WO2020122702A1

WO2020122702A1 - Metodo para incrementar la produccion de biomasa y de lipidos en chlorella vulgaris

Info

Publication number: WO2020122702A1
Application number: PCT/MX2019/050030
Authority: WO
Inventors: M. del Pilar SÁNCHEZ SAAVEDRA
Original assignee: Centro de investigacion Cientifica y de Educacion Superior de Ensenada
Current assignee: Centro de investigacion Cientifica y de Educacion Superior de Ensenada
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-06-18
Anticipated expiration: 2021-06-14
Also published as: EP3896150A1; US20220056490A1; EP3896150A4

Abstract

Un método para incrementar la producción de biomasa y de ácidos grasos en el alga Chlorella vulgaris Beyerinck y obtener una biomasa rica en lípidos de tipo C:16 (palmítico), 5 C18:1n-9 (oleico), C18:2n-6t (linoléidico) y C18:3n-3 (alfa-linolénico), que usa una baja irradiancia de una fuente lumínica dicromática.

Description

METODO PARA INCREMENTAR LA PRODUCCION DE BIOMASA Y DE

LIPIDOS EN CHLORELLA VULGARIS

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un método para incrementar de forma controlada la producción de lipidos en el alga Chlorella vulgaris y más específicamente se refiere a un novedoso método para incrementar la producción de ácidos grasos en el alga Chlorella vulgaris Beyerinck (Beijerinck) que permite obtener un aumento significativo de ácidos grasos del tipo C:16 (palmítico) , C18:ln-9 (oleico) , C18:2n-6t

( linoléidico ) y C18:3n-3 (alfa-linolénico) , favoreciéndose además un incremento en la producción de biomasa del alga. Antecedentes de la Invención

Los cultivos de microalgas son una de las alternativas de generación de biomasa vegetal con mayor potencial de desarrollo, ya que no requieren de sustratos sólidos para su puesta en práctica. Asimismo, estos cultivos tienen la ventaja de ser tan versátiles que pueden llevarse a cabo al aire libre o en reactores cerrados en los que se pueden controlar de mejor forma las condiciones del cultivo. Uno de los aspectos fundamentales a considerar al realizar estos cultivos, es eficientizar la producción de biomasa, esto es, la cantidad en gramos de las células cosechadas respecto al volumen del medio líquido con nutrientes usado como sustrato de cultivo. La biomasa de las células de las microalgas varía en función del tamaño de las células y del peso seco orgánico (libre de cenizas) .

En el estado de la técnica se describen diversos métodos para producir cultivos de microalgas en los que el rendimiento en la cantidad de la biomasa producida, depende de diversos factores como el tipo de sistema de cultivo, la magnitud de las variables ambientales entre las que se consideran principalmente la temperatura, la cantidad y la forma química de los nutrientes disponibles en medio, la salinidad, el pH, el tipo de especie de microalga y las condiciones de iluminación.

Los cultivos de microalgas son considerados una de las más promisorias fuentes de biomasa para la obtención de biocombustibles , debido a que muchas especies tienen un rápido crecimiento y una alta producción de biomasa, así como un alto contenido de lípidos que puede ser utilizado para la producción de biodiésel. Por otra parte, las microalgas usan dióxido de carbono disuelto y pueden crecer en aguas residuales usando los nutrientes disponibles en las mismas, además de que pueden cultivarse en tierras no aptas para la agricultura [Christi, Y. (2007) Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances 25(3) : 294—306] .

Uno de los factores más significativos para alterar el metabolismo de las células de las microalgas es el tipo y tasa de exposición a la luz, lo cual se refiere a las horas de luz y de oscuridad (ciclo luz y oscuridad) , a la cantidad de luz (irradiancia) y a la composición espectral de la luz (longitudes de onda o colores de la luz) . La composición espectral de la luz en algunas especies de microalgas modifica el crecimiento, la producción de enzimas, la fotosíntesis y las rutas de síntesis metabólica [Voskresenskaya, N.P. (1972) Blue light and carbón metabolism. Annual Review of Plant Physiology 23(1) :219- 234.; de la Peña M.R. (2007) Cell growth and nutritive valué of the tropical benthic diatom, Amphora sp . , at varying levels of nutrients and light intensity, and different culture locations. Journal of Applied Phycology 19:647-655; Vadiveloo, A. , N.R. Moheimani, J.J. Cosgrove, P.A. Bahri, D. Parlevliet. (2015) Effect of different light spectra on the growth and productivity of acclimated Nannochloropsis sp . (Eustigmatophyceae ) . Algal Research 8:121-127] .

Adicionalmente, durante el transcurso de un cultivo de microalgas, la disponibilidad de los nutrientes y de la luz tiende a disminuir, debido a que los nutrientes son usados para la producción de biomasa de las células y la luz disminuye debido al aumento en la densidad de células en suspensión. Por lo anterior, en los cultivos de microalgas durante la fase de crecimiento exponencial (cuando no hay limitación de luz y nutrientes) el crecimiento y la producción de biomasa son mayores que en la fase estacionaria del crecimiento (donde hay limitación de luz y/o nutrientes) . Estos cambios en el crecimiento de las microalgas producen también modificaciones en la composición química de las células. Sin embargo, no todas las especies de microalgas responden de forma igual a las distintas variables medio ambientales y estas diferencias en su respuesta se deben a sus características fisiológicas, las cuales determinan su tasa de crecimiento, el tamaño de las células y la composición bioquímica. Estas diferencias en la fisiología de las microalgas se deben a una respuesta especie- específica, ya que, dependiendo del espectro lumínico incidente sobre el cultivo, se producen distintas cantidades y tipos de pigmentos que permiten a las microalgas captar la energía de la luz, de la que a su vez depende la actividad enzimática y por tanto, la producción de metabolitos celulares . Se han llevado a cabo, distintos estudios para intentar identificar cómo el espectro lumínico incidente sobre los cultivos de microalgas, modifica el metabolismo celular. Por ejemplo, Kim et al. 2014 [Kim, D.G., Lee, C., Park, S.M. y Choi, Y.E. (2014) Manipulation of light wavelength at appropriate growth stage to enhance biomass productivity and fatty acid methyl ester yield using Chlorella vulgaris . Bioresource Technology 159:240-248] describen un estudio sobre el efecto de diversos tipos de lámparas LEDs (Light- emitting diodes) de color rojo (630-665 nm) y azul (430-465 nm) sobre el cultivo fototrófico de Chlorella vulgaris obtenida de la colección de UTEX en Texas, USA. El cultivo se realizó en medio JM en Erlenmeyer de 1000 mi a 2610.5°C, 100 gmol fotón m-2 s-1 de luz continua y aireación de 110 mi min-1. Los resultados mostraron que la luz azul incrementó el tamaño celular y que la luz roja disminuye el tamaño de las células, pero activa la división celular. Los autores proponen el uso alterno de iluminación de los cultivos con luz azul y luz roja para fomentar el crecimiento y la producción de lipidos respecto al tratamiento control (luz blanca) . En luz azul obtienen células de tamaño de entre 4.5 y 6.0 pm, en luz roja de entre 1.8 a 4.0 pm y en luz blanca de entre 2.8 a 5.0 pm. La producción de biomasa como peso seco fue para luz azul de 0.020 ng celula-1 y para luz roja de entre 0.15 a 0.22 ng celula-1. En dicho estudio se describen los valores solo para algunos componentes del perfil de ácidos grasos y su efecto por cambio del tipo de iluminación a diferente número de dias en luz azul y roja en los que obtienen para <310:0 (0.51 a 1.51%), <314:0 (1.11 a 1.63%), <316:0 (14.38 a 15.53%), C17:l (11.23 a 12.28%), C18:0

(3.7 a 7.21%), C18:2 (7.76 a 10.33%) y C18:3 (29.7 a 33.47%). Blair et al . 2014 [Blair, M.F., Kokabian, B. y Gude,

V.G., (2014) Light and growth médium effect on Chlorella vulgaris biomass production. Journal of Environmental Chemical Engineering 2(1) : 665-674] describen un estudio acerca del efecto de distintas longitudes de onda de luz incidente (azul, blanca, verde, roja) y la composición del medio de cultivo sobre el crecimiento de microalgas. En dicho estudio utilizaron una cepa de Chlorella vulgaris obtenida de Connecticut Valley Biological Supply Co . Inc. , Southampton, MA. El medio de cultivo usado fue Bold basal (BBM) y los cultivos se mantuvieron en reactores de 6 L a 276 pmol fotón m-2 s-1, con agitación constante de 100 rpm a una temperatura controlada de 25°C. Los experimentos se realizaron en 3 fases: 1) el efecto de diferentes longitudes de onda; 2) el efecto del medio a 25%, 50% y 100% de la composición sugerida y; 3) el efecto de la concentración de nutrientes (nitrógeno y fósforo) . Los resultados mostraron que la luz azul produce mayores tasas de crecimiento y producción de biomasa comparativamente a lo obtenido en luz blanca, roja y verde. Se encontró que por efecto del medio de cultivo la concentración de 50% respecto a la composición sugerida es la que brinda un mayor crecimiento. Los valores de producción de biomasa al día 2 resultaron para luz blanca en 0.02 g L-l día-1, para luz roja 0.005 g L-l día-1, para luz azul 0.012 g L-l día-1 y para luz verde 0.01 g L-l día- 1.

Daliry et al. 2017 [Daliry, S., Hallajisani, A., Roshandeh, J.M., Nouri, H., Golzary, A. (2017) Investigation of optimal condition for Chlorella vulgaris microalgae growth. Global Journal of Environmental Science and Management 3 (2) : 217-230] , es un trabajo de revisión bibliográfica en donde se describe el comportamiento del cultivo de Chlorella vulgaris al ser mantenido en distintas condiciones ambientales. Se menciona que los cultivos son más eficientes cuando la fuente de nitratos se encuentra en una concentración de entre 20 a 0.5 g L-l, el pH se fija entre 9 a 10, la iluminación es discontinua de entre 5 y 7 Klux y, se instaura un flujo de aireación de 200 mi min-1. La mayor producción de biomasa obtenida fue de 3.43 g L-l y la mejor producción de lipidos fue de 66.25 mg L-l día-1. Tomado del trabajo de Kim et al. (2014), describen los cambios en el tamaño de las células de Chlorella vulgaris al ser expuesta en luz azul la cual incrementa entre un 60 a 70% el diámetro respecto a la luz roja y que la producción de biomasa cambia en dependencia de los dias de exposición a luz roja o azul.

Pérez-Pasos et al. 2011 [ Pérez-Pazos , J.V., Fernández-

Izquierdo, P. (2011) Synthesis of neutral lipids in Chlorella sp . under different light and carbonate conditions. CT&F- Ciencia, Tecnología y Futuro 4(4) : 47-58] describen el uso de una especie de Chlorella sp . que es una microalga silvestre catalogada como LAUN0016 y que fue crecida en medio Bold's Basal (BBM) , mantenida en fotobioreactores con luz blanca a 20°C, aireación constante y un fotoperiodo de 12/12 horas de luz y oscuridad. En el trabajo se usan distintas condiciones experimentales en un diseño factorial en donde usan luz roja (700 nm) y azul (500 nm) , 2 concentraciones de CaC03 (0.5 y 1.5 g L-l) y 2 fotoperiodos (18:6 y 6:18) de horas de luz y oscuridad. Los resultados muestran que la mayor tasa de crecimiento se obtuvo con luz roja, con 0.5 g L-l CaC03 y 6:18 de fotoperiodo (0.109010.0014), mientras que la mayor producción de lipidos ocurre con luz azul 1.5 g L-l CaC03 y 18:6 de fotoperiodo (0.778310.0219 g L-l) . En el Articulo muestran un cromatograma, pero no calculan el porcentaje de lipidos para cada tipo de ácido graso en las distintas condiciones experimentales. Los autores describen los efectos del uso de luz azul y roja, pero solo indican la longitud de onda pico para cada caso; sin embargo, no indican el tipo de lámpara y tampoco las características espectrales de la luz utilizada para los ensayos.

Sánchez-Saavedra et al. 1996 [ Sánchez-Saavedra, M.P., Jiménez, C., Figueroa, F.L. (1996) Far-red light inhibit growth but promotes carotenoid accumulation in the green microalgae Dunalíella bardawil. Physiologia Plantarum 95:419-423] describen un estudio con Dunalíella bardawil , en donde los cultivos fueron expuestos a un gradiente de irradiancia de 50 a 300 pmol fotón m-2 s-1 de luz blanca y luz rojo lejano, se encontró que para ambos tipos de iluminación la densidad de células y la tasa de crecimiento incrementaron en relación directa al aumento de la irradiancia. La tasa de crecimiento fue significativamente menor con la luz rojo lejano (en el gradiente de irradiancia) con respecto a la luz blanca, sin embargo, se encontró que la producción de carotenoides se incrementó hasta un 50% (en base al peso seco) y que se obtuvo un aumento del tamaño celular por efecto de la luz rojo lejano respecto a los valores menores obtenidos con luz blanca.

Finalmente, Chávez-Fuentes et al. (2018) [Chávez-Fuentes, P., Ruiz-Marin, A., Y. Canedo-López . 2018. Biodiesel synthesis from Chlorella vulgaris under effect of nitrogen limitation, intensity and quality light: estimation on the based fatty acid profiles. Molecular Biology Reports https://doi.org/10.1007/sll033-018-4266-9] divulga que en ensayos realizados con Chlorella vulgaris expuesta a un efecto de limitación de nitrógeno y de la composición espectral de la luz respecto a la composición de ácidos grasos, se encontró una mayor producción de biomasa y densidad celular en la irradiancia de luz a 140 mE m-2 s-1, en luz blanca y luz azul comparado con luz violeta y amarilla. En dicho documento también se menciona que a causa de la composición espectral de la luz, no se encontró un efecto negativo en la producción de lipidos para uso como biocombustibles . En la composición de ácidos grasos el principal componente fue de C12:0 (ácido láurico) en valores entre 53.09 para luz azul en irradiancia de 140 mE m-2 s-1 y de 80.33 y 80.86 en luz blanca y violeta mantenidos con 70 mE m-2 s-1 respectivamente. Estos valores de ácidos grasos indicados para Chlorella vulgaris por Chávez-Fuentes et al. (2018) son muy diferentes a los publicados en la literatura del área aún en las condiciones estándar de producción en luz blanca. Si bien en los Artículos antes mencionados, se describe que el tipo de luz incidente puede modificar la respuesta metabólica de las microalgas y en particular se indica que es uno de los parámetros críticos en la producción de metabolitos, ninguno de ellos permite tener un panorama claro de los efectos de la radiación incidente en la producción de compuestos específicos. Asimismo, en dichos Artículos, los estudios se centran en especies de microalgas específicas y la irradiancia utilizada es alta por lo que los cultivos obtenidos tendrían dificultades para ser escalados a nivel industrial, toda vez que los requerimientos de estos son muy excesivos. Aunado a ello, si bien las algas estudiadas resultan ser de las más prometedoras para la obtención de grandes cantidades de biomasa, el perfil de producción de lipidos obtenido en los documentos antes citados no es el más indicado para que la biomasa obtenida pueda ser usada en procesos de obtención de biodiesel.

En vista de la problemática anterior, existe la necesidad de proporcionar una metodología específica capaz de modificar el comportamiento metabólico del alga Chlorella vulgaris Beyerinck, la cual es una de las microalgas más idóneas para ser usada en la producción de biomasa destinada a procesos de obtención de biocombustibles , que favorezca la producción de ácidos grasos con un alto índice de cetano (CN) . Asimismo, existe la necesidad de proveer una metodología de cultivo en la que se disminuya significativamente los requerimientos de poder lumínico incidente para así favorecer la implementación del método a gran escala, al mismo tiempo que se controle el tipo de lipidos producidos para así obtener una biomasa con un perfil de compuestos lipidíeos controlados y reproducibles .

Sumario de la Invención

Con el fin de superar las desventajas de los métodos convencionales de cultivo para microalgas, la presente invención tiene por objetivo de proveer una nueva metodología de cultivo específica que permita incrementar la producción de ácidos grasos en el alga Chlorella vulgaris Beyerinck, sin que sea necesario modificar las condiciones básales del medio de cultivo. Un objetivo particular de la presente invención es el proporcionar un método de cultivo específico para el alga Chlorella vulgaris Beyerinck que permita obtener un incremento significativo de la producción de lipidos del tipo C:16 (palmitico) , C18:ln-9 (oleico) , C18:2n-6t

( linoléidico ) y C18:3n-3 (alfa-linolénico) . Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar un método para incrementar la producción de ácidos grasos en el alga Chlorella vulgaris Beyerinck, que use un poder de irradiancia bajo y que además permita incrementar la biomasa producida.

Un objetivo adicional de la presente invención es el de proporcionar un método para incrementar la producción de ácidos grasos en el alga Chlorella vulgaris Beyerinck, que permita obtener una biomasa con una alta proporción de lipidos que pueda ser usada en procesos de obtención de biocombustibles .

Los objetivos antes citados, asi como otros y las ventajas de la presente invención, vendrán a ser aparentes de la siguiente descripción detallada de la misma.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención proporciona un novedoso método para incrementar la producción de ácidos grasos en el alga Chlorella vulgaris Beijerinck, en particular para incrementar la producción de lipidos de tipo <3:16

(palmitico), C18:ln-9 (oleico), C18:2n-6t (linoléidico) y C18:3n-3 (alfa-linolénico) ; al mismo tiempo que se incrementa el rendimiento del cultivo obteniéndose una biomasa mayor.

El método de la presente invención permite controlar el metabolismo del alga Chlorella vulgaris Beyerinck, a fin de favorecer la producción de ácidos grasos del tipo C:16 (palmitico) , C18:ln-9 (oleico) , C18:2n-6t ( linoléidico ) y

C18:3n-3 (alfa-linolénico) , sin que sea necesario modificar de ninguna forma las condiciones básales de los medios de cultivo convencionales del alga. Para ello el método de la presente invención usa fuentes de iluminación dicromáticas de baja intensidad con longitudes de onda especificas aplicadas en fases de crecimiento concretas, que permiten modificar el comportamiento metabólico basal del alga de forma que se favorece la producción de los ácidos grasos antes mencionados.

El método de la presente invención comprende los siguientes pasos secuenciales :

1.- Adicionar un inoculo del alga Chlorella vulgaris Beyerinck en fase exponencial de crecimiento, a un medio de cultivo "f" [ (Guillard, R.R.L., Ryther, J.H. (1962). Studies of marine planktoníc diatoms: I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (CLEVE) Gran. Canadian Journal of Microbiology, 8(2): 229-239) ] , preparado con agua dulce a pH de entre 7.3 y 8,0, hasta obtener una concentración de entre 0.4 a 0.5 x 106 células ml-1;

2.- Iluminar la solución del paso 1 con una fuente lumínica dicromática con picos de emisión de 450 nm y 625 nm, a una irradiancia de 50 Dmol fotón m-2 s-1, de forma continua en ciclos de luz/oscuridad de 24:0, manteniendo el cultivo a una temperatura de entre 20°C y 22°C por un periodo de tiempo de entre 48 y 72 horas hasta obtener una densidad de células de entre 0.95 a 1.05 X 106 células ml-1; 3.- Centrifugar la biomasa obtenida entre 3800 y 4200 rpm, por 5 a 10 min a una temperatura de entre 4°C y 6°C y;

4.- Liofilizar la biomasa centrifugada a -50°C y a una presión de 0.11 bar para obtener células secas de Chlorella vulgaris Beyerinck con un alto porcentaje de ácidos grasos.

Con el método antes descrito se obtiene una biomasa seca que tiene células completas de Chlorella vulgaris Beyerinck con una producción de biomasa promedio de 57.2 pg célula-1. Esta biomasa obtenida tiene un contenido de lipidos totales del 18% en la fase exponencial y 11% en la fase estacionaria, siendo el contenido de lipidos de C:16 de 12.47% en la fase exponencial y 19.71% en la fase estacionaria, C18:ln-9 de 12.09% en la fase exponencial y 23.23% en la fase estacionaria, C18:2n-6t de 12.04% en la fase exponencial y 10.42% en la fase estacionaria y C18:3n-3 de 36.31% en la fase exponencial y 25.89 en la fase estacionaria. Dicho contenido de lipidos, asi como su tipo permiten usar la biomasa obtenida como materia prima de procesos convencionales de obtención de biocombustibles dado que el tipo de lipidos obtenidos presentan el mejor perfil para ser usados como materia de partida de procesos de obtención de aceites de alto indice de cetano. Asimismo, debido a que no se usan ningún tipo de hormonas aceleradoras de crecimiento ni se incluyen compuestos tóxicos en el medio de cultivo, la biomasa obtenida puede usarse en la fabricación de piensos animales o de suplementos destinados al consumo humano. Además de lo anterior, al no usarse cepas con modificaciones genéticas de Chlorella vulgaris Beyerinck, se garantiza la seguridad ambiental e inocuidad de la biomasa obtenida. La biomasa obtenida por la metodología antes descrita es perfectamente susceptible de ser usada en procesos de obtención de biodiesel ya que se obtienen ácidos grasos con alto grado de saturación (SFAs) como el caso del C16:0 con una concentración porcentual en fase exponencial de 12.47 ± 0.15 y en la fase estacionaria de 19.71 ± 0.73, los cuales muestran alto valor de número de cetano (CN = 74.5), altos valores de punto de fusión (62.9°C), alto punto de ebullición (351.0 °C) y baja densidad (0.85 g cm-3) . El número de cetanos (CN) es uno de los indicadores que describen la calidad de la combustión del biodiesel durante el proceso de ignición. En particular en la ingeniería de biodiesel, un valor alto de CN en los combustibles tiene cortos procesos de retardo de la ignición respecto a los valores bajos de CN (Knothe, 2005) . [Knothe, G. (2005) Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters. Fuel. Process Technol. 86(10) :1059-1070] . El CN y la calidad de la ignición están inversamente relacionados por medio de una función logarítmica negativa respecto al grado de saturación de los ácidos grasos (Knothe et al., 2003)

[Knothe. G., Matheaus, A.C., Ryan T.W. (2003) Cetane numbers of branched and straight-chain fatty esters determined in an ignition quality tester. Fuel 82 ( 8 ): 971-975] . Los ácidos grasos saturados (SFAs) que se producen con el método antes descrito, tiene altos valores de CN y estabilizan la combustión con bajas emisiones, son resistentes a la degradación y en consecuencia incrementan la longevidad del biodiesel obtenido, también incrementan la resistencia a la oxidación en lugares con climas cálidos, por lo que la biomasa obtenida por la metodología antes descrita puede ser usada en procesos de obtención de biodiesel convencionales. La biomasa obtenida por el método de la presente invención también puede ser usada como suplemento alimenticio, ya que el tipo y proporción de los ácidos grasos obtenidos la vuelven un candidato idóneo como materia prima de partida de la obtención de piensos y complementos. Por medio de la metodología de la presente invención, se obtiene una biomasa rica en ácidos grasos saturados que son estables a la oxidación como resultado de la saturación de los dobles enlaces de carbón, por lo que esta biomasa puede usarse para aportar características importantes en la estabilidad de los alimentos. Por ejemplo, el ácido graso palmítico es usado en la dieta de humanos y constituye cerca del 60% de su dieta, su aporte es principalmente de carnes y grasas animales (mantequilla, queso, nata) así como de vegetales como la palma (44%) y semillas (8 a 20%) [Carta, G., E. Murru, S. Banni, C. Manca. 2017. Palmitic acid : physiological role metabolism and nutritional implications . Front . Physiol. https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00902] . Por otro lado, el ácido graso oleico es usado como hipotensor y previene el desarrollo de problemas cardiovasculares y ayuda al control de colesterol y lipoproteínas de alta densidad (HDL) [Pérez- Rosales, R., Villanueva-Rodríguez S., Cosío-Ramírez , R. 2005. El aceite de aguacate y sus propiedades nutricionales . E-Gnosis 3 (10) : 11 pp . ] .

A fin de evidenciar las ventajas técnicas del método antes mencionado, se muestra a continuación un ejemplo de la puesta en práctica de la presente invención.

Ejemplo 1. Cultivo del alga Chlorella vulgaris Beyerinck bajo la metodología de la presente invención. Se inició un cultivo madre monoespecifico de células de Chlorella vulgaris Beyerinck (Beij erinick) 1890 obtenidas de la colección de microalgas del "Institute of Applied Microbiology (IAM)" de la Universidad de Tokyo, Bunkyo-Ku, Tokyo, Japón.

Se tomaron células de los cultivos madre en fase de crecimiento exponencial y se trasfirieron a matraces Erlenmeyer que contenían medio "f" de cultivo (Guillard y Ryther, 1962), preparado con agua dulce, cuya composición se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Composición del medio "f" de cultivo.

Compuesto Concentración

NaN03 150 mg

NaH2 P04 · H20 10 mg

Quelato de Fe 10 mg

Na2Si03 · 9H20 30-60 mg

Tiamina · HC1 0.2 mg

Biotina 1.0 mg

B12 1.0 mg

CuS04 · 5H20 0.0196 mg

ZnS04 · 7H20 0.044 mg

CoC12 · 6H20 0.020 mg

MnC12 · 4H20 0.360 mg

NaMo04 · 2H20 0.0126 mg

Agua cbp 1 L

Los cultivos se iniciaron con una densidad de células promedio de entre 0.40 a 0.42 x 106 células ml-1, y se irradiaron con una fuente de luz dicromática con picos de emisión en 450 nm y 625 nm, por fotoperiodos de luz y oscuridad de 24:0 de forma continua, manteniendo la temperatura de los cultivos a 21±1°C y a pH entre 7.3 y 8.0, con agitación manual de 1 minuto cada 24 horas. La densidad celular se midió diariamente por conteos directos con hemocitómetro y microscopio compuesto y se valoró el tamaño de las células midiendo aleatoriamente el diámetro celular.

La evaluación de la cantidad de la biomasa producida de Chlorella vulgaris Beyerinck se realizó por medio de colecta de una alícuota de los cultivos en filtros de fibra de vidrio (GF/C) con abertura de poro de 1 pm, el filtro se enjuagó con formiato de amonio (3%) para eliminar residuos de sales. El peso seco total (TDW) se obtuvo al mantener los filtros en una estufa a 60°C hasta tener peso constante. El contenido de cenizas (AC) se obtuvo al incinerar los filtros en una mufla a 450°C por 12 h para posteriormente obtener el peso de la muestra. El contenido del peso seco orgánico (ODW) se calculó al sustraer del valor del peso seco total del peso de las cenizas (ODW=TDW-AC) .

La producción de biomasa por célula se calculó relacionando el peso orgánico de la muestra y la densidad de células. La producción diaria de biomasa (PDB) se obtuvo al relacionar el peso seco orgánico con el tiempo de cultivo.

El contenido de lípidos de los cultivos de Chlorella vulgaris Beyerinck se obtuvo al colectar una alícuota de un volumen de los cultivos en filtros de fibra de vidrio (GF/C) con abertura de poro de 1 pm. Los lípidos se extrajeron al macerar la muestra y usar cloroformo, metanol y agua (2:2:1) . La cuantificación se realizó siguiendo el método con ácido sulfúrico. El contenido de lípidos se expresó como porcentaje en base al peso seco orgánico de la muestra. Como estándar para la curva de calibración se utilizó tripalmitina (99%) . Para obtener el perfil de ácidos grasos, la biomasa de células de Chlorella vulgaris Beyerinck se cosechó por centrifugación a 4000 rpm, por 5 a 10 min y a 4°C. La biomasa húmeda de las células de Chlorella vulgaris Beyerinck se liofilizó a -50°C y una presión de 0.110 bar hasta obtener biomasa seca. La extracción de los lipidos de las células de Chlorella vulgaris Beyerinck se realizó por métodos gravimétricos en frío usando cloroformo para la extracción. Se realizó una metilación y el perfil de ácidos grasos se analizó por cromatografía de gases. Para la identificación de los ácidos grasos se tomó en consideración el tiempo de retención de un estándar comercial de ácidos grasos.

Todas las valoraciones se llevaron a cabo en fase de crecimiento exponencial (E) día 2 y estacionaria (S) día 8. Los resultados de las valoraciones de los cultivos se muestran a continuación:

Tabla 2. Tasa de crecimiento (m: divisiones día-1), máxima concentración de células (MCD: x 106 células ml-1), peso seco total (TDW: pg célula-1), peso seco orgánico (ODW: pg célula-1), tamaño celular (TC: pm) y valores de producción diaria de biomasa (PDB: g L-l día-1) para Chlorella vulgaris Beyerinck en fase de crecimiento: exponencial (E) y estacionaria (S) .

TDW ODW TC PDB

m MCD

E S E S E S E S

0.47+2.29+ 80.90+ 68.51+ 57.20+ 68.51+ 14.95+ 14.86+ 0.065+ 0.078+ 0.04b 0.15 3.37 5.99 0.82 5.99 2.94 2.40 0.001 0.001

Tabla 3. Contenido de lipidos (%) de Chlorella vulgaris Beyerinck en dos fases de crecimiento: exponencial (E) y estacionaria (S) .

Lipidos

E S

18.35+0.25 11.27+0.70

Tabla 4. Composición de ácidos grasos (en base al porcentaje del total de ácidos grasos) de Chlorella vulgaris Beyerinck cultivada en dos fases de crecimiento: exponencial y estacionaria.

Tipo de lipido Fase de crecimiento

Ácidos grasos saturados (SFA) Exponencial Estacionaria

C6 : 0 0.13 ±0.01 0.15 ±0.01 C8 : 0 0.49 ±0.03 0.36 ±0.02 CIO: 0 3.61 ±0.10 3.02 ±0.12 Cll : 0 0.96 ±0.03 1.06 ±0.03 C12 : 0 0.13 ±0.01

C13 : 0 1.89 ±0.08 1.56 ±0.05 C14 : 0 0.38 ±0.01 0.38 ±0.01 C15 : 0 0.18 ±0.00 0.19 ±0.01 C16 : 0 12.47 ±0.15 19.71 ±0.73 C17 : 0 0.19 ±0.01 0.23 ±0.02 C18 : 0 1.74 ±0.10 2.09 ±0.03 C20: 0 0.21 ±0.01 0.30 ±0.03 C21: 0

C24 : 0 0.11 ±0.01 0.07 ±0.00

Ácidos grasos monosaturados (MUFA)

C14 : 1 0.43 ±0.02 0.33 ±0.01

C15 : 1 0.33 ±0.02 0.08 ±0.01

C16 : 1 9.25 ±0.48 8.13 ±0.05

C17 : 1 6.18 ±0.22 1.56 ±0.09

C24 : 1 0.06 ±0.00 0.09 ±0.00

C18 : ln-9 12.09 ±0.13 23.23 ±0.41

C20 : ln-9 0.11 ±0.01 0.30 ±0.00

C22 : ln-9 0.18 ±0.01 0.38 ±0.01

Ácidos grasos poliinsaturados (PUFA)

C18 : 2n-6c 0.19 ±0.01 0.09 ±0.00

C18 : 2n-6t 12.04 ±0.11 10.42 ±0.09

C18 : 3n-6 0.19 ±0.00 0.10 ±0.01

C18 : 3n-3 36.31 ±0.73 25.89 ±0.81

C20 : 2 0.08 ±0.01

C20 : 3n-3 0.08 ±0.00 0.12 ±0.00

C20 : 4n-6

C20 : 5n-3 0.06 ±0.00 0.08 ±0.00

TOTAL 100.00 100.00

Los resultados anteriores muestran de forma inequívoca que, con la metodología de la presente invención, se puede incrementar la proporción de ácidos grasos producidos por Chlorella vulgaris Beyerinck obteniéndose un perfil lipidico apto para ser usado como materia de partida de procesos de obtención de biodiesel y con altos valores de indice de cetano.

La presente invención se ha descrito de acuerdo con una de sus modalidades preferidas; sin embargo, será aparente para un técnico con conocimientos medios en la materia, que podrán hacerse modificaciones a la invención, sin apartarse de su espíritu y alcance.

Claims

RE IVINDICACIONES

1.- Un método para incrementar la producción de ácidos grasos en Chlorella vulgaris Beyerinck y obtener una biomasa del alga con un porcentaje elevado de lipidos de C:16, C18:ln-9, C18:2n-6t y C18:3n-3 caracterizado porque comprende los pasos de:

1) adicionar un inoculo del alga Chlorella vulgaris Beyerinck en fase exponencial de crecimiento, a un medio de cultivo "f", preparado con agua dulce a pH de entre 7.3 y 8.0, hasta obtener una concentración de entre 0.4 a 0.5 x 106 células ml-1;

2) iluminar la solución del paso 1 con una fuente lumínica dicromática con picos de emisión de 450 nm y 625 nm, a una irradiancia de 50Qmol fotón m-2 s-1, de forma continua en ciclos de luz/oscuridad de 24:0, manteniendo el cultivo a una temperatura de entre 20°C y 22°C por un periodo de tiempo de entre 48 y 72 horas hasta obtener una densidad de células de entre 0.95 a 1.05 X 106 células ml-1;

3) centrifugar la biomasa obtenida a entre 3800 y 4200 rpm, por 5 a 10 min a una temperatura de entre 4°C y 6°C y;

4) liofilizar la biomasa centrifugada a -50°C y a una presión de 0.11 bar para obtener células de Chlorella vulgaris Beyerinck con un contenido de lipidos totales del 18%, de lipidos de C20 del 31%, de lipidos de C16 del 17% y de lipidos de C18:ln9t del 20.63%.

2 .- El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo "f" comprende 150 mg de NaN03; 10 mg de NaH2P04 ·H20; 10 mg de quelato de Fe; entre 30 a 60 mg de Na2Si03 · 9H20; 0.2 mg de tiamina*HCl; 1.0 mg de biotina; 1.0 mg de B12; 0.0196 mg de CuS04 · 5H20; 0.044 mg de ZnS04 · 7H20; 0.020 mg de CoC12^»6H20; 0.360 mg de MnC12^»4H20; 0.0126 mg de NaMo04 · 2H20 y; Agua cbp 1L.

3 . - El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo del paso 2) se mantiene a una temperatura de 21 °C y el pH entre 7.3 y 8.0, con agitación manual de 1 minuto cada 24 horas.

4 .- El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la centrifugación del paso 3 se lleva a cabo a 4000 rpm y a una temperatura de 4°C.

5 .- El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de Chlorella vulgaris Beyerinck liofilizadas tienen un perfil de lipidos en base al porcentaje total de ácidos grasos en la fase exponencial de 0.13 para C6:0; de 0.49 para C8:0; 3.61 para <310:0; 0.96 para C:ll; 0.13 para C12:0; 1.89 para C13:0; 0.38 para C14:0; 0.18 para C:15; 12.47 para C16:0; 0.19 para C17:0; 1.74 para C18:0; 0.21 para C:20; 0.11 para C:24;0.43 para C14:l; 0.33 para C15:l; 9.25 para C16:l; 6.18 para C17.1; 0.06 para C24:l; 12.09 para C18:ln-9; 0.11 para C20:ln-9; 0.18 para C22:ln-9; 0.19 para C18:2n-6c; 12.04 para C18:2n-6t; 0.19 para C18:3n-6; 36.31 para C18:3n-3; 0.00 para C20:2; 0.08 para C20:3n-3; 0.06 para C20:5n-5. El perfil de lipidos durante la fase estacionaria corresponde a 0.15 para C6:0; de 0.36 para C8:0; 3.02 para C10:0; 1.06 para C:ll; 0.00 para C12:0; 1.56 para C13:0; 0.38 para C14:0; 0.19 para C:15; 19.71 para C16:0; 0.23 para C17:0; 2.09 para C18:0; 0.30 para C:20; 0.07 para C:24; 0.33 para C14 : 1 ; 0.08 para C15 : 1 ; 8.13 para C16:l; 1.56 para C17.1; 0.09 para C24:l; 23.23 para C18:ln-9; 0.30 para C20:ln-9; 0.38 para C22:ln-9; 0.09 para C18:2n-6c; 10.42 para C18:2n-6t; 0.10 para C18:3n-6; 25.89 para C18:3n-3; 0.08 para C20:2; 0.12 para C20:3n-3; 0.08 para C20:5n-5.

6.- El uso de las células de Chlorella vulgaris Beyerinck obtenidas del paso 4, para la producción de biocombustibles .

7.- El uso de las células de Chlorella vulgaris Beyerinck obtenidas del paso 4, para preparar un suplemento alimenticio .