WO2020100361A1 - ゲノム編集された細胞を製造する方法 - Google Patents

ゲノム編集された細胞を製造する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020100361A1
WO2020100361A1 PCT/JP2019/031117 JP2019031117W WO2020100361A1 WO 2020100361 A1 WO2020100361 A1 WO 2020100361A1 JP 2019031117 W JP2019031117 W JP 2019031117W WO 2020100361 A1 WO2020100361 A1 WO 2020100361A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
site
cells
dna
tscer2
chromosome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/031117
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
慎一郎 中田
亜希子 富田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Priority to CN201980075266.3A priority Critical patent/CN113015799A/zh
Priority to US17/294,165 priority patent/US12365923B2/en
Priority to JP2020556604A priority patent/JP7426101B2/ja
Priority to EP19885454.9A priority patent/EP3882347A4/en
Publication of WO2020100361A1 publication Critical patent/WO2020100361A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a genome-edited cell, and mainly to a method for producing a cell in which a hetero mutation is replaced with a normal sequence by homologous recombination between homologous chromosomes.
  • TALENs a genome-editing technology of a generation ago
  • TALE a fusion protein of a TALE protein that targets DNA and a nuclease that cleaves DNA (mainly FokI), but like the CRISPR-Cas system, it targets on the genome.
  • a double-strand break in the DNA occurs at the site.
  • nucleotide insertion or deletion (insertion / deletion: indel) occurs, and gene knockout can be performed by frame shift or the like.
  • gene knock-in can be performed by homologous recombination between the genome and the donor DNA. In this gene knock-in, not only insertion of DNA but also substitution or deletion of 1 to several nucleotides can be caused.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • the present inventors have further developed this method, and put one nick in the target genome and one nick in the donor plasmid containing the repair template.
  • the SNGD method (a combination of single nickels in the Target gene and donor plasmids were also developed (Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the problems of the above-mentioned conventional techniques, and an object thereof is to perform genome editing by homologous recombination specifically and highly efficiently without using a foreign donor DNA. To provide a method.
  • the present inventors first performed genome editing using a homologous chromosome originally present in the cell as a repair template, rather than introducing the donor DNA from outside the cell. , was conceived to avoid the problem of random integration of donor DNA.
  • the gene mutation existing in one allele (this is referred to as "allyl A”) is ”)) Does not exist.
  • the mutation of allyl A can be restored to a normal sequence using allyl B as a repair template, or conversely, allyl A can be used as a template. It is possible to introduce mutations into the normal sequence of allyl B. In this case, the foreign donor DNA (artificially synthesized DNA chain, plasmid, etc.) used as a template in the existing method becomes unnecessary.
  • repair of homologous recombination occurs between sister chromatids, and homologous recombination between homologous chromosomes is extremely unlikely.
  • the present inventors tried to induce homologous recombination between homologous chromosomes by introducing a DNA break around the target site of the homologous chromosomes.
  • nicks were generated at multiple sites in the DNA region near the nucleotide to be modified on the recipient chromosome, and on the donor chromosome, nicks were generated on the recipient chromosome.
  • By creating a nick in at least one of the sites corresponding to the site of growth it was possible to significantly suppress non-homologous end joining and specifically induce recombination between homologous chromosomes at the target site ( An example of the introduction of a nick is shown in Figures 1A-H).
  • the present invention relates to genome editing utilizing homologous recombination between homologous chromosomes, and more specifically provides the following.
  • a method for producing a genome-edited cell which comprises: A cell having a different base between homologous chromosomes at a specific site of a homologous chromosome is introduced with a combination of site-specific nickases that single-strand breaks in a DNA region near the specific site, and one of the homologous chromosomes is used as a recipient.
  • a kit for use in the method according to any one of (1) to (3) In a cell having different bases between homologous chromosomes at a specific site of a homologous chromosome, including a combination of site-specific nickases that single-strand breaks in a DNA region in the vicinity of the specific site, The combination of the site-specific nickase, in the recipient chromosome, single-strand breaks at multiple sites in the DNA region in the vicinity of the specific site, in the donor chromosome, single-stranded in the recipient chromosome A kit for cutting a single strand at least at one position corresponding to the position to be cut.
  • the present invention it is possible to perform specific and highly efficient genome editing by homologous recombination between homologous chromosomes while significantly suppressing the occurrence of unintended mutations due to non-homologous end joining.
  • genome editing can be performed with high safety even when medical applications such as gene therapy are performed. it can.
  • FIG. 1A shows an example of a pattern of single-strand breaks of homologous chromosomes by a site-specific nickase in the method of the present invention.
  • FIG. 1B is a continuation of FIG. 1A.
  • FIG. 1B is a continuation of FIG. 1B.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1C.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1D.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1E.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1F.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1G.
  • FIG. 1A shows an example of a pattern of single-strand breaks of homologous chromosomes by a site-specific nickase in the method of the present invention.
  • FIG. 1B is a continuation of FIG. 1A.
  • FIG. 1B is a continuation of FIG. 1B.
  • FIG. 1C is a continuation of FIG. 1C.
  • FIG. 2A shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome that served as the donor for homologous recombination.
  • Uppercase letters indicate exons and lowercase letters indicate introns.
  • the nucleotide sequence surrounded by a square is the PAM sequence (the same applies to FIGS. 2B to 2H below).
  • Underlines indicate the target sites of TSCER2_TK1 (ex4) -322s, TSCER2_TK1 (ex4) 21s, and TSCER2_TK1 (ex4) 29s in order from the top.
  • FIG. 2B shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome that was the recipient of homologous recombination.
  • the underlines indicate the target sites of TSCER2_TK1 (ex4) -322s, TSCER2_TK1 (ex4) 21s, TSCER2_TK1 (ex4) 20s, and TSCER2_TK1 (ex4) 29s in order from the top.
  • FIG. 2C shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome that was the recipient of homologous recombination.
  • the underlines indicate the target sites of the TSCER2_TK1 (ex4) -S1 (upper diagram) and TSCER2_TK1 (ex4) -S2 (lower diagram) crRNA, respectively.
  • FIG. 2D shows the target site of crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome that was the recipient of homologous recombination.
  • FIG. 2E shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome as the recipient of homologous recombination.
  • Underlines indicate the target sites of the TSCER2_TK1 (ex4) -S5 (top panel) and TSCER2_TK1 (ex4) -S6 (bottom panel) crRNAs, respectively.
  • FIG. 2F shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome as the recipient of homologous recombination.
  • Underlines indicate the target sites of the TSCER2_TK1 (ex4) -S7 (upper diagram) and TSCER2_TK1 (ex4) -S8 (lower diagram) crRNA, respectively.
  • FIG. 2G shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome that was the recipient of homologous recombination.
  • FIG. 2H shows the target site of the crRNA (corresponding to the 5'side region of sgRNA) designed in this example in the thymidine kinase 1 gene of the chromosome as the recipient of homologous recombination.
  • Underlines indicate the target sites of the TSCER2_TK1 (ex4) -S11 (upper diagram) and TSCER2_TK1 (ex4) -S12 (lower diagram) crRNA, respectively.
  • FIG. 2I shows single-strand breaks at the target site when a combination of TSCER2_TK1 (ex4) -322s and TSCER2_TK1 (ex4) 20s was used as crRNA.
  • FIG. 3 shows the positions where single-strand breaks or double-strand breaks of DNA occur in each sample of this example.
  • FIG. 4A shows the result of detecting cells in which genome editing occurred in the sample of this example shown in FIG. 3 with the recovery of thymidine kinase activity as an index. The lower part of the figure is an enlarged graph of the samples # 1 to 6 in the figure.
  • FIG. 4B shows the result of detection of cells in which genome editing occurred in the sample of this example shown in FIG. 3 with the recovery of thymidine kinase activity as an index.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the base sequence of the target site after genome editing in the samples # 2 and # 7 of this example shown in FIGS. 3 and 4.
  • FIG. 6 shows the results of detection of cells in which genome editing occurred in the sample of the present example shown in FIG. 7 at the position where DNA single-strand breaks entered (upper figure) and recovery of thymidine kinase activity as an index. (Bottom of figure).
  • FIG. 7 shows the positions where single-strand breaks of DNA occur in each sample of this example.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing the base sequence of the target site after genome editing in the samples S3 / 20s and S12 / 20s of this example shown in FIGS. 6 and 7.
  • FIG. 9 shows the positions of DNA single-strand breaks (in the figure) in each sample of the present example shown in FIG. 10 and the cells in which genome editing occurred with the recovery of thymidine kinase activity as an index. The results (bottom of the figure) are shown.
  • FIG. 10 shows the positions where single-strand breaks of DNA are introduced in each sample of this example.
  • FIG. 11 shows the position of DNA single-strand break (in the figure) in each sample of the present example shown in FIG. 12 and the cells in which genome editing occurred with the recovery of thymidine kinase activity as an index. The results (bottom of the figure) are shown.
  • FIG. 12 shows the positions where single-strand breaks of DNA occur in each sample of this example.
  • the method for producing a genome-edited cell according to the present invention utilizes homologous recombination between homologous chromosomes induced by single-strand breaks by site-specific nickases, whereby different bases between homologous chromosomes are either The principle is to unify the bases.
  • a cell having a different base between homologous chromosomes at a specific site of the homologous chromosome is introduced with a combination of site-specific nickases that single-strand breaks in the DNA region near the specific site, and the homologous chromosome Homologous recombination with one of the recipients as the recipient and the other as the donor is induced to replace the recipient's base at the specific site with the donor's base.
  • the “cell” targeted for genome editing in the present invention is not particularly limited as long as it has a homologous chromosome, and various eukaryotic cells can be targeted.
  • eukaryotic cell include animal cells, plant cells, algal cells, and fungal cells.
  • animal cells include mammalian cells, as well as fish, bird, reptile, amphibian and insect cells.
  • Animal cells include, for example, cells that make up individual animals, cells that make up organs / tissues extracted from animals, and cultured cells derived from animal tissues. Specifically, for example, embryo cells of each stage embryo (eg, 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage embryo, morula stage embryo, etc.); induction Stem cells such as pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, hematopoietic stem cells; fibroblasts, hematopoietic cells, neurons, muscle cells, osteocytes, hepatocytes, pancreatic cells, brain cells, kidney cells, etc. Somatic cells and the like.
  • iPS pluripotent stem
  • ES embryonic stem
  • fibroblasts hematopoietic stem cells
  • neurons e.g, muscle cells, osteocytes, hepatocytes, pancreatic cells, brain cells, kidney cells, etc. Somatic cells and the like.
  • An oocyte after fertilization that is, a fertilized egg can be used to create a genome-edited animal.
  • the fertilized egg is of a pronuclear stage embryo.
  • a frozen-preserved oocyte can be thawed and used.
  • the term “mammal” is a concept that includes humans and non-human mammals.
  • non-human mammals are artiodactyls such as cows, boars, pigs, sheep and goats, perissodactyla such as horses, rodents such as mice, rats, guinea pigs, hamsters and squirrels, and Lagomorpha such as rabbits. , Meats such as dogs, cats and ferrets.
  • the non-human mammals described above may be domestic animals or companion animals (pet animals), or may be wild animals.
  • Plant cells include, for example, cells of cereals, oil crops, feed crops, fruits and vegetables.
  • Plant cells include, for example, cells that form individual plants, cells that form organs and tissues separated from plants, and cultured cells derived from plant tissues. Examples of plant organs and tissues include leaves, stems, shoot tips (growing points), roots, tubers, tubers, seeds, and callus. Examples of plants include rice, corn, banana, peanut, sunflower, tomato, rape, tobacco, wheat, barley, potato, soybean, cotton, carnation and the like.
  • a base that differs between homologous chromosomes at a specific site of a homologous chromosome may be a single base or a plurality of bases (base sequence). Further, it may be a mutation or a polymorphism. Examples of the mutation include substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and examples of the polymorphism include single nucleotide polymorphism and microsatellite polymorphism.
  • a chromosome having a mutation or polymorphism at a specific site can be a recipient for homologous recombination or a donor. That is, by the genome editing in the present invention, both bases of specific sites of two chromosomes constituting homologous chromosomes can be made into a normal sequence, or both can be made into a specific mutant sequence or polymorphic sequence. it can.
  • HLA HLA of a heterozygote can also be made into a homozygous HLA.
  • a typical embodiment of the present invention from the viewpoint of medical utility is to restore a mutation in a human cell to a normal sequence in order to treat or prevent a human disease caused by a heterozygous mutation.
  • a disease caused by a heterozygous mutation refers to a disease (dominant genetic disease) directly caused by the heterozygous mutation, as well as a disease (recessive recession) caused by a combination of two different mutations (complex heterozygote). (Genetic disease).
  • the target disease includes, for example, a disease caused by an autosomal heterozygous mutation having an autosomal dominant inheritance pattern such as OAS1 abnormality in congenital immunodeficiency, and an autosomal recessive inheritance pattern such as ADA deficiency.
  • the diseases include, but are not limited to, diseases that develop in an X-linked sex-linked genetic form in women, such as hemophilia with a female factor VIII / factor IX deficiency.
  • the “site-specific nickase” used in the present invention is not limited as long as it can site-specifically cleave single-stranded DNA on the genome, but the CRISPR-Cas system having a nickase-type Cas protein as a component is preferable.
  • Cas proteins usually contain a domain involved in cleavage of the target strand (RuvC domain) and a domain involved in cleavage of the non-target strand (HNH domain), whereas nickase-type Cas proteins typically Mutation of one of the domains results in loss of its cleavage activity.
  • RuvC domain a domain involved in cleavage of the target strand
  • HNH domain a domain involved in cleavage of the non-target strand
  • nickase-type Cas proteins typically Mutation of one of the domains results in loss of its cleavage activity.
  • spCas9 protein Cas9 protein derived from S.
  • pyogenes for example, mutation of the 10th amino acid from the N-terminus (aspartic acid) to alanine (mutation in D10A: RuvC domain) , N-terminal 840th amino acid (histidine) mutation to alanine (H840A: mutation in HNH domain), N-terminal 863rd amino acid (asparagine) mutation to alanine (N863A: HNH domain mutation) , Mutation of the 762nd amino acid (glutamic acid) from the N terminus to alanine (E762A: mutation in RuvCII domain), mutation of 986th amino acid from the N terminus (aspartic acid) to alanine (D986A: mutation in RuvCIII domain) ) Is mentioned.
  • Cas9 proteins of various origins are known (for example, WO2014 / 131833), and their nickase types can be used.
  • the amino acid sequence and base sequence of Cas9 protein are registered in a public database, for example, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (for example, accession number: Q99ZW2.1). ), These can be utilized in the present invention.
  • Cas proteins other than Cas9 for example, Cpf1 (Cas12a), Cas12b, CasX (Cas12e), Cas14 and the like can be used.
  • the mutation in the nickase Cpf1 protein include a mutation in AsCpf1 (Cas12) from the N-terminal to the 1226th amino acid (arginine) to alanine (R1226A: mutation in Nuc domain).
  • the amino acid sequence of Cpf1 is registered in a public database, for example, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (for example, accession numbers: WP_0217373622, WP_035635884).
  • a protein that constitutes the CRISPR-Cas system a protein to which a nuclear localization signal is added may be used.
  • the nickase-type Cas protein binds to the guide RNA to form a complex, which is targeted by the target DNA sequence to cut the single-stranded DNA.
  • the guide RNA includes crRNA and tracrRNA, but in the CRISPR-Cpf1 system, the tracrRNA is unnecessary.
  • the guide RNA in the CRISPR-Cas9 system may be a single-molecule guide RNA containing crRNA and tracrRNA or a double-molecule guide RNA consisting of a crRNA fragment and a tracrRNA fragment.
  • the CrRNA contains a base sequence complementary to the target DNA sequence.
  • the target DNA sequence is usually a base sequence consisting of 12 to 50 bases, preferably 17 to 30 bases, and more preferably 17 to 25 bases, and is selected from a region adjacent to the PAM (proto-spacer adjuvant motif) sequence.
  • PAM proto-spacer adjuvant motif
  • site-specific cleavage of DNA occurs at a position determined by both the base pairing complementarity between the crRNA and the target DNA sequence and the PAM that is adjacent to it.
  • crRNA further contains a base sequence capable of interacting (hybridizing) with a tracrRNA fragment on the 3'side.
  • tracrRNA contains a base sequence capable of interacting (hybridizing) with a part of the base sequence of crRNA on the 5'side. Due to the interaction of these base sequences, crRNA / tracrRNA (one molecule or two molecules) forms a double-stranded RNA, and the formed double-stranded RNA interacts with the Cas protein.
  • PAM differs depending on the type and origin of Cas protein.
  • a typical PAM sequence is, for example, S.
  • the Cas9 protein (type II) derived from P. pyogenes is "5'-NGG", and S.
  • the Cas9 protein (type I-A1) derived from S. solfataricus is "5'-CCN", and S.
  • the Cas9 protein (type I-A2) derived from S. sofataricus is "5'-TCN", and H.
  • Cas9 protein (type IB) derived from walsbyl it is "5'-TTC", and E.
  • the Cas9 protein (IE type) derived from E. coli is "5'-AWG",
  • the Cas9 protein (type I-F) derived from Aeruginosa it is "5'-CC”.
  • the Cas9 protein (Type II-A) derived from Thermophilus is "5'-NNAGAA”, and S.
  • the Cas9 protein (type II-A) derived from Agalactiae is "5'-NGG”, and S.
  • the Cas9 protein derived from Aureus it is "5'-NGRRT" or "5'-NGRRN”.
  • the Cas9 protein derived from Meningitidis is "5'-NNNNGATT", and T.
  • the Cas9 protein derived from denticola it is "5'-NAAAC”.
  • Cpf1 it is typically "5'-TTN” or “5'-TTTN”. It is also possible to modify PAM recognition by modifying the protein (for example, introducing a mutation) (Benjamin, P. et al., Nature 523, 481-485 (2015), Hirano, S. et al., Molecular). Cell 61, 886-894 (2016)).
  • a site-specific nickase other than the CRISPR-Cas system can also be used.
  • a site-specific nickase include an artificial nuclease fused with an enzyme having nickase activity.
  • the artificial nuclease for example, TALE (transcription activator-like effector), ZF (zinc finger), and PPR (pentatriceptide repeat) can be used.
  • An example of an enzyme capable of exerting a nickase activity by fusion with these artificial nucleases is TevI (Nat Commun. 2013; 4: 1762. Doi: 10.1038 / ncomms2782).
  • These artificial nucleases are targeted to a target DNA sequence by a DNA binding domain constructed by linking a module (peptide) that recognizes a specific base (or a specific base sequence), and are fused to the DNA binding domain.
  • the nickase cleaves the DNA into single strands.
  • An appropriate spacer peptide may be introduced between the DNA binding domain and nickase in the artificial nuclease.
  • single-strand breaks are made at multiple sites in the DNA region in the vicinity of the specific site (bases that differ between homologous chromosomes).
  • a combination of site-specific nickases that single-strand breaks at at least one of the positions corresponding to the sites where double-strand breaks are used.
  • nearby DNA region is usually within 100,000 bases, within 10000 bases, within 5000 bases, within 2000 bases, and preferably within 1000 bases (eg, within 500 bases, within 400 bases, 300 bases) from a specific site. Within bases, within 200 bases, within 100 bases, within 50 bases, within 20 bases, within 10 bases).
  • the "plurality of neighboring DNA regions” may be in the same DNA chain or on different DNA chains.
  • one site is provided in each of the 5′-side DNA region and the 3′-side DNA region of the specific site (pattern 1 and pattern 2 in FIG. 1A and patterns 1 ′ and 2 (in FIG. 1C).
  • pattern 1 and pattern 2 in FIG. 1A and patterns 1 ′ and 2 in FIG. 1C.
  • a) ′, pattern 2 (b) ′ in FIG. 1D), and two locations in the DNA region near the 5 ′ side of the specific site pattern 3 (a) in FIG. 1B, pattern 4 (a), pattern 3 in FIG. 1D.
  • pattern 4 (a) ′ in FIG. 1E two locations in the DNA region near the 3 ′ side of the specific site (pattern 3 (b) in FIG. 1B, pattern 4 (b), pattern in FIG. 1E).
  • a mode in which all single-strand breaks in the donor chromosome and the recipient chromosome correspond (pattern 1 in FIG. 1A, pattern 3 in FIG. 1B, pattern 1 ′ in FIG. 1C, pattern 3 in FIG. 1D ( a) ′, pattern 3 (b) ′ in FIG. 1E, pattern 6 in FIG. 1G, pattern 7 (d) in FIG. 1H),
  • the site-specific nickase that binds to the target DNA sequence of the recipient chromosome is It may be designed so that it also binds to the corresponding DNA sequence of the chromosome.
  • the target DNA sequence of the recipient's chromosome and the corresponding DNA sequence of the donor's chromosome are typically the same DNA sequence.
  • a mode in which part of the single-strand break in the donor chromosome and the recipient chromosome does not correspond (Pattern 2 in FIG. 1A, Pattern 4 in FIG. 1B, Pattern 2 (a) ′ in FIG. 1C, In the pattern 2 (b) ′ of FIG. 1D, the pattern 4 (a) ′ of FIG. 1E, the pattern 4 (b) ′ of FIG. 1F, the pattern 5 of FIG. 1G, and the patterns 7 (a) to (c) of FIG. 1H)
  • the target DNA sequence of the recipient's chromosome and the corresponding DNA sequence of the donor's chromosome are different DNA sequences.
  • the target DNA sequence of the site-specific nickase is set so as to include bases that are replaced by genome editing (bases that differ between homologous chromosomes)
  • the target DNA sequence of the recipient chromosome and the corresponding DNA of the donor chromosome The sequences will be different DNA sequences.
  • the site-specific nickase is the CRISPR-Cas system
  • the guide RNA may be designed so that it has binding specificity to the target DNA sequence of the recipient.
  • the DNA binding domain may be designed so that it has binding specificity to the target DNA sequence of the recipient.
  • the site to be single-stranded is usually within about 100 bases, more preferably within 50 bases from the above-mentioned specific site (bases that differ between homologous chromosomes). (For example, within 40 bases, within 30 bases, within 20 bases, within 10 bases).
  • the distance between single-strand breaks on different DNA strands is usually 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and usually 2000 bases or less, preferably 1000 bases or less, more preferably 500 bases.
  • site-specific nickases is introduced into cells.
  • site-specific nickase is introduced into cells as messenger RNA translated into guide RNA and Cas protein, even in the form of a combination of guide RNA and Cas protein. Or a combination of vectors expressing them.
  • the guide RNA may be modified (such as chemically modified) to suppress degradation.
  • an artificial nuclease fused with an enzyme having nickase activity for example, it may be in the form of a protein, messenger RNA translated into the protein, or a vector expressing the protein. May be.
  • operably linked means that the DNA is expressibly linked to a regulatory element.
  • regulatory elements include promoters, enhancers, internal ribosome entry sites (IRES), and other expression control elements (eg, transcription termination signals, such as polyadenylation signals and polyU sequences).
  • promoter examples include polIII promoter (for example, U6 and H1 promoter), polII promoter (for example, retrovirus Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerol kinase (PGK) promoter, and EF1 ⁇ promoter), polI promoter, or a combination thereof.
  • polIII promoter for example, U6 and H1 promoter
  • polII promoter for example, retrovirus Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerol kinase (PGK) promoter, and EF1 ⁇ promoter
  • PGK phosphoglycerol kina
  • the site-specific nickase can be introduced into cells by known methods such as electroporation, microinjection, DEAE-dextran method, lipofection method, nanoparticle-mediated transfection method, and virus-mediated nucleic acid delivery method. You can
  • a combination of site-specific nickases, in the recipient chromosome, single-strand breaks at multiple sites in the DNA region near the target base, in the donor chromosome, single-stranded in the recipient chromosome Single-strand breaks at at least one of the locations corresponding to the location to be cut. This markedly suppressed the occurrence of unintended mutations due to non-homologous end joining, while inducing homologous recombination between homologous chromosomes, specifically and efficiently replacing the target base with the corresponding base in the donor.
  • the occurrence of unintended mutations due to non-homologous end joining is suppressed by 90% or more, preferably 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100%). can do.
  • the present invention also provides a kit for use in the method of the present invention, which comprises a combination of the above site-specific nickases.
  • the kit may further include one or more additional reagents, and examples of the additional reagent include a dilution buffer, a reconstitution solution, a washing buffer, a nucleic acid introduction reagent, a protein introduction reagent, and a control reagent. (For example, a control guide RNA), but is not limited thereto.
  • the kit may include instructions for carrying out the methods of the invention.
  • TSCER2 cells Cells derived from lymphoblast TK6 cells (one nucleotide inserted into exon 4; frameshift) having a heterozygous mutation of the Thymidine Kinase 1 gene (TK1). Insertion of 31 base pairs into healthy allele intoron 4 (which is not related to loss of TK1 gene function per se) and mutation in exon 5 to change to complex heterozygous mutation, resulting in loss of TK1 gene function. There is.
  • thymidine kinase-dependent DNA synthesis salvage pathway does not function, if the DNA de novo synthesis pathway is blocked by aminopterin, the cells cannot proliferate even if 2-deoxycytidine, hypoxanthine, and thymidine are supplied.
  • CHAT medium (10 ⁇ M 2-deoxycytidine [Sigma], 200 ⁇ M hypoxanthine [Sigma], 100 nM aminopterin [Sigma], and even 17.5 ⁇ M thymidine] cell proliferation is possible [Sigma]. .
  • FIG. 2A A wild-type target region (sequence of TK1 Intron3 to Exon4 to Intron4) serving as a donor is shown in FIG. 2A (SEQ ID NO: 1). Uppercase letters indicate exons and lowercase letters indicate introns. The base sequence surrounded by a square is the PAM sequence. Underlines indicate the target site of TSCER2_TK1 (ex4) -322s, the target site of TSCER2_TK1 (ex4) 21s, and the target site of TSCER2_TK1 (ex4) 29s in order from the top.
  • mutant target region that serves as the recipient is shown in FIG. 2B (SEQ ID NO: 2).
  • Uppercase letters indicate exons and lowercase letters indicate introns.
  • the base sequence surrounded by a square is the PAM sequence.
  • the underlines indicate the target sites of TSCER2_TK1 (ex4) -322s, TSCER2_TK1 (ex4) 21s, TSCER2_TK1 (ex4) 20s, and TSCER2_TK1 (ex4) 29s in order from the top.
  • FIGS. 2C to 2H SEQ ID NOs: 3 to 14
  • Uppercase letters indicate exons
  • lowercase letters indicate other sequences.
  • the base sequence surrounded by a square is the PAM sequence.
  • Target sequence sites are underlined.
  • TSCER2_TK1 (ex4) 20s CGTCTCGGAGCAGCGCAGGCG GGG (SEQ ID NO: 15) TSCER2_TK1 (ex4) 21s ACGTCTCGGAGCAGGCAGGC GGG (SEQ ID NO: 16) TSCER2_TK1 (ex4) -322s CCTCAGCCACAAAGAGTAGCT GGG (SEQ ID NO: 17) TSCER2_TK1 (ex4) 29s CCTGGGCCACGTCTCGGAGC AGG (SEQ ID NO: 18) TSCER2_TK1_S1 ACCTCTAGACCATGGATCG AGG (SEQ ID NO: 19) TSCER2_TK1_S2 CTGACAAAGAGCCTCTCAC TGG (SEQ ID NO: 20) TSCER2_TK1_S3 ATTCAAGGGAGGGAGCACCCC AGG (SEQ ID NO: 21) TSCER2_TK1_S3 ATTCAAGGGAGGGAGCACCCC AGG (SEQ ID NO: 21) T
  • TSCER2_TK1 (ex4) 29s is used between [CCTGCT] and [CCGAGACTGGGCCCAGG]
  • TSCER2_TK1_S is used when TSCER2_TK is used.
  • TSCER2_TK1_S2 is used between [CCTCAG] and [ATCCATGGTCTAGAGGT]
  • [CCAGTG] and [AAGGAGCTCTTTTGTCAG] and when TSCER2_TK1_S3 [CCTGGG] and CCTGCT of [CCTGGG] and [GTCTCT].
  • TSCER2_TK1_S4 When TSCER2_TK1_S4 is used, between [CCTGTC] and [CAGTGGAAAAATCACAAG]; when TSCER2_TK1_S5 is used, between [CCAGCT] and [GTTGGAAGTACAACTTC]; When using TSCER2_TK1_S7 between [GAAGTTTGGCCCTAGTCTG] and [CCCTCG] and [CTGAACTTGGAAGTTTATC], when using TSCER2_TK1_S8 between [CCAGGA] and [GGTATAGATGG_T1 using SCCER2_TK1_S8] and [CCAGGA] and [GGTAGATGTGATKS] are used.
  • [CCC C GCCTGCCTGCTCCGAGACG] sequences on mutant alleles is a wild-type sequence of healthy allyl modified by homologous chromosomes Hazama recombination as a template, if it is corrected with [CCCGCCTGCCTGCTCCGAGACG], rhino The midine kinase activity is restored.
  • Cas9 and sgRNA were expressed using a vector that expresses both Cas9 and sgRNA.
  • the vectors used are shown below.
  • EGFP-positive cells (cells that were successfully transfected with the PX461 or PX458 vector) were sorted using FACSAriaII or FACSAriaIII.
  • the sorted cells were cultured in 10% horse serum / RPMI1640 medium for 1 day and 5% horse serum / RPMI1640 medium for 5 days.
  • CHAT medium 10 ⁇ M 2-deoxycytidine [Sigma], 200 ⁇ M hypoxanthine [Sigma], 100 nM aminopterin [Sigma], and 17.5 ⁇ M thymidine [Sigma]).
  • the plate was dispensed at 10, 20, 100, or 200 cells per well, and the culture was continued. Further, in order to measure the plating efficiency, cells in 5% horse serum-RPMI1640 medium were dispensed to 96 plates at 0.5 or 1 cell per well, and cultured. Two weeks later, the percentage of wells that formed colonies was measured.
  • FIG. 5A the DNA sequence result in a cell corrected by homologous inter-chromosomal recombination is shown in FIG. 5B, and an example of a DNA sequence with a nucleotide deletion is shown in FIGS. 5C and D.
  • the percentage of cells in which the mutant allele was corrected to wild type was 100% (111 clones / 111 clones) in sample # 2 (Table 1).
  • VN1 PX461 (Cas9D10A-P2A-GFP) -TSCER2_TK1 (ex4) 20s
  • VN2 PX462 (Cas9D10A-P2A-PuroR) -TSCER2_TK1 (ex4) 20s
  • VN5 PX462 (Cas9D10A-P2A-PuroR) -empty
  • VS1 PX462 (Cas9D10A-P2A-PuroR) -TSCER2_TK1-S1 VS2: PX462 (Cas9D10A-P2A-PuroR) -TSCER2_TK
  • FIG. 7 the positions where the nicks enter in each sample are shown in FIG. In each sample, the expected distance between nicks (distance between site A and site B in FIG. 7) and cutting pattern (see FIGS. 1A to 1H) are as follows. -322s / 20s: 341nt, pattern 2 (a) S1 / 20s: 8173nt, pattern 2 (a) S2 / 20s: 5678nt, pattern 2 (a) S3 / 20s: 3964nt, pattern 2 (a) S4 / 20s: 2369nt, pattern 2 (a) S5 / 20s: 1367nt, pattern 2 (a) S6 / 20s: 608nt, pattern 2 (a) S7 / 20s: 136nt, pattern 4 (b) S8 / 20s: 1004nt, pattern 4 (b) S9 / 20s: 2353nt, pattern 4 (b) S10 / 20s: 4041nt, pattern 4 (b) S
  • the sorted cells were cultured in 10% horse serum / RPMI1640 medium for 1 day and then in 5% horse serum / RPMI1640 medium. 1-2 weeks after electroporation, a part of the cells was transferred to CHAT medium (10 ⁇ M 2-deoxycytidine [Sigma], 200 ⁇ M hypoxanthine [Sigma], 100 nM aminopterin [Sigma], and 17.5 ⁇ M thymidine [Sigma]]. , 96 plates were dispensed at 40 or 100 cells per well, and the culture was continued. Further, in order to measure the plating efficiency, cells in 5% horse serum-RPMI1640 medium were dispensed into 96 plates at 1 cell per well and cultured. After 2-3 weeks, the percentage of wells that formed colonies was measured.
  • a direct PCR of the DNA fragment in the Intron3 to Intron4 region and the DNA fragment in the Intron4 to Intron5 region of the TK1 gene in the cells forming the colony, or PCR using the extracted genomic DNA as a template was amplified by.
  • the Kaneka simple DNA extraction kit Version 2 (Kaneka) was used for genomic DNA extraction.
  • Direct PCR includes MightyAmp DNA Polymerase Ver. 2 (Takara Bio) was used.
  • KOD plus neo (TOYOBO) was used for PCR using the genomic DNA as a template.
  • the PCR fragment of the Intron3 to Intron4 region was subjected to DNA sequence analysis by the Sanger sequencing method using [TGAACACTGAGCCTGCTT (SEQ ID NO: 33)], and the PCR fragment of the Intron4 to Intron5 region was [TAACCCTGTGGTGGGCTGA (SEQ ID NO: 36)]. ..
  • the DNA sequence results before editing the Intron4 to Intron5 regions are shown in FIG. 8 (a), and the DNA sequence results in cells in which both alleles became wild type by homologous interchromosomal recombination are shown in FIG. 8 (b).
  • the cutting patterns (see FIGS. 1A to 1H) in each sample are as follows.
  • Each plasmid in the amount shown in the above list was mixed with 150 ⁇ 10 4 TSCER2 cells in 30 ⁇ L of R buffer (Invitrogen Neon Transfection Kit), and 10 ⁇ L of these was mixed with 1300 V for 20 ms twice. Electroporation was performed using the Transfection System (electroporation condition 2). After overnight culture in 10% horse serum / RPMI1640 medium at 37 ° C. and 5% CO2, EGFP-positive cells (cells that were successfully transfected with the PX461 vector) were sorted using FACSAriaII or FACSAriaIII.
  • the sorted cells were cultured in 10% horse serum / RPMI1640 medium for 1 day and then in 5% horse serum / RPMI1640 medium for 5 days. 1-2 weeks after electroporation, a part of the cells was transferred to CHAT medium (10 ⁇ M 2-deoxycytidine [Sigma], 200 ⁇ M hypoxanthine [Sigma], 100 nM aminopterin [Sigma], and 17.5 ⁇ M thymidine [Sigma]]. , 96 plates were dispensed at 20 or 200 cells per well, and the culture was continued. Further, in order to measure the plating efficiency, cells in 5% horse serum-RPMI1640 medium were dispensed into 96 plates at 1 cell per well and cultured. After 2-3 weeks, the percentage of wells that formed colonies was measured.
  • the proportion of cells that recover thymidine kinase activity in sample S3 / 20s / S11 is also higher than that in samples S3 / 20s / emp and sample 20s / S11 / emp, and cells that recover thymidine kinase activity in sample S6 / 20s / S8 Of sample S6 / 20s / emp and sample 20s / S8 / emp, and the ratio of cells recovering thymidine kinase activity in sample S6 / 20s / S11 was also sample S6 / 20s / emp and sample 20s / It was shown to be higher than S11 / emp.
  • Example 4 Verification of genome editing efficiency by multiple nick method without using exogenous DNA A.
  • Materials sgRNAs targeting the regions (S3, 20s, 29s, S8) shown in FIG. 11 or sgRNAs (no) having no target sequence in the human genome were combined as follows and introduced into TSCER2 cells together with Cas9D10A mRNA. ..
  • sgRNA was added in the amounts shown in the above list, Cas9 mRNA (500 ng / ⁇ L) was added in 1.8 ⁇ L, and R buffer (Invitrogen Neon Transfection Kit) was added to 70 ⁇ 10 4 TSCER2 cells to give a total amount of 14 ⁇ L. .. 10 ⁇ L of this was electroporated by the Neon Transfection System under the condition of 1500 V 10 ms 3 times (electroporation condition 3). Overnight culture was performed in 10% horse serum / RPMI1640 medium at 37 ° C. and 5% CO2, and then, interculturing was performed in 5% horse serum / RPMI1640 medium.
  • CHAT medium (10 ⁇ M 2-deoxycytidine [Sigma], 200 ⁇ M hypoxanthine [Sigma], 100 nM aminopterin [Sigma], and 17.5 ⁇ M thymidine [Sigma]).
  • the plate was dispensed at 10, 30, 100, or 200 cells per well, and the culture was continued. Further, in order to measure the plating efficiency, cells in 5% horse serum-RPMI1640 medium were dispensed into 96 plates at 1 cell per well and cultured. After 2-3 weeks, the percentage of wells that formed colonies was measured.
  • Recipient allele has 1 spot and donor allele has 1 spot Nick sample S3 (0.133 ⁇ 0.026%), 29s (0.844 ⁇ 0.305%), S8 (0.773 ⁇ 0.221%) ,
  • the thymidine kinase activity was recovered with higher efficiency than the sample 20s (0.147 ⁇ 0.022%) in which the recipient allele was introduced at one site and the donor allele was not nicked.
  • the present invention by utilizing homologous recombination between homologous chromosomes induced by single-strand breaks by site-specific nickase, different bases between homologous chromosomes can be either bases. It is possible to unify.
  • the present invention which does not use a foreign donor DNA, can greatly contribute to gene therapy of diseases caused by hetero mutations in particular because of its high safety.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

レシピエントとなる染色体上の修正対象とするヌクレオチドの近傍ＤＮＡ領域の複数箇所にニックを生じさせ、かつ、ドナーとなる染色体上では、レシピエントの染色体においてニックを生じさせる箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所でニックを生じさせることにより、非相同末端結合が顕著に抑制され、標的部位における相同染色体間での組換えが特異的に誘導されることを見出した。

Description

ゲノム編集された細胞を製造する方法
　本発明は、ゲノム編集された細胞を製造する方法に関し、主として、相同染色体間の相同組換えにより、ヘテロ変異が正常配列に置換された細胞の製造方法に関する。
　ＴＡＬＥＮｓやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系などのプログラム可能なヌクレアーゼの登場により、現在、ゲノム編集技術は、急速な広まりを見せている。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、この複合体が、ガイドＲＮＡと相補的な配列を持つゲノム上の標的部位に結合して、ＤＮＡ二本鎖の両方を切断する。一世代前のゲノム編集技術であるＴＡＬＥＮｓは、ＤＮＡを標的化するＴＡＬＥタンパク質とＤＮＡを切断するヌクレアーゼ（主として、ＦｏｋＩ）との融合タンパク質であるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と同様に、ゲノム上の標的部位でＤＮＡの二本鎖切断を生じさせる。
　このＤＮＡの二本鎖切断は、非相同末端結合により修復された場合、ヌクレオチドの挿入や欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ：　ｉｎｄｅｌ）が生じ、フレームシフトなどにより遺伝子ノックアウトを行うことができる。一方、細胞外から、修復鋳型となるドナーＤＮＡを導入した場合には、ゲノムとドナーＤＮＡとの間の相同組換えにより、遺伝子ノックインを行うことができる。この遺伝子ノックインにおいては、ＤＮＡの挿入のみならず、１～数ヌクレオチドの置換や欠失を生じさせることも可能である。
　しかしながら、ゲノム恒常性の観点では、プログラム可能なヌクレアーゼを用いたゲノム編集には大きな問題がある。その一つは、ＤＮＡの二本鎖切断による目的外の遺伝子変異の発生である。体細胞では、相同組換えによる修復よりも非相同末端結合による修復が優位であるため、ゲノム編集系により二本鎖切断された標的部位では、修復鋳型によるノックインよりも、目的外の変異（ｉｎｄｅｌ）が生じやすい。そのため、ゲノム編集を実施した細胞集団において、目的通りのノックインを達成できた細胞や遺伝子配列の変化が全く起こらなかった細胞に加え、非相同末端結合に起因する目的外の変異が生じた細胞が少なからず含まれてしまう。また、１細胞レベルで見れば、常染色体の対立遺伝子のうち１つが計画通りにノックインされても、もう一方には目的外の変異が入る可能性がある。また、プログラム可能なヌクレアーゼは、標的配列と類似性の高いＤＮＡ配列（オフターゲット）においてもＤＮＡ二本鎖切断を発生させ、ゲノム変異を生じさせることが報告されている。
　そこで、本発明者らは、Ｃａｓ９の２つのヌクレアーゼ部位のうち一方を失活させたニッカーゼ型Ｃａｓ９を用い、ＤＮＡの一本鎖切断によって相同組換えを誘導することにより、従来のＤＮＡの二本鎖切断による手法と比較して、非相同末端結合による目的外の変異（ｉｎｄｅｌ）の発生を抑制しうる手法を開発した。その一つは、ニッカーゼを用い、標的とするゲノムに２箇所、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れることによる、タンデムニック法を利用したゲノム編集法である（非特許文献１、特許文献１）。また、本発明者らは、この方法をさらに発展させ、標的とするゲノムに１箇所のニックを入れ、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れるＳＮＧＤ法（ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｉｃｋｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｄｏｎｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ）も開発した（特許文献１）。
　その一方で、ゲノム編集においては、修復鋳型として用いるドナーＤＮＡのゲノムへのランダムな組み込みという問題もある。すなわち、細胞にＤＮＡを多量に導入すると、ＤＮＡの一部がゲノムの任意の部位に組み込まれてしまう現象（ランダムインテグレーション）が高頻度に発生する。しかしながら、ランダムインテグレーションが生じた部位を同定することは困難であり、医療応用などを行う場合には、安全性の面で問題となる。
特開２０１８－１１５２５号公報
Ｎａｋａｊｉｍａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　２８，　２２３－２３０，　２０１８
　本発明は、このような上記従来技術の有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、外来のドナーＤＮＡを用いずに、特異的かつ高効率に、相同組換えによるゲノム編集を行う方法を提供することにある。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、まず、細胞外からドナーＤＮＡを導入するのではなく、細胞に元々存在する相同染色体を修復鋳型としてゲノム編集を行うことにより、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションという問題を回避することを構想した。
　細胞内の染色体にヘテロ接合体変異あるいは複合ヘテロ接合体変異が存在する場合、一方のアリル（これを「アリルＡ」と称する）に存在する遺伝子変異は、もう一方のアリル（これを「アリルＢ」と称する）には存在しない。ここで、仮に、アリルＡとアリルＢとの間で相同組換えを誘導することができれば、アリルＢを修復鋳型としてアリルＡの変異を正常配列に修復したり、逆に、アリルＡを鋳型としてアリルＢの正常配列に変異を導入することが可能である。この場合、既存法において鋳型として用いていた外来のドナーＤＮＡ（人工合成ＤＮＡ鎖やプラスミドなど）は不要となる。しかしながら、体細胞において相同組換え修復が起こるのは姉妹染色分体間であり、相同染色体間での相同組換えは非常に起こりにくい。
　そこで、本発明者らは、相同染色体の標的部位周辺にＤＮＡ切断を導入することによる、相同染色体間の相同組換えの誘導を試みた。様々な切断様式を検討した結果、レシピエントとなる染色体上の修正対象とするヌクレオチドの近傍ＤＮＡ領域の複数箇所にニックを生じさせ、かつ、ドナーとなる染色体上では、レシピエントの染色体においてニックを生させる箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所にニックを生じさせることにより、非相同末端結合を顕著に抑制し、標的部位における相同染色体間での組換えを特異的に誘導することに成功した（ニックの導入の例を図１Ａ～Ｈに示す）。そして、これにより、目的外の変異を生じさせずに、高効率で標的の変異を修復することに成功した。さらに、本発明者らは、この方法の原理によれば、広く、相同染色体間で異なる塩基を標的として、いずれかの塩基に統一することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、相同染色体間の相同組換えを利用したゲノム編集に関するものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
　（１）ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する方法。
　（２）置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、（１）に記載の方法。
　（３）部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、（１）又は（２）に記載の方法。
　（４）（１）から（３）のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断するキット。
　本発明によれば、非相同末端結合による目的外の変異の発生を顕著に抑制しながら、相同染色体間の相同組換えによって、特異的かつ高効率にゲノム編集を行うことができる。また、相同組換えに外来のドナーＤＮＡを利用ぜず、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションという問題も生じないことから、遺伝子治療などの医療応用を行った場合でも、高い安全性でゲノム編集を行うことができる。
図１Ａは、本発明の方法における、部位特異的ニッカーゼによる相同染色体の一本鎖切断のパターンの例を示す。 図１Ａの続きの図である。 図１Ｂの続きの図である。 図１Ｃの続きの図である。 図１Ｄの続きの図である。 図１Ｅの続きの図である。 図１Ｆの続きの図である。 図１Ｇの続きの図である。 図２Ａは、相同組換えのドナーとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５′側領域に相当）の標的部位を示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である（以下、図２Ｂ～Ｈについても同様）。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。 図２Ｂは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。 図２Ｃは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ２（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。 図２Ｄは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ３（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ４（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。 図２Ｅは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ５（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ６（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。 図２Ｆは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ７（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ８（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。 図２Ｇは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ９（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１０（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。 図２Ｈは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１１（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１２（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。 図２Ｉは、ｃｒＲＮＡとして、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓとＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓの組み合わせを用いた場合における、標的部位の一本鎖切断を示す。 図３は、本実施例の各サンプルにおいて、ＤＮＡの一本鎖切断又は二本鎖切断が入る位置を示す。 図４Ａは、図３に示した本実施例のサンプルにおいて、サイミジンキナーゼ活性の回復を指標にゲノム編集が生じた細胞を検出した結果を示す。図下は、図上のサンプル＃１～６のグラフを拡大したものである。 図４Ｂは、図３に示した本実施例のサンプルにおいて、サイミジンキナーゼ活性の回復を指標にゲノム編集が生じた細胞を検出した結果を示す。図４Ａとは、ニッカーゼ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を発現するプラスミドを細胞へ導入する際のエレクトロポレーションの条件が異なる。 図５は、図３及び４に示した本実施例のサンプル＃２及び＃７において、ゲノム編集後の標的部位の塩基配列を解析した結果を示す。 図６は、図７に示した本実施例のサンプルにおける、ＤＮＡの一本鎖切断が入る位置（図上）及び、サイミジンキナーゼ活性の回復を指標にゲノム編集が生じた細胞を検出した結果（図下）を示す。 図７は、本実施例の各サンプルにおいて、ＤＮＡの一本鎖切断が入る位置を示す。 図８は、図６及び７に示した本実施例のサンプルＳ３／２０ｓ及びＳ１２／２０ｓにおいて、ゲノム編集後の標的部位の塩基配列を解析した結果を示す。 図９は、図１０に示した本実施例の各サンプルにおける、ＤＮＡの一本鎖切断が入る位置（図上）及び、サイミジンキナーゼ活性の回復を指標にゲノム編集が生じた細胞を検出した結果（図下）を示す。 図１０は、本実施例の各サンプルにおいて、ＤＮＡの一本鎖切断が入る位置を示す。 図１１は、図１２に示した本実施例の各サンプルにおける、ＤＮＡの一本鎖切断が入る位置（図上）及び、サイミジンキナーゼ活性の回復を指標にゲノム編集が生じた細胞を検出した結果（図下）を示す。 図１２は、本実施例の各サンプルにおいて、ＤＮＡの一本鎖切断が入る位置を示す。
　本発明におけるゲノム編集された細胞を製造する方法は、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断により誘導された相同染色体間の相同組換えを利用して、相同染色体間で異なる塩基を、いずれかの塩基に統一することを原理とする。
　具体的には、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換する。
　本発明におけるゲノム編集の対象となる「細胞」としては、相同染色体を有する限り、特に制限はなく、様々な真核細胞を対象とすることができる。「真核細胞」としては、例えば、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞が挙げられる。また動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。
　「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成には、受精後の卵母細胞、すなわち受精卵を用いることができる。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。受精前の卵母細胞には、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　本発明において「哺乳動物」とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。上記の非ヒト哺乳動物は、家畜又はコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。
　「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスなどが挙げられる。植物の例としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられる。
　相同染色体の特定の部位における「相同染色体間で異なる塩基」は、一つの塩基であっても、複数の塩基（塩基配列）であってもよい。また、変異であっても、多型であってもよい。変異としては、例えば、置換、欠失、挿入、又はこれらの組み合わせが挙げられ、多型には、例えば、一塩基多型やマイクロサテライト多型が挙げられる。
　本発明においては、相同染色体のうち、特定部位に変異や多型を持つ染色体を、相同組換えにおけるレシピエントとすることも、ドナーとすることもできる。すなわち、本発明におけるゲノム編集により、相同染色体を構成する２つの染色体の特定部位の塩基を、双方とも正常配列にすることもでき、また、双方とも特定の変異配列や多型配列にすることもできる。例えば、ＨＬＡにおいては、ヘテロ接合体のＨＬＡをホモ接合体ＨＬＡにすることもできる。
　医療上の有用性の観点からの典型的な本発明の利用態様は、ヘテロ接合体変異に起因するヒトの疾患を治療又は予防するために、ヒト細胞における当該変異を正常配列へと修復することである。ここで「ヘテロ接合体変異に起因する疾患」としては、当該ヘテロ変異により直接的に生じる疾患（優性遺伝疾患）の他、２種の異なる変異の組み合わせ（複合ヘテロ接合体）により生じる疾患（劣性遺伝疾患）も含む意である。対象疾患としては、例えば、先天性免疫不全症におけるＯＡＳ１異常症などの常染色体優性遺伝形式をとる常染色体ヘテロ接合体変異により発症する疾患、ＡＤＡ欠損症などの常染色体劣性遺伝形式をとる遺伝性疾患、及び女性の第ＶＩＩＩ因子・第ＩＸ因子欠損の血友病などの女性でＸ連鎖性伴性遺伝形式で発症する疾患が挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明に用いる「部位特異的ニッカーゼ」としては、ゲノム上の部位特異的にＤＮＡを一本鎖切断できるものであれば制限はないが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が好ましい。Ｃａｓタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（ＲｕｖＣドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（ＨＮＨドメイン）を含むが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質は、典型的には、これら２つのドメインのいずれかのドメインの変異により、その切断活性が喪失している。このような変異としては、ｓｐＣａｓ９タンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質）の場合には、例えば、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ：ＲｕｖＣドメイン内の変異）、Ｎ末端から８４０番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（Ｈ８４０Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から８６３番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（Ｎ８６３Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から７６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（Ｅ７６２Ａ：ＲｕｖＣＩＩドメイン内の変異）、Ｎ末端から９８６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ９８６Ａ：ＲｕｖＣＩＩＩドメイン内の変異）が挙げられる。その他、種々の由来のＣａｓ９タンパク質が公知であり（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３）、それらのニッカーゼ型を利用することができる。なお、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。
　また、本発明においては、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１４などを利用することもできる。ニッカーゼ型Ｃｐｆ１タンパク質における変異としては、例えば、ＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２）では、Ｎ末端から１２２６番目のアミノ酸（アルギニン）のアラニンへの変異（Ｒ１２２６Ａ：Ｎｕｃドメイン内の変異）が挙げられる。Ｃｐｆ１のアミノ酸配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されている（例えば、アクセッション番号：ＷＰ＿０２１７３６７２２、ＷＰ＿０３５６３５８４１など）。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を構成するタンパク質としては、核移行シグナルを付加したものを用いてもよい。
　ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡと結合して複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列に標的化されてＤＮＡを一本鎖切断する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系においては、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系においては、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系におけるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡでも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
　ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む。標的ＤＮＡ配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域より選択されることが好ましい。典型的には、ＤＮＡの部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡ配列の間の塩基対形成の相補性と、それに隣接して存在するＰＡＭの両方によって決定される位置で生じる。
　多くのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（一分子又は二分子）が二重鎖ＲＮＡを形成し、形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。
　ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質の種類や由来により異なる。典型的なＰＡＭ配列は、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ１型）では、「５′－ＣＣＮ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ２型）では、「５′－ＴＣＮ」であり、Ｈ．ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｂ型）では、「５′－ＴＴＣ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｅ型）では、「５′－ＡＷＧ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＧＲＲＴ」又は「５′－ＮＧＲＲＮ」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＡＡＡＡＣ」である。Ｃｐｆ１では、典型的には、「５’－ＴＴＮ」又は「５’－ＴＴＴＮ」である。なお、タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　５２３，４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　６１，　８８６－８９４（２０１６））。
　本発明においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系以外の部位特異的ニッカーゼを利用することもできる。このような部位特異的ニッカーゼとしては、例えば、ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼが挙げられる。人工ヌクレアーゼとしては、例えば、ＴＡＬＥ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ＺＦ（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）、ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）を利用することができる。これら人工ヌクレアーゼとの融合により、ニッカーゼ活性を発揮し得る酵素としては、例えば、ＴｅｖＩが挙げられる（Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０１３；４：１７６２．　ｄｏｉ：　１０．１０３８／　ｎｃｏｍｍｓ２７８２）。これら人工ヌクレアーゼは、特定の塩基（あるいは特定の塩基配列）を認識するモジュール（ペプチド）を連結することにより構築されたＤＮＡ結合ドメインにより、標的ＤＮＡ配列に標的化され、当該ＤＮＡ結合ドメインに融合されたニッカーゼにより、ＤＮＡを一本鎖切断する。人工ヌクレアーゼにおけるＤＮＡ結合ドメインとニッカーゼの間には、適当なスペーサーペプチドが導入されていてもよい。
　本発明においては、レシピエントの染色体においては、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを利用する。
　ここで「近傍ＤＮＡ領域」とは、特定の部位から、通常、１０００００塩基以内、１００００塩基以内、５０００塩基以内、２０００塩基以内、好ましくは１０００塩基以内（例えば、５００塩基以内、４００塩基以内、３００塩基以内、２００塩基以内、１００塩基以内、５０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）の領域である。また、「近傍ＤＮＡ領域の複数箇所」は、同一のＤＮＡ鎖状であっても、異なるＤＮＡ鎖上であってもよい。
　具体的な態様の例としては、上記特定の部位の５′側近傍ＤＮＡ領域と３′側近傍ＤＮＡ領域に１箇所ずつ（図１Ａのパターン１とパターン２、図１Ｃのパターン１′と２（ａ）′、図１Ｄのパターン２（ｂ）′）、上記特定の部位の５′側近傍ＤＮＡ領域に２箇所（図１Ｂのパターン３（ａ）、パターン４（ａ）、図１Ｄのパターン３（ａ）′、図１Ｅのパターン４（ａ）′）、上記特定の部位の３′側近傍ＤＮＡ領域に２箇所（図１Ｂのパターン３（ｂ）、パターン４（ｂ）、図１Ｅのパターン３（ｂ）′、図１Ｆのパターン４（ｂ）′）、及び上記特定の部位の５′側近傍ＤＮＡ領域と３′側近傍ＤＮＡ領域に少なくとも１箇所ずつで計３箇所（図１Ｇのパターン５とパターン６）が挙げられる。切断される箇所は、４箇所以上であってもよい。また、１つの特定の部位の近傍ＤＮＡ領域には、他の特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）が存在していてもよい（図１Ｈのパターン７）。
　ドナーの染色体とレシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所の全てが対応している態様（図１Ａのパターン１、図１Ｂのパターン３、図１Ｃのパターン１′、図１Ｄのパターン３（ａ）′、図１Ｅのパターン３（ｂ）′、図１Ｇのパターン６、図１Ｈのパターン７（ｄ））においては、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼが、ドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列にも結合するように設計すればよい。この場合、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、典型的には、同一のＤＮＡ配列である。
　一方、ドナーの染色体とレシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所の一部が対応していない態様（図１Ａのパターン２、図１Ｂのパターン４、図１Ｃのパターン２（ａ）′、図１Ｄのパターン２（ｂ）′、図１Ｅのパターン４（ａ）′、図１Ｆのパターン４（ｂ）′、図１Ｇのパターン５、図１Ｈのパターン７（ａ）～（ｃ））においては、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼの組み合わせの一部を、ドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列には結合しないように設計することができる。この場合、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ配列である。例えば、ゲノム編集により置換を行う塩基（相同染色体間で異なる塩基）を含むように、部位特異的ニッカーゼの標的ＤＮＡ配列を設定すれば、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ配列となる。部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である場合には、レシピエントの標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにガイドＲＮＡを設計すればよい。また、部位特異的ニッカーゼがニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼの場合には、レシピエントの標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにＤＮＡ結合ドメインを設計すればよい。この態様においては、部位特異的ニッカーゼの設計上、一本鎖切断される部位は、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）から、通常、約１００塩基位内、より好ましくは５０塩基以内（例えば、４０塩基以内、３０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）である。
　本発明において、異なるＤＮＡ鎖上で一本鎖切断を行う場合には、一本鎖切断の距離が近すぎると二本鎖切断が生じうる。従って、異なるＤＮＡ鎖上にある一本鎖切断箇所の距離は、通常、１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上であり、かつ、通常、２０００塩基以内、好ましくは１０００塩基以内、さらに好ましくは５００塩基以内である。
　本発明においては、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを細胞に導入する。細胞に導入される「部位特異的ニッカーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合には、例えば、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質の組み合わせの形態であっても、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡとの組み合わせの形態であっても、それらを発現するベクターの組み合わせであってもよい。ガイドＲＮＡは、分解を抑制するための修飾（化学修飾など）が行われていてもよい。ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼである場合には、例えば、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡであっても、当該タンパク質を発現するベクターの形態であってもよい。
　発現ベクターの形態を採用する場合には、発現させるべきＤＮＡに作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含む。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列）が挙げられる。調節エレメントとしては、目的に応じて、例えば、多様な宿主細胞中でのＤＮＡの構成的発現を指向するものであっても、特定の細胞、組織、あるいは器官でのみＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。また、特定の時期にのみＤＮＡの発現を指向するものであっても、人為的に誘導可能なＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１プロモーター）、ｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター）、ｐｏｌＩプロモーター、又はそれらの組合せが挙げられる。当業者であれば、導入する細胞の種類などに応じて、適切な発現ベクターを選択することができる。
　部位特異的ニッカーゼの細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リポフェクション法、ナノ粒子媒介性トランスフェクション法、ウイルス媒介性核酸送達法などの公知の方法で行うことができる。
　細胞への導入後、部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、レシピエントの染色体においては、標的塩基の近傍ＤＮＡ領域で複数箇所一本鎖切断し、ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する。これにより非相同末端結合による目的外の変異の発生を顕著に抑制しながら、相同染色体間での相同組換えが誘導され、特異的かつ高効率に、標的塩基がドナーにおける対応する塩基に置換される。本発明によれば、非相同末端結合による目的外の変異の発生を９０％以上、好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％）抑制することができる。
　また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットであって、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含むキットを提供する。当該のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　[実施例１］複数ニック法の有効性
　Ａ．材料
（１）ＴＳＣＥＲ２細胞
　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　１遺伝子（ＴＫ１）のヘテロ接合体変異をもつｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔＴＫ６細胞（ｅｘｏｎ　４に１ヌクレオチド挿入。フレームシフト）由来細胞である。健常アリルのｉｎｔｏｒｏｎ　４に３１塩基対の挿入（これ自体はＴＫ１遺伝子機能の喪失とは関係ない）とｅｘｏｎ　５に変異を入れ、複合ヘテロ接合体変異に改変し、ＴＫ１遺伝子の機能を喪失させている。サイミジンキナーゼに依存したＤＮＡ合成ｓａｌｖａｇｅ経路が機能しないため、ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎによりＤＮＡ　ｄｅ　ｎｏｖｏ合成経路を遮断すると、２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、及びｔｈｙｍｉｄｉｎｅを供給しても細胞増殖することができない。ゲノム編集によりサイミジンキナーゼ活性が回復した場合、ＣＨＡＴ培地（１０μＭ　２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］，　１００ｎＭ　ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］）中でも細胞増殖可能となる。
　（２）ニッカーゼ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系と標的領域の構造
　ドナーとなる野生型の標的領域（ＴＫ１　Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｅｘｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ４の配列）を図２Ａ（配列番号：１）に示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
　また、レシピエントとなる変異型の標的領域を図２Ｂ（配列番号：２）に示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
　また、Ｓ１～Ｓ１２の標的領域を図２Ｃ～２Ｈ（配列番号：３～１４）に示す。大文字はエクソン、小文字はその他の配列を示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。標的配列部位をアンダーラインで示した。
　ｓｇＲＮＡのうちｃｒＲＮＡに相当する配列は、以下の通りである。なお、下線はＰＡＭに対する配列である。
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号：１５）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ
ＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧ（配列番号：１６）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号：１７）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓ
ＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号：１８）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１
ＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧ（配列番号：１９）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ２
ＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号：２０）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ３
ＡＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧ（配列番号：２１）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ４
ＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧ（配列番号：２２）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ５
ＧＡＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号：２３）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ６
ＣＡＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧ（配列番号：２４）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ７
ＧＡＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧ（配列番号：２５）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ８
ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号：２６）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ９
ＣＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＡＧＧ（配列番号：２７）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１０
ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＧＧ（配列番号：２８）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１１
ＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＧＧ（配列番号：２９）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１２
ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号：３０）
　ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓを用いた場合は、［ＣＣＣＣＧＣ］と［ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓを用いた場合は、［ＣＣＣＧＣＣ］と［ＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓを用いた場合は、［ｃｃｃａｇｃ］と［ｔａｃｔｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇａｇｇ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓを用いた場合は、［ＣＣＴＧＣＴ］と［ＣＣＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１を用いた場合は、［ＣＣＴＣＡＧ］と［ＡＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ２を用いた場合は、［ＣＣＡＧＴＧ］と［ＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ３を用いた場合は、［ＣＣＴＧＧＧ］と［ＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＧＡＡＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ４を用いた場合は、［ＣＣＴＧＴＣ］と［ＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ５を用いた場合は、［ＣＣＡＧＣＴ］と［ＧＴＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＴＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ６を用いた場合は、［ＣＣＴＧＡＴ］と［ＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＴＡＧＴＣＴＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ７を用いた場合は、［ＣＣＣＴＣＧ］と［ＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ８を用いた場合は、［ＣＣＡＧＧＡ］と［ＧＧＴＡＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ９を用いた場合は、［ＣＣＴＡＣＧ］と［ＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＴＴＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１０を用いた場合は、［ＣＣＣＡＴＴ］と［ＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１１を用いた場合は、［ＣＣＡＧＣＴ］と［ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１２を用いた場合は、［ＣＣＣＴＧＧ］と［ＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣ］との間に、それぞれＤＮＡ二本鎖切断あるいはニックが生じると予想されている（図２Ａ～Ｈ及び配列番号：１～１４を参照のこと）。
　変異アリル上の［ＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］配列（アンダーラインは、１ヌクレオチド挿入変異）が、健常アリルの野生型配列を鋳型として相同染色体間組換えにより修正され、［ＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］と修正された場合に、サイミジンキナーゼ活性が回復する。また、［ＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］、［ＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］といった、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断部位周辺での１ヌクレオチド欠失（ヌクレオチド欠失型）でもサイミジンキナーゼ活性は回復する（非特許文献１）。
　Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両者を発現するベクターを用いて、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡを発現させた。利用したベクターを以下に示す。
Ｖ１：　ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
Ｖ２：　ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ
Ｖ３：　ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ４：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
Ｖ５：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ６：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ７：　ＰＸ４５８（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
Ｖ８：　ＰＸ４５８（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ９：　ＰＸ４５９（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
　上記のベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
サンプル＃１：　Ｖ１＋Ｖ５
サンプル＃２：　Ｖ１＋Ｖ４
サンプル＃３：　Ｖ２＋Ｖ５
サンプル＃４：　Ｖ２＋Ｖ４
サンプル＃５：　Ｖ３＋Ｖ４
サンプル＃６：　Ｖ３＋Ｖ５
サンプル＃７：　Ｖ７＋Ｖ９
サンプル＃８：　Ｖ８＋Ｖ９
　各サンプルにおいてニックあるいはＤＮＡ二本鎖切断が入る位置を図３に示した。
　Ｂ．方法と結果
　２種類のプラスミドをそれぞれ８μｇ、６００ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を１２０μＬのＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１００μＬを１３５０Ｖ　１０ｍｓ　３回の条件でＮｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件１）。別の方法として、細胞濃度及びプラスミド濃度は維持したまま、１０μＬを１３００Ｖ　２０ｍｓ　２回の条件でＮｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃　５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１もしくはＰＸ４５８ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、５％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。エレクトロポレーションから１週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ　２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ　ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり１０、２０、１００、又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％　馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり０．５、又は１細胞となるように分注し、培養した。２週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
　ＣＨＡＴ培地中で、１　ｗｅｌｌあたりＡ個の細胞をまいた場合に、コロニーができたｗｅｌｌの割合（％）をＢとし、通常培地中で１　ｗｅｌｌあたりＣ個の細胞をまいた場合に、コロニーができたｗｅｌｌの割合（％）をＤとしたとき、編集成功率を下記のように算出した。
（Ｂ／Ａ）／（Ｄ／Ｃ）ｘ１００　（％）
　結果を図４Ａ（エレクトロポレーション条件１）及び図４Ｂ（エレクトロポレーション条件２）に示す。標的遺伝子をＣａｓ９もしくはＣａｓ９ニッカーゼにより認識させない場合、ゲノム編集は起こらなかった（図３，４Ａ，４Ｂ、サンプル＃６，＃８）。修正対象とするヌクレオチド付近にＤＮＡ二本鎖切断を発生させた場合、サイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合は、５．４３±０．７７％に達するが、このうち相同染色体間組換えによるものは３．６６％にとどまり、９６．３％はヌクレオチド欠失が原因となっていた（図３，４Ａ、サンプル＃７及び表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　一方、変異アリルの修正対象とするヌクレオチド付近（部位Ａ）と離れた部位（部位Ｂ）の２箇所及び健常アリルの部位Ｂの１箇所にニックを発生させると０．４６０±０．０５０％の割合で細胞のサイミジンキナーゼ活性が回復した（図３，４Ａ、サンプル＃２）。エレクトロポレーションの条件を変えると、この割合は１．０４±０．１０５％に向上した（図４Ｂ）。これらは、変異アリルの部位Ａに１箇所ニックを入れた場合（０．０５０２±０．０１１３％、図３，４Ａ、サンプル＃１）よりも修正効率が高かった。変異アリル、健常アリルともに、部位Ａ及び部位Ｂの２箇所にニックを発生させた場合にも０．５２２±０．０３５％の割合で遺伝子修正が行われた（図３，４Ａ、サンプル＃４）。
　次に、Ｓａｍｐｌｅ＃２及び＃７において、コロニーを形成した細胞におけるＴＫ１遺伝子のＩｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域のＤＮＡ断片をｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲにより増幅させた。Ｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲにはＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いた。プライマーとして［ＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＧ（配列番号：３１）］［ＡＡＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＴＣ（配列番号：３２）］を用いた。ＰＣＲ断片は［ＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴ（配列番号：３３）］をプライマーとしてサンガーシーケンス法によるＤＮＡ配列解析を行った。編集前のＤＮＡシーケンス結果を図５Ａ、相同染色体間組換えによる修正が行われた細胞でのＤＮＡシーケンス結果を図５Ｂ、ヌクレオチド欠失となったＤＮＡシーケンスの例を図５Ｃ，Ｄに示した。変異アリルが野生型に修正された細胞の割合は、サンプル＃２では１００％（１１１クローン／１１１クローン）であった（表１）。
　［実施例２］ニック間の距離がゲノム編集効率に与える影響の検証
　Ａ．材料
　本実施例で利用したベクターを以下に示す。
ＶＮ１：　ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＶＮ２：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＶＮ３：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
ＶＮ４：　ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
ＶＮ５：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
ＶＳ１：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１
ＶＳ２：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ２
ＶＳ３：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ３
ＶＳ４：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ４
ＶＳ５：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ５
ＶＳ６：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ６
ＶＳ７：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ７
ＶＳ８：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ８
ＶＳ９：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ９
ＶＳ１０：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１０
ＶＳ１１：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１１
ＶＳ１２：　ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１２
　上記のベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
－３２２ｓ／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ３（３．０μｇ）
Ｓ１／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１（３．０μｇ）
Ｓ２／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ２（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）
Ｓ４／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ４（３．０μｇ）
Ｓ５／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ５（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）
Ｓ７／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ７（３．０μｇ）
Ｓ８／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ９／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ９（３．０μｇ）
Ｓ１０／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１０（３．０μｇ）
Ｓ１１／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ１２／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１２（３．０μｇ）
２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ４（１．５μｇ）＋ＶＮ５（４．５μｇ）
　なお、各ベクター由来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的とするゲノム上の位置を図６に示した。また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図７に示した。各サンプルにおいて、予想されるニック間の距離（図７における部位Ａと部位Ｂとの間の距離）及び切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
－３２２ｓ／２０ｓ：３４１ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ１／２０ｓ：８１７３ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ２／２０ｓ：５６７８ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ３／２０ｓ：３９６４ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ４／２０ｓ：２３６９ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ５／２０ｓ：１３６７ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ６／２０ｓ：６０８ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ７／２０ｓ：１３６ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ８／２０ｓ：１００４ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ９／２０ｓ：２３５３ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１０／２０ｓ：４０４１ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１１／２０ｓ：６３３３ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１２／２０ｓ：８６１２ｎｔ、パターン４（ｂ）、パターン７（ａ）
２０ｓ／ｅｍｐ．：ニックは一箇所のみ
ｅｍｐ．／ｅｍｐ．：ニックは発生しない
　Ｂ．方法と結果
　上記リスト中に示した量の各プラスミドと、１５０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を３０μＬのＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１０μＬを１３００Ｖ　２０ｍｓ　２回の条件でＮｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃　５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、その後、５％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。エレクトロポレーションから１－２週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ　２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ　ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり４０、又は１００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％　馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
　結果を図６に示す。標的遺伝子をＣａｓ９ニッカーゼにより認識させない場合、ゲノム編集は起こらなかった（図６及び７のサンプル　ｅｍｐ/ｅｍｐ）。変異アリルの修正対象とするヌクレオチド付近（部位Ａ）と離れた部位（部位Ｂ）の２箇所及び健常アリルの部位Ｂの１箇所にニックを発生させると０．２９４±０．０９８％～２．８２±０．０１０％の割合で細胞のサイミジンキナーゼ活性が回復し（図６及び７のサンプル　－３２２ｓ／２０ｓ、Ｓ１／２０ｓ、Ｓ２／２０ｓ、Ｓ３／２０ｓ、Ｓ４／２０ｓ、Ｓ５／２０ｓ、Ｓ６／２０ｓ、Ｓ７／２０ｓ、Ｓ８／２０ｓ、Ｓ９／２０ｓ、Ｓ１０／２０ｓ、Ｓ１１／２０ｓ、Ｓ１２／２０ｓ）、すべてのサンプルにおいて、変異アリルの修正対象とするヌクレオチド付近（部位Ａ）にのみニックを発生させた場合（図６及び７のサンプル　２０ｓ/ｅｍｐ：０．０９１６±０．０４９８％の割合で細胞のサイミジンキナーゼ活性が回復）よりも修正効率が高かった。
　次に、Ｓａｍｐｌｅ　Ｓ３／２０ｓ及びＳ１２／２０ｓにおいて、コロニーを形成した細胞におけるＴＫ１遺伝子のＩｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域のＤＮＡ断片及びＩｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域のＤＮＡ断片をｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲもしくは抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにより増幅させた。ゲノムＤＮＡ抽出には、カネカ簡易ＤＮＡ抽出キット　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２（Ｋａｎｅｋａ）を用いた。Ｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲにはＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いた。ゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲには、ＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域用のプライマーとして［ＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＧ（配列番号：３１）］［ＡＡＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＴＣ（配列番号：３２）］を用いた。Ｉｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域用のプライマーとして［ＡＧＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＣＴ（配列番号：３４）］［ＡＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴ（配列番号：３５）］を用いた。Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域のＰＣＲ断片は［ＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴ（配列番号：３３）］を、Ｉｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域のＰＣＲ断片は［ＴＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号：３６）］をプライマーとして、サンガーシーケンス法によるＤＮＡ配列解析を行った。Ｉｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域の編集前のＤＮＡシーケンス結果を図８（ａ）、相同染色体間組換えにより、両アリルが野生型となった細胞でのＤＮＡシーケンス結果を図８（ｂ）に示した。
　サンプルＳ３／２０ｓ、Ｓ１２／２０ｓともに、Ｅｘｏｎ４及びＥｘｏｎ５にゲノム編集に伴う新たな変異の発生は認められなかった。サンプルＳ３／２０ｓでは、Ｅｘｏｎ４は９８．９％、Ｅｘｏｎ５は１．０６％が修正された。Ｅｘｏｎ４、Ｅｘｏｎ５がともに修正された細胞はなかった。サンプルＳ１２／２０ｓではＥｘｏｎ４は８３．２％、Ｅｘｏｎ５は３０．５％が修正された。Ｅｘｏｎ４、Ｅｘｏｎ５がともに修正された細胞は１３．７％であった（表２）。Ｅｘｏｎ５が修正されたすべての細胞において、Ｉｎｔｒｏｎ４に存在する３１ヌクレオチドの挿入変異も修正されていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｓ１２／２０ｓのようなパターン（パターン７（ａ））により、Ｅｘｏｎ４の１ヌクレオチド挿入、Ｉｎｔｒｏｎ４の３１ヌクレオチド挿入、Ｅｘｏｎ５の１塩基置換と３箇所の変異を同時に修正することが可能であった。
　［実施例３］追加の一本鎖切断の導入によるゲノム編集効率への影響の検証
　Ａ．材料
　本実施例で利用したベクターを以下に示す。本実施例では、ベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ１１：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ８：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ１１：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ５（６．０μｇ）
ｅｍｐ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ４（１．５μｇ）＋ＶＮ５（７．５μｇ）
　なお、各ベクター由来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的とするゲノム上の位置を図９に示した。また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図１０に示した。各サンプルにおける切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：パターン５
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ１１：パターン５ 
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ８：パターン５ 
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ１１：パターン５ 
Ｓ３／２０ｓ／ｅｍｐ：パターン２（ａ） 
Ｓ６／２０ｓ／ｅｍｐ：パターン２（ａ） 
２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ：パターン４（ｂ） 
２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐ：パターン４（ｂ） 
２０ｓ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ニックが一箇所のみ 
ｅｍｐ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ニックが発生しない
　Ｂ．方法と結果
　上記リスト中に示した量の各プラスミドと、１５０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を３０μＬのＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１０μＬを１３００Ｖ　２０ｍｓ　２回の条件でＮｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃　５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、その後、５％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。エレクトロポレーションから１－２週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ　２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ　ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり２０、又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％　馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
　結果を図９に示した。レシピエントアリルに２箇所、ドナーアリルに１箇所ニックが入るサンプルＳ３／２０ｓ／ｅｍｐ（２．６８±０．３７％）、サンプル２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ（２．５９±０．１７％）と比較し、レシピエントアリルに３箇所、ドナーアリルに２箇所ニックが入るサンプルＳ３／２０ｓ／Ｓ８では、サイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合が５．０７±１．４７％と高効率であった。サンプルＳ３／２０ｓ／Ｓ１１においてサイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合もサンプルＳ３／２０ｓ／ｅｍｐ及びサンプル２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐよりも高く、サンプルＳ６／２０ｓ／Ｓ８においてサイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合もサンプルＳ６／２０ｓ／ｅｍｐ及びサンプル２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐよりも高く、また、サンプルＳ６／２０ｓ／Ｓ１１においてサイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合もサンプルＳ６／２０ｓ／ｅｍｐ及びサンプル２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐよりも高いことが示された。
　［実施例４］外来性ＤＮＡを利用しない複数ニック法によるゲノム編集効率の検証
　Ａ．材料
　図１１に示した領域（Ｓ３、２０ｓ、２９ｓ、Ｓ８）を標的とするｓｇＲＮＡもしくはヒトゲノム中には標的配列が存在しないｓｇＲＮＡ（ｎｏ）を、以下の通り組み合わせ、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ　ｍＲＮＡとともにＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．３μＬずつ
Ｓ３／２９ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．３μＬずつ
Ｓ３／２０ｓ：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
２０ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
Ｓ３／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
Ｓ３：１００μＭを０．９μＬ
２０ｓ：１００μＭを０．９μＬ
２９ｓ：１００μＭを０．９μＬ
Ｓ８：１００μＭを０．９μＬ
ｎｏ：１００μＭを０．９μＬ
　また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図１２に示した。各サンプルにおける切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８： パターン５
Ｓ３／２９ｓ／Ｓ８： パターン６
Ｓ３／２０ｓ： パターン２（ａ）
２０ｓ／Ｓ８： パターン４（ｂ）
Ｓ３／Ｓ８： パターン１
Ｓ３：ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
２０ｓ： ニックは一か所のみ
２９ｓ： ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
Ｓ８：ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
ｎｏ： ニックは発生しない
　Ｂ．方法と結果
　ｓｇＲＮＡをそれぞれ上記リスト中に示した量、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）を１．８μＬ、７０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞にＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を加え、全体量を１４μＬとした。このうちの１０μＬを１５００Ｖ　１０ｍｓ　３回の条件でＮｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件３）。１０％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃　５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、５％　馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で間培養した。エレクトロポレーションから１週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ　２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ　ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり１０、３０、１００又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％　馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１　ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
　結果を図１１に示した。外来性ＤＮＡを一切用いず、また、セルソーターによる細胞選択を行わない条件下で、レシピエントアリルに３箇所、ドナーアリルに２箇所ニックが入るサンプルＳ３／２０ｓ／Ｓ８（図１Ｇパターン５）において、３．４６±０．３４％と高い効率でサイミジンキナーゼ活性が回復した。レシピエントアリルに３箇所、ドナーアリルに３箇所ニックが入るサンプルＳ３／２９ｓ／Ｓ８（図１Ｇパターン６）においても、２．６４±０．５８％の細胞でサイミジンキナーゼ活性が回復した。また、ニックが標的ヌクレオチドから１０００ｂｐ以上離れた位置に、レシピエントアリルに２箇所、ドナーアリルに２箇所ニックが入るサンプルＳ３／Ｓ８（図１Ａパターン１）では、１．５４±０．４０％と、レシピエントアリルに１箇所、ドナーアリルに１箇所ニックが入るサンプルＳ３（０．１３３±０．０２６％）、２９ｓ（０．８４４±０．３０５％）、Ｓ８（０．７７３±０．２２１％）、レシピエントアリルに１箇所入り、ドナーアリルにニックが入らないサンプル２０ｓ（０．１４７±０．０２２％）よりも高い効率でサイミジンキナーゼ活性が回復した。
　以上説明したように、本発明によれば、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断により誘導された相同染色体間の相同組換えを利用して、相同染色体間で異なる塩基を、いずれかの塩基に統一することが可能である。外来のドナーＤＮＡを用いない本発明は、その安全性の高さから、特に、ヘテロ変異に起因する疾患の遺伝子治療に大きく貢献し得る。
配列番号：１５～３６
・人工的な配列

Claims (4)

  1. 　ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
    　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
    　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する少なくとも１箇所で一本鎖切断する方法。
  2. 　置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、請求項１に記載の方法。
  3. 　部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　請求項１から３のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
    　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
    　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する少なくとも１箇所で一本鎖切断するキット。
PCT/JP2019/031117 2018-11-16 2019-08-07 ゲノム編集された細胞を製造する方法 Ceased WO2020100361A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980075266.3A CN113015799A (zh) 2018-11-16 2019-08-07 经基因组编辑的细胞的制造方法
US17/294,165 US12365923B2 (en) 2018-11-16 2019-08-07 Method for producing genome-edited cell
JP2020556604A JP7426101B2 (ja) 2018-11-16 2019-08-07 ゲノム編集された細胞を製造する方法
EP19885454.9A EP3882347A4 (en) 2018-11-16 2019-08-07 METHODS FOR GENERATING GENOMEEDIT CELLS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-215588 2018-11-16
JP2018215588 2018-11-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020100361A1 true WO2020100361A1 (ja) 2020-05-22

Family

ID=70730219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/031117 Ceased WO2020100361A1 (ja) 2018-11-16 2019-08-07 ゲノム編集された細胞を製造する方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US12365923B2 (ja)
EP (1) EP3882347A4 (ja)
JP (1) JP7426101B2 (ja)
CN (1) CN113015799A (ja)
WO (1) WO2020100361A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2023054573A1 (ja) * 2021-09-30 2023-04-06
WO2023120530A1 (ja) 2021-12-24 2023-06-29 国立大学法人大阪大学 相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
JP2018011525A (ja) 2016-07-19 2018-01-25 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4357457B1 (en) 2012-10-23 2024-10-16 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
MX2015017312A (es) 2013-06-17 2017-04-10 Broad Inst Inc Suministro y uso de composiciones, vectores y sistemas crispr-cas para la modificación dirigida y terapia hepáticas.
WO2017044419A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 University Of Massachusetts Dnase h activity of neisseria meningitidis cas9
WO2019148166A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods of enhancing chromosomal homologous recombination

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
JP2018011525A (ja) 2016-07-19 2018-01-25 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENJAMIN, P. ET AL., NATURE, vol. 523, 2015, pages 481 - 485
HIRANO, S. ET AL., MOLECULAR CELL, vol. 61, 2016, pages 886 - 894
NAKAJIMA K ET AL., GENOME RES., vol. 28, 2018, pages 223 - 230
NAT COMMUN., vol. 4, 2013, pages 1762
See also references of EP3882347A4
WU, Y. ET AL.: "Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9", CELL STEM CELL, vol. 13, 5 December 2013 (2013-12-05), pages 659 - 662, XP055196555, DOI: 10.1016/j.stem.2013.10.016 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2023054573A1 (ja) * 2021-09-30 2023-04-06
WO2023054573A1 (ja) 2021-09-30 2023-04-06 国立大学法人大阪大学 相同染色体の一方に特異的なｄｎａ欠失を有する細胞を製造する方法
JP7672012B2 (ja) 2021-09-30 2025-05-07 国立大学法人大阪大学 相同染色体の一方に特異的なｄｎａ欠失を有する細胞を製造する方法
WO2023120530A1 (ja) 2021-12-24 2023-06-29 国立大学法人大阪大学 相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3882347A4 (en) 2022-03-02
JP7426101B2 (ja) 2024-02-01
JPWO2020100361A1 (ja) 2021-10-07
EP3882347A1 (en) 2021-09-22
EP3882347A9 (en) 2022-11-02
CN113015799A (zh) 2021-06-22
US12365923B2 (en) 2025-07-22
US20210324420A1 (en) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220256822A1 (en) Genetic modification non-human organism, egg cells, fertilized eggs, and method for modifying target genes
Bhowmik et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9
Hall et al. Genome editing in mice using CRISPR/Cas9 technology
Wefers et al. Gene editing in mouse zygotes using the CRISPR/Cas9 system
Koller et al. Toward an animal model of cystic fibrosis: targeted interruption of exon 10 of the cystic fibrosis transmembrane regulator gene in embryonic stem cells.
JP6958917B2 (ja) 遺伝子ノックイン細胞の作製方法
Zhang et al. Crispr/Cas9‐mediated cleavages facilitate homologous recombination during genetic engineering of a large chromosomal region
Horii et al. Generation of floxed mice by sequential electroporation
Wefers et al. Gene editing in mouse zygotes using the CRISPR/Cas9 system
JP7426101B2 (ja) ゲノム編集された細胞を製造する方法
Shola et al. Generation of mouse model (KI and CKO) via Easi-CRISPR
Chan et al. Efficient mutagenesis of the rhodopsin gene in rod photoreceptor neurons in mice
US20250129390A1 (en) Method for producing cell having dna deletion specific to one of homologous chromosomes
EP4455282A1 (en) Method for producing genome-edited cells utilizing homologous recombination
AU2021238926A1 (en) Optimised methods for cleavage of target sequences
Mangerich et al. A caveat in mouse genetic engineering: ectopic gene targeting in ES cells by bidirectional extension of the homology arms of a gene replacement vector carrying human PARP-1
US20220323609A1 (en) Gene editing to correct aneuploidies and frame shift mutations
EP1451295B1 (en) Methods for mutating genes in cells and animals using insertional mutagenesis
WO2024204215A1 (ja) 相同染色体の一方のＣｏｌ７ａ遺伝子に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法
Hu et al. Enhance genome editing efficiency and specificity by a quick CRISPR/Cas9 system
FKKT et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering (2013)
HK1065824B (en) Methods for mutating genes in cells and animals using insertional mutagenesis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19885454

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020556604

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019885454

Country of ref document: EP

Effective date: 20210616

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2019885454

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 17294165

Country of ref document: US