PAM 사이트를 제외한 가이드 RNA의 염기 서열 길이는 20염기쌍(base pair)이다. (b) 가이드 RNA에 존재하는 구아닌(guanine) 과 시토신 (cytosine)의 합 비율이 40%에서 60% 사이이다. (c) InDel이 PAM 사이트 근처 바로 앞 영역에 존재한다. (d) 최대 단일 중합체 (homopolymer) 길이가 4염기쌍(base pair) 이하이다. (e) 일반 세포의 WGS 결과 데이터에 하나의 불일치(mismatch)를 허용하는 매핑 했을 때, 매핑 결과가 없어야 한다.
이를 바탕으로 제작된 상기 가이드 RNA는 예를 들어, 서열번호 1 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 암세포 사멸을 유도할 수 있는 가이드 RNA의 수는 구체적으로 약 1 내지 40여개, 약 15 내지 25개, 또는 약 10 내지 20개일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, 서열번호 1 내지 30으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 31 내지 60으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 61 내지 90으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 91 내지 120으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 대장암이고, 대장암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 1 내지 30의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 골육종이고, 골육종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어, 서열번호 31 내지 60의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA 또는 서열번호 91 내지 120의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 정상세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 61 내지 90의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 교모세포종이고, 교모세포종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어, 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 폐암이고, 폐암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어, 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 대장암 세포주인 HCT116, 골육종 세포주인 U2OS, 교모세포종 세포주인 GBL-67, 폐암 조직 및 정상 세포를 immortalization 한 세포주 REP1 세포 각각에서 암 특이적 InDel을 확인하고, 이를 특이적으로 인식하는 가이드 RNA를 제작하여 DNA DSB를 유도한 후 세포 생장을 확인하였다. 구체적으로 대장암 세포주인 HCT116의 InDel을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 30의 서열을 포함하고, 골육종 세포주인 U2OS의 InDel을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 서열번호 31 내지 60 또는 서열번호 91 내지 120의 서열을 포함하며, 교모세포종인 Glioblastoma의 InDel을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하고, 폐암 조직의 InDel을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하며, 정상 세포주인 REP1의 InDel을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 서열번호 61 내지 90의 서열을 포함한다.
세포주 특이적인 InDel 을 전장유전체 해독(WGS)을 통해 확인한 이후, 해당 영역을 강하게 결합하는 PAM 사이트 영역에 포함하도록 가이드 RNA를 설계한다. 설계된 가이드 RNA는 정상을 대표하는 인간 표준 유전체에 확인하여 비특이적 반응이 없음을 확인한다. 그 이후 InDel 사이트의 길이를 고려하여 임의적 순위를 부여하고 이를 바탕으로 모든 염색체(chromosome)에 골고로 가이드 RNA 가 설계될 수 있도록 하여 최종 가이드 RNA 조합을 완성한다. 현재 실시예에서 30개의 가이드 RNA를 사용하였으나 이 숫자는 암세포의 종류 및 DSB를 일으키는 실험 방법에 따라 조정 가능하다.
본 발명에 따른 핵산절단효소 및 절단인자 예를 들어, 가이드 RNA는 (a) 하나 이상의 가이드 RNA 및 핵산절단효소 예를 들어 Cas 단백질을 발현하는 핵산서열을 포함하는 벡터, (b) 하나 이상의 가이드 RNA 및 핵산절단효소 예를 들어 Cas 단백질로 구성된 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 또는 RGEN(RNA-guided engineered nuclease), 또는 (c) 하나 이상의 가이드 RNA 및 핵산절단효소 예를 들어 Cas 단백질로 코딩되는 mRNA의 구성으로 세포 내에 전달될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 실시예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련 (adenoassociated) 바이러스 (AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스 (orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스 (rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이 (Sendai), 알파바이러스 (alphavirus) 및 피코르나바이러스 (picornavirus))와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 폭스바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 또는 카나리아두창(canarypox)) 등일 수 있다.
상기 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
경우에 따라서, DNA 이중나선절단을 통해 세포 사멸 효율을 높이고자 DNA 이중나선 복구를 저해하도록 예를 들어, Caffeine, Wortmannin, CP-466722, KU-55933, KU-60019, KU-559403으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATM (Ataxia telangiectasia mutated) 저해제, Schisandrin B, NU6027, NVP-BEZ235, VE-821, VE-822 (VX-970), AZ20, AZD6738로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATR (Ataxia telangiectasia and Rad-3 mutated) 저해제, 또는 DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)의 DNA 이중나선 복구 저해제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산절단효소 및 암 세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산절단효소 및 암 세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따르면 환자의 암세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자 및 핵산절단효소를 포함하는 환자 맞춤형 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
환자 맞춤형은 환자 고유의 특성 또는 환자의 질병 특성을 충분히 반영하여, 효과적으로 암을 치료할 수 있음을 의미한다. 환자 맞춤형 암 치료용 조성물을 통해 치료제의 선별 및 치료 방법의 선택 등에 유용하게 사용할 수 있다.
상기 유전자 변이된 세포는 유전자 변형에 의해 세포의 활성이 정상세포와 다르게 된 세포를 의미하고, 예를 들어 유전자 변이에 의한 질환 발병 상태의 세포, 구체적으로 암세포를 의미할 수 있다.
상기 암은 예를 들어, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 골육종, 담관암 또는 표피암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
모든 암세포에는 정상세포에서 발견되지 않는 새로운 DNA 서열이 삽입되거나 (Insertion: IN), 정상세포의 DNA 일부가 잘려지는 (Deletion: Del) 현상이 다수 관찰되며, 각 암세포마다 특이적으로 삽입/결실된 DNA 서열이 존재할 수 있다.
세포는 DNA 이중나선이 절단되면, 이를 복구하려는 DNA 손상 복구 기작이 있다. 그러나, 이러한 손상 복구 기작은 DNA 이중나선 절단의 수가 적은 경우 효과적으로 복구하나, 그 수가 많아지면 사멸하게 된다. 박테리아의 경우 한 개의 DNA 이중나선 절단으로 박테리아가 사멸될 수 있으나, 동물 세포의 경우 그보다 많은 DSB가 필요하다고 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 위 사실을 기초로 유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포의 InDel을 찾아내어 이를 인식할 수 있는 절단인자를 제작하고, 핵산절단효소를 이용하여 유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포 등을 특이적으로 사멸하도록 유도할 수 있다.
이러한 DNA 이중나선 절단의 수단인 핵산절단효소는 제한효소 (restriction enzyme), ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), Cas6, C2c12 또는 C2c2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus: Streptococcus pyogenes), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus: Staphylococcus aureus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 단순 분리된 것 또는 재조합된 것일 수 있다.
유전자 변이된 세포의 한 종류인 암 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 예를 들어, InDel을 타겟으로 하여 핵산절단효소에 의해 핵산 서열 내 DNA의 DSB가 일어나는 유전자 부위를 의미하는 것으로, 핵산 서열 내 핵산절단효소가 특이적으로 인식하는 서열 예를 들어 핵산절단효소가 Cas9인 경우 Cas9 단백질이 인식하는 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 약 17bp 내지 23bp 길이의 핵산 서열을 의미할 수 있다.
유전자 변이된 세포인, 암 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 해당 서열 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때, 실제로 가이드 RNA가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥이므로, 상기 가이드 RNA에 포함된 표적화 서열은, RNA 특성상 T를 U로 변경하는 것을 제외하고, InDel을 포함하는 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 갖게 된다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NGG-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNAGAAW-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NNAGAAW-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5’-NNGRRT-3' (N은 A, T, G, 또는 C이고, R은 A 또는 G)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5’-NNGRRT-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
상기 Cas9 단백질이 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 것인 경우, 상기 PAM 서열은 5'-NNNNRYAC-3' (N은 A, T, G, 또는 C이고, R은 A 또는 G 이고, Y는 C 또는 T임)이고, 유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열은 서열 내 5'-NNNNRYAC-3' 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 유전자 부위로서, 예컨대, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위일 수 있다.
본 발명에서 절단인자란, 정상세포와 비교하여 유전자 변이된 세포의 핵산서열 중에서 변이되어 달라진 부분을 인식하여 절단할 수 있도록 하는 염기서열을 말한다.
본 발명에서 상기 절단인자는 정상세포의 염기서열과 비교하여 세포의 사멸을 유도할 수 있는 충분한 숫자여야 하고, 바람직하게는 1개 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10개 내지 30개, 더욱 바람직하게는 16개 내지 30개일 수 있으나, 세포의 종류나 절단인자에 따라 숫자가 달라질 수 있다.
유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어 가이드 RNA일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
유전자 변이된 세포 고유의 InDel을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 가이드 RNA는 PAM 서열이 위치하는 DNA 가닥의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 결합 가능하다.
상기 가이드 RNA는 다음과 같은 단계를 통해 제작할 수 있다: 암 세포와 일반 세포의 WGS 결과 데이터를 비교하여 암세포 특이적인 InDel을 찾는다. 이를 바탕으로 가이드 RNA 제작 조건에 충족한 암 세포 특이적인 가이드 RNA를 설계한다. 그 후 InDel 사이트의 길이를 고려하여 임의적 순위를 부여하고 모든 염색체(chromosome)에 골고루 가이드 RNA가 설계될 수 있도록 하여 최종 가이드 RNA 조합을 완성한다.
가이드 RNA 제작 조건은 다음과 같다. (a) PAM 사이트를 제외한 가이드 RNA의 염기 서열 길이는 20염기쌍(base pair)이다. (b) 가이드 RNA에 존재하는 구아닌(guanine) 과 시토신 (cytosine)의 합 비율이 40%에서 60% 사이이다. (c) InDel이 PAM 사이트 근처 바로 앞 영역에 존재한다. (d) 최대 단일 중합체 (homopolymer) 길이가 4염기쌍(base pair) 이하이다. (e) 일반 세포의 WGS 결과 데이터에 하나의 불일치(mismatch)를 허용하는 매핑 했을 때, 매핑 결과가 없어야 한다.
이를 바탕으로 제작된 상기 가이드 RNA는 예를 들어, 서열번호 1 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 암세포 사멸을 유도할 수 있는 가이드 RNA의 수는 구체적으로 약 1 내지 40여개, 약 15 내지 25개, 또는 약 10 내지 20개일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, 서열번호 1 내지 30으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 31 내지 60으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 61 내지 90으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 91 내지 120으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 서열, 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 대장암이고, 대장암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 1 내지 30의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 골육종이고, 골육종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어, 서열번호 31 내지 60의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA 또는 서열번호 91 내지 120의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 정상세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 61 내지 90의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 교모세포종이고, 교모세포종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어, 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암은 폐암이고, 폐암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 예를 들어, 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산절단효소 및 절단인자 예를 들어, 가이드 RNA는 (a) 하나 이상의 가이드 RNA 및 핵산절단효소 예를 들어 Cas 단백질을 발현하는 핵산서열을 포함하는 벡터, (b) 하나 이상의 가이드 RNA 및 핵산절단효소 예를 들어 Cas 단백질로 구성된 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein, RNP) 또는 RGEN(RNA-guided engineered nuclease), 또는 (c) 하나 이상의 가이드 RNA 및 핵산절단효소 예를 들어 Cas 단백질로 코딩되는 mRNA의 구성으로 세포 내에 전달될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 실시예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스 (예컨대, 아데노관련 (adenoassociated) 바이러스 (AAV)), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스 (orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스 (rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이 (Sendai), 알파바이러스 (alphavirus) 및 피코르나바이러스 (picornavirus))와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 폭스바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 또는 카나리아두창(canarypox)) 등일 수 있다.
상기 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
경우에 따라서, DNA 이중나선절단을 통해 세포 사멸 효율을 높이고자 DNA 이중나선 복구를 저해하도록 예를 들어, Caffeine, Wortmannin, CP-466722, KU-55933, KU-60019, KU-559403으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATM (Ataxia telangiectasia mutated) 저해제, Schisandrin B, NU6027, NVP-BEZ235, VE-821, VE-822 (VX-970), AZ20, AZD6738로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATR (Ataxia telangiectasia and Rad-3 mutated) 저해제, 또는 DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)의 DNA 이중나선 복구 저해제를 추가로 포함할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따르면 환자의 암세포에서 암세포 특이적인 indel을 선별하고, 이를 인식하는 절단인자를 제조하여 핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 환자에 전달하는 것을 포함하는 환자 맞춤형 암의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도는 이를 필요로 하는 대상체에 충분량 또는 유효량으로 투여될 수 있다. '유효량' 또는 '충분량'은 단일 또는 다중 용량으로 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료용 조성물, 프로토콜, 또는 치료 요법과 조합되어 임의의 기간 동안 대상체에 이로움을 주거나 대상체에 예상되거나 요망되는 결과를 제공하는 양을 나타낸다. 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 예를 들어, 암 세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자의 발현 카세트를 포함하는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 벡터가 전달을 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 바이러스 벡터인 AAV (Adeno-associated virus) 벡터가 전달을 위해 사용될 수 있다.
치료학적 효과를 달성하기 위한 AAV 벡터 용량은 벡터 유전체 용량/체중kg(vg/kg)로 제공될 수 있으나, (a) 투여 경로, (b) 치료학적 효과를 달성하는데 요구되는 치료 유전자의 발현 수준, (c) AAV 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, (d) 발현된 단백질의 안정도와 같은 요건에 따라 변동될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. DSB에 따른 세포사멸 효과 확인
수 개의 DSB가 세포사멸을 유도할 수 있고, 모든 암세포는 고유의 In/Del 서열을 가지는 것을 바탕으로, HCT116, U2OS, 및 REP1 세포에서 고유의 In/Del 서열을 WGS (whole genome sequencing)를 통해 확인하였다. 이후 다음 표 1 내지 표 3과 같이 암세포가 가지고 있는 고유의 DNA 삽입 (insertion) 서열들 중 에 6~8bpdml 삽입 크기로 염색체 상에 고루 퍼져있는 부위를 30개 선정하여 세포주별 crRNA를 제작하였고, CRISPR RNP 복합체로 세포로 형질감염시킨 다음 crRNA 특이성 및 세포 생존도를 확인하였다.
Figure PCTKR2019011866-appb-T000001
Figure PCTKR2019011866-appb-I000001
Figure PCTKR2019011866-appb-T000002
Figure PCTKR2019011866-appb-I000002
Figure PCTKR2019011866-appb-T000003
Figure PCTKR2019011866-appb-I000003
먼저 DNA DSB가 동시 다발적으로 발생하였을시 세포가 사멸되는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. AsiSI 제한효소에 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor)의 도메인을 삽입하여 만든 세포에 4-OHT (tamoxifen)을 처리하였을 때 세포의 사멸을 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
AsiSI 제한효소는 4-OHT을 처리하게 되면 핵 안으로 들어가 특정 서열을 인식하여 DNA DSB (double strand break)를 만들며, 대략 100개의 DSB가 만들어지게 된다. DSB의 생성에 따른 세포 생존률을 콜로니 형성 어세이 (colony forming assay)를 통하여 확인하였다. 200개의 세포를 시딩 (seeding)한 후 2일 뒤부터 4-OHT를 주기적으로 처리(2-3일에 한번씩 배양 배지에 처리)하여 DSBs를 만들어주고 2주 뒤에 콜로니가 형성되는지를 메틸렌 블루 염색 (methylene blue staining)을 통해 확인하였다. 또한, 세포마다 콜로니의 크기가 다르기 때문에 염색한 샘플들을 탈염색 (destain)하여 상대적 세포 생존도(relative cell survival)도 확인했을 때 염색시 확인한 결과와 유사한 것을 알 수 있었다.
실시예 2. CRISPR system의 in vitro 작동 여부 확인
실시예 1에서 제작된 crRNA를 이용하여 CRISPR 시스템이 작동하는지 여부를 알아보기 위하여 in vitro 절단 어세이(cleavage assay)를 수행하였다. 먼저 PCR을 통하여 삽입 서열 (insertion sequence)의 앞뒤 부분의 DNA를 500bp 크기로 증폭하고 정제 후, 제작된 crRNA를 이용하여 CRIPSR 시스템에 의한 DNA의 절단이 이루어 지는지 확인하였다.
RPE1, U2OS, HCT116 세포들에서 genomic DNA를 Qiamp DNA　mini kit를 이용하여 추출하였으며 guide RNA를 중심으로 약 500bp 길이가 되도록 하는 양방향의 primer를 주문제작 하였다. iProof High-Fidelity DNA polymerase를 이용하여 annealing 온도를 맞추어 genomic DNA를 증폭한 후 1% agarose gel에서 증폭된 DNA를 절단 한 후 Qiagen QiAquick gel extraction kit를 이용하여 extraction을 시행하였다.
10uM crRNA와 tracerRNA complex를 만들기 위해 95℃ 5분간 둔 후 상온에서 열이 증발될 때까지 기다린다. 그 후 RNP complex를 생성하기 위해 crRNA:tracerRNA complex와 Cas9 Nuclease를 1uM 농도로 PBS를 이용하여 맞춘 후 상온에서 10분간 incubation 한다.
10X Cas9 Nuclease Reaction Buffer(200mM HEPES, 1M Nacl, 50mM　Mgcl(2), 1mM EDTA pH 6.5), 1uM　Cas9 RNP, 100nM DNA substrate, Nuclease-Free Water를 혼합하여 37℃ 3시간 동안 digestion reaction을 한다. 세 시간후 Cas9 endonulcease로부터 DNA substrate를 release하기 위해 20mg/ml Proteinase K 1ul 첨가 후 56℃ 10분간 incubation 한다. cleaved된 genomic DNA를 1% agarose gel에서 확인하였다.
Figure PCTKR2019011866-appb-T000004
Figure PCTKR2019011866-appb-T000005
Figure PCTKR2019011866-appb-T000006
그 결과를 도 2에 나타내었으며, 아가로스 겔상에서 원래의 500bp 크기와 300bp 크기의 두 DNA 절편이 확인되었다. 이를 통하여, 제작된 crRNA를 이용한 CRISPR 시스템이 잘 작동되고 있음을 확인하였다.
실시예 3. DNA DSB 유도 후 세포의 생장률 확인
대장암 HCT116 세포와 골육종 U2OS 세포에 30개의 특위적 RNP (ribonucleotide protein) 복합체를 형질감염하여 DNA DSB를 유도한 후 세포의 생장률을 콜로니 형성 어세이 (colony forming assay)를 통하여 확인하였다.
각각 500개와 1000개의 세포를 분주한 후 세포주별 특이적 RNP 복합체를 형질감염하였다. U2OS 세포들은 60mm 디시에 1000개, HCT 116 세포들은 500개 분주한 후 이틀 동안 안정화시킨 후 guide RNA 형질전환할 준비를 한다. 1uM crRNA와 1uM tracerRNA 복합체를 만들기 위해 95℃ 5분간 둔 후 상온에서 열이 증발될 때까지 기다린다. 그 후 RNP 복합체를 생성하기 위해 96well 디시에 1uM crRNA:tracerRNA 복합체 1.5ul와 1uM Cas9 Nuclease 1.5ul, Opti-MEM　media 22ul를 상온에서 5분간 반응한다. 25ul volume의 RNP 복합체 30개와 RNAimax transfection reagent 1.2ul의 30배, Opti-MEM 배지 23.8ul 30배로 총 볼륨 1.5ml를 20분간 상온에서 두어 형질전환 복합체를 만든다. 또한, 세포주별 특위적 crRNA를 이용한 DSB의 유도가 다른 세포주에서는 야기되지 않는다는 것을 확인하기 위하여 대장암세포에 골육종세포 고유의 RNP 복합체를 형질감염하였고 마찬가지로 골육종세포에 대장암 고유의 RNP 복합체를 형질감염하였다. 이때 세포내의 DSB 복구 시스템 (DSB repair system)을 억제하기 위하여 ATM 저해제 (inhibitor)인 2uM KU 55933을 함께 처리하였다. 이후 세포의 생장을 관찰하며 3일마다 배지를 바꾸어주며 ATM 저해제를 함께 처리해 주었다. 2주 후 메틸렌 블루 (methylene blue) 염색을 통하여 세포의 생장을 확인하였다. Stain된 colony들은 Imaje J 프로그램을 통하여 colony 개수와 area를 서로 비교하여 결과를 정리한다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 각각의 세포주에 고유한 RNP 복합체를 형질감염한 실험군에서는 DSB에 의해 세포가 거의 사멸한 것을 확인할 수 있었고, 특이적 RNP 복합체는 다른 세포주에서는 DSB를 야기하지 않아 세포가 계속해서 생장하는 것을 확인하였다.
다만 골육종에서는 대장암 특위적 RNP 복합체를 형질감염하였을 때 세포의 생장이 어느 정도 저해되는 현상이 보였다. 이는 많은 양의(30개) 형질감염에 의해 세포의 성장이 저해된 것으로 고려된다. 이를 보완하고 세포사멸을 위한 최소한의 RNP 복합체를 정하기 위하여 HCT116 및 U2OS gRNA를 RPE1 세포에 형질감염시켜 crRNA 특이도를 확인할 것이고, 최소 gRNA 수를 각 암세포당 20개 정도로 적정화시킬 것이다.
실시예 4. 암 특이적 INDEL에 의한 세포사멸 (Cancer specific INsertion-DELetions induced Apoptosis: CINDELA) 효과 확인
WGS (whole genome sequencing)를 통해, saCas9에 대한 신규한 U2OS 세포주 특이적 crRNA를 설계하여 AAV에 패키징하였다. U2OS 세포주 특이적 crRNA의 구체적 서열은 다음과 같다.
Figure PCTKR2019011866-appb-T000007
Figure PCTKR2019011866-appb-I000004
면역형광 (immunofluorescence) 및 유세포분석 (flow cytometry)을 이용하여, AAV의 세포 감염율을 측정하였다. HA 세포내 염색은 60mm dish에 0.1M 세포를 포함하고 (0 day), HA 포함하지 않거나, 0.25ml, 0.5ml, 1ml HA를 포함하여 AAV를 감염시키고 (2day), 세포를 수확한 다음 염색하였다 (3day). HA (1:300)는 2시간 실온 조건, 마우스 488 (1:500)은 1시간 실온 조건에서 두고, Rnase A 37℃ 30min 조건, PI 실온 10min 조건에 두었다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 핵 HA 태그 양성 세포의 비율은 1일차에 약 80% 정도로 나타났고, 비율은 2일 및 3일차에 부가적으로 감소하였다.
8 * 104 U2OS 세포 웰을 챔버 슬라이드에 파종하여 하룻밤 성장시켰다. 세포를 차가운 PBS (ice-cold PBS)로 2회 세척하였다. 1ml의 차가운 투과 용액 (CSK 버퍼 + 0.5 % Triton X-100)를 10 분간 적용하였다. 세포를 1ml의 차가운 PBS로 2회 세척 하였다. PBS에 4 % paraformaldehyde 500μl를 사용하여 실온에서 15 분간 세포를 고정하였다.
정착액을 제거하고, 1ml의 100 % 메탄올을 첨가한 다음, -20℃ 10 분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 1ml PBS로 2회 세척하였다.
PBS에 10% FBS 500μl로 30분간 차단하고, 차단 용액을 제거한 다음 적절한 1차 항체를 1 시간 동안 차단 용액에 추가하였다. 세포를 PBS 중 0.05 % Triton X-100으로 5 분간 3 회 세척하였다. 암조건에서 실온 30 분간 2차 항체를 가한 후, PBS에 0.05% Triton X-100 세포를 5 분간 3 회 세척하고 PBS 및 DW에 추가 세척 공정을 실시했다. 주위의 챔버는 슬라이드에서 제거하였다.
마운팅 시약 (mounting reagent)을 한방울씩 각 샘플에 도포하고, 커버 유리로 덮었다. 그 상태로 건조하고, 슬라이드를 완전히 밀폐하였다. LSM 880 (ZEISS) 및 ZEN 소프트웨어 (ZEISS)를 사용하여 초점을 감지하고 시각화하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 면역형광법을 통해 AAV 입자가 충분히 형질감염되었고, 표 7의 crRNA는 DNA DSB에 해당하는 rH2AX 포커스를 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
30개의 U2OS 세포주 특이적 crRNA를 사용하여, saCAS9 AAV 시스템을 개발하였고, AAV 입자를 U2OS 세포에 형질도입하였다. 8 * 104 U2OS 세포를 6 웰 플레이트에 플레이팅하고 하룻밤 인큐베이션하여, 9 * 109 AAV 입자가 세포에 각각 형질도입되었다. 도 6에 따르면, 24 시간 후 EVOS 세포 이미징 시스템을 통해 U2OS 특이적 crRNA 의존성 세포사멸이 관찰되었다. 그러나, 비특이적 crRNA, HCT116 세포 특이적 crRNA는 세포사멸을 유도할 수 없었다. 도 6의 결과로부터, AAV 시스템에 의해 세포주 특이적인 선택적 세포사멸이 유도될 수 있음이 확인되었다.
정상세포인 RPE1 세포주에서도 세포주 특이적인 선택적 세포사멸이 있는지 확인하였다. 도 7에 따르면, 실시예 2에서와 마찬가지로, U2OS 세포 특이적 saCAS9 AAV 시스템은 작동하고, U2OS 세포에서 세포사멸을 유도할 수 있으나, RPE1 세포에서 U2OS 세포주 특이적 AAV 시스템에 의해 유도되는 세포사멸은 없었다.
암 특이적 INDEL에 의한 세포사멸 (Cancer specific INsertion-DELetions induced Apoptosis: CINDELA)에 의한 세포생존 (cell viability) 비율을 측정하였다. 72시간 후, AAV 입자가 형질도입된 세포를 실온에서 10 분간 1% 메틸렌블루로 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 10 분간 세척하고 실온에서 건조시켰다. 세포를 500ul의 10 % 아세트산 용액으로 탈색하고 OD값을 측정하였다. 암세포 세포생존율(cell viability)에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
유세포분석을 통해 세포생존율을 시간 의존적 방식으로 측정하였다. U2OS 및 RPE1 세포 모두에 U2OS 세포 특이적 crRNA AAV 입자를 형질도입하였다. 아자이드 (azide)를 포함하지 않는 abd 혈청 / 단백질을 포함하지 않는 PBS를 이용하여 세포를 1 * 106 / ml로 재현탁하였다. 1ml 세포 당 1ul pf FVD를 넣고 즉시 볼텍싱하였다. 4℃에서 30 분간 인큐베이션하고, 광을 차단하였다. PBS로 세포를 2회 세척하고, FACS VERSE (BD Inc.) 기계를 확인하였다. 도 9에 따르면, AAV 의존성 세포사멸은 crRNA 특이적 세포주에서만 유도되는 것으로 확인되었다.
실시예 5. 교모세포종 특이적 INDEL에 의한 세포사멸 효과 확인
환자 유래 교모세포종에서 INDEL에 의한 세포사멸 효과를 확인하였다. 세포를 저산소 챔버에서 배양한 것을 제외하고는 실시예 4과 동일한 방법으로 실험하였다. 교모세포종에 사용할 수 있는 서열은 16개 뿐이었다. 16개의 교모세포종 특이적 서열을 통한 선택적 세포사멸을 확인한다는 것은 16개 DNA DSB만을 생성시킬 수 있음을 의미한다.
Figure PCTKR2019011866-appb-T000008
16개의 교모세포종 특이적 서열에 대한 연속적 형질도입을 수행하였다. NSC-10 세포를 정상 대조군으로 사용하였다. 도 10에 따르면, 교모세포종에서 선택적 암세포 사멸이 일어났음을 확인할 수 있다.
실시예 6. ATM kinase 포함에 따른 세포사멸 효과
ATM 카이네이즈 억제제를 포함하거나 포함하지 않는 AAV 입자를 실시예 5의 교모세포종 세포에 형질도입하였고, 실시예 4 및 실시예 5와 동일한 방법으로 실험하였다. 24시간의 형질도입 후, 세포를 실온에서 10분간 1% 메틸렌 블루로 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 10분간 세척하고 실온에서 건조시켰다. 세포를 500ul의 10 % 아세트산 용액으로 탈색하고 OD를 측정하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.
실시예 7. 폐암 특이적 INDEL에 의한 세포사멸 효과 확인
암 특이적 INDEL 유도 세포사멸 (CINDELA) 효과를 확인하기 위해, 환자 유래의 폐암 조직을 마우스 이종이식에 사용하였다. 환자 유래의 폐암 조직을 마우스에 삽입하고 28개의 폐암 조직 특이적 crRNA을 포함하는 AAV 입자를 마우스에 연속적으로 주사하였다.
Figure PCTKR2019011866-appb-T000009
Figure PCTKR2019011866-appb-I000005
AAV 입자를 2일마다 주입하고 종양 크기를 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 따르면, 정상세포는 시간 의존적으로 성장하였으나, 암세포는 두 번째 AAV 주사 동안 성장하지 않았다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다
전자파일 첨부하였음.

Claims (47)

  1. 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도용 조성물.
  2. 핵산절단효소 및 암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 암 치료용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산절단효소는 제한효소 (restriction enzyme), ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas6, C2c12 또는 C2c2인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 분리된 것 또는 재조합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 절단인자는 서열번호 1 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전자 변이된 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정상세포의 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 61 내지 90의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 암은 대장암이고, 대장암 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 1 내지 30의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 암은 골육종이고, 골육종 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 31 내지 60의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 암은 교모세포종이고, 교모세포종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제2항에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 폐암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 유전자 변이된 세포 고유의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 핵산 서열 부위에 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 유도하여 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 벡터를 이용하여 절단인자를 도입하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터는 AAV인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 유전자 변이된 세포에 처리하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도 방법.
  17. 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS (whole genome sequenceing)을 수행하는 단계;
    유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS를 비교하여 유전자 변이된 세포 특이적인 변이 서열을 선별하는 단계;
    상기 선별된 변이 서열을 인식하는 절단인자를 제조하는 단계;
    상기 절단인자와 핵산절단효소를 결합하는 단계; 및
    핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 유전자 변이된 세포에 인가하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법.
  18. 유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS (whole genome sequenceing)을 수행하는 단계;
    유전자 변이된 세포와 정상세포의 WGS를 비교하여 유전자 변이된 세포 특이적인 indel을 선별하는 단계;
    상기 선별된 indel을 인식하는 절단인자를 제조하는 단계;
    상기 절단인자와 핵산절단효소를 결합하는 단계; 및
    핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 유전자 변이된 세포에 인가하는 단계를 포함하는 유전자 변이된 세포 사멸 유도방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 핵산절단효소는 제한효소 (restriction enzyme), ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas6, 또는 C2c2인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 단순 분리된 것 또는 재조합된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 절단인자는 서열번호 1 내지 163의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 유전자 변이된 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항 또는 제18항에 있어서, 정상세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 61 내지 90의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 암은 대장암이고, 대장암 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 1 내지 30의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 암은 골육종이고, 골육종 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 31 내지 60의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 암은 교모세포종이고, 교모세포종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 폐암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제17항 또는 제18항에 있어서, 유전자 변이된 세포 고유의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 핵산 서열 부위에 동시다발적 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 유도하여 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    Caffeine, Wortmannin, CP-466722, KU-55933, KU-60019, KU-559403으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATM (Ataxia telangiectasia mutated) 저해제,
    Schisandrin B, NU6027, NVP-BEZ235, VE-821, VE-822 (VX-970), AZ20, AZD6738로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 ATR (Ataxia telangiectasia and Rad-3 mutated) 저해제, 또는
    DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)의 DNA 이중나선 복구 저해제를 추가로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 변이 서열을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법.
  32. 핵산절단효소 및 유전자 변이된 세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 유전자 변이된 세포에 처리하는 것을 포함하는 암의 치료방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 벡터는 AAV (Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 핵산절단효소 및 환자의 암세포 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자를 포함하는 환자 맞춤형 암 치료용 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 핵산절단효소는 제한효소 (restriction enzyme), ZNFN (zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease) 또는 Cas 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas6, C2c12 또는 C2c2인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 분리된 것 또는 재조합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 상기 절단인자는 서열번호 1 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제34항에 있어서, 정상세포의 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 61 내지 90의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제34항에 있어서, 상기 암은 대장암이고, 대장암 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 1 내지 30의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제34항에 있어서, 상기 암은 골육종이고, 골육종 고유의 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 31 내지 60의 서열으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제34항에 있어서, 상기 암은 교모세포종이고, 교모세포종 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 121 내지 136으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제34항에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 폐암 특이적 삽입 (insertion) 및/또는 결실 (deletion)을 포함하는 핵산 서열을 특이적으로 인식하는 절단인자는 서열번호 137 내지 163로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 가이드 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제34항에 있어서, 상기 조성물은 유전자 변이된 세포 고유의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 핵산 서열 부위에 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 유도하여 세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제34항에 있어서, 벡터를 이용하여 절단인자를 도입하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 벡터는 AAV인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 환자의 암세포에서 암세포 특이적인 indel을 선별하고, 이를 인식하는 절단인자를 제조하여 핵산절단효소와 절단인자를 포함하는 조성물을 환자에 전달하는 것을 포함하는 환자 맞춤형 암의 치료방법.
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