WO2020116573A1

WO2020116573A1 - 子宮体癌の予後の判定方法

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Publication number: WO2020116573A1
Application number: PCT/JP2019/047656
Authority: WO
Inventors: 弥栄金井; 恵吏新井; 青木　大輔; 伸幸進; 亘山上; 健真壁
Original assignee: Keio University; Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Keio University; Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-06-11
Anticipated expiration: 2021-06-05
Also published as: JPWO2020116573A1; EP3950954A1; CN113166813A; EP3950954A4; US20220033911A1

Abstract

子宮体癌の予後判定方法、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者の判定方法、及び子宮体癌のリスク判定方法。当該方法は、子宮内膜細胞、子宮体癌細胞又はそれらを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む。検出したＤＮＡメチル化レベルから、被験体についての子宮体癌の予後、温存療法への適合性、又は子宮体癌のリスクが判定される。

Description

子宮体癌の予後の判定方法

　本発明は、子宮体癌の予後の判定方法に関する。

　子宮体癌（endometrial cancer）は、子宮内膜に発生する癌であり、先進国に最もよくみられる婦人科悪性腫瘍の１つである。子宮体癌は、閉経後の女性が発症することが多い疾患であるが、近年ではより若年の４０歳以下の閉経前女性での発症例が顕著に増加している。現在の子宮体癌の治療は、外科手術、すなわち子宮切除及び両側卵管卵巣摘除術、ならびに必要に応じてリンパ節切除が一般的である。しかし、特に将来の妊娠を希望するより若年の患者に対しては、外科的閉経を避けるため妊孕性温存療法が選択されることがある。妊孕性温存療法の１つは、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）などによるホルモン療法である。異型増殖症や早期子宮体癌等の子宮内膜の初期腫瘍に対して、ＭＰＡ療法に高い治療効果が認められたことが報告されている。

　一方、妊孕性温存療法の問題点は再発である。ＭＰＡ療法を受けた早期子宮体癌患者の再発率が約６３％であったという報告があり（非特許文献１）、これはＭＰＡ療法が外科的療法と比べて再発リスクの高い治療法であることを意味する。さらに、通常ＭＰＡ療法が有効であるのは子宮筋層への浸潤が観察されない早期癌患者である。したがって、ＭＰＡ療法の適用においては、患者による妊孕性維持の希望のみならず、癌のステージ及び癌再発のリスクを考慮して、患者の当該療法への適合性を慎重に見極める必要がある。

　近年、ＤＮＡのメチル化の異常が、がん化に深く関与することが明らかになり、注目を集めている。癌細胞における特徴的なエピジェネティック異常として、ＣｐＧアイランドにおける異常なＤＮＡメチル化が知られている。ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域であり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化の異常は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与する。非特許文献２には、子宮体癌患者におけるＤＮＡメチル化レベルの上昇と相関してＣｐＧアイランドのメチル化レベルが上昇する１３個の遺伝子が記載されている。非特許文献３には、子宮体癌のハイリスク群のマーカーとなるメチル化ＤＮＡマーカーが記載されている。非特許文献４には、子宮体部の類内膜癌と漿液性癌に関連してメチル化するＤＮＡ領域を、両癌に共通して関連するものを含め、それぞれ約２７，０００個及び約１５，７００個同定したことが記載されている。非特許文献５には、ＺＮＦ１５４プロモーターのＣｐＧアイランドを含む、卵巣癌や子宮体癌でメチル化する１２個の領域を同定したことが記載されている。

　メチル化ＤＮＡの解析方法として、バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）法を利用する方法が既に確立され、汎用されている。バイサルファイト法を基本原理とするメチル化ＤＮＡ解析方法としては、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法、ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法（ＢＡＭＣＡ法）、次世代シーケンサーによるシーケンシング（ＭｅｔｈｙｌＣａｐ－ｓｅｑ）、メチル化／非メチル化ＤＮＡ特異的プローブで一塩基の伸長反応を検出する方法（例えばＩｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）アッセイ）、ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＲＥ－ｓｅｑ）法などが利用されている。

　特許文献１には、ビーズアレイ法、質量分析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）、パイロシークエンシング、メチル化感受性高解像能融解曲線分析、定量ＰＣＲ、バイサルファイト処理物の直接シークエンシング、ＣＯＢＲＡ法などにより特定の遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルを検出することによって、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法が開示されている。特許文献２には、特定の遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルをイオン交換クロマトグラフィーによる保持時間の違いに基づいて検出することによって、腎細胞癌の予後を判定する方法が開示されている。

国際公開公報第２０１３／１６８６４４号国際公開公報第２０１５／１２９９１６号

Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ，２０１８，２９：ｅ２１ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１７，１２：ｅ０１７３２４２Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１７，１２：１９－２６ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，１５：８６８Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１３，８：１３５５－７２

　本発明は、ＤＮＡのメチル化レベルを基準に子宮体癌の状態や予後、又は発症リスクを判定する方法、及びそれらの判定のためのデータを取得する方法を提供する。

　本発明者らは、子宮体癌組織において正常子宮内膜組織と比べてメチル化レベルの異なる遺伝子領域を同定し、さらにそれらの遺伝子領域の中から子宮体癌の悪性度によりメチル化レベルの異なる遺伝子領域を同定した。さらに本発明者らは、該遺伝子領域のＤＮＡメチル化レベルについてのデータを測定することで、子宮体癌の予後、子宮体癌患者の温存療法への適合性、及び子宮体癌の発症リスクを判定できることを見出した。

　したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出方法であって、
　子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔２〕温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出方法であって、
　子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔３〕子宮内膜の癌化リスクの判定方法であって、
　子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、該子宮内膜の癌化リスクを判定すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔４〕子宮体癌の予後判定方法であって、
　被験体の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体の子宮体癌の予後を判定すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔５〕子宮体癌患者の温存療法への適合性の判定方法であって、
　子宮体癌患者の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、該子宮体癌患者の温存療法への適合性を判定すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔６〕子宮体癌のリスクの判定方法であって、
　被験体の子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体の子宮体癌のリスクを判定すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔７〕予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出、又は、子宮体癌の予後判定に用いるためのデータの取得方法であって、
　被験体の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルに基づいて、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出するためのデータ、又は該被験体の子宮体癌の予後を判定するためのデータを取得すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔８〕温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出、又は、子宮体癌患者の温存療法への適合性の判定に用いるためのデータの取得方法であって、
　子宮体癌患者の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルに基づいて、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出するためのデータ、又は該子宮体癌患者の温存療法への適合性を判定するためのデータを取得すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔９〕子宮内膜の癌化リスクの判定、又は、子宮体癌のリスク判定のためのデータの取得方法であって、
　被験体の子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルに基づいて、該子宮内膜の癌化リスクを判定するためのデータ、又は該被験体の子宮体癌のリスクを判定するためのデータを取得すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
〔１０〕前記標的ＣｐＧサイトが、第１０染色体１０６，４００，２５９位、第８染色体５６，８５２，２９０位、第１４染色体６０，９７３，８２３位、第６染色体２８，２２６，９８０位、第１染色体６２，６６０，６２４位、第６染色体１０，３９０，９１９位、第８染色体１３２，３２１，９１７位、第１１染色体５，３４６，２４９位、第２１染色体３１，９７２，５０６位、第２染色体１，９２８，４８０位、及び第１染色体２４８，３６６，３９９位に位置するＣｐＧサイト、ならびにそれらの近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記標的ＣｐＧサイトが、以下：
　第１０染色体の１０６，４００，１９９位から１０６，４００，３２０位までのＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の５６，８５２，２３０位から５６，８５２，３５１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１４染色体の６０，９７３，７６３位から６０，９７３，８８４位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の２８，２２６，９２０位から２８，２２７，０４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１染色体の６２，６６０，５６４位から６２，６６０，６８５位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の１０，３９０，８５９位から１０，３９０，９８０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の１３２，３２１，８５７位から１３２，３２１，９７８位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１１染色体の５，３４６，１８９位から５，３４６，３１０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２１染色体の３１，９７２，４４６位から３１，９７２，５６７位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２染色体の１，９２８，４２０位から１，９２８，５４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；及び
　第１染色体の２４８，３６６，３３９位から２４８，３６６，４６０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト、
からなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕前記標的ＣｐＧサイトが、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、バイサルファイト処理された前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、パイロシークエンシング法、質量分析、ビーズアレイ法又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕子宮体癌の予後判定、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者の判定、又は子宮体癌のリスク判定のためのプライマー又はプローブであって、
　該プライマー又はプローブは、少なくとも１２塩基の鎖長を有し、かつ、バイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトにハイブリダイズし、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
プライマー又はプローブ。
〔１６〕前記標的ＣｐＧサイトが、第１０染色体１０６，４００，２５９位、第８染色体５６，８５２，２９０位、第１４染色体６０，９７３，８２３位、第６染色体２８，２２６，９８０位、第１染色体６２，６６０，６２４位、第６染色体１０，３９０，９１９位、第８染色体１３２，３２１，９１７位、第１１染色体５，３４６，２４９位、第２１染色体３１，９７２，５０６位、第２染色体１，９２８，４８０位、及び第１染色体２４８，３６６，３９９位に位置するＣｐＧサイト、ならびにそれらの近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、〔１５〕記載のプライマー又はプローブ。
〔１７〕前記標的ＣｐＧサイトが、以下のＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、〔１５〕記載のプライマー又はプローブ：
　第１０染色体の１０６，４００，１９９位から１０６，４００，３２０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の５６，８５２，２３０位から５６，８５２，３５１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１４染色体の６０，９７３，７６３位から６０，９７３，８８４位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の２８，２２６，９２０位から２８，２２７，０４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１染色体の６２，６６０，５６４位から６２，６６０，６８５位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の１０，３９０，８５９位から１０，３９０，９８０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の１３２，３２１，８５７位から１３２，３２１，９７８位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１１染色体の５，３４６，１８９位から５，３４６，３１０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２１染色体の３１，９７２，４４６位から３１，９７２，５６７位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２染色体の１，９２８，４２０位から１，９２８，５４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；及び
　第１染色体の２４８，３６６，３３９位から２４８，３６６，４６０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト。
〔１８〕前記標的ＣｐＧサイトが、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、〔１５〕記載のプライマー又はプローブ。

　本発明によれば、高い感度及び特異度で、子宮体癌の予後（悪性度、再発リスクを含む）、子宮体癌患者の温存療法後への適合性、及び子宮体癌の発症リスクを判定することができる。本発明は、子宮体癌の早期診断を可能にする。また本発明は、子宮体癌患者の治療方針、例えば外科手術か又は温存療法か、を決定するための指針を提供する。特に本発明は、妊娠を希望するより若年の子宮体癌患者についての温存療法の有効性や温存療法後の再発リスクの情報を提供し、該患者のＱＯＬ及び生存率の向上に貢献する。また本発明は、それらの判定又は診断のためのデータを提供することができる。

子宮体癌患者群でメチル化異常を示した６３，０３３個のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルに基づく、子宮体癌患者（ｎ＝７４）の階層的クラスタリング。若年性子宮体癌患者群でメチル化異常を示した４０，５８９個のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルに基づく、若年性子宮体癌患者（ｎ＝３４）の階層的クラスタリング。ＣｐＧサイトのメチル化レベルに関するスキャッターグラム：（Ａ）第１０染色体１０６，４００，２５９位、（Ｂ）第８染色体５６，８５２，２９０位、（Ｃ）第１４染色体６０，９７３，８２３位、（Ｄ）第６染色体２８，２２６，９８０位、（Ｅ）第１染色体６２，６６０，６２４位、（Ｆ）第６染色体１０，３９０，９１９位、（Ｇ）第２染色体１，９２８，４８０位、（Ｈ）第１染色体２４８，３６６，３９９位、（Ｉ）第２１染色体３１，９７２，５０６位、（Ｊ）第１１染色体５，３４６，２４９位、（Ｋ）第８染色体１３２，３２１，９１７位。ＣＶは、ＲＯＣ曲線に基づく（ＹＥ－Ａ）群と（ＹＥ－Ｂ）群とを分ける診断閾値（カットオフ値）。各図中にはＷｅｌｃｈ　ｔ検定によるｐ値を示す。

　本明細書において、「子宮体癌（endometrial cancer）」とは、子宮内膜に発生する癌をいい、好ましくは子宮類内膜癌をいう。本明細書における「子宮体癌」とは、原発癌及び再発癌を含む。本明細書において、「若年性子宮体癌」とは、閉経前女性、好ましくは生殖可能年齢の女性、より好ましくは４０歳以下の女性における子宮体癌をいう。また本明細書において、「老年性子宮体癌」とは、若年性子宮体癌以外の子宮体癌を意味し得るが、好ましくは４０歳より上の女性、又は生殖可能年齢より上の年齢の女性における子宮体癌をいう。

　本明細書において、「癌のリスク」とは、癌を発症しているか、又は将来発症するリスクをいう。また本明細書において、細胞又は組織の「癌化リスク」とは、細胞又は組織が癌を有しているか、又は将来癌を有するリスクをいう。また本明細書において、癌の「再発リスク」とは、当該癌が再発しているか、又は将来再発するリスクをいう。好ましくは、本明細書における子宮体癌の「再発リスク」とは、子宮体癌の温存療法後における再発リスクをいう。

　本明細書において、「悪性度」とは癌の進行度（ステージ）又は異型度（グレード）をいう。子宮体癌のステージは、ＦＩＧＯ（Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ）による手術進行期分類、又はＵＩＣＣ（Ｔｈｅ　Ｕｎｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）によるＴＮＭ分類（Ｔｕｍｏｒ－Ｎｏｄｅ－Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に従って決定することができる。本明細書において、「高悪性度」の癌とは、より進行したステージ又はより高異型度の癌をいう。

　本明細書において、癌の「予後」とは、該癌の将来の状態をいう。例えば、癌が改善する可能性が高いほど、予後はより「良い」（又は「非不良」）とみなされ、改善する可能性が低いほど、予後はより「悪い」（又は「不良」）とみなされる。癌の「予後」はまた、該癌の悪性度や再発リスクを反映する。癌の悪性度や再発リスクが高いほど、予後をより「悪い」（又は「不良」）とみなすことができる。例えば、癌の予後がより悪いということは、該癌がより高悪性度であるか再発リスクがより高いことを意味し得、一方、癌の予後がより良いということは、該癌がより低悪性度であるか再発リスクがより低いことを意味し得る。

　本明細書において、子宮体癌の「温存療法」とは、患者の子宮を温存するように癌を治療する方法をいい、好ましくは妊孕性温存療法、すなわち患者の妊孕性を温存するように癌を治療する方法をいう。温存療法としては、例えば化学療法、放射線療法、ホルモン療法及びこれらの組み合わせなどの非外科的処置が挙げられる。ホルモン療法としては、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）投与などによる黄体ホルモン療法が挙げられる。あるいは、温存療法は、患者の妊孕性が温存される限りにおいて、前述した非外科的処置と、外科的処置（子宮内膜の一部切除など）との組み合わせであってもよい。好ましくは、本明細書における「温存療法」とは、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）投与などによる黄体ホルモン療法、又は、該黄体ホルモン療法と、患者の妊孕性を温存可能な外科的処置との組み合わせをいう。

　本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。ＣｐＧサイトが高頻度で出現する領域は、ＣｐＧアイランドと呼ばれる。ＣｐＧアイランドは、遺伝子のコード領域に近い位置、例えばプロモーター領域に存在することが多く、したがって遺伝子のＣｐＧサイトは、該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランド、又は該遺伝子のプロモーター領域に多く存在する。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイト」とは、別途定義されない場合、好ましくは該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイトを意味し、より好ましくは該遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧサイトを意味する。

　本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また本明細書において、あるＣｐＧサイトの「ＤＮＡメチル化レベル」とは、該ＣｐＧサイトにおいてＤＮＡがメチル化されている割合を意味する。本明細書において、ＤＮＡメチル化レベルが高い及び低いとは、それぞれ、ＤＮＡがメチル化されている割合が高いこと及び低いことを意味する。

　本発明の一態様は、子宮体癌の予後判定方法に関する。本態様の一実施形態は、子宮体癌の予後判定方法であり、該方法は：被験体の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること；及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体の子宮体癌の予後を判定すること、を含む。本態様の別の一実施形態は、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出方法であり、該方法は：被験体の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること；及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出すること、を含む。本態様において、該被験体の例としては、子宮体癌の予後判定を必要とする者、例えば子宮体癌の治療前、治療中又は治療後の患者を含む子宮体癌患者、が挙げられる。好ましくは、該子宮体癌患者は、若年性子宮体癌の患者である。該被験体の好ましい例としては、子宮体癌の温存療法を受けているか又は受けることを所望する患者が挙げられ、より好ましい例としては、妊孕性温存療法を受けているか又は受けることを所望する若年性子宮体癌の患者が挙げられる。

　本発明の別の一態様は、子宮体癌患者の温存療法への適合性の判定方法に関する。本態様の一実施形態は、子宮体癌患者の温存療法への適合性の判定方法であり、該方法は：子宮体癌患者の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること；及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、該子宮体癌患者の温存療法への適合性を判定すること、を含む。本態様の別の一実施形態は、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出方法であり、該方法は：子宮体癌患者の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること；及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出すること、を含む。本態様において、該子宮体癌患者の例としては、温存療法への適合性の判定を必要とする患者が挙げられる。該子宮体癌患者の好ましい例としては、子宮体癌の温存療法を受けているか又は受けることを所望する患者が挙げられ、より好ましい例としては、妊孕性温存療法を受けているか又は受けることを所望する若年性子宮体癌の患者が挙げられる。

　本発明のさらなる一態様は、子宮体癌のリスク判定方法に関する。本態様の一実施形態は、被験体における子宮体癌のリスクの判定方法であり、該方法は：被験体の子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること；及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体の子宮体癌のリスクを判定すること、を含む。本態様の別の一実施形態は、子宮内膜の癌化リスクの判定方法であり、該方法は：被験体の子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること；及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、該子宮内膜の癌化リスクを判定すること、を含む。本態様において、該被験体の例としては、子宮体癌のリスクの判定を必要とする者、例えば、検診受診者、子宮体癌に罹患した疑いのある患者など、が挙げられる。

　本発明の方法において用いられる子宮内膜細胞、子宮体癌細胞、又はそれらを含む組織由来のゲノムＤＮＡとしては、被験体の子宮内膜細胞、子宮体癌細胞、又はそれらを含む組織から調製されたゲノムＤＮＡが挙げられる。該子宮内膜細胞、子宮体癌細胞、又はそれらを含む組織としては、例えば、外科手術や生検において採取した新鮮な子宮内膜細胞、子宮体癌細胞又はそれらを含む組織；採取後凍結した凍結子宮内膜細胞、凍結子宮体癌細胞又はそれらを含む凍結組織；採取後ホルマリン固定及びパラフィン包埋を施した子宮内膜細胞、子宮体癌細胞又はそれらを含む組織、などが挙げられる。このうち、細胞又は組織中のゲノムＤＮＡの分解等を抑制し、より効率よくＤＮＡメチル化レベルの検出を行えるという観点からは、凍結子宮内膜細胞、凍結子宮体癌細胞又はそれらを含む凍結組織が好ましい。

　組織又は細胞からサンプルＤＮＡを調製する手法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、又は市販のＤＮＡ抽出キット、例えばＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＺＲ　Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）、を用いるＤＮＡ抽出方法などが挙げられる。

　好ましくは、調製されたゲノムＤＮＡは、バイサルファイト処理される。ＤＮＡのバイサルファイト処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。バイサルファイト処理のための公知の方法としては、例えば、ＥＺ　ＤＮＡメチレーション－ゴールド^TMキット（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＥｐｉＴｅｃｔ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ　Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣｐＧ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ　Ｔｕｒｂｏ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。

　さらに、前記バイサルファイト処理されたＤＮＡを増幅することが好ましい。増幅の手法には特に制限はないが、好ましくはＰＣＲが利用される。増幅の手法及び条件は、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法及び条件を適宜選択して用いることができる。

　後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、表１～表３に示すＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルが、高悪性度の子宮体癌を有する患者群と、より低悪性度の子宮体癌を有する患者群との間で異なることを見出した。なかでも、表１に示すＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルは、後述の実施例において、１００％の感度及び特異度で高悪性度患者と低悪性度患者との判別を可能にした。表１～表３に示すＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルは、子宮体癌の進行の度合い（悪性度）を反映しており、よって子宮体癌の予後（悪性度、再発リスクを含む）やリスクを表すマーカーとして使用することができる。

　したがって、本発明の方法においてＤＮＡメチル化レベルを検出される標的ＣｐＧサイトとしては、表１～表３に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトが挙げられる。本発明の方法においては、表１～表３に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すればよい。

　本明細書において、ＣｐＧサイトの染色体上の位置は、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｕｉｌｄ　３７（ＧＲＣｈ３７）上の位置を基準にして表されている。また本明細書において、遺伝子の名称は、ＮＣＢＩデータベース（[www.ncbi.nlm.nih.gov/gene]）に登録された遺伝子の名称に基づく。

　本明細書において、染色体上の位置の「近傍」とは、当該染色体上の位置から上流（ＤＮＡの５’側）５００塩基～下流（ＤＮＡの３’側）５００塩基、好ましくは上流２００塩基～下流２００塩基、より好ましくは上流１００塩基～下流１００塩基、さらに好ましくは上流６０塩基～下流６０塩基の領域をいう。

　表１、表２及び表３に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトの例としては、それぞれ、以下の表４、表５及び表６に示すＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトが挙げられる。

　いいかえると、ＤＮＡメチル化レベルを検出される標的ＣｐＧサイトの例としては、配列番号１～６８のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトが挙げられる。

　本発明の方法においては、上述の標的ＣｐＧサイトのうちの少なくとも１つのＣｐＧサイトについてのＤＮＡメチル化レベルを検出すればよい。例えば、本発明の方法においては、上記の表４、表５及び表６に示すＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すればよい。あるいは、本発明においては、配列番号１～６８のヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すればよい。

　好ましくは、本発明の方法で用いられる標的ＣｐＧサイトは、第１０染色体１０６，４００，２５９位、第８染色体５６，８５２，２９０位、第１４染色体６０，９７３，８２３位、第６染色体２８，２２６，９８０位、第１染色体６２，６６０，６２４位、第６染色体１０，３９０，９１９位、第８染色体１３２，３２１，９１７位、第１１染色体５，３４６，２４９位、第２１染色体３１，９７２，５０６位、第２染色体１，９２８，４８０位、及び第１染色体２４８，３６６，３９９位に位置するＣｐＧサイト、ならびにそれらの近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。

　好ましい実施形態において、本発明の方法で用いられる標的ＣｐＧサイトは、以下：
　第１０染色体の１０６，４００，１９９位から１０６，４００，３２０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の５６，８５２，２３０位から５６，８５２，３５１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１４染色体の６０，９７３，７６３位から６０，９７３，８８４位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の２８，２２６，９２０位から２８，２２７，０４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１染色体の６２，６６０，５６４位から６２，６６０，６８５位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の１０，３９０，８５９位から１０，３９０，９８０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の１３２，３２１，８５７位から１３２，３２１，９７８位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１１染色体の５，３４６，１８９位から５，３４６，３１０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２１染色体の３１，９７２，４４６位から３１，９７２，５６７位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２染色体の１，９２８，４２０位から１，９２８，５４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；及び
　第１染色体の２４８，３６６，３３９位から２４８，３６６，４６０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト、
からなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。

　好ましい実施形態において、本発明の方法で用いられる標的ＣｐＧサイトは、配列番号１～１１のヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。

　より好ましい実施形態において、本発明の方法においてＤＮＡメチル化レベルを検出する対象となる標的ＣｐＧサイトは、第１０染色体１０６，４００，２５９位、第８染色体５６，８５２，２９０位、第１４染色体６０，９７３，８２３位、第６染色体２８，２２６，９８０位、第１染色体６２，６６０，６２４位、第６染色体１０，３９０，９１９位、第８染色体１３２，３２１，９１７位、第１１染色体５，３４６，２４９位、第２１染色体３１，９７２，５０６位、第２染色体１，９２８，４８０位、及び第１染色体２４８，３６６，３９９位のＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。

　ＤＮＡメチル化レベルの検出の感度又は特異度をより向上させることができるという観点からは、前述したＣｐＧサイトを組み合わせて標的として用いてもよい。該組み合わせの例としては、表１に示すいずれかのＣｐＧサイトとその近傍に位置するＣｐＧサイトとの組み合わせ、表１に示すＣｐＧサイトのいずれか２つ以上の組み合わせ、表１に示す全ＣｐＧサイトの組み合わせ、表１に示すＣｐＧサイトのいずれか１つ以上と、表２又は３に示すＣｐＧサイトのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、表１に示すいずれかのＣｐＧサイトとその近傍に位置するＣｐＧサイトとの組み合わせ、表１に示すＣｐＧサイトのいずれか２つ以上の組み合わせ、及び表１に示す全ＣｐＧサイトの組み合わせが好ましい。

　したがって、本発明の方法において前述したようにバイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ等で増幅する場合、前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域が増幅される。好ましくは、前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域が増幅される。

　より好ましくは、本発明の方法においてバイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ等で増幅する場合、表４～６に示すＤＮＡ領域のいずれかの一部又は全部が増幅される。さらに好ましくは、表４に示すＤＮＡ領域のいずれかの一部又は全部が増幅される。該増幅されるＤＮＡ領域のサイズは、そこに標的ＣｐＧサイトが含まれている限りにおいて、特に限定されない。

　本発明の方法において、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する手法としては、所与のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを定量できる手法であればよく、公知の手法を適宜選択することができる。かかる公知の手法としては、例えば以下に示す第１～第８の手法が挙げられる。

　第１の手法は、３’末端にメチル化シトシン又は非メチル化シトシンに相補的な塩基を有するように構築されたプローブを用いた１塩基伸長反応を利用して、ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡのメチル化を定量する方法である。例えば、第１の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基は変換されない（Ｃｌａｒｋ　ＳＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１９９４年、２２巻、２９９０～７頁参照）。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、全ゲノム増幅を行い、酵素による断片化（通常３００～６００ｂｐ程度の断片化）を行い、一本鎖に解離させる。

　第１の手法では、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基が、前記ＣｐＧサイトのシトシンに相補的な塩基であるプローブを調製する。すなわち、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、プローブの３’末端の塩基はグアニンとなり、該ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、プローブの３’末端の塩基はアデニンとなる。

　そして、このような前記ＣｐＧサイトに相補的な３’末端の塩基のみが異なる２種類のプローブと、前記一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、蛍光標識した塩基存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、該一本鎖断片のＣｐＧサイトがメチル化されている場合、３’末端の塩基がグアニンであるプローブ（メチル化検出用プローブ）には１塩基伸長反応により蛍光標識した塩基が取り込まれるが、３’末端の塩基がアデニンであるプローブ（非メチル化検出用プローブ）には、３’末端の塩基のミスマッチのため１塩基伸長反応が起こらず、蛍光標識した塩基は取り込まれない。一方、該一本鎖断片のＣｐＧサイトがメチル化されていない場合、非メチル化検出用プローブには蛍光標識した塩基が取り込まれるが、メチル化検出用プローブには蛍光標識した塩基は取り込まれない。したがって、メチル化検出用プローブ及び／又は非メチル化検出用プローブが発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。

　また、かかる第１の手法においては、別の態様として、前記メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブの代わりに、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基が前記ＣｐＧサイトのグアニンに相補的な塩基となっているプローブを用いてもよい。そして、かかるプローブと、前記一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、蛍光物質にて標識したグアニン及び／又は該蛍光物質とは異なる蛍光色素にて標識したアデニンの存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、当該プローブに蛍光標識したグアニンが取り込まれることになり、一方、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、当該プローブに蛍光標識したアデニンが取り込まれることになるため、前記プローブに取り込まれた各蛍光物質が発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。

　かかる第１の手法の好ましい例としては、例えば、ビーズアレイ法（例えば、インフィニウム（登録商標）アッセイ）が挙げられる。

　第２の手法は、質量分析によりメチル化ＤＮＡを定量する方法である。例えば、第２の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを付加したプライマーで増幅する。次いで、増幅したＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮａｓｅにより塩基特異的な切断反応を行う。そして、かかる切断反応産物を質量分析計にかけ、質量測定を行う。

　そして、質量測定によって得られたメチル化シトシン残基由来の質量（シトシンの質量）と、非メチル化シトシン残基由来の質量（ウラシルの質量）とを比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。

　かかる第２の手法の好ましい例としては、例えば、質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法（例えば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）、Ｊｕｒｉｎｋｅ　Ｃら、Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、８３～９５頁、及び特許文献２を参照）が挙げられる。

　ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）では、バイサルファイト処理後のＣｐＧサイトを含むＤＮＡを増幅し、ＲＮＡに転写した後、ＲＮＡａｓｅによりウラシルの部位で特異的に切断する。これにより、ＤＮＡのメチル化の有無に応じて長さの異なるＲＮＡ断片が生成される。得られたＲＮＡ断片を質量分析にかけることで、ＣｐＧサイトがメチル化された断片と非メチル化断片とが分子量の差に従って分離され、検出される。該ＣｐＧサイトを含むＤＮＡの増幅のためのプライマーは、ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ用プライマー設計ソフト）等を用いて設計することができる。ＲＮＡ断片の質量分析には、一塩基の質量の差異を検出できるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＡＳ（例えば、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　４）が用いられる。メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片との質量の比から、ＤＮＡのメチル化レベルが算出される。

　第３の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、下記伸長反応（シークエンス反応）においては、ウラシルはチミンとして示される。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。そして、前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。このようにして得られたメチル化シトシン残基由来の発光の強度（シトシンの発光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の発光の強度（チミンの発光強度）とを比較し、例えば、下記式によって前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（％）を算出する。
　　ＤＮＡメチル化レベル（％）＝シトシンの発光強度×１００／（シトシンの発光強度＋チミンの発光強度）。

　第３の手法としては、例えば、パイロシークエンシング法（登録商標、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）１０：１０３－１１０参照）等が挙げられる。

　第４の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを増幅する。次いで、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出する。前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドの融解曲線を、メチル化・非メチル化対照検体を鋳型とする増幅産物の融解曲線と比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。

　第４の手法としては、例えば、メチル化感受性高解像能融解曲線分析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔｉｎｇ：ＭＳ－ＨＲＭ、Ｗｏｊｄａｃｚ　ＴＫら、Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．，２００８年、３巻、１９０３～８ページ参照）が挙げられる。

　第５の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合に増幅可能なプライマーセット、及び前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に増幅可能なプライマーセットを調製する。そして、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを、これらのプライマーセットを用いて各々増幅する。そして、得られた増幅産物の量、すなわちメチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量、及び非メチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量を比較することにより、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。

　さらに、かかる第５の手法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、前記レポーター蛍光色素とは異なるレポーター蛍光色、及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡに前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたゲノムＤＮＡを鋳型として前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このようにして検出されたメチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。

　第５の手法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を用いたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法等のメチル化特異的定量ＰＣＲ法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＳ－ＰＣＲ）　ｕｓｉｎｇ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ）が挙げられる。

　第６の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、直接シークエンシング反応を行う。そして、決定された塩基配列に基づく蛍光強度、すなわちメチル化シトシン残基由来の蛍光強度（シトシンの蛍光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の蛍光強度（チミンの蛍光強度）とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。

　さらに、かかる第６の手法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドをＰＣＲ反応等によってクローニングする。そして、得られた複数のクローンニング産物の塩基配列を各々決定し、メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。

　第６の手法としては、例えば、バイサルファイト直接シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、及びバイサルファイトクローニングシークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられる（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ＬＳら、Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ、２００９年、５５巻、１４７１～８３ページ参照）。

　第７の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを含む領域をＰＣＲにて増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ断片を、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合とされていない場合とで配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理する。そして、電気泳動することによって分画された、メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片と非メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片とのバンドの濃さを定量的に解析することにより、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。

　第７の手法としては、例えば、ＣＯＢＲＡ（バイサルファイトと制限酵素との併用による解析）が挙げられる。

　第８の手法は、イオン交換クロマトグラフィーを用いる方法である。例えば、第８の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いでこれを断片化して、前記ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片を得る。得られたＤＮＡ断片を鋳型として、該ＣｐＧサイトを含む領域をＰＣＲにて増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ断片を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、該ＣｐＧサイトがメチル化されているＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡとを分離する。

　第８の手法において、ＰＣＲの増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＣｐＧサイトが多いサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＣｐＧサイトが少ないサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５ｍｅｒ付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０～４０ｂｐが下限となる。一方で、ＣｐＧサイトの含有率がリッチになるようにプライマーを設計するのが好ましい。例えば、ＣｐＧサイトのシトシンが、ＰＣＲ増幅産物の鎖長に対して２％以上含まれるのが好ましく、５％以上含まれるのがより好ましい。

　第８の手法では、非メチル化シトシン残基は、ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理によってウラシルに変換された後、ＰＣＲによりさらにチミンへと変換される。一方、メチル化シトシン残基は、バイサルファイト処理及びＰＣＲの後にもシトシンのままである。この塩基の違いにより、メチル化シトシンを含む断片（メチル化断片）と非メチル化断片は、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、保持時間が異なる別個のピークとして検出される。すなわち、メチル化断片は、非メチル化断片と比べて、より保持時間が短いピークとして検出される。したがって、イオン交換クロマトグラフィーでのピークの保持時間に基づいて、ＣｐＧサイトのＤＮＡがメチル化しているか否かを判定することができる。さらに、イオン交換クロマトグラフィーにかけるＤＮＡに複数のＣｐＧサイトが含まれている場合、より多数のＣｐＧサイトがメチル化されているほど、ピークの保持時間はより短くなる。したがって、該ピークの保持時間に基づいて、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。あるいは、該ピークの面積又は高さに基づいて、メチル化断片及び非メチル化断片それぞれの存在量や存在比率を算出することも可能である。

　好ましくは、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルが既知のサンプル（対照）と比較するか、又はＤＮＡメチル化レベルが既知のサンプルを用いて予め作成した検量線を用いることによって、ＣｐＧサイトのＤＮＡがメチル化しているか否か、又はＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを判定する。あるいは、ＤＮＡメチル化レベルが既知のサンプルを用いて、ＣｐＧサイトが高度にメチル化されているメチル化断片のピークの保持時間とメチル化レベルの低い断片のピークの保持時間とを分ける基準となる保持時間（本明細書において基準保持時間ともいう）を予め決定しておく。例えば、基準保持時間より早い保持時間で検出された断片は、高度にメチル化されたＤＮＡと判定される。

　第８の手法で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーである。カラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、国際公開公報第２０１２／１０８５１６号に示される、充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。より好ましくは、該基材粒子は、強カチオン性基（好ましくは４級アンモニウム塩）を有する親水性重合体の層が疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されている被覆重合体粒子と、該被覆重合体粒子表面に導入された弱カチオン性基（好ましくは３級アミノ基）とを含む基材粒子である。クロマトグラフィー分析の際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上９０℃未満である。

　以上、本発明において「ＤＮＡメチル化レベルを検出する手法」として好適に用いることのできる手法を例示したが、手法はこれに限定されるものではない。前記第１～第８の手法では、前述のとおり、子宮内膜細胞、子宮体癌細胞、又はそれらを含む組織から調製されたゲノムＤＮＡは、さらにバイサルファイト処理に供される。したがって、本発明の方法においてＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルの検出に用いられるゲノムＤＮＡは、好ましくは、子宮内膜細胞、子宮体癌細胞、又はそれらを含む組織由来の、バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡである。

　本発明の方法においては、検出したＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルから子宮体癌の予後（悪性度、再発リスクを含む）、被験体の温存療法への適合性、又は子宮体癌のリスク（子宮内膜の癌化リスク）、が判定される。
　本発明による子宮体癌の予後判定においては、好ましくは、被験体の子宮体癌の予後が悪いか否か、あるいは、該被験体の子宮体癌が高悪性度であるか否か、又は該被験体の子宮体癌の再発リスクが高いか否かが判定される。また好ましくは、該ＤＮＡメチル化レベルの検出に用いた細胞又は組織が、予後不良の子宮体癌を有する患者に由来するものであるか否か、あるいは、高悪性度又は再発リスクの高い子宮体癌を有する患者に由来するものであるか否かが判定される。
　本発明による被験体の温存療法への適合性の判定においては、好ましくは、該被験体が子宮体癌の温存療法に対して適合性があるか否かが判定される。また好ましくは、該ＤＮＡメチル化レベルの検出に用いた細胞又は組織が、子宮体癌の温存療法に対して適合性である患者に由来するものであるか否かが判定される。
　本発明による子宮体癌のリスク判定においては、好ましくは、被験体の子宮内膜の癌化リスクが高いか否か、又は該被験体が子宮体癌のリスクが高いか否かが判定される。より好ましくは、該被験体の子宮内膜が将来子宮体癌を保有するリスクが高いか否か、又は該被験体が将来子宮体癌を発症するリスクが高いか否かが判定される。あるいは、該ＤＮＡメチル化レベルの検出に用いた細胞又は組織が、子宮体癌のリスクが高い被験体に由来するものであるか否かが判定される。

　前記の判定のための具体的な指標（閾値）は、当業者であれば、ＤＮＡメチル化レベルを検出する手法に合わせて適宜設定することができる。判定の手順の実施形態について以下に述べる。

　前記判定のための第一の実施形態においては、まず各ＤＮＡメチル化レベル検出手法について、各々のＣｐＧサイトに対し受信者操作特性（ＲＯＣ）解析を行い、感度（陽性率）及び特異度（陰性率）を求める。感度及び特異度の和が最大となるＤＮＡメチル化レベルをカットオフ値として設定することができる。例えば、ヨーデン指標に基づいてカットオフ値を設定することができる。

　前記第一の実施形態において、子宮体癌の進行によってメチル化レベルが亢進するＣｐＧサイト（例えば、表１（Ａ）及び表２に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイト）については、本発明の方法で検出されたＤＮＡメチル化レベルがカットオフ値より高い場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定されるか、又は温存療法への適合群ではないと判定される。一方、該検出されたメチル化レベルが該カットオフ値以下であれば、該被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群ではないと判定されるか、又は温存療法への適合群であると判定される。
　一方、子宮体癌の進行によってメチル化レベルが低減するＣｐＧサイト（例えば、表１（Ｂ）及び表３に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイト）については、本発明の方法で検出されたＤＮＡメチル化レベルがカットオフ値より低い場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定されるか、又は温存療法への適合群ではないと判定される。一方、検出されたメチル化レベルが該カットオフ値以上であれば、該被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群ではないと判定されるか、又は温存療法への適合群であると判定される。

　前記判定のための第二の実施形態においては、被験体由来の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（サンプル）についてのイオン交換クロマトグラフィー解析（前記第８の手法）で得られたピークの保持時間を、メチル化していない該標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（陰性対照）又はメチル化した該標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（陽性対照）についての保持時間と比較することによって、該ＣｐＧサイトのメチル化レベルの決定、又は前述した子宮体癌についての癌の予後判定、リスク判定、もしくは温存療法への適合性の判定を行う。

　前記第二の実施形態においては、子宮体癌の進行によってメチル化レベルが亢進するＣｐＧサイト（例えば、表１（Ａ）及び表２に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイト）については、陰性対照のピークよりも短い所定の保持時間のピークがサンプルから検出された場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定されるか、又は温存療法への適合群ではないと判定される。好ましくは、陽性対照と同等の保持時間のピークがサンプルから検出された場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定されるか、又は温存療法への適合群ではないと判定される。一方、該ＤＮＡメチル化レベルが診断閾値を超えない場合、該被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群ではないと判定されるか、又は温存療法への適合群であると判定される。
　一方、子宮体癌の進行によってメチル化レベルが低減するＣｐＧサイト（例えば、表１（Ｂ）及び表３に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイト）については、陽性対照のピークよりも長い所定保持時間のピークがサンプルから検出された場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定されるか、又は温存療法への適合群ではないと判定される。あるいは、陰性対照と同等の保持時間のピークがサンプルから検出された場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定されるか、又は温存療法への適合群ではないと判定される。一方、該ＤＮＡメチル化レベルが診断閾値を超えない場合、該被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群ではないと判定されるか、又は温存療法への適合群であると判定される。

　前記第一及び第二の実施形態において、複数のＣｐＧサイトのメチル化レベルが検出される場合は、ＤＮＡメチル化レベルが前記診断閾値を超えたＣｐＧサイトの数又は割合を、判定のための指標とすることができる。例えば、調べた全てのＣｐＧサイトのメチル化レベルがいずれも診断閾値を超えた場合に、被験体を、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定するか、又は温存療法への適合群ではないと判定することができる。あるいは、調べたＣｐＧサイトのうちの一定割合以上でメチル化レベルが診断閾値を超えた場合に、被験体を、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定するか、又は温存療法への適合群ではないと判定することができる。あるいは、一定数以上のＣｐＧサイトのメチル化レベルが診断閾値を超えた場合に、被験体を、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群であると判定するか、又は温存療法への適合群ではないと判定することができる。一方、これらの基準を満たさなかった被験体は、子宮体癌の予後不良群もしくは子宮体癌の高リスク群ではないと判定されるか、又は温存療法への適合群であると判定され得る。

　このように、本発明によれば、子宮体癌のリスクや予後を判定することができる。本発明の方法により子宮体癌の発症の高リスク群患者を早期に発見することができれば、予防的に介入を行って子宮体癌の発症を回避したり、早期の治療により患者の生命予後を改善することができる。特に、本発明の方法により悪性度や再発の可能性の低い子宮体癌を選別することで、患者に対する温存療法の有効性を予測することができる。該温存療法への有効性の予測は、将来妊娠する可能性のある若年性子宮体癌の患者にとって特に有用である。ＭＰＡ療法などの妊孕性温存療法は、妊娠を望む患者にとって重要な治療の選択肢であるが、早期癌患者にしか有効でなく、かつ外科手術と比べて再発のリスクが高い。そのため、温存療法の適用に際しては、当該療法に対する患者の適合性を慎重に見極める必要がある。本発明は、温存療法を望む患者に対して該患者への温存療法の有効性についての情報を提供することで、該患者のＱＯＬ及び生命予後の改善に貢献することができる。

　したがって、本発明はまた、前記本発明のリスク判定方法により子宮体癌の高リスク群に分類された被験体に予防介入することに関する。この本発明の態様は、該高リスク群の被験体における子宮体癌の予防、早期診断、又は早期治療を可能にする。
　さらに本発明は、前記本発明のリスク判定方法により子宮体癌と判定された被験体を治療することを含む、子宮体癌の治療方法を提供する。さらに本発明は、前記本発明の予後判定方法により子宮体癌の予後不良群に分類された被験体を治療することを含む、子宮体癌の治療方法を提供する。これらの本発明の態様は、子宮体癌を有する被験体に対してより早期に適切な治療を施すことを可能にする。治療の手段としては、外科手術、化学療法、放射線療法、ＭＰＡ療法等のホルモン療法などが挙げられるが、特に限定されない。

　さらなる態様において、本発明は、上述した子宮体癌のリスクや予後判定のため、又は患者の温存療法への適合性の判定のためのデータを提供することに関する。本態様の一実施形態は、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出、又は、子宮体癌の予後判定に用いるためのデータの取得方法であり、該方法は：被験体の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、検出したＤＮＡメチル化レベルに基づいて、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出するためのデータ、又は該被験体の子宮体癌の予後を判定するためのデータを取得すること、を含む。本態様の別の一実施形態は、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出、又は、子宮体癌患者の温存療法への適合性の判定に用いるためのデータの取得方法であり、該方法は：子宮体癌患者の子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、検出したＤＮＡメチル化レベルに基づいて、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出するためのデータ、又は該子宮体癌患者の温存療法への適合性を判定するためのデータを取得すること、を含む。本態様の別の一実施形態は、子宮内膜の癌化リスクの判定、又は、子宮体癌のリスク判定のためのデータの取得方法であり、該方法は：被験体の子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、検出したＤＮＡメチル化レベルに基づいて、該子宮内膜の癌化リスクを判定するためのデータ、又は該被験体の子宮体癌のリスクを判定するためのデータを取得すること、を含む。該被験体の例、ゲノムＤＮＡの調製及びＤＮＡメチル化レベルの検出の手順、及びメチル化レベルを検出すべき標的ＣｐＧサイトは上述と同様である。上述のとおり、表１～表３に示すＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルは、子宮体癌の予後やリスク又は温存療法への適合性を表すマーカーとして使用することができる。
　上記の本発明によるデータの取得方法は、医師等による子宮体癌の予後やリスク又は温存療法への適合性の診断を含まない方法である。例えば、該方法は、研究所や臨床検査機関などにおいて実施される、医師等による診断に必要なデータを取得するための方法である。

　さらに本発明は、子宮体癌の予後（悪性度、再発リスクを含む）の判定、被験体の子宮体癌の温存療法への適合性の判定、又は子宮体癌のリスク（子宮内膜の癌化リスク）判定のためのプライマー又はプローブを提供する。該プライマー又はプローブは、少なくとも１２塩基の鎖長を有し、かつ、バイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトにハイブリダイズする。

　本発明のプライマー又はプローブの一例は、表４～６に示すいずれかのＤＮＡ領域（例えば、配列番号１～６８のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域）に含まれるＣｐＧサイトにハイブリダイズするプライマー又はプローブである。好ましくは、当該プライマー又はプローブは、表４に示すいずれかのＤＮＡ領域（例えば、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域）に含まれるＣｐＧサイトにハイブリダイズするプライマー又はプローブである。

　本発明のプライマー又はプローブの好ましい一例は、配列番号１～６８のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるプライマー又はプローブである。本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、配列番号１～６８のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列と９５％以上の同一性を有し、かつ当該配列がハイブリダイズするＣｐＧサイトと同じＣｐＧサイトにハイブリダイズするプライマー又はプローブである。また、これらのプライマー又はプローブがハイブリダイズするＣｐＧサイトと同じＣｐＧサイトにハイブリダイズする該プライマー又はプローブの断片も、本発明のプライマー又はプローブとして使用することができる。

　本発明のプライマー又はプローブのより好ましい例は、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるプライマー又はプローブである。本発明のプライマー又はプローブの別のより好ましい例は、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列と９５％以上の同一性を有し、かつ当該配列がハイブリダイズするＣｐＧサイトと同じＣｐＧサイトにハイブリダイズするプライマー又はプローブである。また、これらのプライマー又はプローブがハイブリダイズするＣｐＧサイトと同じＣｐＧサイトにハイブリダイズする該プライマー又はプローブの断片も、本発明のプライマー又はプローブとして使用することができる。

　本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片（例えば、配列番号１～６８のいずれかのヌクレオチド配列を含む断片又はその相補鎖）にハイブリダイズし、かつその３’末端にメチル化シトシン又は非メチル化シトシンに相補的な塩基を有するように構築されたプライマー又はプローブである（例えば前述した第１の手法に用いることができるプライマー又はプローブ）。

　本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行うことができるプライマー（シークエンシングプライマー）である（例えば前述した第３の手法に用いることができるプライマー又はプローブ）。別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプローブである（例えば前述した第４の手法に用いることができるプライマー又はプローブ）。

　本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片（例えば、配列番号１～６８のいずれかのヌクレオチド配列を含む断片又はその相補鎖）における、メチル化された又はメチル化されていない該標的ＣｐＧサイトを含む領域を特異的に増幅可能なプライマーセットである（例えば前述した第５の手法もしくは第８の手法におけるＰＣＲ増幅に用いることができるプライマーセット）。

　本発明のプライマー又はプローブの鎖長は、少なくとも１２塩基であればよいが、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、さらに好ましくは１５～２００塩基である。プローブの場合、好ましい鎖長は１００～２００塩基、より好ましくは１００～１５０塩基である。ＰＣＲプライマーの場合、好ましい鎖長は１２～６０塩基、より好ましくは１５～４０塩基である。また、本発明のプライマー又はプローブは、標識（例えば蛍光標識）されていてもよい。また本発明のプライマー又はプローブは、好ましくは、前記第１～第８の手法のいずれかに用いることができるプライマー又はプローブである。

　さらに、本発明は、前記本発明のプライマー又はプローブを含む、子宮体癌の予後判定、被験体の子宮体癌の温存療法への適合性の判定、又は子宮体癌のリスク判定のためのキットを提供する。好ましくは、本発明のキットは、前記第１～第８の手法のいずれかによる、子宮体癌の予後判定、被験体の子宮体癌の温存療法への適合性の判定、又は子宮体癌のリスク判定のため、又はそれらの判定のためのデータを取得するために用いられる。

　本発明のキットは、前記本発明のプライマー又はプローブ以外の成分を含むことができる。このような成分の例としては、バイサルファイト処理に必要な試薬（例えば、亜硫酸水素ナトリウム溶液等）、ＰＣＲ反応に必要な試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチドや耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等）、インフィニウム（登録商標）アッセイに必要な試薬（例えば、蛍光物質にて標識されたヌクレオチド）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）に必要な試薬（例えば、塩基特異的な切断反応を行うためのＲＮａｓｅ）、パイロシークエンシングに必要な試薬（例えば、ピロリン酸の検出のためのＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン－５’－ホスホ硫酸、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、一本鎖ＤＮＡを分離するためのストレプトアビジン等）、ＭＳ－ＨＲＭ法に必要な試薬（例えば、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーター等）、標識の検出に必要な試薬（例えば基質や酵素、陽性対照や陰性対照サンプル、試料（組織由来のゲノムＤＮＡ等）の希釈や洗浄に用いる緩衝液等）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、該キットには、その使用説明書を含めることができる。

　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔患者及び組織サンプル〕
　本実施例は、慶應義塾大学病院の倫理委員会の承認のもと、ヘルシンキ条約に従って実施された。組織サンプルは、慶應義塾大学病院にて外科手術を受けた患者から得られた。全ての患者からは、書面によるインフォームドコンセントを得た。

　類内膜癌を有する子宮体癌患者（Ｅ）群（年齢２３－７７歳）より、子宮体癌組織のサンプルを得た（ｎ＝７４）。また子宮体癌を有さない患者（Ｃ）群（年齢３３－５５歳）より、子宮内膜組織サンプルを得た（ｎ＝３１）。子宮体癌患者（Ｅ）群のうち、年齢が４０歳以下の３４人を若年性子宮体癌患者（ＹＥ）群に分類し、年齢が４０歳より上の４０人を老年性子宮体癌患者（ＯＥ）群に分類した。
　（Ｅ）群における癌の組織学的診断および異型度診断は、ＷＨＯ分離（２００３）及びＴＮＭ分類に基づいて行った。臨床的ステージの診断は、ＦＩＧＯ分類に基づいて行った。癌の再発は、診察と画像診断に基づいて臨床医が診断した。（Ｅ）群の臨床病理学的因子を表７に示す。

　採取した組織は凍結保存された。得られた新鮮凍結組織サンプルを、フェノール－クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ　ＤＮＡメチレーション－ゴールド^TMキット（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてバイサルファイト処理した。

〔実施例１　子宮体癌に伴うＤＮＡメチル化の変化〕
（インフィニウム（登録商標）アッセイによるＤＮＡメチル化レベルの検出）
　８６６，８９５個のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化状態を、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ　ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、１ＣｐＧサイトの解像度にて解析した。ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ　ＢｅａｄＣｈｉｐは、販売元のＩｌｌｕｍｉｎａ社から提供される仕様によれば、プロモーター領域、５’非翻訳領域、第１エクソン、遺伝子内、３’非翻訳領域を解析対象に含み、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子の９９％、ＣｐＧアイランドの９６％をカバーする。

　バイサルファイト処理したＤＮＡに対し、インフィニウム（登録商標）アッセイキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて全ゲノム増幅処理を行った。増幅したＤＮＡ断片を、前記チップ上のプローブとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしたＤＮＡに対し、１塩基伸長反応にて蛍光標識した塩基を取り込ませた。これにより、メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズしたメチル化検出用プローブ、及び非メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズした非メチル化検出用プローブのそれぞれを蛍光標識した。次いで、製造会社のプロトコールに従って、ｉＳｃａｎ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて蛍光シグナルを測定した。得られたデータは、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて解析した。各ＣｐＧサイトにおいて、メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブからのシグナルの合計に対する、メチル化検出用プローブからのシグナルの相対比を算出した。すなわち、各ＣｐＧサイトからのメチル化レベルは、所謂β値（範囲：０．００～１．００）として表された。

（統計解析）
　得られたメチル化レベルのデータについて、Ｗｅｌｃｈ　ｔ検定及びボンフェローニ補正を行い、（Ｃ）群と（Ｅ）群との間でメチル化レベルに有意差（ｐ値＜０．０１、かつ｜Ｅ群平均－Ｃ群平均｜≧０．２５）を示すＣｐＧサイトを検出した。その結果、（Ｃ）群と比べて（Ｅ）群でメチル化異常を示す６３，０３３個のＣｐＧサイトを同定した。

〔実施例２　若年性子宮体癌に伴うＤＮＡメチル化の変化〕
　実施例１と同様の手順で、若年性子宮体癌患者（ＹＥ）群についてインフィニウム（登録商標）アッセイを行い、癌に伴いＤＮＡメチル化レベルが変化するＣｐＧサイトを検出した。その結果、（Ｃ）群と比べて（ＹＥ）群でメチル化異常を示す４０，５８９個のＣｐＧサイトを同定した。

〔実施例３　ＤＮＡメチル化プロファイルに基づく全子宮体癌のクラスタリング〕
（階層的クラスタリング）
　実施例１で見出された６３，０３３個のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルに基づく階層的クラスタリング（ユークリッド距離、ウォード法、及びキャンベラ距離、完全リンク法）により、（Ｅ）群をクラスターＡ（（Ｅ－Ａ）群、ｎ＝５８）とクラスターＢ（（Ｅ－Ｂ）群、ｎ＝１６）に分けた（図１）。（Ｅ－Ａ）群及び（Ｅ－Ｂ）群の臨床病理学的因子を表８に示す。（Ｅ－Ａ）群は、（Ｅ－Ｂ）群に比して、有意に年齢が高く、脈管侵襲が有意に高頻度であって、かつ高異型度Ｇ３症例が多い傾向を有していた。また再発及び死亡例は全て（Ｅ－Ａ）群に含まれていた。したがって、（Ｅ－Ａ）群は臨床病理学的悪性度が高い、予後不良の患者群であると考えられた。

〔実施例４　ＤＮＡメチル化プロファイルに基づく若年性子宮体癌のクラスタリング〕
（階層的クラスタリング）
　実施例３と同様の手順で、実施例２で見出された４０，５８９個のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルに基づく階層的クラスタリングにより、（ＹＥ）群をクラスターＡ（（ＹＥ－Ａ）群、ｎ＝２２）とクラスターＢ（（ＹＥ－Ｂ）群、ｎ＝１２）に分けた（図２）。（ＹＥ－Ａ）群及び（ＹＥ－Ｂ）群の臨床病理学的因子を表９に示す。（ＹＥ－Ａ）群は、（ＹＥ－Ｂ）群に比して、脈管侵襲及び高異型度Ｇ３症例が多い傾向を有していた。また唯一の再発例は（ＹＥ－Ａ）群に含まれていた。さらに、（ＹＥ－Ａ）群の患者は、全て前記（Ｅ－Ａ）群に含まれており、かつ（ＹＥ－Ｂ）群の患者は、全て前記（Ｅ－Ｂ）群に含まれていた。これらの結果から、（ＹＥ－Ａ）群は臨床病理学的悪性度が高い、予後不良の患者群であると考えられた。

〔実施例５　低悪性度の子宮体癌を検出可能なＤＮＡメチル化マーカーの同定〕
　高悪性度の（ＹＥ－Ａ）群とより低悪性度の（ＹＥ－Ｂ）群とを判別するためのマーカーを探索した。（ＹＥ－Ａ）群と（ＹＥ－Ｂ）群とでのＤＮＡメチル化レベルの差が最も大きい１００個のＣｐＧサイトについてＲＯＣ解析を行った。各サイトのメチル化レベルについて、（ＹＥ－Ａ）群と（ＹＥ－Ｂ）群の判別の感度と特異度によるＲＯＣ曲線を作成し、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。

　ＲＯＣ解析の結果、ＡＵＣが０．９５以上である６８個のＣｐＧサイトが見出された。このうち、３１個のＣｐＧサイトは、（ＹＥ－Ａ）群でメチル化レベルが亢進しており、３７個のＣｐＧサイトは、（ＹＥ－Ｂ）群でメチル化レベルが亢進していた（表１０及び１１）。さらに、これら６８個のＣｐＧサイトのうち、ＡＵＣが１（感度及び特異度１００％）である１１個のＣｐＧサイトが見出された。１１個中６個のＣｐＧサイトは、（ＹＥ－Ａ）群でメチル化レベルが亢進しており、５個のＣｐＧサイトは、（ＹＥ－Ｂ）群でメチル化レベルが亢進していた。これら６８個のＣｐＧサイトのメチル化レベルは、若年性子宮体癌のリスク又は予後を示すマーカー、特に、低悪性度（すなわち非予後不良）群を判別するためのマーカーとして利用可能であることが示唆された。悪性度が低い若年性子宮体癌の患者は温存療法の有力な適用対象であることから、これらのＣｐＧサイトのメチル化レベルは、温存療法に適合性を有する子宮体癌患者を判別するためのマーカーとしても有用である。

〔実施例６　ＤＮＡメチル化マーカーを用いた子宮体癌の悪性度判定〕
　実施例５で同定したＡＵＣが１である１１個のＣｐＧサイトの各々について、ヨーデン指標に基づいて、感度及び特異度の和が最大となる（ＲＯＣ曲線のグラフ上の左上隅に最も近づく）メチル化レベルを仮の診断閾値（カットオフ値）として設定した。図３に示すように、１１個のＣｐＧサイト全てについて、設定した診断閾値により、１００％の感度及び特異度で（ＹＥ－Ａ）群と（ＹＥ－Ｂ）群が区別された。したがって、実施例５で同定したＣｐＧサイトのメチル化レベルを測定することで、若年性子宮体癌のリスク又は予後の判定、又は低悪性度（すなわち非予後不良）群の判別が可能であることが示された。

　さらに、実施例４で示したとおり、若年性子宮体癌患者の（ＹＥ－Ａ）群及び（ＹＥ－Ｂ）群は、全子宮体癌患者の（Ｅ－Ａ）群及び（Ｅ－Ｂ）群にそれぞれ包含されることから、実施例５で同定されたＤＮＡメチル化マーカーが、若年性子宮体癌患者のみならず、老年性子宮体癌患者を含むあらゆる子宮体癌患者について癌のリスク又は予後を示すマーカーとして使用可能であることが示唆された。そこで、実施例５で同定したＡＵＣが１である１１個のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルについて、高悪性度（Ｅ－Ａ）群と低悪性度（Ｅ－Ｂ）群の判別の感度と特異度に関するＲＯＣ曲線を作成し、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。結果を表１２に示す。１１個のＣｐＧサイトのＡＵＣは、約０．９４～０．９９以上であり、かつその半数以上は特異度１００％を示した。したがって、これらのＣｐＧサイトが、若年性子宮体癌患者及び老年性子宮体癌患者を含むあらゆる子宮体癌患者についての癌のリスク又は予後を示すマーカーとして有用であることが示された。

Claims

　予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出方法であって、
　子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、予後不良な子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
　温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織の検出方法であって、
　子宮体癌細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者由来の細胞又は組織を検出すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
　子宮内膜の癌化リスクの判定方法であって、
　子宮内膜細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
　検出したＤＮＡメチル化レベルから、該子宮内膜の癌化リスクを判定すること、
を含み、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
方法。
　前記標的ＣｐＧサイトが、第１０染色体１０６，４００，２５９位、第８染色体５６，８５２，２９０位、第１４染色体６０，９７３，８２３位、第６染色体２８，２２６，９８０位、第１染色体６２，６６０，６２４位、第６染色体１０，３９０，９１９位、第８染色体１３２，３２１，９１７位、第１１染色体５，３４６，２４９位、第２１染色体３１，９７２，５０６位、第２染色体１，９２８，４８０位、及び第１染色体２４８，３６６，３９９位に位置するＣｐＧサイト、ならびにそれらの近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
　前記標的ＣｐＧサイトが、以下：
　第１０染色体の１０６，４００，１９９位から１０６，４００，３２０位までのＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の５６，８５２，２３０位から５６，８５２，３５１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
第１４染色体の６０，９７３，７６３位から６０，９７３，８８４位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の２８，２２６，９２０位から２８，２２７，０４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１染色体の６２，６６０，５６４位から６２，６６０，６８５位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の１０，３９０，８５９位から１０，３９０，９８０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の１３２，３２１，８５７位から１３２，３２１，９７８位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１１染色体の５，３４６，１８９位から５，３４６，３１０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２１染色体の３１，９７２，４４６位から３１，９７２，５６７位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２染色体の１，９２８，４２０位から１，９２８，５４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；及び
　第１染色体の２４８，３６６，３３９位から２４８，３６６，４６０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト、
からなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
　前記標的ＣｐＧサイトが、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
　前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、バイサルファイト処理された前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
　前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、パイロシークエンシング法、質量分析、ビーズアレイ法又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、請求項７記載の方法。
　子宮体癌の予後判定、温存療法に対して適合性である子宮体癌患者の判定、又は子宮体癌のリスク判定のためのプライマー又はプローブであって、
　該プライマー又はプローブは、少なくとも１２塩基の鎖長を有し、かつ、バイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトにハイブリダイズし、
　該標的ＣｐＧサイトが、表Ａに記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
プライマー又はプローブ。
　前記標的ＣｐＧサイトが、第１０染色体１０６，４００，２５９位、第８染色体５６，８５２，２９０位、第１４染色体６０，９７３，８２３位、第６染色体２８，２２６，９８０位、第１染色体６２，６６０，６２４位、第６染色体１０，３９０，９１９位、第８染色体１３２，３２１，９１７位、第１１染色体５，３４６，２４９位、第２１染色体３１，９７２，５０６位、第２染色体１，９２８，４８０位、及び第１染色体２４８，３６６，３９９位に位置するＣｐＧサイト、ならびにそれらの近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項９記載のプライマー又はプローブ。
　前記標的ＣｐＧサイトが、以下のＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項９記載のプライマー又はプローブ：
　第１０染色体の１０６，４００，１９９位から１０６，４００，３２０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の５６，８５２，２３０位から５６，８５２，３５１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
第１４染色体の６０，９７３，７６３位から６０，９７３，８８４位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の２８，２２６，９２０位から２８，２２７，０４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１染色体の６２，６６０，５６４位から６２，６６０，６８５位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第６染色体の１０，３９０，８５９位から１０，３９０，９８０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第８染色体の１３２，３２１，８５７位から１３２，３２１，９７８位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第１１染色体の５，３４６，１８９位から５，３４６，３１０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２１染色体の３１，９７２，４４６位から３１，９７２，５６７位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；
　第２染色体の１，９２８，４２０位から１，９２８，５４１位までの領域に含まれるＣｐＧサイト；及び
　第１染色体の２４８，３６６，３３９位から２４８，３６６，４６０位までの領域に含まれるＣｐＧサイト。
　前記標的ＣｐＧサイトが、配列番号１～１１のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項９記載のプライマー又はプローブ。