WO2020066396A1 - 心毒性評価方法 - Google Patents

心毒性評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020066396A1
WO2020066396A1 PCT/JP2019/033022 JP2019033022W WO2020066396A1 WO 2020066396 A1 WO2020066396 A1 WO 2020066396A1 JP 2019033022 W JP2019033022 W JP 2019033022W WO 2020066396 A1 WO2020066396 A1 WO 2020066396A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
polymer
alicyclic structure
cardiotoxicity
containing polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/033022
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
慧 足達
祐子 関野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zeon Corp
Original Assignee
Zeon Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeon Corp filed Critical Zeon Corp
Priority to EP19865332.1A priority Critical patent/EP3859005A4/en
Priority to JP2020548180A priority patent/JP7384167B2/ja
Priority to US17/278,823 priority patent/US20220034868A1/en
Priority to CN201980026140.7A priority patent/CN111989405A/zh
Publication of WO2020066396A1 publication Critical patent/WO2020066396A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating drug-induced cardiotoxicity for predicting side effects and determining doses to humans before clinical trials, especially for new drugs, and in particular, from cardiomyocytes due to contact with drugs.
  • the present invention relates to a method for evaluating cardiotoxicity by measuring secreted heart disease biomarkers.
  • Patent Literature 1 describes a method for accurately measuring the amount of BNP in blood by using a BNP measurement standard that is close to an actual sample.
  • Patent Document 2 describes that in-vitro differentiated cardiomyocytes are used for drug screening, and their efficacy and toxicity are evaluated.
  • JP 2014-32062 A Japanese Patent Publication No. 2007-537429
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and has as its object to provide a cardiotoxicity evaluation method for measuring a biomarker of a heart disease with high accuracy.
  • the present inventors use a culture vessel composed of an alicyclic structure-containing polymer, and the surface free energy of the culture surface is within a specific range, the reproducibility of biomarkers secreted from cells
  • the inventors have found that high measurement is possible, and have completed the present invention.
  • the surface free energy is a criterion determined by measuring how much ink or the like adheres to the surface of plastic or metal.
  • the unit is represented by mN / m, and the higher the value of surface free energy, the higher the adhesiveness.
  • one aspect of the present invention is to seed a cardiomyocyte together with a medium in a culture vessel, Adding a drug to the culture medium in the culture vessel, contact the drug with the cardiomyocytes, and then evaluate the cardiotoxicity of the drug by measuring a biomarker of heart disease secreted from the cardiomyocytes,
  • a method for evaluating cardiotoxicity wherein at least the culture surface of the culture vessel is composed of an alicyclic structure-containing polymer, and the surface free energy of the culture surface is 30 to 37 mN / m.
  • cardiomyocytes are secreted in response to the drug. Variations in the measured values of biomarkers for heart disease are reduced, and highly reproducible measurements can be performed.
  • the cardiomyocytes are preferably pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • it is preferably an induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte. Because there is no ethical problem and stable supply can be expected, highly accurate measurement can be performed even when the measurement is performed for a long time.
  • the heart disease is heart failure
  • the biomarker of the heart failure is a natriuretic peptide
  • the polymer having an alicyclic structure is preferably a hydrogenated norbornene ring-opening polymer. This is because, when the culture surface of the culture vessel is made of a hydrogenated norbornene ring-opening polymer among the alicyclic structure-containing polymers, the variation in the measured value of the biomarker amount for heart disease is significantly reduced.
  • a biomarker for heart disease can be measured with high accuracy.
  • FIG. 1 is a graph showing the difference in BNP concentration before and after adding doxorubicin in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the difference in BNP concentration before and after doxorubicin addition in Comparative Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the difference in BNP concentration before and after doxorubicin addition in Comparative Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the difference in BNP concentration before and after doxorubicin addition in Comparative Example 3.
  • the surface free energy of a surface (hereinafter, referred to as a “culture surface”) of a cell in contact with an inner surface of a culture container is within a specific range, and the culture surface is oily. It is characterized in that a culture vessel composed of a polymer having a ring structure is used. By using such a culture vessel, the cells can be adhered to the culture surface without applying unnecessary stress to the cells, thereby minimizing the variation of the biomarkers secreted from the cells. It is thought that it is possible.
  • the cells used in the present invention are cardiomyocytes, and include, for example, pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (among others, induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes), embryonic stem cell-derived cardiomyocytes, and human-derived cardiomyocytes.
  • pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes among others, induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • embryonic stem cell-derived cardiomyocytes embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • human-derived cardiomyocytes human-derived cardiomyocytes.
  • the medium for culturing the cells is not particularly limited as long as the cardiomyocytes can be cultured and maintained, and a commercially available cardiomyocyte culture medium can be used.
  • Additives can be added to the medium. Examples of the additives include minerals, metals, and vitamin components. These additives can be used alone or in combination of two or more.
  • ⁇ There is no particular limitation on the method of seeding the cells in a culture vessel.
  • at least the culture surface is coated with an extracellular matrix or the like, if necessary.
  • the cells suspended in the medium are seeded in a culture container with a pipette or the like, and the container is rocked as necessary to evenly disperse the cells in the culture container, and then allowed to stand in an incubator.
  • the extracellular matrix include naturally occurring or synthetic ones such as gelatin, fibronectin, vitronectin, and laminin.
  • the method of coating the culture surface with the extracellular matrix is the same as the method of coating a general cell substrate on a culture vessel, and usually, the above-mentioned coating agent is put in the culture vessel, and at a temperature near the culture temperature, In general, a method is employed in which the coating agent is allowed to stand for 10 minutes to 5 hours, preferably 30 minutes to 2 hours, and brought into contact with the culture surface, and then the coating agent is removed. If the contact time is too short, the coating will be insufficient. On the other hand, the protein absorptivity to the alicyclic structure-containing polymer constituting the culture surface is low, and it does not adsorb multiple layers like polystyrene. Therefore, it is not necessary to make the contact time longer than the above time. After removing the coating agent, it is desirable to add a medium immediately to prevent drying.
  • the amount of the coating agent added to the culture container is 1.5 to 1.5 times the amount of the coating agent added to a general polystyrene cell culture container. It is desirable to add about 3 times as much, specifically 0.15 to 0.30 ml per 1 cm 2 of the culture surface.
  • a novel drug is added to the medium, and the medium is brought into contact with the cells to evaluate the secretion of the biomarker. Whether the above method is effective or not can be confirmed, for example, by comparing the secretion of biomarkers of heart disease with drugs with known cardiotoxicity such as doxorubicin, endothelin, trastuzumab and the like.
  • the biomarkers for heart disease measured in the present invention include atrial natriuretic peptide (ANP), cerebral natriuretic peptide (BNP) (hereinafter referred to as “BNP”), C-type natriuretic peptide (CNP), Biomarkers for heart failure such as natriuretic peptides such as precursors and degradation products; biomarkers for myocardial infarction such as troponin T, troponin I, myoglobin, and CK-MB; and the like.
  • the biomarker for heart failure has a remarkable effect of reducing variation in measured values. From such a viewpoint, brain natriuretic peptides such as BNP and N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) are particularly preferable, and BNP is particularly preferable.
  • any shape can be used as long as the alicyclic structure-containing polymer can be used as a material for the culture vessel.
  • the shape of the culture vessel include a dish, a plate, a microchannel chip, a bag, a tube, a scaffold, a cup, and a jar fermenter. It is sufficient that at least the culture surface of the culture vessel is made of an alicyclic structure-containing polymer.
  • the bottom surface inside each well may be formed of an alicyclic structure-containing polymer.
  • the innermost layer may be formed of a film made of an alicyclic structure-containing polymer.
  • the entire culture vessel may be made of an alicyclic structure-containing polymer.
  • the entire container can be formed of the alicyclic structure-containing polymer by molding these containers entirely with the alicyclic structure-containing polymer. .
  • the alicyclic structure-containing polymer is a resin having an alicyclic structure in a main chain and / or a side chain. From the viewpoint of mechanical strength, heat resistance, and the like, a polymer having an alicyclic structure in a main chain is preferable, From the viewpoint of differentiation induction efficiency, those having no polar group are more preferable.
  • the polar group refers to an atomic group having polarity. Examples of the polar group include an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, and an acid anhydride group.
  • Examples of the alicyclic structure include a saturated cyclic hydrocarbon (cycloalkane) structure and an unsaturated cyclic hydrocarbon (cycloalkene) structure. From the viewpoint of mechanical strength, heat resistance, and the like, a cycloalkane structure and a cycloalkene are preferable. Structures are preferred, and those having a cycloalkane structure are most preferred.
  • the number of carbon atoms constituting the alicyclic structure is not particularly limited, but is usually 4 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 5 to 15 carbon atoms. When the number of carbon atoms constituting the alicyclic structure is within this range, the mechanical strength, heat resistance, and moldability characteristics are highly balanced, which is preferable.
  • the proportion of the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer may be appropriately selected depending on the purpose of use, but is usually 30% by weight or more, preferably 50% by weight or more, more preferably 70% by weight. % Or more. If the proportion of the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer is too small, the heat resistance is poor, which is not preferable.
  • the remainder other than the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer is not particularly limited, and is appropriately selected depending on the purpose of use.
  • the alicyclic structure-containing polymer examples include (1) a norbornene-based polymer, (2) a monocyclic cycloolefin-based polymer, (3) a cyclic conjugated diene-based polymer, and (4) a vinyl alicyclic carbonized polymer. And hydrogenated polymers and hydrides of (1) to (4).
  • a norbornene-based polymer and a hydride thereof are preferable from the viewpoint of heat resistance, mechanical strength, and the like.
  • norbornene-based polymer The norbornene-based polymer is obtained by polymerizing a norbornene-based monomer that is a monomer having a norbornene skeleton, and is obtained by ring-opening polymerization and by addition polymerization. It is roughly divided into things.
  • ring-opened polymers of norbornene-based monomers and ring-opened polymers of norbornene-based monomers and other monomers capable of ring-opening copolymerization with these, and Hydride and the like examples include an addition polymer of a norbornene-based monomer and an addition polymer of a norbornene-based monomer and another monomer copolymerizable therewith.
  • a hydrogenated ring-opened polymer of a norbornene-based monomer is preferable from the viewpoint of heat resistance, mechanical strength, and the like.
  • Examples of the norbornene-based monomer that can be used for the synthesis of the norbornene-based polymer include bicyclo [2.2.1] hept-2-ene (common name: norbornene) and 5-methyl-bicyclo [2.2.1] hepta.
  • deca-3,7-diene (commonly used dicyclopentadiene), 2-methyldicyclopentadiene, 2,3-dimethyldicyclopentadiene, 2,3-dihydroxydicyclopentadiene, etc.
  • Monomer Tetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene (tetracyclododecene), tetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene, 8-methyltetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene, 8-ethyltetracyclo [4.4.0.1 2,5 .
  • dec-3-ene (common name methanotetrahydrofluorene: 1,4-methano-1,4 , 4a, 9a-tetrahydrofluorene), 1,4-methano-8-methyl-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene, 1,4-methano-8-chloro-1,4,4a, 9a- Tetracyclic monomers such as tetrahydrofluorene and 1,4-methano-8-bromo-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene; and the like.
  • monomers capable of ring-opening copolymerization with norbornene monomers include cyclohexene, cycloheptene, cyclooctene, 1,4-cyclohexadiene, 1,5-cyclooctadiene, 1,5-cyclodecadiene, Monocyclic cycloolefin monomers such as 1,5,9-cyclododecatriene and 1,5,9,13-cyclohexadecatetraene are exemplified. These monomers may have one or more substituents. Examples of the substituent include an alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a silyl group, an alkoxycarbonyl group, and an alkylidene group.
  • ⁇ -olefin monomers having 2 to 20 carbon atoms such as ethylene, propylene, 1-butene, 1-pentene, and 1-hexene; cyclobutene, cyclopentene, cyclohexene, cyclooctene, tetracyclo [9.2.1.0 2,10.
  • Cycloolefin monomers such as [0 3,8 ] tetradeca-3,5,7,12-tetraene (also referred to as 3a, 5,6,7a-tetrahydro-4,7-methano-1H-indene);
  • Non-conjugated diene-based monomers such as 4-hexadiene, 4-methyl-1,4-hexadiene, 5-methyl-1,4-hexadiene, and 1,7-octadiene; and the like.
  • ⁇ -olefin-based monomers are preferred as other monomers that can be addition-copolymerized with norbornene-based monomers, and ethylene is more preferred.
  • These monomers may have one or more substituents. Examples of the substituent include an alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a silyl group, an alkoxycarbonyl group, and an alkylidene group.
  • a ring-opening polymer of a norbornene-based monomer, or a ring-opening polymer of a norbornene-based monomer and another monomer capable of ring-opening copolymerization with the norbornene-based monomer is prepared by subjecting a monomer component to a known ring-opening polymerization. It can be obtained by polymerization in the presence of a catalyst.
  • a catalyst comprising a metal halide such as ruthenium and osmium and a nitrate or acetylacetone compound, and a reducing agent, or a metal halide such as titanium, zirconium, tungsten, and molybdenum or acetylacetone
  • a catalyst comprising a compound and an organoaluminum compound can be used.
  • the ring-opening polymer hydride of a norbornene-based monomer is usually prepared by adding a known hydrogenation catalyst containing a transition metal such as nickel or palladium to a polymerization solution of the above-mentioned ring-opening polymer to obtain a carbon-carbon unsaturated bond.
  • a known hydrogenation catalyst containing a transition metal such as nickel or palladium
  • An addition polymer of a norbornene-based monomer, or an addition polymer of a norbornene-based monomer and another monomer copolymerizable therewith, is prepared by converting a monomer component in the presence of a known addition polymerization catalyst. It can be obtained by polymerization.
  • a catalyst for example, a catalyst comprising a titanium, zirconium or vanadium compound and an organic aluminum compound can be used.
  • Monocyclic cycloolefin polymer As the monocyclic cycloolefin polymer, for example, an addition polymer of a monocyclic cycloolefin monomer such as cyclohexene, cycloheptene, or cyclooctene may be used. it can.
  • Cyclic conjugated diene-based polymer As the cyclic conjugated diene-based polymer, for example, a polymer obtained by subjecting a cyclic conjugated diene-based monomer such as cyclopentadiene or cyclohexadiene to 1,2- or 1,4-addition polymerization and The hydride or the like can be used.
  • Vinyl alicyclic hydrocarbon polymer examples include polymers of vinyl alicyclic hydrocarbon monomers such as vinylcyclohexene and vinylcyclohexane, and hydrogenated products thereof; styrene. And hydrogenated aromatic ring moieties of polymers of vinyl aromatic monomers such as ⁇ -methylstyrene.
  • the vinyl alicyclic hydrocarbon polymer may be a copolymer of these monomers with another monomer copolymerizable therewith.
  • the molecular weight of the alicyclic structure-containing polymer is not particularly limited, but is usually the weight average molecular weight in terms of polyisoprene measured by gel permeation chromatography of a cyclohexane solution (a toluene solution if the polymer does not dissolve). It is 5,000 or more, preferably 5,000 to 500,000, more preferably 8,000 to 200,000, and particularly preferably 10,000 to 100,000. When the weight average molecular weight is within this range, mechanical strength and moldability are highly balanced, which is preferable.
  • the glass transition temperature of the alicyclic structure-containing polymer may be appropriately selected according to the purpose of use, and is usually 50 to 300 ° C, preferably 100 to 280 ° C. When the glass transition temperature is within this range, the heat resistance and the moldability are highly balanced and suitable.
  • the glass transition temperature of the alicyclic structure-containing polymer in the present invention is measured based on JIS K7121.
  • the alicyclic structure-containing polymers can be used alone or in combination of two or more.
  • a compounding agent usually used in a thermoplastic resin material for example, a soft polymer, an antioxidant, an ultraviolet absorber, a light stabilizer, a near infrared absorber, a release agent
  • a compounding agent such as a coloring agent such as a dye or a pigment, a plasticizer, an antistatic agent, and a fluorescent brightening agent can be added in an amount usually used.
  • the alicyclic structure-containing polymer may be mixed with another polymer other than the soft polymer (hereinafter, simply referred to as “other polymer”).
  • the amount of the other polymer mixed with the alicyclic structure-containing polymer is usually 200 parts by mass or less, preferably 150 parts by mass or less, more preferably 100 parts by mass, based on 100 parts by mass of the alicyclic structure-containing polymer. It is as follows. If the proportion of the various compounding agents and other polymers to be added to the alicyclic structure-containing polymer is too large, the cells are difficult to float, so that any compounding agent is added in a range that does not impair the properties of the alicyclic structure-containing polymer. Is preferred.
  • the method of mixing the alicyclic structure-containing polymer with the compounding agent or another polymer is not particularly limited as long as the compounding agent is sufficiently dispersed in the polymer.
  • a compounding method for example, a method of kneading the resin in a molten state using a mixer, a single-screw kneader, a twin-screw kneader, a roll, a Brabender, an extruder, or the like, after dissolving and dispersing in a suitable solvent, Examples include a method of removing the solvent by a coagulation method, a casting method, or a direct drying method.
  • the mixture is usually extruded into a rod in a molten state, cut into a suitable length by a strand cutter, and pelletized.
  • the method of molding the container made of the alicyclic structure-containing polymer can be arbitrarily selected according to the desired shape of the culture container.
  • the molding method include an injection molding method, an extrusion molding method, a cast molding method, an inflation molding method, a blow molding method, a vacuum molding method, a press molding method, a compression molding method, a rotational molding method, a calendar molding method, and a roll molding method. , A cutting method, a spinning method, and the like. These forming methods can be combined, and post-processing such as stretching can be performed as needed after forming.
  • the culture vessel used in the present invention is preferably sterilized.
  • sterilization and heating methods such as a high-pressure steam method and a dry heat method; a radiation method of irradiating radiation such as ⁇ -rays and electron beams, and an irradiation method of irradiating a high frequency; ethylene oxide gas (EOG)
  • the method can be selected from methods generally used in the medical field, such as a gas method for contacting a gas with the gas; a filtration method using a sterilizing filter; and the like, depending on the shape of the molded article and the cells to be used.
  • the gas method is preferable because the surface free energy of the culture surface is easily maintained in a specific range.
  • the surface free energy of the culture surface of the culture vessel used in the present invention is in the range of 30 to 37 mN / m. In order to control the surface free energy of the culture surface within the above range, it is important that surface treatment such as plasma treatment, which is usually performed to improve cell adhesion, is not performed on the culture surface.
  • the surface free energy is preferably in the range of 32 to 36 mN / m.
  • the surface free energy is evaluated by measuring whether or not several test inks each having a corresponding surface free energy value within a predetermined range can maintain adhesion to a culture surface for a predetermined time. Is done. More specifically, if the line of ink drawn on the culture surface does not change for 2 seconds without forming a water droplet, the value of the surface free energy of the culture surface is equal to the value of the surface free energy applied to the used ink. Means the same number or more.
  • the components of the ink are a mixture of an organic solvent (2-ethoxyethanol, 2-propanol) and a basic dye (formamide). These liquids are mixed at different ratios to form inks corresponding to various surface free energy values. Is prepared.
  • an ink provided with a surface free energy value of 38 mN / m is used, and a line is drawn on the measurement surface. If it does not change for seconds, the surface free energy is equal to or greater than 38 mN / m. In this case, next, the same measurement is performed using the ink provided with the surface free energy value of 40 mN / m. If the line of ink does not drop and does not change for 2 seconds, such a measurement is made using the higher valued ink until the line of ink changes to a droplet within 2 seconds.
  • the same measurement is performed by using an ink provided with a value lower than 38 mN / m.
  • the value of the surface free energy becomes 2 It can be seen that it is between the values (35-38 mN / m).
  • a known method such as a commercially available measurement kit may be used for measurement of the biomarker for heart disease, and is not particularly limited.
  • Example I As an alicyclic structure-containing polymer, ZEONOR (registered trademark) 1060R (manufactured by ZEON CORPORATION, norbornene-based ring-opened polymer hydride: hereinafter simply referred to as "1060R”) is used to obtain 0.32 cm 2 by an injection molding method. A well plate containing 96 cylindrical wells having the following bottom area was obtained as a culture vessel. Thereafter, the culture vessel was sterilized with ethylene oxide gas (hereinafter, this culture vessel is referred to as "1060R 96-well plate").
  • the surface free energy on the bottom surface in the well (the surface in contact with the cells, that is, the culture surface) of the 96-well plate made of 1060R was 34 mN / m.
  • the surface free energy was measured using a surface energy value evaluation ink (manufactured by Arcotest).
  • a surface energy value evaluation ink manufactured by Arcotest.
  • 200 ⁇ L of a solution of human fibronectin manufactured by Corning, model number 356008
  • 10 fibronectin coating was performed on the bottom surface in the well of the well plate.
  • the human fibronectin solution was removed from each well, and using the attached thawing medium for cardiomyocytes, 7.5 cells of iCell (registered trademark) Cardiomyocytes 2 (manufactured by Cellular Dynamics International, model number CMC-100-012-001) were used. The cells were seeded at ⁇ 10 4 cells / well, and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. Thereafter, the thawing medium for cardiomyocytes was removed from each well of the 1060R 96-well plate, and 200 ⁇ L of a maintenance medium for cardiomyocytes was newly added, followed by culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • doxorubicin Toronto Research Chemical, model number D558000 was diluted, and 20 ⁇ L was added to a 96 well plate manufactured by 1060R. The doxorubicin was adjusted to a final concentration of 10 -6 M.
  • the concentration of BNP contained in the supernatant sample was measured using a Human BNP ELISA Kit (manufactured by RayBiotech, model number ELH-BNP).
  • the difference in the concentration of BNP secreted from the cells before and after the addition of doxorubicin is shown in the graph of FIG.
  • the results in FIG. 1 show that the difference in the difference in the concentration of BNP secreted from cells before and after the addition of doxorubicin is extremely small. Further, from the graph of FIG. 1, it is possible to read a correlation that the difference in the concentration of BNP increases as the doxorubicin concentration increases.
  • Example 1 Comparative Example 1
  • the inner bottom surface of the well and the inner wall of the well were adjusted to 60 V at 100 V using a plasma inner wall treatment device (manufactured by Izumi Kogyo Co., Ltd., model number IP-200).
  • the procedure was performed except that a well plate treated for 2 seconds (a value of surface free energy measured by the surface energy value evaluation ink: 52 mN / m, hereinafter, referred to as a "plasma treated 1060R 96-well plate") was used for the culture vessel.
  • a plasma inner wall treatment device manufactured by Izumi Kogyo Co., Ltd., model number IP-200
  • Example 2 (Comparative Example 2) The procedure was performed except that a 96-well plate made of polystyrene (Falcon (registered trademark), manufactured by Corning, model number 353916; surface free energy: 43 mN / m) was used instead of the 96-well plate made of 1060R used in Example 1.
  • cell culture, addition of doxorubicin, and collection of the supernatant were performed, and the BNP concentration before and after the addition of doxorubicin was measured.
  • the difference in the concentration of BNP secreted from the cells before and after the addition of doxorubicin is shown in the graph of FIG.
  • Example 3 (Comparative Example 3) Except that a 96-well plate made of polystyrene for tissue culture (Falcon (registered trademark), manufactured by Corning, model number 351172; surface free energy: 37 mN / m) was used instead of the 96-well plate made of 1060R used in Example 1.
  • cell culture, addition of doxorubicin, and recovery of the supernatant were performed, and the BNP concentration before and after the addition of doxorubicin was measured.
  • the difference in the concentration of BNP secreted from the cells before and after the addition of doxorubicin is shown in the graph of FIG.
  • the BNP concentration was determined by using a well plate in which the value of the surface free energy of the culture surface was within a specific range and the culture surface was composed of an alicyclic structure-containing polymer. It can be seen that the dispersion of the measured values of the above is remarkably reduced, and measurement with high reproducibility becomes possible. If the surface free energy of the culture surface is less than 30 mN / m, the culture surface becomes more hydrophobic and the protein adsorption by the hydrophobic interaction is further promoted. Therefore, similarly to the case where the culture surface is surface-treated as in Comparative Example 2, the variation in the difference in BNP concentration becomes large, and the measurement accuracy is significantly reduced.
  • the measurement can be performed by adhering the cells to the culture vessel with a minimum stress, similarly to the measurement result of BNP. Variation in values can be significantly reduced.
  • a biomarker for heart disease can be measured with high accuracy, so that accurate cardiotoxicity evaluation can be performed.
  • This makes it possible to accurately measure the toxicity of a compound already known to have cardiotoxicity. Therefore, using the evaluation method of the present invention, for example, while using doxorubicin as a positive control, it is possible to evaluate the toxicity of another novel drug, and thus, to maximize drug efficacy while reducing toxicity. It is also possible to determine the dose of the drug.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medical Treatment And Welfare Office Work (AREA)

Abstract

心疾患のバイオマーカーを高い精度で測定する心毒性評価方法。心筋細胞を培地とともに培養容器に播種し、前記培養容器内の培地に薬剤を添加して、該薬剤を前記心筋細胞に接触させ、その後、前記心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定して前記薬剤の心毒性を評価する、心毒性評価方法であって、前記培養容器の少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成され、かつ、前記培養面の表面自由エネルギーが３０～３７ｍＮ／ｍである、方法。

Description

心毒性評価方法
　本発明は、新規薬剤に関して、副作用予測や臨床試験前のヒトへの投与量決定のために、薬物誘導性の心毒性を評価する方法に関し、特に、薬物との接触に起因して心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定することにより心毒性を評価する方法に関する。
　心疾患を診断する方法の１つとして、心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定する方法が挙げられる。特許文献１には、実検体に近いＢＮＰ測定用標準物を用いることにより血中のＢＮＰ量を正確に測定する方法が記載されている。また、特許文献２には、薬剤のスクリーニングのためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化心筋細胞を用い、その薬効評価や毒性評価を行うことが記載されている。
特開第2014-32062号公報 特表第2007-537429号公報
　しかしながら、バイオマーカー測定の際に使用される容器の素材や特性を制御することにより、測定の再現性を高めることについてはこれまで検討されてこなかった。
　本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、心疾患のバイオマーカーを高い精度で測定する心毒性評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、脂環構造含有重合体で構成され、かつ、培養面の表面自由エネルギーが特定の範囲内である培養容器を用いることにより、細胞から分泌されるバイオマーカーについて、再現性の高い測定が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
　ここで、表面自由エネルギーとは、インク等がプラスチックや金属の表面にどれだけ接着するかを測定することにより判断される基準である。単位は、ｍＮ／ｍで表され、表面自由エネルギーの値が高いほど接着性が高い。
　本発明は、上記の知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の一態様は、心筋細胞を培地とともに培養容器に播種し、前記培養容器内の培地に薬剤を添加して、該薬剤を前記心筋細胞に接触させ、その後、前記心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定して前記薬剤の心毒性を評価する、心毒性評価方法であって、前記培養容器の少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成され、かつ、前記培養面の表面自由エネルギーが３０～３７ｍＮ／ｍである、方法である。
　培養容器の少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成され、かつ、培養面の表面自由エネルギーが３０～３７ｍＮ／ｍである培養容器を用いることにより、薬剤に反応して心筋細胞が分泌する心疾患のバイオマーカー量の測定値のバラツキが低減され、再現性の高い測定を行うことができる。
　また、上記態様では、前記心筋細胞が多能性幹細胞由来心筋細胞であることが好ましい。とりわけ、人工多能性幹細胞由来心筋細胞であることが好ましい。倫理上の問題がないこと、安定供給が見込めるため、測定が長期間にわたる場合でも精度の高い測定を行うことができるからである。
　また、上記態様では、前記心疾患が心不全であり、該心不全のバイオマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドであることが好ましい。
　また、上記態様では、前記脂環構造含有重合体がノルボルネン系開環重合体水素化物であることが好ましい。脂環構造含有重合体のなかでもノルボルネン系開環重合体水素化物で培養容器の培養面を構成することにより、心疾患のバイオマーカー量の測定値のバラツキが顕著に低減されるからである。
　本発明によれば、心疾患のバイオマーカーを高い精度で測定することができる。
図１は、実施例１のドキソルビシン添加前後でのＢＮＰの濃度の差分を示すグラフである。 図２は、比較例１のドキソルビシン添加前後でのＢＮＰの濃度の差分を示すグラフである。 図３は、比較例２のドキソルビシン添加前後でのＢＮＰの濃度の差分を示すグラフである。 図４は、比較例３のドキソルビシン添加前後でのＢＮＰの濃度の差分を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
　本発明の方法は、心疾患のバイオマーカーを測定するにあたって、培養容器内面における細胞が接する面（以下、「培養面」という）の表面自由エネルギーが特定の範囲であり、かつ、培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器を用いる点に特徴がある。
　このような培養容器を用いることで、細胞に必要以上のストレスを与えることなく、細胞を培養面に接着させることができ、これにより、細胞から分泌されるバイオマーカーのバラツキを最小限に抑えることができると考えられる。
　本発明において使用される細胞は、心筋細胞であり、例えば、多能性幹細胞由来心筋細胞（なかでも人工多能性幹細胞由来心筋細胞）、胚性幹細胞由来心筋細胞、ヒト由来心筋細胞などが挙げられる。
　上記細胞を培養するための培地は、心筋細胞を培養し、維持することができれば、特に限定されるものではなく、市販の心筋細胞培養用培地を用いることができる。
　上記培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
　これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
　上記細胞を培養容器に播種する方法に格別な制限はなく、例えば、必要に応じて、少なくとも培養面を細胞外マトリックス等でコートする。その後、培地に懸濁した細胞をピペット等で培養容器内に播種し、必要に応じて容器を揺動させて培養容器内に細胞を均等に散らした後、インキュベータ内で静置する。細胞外マトリックスとしては、例えば、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの天然由来または合成のものが挙げられる。
　培養面を細胞外マトリックスでコートする方法は、一般的な細胞基質を培養容器にコートする方法と同様であり、通常、培養容器内に上述のコート剤を入れて、培養温度付近の温度で、通常１０分間～５時間、好ましくは３０分間～２時間静置しコート剤を培養面に接触させた後、コート剤を除去する方法が採用される。接触時間が短すぎるとコートが不十分となる。一方、培養面を構成する脂環構造含有重合体へのタンパク質吸着性は低く、ポリスチレンなどのように多層吸着しないため、接触時間を長くしても、吸着量が増えることはない。従って、上記の時間以上に接触時間を長くする必要はない。なお、コート剤除去後、乾燥を防ぐために、速やかに培地を添加することが望ましい。
　脂環構造含有重合体で構成される培養面は水性溶液をはじきやすいため、培養容器に添加するコート剤の量は、一般的なポリスチレン製細胞培養容器に添加するコート剤量より１．５～３倍程度多く添加することが望ましく、具体的には培養面１ｃｍ2に対して、０．１５～０．３０ｍｌを添加するのが好ましい。
　上記培地に、新規薬剤を添加して細胞と接触させ、バイオマーカーの分泌の有無を評価する。
　上記方法が有効であるかどうかは、例えば、ドキソルビシン、エンドセリン、トラスツズマブなどの心毒性が知られた薬剤での心疾患のバイオマーカーの分泌と比較することで確認できる。
　本発明において測定される心疾患のバイオマーカーとしては、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（以下、「ＢＮＰ」という）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、これらの前駆体や分解物などのナトリウム利尿ペプチド類のような心不全のバイオマーカー；トロポニンＴ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫ－ＭＢなどの心筋梗塞のバイオマーカー；などが挙げられる。
　これらの中でも、心不全のバイオマーカーでは、測定値のバラツキ低減の顕著な効果が得られる。このような観点から、特に、ＢＮＰやＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）などの脳性ナトリウム利尿ペプチド類が好ましく、とりわけＢＮＰが好ましい。
　本発明の培養容器としては、脂環構造含有重合体を培養容器の材料として用いることが可能であれば、任意の形状のものを使用することができる。培養容器の形状としては、ディッシュ、プレート、マイクロ流路チップ、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどが挙げられる。
　培養容器のうち、少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成されていればよい。例えば、９６ウェルプレートの場合、各ウェルの内側の底面が脂環構造含有重合体で形成されていればよい。バッグの場合、例えば、異なるポリマー材料からなるフィルムの積層体で構成されているものは、最内層（バッグ内面）が脂環構造含有重合体からなるフィルムにより形成されていればよい。
　あるいは、培養容器全体が脂環構造含有重合体からなることとしてもよい。例えば、培養ディッシュ、フラスコ、または複数のウェルを有するプレートであれば、脂環構造含有重合体でこれらの容器全体を成形することにより、容器全体を脂環構造含有重合体で構成することができる。
　上記脂環構造含有重合体は、主鎖および／または側鎖に脂環構造を有する樹脂であり、機械的強度、耐熱性などの観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましく、分化誘導効率の観点から、極性基を有しないものがより好ましい。ここで、極性基とは、極性のある原子団を指す。極性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、酸無水物基などが挙げられる。
　上記脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造などが挙げられるが、機械的強度、耐熱性などの観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、中でもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。
　脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４～３０個、好ましくは５～２０個、より好ましくは５～１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、および成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。
　脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。
　脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素系重合体、および（１）～（４）の水素化物などが挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体およびその水素化物が好ましい。
（１）ノルボルネン系重合体
　ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
　開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体およびノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、ならびにこれらの水素化物などが挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体およびノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体などが挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましい。
　ノルボルネン系重合体の合成に使用可能なノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン（慣用名ノルボルネン）、５－メチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５，５－ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチリデン－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－ビニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メチル－５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン等の２環式単量体；
　トリシクロ［４．３．０1,6．１2,5］デカ－３，７－ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２－メチルジシクロペンタジエン、２，３－ジメチルジシクロペンタジエン、２，３－ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
　テトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８－メチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８－エチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８－エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８，９－ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８－エチル－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８－エチリデン－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、８－メチル－８－カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］－３－ドデセン、７，８－ベンゾトリシクロ［４．３．０．１2,5］デカ－３－エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４－メタノ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４－メタノ－８－メチル－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－クロロ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－ブロモ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４－シクロヘキサジエン、１，５－シクロオクタジエン、１，５－シクロデカジエン、１，５，９－シクロドデカトリエン、１，５，９，１３－シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
　これらの単量体は、置換基を１種または２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン等の炭素数２～２０のα－オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０2,10．０3,8］テトラデカ－３，５，７，１２－テトラエン（３ａ，５，６，７ａ－テトラヒドロ－４，７－メタノ－１Ｈ－インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４－ヘキサジエン、４－メチル－１，４－ヘキサジエン、５－メチル－１，４－ヘキサジエン、１，７－オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
　これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α－オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
　これらの単量体は、置換基を１種または２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体の開環重合体、またはノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩またはアセチルアセトン化合物、および還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物またはアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
　ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素－炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
　ノルボルネン系単量体の付加重合体、またはノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウムまたはバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
（２）単環の環状オレフィン系重合体
　単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンなどの、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体
　環状共役ジエン系重合体としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエンなどの環状共役ジエン系単量体を１，２－または１，４－付加重合した重合体およびその水素化物などを用いることができる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体
　ビニル脂環式炭化水素重合体としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサンなどのビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体およびその水素化物；スチレン、α－メチルスチレンなどのビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；などが挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
　脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリイソプレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００～５００，０００、より好ましくは８，０００～２００，０００、特に好ましくは１０，０００～１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
　脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０～３００℃、好ましくは１００～２８０℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
　本発明における脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、ＪＩＳ　Ｋ　７１２１に基づいて測定されたものである。
　上記脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
　また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
　また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００質量部に対して、通常２００質量部以下、好ましくは１５０質量部以下、より好ましくは１００質量部以下である。
　脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
　脂環構造含有重合体と配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、または直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
　二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
　脂環構造含有重合体で構成される容器の成形方法は、所望される培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
　本発明で使用される培養容器は、滅菌処理することが好ましい。
　滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、培養面の表面自由エネルギーを特定の範囲に維持しやすいことから、ガス法が好ましい。
　本発明で使用される培養容器の培養面の表面自由エネルギーは、３０～３７ｍＮ／ｍの範囲であることとする。培養面の表面自由エネルギーを上記の範囲に制御するためには、細胞の接着性を向上させるために通常行われるプラズマ処理などの表面処理を、培養面に対して行わないことが重要である。上記表面自由エネルギーは、好ましくは、３２～３６ｍＮ／ｍの範囲である。
　上記表面自由エネルギーは、所定のレンジで、対応する表面自由エネルギー値がそれぞれ付与されているいくつかのテストインクが、培養面に所定時間の間、接着を維持できるかどうかを測定することにより評価される。より具体的には、培養面に引いたインクの線が水滴にならずに２秒間変わらなければ、培養面の表面自由エネルギーの値は、使用したインクに付与されている表面自由エネルギーの値と同じ数値か、それ以上であることを意味する。インクの成分は、有機溶媒（２－エトキシエタノール、２－プロパノール）と塩基性染料（ホルムアミド）の混合物であり、これらの液体を異なる比率で混ぜ合わせて、種々の表面自由エネルギー値に対応するインクを作製する。
　具体的な表面自由エネルギーの測定方法としては、例えば、まず３８ｍＮ／ｍの表面自由エネルギー値が付与されているインクを使用して、測定面に線を引き、インクの線が水滴にならず２秒間変わらなければ表面自由エネルギーは３８ｍＮ／ｍと同じかそれ以上ということである。この場合、次に、４０ｍＮ／ｍの表面自由エネルギー値が付与されているインクを使って同様の測定を行う。インクの線が水滴にならず２秒間変わらなければ、このような測定を、２秒以内にインクの線が水滴に変わるまで、さらに高い値が付与されているインクを使用して行う。
　上記の測定において、３８ｍＮ／ｍ程度のインクで既に水滴に変わるようであれば、３８ｍＮ／ｍよりも低い値が付与されているインクを使って同様の測定を行う。例えば、３５ｍＮ／ｍの表面自由エネルギー値が付与されているインクで測定面に線を引き、２秒以内にインクの線が水滴にならず２秒間変わらなければ、表面自由エネルギーの値は２つの値の間（３５～３８ｍＮ／ｍ）であることがわかる。
　上記心疾患のバイオマーカーの測定は、市販の測定キットなど、公知の方法を使用すればよく、特に限定されない。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例Ｉ）
　脂環構造含有重合体として、ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系開環重合体水素化物：以下、単に「１０６０Ｒ」という）を用いて、射出成形法により、０．３２ｃｍ2の底面積を有する円筒形状のウェルを９６個含むウェルプレートを培養容器として得た。その後、当該培養容器について酸化エチレンガスによる滅菌処理を行った（以下、この培養容器を「１０６０Ｒ製９６ウェルプレート」という。）。１０６０Ｒ製９６ウェルプレートのウェル内底面（細胞と接触する面、すなわち培養面）における表面自由エネルギーは３４ｍＮ／ｍであった。ここで、上記表面自由エネルギーは、表面エネルギー値評価インク（Ａｒｃｏｔｅｓｔ社製）を用いて測定した。
　１０６０Ｒ製９６ウェルプレートの各ウェルに対して、滅菌水を用いて１０μｇ／ｍＬに調製したヒトフィブロネクチン（コーニング社製、型番３５６００８）溶液を２００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートし、１０６０Ｒ製９６ウェルプレートのウェル内底面について、ヒトフィブロネクチンコーティングを行った。その後、各ウェルからヒトフィブロネクチン溶液を取り除き、付属の心筋細胞用解凍培地を使用して、ｉＣｅｌｌ（登録商標）　Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ2（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、型番ＣＭＣ－１００－０１２－００１）を７．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で４時間培養を行った。
　その後、１０６０Ｒ製９６ウェルプレートの各ウェルより心筋細胞用解凍培地を取り除き、新たに心筋細胞用維持培地を２００μＬ加え、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で培養を行った。
　細胞を播種してから２日後に１０６０Ｒ製９６ウェルプレートの各ウェル内の心筋細胞用維持培地を半量交換した。細胞を播種してから３日後に１０６０Ｒ製ウェルプレートの各ウェルから培養上清を２０μＬずつ採取した（添加前上清サンプル）。
　次に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ナカライテスク社製、型番１３４３５－３５）を用いてドキソルビシン（Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、型番Ｄ５５８０００）溶液を希釈し、１０６０Ｒ製９６ウェルプレートに２０μＬ加え、ウェル内におけるドキソルビシンの終濃度が１０-6Ｍとなるように調製した。さらに段階希釈を行って、各ウェルにおけるドキソルビシンの終濃度が１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、１０-12Ｍ、１０-13Ｍおよび１０-14Ｍとなるように調製して各ウェルに２０μＬ加え、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で１６時間インキュベートを行った。その後、ドキソルビシン溶液を加えた各ウェルから上清を２０μＬ回収した（添加後上清サンプル）。
　ドキソルビシン添加前後で回収した上清サンプルについて、Ｈｕｍａｎ　ＢＮＰ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製、型番ＥＬＨ－ＢＮＰ）を用いて上清サンプル中に含まれるＢＮＰ濃度を測定した。
　ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分を図１のグラフに示す。上記の各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。図１の結果から、ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分のバラツキがきわめて小さいことがわかる。また、図１のグラフから、ドキソルビシン濃度が高くなるにつれて、ＢＮＰの濃度の差分も大きくなるという相関関係を読み取ることができる。
（比較例１）
　実施例１で使用した１０６０Ｒ製９６ウェルプレートの代わりに、１０６０Ｒ９６製ウェルプレートに対してプラズマ内壁処理装置（泉工業社製、型番ＩＰ－２００）を用いてウェル内底面およびウェル内壁を１００Ｖで６０秒処理したウェルプレート（上記表面エネルギー値評価インクにより測定された表面自由エネルギーの値：５２ｍＮ／ｍ、以下、「プラズマ処理１０６０Ｒ製９６ウェルプレート」という）を培養容器に用いたこと以外は、実施例１と同様に、細胞培養、ドキソルビシンの添加、および上清の回収を行い、ドキソルビシン添加前後のＢＮＰ濃度を測定した。
　ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰ濃度の差分を図２のグラフに示す。各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。図２の結果から、表面処理により培養面の表面自由エネルギーの値が特定の範囲を外れたウェルプレートを使用すると、ＢＮＰの濃度の差分の測定値のバラツキが大きくなり、測定精度が顕著に低下していることがわかる。また、測定精度が低下するため、ドキソルビシン濃度とＢＮＰの濃度の差分との相関関係を読み取ることができない。
（比較例２）
　実施例１で使用した１０６０Ｒ製９６ウェルプレートの代わりに、ポリスチレン製９６ウェルプレート（ファルコン（登録商標）、コーニング社製、型番３５３９１６；表面自由エネルギー：４３ｍＮ／ｍ）を用いたこと以外は、実施例１と同様に、細胞培養、ドキソルビシンの添加、および上清の回収を行い、ドキソルビシン添加前後のＢＮＰ濃度を測定した。
　ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰ濃度の差分を図３のグラフに示す。各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。図３の結果から、ポリスチレンのような、培養面の材質が脂環構造含有重合体以外であり、表面自由エネルギーが３７ｍＮ／ｍを上回るウェルプレートを用いると、ＢＮＰの濃度の差分のバラツキが大きくなり、測定精度が顕著に低下していることがわかる。また、測定精度が低下するため、ドキソルビシン濃度とＢＮＰの濃度の差分との相関関係を読み取ることができない。
（比較例３）
　実施例１で使用した１０６０Ｒ製９６ウェルプレートの代わりに、組織培養用ポリスチレン製９６ウェルプレート（ファルコン（登録商標）、コーニング社製、型番３５１１７２；表面自由エネルギー：３７ｍＮ／ｍ）を用いたこと以外は、実施例１と同様に、細胞培養、ドキソルビシンの添加、および上清の回収を行い、ドキソルビシン添加前後のＢＮＰ濃度を測定した。
　ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰ濃度の差分を図４のグラフに示す。各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。図４の結果から、培養面の表面自由エネルギーの値が特定の範囲内であっても、培養面が脂環構造含有重合体で構成されていないウェルプレートを用いると、ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分のバラツキが大きくなり、測定精度が顕著に低下していることがわかる。
　図１～４の結果から、培養面の表面自由エネルギーの値が特定の範囲内であり、かつ、培養面が脂環構造含有重合体で構成されているウェルプレートを使用することにより、ＢＮＰ濃度の測定値のバラツキが顕著に低減され、再現性の高い測定が可能となることがわかる。
　なお、培養面の表面自由エネルギーが３０ｍＮ／ｍを下回る場合、培養面の疎水性が高くなり、疎水性相互作用によるタンパク質吸着がより促進される。そのため、比較例２のように培養面を表面処理した場合と同様に、ＢＮＰの濃度の差分のバラツキが大きくなり、測定精度が顕著に低下することとなる。
　また、ＢＮＰ以外のバイオマーカーであっても、上述のようなストレス性のバイオマーカーであれば、上記ＢＮＰの測定結果と同様に、最小限のストレスで培養容器に細胞を接着させることにより、測定値のバラツキを顕著に低減できる。
　本発明の心毒性評価方法によれば、高精度で心疾患のバイオマーカーを測定することができるため、正確な心毒性評価を行うことができる。
　これにより、既に心毒性を有することが分かっている化合物について、その毒性を正確に測定できる。そのため、本発明の評価方法を利用して、例えば、ドキソルビシンをポジティブコントロールとしつつ、別の新規薬剤の毒性を評価することが可能となり、ひいては、毒性を低減しつつ薬効を最大限に引き出すための当該薬剤の投与量を決定することも可能となる。

Claims (4)

  1. 　心筋細胞を培地とともに培養容器に播種し、
    　前記培養容器内の培地に薬剤を添加して、該薬剤を前記心筋細胞に接触させ、その後、
    　前記心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定して前記薬剤の心毒性を評価する、心毒性評価方法であって、
    　前記培養容器の少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成され、かつ、前記培養面の表面自由エネルギーが３０～３７ｍＮ／ｍである、方法。
  2. 　前記心筋細胞が多能性幹細胞由来心筋細胞である、請求項１に記載の心毒性評価方法。
  3. 　前記心疾患が心不全であり、該心不全のバイオマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項１または２に記載の心毒性評価方法。
  4. 　前記脂環構造含有重合体がノルボルネン系開環重合体水素化物である、請求項１～３のいずれかに記載の心毒性評価方法。
PCT/JP2019/033022 2018-09-28 2019-08-23 心毒性評価方法 Ceased WO2020066396A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19865332.1A EP3859005A4 (en) 2018-09-28 2019-08-23 Cardiotoxicity assessment method
JP2020548180A JP7384167B2 (ja) 2018-09-28 2019-08-23 心毒性評価方法
US17/278,823 US20220034868A1 (en) 2018-09-28 2019-08-23 Cardiotoxicity assessment method
CN201980026140.7A CN111989405A (zh) 2018-09-28 2019-08-23 心脏毒性评价方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018185533 2018-09-28
JP2018-185533 2018-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020066396A1 true WO2020066396A1 (ja) 2020-04-02

Family

ID=69951352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/033022 Ceased WO2020066396A1 (ja) 2018-09-28 2019-08-23 心毒性評価方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220034868A1 (ja)
EP (1) EP3859005A4 (ja)
JP (1) JP7384167B2 (ja)
CN (1) CN111989405A (ja)
TW (1) TWI822860B (ja)
WO (1) WO2020066396A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023062597A (ja) * 2021-10-21 2023-05-08 日本ゼオン株式会社 心毒性評価方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7543656B2 (ja) * 2020-02-19 2024-09-03 日本ゼオン株式会社 心毒性評価方法
TWI849993B (zh) * 2023-06-21 2024-07-21 高雄榮民總醫院 具有受機械性壓力細胞模型之藥效測試平台及其應用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007119509A (ja) * 2005-10-25 2007-05-17 Nippon Zeon Co Ltd 環状オレフィン重合体の製造法
JP2007537429A (ja) 2004-05-11 2007-12-20 アキシオジェネシス エージー ｉｎｖｉｔｒｏ分化細胞に基づく薬物発見のための検定
JP2014032062A (ja) 2012-08-02 2014-02-20 Mitsubishi Chemical Medience Corp Ｂｎｐ測定用標準物質とその利用
WO2017188061A1 (ja) * 2016-04-25 2017-11-02 株式会社バイオ未来工房 細胞用保存容器、及び細胞の保存方法
WO2018066512A1 (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 株式会社バイオ未来工房 幹細胞の分離方法、分化誘導方法及び細胞培養容器の使用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10195313B2 (en) * 2014-04-10 2019-02-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for forming hydrogel arrays using surfaces with differential wettability
KR102470046B1 (ko) * 2014-06-26 2022-11-22 니폰 제온 가부시키가이샤 접착형 세포의 배양 방법, 배양 용기 및 단백질의 생산 방법
KR102412034B1 (ko) * 2014-06-26 2022-06-21 니폰 제온 가부시키가이샤 배양 세포의 분화 촉진 방법 및 배양 세포 분화 촉진제
WO2017010533A1 (ja) * 2015-07-16 2017-01-19 日本ゼオン株式会社 細胞外マトリックス産生促進方法、細胞の培養方法、及び細胞外マトリックス産生促進剤
JP6716887B2 (ja) * 2015-10-29 2020-07-01 日本ゼオン株式会社 接着型細胞の培養方法、及びタンパク質の産生方法
EP3392335A4 (en) * 2015-12-16 2019-07-10 Zeon Corporation METHOD FOR CULTIVATING ADHERENT CELLS
WO2017104821A1 (ja) * 2015-12-18 2017-06-22 日本ゼオン株式会社 浮遊培養馴化接着型細胞の調製方法、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導方法、及びそれらの利用
WO2017115706A1 (ja) * 2015-12-28 2017-07-06 日本ゼオン株式会社 培養細胞の分化促進方法及び培養細胞分化促進剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007537429A (ja) 2004-05-11 2007-12-20 アキシオジェネシス エージー ｉｎｖｉｔｒｏ分化細胞に基づく薬物発見のための検定
JP2007119509A (ja) * 2005-10-25 2007-05-17 Nippon Zeon Co Ltd 環状オレフィン重合体の製造法
JP2014032062A (ja) 2012-08-02 2014-02-20 Mitsubishi Chemical Medience Corp Ｂｎｐ測定用標準物質とその利用
WO2017188061A1 (ja) * 2016-04-25 2017-11-02 株式会社バイオ未来工房 細胞用保存容器、及び細胞の保存方法
WO2018066512A1 (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 株式会社バイオ未来工房 幹細胞の分離方法、分化誘導方法及び細胞培養容器の使用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3859005A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023062597A (ja) * 2021-10-21 2023-05-08 日本ゼオン株式会社 心毒性評価方法

Also Published As

Publication number Publication date
TWI822860B (zh) 2023-11-21
US20220034868A1 (en) 2022-02-03
CN111989405A (zh) 2020-11-24
EP3859005A4 (en) 2022-06-29
JPWO2020066396A1 (ja) 2021-08-30
JP7384167B2 (ja) 2023-11-21
TW202012936A (zh) 2020-04-01
EP3859005A1 (en) 2021-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7384167B2 (ja) 心毒性評価方法
US12509489B2 (en) Oligopeptide
CN106661537A (zh) 医疗器具、细胞培养方法、含氟环状烯烃聚合物、含氟环状烯烃聚合物组合物及培养细胞
JP6720867B2 (ja) 培養表皮細胞の分化促進方法および培養表皮細胞分化促進剤
JP7543656B2 (ja) 心毒性評価方法
JP7268439B2 (ja) 多能性幹細胞の分化誘導方法
JP7035616B2 (ja) 人工多能性幹細胞の分化誘導方法
US20220259567A1 (en) Culture method and culture vessel
JP5958658B2 (ja) 培養細胞内のｅｒｋまたはａｋｔのリン酸化亢進方法、細胞の培養方法、およびリン酸化亢進剤
JP2023062597A (ja) 心毒性評価方法
JP6973082B2 (ja) 接着型細胞の培養方法
JP7766347B2 (ja) 被験物質の神経作用評価方法及びそのためのキット及び神経細胞培養容器
JP6716887B2 (ja) 接着型細胞の培養方法、及びタンパク質の産生方法
JPWO2017010533A1 (ja) 細胞外マトリックス産生促進方法、細胞の培養方法、及び細胞外マトリックス産生促進剤
JP2025115811A (ja) 心筋細胞の拍動評価方法および接着分子
EP4653388A1 (en) Method for manufacturing cyclic-olefin-resin flow path device
EP4159669A1 (en) Microchannel chip and method for manufacturing same
JP2024140707A (ja) 接着型細胞用培養容器およびそれを用いた接着型細胞の培養方法
JP2017081073A (ja) ガス透過性複合体及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19865332

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020548180

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019865332

Country of ref document: EP

Effective date: 20210428

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2019865332

Country of ref document: EP