WO2020059848A1 - レンチウイルスベクター産生の増強方法 - Google Patents

レンチウイルスベクター産生の増強方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020059848A1
WO2020059848A1 PCT/JP2019/036929 JP2019036929W WO2020059848A1 WO 2020059848 A1 WO2020059848 A1 WO 2020059848A1 JP 2019036929 W JP2019036929 W JP 2019036929W WO 2020059848 A1 WO2020059848 A1 WO 2020059848A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lentiviral vector
packaging
ltr
lentiviral
plasmids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/036929
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
昇司 山岡
尚人 鈴木
剛 芳田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Medical and Dental University NUC
Original Assignee
Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Medical and Dental University NUC filed Critical Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority to JP2020549114A priority Critical patent/JP7538531B2/ja
Priority to US17/277,618 priority patent/US20210348192A1/en
Priority to CN201980076169.6A priority patent/CN113166782A/zh
Priority to EP19863931.2A priority patent/EP3854879A4/en
Publication of WO2020059848A1 publication Critical patent/WO2020059848A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
    • C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing a lentiviral vector.
  • Lentiviral vectors derived from human immunodeficiency virus type 1 are valuable tools for transducing foreign genes into dividing and non-dividing cells, both in vitro and in vivo.
  • the safety and convenience of lentiviral vectors have been improved by various methods (Non-Patent Document 1).
  • VSV-G Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • CMV human cytomegalovirus
  • Non-Patent Document 4 This procedure is currently a major hindrance due to the high cost of vector preparation using large amounts of plasmid and cell culture materials and equipment for enrichment and purification.
  • Non-Patent Document 5 Increased viral vector production by blocking the intracellular innate immune response (Non-Patent Document 5) and stable expression of the immune response protein Siglec-9 increase lentiviral vector production by increasing transfection efficiency (Non-Patent Document 6).
  • Others have studied adding caffeine (Non-Patent Document 7) or sodium butyrate (Non-Patent Document 8) to the culture medium to increase the titer of lentiviral vectors. However, further improvements are needed to prepare high titer lentiviral vectors.
  • Lentiviral vectors are valuable tools for delivering foreign genes for stable expression in cells. Significant progress has been made in developing techniques for purifying lentiviral vectors from lentiviral vector-containing media. However, methods for increasing the production of lentiviral vectors from producer cells have not been sufficiently studied.
  • An object of the present invention is to provide a method for enhancing production of a lentiviral vector in 293T cells and a reagent for enhancing the method.
  • HTLV-1 Tax human T-cell leukemia virus type 1
  • CREB cAMP response element binding protein
  • ATF Activating transcription factor
  • NF- ⁇ B nuclear factor-B
  • AP-1 activator protein-1
  • the present invention for preparing a high-titer lentivirus vector has been completed by activating a promoter in a production cell.
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing a lentiviral vector comprising a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentiviral particles, and genes and expressions for transcribing RNA incorporated into lentiviral particles
  • the lentivirus vector production amount is increased by simultaneously expressing a factor that activates a promoter
  • a method for producing [2] The method for producing a lentiviral vector according to [1], wherein the promoter activating factor is a CMV promoter activating factor.
  • the promoter activating factor is one or more selected from the group consisting of HTLV-1 Tax, HIV-1 Tat, NF- ⁇ B RelA, AP-1 and CREB / ATF, [1] Or the method of [2].
  • a method for producing a lentiviral vector comprising a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentiviral particles, and genes and expressions for transcribing RNA incorporated into lentiviral particles When co-transfecting a 293T cell with a packaging mix containing a plasmid containing the desired transgene to be caused, simultaneously express HTLV-1 Tax or NF- ⁇ B RelA in the 293T cell to produce a lentiviral vector.
  • a method for producing a lentiviral vector according to any one of [1] to [3], wherein [5] A method for producing a lentiviral vector, comprising a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentiviral particles, and genes and expressions for transcribing RNA incorporated into lentiviral particles
  • a method for producing a lentiviral vector comprising a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentiviral particles, and genes and expressions for transcribing RNA incorporated into lentiviral particles
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are a lentiviral vector plasmid containing at least an LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a transgene of interest (transgene), and gag,
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are: (1) a lentiviral vector plasmid containing at least LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a target transgene (transgene); (2) three plasmids, a packaging plasmid containing gag and pol necessary for packaging and optionally containing control genes rev and tat, and (3) an envelope plasmid containing a gene encoding VSV-G.
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are: (A) a lentiviral vector plasmid containing at least the LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a target transgene (transgene); It consists of four plasmids, (B) a packaging plasmid containing gag and pol necessary for packaging, (C) an envelope plasmid containing a gene encoding VSV-G, and (D) a rev expression plasmid containing rev. 6]
  • a method for producing a lentiviral vector are: (A) a lentiviral vector plasmid containing at least the LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a target transgene (transgene); It consists of four plasmids, (B) a packaging plasmid containing gag and
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are: (B) a packaging plasmid containing gag and pol necessary for packaging, and (C) a plasmid containing an envelope expression unit containing a gene encoding VSV-G and a rev expression unit containing rev, [6]
  • a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentivirus particles, and a plasmid containing a gene that transcribes RNA incorporated into lentivirus particles and a transgene of interest to be expressed A kit for producing a lentiviral vector in 293T cells, comprising a packaging mix containing the same, and an expression vector containing a gene encoding a factor that activates a promoter. [13] The kit for producing a lentiviral vector according to [12], wherein the factor for activating the promoter is a factor for activating the CMV promoter.
  • the promoter activating factor is one or more selected from the group consisting of HTLV-1 Tax, HIV-1 Tat, NF- ⁇ B RelA, AP-1 and CREB / ATF, [12] Or the kit of [13].
  • a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentivirus particles, and a plasmid containing a gene that transcribes RNA incorporated into lentivirus particles and a transgene of interest to be expressed For producing a lentivirus vector in 293T cells of any of [12] to [14], comprising a packaging mix containing the same and an expression vector containing a gene encoding HTLV-1 Tax or NF- ⁇ B RelA .
  • a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentivirus particles, and a plasmid containing a gene that transcribes RNA incorporated into lentivirus particles and a transgene of interest to be expressed Encoding packaging mix and encodes two types selected from the group consisting of HTLV-1 Tax, HIV-1 Tat and NF- ⁇ B RelA, or three types of HTLV-1 Tax, HIV-1 Tat and NF- ⁇ B RelA
  • HTLV-1 A gene encoding two types selected from the group consisting of HIV-1 Tax, Tat and NF- ⁇ B RelA, or a gene encoding three types of HTLV-1 Tax, HIV-1 Tat and NF- ⁇ B RelA.
  • a plurality of plasmids constituting the packaging mix are a lentiviral vector plasmid containing at least an LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a transgene of interest (transgene), and gag,
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are: (1) a lentivirus vector plasmid containing at least an LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a target transgene (transgene); (2) three plasmids, a packaging plasmid containing gag and pol necessary for packaging and optionally containing control genes rev and tat, and (3) an envelope plasmid containing a gene encoding VSV-G.
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are: (A) a lentiviral vector plasmid containing at least the LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a target transgene (transgene); It consists of four plasmids, (B) a packaging plasmid containing gag and pol necessary for packaging, (C) an envelope plasmid containing a gene encoding VSV-G, and (D) a rev expression plasmid containing rev. [18]
  • the plurality of plasmids constituting the packaging mix are: (A) a lentiviral vector plasmid containing at least an LTR (5 ′ LTR and 3 ′ LTR), a packaging signal ( ⁇ ) and a target transgene (transgene); (B) a packaging plasmid containing gag and pol necessary for packaging, and (C) a plasmid containing an envelope expression unit containing a gene encoding VSV-G and a rev expression unit containing rev, [18] A kit for producing a lentiviral vector.
  • the Tax protein is not incorporated into the lentiviral vector particles, the safety of the preparation is ensured.
  • FIG. 2 shows the structures of representative first, second and third generation lentiviral vector systems.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of a third generation lentiviral vector system in which VSV-G and rev are contained in one plasmid.
  • FIG. 7 shows that Tax strongly activates the CMV promoter in HEK293T cells.
  • FIG. 3 shows enhancement of lentiviral vector production by co-expression of Tax in lentiviral vector-producing cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the levels of Tax expression and Gag expression in lentivirus vector-producing cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing enhancement of virus release from producer cells by Tax.
  • FIG. 4 shows that Tax is unlikely to be incorporated into lentiviral vector particles.
  • FIG. 3 is a view showing the structure of a pSV plasmid.
  • FIG. 3 is a view showing the structure of a transfer plasmid used in Example 2.
  • FIG. 4 is a view showing the structure of a transfer plasmid used in Example 3. It is a figure which shows the outline
  • the present invention relates to a method for producing a lentiviral vector, and a method for enhancing the amount of lentiviral vector produced.
  • a 293T (HEK293T) cell is used as a packaging cell capable of producing a lentivirus vector, and when a lentivirus is produced in the 293T cell, it acts on the promoter and activates the promoter. Co-express the factor.
  • the promoter is not limited, and includes, for example, a CMV promoter.
  • Factors that activate the promoter include Tax, NF- ⁇ B RelA, HIV-1 Tat (hereinafter, referred to as “HIV-1 Tat” or “Tat”), AP-1, CREB / ATF, and the like. One may be co-expressed, or two, three, four or five may be co-expressed in combination. In the present invention, it is preferable to co-express one or more factors selected from Tax, NF- ⁇ B ⁇ RelA and Tat as factors for activating the promoter.
  • 293T (HEK293T) cells are used as packaging cells capable of producing a lentivirus vector, and when producing a lentivirus in 293T cells, Tax, NF- ⁇ B-RelA, etc. Co-express transcription factors, Tat, or combinations thereof.
  • Lentiviral vectors were developed based on human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).
  • HIV-1 provirus genome may be divided and contained in a plurality of plasmids, and each plasmid may be co-transfected (co-transfected) into cells.
  • each plasmid may be co-transfected (co-transfected) into cells.
  • a plurality of plasmids containing genes encoding proteins essential for the formation of lentivirus particles, a plasmid containing a gene that transcribes RNA incorporated into lentivirus particles, and a plasmid containing a target transgene to be expressed into the packaging cells.
  • Proteins such as gag, pol, tat, and rev required for packaging and envelopes such as VSV-G (G glycoprotein of vesicular stomatitis virus: vesicular stomatitis virus glycoprotein) are essential proteins for lentivirus particle formation. (Env) protein.
  • VSV-G is preferred in that it has a wide host range and high physical strength, but other envelopes can be used.
  • the gag gene encodes internal structure (cell stroma, capsid and nucleocapsid) proteins
  • the pol gene encodes RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase), protease and integrase
  • the env gene encodes the viral envelope. Encodes a glycoprotein.
  • the lentivirus vector plasmid is a plasmid containing a packaging signal ( ⁇ ) and having a target gene inserted therein.
  • Nucleic acids encoding proteins such as gag, pol, tat, and rev required for packaging, and nucleic acids encoding an envelope (env) protein such as VSV-G may be a plurality of plasmids, for example, 3 to 5 plasmids, preferably May be divided into three or four plasmids and cotransfected with a plurality of these plasmids and a lentiviral vector plasmid.
  • the recombinant viral RNA genome transcribed from the lentiviral vector plasmid is incorporated into the packaging protein by the action of the packaging signal ( ⁇ ) to form a viral core.
  • nucleic acids encoding proteins essential for virus formation are dispersed and contained in different plasmids, thereby preventing the generation of wild-type HIV-1 by homologous recombination.
  • Lentiviral vectors that infect cells are not re-infectious and safe because they cannot self-replicate in cells.
  • a lentivirus vector plasmid for example, a lentivirus vector plasmid, a plasmid containing a nucleic acid encoding a protein such as gag, pol, tat, rev, and a plasmid containing a nucleic acid encoding an envelope (env) protein such as VSV-G can be used.
  • rev and tat which are control genes may be divided into other plasmids.
  • LTR 5 ′ LTR and 3 ′ LTR
  • ⁇ packaging signal
  • transgene target transgene
  • gag required for packaging And pol a packaging plasmid that may contain the control genes rev and tat
  • an env expression plasmid envelope plasmid
  • env envelope plasmid
  • Packaging plasmid (C) an env expression plasmid containing an env gene encoding an envelope (env) such as VSV-G (envelope plasmid), and (D) a rev expression plasmid containing rev. Good.
  • 5 'LTR and 3' LTR may be modified, for example, U3 of 5 'LTR and 3' LTR may be deleted or mutated, at this time, U3 of 5 'LTR is CMV promoter And the like.
  • the plurality of plasmids used for the production of a lentivirus vector in cells are called a packaging mix for lentivirus production.
  • a polyA-added sequence (polyadenylation sequence, poly ⁇ A) is ligated to the 3 ′ end of a plasmid other than the lentivirus vector plasmid.
  • the origin of the poly-A additional sequence is not limited, and a poly-A additional sequence derived from a growth hormone gene, for example, a poly-A additional sequence derived from a bovine growth hormone gene or a poly-A additional sequence derived from a human growth hormone gene, Examples include a polyA additional sequence derived from SV40 virus, and a polyA additional sequence derived from human or rabbit ⁇ -globin gene.
  • the above-mentioned lentiviral vector plasmid has an internal promoter and a gene of interest inserted between the HIV-LTRs at both ends containing a packaging signal ( ⁇ ).
  • the lentivirus vector plasmid and the packaging plasmid may contain an RRE (rev response element).
  • a promoter may be linked to the 5 'end of each plasmid. Furthermore, as described above, a promoter is included upstream of the target gene in the lentiviral vector plasmid.
  • the promoter used is not limited. CMV promoter, CMV-i promoter (hCMVCM + CM intron promoter), SV40 promoter, UbC promoter, EF1a promoter, RSV promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter, tissue-specific promoter, tet expression control promoter And the like, and among them, the CMV promoter is preferable.
  • HIV accessory genes such as vif, vpr, vpu, vpx, nef, etc. has been removed or inactivated.
  • the lentivirus vector plasmid may contain cPPT (central polypolyine tract) or WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulator element).
  • cPPT central polypolyine tract
  • WPRE woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulator element
  • Each element in the plasmid must be functionally linked.
  • “functionally linked” means that the elements are linked so that the expression of the gene to be expressed is enhanced by each element exhibiting its function.
  • Lentiviral vector systems for producing lentiviral vectors include first-generation lentiviral vector systems, second-generation lentiviral vector systems, and third-generation lentiviruses to prevent the generation of wild-type viruses due to homologous recombination. The vector system was improved.
  • the lentiviral vector system using the three plasmids (1) to (3) is a second-generation lentiviral vector system, and the lentiviral vector system using the four plasmids (A) to (D) is the third. Generation lentivirus vector system.
  • the U3 of the 5 ′ LTR of the lentiviral vector plasmid may be replaced with a CMV promoter, and the U3 of the 3 ′ LTR may be mutated to neutralize the promoter activity.
  • a lentiviral vector plasmid is called a SIN (self-inactivating) plasmid. It has been reported that when U3 of the 5 'LTR is replaced with a CMV promoter, tat is unnecessary and tat can be removed from the packaging plasmid (MIYOSHI et al., J. Virol., 70, 8150, 1998 ; Dull et al., J. Virol., 72, 8463, 1998.).
  • the third generation lentiviral vector has been described as a tat-independent lentiviral vector system that does not contain tat.
  • FIG. 1-1 shows a typical configuration of a first-generation lentivirus vector system, a second-generation lentivirus vector system, and a third-generation lentivirus vector system (modified from Biochem J. J. (2012) 443, 603-618). ).
  • FIG. 1-2 shows the configuration of a third-generation lentiviral vector system in which VSV-G and rev are contained in one plasmid.
  • a second generation lentivirus vector system or a third generation lentivirus vector system is preferably used.
  • the second generation lentiviral vector system has the advantage of high lentiviral vector production
  • the third generation lentiviral vector system has the advantage of high safety.
  • Tax is a transcriptional activator of the human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) virus gene and activates transcription factors such as AP-1, NF- ⁇ B and CREB / ATF, and the activated transcription factor Enhance lentiviral vector production by binding to binding sequences in promoters such as the CMV promoter to act on the promoter to promote expression of the plasmids that make up the lentiviral vector system cotransfected into 293T cells .
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus type 1
  • 293T cells may be co-transfected with an expression vector containing a nucleic acid encoding a Tax protein in addition to the plasmid constituting the lentivirus vector system, and co-expressed.
  • an expression vector a virus vector other than a lentivirus vector, for example, an adenovirus, an adeno-associated virus, a gamma retrovirus, and the like can also be used.
  • the promoter in the Tax expression vector is not limited, and use a CMV promoter, CMV-i promoter (hCMV + intron promoter), SV40 promoter, EF1 ⁇ promoter, RSV promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter, tissue-specific promoter, etc. Can be. Expression may be transient or constant. For constitutive expression, for example, a nucleic acid encoding a Tax protein may be integrated into the genome of 293T cells.
  • HTLV-1 Tax is a powerful viral trans-acting protein, its trans-acting function, if sufficient, can be incorporated into lentiviral vector particles to elicit undesirable effects in target cells. In the method of the present invention, Tax is not incorporated into lentiviral particles.
  • a transcription factor acting on a promoter such as a CMV promoter in a plasmid constituting the lentivirus vector system may be co-expressed.
  • Tax can be used for lentiviral vector production. This is because Tax activates all of these transcription factors. Co-expression of small amounts of Tax significantly increases both Gag expression and lentiviral vector particle release in producer cells, and increases transduction efficiency by more than 10-fold.
  • Candidate transcription factors to be activated include AP-1, NF- ⁇ B and CREB / ATF. As described above, Tax activates transcription factors such as AP-1, NF- ⁇ B and CREB / ATF, and the activated transcription factors act on promoters such as the CMV promoter.
  • transcription factors may be co-expressed, and when these transcription factors are co-expressed, the amount of the transcription factors in 293T cells increases, which makes them more likely to be activated by Tax, and consequently co-transfects into 293T cells. It can be expected that the expression of the plasmid constituting the infected lentiviral vector system is promoted, and the production of the lentiviral vector is enhanced.
  • NF- ⁇ B may express NF- ⁇ B RelA containing a transcription activation domain.
  • Tat may be co-expressed with Tax or with Tax and a transcription factor.
  • Tax and Tat By co-expressing Tax and Tat, lentivirus production is additively enhanced.
  • the third-generation lentiviral vector system is a Tat-independent lentiviral vector system, but also in the third-generation lentiviral vector system, co-expression of Tax and Tat enhances lentiviral vector production.
  • transcription factor and Tat can be performed in the same manner as expression of Tax. That is, an expression vector containing a nucleic acid encoding each protein may be co-transfected into 293T cells and co-expressed. At this time, a plurality of different vectors containing each of them may be used, or co-expression may be made using a vector containing two or more or all of Tax, a transcription factor and Tat. The input amount of each plasmid may be appropriately set, and the nucleic acid encoding Tax, Tat, and NF- ⁇ B ⁇ RelA may be transfected in the same amount in terms of vector amount, or in a ratio of about 2 to 3 times. .
  • a vector containing a nucleic acid encoding Tax or Tat is about 0.1 ⁇ g / 12-well, and a vector containing a nucleic acid encoding NF- ⁇ B RelA is 0.1-0.2 ⁇ g / 12. It is sufficient to transfect well.
  • the amount of lentivirus production increases, so that the amount of plasmids containing genes encoding proteins essential for lentivirus particle formation is reduced. be able to.
  • the conventional method method of preparing lentiviral vector Hiroyuki Miyoshi http://cfm.brc.riken.jp/wp-content/uploads/Subteam_for_Manipulation_of_Cell_Fate_J/Protocols_J_files/Lentiviral%20vector%20prep.pdf
  • the reason for this is that the lentiviral vector-producing cell condition is improved by reducing the amount of plasmid for expressing the lentiviral vector components, and that sufficient activation can be obtained by simply activating the CMV enhancer / promoter. Can be considered.
  • the plasmid constituting the lentivirus vector system may be co-transfected into 293T cells, which are packaging cells, and Tax, or Tax and Tat and / or a transcription factor may be co-expressed.
  • Tax or Tax and Tat and / or a transcription factor
  • only Tax, only RelA, two types of Tax and Tat, two types of Tax and RelA, two types of Tat and RelA, and three types of Tax, Tat and RelA may be co-expressed.
  • 293T (HEK293T) cells are derivatives of 293 cells (HEK293 cells), which are cell lines derived from human embryonic kidney, and are cell lines that express the SV40 Large T antigen.
  • 293T cells are commercially available and can be obtained from ATCC (American Type Culture Collection) or the like.
  • derivative cells derived from 293T cells can also be used, and such cells include Lenti-X TM 293T cells (Takara Bio Inc.).
  • such a derivative of the 293T cell is also referred to as a 293T cell.
  • 293Transfection of 293T cells with the plasmid can be performed by a known method. Examples thereof include a method using a gene introduction reagent, a calcium phosphate method, a lipofection method, a DEAE dextran method, an electroporation method, and a microinjection method.
  • the gene transfer reagent include polyethyleneimine (PEI, linear or branched) and commercially available gene transfer reagents.
  • Gene transfer reagents include Lipofectamine (registered trademark), Lipofectamine plus (registered trademark), jet PEI (registered trademark), TransIT (registered trademark), Xfect (registered trademark), Transfectin-Lipid (registered trademark), and Oligofectamine (registered trademark). ), SiLentFect (registered trademark), DMRIE-C (registered trademark), Effectene (registered trademark), FuGENE (registered trademark), and the like.
  • Polyethyleneimine (PEI) includes linear PEI and branched PEI containing primary, secondary and tertiary amines, and any of them can be used. Also, the molecular weight of PEI is not limited. Further, chemically modified PEI such as deacylation can also be used.
  • the culture supernatant is recovered after several days of culture, and lentiviral particles are recovered from the culture supernatant.
  • the medium and culture conditions used for culturing 293T cells are the same as those used for normal animal cell culture.
  • the culture period for producing a lentivirus is, for example, 12 to 72 hours, preferably 24 to 48 hours.
  • a sufficient titer means 1 ⁇ 10 5 IFU / mL or more, preferably 5 ⁇ 10 5 IFU / mL or more.
  • the titer can be measured using real-time RT-PCR, P24 measurement ELISA, flow cytometry and the like.
  • the amount of the obtained lentiviral vector can be confirmed by the efficiency of transducing cells.
  • the amount of lentivirus produced is at least 3 times, preferably 5 times, more preferably 8 times, when the transduction efficiency into cells, for example, MT-4 cells by luciferase reporter assay is used as an index. , More preferably 12 times, further preferably 14 times, more preferably 16 times, more preferably 18 times, more preferably 20 times, further preferably 22 times, and still more preferably 24 times.
  • Tax, Tat the enhancement effect when co-expressing two or three types of transcription factors is large, when Tax and Tat are co-expressed, at least 5 times, and when Tax and RelA are co-expressed, It is enhanced at least 12-fold, at least 16-fold when Tat and RelA are co-expressed, and at least 22-fold when Tax, Tat and RelA are co-expressed.
  • the collected lentiviral vector can be concentrated and purified by ultracentrifugation or the like before use.
  • the obtained lentiviral vector may be stored frozen.
  • the lentiviral vector obtained in this manner can be used for gene transfer into mammalian cells, regardless of whether the cells are growing or cells that have stopped growing, and the introduced genes are stably integrated into the host cell genome. Thus, long-term gene expression becomes possible. Therefore, it can be suitably used as a vector for gene therapy.
  • the present invention includes a reagent or a kit for enhancing the production of a lentiviral vector using 293T cells.
  • the reagent or kit includes a plurality of plasmids containing a gene encoding a protein essential for the formation of the above-mentioned lentiviral particles, a gene which transcribes RNA incorporated into the lentiviral particles, and a target transgene to be expressed
  • a packaging mix containing a plasmid containing lentivirus (a lentivirus vector plasmid) and an expression vector that expresses HTLV-1 Tax.
  • the reagent or kit may further include an expression vector expressing a transcription factor selected from the group consisting of AP-1, NF- ⁇ B and CREB / ATF and / or an expression vector expressing HIV-1 ⁇ Tat. .
  • Example 1 Materials and Methods for Enhancing Lentiviral Vector Production by HTLV-1 Tax Cells Dulbecco's Modified Eagle Medium (Nacalai Tesque) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin ) was cultured in HEK293T (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).
  • MT-4 cells were maintained in complete RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque) supplemented with 10% FBS, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • Plasmids pCSII-CMV-MCS-IRES2-Bsd, pCAG-HIVgp, pCMV-VSV-G-RSV-Rev were provided by RIKEN BRC through the National BioResource Project of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology.
  • pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd To generate pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd, pCSII-CMV-MCS-IRES2-Bsd and pCMV-luc were digested with XhoI and NotI.
  • pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd pHCMV-VSV-G was provided by Dr. ISY Chen.
  • pCMVdeltaR8.2 pCMV-Neo-Bam-Tax, pCMV-Neo-Bam are described in Yamaoka, S. et al., Cell 93, 1231-1240 (1998); Naldini, L. et al.
  • pH2RneoTax, pSV2Tat and pRC / CMVRelA are respectively Yamaoka et al., EMBO J. 15, 873-87, 1996; Subramani S et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854, 1981; Schmitz and It was prepared by the method described in Baeuerle, EMBO J., 10, 3805-3817, 1991.
  • the membrane was incubated with horseradish peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG (A206PS, American Qualex International Inc.) or goat anti-rat IgG (sc-2006, Santa Cruz Biotechnology), and the protein was incubated with Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer). Visualized.
  • Preparation of virus solution For production of lentivirus vector in the presence of Tax, using PEI (polyethyleneimine), 1.4 ⁇ g of pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd, 0.9 ⁇ g of pCMVdeltaR8 per 6-well plate. 2 and 0.4 ⁇ g of pHCMV-VSV-G were co-transfected with pCMV-Neo-Bam-Tax and / or pCMV-Neo-Bam. Virus in the supernatant was harvested 48 hours after transfection.
  • PEI polyethyleneimine
  • HIV-1 capsid The amount of HIV-1 capsid (CA) in the supernatant was quantified by HIV-1 CA (p24) ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (ZeptMetrix Corporation).
  • HIV-1 CA p24
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Tax, Tat or RelA were used alone, in combination of two types, or co-expressed in all three types.
  • Tax, Tat or RelA alone co-expression, Tax, Tat and RelA co-expression of two, and Tax, Tat and RelA co-expression on the third-generation lentiviral vector production amount using PEI 24- 0.14 ⁇ g of pCAG-HIVgp per well plate, 0.14 ⁇ g of pCMV-VSV-G-RSV-Rev, 0.24 ⁇ g of pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd, and their respective expression vectors or their control empty vectors (EV1, EV2 And EV3) were co-transfected with 0.05 ⁇ g.
  • Luciferase Reporter Assay Approximately 2 ⁇ 10 5 MT4 cells in a 24-well plate infected with a lentiviral vector were harvested 24 hours post-infection and lysis buffer (25 mM Tris pH 7.8, 8 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, After lysis with 1% Triton-X100, 15% glycerol), luciferase activity was measured. Firefly luciferase activity was measured according to the manufacturer's protocol and the GloMax-Multi Detection System (Promega Corp.). Luciferase activity was normalized to protein concentration determined by the Bradford assay.
  • Lentiviral Vector 2 ml of a 20% sucrose solution was placed in the bottom of a model SW55 ultracentrifuge tube and overlaid with 2 ml of the culture supernatant containing the lentiviral vector. The sample was then centrifuged at 35,000 rpm at 4 ° C. for 60 minutes. The pelletable fraction was resuspended in PBS (-) and subjected to Western blotting.
  • HTLV-1 Tax strongly enhances lentiviral vector production.
  • the production of lentiviral vectors by HEK293T cells was based on the expression of firefly luciferase (pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd), packaging plasmid (pCMV deltaR8.2) and plasmid expressing vesicular stomatitis virus glycoprotein (pHCMV-VSV-G ) was expressed by co-transfecting HEK293T cells with CV (control vector: empty vector).
  • HTLV-1 Tax which is well known to activate several cellular transcription factors, including AP-1, NF- ⁇ B and CREB / ATF19 (Currer et al., Frontiers in Microbiology, 3, article 406, 2012).
  • Tax activated the CMV promoter in HEK293 cells but not HEK293T cells (Lwa, TR et al., Biotechnology progress 27, 751-756, doi: 10.1002 /btpr.571 (2011).).
  • Tax strongly activates the CMV promoter in HEK293T cells.
  • 0.1 ⁇ g of pCMV-luc and 0.2 ⁇ g of pCMV-Neo-Bam-Tax (Tax) as a reporter vector or pCMV-Neo- as a control vector (CV) were added to about 2 ⁇ 10 5 HEK293T cells.
  • Cotransfected with Bam. 30 ⁇ g of cell lysate was subjected to Western blotting using anti-HTLV-1 Tax or anti- ⁇ -tubulin antibodies (lower panel in FIG. 2).
  • the upper panel of FIG. 2 shows the results of the luciferase assay in fold compared to CV. Bars indicate standard error calculated from three independent experiments.
  • HEK293T cells Approximately 1.5 ⁇ 10 6 HEK293T cells were loaded with 0.4 ⁇ g of pHCMV-VSV-G, 0.9 ⁇ g of pCMV ⁇ R8.2 and 1.4 ⁇ g of pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd in CV or pCMV-Neo with increasing dose. -Co-transfected with one of Bam-Tax. The total amount of the effector plasmid was adjusted to 0.4 ⁇ g. 48 hours after transfection, lentiviral vector-containing culture supernatant was collected. Transduction efficiency in MT-4 cells exposed to culture supernatant was evaluated 24 hours after exposure.
  • Luciferase activity was corrected using protein concentration and results are shown as folds compared to control (0 ⁇ g of pCMV-Neo-Bam-Tax). The average and standard error calculated from three independent experiments are shown. Thereafter, the results of the reporter assay were corrected using the protein concentration.
  • Co-expression of Tax in lentiviral vector producing cells showed up to a 12-fold increase in lentiviral vector production, as indicated by luciferase activity in infected cells in FIG.
  • the transfected cells shown in FIG. 3 were collected. 30 ⁇ g of the same set of lysates were subjected to Western blotting with anti-HTLV-1 Tax and anti- ⁇ -tubulin antibodies or anti-HIV-1p24 and anti-cyclophilin A antibodies. As shown in FIG. 4, a dose-dependent increase in Tax expression in producer cells was confirmed by Western blotting. Gag expression levels in producer cells correlated well with the results of lentiviral vector transduction.
  • the concentration of HIV-1 Gag was measured using a specific ELISA.
  • the amount of Gag protein in the supernatant of the transfected cells was quantified by HIV-1 ⁇ CA (p24) ELISA, and the result is shown as a fold as compared with the control (0 ⁇ g of pCMV-Neo-Bam-Tax). Means and standard errors calculated from three independent experiments are shown.
  • the amount of Gag in the supernatant similarly increased in the presence of Tax and correlated well with the transduction efficiency and Gag expression level in producer cells (FIGS. 3 and 4).
  • HTLV-1 Tax is a potent viral trans-acting protein, contamination of lentiviral vector particles can elicit undesirable effects in target cells if its trans-acting function is sufficient.
  • the virus particles in the culture supernatant were collected by ultracentrifugation as a pellet through a sucrose cushion. That is, lentiviral particles were collected by ultracentrifugation using 20% sucrose. Then both cell lysate and pelleted virus particles were subjected to Western blotting. The same set of 30 ⁇ g lysates were subjected to western blotting with anti-HTLV-1 Tax and anti- ⁇ -tubulin antibodies or anti-HIV-1p24 and anti-cyclophilin A antibodies. As shown in FIG. 6, Tax protein was not detected by Western blotting on the pellet obtained by ultracentrifugation. This result suggests that Tax is significantly less likely to be incorporated into lentiviral vector particles.
  • a transcriptional activator such as HTLV-1 Tax significantly improved lentiviral vector production by enhancing viral protein expression in producer cells (FIGS. 2-6).
  • Tax enhanced reporter gene expression driven by the CMV promoter (FIG. 2) and further enhanced Gag expression in producer cells. This correlated well with the results of lentiviral vector transduction (FIGS. 3 and 4).
  • the CMV promoter is a lentivirus transfer vector (pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd), a packaging plasmid (pCMVdeltaR8.2), and a plasmid (pHCMV-VSV-G) expressing an envelope. Drive.
  • Example 2 Enhancement of lentiviral vector production when HTLV-1 Tax, Tat or NF- ⁇ B RelA is expressed alone or simultaneously, then, third generation lentiviral vector systems pCAG-HIVgp, pCMV-VSV-G Using -RSV-Rev and pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd, the effect of increasing lentiviral vector production by co-expression of the following combinations was examined using luciferase activity in MT4 cells as an index (FIG. 7).
  • FIG. 7-1 shows the amount of the third-generation lentiviral vector produced by co-expression of Tax alone (FIG. 7-1A), co-expression of Tat alone (FIG. 7-1B), and co-expression of ⁇ RelA alone (FIG. 7-1C). Show the effect.
  • FIG. 7-2 shows the third generation of co-expression of Tax, ⁇ Tat and ⁇ RelA (FIG. 7-2A; Tax and Tat, FIG. 7-2B; Tax and RelA, FIG. 7-2C; Tat and RelA). The effect on lentiviral vector production is shown.
  • FIG. 7-2D shows the effect of the expression of Tax, Tat and RelA on the third-generation lentiviral vector production.
  • FIG. 8 shows the structure of the pSV plasmid. (3) After 24 hours, the culture solution was replaced.
  • FIG. 9 shows the structure of the transfer plasmid (expressing the genome of the viral vector containing the transgene) of (iii).
  • FIG. 10 shows the results of the luciferase assay. As shown in FIG. 10, the expression level of the gene (luciferase) in the infected target cells increased by about 4 times when Tat alone was expressed, about 5 times when RelA was expressed alone, and about 11 times when both were expressed.
  • Example 4 Measurement titer when co-expressing Tat, RelA, and Tat + RelA when using Venus as the reporter gene
  • Human Embryonic Kidney (HEK) 293T cells were coated on a collagen-coated 24-well plate. The cells were seeded and adhered at 3.0 ⁇ 10 5 cells / well using 0.5 mL of DMEM containing 10% fetal bovine serum.
  • HEK Human Embryonic Kidney
  • Opti-MEM 30 ⁇ L of 1 ⁇ g / ⁇ L Polyethylenimine (PEI) was added, the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes, and then added dropwise to the cells.
  • PEI Polyethylenimine
  • pCSII-CMV-HSVTK-IRES2-Venus was prepared by the following method. HSV amplified by PCR using pNL4-3tk (Hori et al., JVI 2013) as a template between the NheI recognition site and BamHI recognition site of CSII-CMV-RfA-IRES2-Venus (from Dr. Hiroyuki Miyoshi, RIKEN) -1 (TK) thymidine kinase (DNA) fragment was inserted.
  • the primers used in the PCR were as follows.
  • FIG. 11 shows the structure of the transfer plasmid (expressing the genome of the viral vector containing the transgene) of (iii).
  • FIG. 12 shows an outline of a titer measurement method using Venus as a reporter gene.
  • FIG. 13 and 14 show the results of the titer measurement.
  • FIG. 13 shows the absolute value of the titer (the titer of the lentiviral vector)
  • FIG. 14 shows the degree of increase in the titer when the titer when the control vector was used was set to 100%.
  • TU Transduction Unit
  • a lentiviral vector for gene transfer that can be used for gene therapy or the like can be safely and efficiently produced.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

293T細胞において、レンチウイルスベクターの産生を増強させる方法および増強させるための試薬の提供を目的とする。　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスで293T細胞をコトランスフェクトするときに、同時に293T細胞中でHTLV-1 Tax、HIV-1 TatまたはNF-κB RelAを発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、レンチウイルスベクターを産生する方法。

Description

レンチウイルスベクター産生の増強方法
　本発明はレンチウイルスベクターの効率的な産生方法に関する。
　ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）由来のレンチウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの両方において、分裂細胞および非分裂細胞に外来遺伝子を形質導入するための貴重なツールである。レンチウイルスベクターの安全性と利便性は、種々の方法によって、改善されてきた（非特許文献１）。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）偽装型のレンチウイルスベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーターの制御下でHEK293T細胞内で産生され、広範囲の細胞への非常に効率的な形質導入を媒介することができる(非特許文献２)。造血幹細胞およびT細胞を標的とするレンチウイルスベクターの最近の臨床応用は、かなり成功している(非特許文献３）。インビボ実験および非分裂細胞の形質導入には、高力価のレンチウイルスベクターが必要となることが多く、このためには大型培養で製造し、超遠心分離によって濃縮し、次いでクロマトグラフィーおよび限外濾過によって精製しなければならない(非特許文献４)。この手順は、大量のプラスミドおよび細胞培養材料ならびに濃縮および精製のための装置を用いるベクター調製の高コストのため、現在、大きな障害となっている。培養上清からのレンチウイルスベクターの濃縮および精製のための手順を改善するために多くの努力が払われてきたが、ベクターの実際の産生を増強するための簡単な方法についての報告は比較的少ない。細胞内自然免疫応答をブロックすることにより、ウイルスベクター産生が増加すること(非特許文献５)、および免疫応答タンパク質Siglec-9の安定した発現が、トランスフェクション効率を上昇させることによってレンチウイルスベクター産生を増強することが示された(非特許文献６)。他の研究者は、カフェイン(非特許文献７)または酪酸ナトリウム(非特許文献８)を培養培地に添加して、レンチウイルスベクターの力価を増加させることについて研究を行った。しかしながら、高力価のレンチウイルスベクターを調製するには、さらに改善が必要である。
Matrai et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 477-490, doi:10.1038/mt.2009.319 (2010). Burns, J. C. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 8033-8037 (1993). Dunbar, C.E. et al., Science 359, doi:10.1126/science.aan4672 (2018). McCarron, A. et al., Journal of biotechnology 240, 23-30, doi:10.1016/j.jbiotec.2016.10.016 (2016). de Vries et al., Gene therapy 15, 545-552, doi:10.1038/gt.2008.12 (2008). Shoji, T. et al., Cytotechnology 67, 593-600, doi:10.1007/s10616-013-9679-7 (2015). Ellis, B. L. et al., Human gene therapy 22, 93-100, doi:10.1089/hum.2010.068 (2011). Ansorge. S. et al., The journal of gene medicine 11, 868-876, doi:10.1002/jgm.1370 (2009).
　レンチウイルスベクターは、細胞内での安定した発現のために外来遺伝子を送達するための貴重なツールである。レンチウイルスベクター含有培地からレンチウイルスベクターを精製する技術の開発には多大な進歩があった。しかし、産生細胞からのレンチウイルスベクターの産生を増加させる方法については十分検討されていない。
　本発明は、293T細胞において、レンチウイルスベクターの産生を増強させる方法および増強させるための試薬の提供を目的とする。
　ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）のTaxタンパク質（以下、「HTLV-1 Tax」または「Tax」と表記）は、HTLV-1のLTR駆動転写を促進し、cAMP応答配列結合タンパク質（CREB）/活性化転写因子（ATF)、核内因子-B（NF-κB）およびアクチベータータンパク質-1（AP-1）1を含む細胞転写因子を活性化するトランス作用性タンパク質である。本発明者らは、HTLV-1 Taxが、HEK293T細胞におけるCMVプロモーター駆動遺伝子発現を増強することを見出し、この知見をレンチウイルスベクター産生に利用した。
　本発明者らは、少量のTaxを同時発現させると、産生細胞におけるGagの発現およびレンチウイルスベクター粒子の放出の両方が著しく増加し、形質導入効率が10倍を超えて増加することを見出し、産生細胞におけるプロモーター活性化により、高力価のレンチウイルスベクターを調製する本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスで293T細胞をコトランスフェクトするときに、同時にプロモーターを活性化する因子を発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、レンチウイルスベクターを産生する方法。
[２]　プロモーターを活性化する因子が、CMVプロモーターを活性化する因子である、[１]のレンチウイルスベクターを産生する方法。
[３]　プロモーターを活性化する因子が、HTLV-1 Tax、HIV-1 Tat、NF-κB RelA、AP-1及びCREB/ATFからなる群から選択される１つまたは複数である、[１]または[２]の方法。
[４]　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスを293T細胞にコトランスフェクトするときに、同時に293T細胞中でHTLV-1 TaxまたはNF-κB RelAを発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、[１]～[３]のいずれかのレンチウイルスベクターを産生する方法。
[５]　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスで293T細胞をコトランスフェクトするときに、同時に293T細胞中でHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAからなる群から選択される２種類、あるいはHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAの３種類を発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、[１]～[３]のいずれかのレンチウイルスベクターを産生する方法。
[６]　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、ならびにgag、pol、revおよびenvを分割して含む複数のプラスミドからなる、[４]または[５]のレンチウイルスベクターを産生する方法。
[７]　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（１）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（２）パッケージングに必要なgagおよびpolを含み、制御遺伝子であるrevおよびtatを含んでいてもよいパッケージングプラスミド、ならびに（３）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミドの３つのプラスミドからなる、[６]のレンチウイルスベクターを産生する方法。
[８]　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、ならびに（D）revを含むrev発現プラスミドの４つのプラスミドからなる、[６]のレンチウイルスベクターを産生する方法。
[９]　 パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、ならびに（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベロープ発現ユニットおよびrevを含むrev発現ユニットを含むプラスミドの３つのプラスミドからなる、[６]のレンチウイルスベクターを産生する方法。
[１０]　レンチウイルスベクタープラスミド中の5'LTRおよび3'LTRが改変されている、[８]または[９]のレンチウイルスベクターを産生する方法。
[１１]　Taxがレンチウイルスベクター中に取り込まれない、[３]～[１０]のいずれかのレンチウイルスベクターを産生する方法。
[１２]　レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックス、およびプロモーターを活性化する因子をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、293T細胞中でレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[１３]　プロモーターを活性化する因子が、CMVプロモーターを活性化する因子である、[１２]のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[１４]　プロモーターを活性化する因子が、HTLV-1 Tax、HIV-1 Tat、NF-κB RelA、AP-1及びCREB/ATFからなる群から選択される１つまたは複数である、[１２]または[１３]のキット。
[１５]　レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックス、およびHTLV-1 TaxまたはNF-κB RelAをコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、[１２]～[１４]のいずれかの293T細胞中でレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[１６]　レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックス、ならびにHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAからなる群から選択される２種類、あるいはHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAの３種類をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、[１２]～[１４]のいずれかの293T細胞中でレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[１７]　HTLV-1 HIV-1 Tax、TatおよびNF-κB RelAからなる群から選択される２種類、あるいはHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAの３種類をコードする遺伝子を含む発現ベクターが別々のベクターである、[１６]のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[１８]　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、ならびにgag、pol、revおよびenvを分割して含む複数のプラスミドからなる、[１５]～[１７]のいずれかのレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[１９]　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（１）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（２）パッケージングに必要なgagおよびpolを含み、制御遺伝子であるrevおよびtatを含んでいてもよいパッケージングプラスミド、ならびに（３）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミドの３つのプラスミドからなる、[１８]のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[２０]　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、ならびに（D）revを含むrev発現プラスミドの４つのプラスミドからなる、[１８]のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[２１]　 パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、ならびに（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベロープ発現ユニットおよびrevを含むrev発現ユニットを含むプラスミドの３つのプラスミドからなる、[１８]のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[２２]　レンチウイルスベクタープラスミド中の5'LTRおよび3'LTRが改変されている、[２０]または［２１］のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
[２３]　[１５]～[２２]のいずれかのキットに含まれるプラスミドおよびベクターを含む293T細胞。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-176230号の開示内容を包含する。
　293T細胞でレンチウイルスのパッケージングに必要な複数のプラスミドをコトランスフェクトするときに、HTLV-1 TaxもしくはNF-κB RelAを単独で同時発現させるか、あるいはHTLV-1 TaxとNF-κB RelA、HTLV-1 TaxとHIV-1 Tat、もしくはNF-κB RelAとHIV-1 Tatの２者を、あるいはHTLV-1 TaxとNF-κB RelAとHIV-1 Tatの３者を同時に発現させることにより、レンチウイルスベクターの産生を増強することができる。この本発明の方法により、レンチウイルスベクター産生が改善され、容易にかつ安全にレンチウイルスベクターを産生することができる。その結果、細胞培養およびトランスフェクション手順のコストの低減に貢献し、現在の濃縮および精製技術と組み合わせることにより、多種多様なインビトロおよびインビボでの応用に用いることができる。
　さらに、本発明の方法においては、Taxタンパク質がレンチウイルスベクター粒子に取り込まれないため、調製物の安全性が確保される。
代表的な第一世代、第二世代および第三世代のレンチウイルスベクターシステムの構造を示す図である。 VSV-G及びrevが１つのプラスミド中に含まれる第三世代のレンチウイルスベクターシステムの構造を示す図である。 TaxがHEK293T細胞においてCMVプロモーターを強く活性化することを示す図である。 レンチウイルスベクター産生細胞におけるTaxの共発現によるレンチウイルスベクターの産生増強を示す図である。 レンチウイルスベクター産生細胞におけるTax発現およびGag発現のレベルを示す図である。 Taxによる産生細胞からのウイルス放出の増強を示す図である。 Taxがレンチウイルスベクター粒子に取り込まれる可能性は低いことを示す図である。 HTLV-1 Tax（A)、HIV-1 Tat（B)またはNF-κB RelA（C)を単独で同時に発現させた場合のレンチウイルスベクターの産生増強効果を示す図である。 HTLV-1 TaxとHIV-1 Tat（A)、HTLV-1 TaxとNF-κB RelA（B)、またはNF-κB RelAとHIV-1 Tat（C)の２者を、あるいはHTLV-1 Tax、NF-κB RelA、HIV-1 Tatの３者（D)を同時に発現させた場合のレンチウイルスベクターの産生増強効果を示す図である。 pSVプラスミドの構造を示す図である。 実施例２で用いたトランスファープラスミドの構造を示す図である。 HIV-1 TatまたはNF-κB RelAの単独で又は同時に発現させた場合のレンチウイルスベクターの産生増強の結果を示す図である。 実施例３で用いたトランスファープラスミドの構造を示す図である。 レポーター遺伝子としてVenusを用いた場合の力価測定法の概要を示す図である。 レポーター遺伝子としてVenusを用いた場合の力価測定の結果（力価の絶対値）を示す図である。 レポーター遺伝子としてVenusを用いた場合の力価測定の結果（力価の増加程度）を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、レンチウイルスベクターの産生方法であり、レンチウイルスベクターの産生量を増強する方法である。
　本発明の方法においては、レンチウイルスベクターを産生する能力を有するパッケージング細胞として、293T（HEK293T)細胞を用い、293T細胞中でレンチウイルスを産生する際に、プロモーターに作用し、プロモーターを活性させる因子を共発現させる。プロモーターは限定されないが、例えば、CMVプロモーターが挙げられる。プロモーターを活性化する因子として、Tax、NF-κB RelA、HIV-1 Tat（以下、「HIV-1 Tat」または「Tat」と表記）、AP-1、CREB/ATF等が挙げられ、それらの１つ、を共発現させても、２個、３個、４個または５個の複数を組み合わせて共発現させてもよい。本発明においては、かかるプロモーターを活性化する因子として、Tax、NF-κB RelAおよびTatから選ばれる１つ以上の因子を共発現させることが好ましい。
　また、本発明の方法においては、レンチウイルスベクターを産生する能力を有するパッケージング細胞として、293T（HEK293T)細胞を用い、293T細胞中でレンチウイルスを産生する際に、Tax、NF-κB RelAなどの転写因子、Tatあるいはそれらの組み合わせを共発現させる。
　レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1)を基に開発された。
　レンチウイルスベクターを製造するためには、HIV-1プロウイルスゲノムを複数のプラスミドに分割して含ませ、各プラスミドを細胞にコトランスフェクト（同時（共）トランスフェクト）させればよい。この際、ウイルスゲノムのすべてを複数のプラスミドに分割して含ませる必要はなく、アクセサリー遺伝子等の遺伝子を除いたウイルスゲノムの一部を含んでいればよい。すなわち、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミドおよびレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミド（レンチウイルスベクタープラスミド）をパッケージング細胞にコトランスフェクトすればよい。レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質として、パッケージングに必要なgag、pol、tat、rev等のタンパク質、VSV-G（G glycoprotein of vesicular stomatitis virus：水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質)等のエンベロープ（env）タンパク質が挙げられる。VSV-Gは、広範囲な宿主域を持ち、物理的な強度が高いという点で好ましいが、他のエンベロープを用いることができる。gag遺伝子は、内部構造（細胞間質、キャプシドおよびヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし、pol遺伝子は、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。また、レンチウイルスベクタープラスミドは、パッケージングシグナル（Ψ）を含み目的遺伝子を挿入したプラスミドである。
　パッケージングに必要なgag、pol、tat、rev等のタンパク質をコードする核酸、VSV-G等のエンベロープ（env）タンパク質をコードする核酸は、複数のプラスミド、例えば、３～５個のプラスミド、好ましくは３または４個のプラスミドに分割して含ませ、それらの複数のプラスミドとレンチウイルスベクタープラスミドをコトランスフェクトすればよい。
　コトランスフェクトの結果、レンチウイルスベクタープラスミドから転写された組換えウイルスRNAゲノムが、パッケージングシグナル（Ψ）の作用でパッケージングタンパク質に取り込まれ、ウイルスコアが形成される。
　このように、ウイルス形成に必須のタンパク質をコードする核酸が異なるプラスミドに分散して含まれる結果、相同組換えにより野生型HIV-1が生成されるのを防止する。細胞に感染したレンチウイルスベクターは細胞中で自己複製できないので、非再感染性であり、安全である。
　例えば、レンチウイルスベクタープラスミド、gag、pol、tat、rev等のタンパク質をコードする核酸を含むプラスミド、およびVSV-G等のエンベロープ（env）タンパク質をコードする核酸を含むプラスミドを用いることができる。また、制御遺伝子であるrevやtatは他のプラスミドに分割してもよい。
　具体的には、（１）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（２）パッケージングに必要なgagおよびpolを含み、制御遺伝子であるrevおよびtatを含んでいてもよいパッケージングプラスミド、ならびに（３）VSV-G等のエンベロープ（env)をコードするenv遺伝子を含むenv発現プラスミド(エンベローププラスミド）の３つのプラスミドを用いることができる。さらに、（A)少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、（C）VSV-G等のエンベロープ（env)をコードするenv遺伝子を含むenv発現プラスミド(エンベローププラスミド）、ならびに（D）revを含むrev発現プラスミドの４つのプラスミドを用いてもよい。また、（A)少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、ならびに（C）VSV-G等のエンベロープ（env)をコードするenv遺伝子を含むenv発現ユニットおよびrevを含むrev発現ユニットを含むプラスミドの３つのプラスミドを用いてもよい。
　5'LTRおよび3'LTRは、改変されていてもよく、例えば、5'LTRおよび3'LTRのU3が欠失、あるいは変異していてもよく、この際、5'LTRのU3がCMVプロモーター等のプロモーターにより置換されていてもよい。
　細胞内でレンチウイルスベクターの産生に用いる上記の複数のプラスミドをレンチウイルス産生のためのパッケージングミックスという。
　好ましくは、レンチウイルスベクタープラスミド以外のプラスミドの3'末端側には、ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、poly A）を連結させる。ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を発現用カセットに含ませることにより、RNAの安定性や翻訳効率が向上する。
　上記のレンチウイルスベクタープラスミドは、パッケージングシグナル（Ψ）を含んだ両端のHIV-LTRの間に内部プロモーターと目的とする遺伝子が組込まれている。
　レンチウイルスベクタープラスミドおよびパッケージングプラスミドには、RRE(rev response element)が含まれていてもよい。
　また、各プラスミドの5'末端側にはプロモーターを連結させてもよい。さらに、上記のように、レンチウイルスベクタープラスミド中の目的遺伝子の上流にプロモーターを含む。用いるプロモーターは限定されず、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター（hCMV + イントロンプロモーター）、SV40プロモーター、UbCプロモーター、EF1aプロモーター、RSVプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、組織特異的なプロモーター、tet発現制御プロモーター等を用いることができるが、この中でもCMVプロモーターが好ましい。
　vif、vpr、vpu、vpx、nef等のHIVのアクセサリー遺伝子の少なくとも１つは除かれているか不活性化されていることが好ましい。
　さらに、レンチウイルスベクタープラスミドは、cPPT（central polypurine tract)やWPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)を含んでいてもよい。cPPTは逆転写効率を向上させ、WPREはRNAの発現効率を向上させる。
　プラスミド中の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
　レンチウイルスベクターを産生するためのレンチウイルスベクターシステムは、相同組換えによる野生型ウイルスの発生を防止するために、第一世代レンチウイルスベクターシステム、第二世代レンチウイルスベクターシステム、第三世代レンチウイルスベクターシステムと改良されていった。
　上記の（１）～（３）の３つのプラスミドを用いるレンチウイルスベクターシステムが第二世代レンチウイルスベクターシステムであり、（A)～（D)の４つのプラスミドを用いるレンチウイルスベクターシステムが第三世代レンチウイルスベクターシステムである。
　第三世代レンチウイルスベクターシステムにおいては、レンチウイルスベクタープラスミドの5'LTRのU3をCMVプロモーターに置換し、3'LTRのU3に変異を加えてそのプロモーター活性を無力化してもよい。このようなレンチウイルスベクタープラスミドをSIN（self inactivating)プラスミドと呼ぶ。5'LTRのU3をCMVプロモーターに置換した場合、tatは不要であり、パッケージングプラスミドからtatを除くことができると報告されている(MIYOSHI et al., J. Virol., 70, 8150, 1998; Dull et al., J. Virol., 72, 8463, 1998.)。第三世代レンチウイルスベクターはtatを含んでいないtat非依存性レンチウイルスベクターシステムとされている。
　図１－１に、代表的な第一世代レンチウイルスベクターシステム、第二世代レンチウイルスベクターシステム、第三世代レンチウイルスベクターシステムの構成を示す（Biochem J. (2012)443, 603-618より改変）。また、図１－２にVSV-G及びrevが１つのプラスミド中に含まれる第三世代のレンチウイルスベクターシステムの構成を示す。
　本発明においては、好ましくは第二世代レンチウイルスベクターシステム、または第三世代レンチウイルスベクターシステムを用いる。第二世代レンチウイルスベクターシステムはレンチウイルスベクターの産生量が高いという利点があり、第三世代レンチウイルスベクターシステムは安全性が高いという利点がある。
　本発明の方法においては、上記のレンチウイルスベクターシステムを構成するプラスミドを293T細胞でコトランスフェクトする際に、細胞中で同時にTax、NF-κB RelAなどの転写因子、Tat等を共発現させる。
　TaxはヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（HTLV-1）ウイルス遺伝子の転写活性化因子であり、AP-1、NF-κBおよびCREB/ATF等の転写因子を活性化し、活性化された転写因子がCMVプロモーター等のプロモーター中の結合配列に結合することによりプロモーターに作用して293T細胞にコトランスフェクトしたレンチウイルスベクターシステムを構成するプラスミドの発現を促進することにより、レンチウイルスベクターの産生を増強する。
　Taxを共発現させるには、レンチウイルスベクターシステムを構成するプラスミドの他に、Taxタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを293T細胞に共トラスフェクトして、共発現させればよい。発現ベクターとてレンチウイルスベクター以外のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ガンマレトロウイルス等を用いることもできる。Tax発現ベクター中のプロモーターも限定されず、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター（hCMV + イントロンプロモーター）、SV40プロモーター、EF1αプロモーター、RSVプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、組織特異的なプロモーター等を用いることができる。発現は一過性の発現でもよいし、恒常的な発現でもよい。恒常的な発現は、例えば、Taxタンパク質をコードする核酸を293T細胞のゲノムに組込めばよい。
　HTLV-1 Taxは強力なウイルストランス作用性タンパク質であるため、そのトランス作用性機能が十分であれば、レンチウイルスベクター粒子への組み込みは、標的細胞において望ましくない効果を引き出す可能性がある。本発明の方法においては、Taxはレンチウイルス粒子内への取り込みは認めない。
　さらに、レンチウイルスベクターシステムを構成するプラスミド中のCMVプロモーター等のプロモーターに作用する転写因子を共発現させてもよい。
　CMVプロモーター等のプロモーターにAP-1、NF-κBおよびCREB/ATF認識部位が存在するため、Taxをレンチウイルスベクター産生に利用することができる。これは、Taxがこれらの転写因子をすべて活性化するためである。少量のTaxを同時発現させると、産生細胞におけるGagの発現およびレンチウイルスベクター粒子の放出の両方が著しく増加し、形質導入効率が10倍を超えて増加する。活性化される転写因子の候補として、AP-1、NF-κBおよびCREB/ATFが挙げられる。上記のように、Taxは、AP-1、NF-κBおよびCREB/ATF等の転写因子を活性化し、活性化された転写因子がCMVプロモーター等のプロモーターに作用する。これらの転写因子を共発現させてもよく、これらの転写因子を共発現させた場合293T細胞中の転写因子の量が増加し、Taxにより活性化されやすくなり、結果的に293T細胞にコトランスフェクトしたレンチウイルスベクターシステムを構成するプラスミドの発現が促進され、レンチウイルスベクターの産生が増強されると期待できる。この場合、NF-κBは、転写活性化ドメインを含むNF-κB RelAを発現させればよい。
　また、Taxと共に、あるいはTaxと転写因子と共に、Tatを共発現させてもよい。TaxとTatを共発現させることにより、レンチウイルス産生が相加的に増強される。第三世代のレンチウイルスベクターシステムにはTat非依存性レンチウイルスベクターシステムであるが、第三世代のレンチウイルスベクターシステムにおいても、TaxおよびTatの共発現によりレンチウイルスベクター産生が増強される。
　転写因子およびTatの発現は、Taxの発現と同様の方法で行うことができる。すなわち、各タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを293T細胞に共トラスフェクトして、共発現させればよい。この際、それぞれを含む異なる複数のベクターを用いてもよいし、Tax、転写因子およびTatの２つ以上または全部を含むベクターを用いて共発現させてもよい。各プラスミドの投入量は適宜設定すればよく、Tax、TatおよびNF-κB RelAをコードする核酸をベクター量換算で同量、あるいは２から３倍程度の量比になるようにトランスフェクトすればよい。例えば、12 well plateを用いて共トラスフェクトする場合、TaxまたはTatをコードする核酸を含むベクターは0.1μｇ/12 well程度、NF-κB RelAをコードする核酸を含むベクターは0.1～0.2μｇ/12 well程度トランスフェクトすればよい。
　また、Tax、転写因子およびTatの少なくとも１つを同時発現させる場合、レンチウイルスの産生量が増大するので、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドの量を減らすことができる。例えば、従来法（レンチウイルスベクターの作製方法　三好浩之　http://cfm.brc.riken.jp/wp-content/uploads/Subteam_for_Manipulation_of_Cell_Fate_J/Protocols_J_files/Lentiviral%20vector%20prep.pdf)に比較して、1/2～1/3量で用いても従来法と同等以上のレンチウイルス産生量を達成することができる。この理由として、レンチウイルスベクター構成要素を発現させるためのプラスミド量を減らすことでレンチウイルスベクター産生細胞の状態がよくなること、およびCMV enhancer/promoterを活性化するだけで十分な最大効果が得られることが考えられる。
　上記のように、レンチウイルスベクターシステムを構成するプラスミドをパッケージング細胞である293T細胞にコトランスフェクトし、さらに、Tax、あるいはTaxとTatおよび／または転写因子を共発現させればよい。具体的には、Tax単独、RelA単独、TaxとTatの２種類、TaxとRelAの２種類、TatとRelAの２種類、TaxとTatとRelAの３種類を共発現させればよい。
　293T（HEK293T)細胞は、ヒト胎児の腎由来の細胞株である293細胞（HEK293細胞）の派生株であり、SV40 Large T抗原を発現する細胞株である。293T細胞は、市販されており、ATCC（American Type Culture Collection)等から入手可能である。本発明においては、293T細胞由来の派生細胞も用いることができ、そのような細胞として、Lenti-X(商標）293T細胞（タカラバイオ株式会社）が挙げられる。本発明においては、このような293T細胞の派生株も293T細胞と呼ぶ。
　プラスミドによる293T細胞のトランスフェクトは、公知の方法で行うことができる。例えば、遺伝子導入試薬を用いた方法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。遺伝子導入試薬としては、ポリエチレンイミン（PEI、直鎖型もしくは分岐型）や市販の遺伝子導入試薬が挙げられる。市販の遺伝子導入試薬として、Lipofectamine（登録商標）、Lipofectamine plus（登録商標）、jet PEI（登録商標）、TransIT（登録商標）、Ｘfect(商標）、Transfectin-Lipid（登録商標）、Oligofectamine（登録商標）、siLentFect（登録商標）、DMRIE-C（登録商標）、Effectene（登録商標）、FuGENE（登録商標）等を挙げることができる。ポリエチレンイミン（PEI)には、直鎖PEIと1級、2級、3級アミンを含む分岐PEIとが存在するがいずれも用いることができる。また、PEIの分子量も限定されない。さらに脱アシル化等の化学修飾されたPEIも用いることができる。
　293T細胞にコトランスフェクト後、数日間の培養後に培養上清を回収し、培養上清からレンチウイルス粒子を回収する。293T細胞の培養に用いる培地、培養条件は通常の動物細胞の培養に用いる培地、条件である。レンチウイルスを産生するための培養期間は、例えば12～72時間、好ましくは24～48時間である。この際、十分なタイターのウイルスベクターを回収するために、培養上清のタイター（力価）を測定するのが好ましい。ここで、十分なタイターとは、1×105IFU/mL以上、好ましくは５×105IFU/mL以上をいう。タイターは、リアルタイムRT-PCR、P24の測定ELISA、フローサイトメトリー等を用いて測定することができる。また、得られたレンチウイルスベクターの量を細胞への形質導入効率により確認することができる。
　本発明の方法により、レンチウイルスの産生量は、細胞、例えばルシフェラーゼレポーターアッセイによるMT-4細胞への形質導入効率を指標にした場合に、少なくとも３倍、好ましくは５倍、さらに好ましくは８倍、さらに好ましくは12倍、さらに好ましくは14倍、さらに好ましくは16倍、さらに好ましくは18倍、さらに好ましくは20倍、さらに好ましくは22倍、さらに好ましくは24倍増強される。Tax、Tat、転写因子の２種類または３種類を共発現させた場合の増強効果が大きく、TaxおよびTatを共発現させた場合には少なくとも５倍、TaxおよびRelAを共発現させた場合には少なくとも12倍、TatおよびRelAを共発現させた場合には少なくとも16倍、TaxおよびTatおよびRelAを共発現させた場合には、少なくとも22倍増強される。
　回収したレンチウイルスベクターは、超遠心分離等により濃縮、精製して用いることもできる。
　得られたレンチウイルスベクターは、凍結保存すればよい。
　このようにして得られたレンチウイルスベクターは、増殖中の細胞、増殖停止中の細胞を問わず哺乳類細胞への遺伝子導入に用いることができ、導入した遺伝子は宿主細胞のゲノムに安定に組込まれ、長期間の遺伝子発現が可能になる。従って、遺伝子治療用ベクターとして好適に用いることができる。
　本発明は、293T細胞を用いたレンチウイルスベクターの産生を増強するための試薬またはキットを包含する。
　該試薬またはキットは、上記のレンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミドおよびレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミド（レンチウイルスベクタープラスミド）を含むパッケージングミックスとHTLV-1 Taxを発現する発現ベクターを含む。該試薬またはキットは、さらにAP-1、NF-κBおよびCREB/ATFからなる群から選択される転写因子を発現する発現ベクターおよび／またはHIV-1 Tatを発現する発現ベクターを含んでいてもよい。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
[実施例１]　HTLV-1 Taxによるレンチウイルスベクター産生の増強
材料および方法
細胞
　10％ウシ胎仔血清（FBS）、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク）で細胞株HEK293T（Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA）を培養した。MT-4細胞は、10％FBS、100U/mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充した完全RPMI 1640培地（ナカライテスク）中に維持した。
プラスミド
　pCSII-CMV-MCS-IRES2-Bsd、pCAG-HIVgp、pCMV-VSV-G-RSV-Revは、文部科学省国立バイオ・リソース・プロジェクトを通じて理研BRCより提供された。pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsdを生成するために、pCSII-CMV-MCS-IRES2-BsdおよびpCMV-lucをXhoIおよびNotIで消化した。次いで、pCMV-luc由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子を保持するXhoI-NotIフラグメントをpCSII-CMV-MCS-IRES2-BsdのXhoI-NotI部位に挿入した。得られたプラスミドをpCSII-CMV-luc-IRES2-Bsdと命名した。pHCMV-VSV-GはDr. I.S.Y. Chenより供与された。pCMVdeltaR8.2、pCMV-Neo-Bam-Tax、pCMV-Neo-Bamは、Yamaoka, S. et al., Cell 93, 1231-1240 (1998)； Naldini, L. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 11382-11388 (1996)；Hironaka, N. et al., Neoplasia 6, 266-278, doi:10.1593/neo.03388 (2004)； Baker, S. J. et al., Science 249, 912-915 (1990) に記載の方法で調製した。
　また、pH2RneoTax、pSV2TatおよびpRC/CMVRelAは、それぞれ、Yamaoka et al., EMBO J. 15, 873-87, 1996； Subramani S et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854, 1981；Schmitz and Baeuerle, EMBO J., 10, 3805-3817,1991に記載の方法で調製した。
ウエスタンブロッティング
　溶解緩衝液（25mM Tris, pH7.8, 8mM MgCl2,1mM DTT、1％Triton-X100,15％グリセロール）を用いて細胞溶解物を調製した。タンパク質濃度はBradfordアッセイによって決定した。タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に移し、Taxに対するマウスモノクローナル抗体（MI73）(Mori, K. et al., The Journal of general virology 68 (Pt 2), 499-506, doi:10.1099/0022-1317-68-2-499 (1987).)、HIV-1 p24に対するマウスモノクローナル抗体（39/5.4A、Abcam, Inc.）、シクロフィリンAに対するウサギポリクローナル抗体（BML-SA296、Enzo Life Sciences、Inc.）またはαチューブリンに対するマウスモノクローナル抗体（DM1A、Sigma-Aldrich Co.）と反応させた。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG（A206PS、American Qualex International Inc.）またはヤギ抗ラットIgG（sc-2006、Santa Cruz Biotechnology）と共に膜をインキュベートし、Western Lightning Plus-ECL（PerkinElmer）によりタンパク質を視覚化した。
ウイルス液の準備
　Taxの存在下でのレンチウイルスベクターの産生のために、PEI(ポリエチレンイミン）を用いて6-well plate当たり1.4μgのpCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd、0.9μgのpCMVdeltaR8.2および0.4μgのpHCMV-VSV-GをpCMV-Neo-Bam-Taxおよび/またはpCMV-Neo-Bamとコトランスフェクトした。上清中のウイルスを、トランスフェクションの48時間後に収穫した。上清中のHIV-1キャプシド（CA）の量を、HIV-1 CA（p24）ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）（ZeptMetrix Corporation）によって定量した。
　また、Tax、TatまたはRelAを単独で、２種類を組合せて、あるいは３種類すべてを共発現させた。Tax、TatまたはRelA単独共発現、Tax、TatおよびRelAのうち２者共発現、Tax、TatおよびRelA３者共発現での第３世代レンチウイルスベクター産生量への効果は、PEIを用いて24-well plate当たり0.14μgのpCAG-HIVgp、0.14μgのpCMV-VSV-G-RSV-Rev、0.24μgのpCSII-CMV-luc-IRES2-Bsdと、それぞれの発現ベクターあるいはそのコントロール空ベクター(EV1、EV2およびEV3)を0.05μgコトランスフェクトした。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　レンチウイルスベクターを感染させた24穴プレート中の約2×105個のMT4細胞は、感染２４時間後に回収し、溶解緩衝液（25mMトリスpH7.8, 8mM MgCl2, 1mM DTT, 1％Triton-X100, 15％グリセロール）で溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性は、製造元のプロトコールおよびGloMax-Multi Detectionシステム（Promega Corp.）に従って測定した。
　ルシフェラーゼの活性は、Bradfordアッセイによって決定されたタンパク質濃度に対して標準化された。
レンチウイルスベクターの精製
　２mlの20％スクロース溶液をモデルSW55超遠心チューブの底に入れ、２mlのレンチウイルスベクター含有培養上清で重層した。次いで、試料を４℃、35,000rpmで60分間遠心分離した。ペレット化可能画分をPBS（-）に再懸濁し、ウエスタンブロッティングを行った。
結果
　HTLV-1 Taxは、レンチウイルスベクター産生を強く増強する。
　HEK293T細胞によるレンチウイルスベクターの産生は、ホタルルシフェラーゼ（pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd）、パッケージングプラスミド（pCMV deltaR8.2）および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を発現するプラスミド（pHCMV-VSV-G）を発現することができるレンチウイルストランスファーベクターをHEK293T細胞にCV（control vector：空ベクター）とコトランスフェクトすることにより行った。
　さらに、AP-1、NF-κBおよびCREB/ATFを同時に活性化するタンパク質は、効率的にレンチウイルス産生を増加させると仮定した。そのような候補タンパク質は、HTLV-1 Taxであり、AP-1、NF-κBおよびCREB/ATF19を含むいくつかの細胞転写因子を活性化することがよく知られている(Currer et al., Frontiers in Microbiology, 3, article 406, 2012)。以前の研究は、TaxがHEK293細胞でCMVプロモーターを活性化したが、HEK293T細胞では活性化しなかったことを報告している（Lwa, T.R. et al., Biotechnology progress 27, 751-756, doi:10.1002/btpr.571 (2011).)。しかし、本発明者らは、TaxがHEK293T細胞においてCMVプロモーターを強く活性化することを見出した。具体的には、約2×105個のHEK293T細胞に、レポーターベクターとして0.1μgのpCMV-lucおよび0.2μgのpCMV-Neo-Bam-Tax（Tax）または対照ベクター（CV）としてpCMV-Neo-Bamによりコトランスフェクトした。30μgの細胞溶解物を、抗HTLV-1Taxまたは抗-α-チューブリン抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した（図２下のパネル）。図２上のパネルは、ルシフェラーゼアッセイの結果をCVと比較した倍数で示す。バーは、3つの独立した実験から計算された標準誤差を示す。
　およそ1.5×106個のHEK293T細胞に、0.4μgのpHCMV-VSV-G、0.9μgのpCMVΔR8.2および1.4μgのpCSII-CMV-luc-IRES2-Bsdを、CVまたは順次増量させたpCMV-Neo-Bam-Taxのいずれかとコトランスフェクトした。エフェクタープラスミドの総量は0.4μgに調整した。トランスフェクションの48時間後に、レンチウイルスベクター含有培養上清を採取した。培養上清に曝露されたMT-4細胞における形質導入効率を、曝露の24時間後に評価した。ルシフェラーゼ活性はタンパク質濃度を用いて補正し、結果を対照（0μgのpCMV-Neo-Bam-Tax）と比較して倍数として示す。3回の独立した実験から計算された平均値および標準誤差が示されている。以後、レポーターアッセイの結果はタンパク質濃度を用いて補正した。レンチウイルスベクター産生細胞におけるTaxの共発現は、図３の感染細胞におけるルシフェラーゼ活性が示すように、レンチウイルスベクター産生の最大12倍の増加が認められた。
　トランスフェクションの48時間後に図３に示すトランスフェクト細胞を回収した。 同じセットの30μgの溶解産物を、抗HTLV-1 Taxおよび抗-α-チューブリン抗体または抗HIV-1p24および抗シクロフィリンA抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。図４に示すように、ウエスタンブロッティングにより、産生細胞におけるTax発現の用量依存的増加が確認された。産生細胞におけるGagの発現レベルは、レンチウイルスベクター形質導入の結果とよく相関した。
　Taxが産生細胞からのウイルス放出を増加させるかどうかを評価するために、特異的ELISAを用いてHIV-1 Gagの濃度を測定した。トランスフェクトした細胞の上清中のGagタンパク質の量をHIV-1 CA（p24）ELISAで定量し、その結果を対照（0μgのpCMV-Neo-Bam-Tax）と比較した倍数で示す。3つの独立した実験から計算された平均値および標準誤差が示されている。図５に示すように、上清中のGagの量は、Taxの存在下で同様に上昇し、産生細胞における形質導入効率およびGag発現レベルとよく相関した（図３および４）。
　最後に、安全性と汚染除去の観点から、Taxがレンチウイルスベクター粒子に組み込まれているかどうかを検討した。
　HTLV-1 Taxは強力なウイルストランス作用性タンパク質であるため、そのトランス作用性機能が十分であれば、レンチウイルスベクター粒子への混入は、標的細胞において望ましくない効果を引き出す可能性がある。
　培養上清中のウイルス粒子を、スクロースクッションを通してペレットとして超遠心分離によって回収した。すなわち、20％スクロースによる超遠心分離により、レンチウイルス粒子を回収した。次いで、細胞溶解物およびペレット化ウイルス粒子の両方をウエスタンブロッティングに供した。同じセットの30μgの溶解産物を、抗HTLV-1 Taxおよび抗-α-チューブリン抗体もしくは抗HIV-1p24および抗シクロフィリンA抗体でウエスタンブロッティングに供した。図６に示すように、Taxタンパク質は、超遠心分離によって得られたペレットにおけるウエスタンブロッティングによって検出されなかった。この結果は、Taxがレンチウイルスベクター粒子に取り込まれる可能性が著しく低いことを示唆している。
　本実施例は、HTLV-1 Taxなどの転写活性化因子の共発現が、産生細胞におけるウイルスタンパク質の発現を増強することによってレンチウイルスベクター産生を大幅に改善することを示した（図２～６）。Taxは、CMVプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子発現を増強し（図２）、さらに産生細胞におけるGag発現を増強した。これは、レンチウイルスベクター形質導入の結果とよく相関した（図３および４）。本実施例における実験環境において、CMVプロモーターは、レンチウイルストランスファーベクター（pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd）、パッケージングプラスミド（pCMVdeltaR8.2）およびエンベロープを発現するプラスミド（pHCMV-VSV-G）を駆動する。したがって、これらの結果は、これらのプラスミドからの遺伝子発現の増強が、レンチウイルスベクターの効率的な産生をもたらしたことを強く示唆する。しかしながら、正式には、Taxが、ある種の宿主HIV-1依存性因子の発現を活性化し、次いで、増強されたレンチウイルス発現に寄与する可能性もあり得る。注目すべきことに、Tax発現ベクター0.4μgをコトランスフェクトした場合、レンチウイルスベクター産生はピークから低下した（図３）。この結果は、過剰量のプラスミドは、レンチウイルスベクター産生に悪影響を及ぼし得ることを示す。実際、このような条件下では、産生細胞におけるGagの発現は減少した（図４）。
[実施例２]　HTLV-1 Tax、TatまたはNF-κB RelAの単独で又は同時に発現させた場合のレンチウイルスベクターの産生増強
　次いで、第３世代レンチウイルスベクターシステムpCAG-HIVgp、pCMV-VSV-G-RSV-Rev、pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsdを用いて、以下の組み合わせの共発現によるレンチウイルスベクター産生増大効果を、MT4細胞におけるルシフェラーゼ活性を指標に検討した（図７）。
　図７－１に、Tax単独共発現（図７－１A）、Tat単独共発現（図７－１B)および RelA単独共発現（図７－１C)での第３世代レンチウイルスベクター産生量への効果を示す。
　図７－２に、Tax, Tat, RelAのうち２者共発現（図７－２A；TaxおよびTat、図７－２B；TaxおよびRelA、図７－２C；TatおよびRelA）での第３世代レンチウイルスベクター産生量への効果を示す。
　図７－２Dに、Tax、Tatおよび RelA３者共発現での第３世代レンチウイルスベクター産生量への効果を示す。
　図７－１に示すように、単独共発現の場合、Taxで4.8倍、Tatで5.1倍、RelAで15.6倍のレンチウイルスベクター産生増大効果が得られ、また、図７－２に示すように、２者共発現の場合、Tax + Tatで5.8倍、Tax + RelAで14.0倍、Tat + RelAで17.1倍のレンチウイルスベクター産生増大効果が得られ、３者共発現の場合、Tax + Tat + RelAで24.9倍のレンチウイルスベクター産生増大効果が得られた。倍率は空ベクター（EV1、EV2およびEV3)を用いた場合の値に対するfold inductionを示す。
[実施例３]　TatまたはNF-κB RelAの単独で又は同時に発現させた場合のレンチウイルスベクターの産生増強
（１）　Human Embryonic Kidney (HEK) 293T細胞をコラーゲンでコートした24-wellプレートに、0.5 mLの10%牛胎児血清入りDMEMを用いて3.0 × 105 細胞/wellで播種・接着させた。
（２）　２時間後に、以下のプラスミドをOpti-MEM（Gibco） 900μLと混合し、1μg/μL Polyethylenimine (PEI)を30μL加え３０分間室温でインキュベートした後、細胞に滴下した。
(i) 0.25 μg pCAG-HIVgp
(ii) 0.125 μg pCMV-VSV-G-RSV-Rev
(iii) 0.375 μg pCSII-CMV-luc-IRES2-Bsd
(iv) 0.05 μg pSV2TatもしくはpSV2
(v) 0.025 μg pRC/CMVRelAもしくはpRC/CMV（Invitrogen社製）
　pSVプラスミドの構造を図８に示す。
（３）　２４時間後、培養液を交換した。
（４）　４８時間後にレンチウイルスベクターを含む培養上清を回収し、0.22μmフィルター（Millex）濾過後、直ちにそのうち100μLを用いて2 × 105 MT4細胞（ヒトT細胞株）に感染させた。
（５）　２４時間後、MT4細胞を遠心回収し、TritonX 1%を含むバッファー（25mMトリスpH7.8，8mM MgCl2，1mM DTT，1%Triton-X100，15%グルセロール）50μLで溶解した。遠心後、その20μLを用いて実施例２と同様にルシフェラーゼアッセイを行い、製造元のプロトコールおよびGloMax-Multi Detectionシステムに従って測定した。
　図９に(iii)のトランスファープラスミド（導入遺伝子を含むウイルスベクターのゲノムを発現）の構造を示す。図１０にルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図１０に示すようにTat単独発現で４倍程度、RelA単独発現で５倍程度、両者共発現で１１倍程度、感染標的細胞における遺伝子（ルシフェラーゼ）発現量が増加した。
　[実施例４]　レポーター遺伝子としてVenusを用いた場合のTat、RelA、Tat＋RelAを共発現させた場合の測定力価
（１）　Human Embryonic Kidney (HEK) 293T細胞をコラーゲンでコートした24-wellプレートに、0.5 mLの10%牛胎児血清入りDMEMを用いて3.0 × 105 細胞/wellで播種・接着させた。
（２）　２時間後に、以下のプラスミドをOpti-MEM 900μLと混合し、1μg/μL Polyethylenimine (PEI)を30μL加え３０分間室温でインキュベートした後、細胞に滴下した。
(i) 0.25 μg pCAG-HIVgp
(ii) 0.125 μg pCMV-VSV-G-RSV-Rev
(iii) 0.375 μg pCSII-CMV-HSVTK -IRES2-Venus
(iv) 0.05 μg pSV2TatもしくはpSV2
(v) 0.025 μg pRC/CMVhRelAもしくはpRC/CMV
　pCSII-CMV-HSVTK -IRES2-Venusは以下の方法により作製した。
　CSII-CMV-RfA-IRES2-Venus (from Dr. Hiroyuki Miyoshi, RIKEN)のNheI認識サイトとBamHI認識サイトの間に、pNL4-3tk (Hori et al., JVI 2013) を鋳型にPCRにより増幅したHSV-1由来のTK (thymidine kinase) DNA断片を挿入した。
　PCRで使用したプライマーは、以下の通りであった。
5’-TK in CSII NheI: GCTCTAGAGCTAGCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAACAC（配列番号３）
3’-TK in CSII BamHI: CGCGGATCCTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCC（配列番号４）
（３）　２４時間後、培養液を交換する。
（４）　４８時間後にレンチウイルスベクターを含む培養上清を回収し、0.22μmフィルター濾過後、直ちに培養上清を８分の１から６４分の１まで２倍ずつ段階希釈してそのうち10μL用いて1 × 105 MT4細胞（ヒトT細胞株）に感染させた。
（５）　４８時間後、FACS解析装置（BECTON DICKINSON社のFACSCalibur）用いてVenus蛍光陽性細胞の割合を測定した。
　図１１に(iii)のトランスファープラスミド（導入遺伝子を含むウイルスベクターのゲノムを発現）の構造を示す。
　図１２にレポーター遺伝子としてVenusを用いた場合の力価測定法の概要を示す。
　図１３及び図１４に力価測定の結果を示す。図１３は力価の絶対値（レンチウイルスベクターの力価）を示し、図１４はコントロールベクターを用いた場合の力価を100％とした場合の力価の増加程度を示す。図１３及び１４に示すようにTat単独で３倍程度、RelA単独発現で４倍程度、両者共発現で６倍程度の力価上昇が見られ、2 × 107 Transduction Unit (TU)/mLの高力価を達成した。
　本発明の方法により、遺伝子治療等に用い得る遺伝子導入用のレンチウイルスベクターを安全に高い効率で産生することができる。
配列番号１　プライマー
配列番号２　プライマー
配列番号３　プライマー
配列番号４　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (23)

  1. 　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスで293T細胞をコトランスフェクトするときに、同時にプロモーターを活性化する因子を発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、レンチウイルスベクターを産生する方法。
  2. 　プロモーターを活性化する因子が、CMVプロモーターを活性化する因子である、請求項１記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  3. 　プロモーターを活性化する因子が、HTLV-1 Tax、HIV-1 Tat、NF-κB RelA、AP-1及びCREB/ATFからなる群から選択される１つまたは複数である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスで293T細胞をコトランスフェクトするときに、同時に293T細胞中でHTLV TaxまたはNF-κB RelAを発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、請求項１～３のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  5. 　レンチウイルスベクターを産生する方法であって、レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックスで293T細胞をコトランスフェクトするときに、同時に293T細胞中でHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAからなる群から選択される２種類、あるいはHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAの３種類を発現させることによりレンチウイルスベクター産生量を増強させる、請求項１～３のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  6. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、ならびにgag、pol、revおよびenvを分割して含む複数のプラスミドからなる、請求項４または５に記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  7. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（１）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（２）パッケージングに必要なgagおよびpolを含み、制御遺伝子であるrevおよびtatを含んでいてもよいパッケージングプラスミド、ならびに（３）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミドの３つのプラスミドからなる、請求項６記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  8. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、ならびに（D）revを含むrev発現プラスミドの４つのプラスミドからなる、請求項６記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  9. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、ならびに（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベロープ発現ユニットおよびrevを含むrev発現ユニットを含むプラスミドの３つのプラスミドからなる、請求項６記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  10. 　レンチウイルスベクタープラスミド中の5'LTRおよび3'LTRが改変されている、請求項８または９に記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  11. 　Taxがレンチウイルスベクター中に取り込まれない、請求項３～１０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを産生する方法。
  12. 　レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックス、およびプロモーターを活性化する因子をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、293T細胞中でレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  13. 　プロモーターを活性化する因子が、CMVプロモーターを活性化する因子である、請求項１２記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  14. 　プロモーターを活性化する因子が、HTLV-1 Tax、HIV-1 Tat、NF-κB RelA、AP-1及びCREB/ATFからなる群から選択される１つまたは複数である、請求項１２または１３に記載のキット。
  15. 　レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックス、およびHTLV-1 TaxまたはNF-κB RelAをコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の293T細胞中でレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  16. 　レンチウイルスの粒子の形成に必須であるタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のプラスミド、ならびにレンチウイルスの粒子に取り込まれるRNAを転写する遺伝子および発現させようとする目的導入遺伝子を含むプラスミドを含むパッケージングミックス、ならびにHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAからなる群から選択される２種類、あるいはHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAの３種類をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の293T細胞中でレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  17. 　HTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAからなる群から選択される２種類、あるいはHTLV-1 Tax、HIV-1 TatおよびNF-κB RelAの３種類をコードする遺伝子を含む発現ベクターが別々のベクターである、請求項１６記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  18. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、ならびにgag、pol、revおよびenvを分割して含む複数のプラスミドからなる、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  19. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（１）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（２）パッケージングに必要なgagおよびpolを含み、制御遺伝子であるrevおよびtatを含んでいてもよいパッケージングプラスミド、ならびに（３）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミドの３つのプラスミドからなる、請求項１８記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  20. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、ならびに（D）revを含むrev発現プラスミドの４つのプラスミドからなる、請求項１８記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  21. 　パッケージングミックスを構成する複数のプラスミドが、（A）少なくともLTR（5'LTRおよび3'LTR）、パッケージングシグナル（Ψ）および目的導入遺伝子（トランスジーン）を含むレンチウイルスベクタープラスミド、（B）パッケージングに必要なgagおよびpolを含むパッケージングプラスミド、ならびに（C）VSV-Gをコードする遺伝子を含むエンベロープ発現ユニットおよびrevを含むrev発現ユニットの３つのプラスミドからなる、請求項１８記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  22. 　レンチウイルスベクタープラスミド中の5'LTRおよび3'LTRが改変されている、請求項２０または２１に記載のレンチウイルスベクターを産生するためのキット。
  23. 　請求項１５～２２のいずれか１項に記載のキットに含まれるプラスミドおよびベクターを含む293T細胞。
PCT/JP2019/036929 2018-09-20 2019-09-20 レンチウイルスベクター産生の増強方法 Ceased WO2020059848A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020549114A JP7538531B2 (ja) 2018-09-20 2019-09-20 レンチウイルスベクター産生の増強方法
US17/277,618 US20210348192A1 (en) 2018-09-20 2019-09-20 Method for increasing lentiviral vector production
CN201980076169.6A CN113166782A (zh) 2018-09-20 2019-09-20 增强慢病毒载体产生的方法
EP19863931.2A EP3854879A4 (en) 2018-09-20 2019-09-20 METHOD OF INCREASING THE PRODUCTION OF LENTIVIRUS VECTORS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-176230 2018-09-20
JP2018176230 2018-09-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020059848A1 true WO2020059848A1 (ja) 2020-03-26

Family

ID=69887202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/036929 Ceased WO2020059848A1 (ja) 2018-09-20 2019-09-20 レンチウイルスベクター産生の増強方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210348192A1 (ja)
EP (1) EP3854879A4 (ja)
JP (1) JP7538531B2 (ja)
CN (1) CN113166782A (ja)
WO (1) WO2020059848A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022170641A (ja) * 2021-04-28 2022-11-10 沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司 レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4448776A1 (en) * 2021-12-16 2024-10-23 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd Antisense transfer vectors and methods of use thereof
CN116254298B (zh) * 2022-09-28 2023-10-13 云舟生物科技(广州)股份有限公司 一种慢病毒包装试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054467A1 (ja) * 2003-12-03 2005-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系
WO2014092094A1 (ja) * 2012-12-11 2014-06-19 タカラバイオ株式会社 発現カセット
JP2018176230A (ja) 2017-04-14 2018-11-15 株式会社三井ハイテック 金属製品の製造方法及び金属製品

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997014809A2 (en) * 1995-10-16 1997-04-24 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
JP2001510053A (ja) * 1997-07-18 2001-07-31 カイロン コーポレイション レンチウイルスベクター
WO2000000600A2 (en) * 1997-09-22 2000-01-06 Chang Lung Ji Lentiviral vectors, comprising modified major donor splice sites and major packaging signals
EP1412493B1 (en) * 2001-08-02 2011-10-05 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
EP1835032A1 (en) * 2006-03-14 2007-09-19 Université de Liège A self-inactivating recombinant lentiviral vector for the inhibition of HIV replication
US20110104789A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Yuntao Wu Non-integrating rev-dependent lentiviral vector and methods of using the same
DK2480677T3 (en) * 2010-09-02 2015-06-15 Molmed Spa Semi-stable production of lentiviral vectors
US20120083035A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 Dharmacon, Inc. Modified Cell Lines for Increasing Lentiviral Titers
PT2782997T (pt) * 2011-11-24 2018-04-09 Genethon Sistema de produção de vetor lentiviral escalável compatível com aplicações farmacêuticas industriais
US11208669B2 (en) * 2016-01-12 2021-12-28 University Of Cincinnati Lentivirus packaging system comprising a synthetic positive feedback loop

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054467A1 (ja) * 2003-12-03 2005-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系
WO2014092094A1 (ja) * 2012-12-11 2014-06-19 タカラバイオ株式会社 発現カセット
JP2018176230A (ja) 2017-04-14 2018-11-15 株式会社三井ハイテック 金属製品の製造方法及び金属製品

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANSORGE. S. ET AL., THE JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. 11, 2009, pages 868 - 876
BAKER, S. J. ET AL., SCIENCE, vol. 249, 1990, pages 912 - 915
BIOCHEM J., vol. 443, 2012, pages 603 - 618
BURNS, J. C. ET AL., PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 90, 1993, pages 8033 - 8037
CURRER ET AL., FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 3, 2012
DE VRIES ET AL., GENE THERAPY, vol. 15, 2008, pages 545 - 552
DUNBAR, C.E. ET AL., SCIENCE, vol. 359, 2018
ELLIS, B. L. ET AL., HUMAN GENE THERAPY, vol. 22, 2011, pages 93 - 100
HIRONAKA, N. ET AL., NEOPLASIA, vol. 6, 2004, pages 266 - 278
LWA, T.R. ET AL., BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 27, 2011, pages 751 - 756
MATRAI ET AL., MOLECULAR THERAPY: THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY, vol. 18, 2010, pages 477 - 490
MCCARRON, A. ET AL., JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 240, 2016, pages 23 - 30
MIYOSHI ET AL., J. VIROL., vol. 72, 1998, pages 8463
MORI, K. ET AL., THE JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 68, 1987, pages 499 - 506
NALDINI, L. ET AL., PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 93, 1996, pages 11382 - 11388
SAKUMA T. ET AL.: "Lentiviral vectors: basic to translational", BIOCHEM. J., vol. 443, 2012, pages 603 - 618, XP055258613, DOI: 10.1042/BJ20120146 *
SCHMITZBAEUERLE, EMBO J., vol. 10, 1991, pages 3805 - 3817
See also references of EP3854879A4
SHOJI, T. ET AL., CYTOTECHNOLOGY, vol. 67, 2015, pages 593 - 600
SUBRAMANI S ET AL., MOL. CELL. BIOL., vol. 1, 1981, pages 854
TAKARA: "pHEK293 Ultra Expression Vector I pHEK293 Ultra Expression Vector II", vol. 12, 2016, pages 1 - 11, XP055799261, Retrieved from the Internet <URL:http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/3390_3392_j.pdf> [retrieved on 20191206] *
TORRES L. ET AL.: "Immediate-Early (IE) gene regulation of cytomegalovirus: IE 1- and pp71-mediated viral strategies against cellular defenses", VIROLOGICA SINICA, vol. 29, no. 6, 2014, pages 343 - 352, XP035415888, DOI: 10.1007/s12250-014-3532-9 *
YAMAOKA ET AL., EMBO J., vol. 15, 1996, pages 873 - 87
YAMAOKA, S. ET AL., CELL, vol. 93, 1998, pages 1231 - 1240

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022170641A (ja) * 2021-04-28 2022-11-10 沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司 レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法
AU2021206846B2 (en) * 2021-04-28 2023-07-13 Pell Bio-Med Technology Co., Ltd Lentivirus packaging system, method for improving lentivirus production in a host cell, and method for treating cancer
JP2024028802A (ja) * 2021-04-28 2024-03-05 沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司 レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法
US11993782B2 (en) 2021-04-28 2024-05-28 PELL Bio-Med Technology Co., Ltd. Lentivirus packaging system, lentivirus produced by the same, cell transduced by the lentivirus, method for improving lentivirus production in a host cell, and method of using the cell for treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
EP3854879A4 (en) 2022-06-22
EP3854879A1 (en) 2021-07-28
JP7538531B2 (ja) 2024-08-22
US20210348192A1 (en) 2021-11-11
CN113166782A (zh) 2021-07-23
JPWO2020059848A1 (ja) 2021-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kafri et al. A packaging cell line for lentivirus vectors
Dull et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system
Yang et al. Inducible, high-level production of infectious murine leukemia retroviral vector particles pseudotyped with vesicular stomatitis virus G envelope protein
US11667929B2 (en) Retroviral vectors
Prel et al. Highly efficient in vitro and in vivo delivery of functional RNAs using new versatile MS2-chimeric retrovirus-like particles
Cockrell et al. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors
AU2016359838B2 (en) Transient transfection method for retroviral production
Kafri Gene delivery by lentivirus vectors: an overview
Rohll et al. [27] Design, production, safety, evaluation, and clinical applications of nonprimate lentiviral vectors
JP6975643B2 (ja) レンチウイルスベクターのバイオ生産法
US20170362607A1 (en) Use of non-subtype b gag proteins for lentiviral packaging
JP7538531B2 (ja) レンチウイルスベクター産生の増強方法
Berg et al. Rapid establishment of stable retroviral packaging cells and recombinant susceptible target cell lines employing novel transposon vectors derived from Sleeping Beauty
US9840720B2 (en) Materials and methods relating to packaging cell lines
Wolkowicz et al. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells
Chang et al. Self-inactivating lentiviral vectors and a sensitive Cre-loxP reporter system
Rizvi et al. Role of a heterologous retroviral transport element in the development of genetic complementation assay for mouse mammary tumor virus (MMTV) replication
Mukherjee et al. A HIV-2-based self-inactivating vector for enhanced gene transduction
US6613569B1 (en) Inducible packaging cell lines for lentivirus vectors
WO2001004360A2 (en) Retroviral recombination assays and uses thereof
EP1283895A2 (en) Retroviral vectors comprising an enhanced 3&#39; transcription termination structure
Shinoda et al. Efficient transduction of cytotoxic and anti-HIV-1 genes by a gene-regulatable lentiviral vector
Guibinga et al. Preparation of pseudotyped lentiviral vectors resistant to inactivation by serum complement
Nogueira Pseudotyped lentiviral vectors for gene therapy: impact of envelope glycoproteins
Bouter Generation of a packaging cell line for the production of gamma retroviral vectors

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19863931

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020549114

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019863931

Country of ref document: EP

Effective date: 20210420

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2019863931

Country of ref document: EP