WO2020153390A1 - 活性炭材料を使用する工程を含む抗体精製方法 - Google Patents

活性炭材料を使用する工程を含む抗体精製方法 Download PDF

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由香 荻野
航太 井上
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Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying an antibody with high purity.
  • Non-patent Document 1 Many antibody pharmaceuticals are manufactured by a production system using CHO cells as a host (Non-patent Document 1), but in addition to the antibody that is the target substance, host cell-derived impurities (protein, DNA, etc.) are contained in the culture supernatant. ), impurities derived from the target substance (aggregates, related substances, etc.), and virus-like particles.
  • a host cell-derived protein Host cell protein; HCP
  • HCP is not only recognized as a heterologous protein in humans and exhibits antigenicity, but also has a tumorigenic risk.
  • the host cell-derived DNA has a concern of tumorigenicity.
  • Aggregates which are impurities derived from the target substance, may cause immunogenicity, and the post-translational modification product of the fragment and the target protein may adversely affect safety and drug efficacy.
  • infectivity of the endogenous virus and the DNA derived from the endogenous virus In addition, it is necessary to take measures against contamination by foreign viruses. In many cases, various in vitro virus tests and in vivo virus tests have been devised to avoid the risk of foreign virus contamination from cell substrates (such as CHO cells mainly used for production), medium raw materials, and conditioned medium. Therefore, it is important to rule out the contamination of typical viruses that may be mixed in the manufacturing process.
  • the antibody purification method is constructed by combining a plurality of steps including chromatography for the above purpose.
  • affinity chromatography such as protein A, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ceramic hydroxyapatite chromatography and the like are used. These chromatographies are based on the charge of the target substance and impurities, the degree of hydrophobicity, or the molecular size, or the specific binding action between the target substance and the immobilized ligand. Impurities, leached protein A, virus-like particles, etc. can be efficiently separated and removed.
  • CEX chromatography has recently been reported as an example of a purification method by F/T mode including overload mode.
  • F/T mode including overload mode.
  • the column By allowing the antibody, which is the target substance, to pass through while adsorbing impurities that are less contaminated than the target substance on the resin, etc., the column can be made smaller and the work process can be simplified and made more efficient. It has been shown that cost reduction can be achieved by reducing the amount of chromatography resin used. In fact, in the B/E mode up to now, even if a high-performance resin was used, the usage condition was 100 g/L resin or less, whereas in the F/T mode, 10 times that amount of 1000 g/L resin was used.
  • the problem was that the amount and type of impurities mixed in had an effect on the resolution compared to the B/E mode.
  • the antibody purification method in which the activated carbon material is combined with the F/T mode of AEX chromatography and CEX chromatography can extend the period of use of the chromatography column, but has a problem that the number of purification steps is large. That is, since the treatment with activated carbon material is performed in addition to the three-step chromatography of protein A chromatography, AEX chromatography, and CEX chromatography, the number of purification steps is large, which increases the manufacturing cost and the purification period. Becomes longer.
  • the inventors of the present application have conducted intensive studies to solve the above problems, and have found an efficient purification method that reduces the number of purification steps while maintaining the same quality as the conventional purification method. That is, by combining the F/T mode of CEX chromatography with the treatment with the activated carbon material, impurities are reduced by the activated carbon material, and it is expected that the activated carbon material can be used at low cost. It was found that the target antibody drug or the like can be stably and highly purified in the F/T mode of CEX chromatography, which had been a problem of reduction.
  • the inventors of the present application have found that the virus is surely removed by the activated carbon material, and complement the function of the AEX chromatography step having high virus clearance ability in the purification step of the antibody drug using CHO cells.
  • a manufacturing process capable of omitting the AEX chromatography step was constructed. That is, the present inventors have found an efficient purification method that combines treatment with an activated carbon material in two steps of F/T mode chromatography of protein A chromatography and CEX chromatography, and compared them with conventional purification methods.
  • the present invention has been completed by reducing the number of purification steps and manufacturing costs, and enabling efficient purification of antibodies to a quality sufficient for human therapeutic use.
  • a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities a1.
  • the cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c1.
  • Inactivating the virus in the affinity chromatography pool to obtain a virus inactivating solution, d1.
  • the virus inactivating liquid is treated with an activated carbon material to obtain an activated carbon material pool liquid, e1.
  • the activated carbon material pool liquid is treated with a cation exchange material to obtain a cation exchange material pool liquid, A1.
  • a method including the steps of.
  • a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities a2.
  • the cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c2.
  • Inactivating the virus in the affinity chromatography pool to obtain a virus inactivating solution, d2.
  • the virus inactivating liquid is treated with a depth filter to obtain a depth filter filtered pool liquid, e2.
  • the depth filter filtration pool liquid is treated with an activated carbon material to obtain an activated carbon material pool liquid, f2.
  • the activated carbon material pool liquid is treated with a cation exchange material to obtain a cation exchange material pool liquid, A2.
  • the virus inactivation is at least one selected from the group consisting of treatment with an acid, a surfactant, a chemical substance, a nucleic acid cross-linking agent, ultraviolet rays, gamma rays and heat, [1] to [4] ] The method described in any one of.
  • the hydrophobic interaction chromatographic material is POROS Benzyl Ultra, POROS Benzyl, Hexyl-650C, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenol Sepharose Pyrose Sepharose Perth, and Phenol Sepharose Phenose Sepharose Perth Phenose Perth.
  • the activated carbon material pool liquid is treated by hydrophobic interaction chromatography to obtain a pool liquid, and further treated with a cation exchange material to obtain a pool liquid. [1] to [14] One described method.
  • the hydrophobic interaction chromatographic material is POROS Benzyl Ultra, POROS Benzyl, Hexyl-650C, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose Pherose Perfore Phenose Perfore, or Phenol Sepharose Pherose Phenose Perfore Persperm.
  • At least one impurity is a host cell-derived protein (Host cell protein; HCP), phospholipase B-like 2 (PLBL2), virus, virus-like particle, high molecular weight species (HMWS), low molecular weight.
  • HCP host cell-derived protein
  • PLBL2 phospholipase B-like 2
  • HMWS high molecular weight species
  • LMWS low molecular weight species
  • a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities, a2. Prepare cell culture supernatant containing antibody, b2.
  • the cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c2.
  • a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities comprising: a1. Prepare cell culture supernatant containing antibody, b1. The cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c1.
  • a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities comprising: a2. Prepare cell culture supernatant containing antibody, b2. The cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c2.
  • the virus inactivating liquid is treated with a depth filter to obtain a depth filter filtered pool liquid, e2.
  • the depth filter filtration pool liquid is treated with an activated carbon material to obtain an activated carbon material pool liquid, f2.
  • the activated carbon material pool liquid is treated with a cation exchange material to obtain a cation exchange material pool liquid, A2 to f2.
  • the inventors of the present application added a treatment with an activated carbon material to the conventional antibody purification process to reduce the impurity load on the subsequent purification step, and stabilize the antibody regardless of the amount or type of impurities mixed in. It was found that it can be purified to the target purity. Furthermore, the inventors of the present invention have found that treatment with an activated carbon material can achieve high virus clearance ability, and complement the function of the AEX chromatography step having virus clearance ability in the purification process of antibody pharmaceuticals using CHO cells. As a result, a manufacturing process capable of omitting AEX chromatography was constructed. As a result, the number of purification steps and the manufacturing cost were reduced as compared with the conventional purification method, and the antibody could be efficiently purified to a sufficient purity for use in human therapy.
  • the term "antibody” refers to a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, or a multispecific antibody (bispecific antibody) formed from at least two intact antibodies. , Fc fusion protein, antibody fragment exhibiting biological activity, and the like.
  • the antibody to which the present invention is applicable is not limited by the antigen to which the antibody specifically binds. Further, the antibody to which the present invention is applicable is not limited by the amino acid sequence of the antibody.
  • bind/elute (B/E) mode refers to a product separation technique in which at least one product contained in a sample binds to a chromatography resin or medium and is subsequently eluted. To do.
  • flow-through (F/T) mode intends that at least one product in a sample will flow through a chromatographic resin or medium, but at least one potential It refers to a product separation technique in which components are attached to a chromatographic resin or medium.
  • the term “overload mode” means a product separation technology that intends to load the adsorption capacity of a column or the like and uses a difference in the strength of adsorption of a target substance and impurities. To do.
  • the cation exchange material is loaded with the crude antibody purified product in excess of the adsorption capacity of the cation exchange material.
  • the adsorption capacity of the crude antibody purified product on the cation exchange material is about 100 g of protein per liter of cation exchange material.
  • the loading density in the overload mode is 150 to 4000 g of protein mass per liter of the cation exchange material, but the preferred loading density is in the range of 500 to 2000 g/L, and the more preferred loading density is 1000 to 1500 g/L. Is the range.
  • affinity chromatography refers to a protein separation technique in which a target protein (eg, a protein or antibody containing the Fc region of interest) is specifically bound to a ligand specific for the target protein. Point to.
  • a target protein eg, a protein or antibody containing the Fc region of interest
  • a ligand is Protein A or Protein G or a functional variant thereof, which is covalently bound to the chromatographic solid phase material and the antibody solution is contacted with the chromatographic solid phase material. When it does, it binds to the antibody in the solution.
  • depth filter refers to a series of sequentially arranged filters with decreasing pore size used to remove particles from an antibody solution.
  • the three-dimensional matrix of the depth filter forms a labyrinthine path through which the antibody solution passes, randomly adsorbing and mechanically trapping particles throughout the depth of the matrix.
  • Various depth filters are composed of rolled cotton, polypropylene, rayon cellulose, glass fibers, sintered metal, porcelain, diatomaceous earth or other known ingredients.
  • cation exchange material or "CEX (;ation exchange) material” are used interchangeably and are negatively charged and thus aqueous solutions that have passed through or through the solid phase. Means a solid phase having free cations for exchange with cations therein.
  • anion exchange material or "AEX (; anion exchange) material” are used interchangeably and are bound to a solid phase, primary, secondary, tertiary or quaternary.
  • positively charged solid phase is meant having one or more positively charged ligands such as primary amino groups.
  • hydrophobic interaction chromatography or "HIC (; Hydrophobic Interaction Chromatography)” refers to the hydrophobicity of a molecule, that is, the ability of the molecule to adsorb onto a hydrophobic surface from an aqueous solution. Means a process for separating. Hydrophobic interaction chromatography, typically relying on differences in hydrophobic groups on the surface of solute molecules. These hydrophobic groups tend to attach to the hydrophobic groups on the surface of the insoluble matrix. Because HIC uses an environment that is more polar and less denaturing than reverse phase liquid chromatography, it is commonly used in antibody purification, often in combination with ion exchange or gel filtration chromatography.
  • activated carbon material means any substance composed of carbon or containing carbon, activated carbon.
  • Activated carbon means a carbonaceous material that has been treated to enhance its pore structure. Activated carbon is a porous solid with a very high surface area. These can be obtained from a variety of sources including coal, wood, coconut shells, nut shells, peat. Activated carbon can be manufactured from these materials using physical activation with heating in a controlled environment or chemical activation using strong acids, bases, or oxidants. The activation method creates a porous structure with a high surface area to give activated carbon a high impurity clearance capacity.
  • activated carbon is believed to use relatively weak Van der Waals forces to interact with molecules.
  • one type of activated carbon may be used alone, or two or more types of activated carbon may be used alone or in combination.
  • the term “continuous” means having some other mechanism that allows for continuous flow between each directly connected material. That is, the output from one process step includes two or more process steps (or unit operations) that flow directly to the next process step in the process without intervention, and include two or more process steps during the period. It means a process for purifying a target substance, which can be performed at least in part at the same time.
  • the terms “removal”, “reduction”, “clearance” are used interchangeably and mean to reduce the amount of one or more impurities in a sample containing the antibody to be purified.
  • purification and “enhancing purity” are used interchangeably to remove one or more impurities from a sample to result in a ratio of target antibody to one or more impurities in the sample. Means to increase.
  • the term “electrical conductivity” means the ability of an aqueous solution to conduct an electric current between two electrodes. In solution, current flows by ionic transport. Thus, as the amount of ions present in the aqueous solution increases, the solution will have higher electrical conductivity. Electrical conductivity can be measured using an electrical conductivity meter, the unit of measurement of electrical conductivity is millisiemens per centimeter (mS/cm or mS).
  • the electrical conductivity of a solution can be modified by changing the concentration of ions in it. For example, the concentration of buffer and/or the concentration of salt in the solution can be varied to achieve the desired electrical conductivity. Preferably, the salt concentrations of the various buffers are modified to achieve the desired electrical conductivity.
  • fraction means a small volume of liquid collected after providing a sample containing a target antibody in the step of loading the sample on the activated carbon material.
  • HCP host cell protein
  • CHO Chinese hamster ovary
  • HMWS high molecular weight species
  • LMWS low molecular weight species
  • virus means a small infectious agent or particle that can only replicate inside a living cell. They generally consist of a nucleic acid (RNA or DNA) encapsulated inside a protein capsid, and optionally a lipid envelope.
  • RNA or DNA nucleic acid
  • virus-like particle means a structure which is morphologically related to a known virus under an electron microscope.
  • retrovirus means an RNA virus capable of integrating its genetic information into the genomic DNA of infected cells via a reverse transcribed DNA intermediate.
  • retrovirus-like particle means a particle produced by a cell having a portion of retrovirus-derived DNA in its genome. These particles resemble retroviruses but are often non-infectious.
  • the murine leukemia virus (MLV) used in the examples herein represents a model retrovirus or retrovirus-like particle.
  • parvovirus refers to a linear, non-segmented, single-stranded DNA non-enveloped virus with an average genome size of 5000 nucleotides and a diameter of 18 to 26 nm.
  • MMV mouse microvirus
  • LRV logarithmic removal value
  • examples of the “medium component” include serum, growth factors (insulin etc.), antibiotics and the like.
  • HCP may induce immunogenicity via various mechanisms.
  • HCP persistence produced anti-HCP antibodies in all patients, and up to 60% of patients produced non-neutralizing anti-somatropin antibodies (M. Pavlovic et al., Horm. Res. 69:14-21 (2008)). Further removal of HCP improved the anti-somatropin antibody to the extent reported for other growth hormone antibodies.
  • recombinant factor IX produced in CHO cells, it was reported that anti-HCP antibody was produced at a considerably high rate and no adverse event was reported, but a pending order was received from the regulatory authority.
  • HCP residue on safety and stability will depend on the type and dosage of the product in addition to the type of host cell and the type of HCP remaining. Therefore, it is necessary to consider the manufacturing process, maximum dose, administration site, administration frequency, etc. to set an appropriate HCP residual value for each product, but to reduce it as much as possible in the manufacturing process. desired.
  • HCP is sufficient as a heterologous protein to show antigenicity to humans, a mammalian cell-derived protein has an oncogenic risk, and is stable from the viewpoint of polysorbate degradation in pharmaceuticals. As described above, it is necessary to remove to a low level in the purification step.
  • Phospholipase B-like 2 (PLBL2), which is a type of HCP, has been reported as a hitchhiking HCP that remains due to interaction with an antibody (B. Tran et al., J. Chromatogr. A 1438:31- 38 (2016)).
  • the activated carbon material has reduced HMWS and LMWS, which are impurities derived from the target substance.
  • HMWS and LMWS are impurities derived from the target substance.
  • the virus clearance ability was improved by adjusting the pH of the antibody solution loaded on the activated carbon material. It has been shown that activated carbon materials may be able to remove retroviruses and/or retrovirus-like particles, or parvoviruses with a limited amount of antibody solutions (WO 2015/005961), but the solution pH Is a condition of 7.0. On the other hand, the present invention found that the virus can be removed under the condition of pH 5.0, and further showed that the virus clearance ability under the condition of pH 5.0 is better than the previously reported conditions.
  • the AEX chromatography step has a virus clearance ability, but it is clear that the activated carbon material has a virus clearance ability equivalent to that of the AEX chromatography. Therefore, it was possible to treat with an activated carbon material as an alternative to the AEX chromatography step, which indicated that AEX chromatography could be omitted.
  • Chromatography such as AEX chromatography has complicated workability. By using an activated carbon material as an adsorption filter, chromatography with complicated workability can be omitted, resulting in a simpler and more efficient process. obtain.
  • expensive AEX resin, Membrane Adsorber, etc. as an inexpensive activated carbon adsorption filter, a significant reduction in running cost can be achieved. Furthermore, since an expensive chromatography device is not required and the filter unit can be replaced with an inexpensive filter unit, it is considered that the initial investment of manufacturing equipment can be greatly reduced.
  • Purification step adopted in the present invention a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities, a1.
  • the cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c1.
  • Inactivating the virus in the affinity chromatography pool to obtain a virus inactivating solution, d1.
  • the virus inactivating liquid is treated with an activated carbon material to obtain an activated carbon material pool liquid, e1.
  • the activated carbon material pool liquid is treated with a cation exchange material to obtain a cation exchange material pool liquid, A1.
  • a method (hereinafter, referred to as improved method 2) including the step of.
  • Protein A resin can be mentioned as a suitable example of the affinity chromatography resin in the step.
  • protein A resins include KanCapA (KANEKA), KanCapA3G (KANEKA), MabSelect SuRe (GE Healthcare LifeHece Science), MabSelectSureReceAceAcePeAceAceAcePeAcePeAcePeAcePeAcePeAcePeAcePeAcePeAcePe, and HbPePePePePePePePePePePe,PePe,PeP,PeP,PeP,PeP,Pp,PeP,Pp,Pp,Pe,Pe,Pe, and Pp and Pb and Pb and Pb and Pb and Pb and Pb (Pb and Pb and Pb and Pb (Pb and Pb and Pb and Pb (PeX).
  • Or Amsphere A3 JSR Life Sciences
  • the virus inactivation in the step of there may be mentioned any one method selected from the group consisting of treatment with an acid, a surfactant, a chemical substance, a nucleic acid crosslinking agent, ultraviolet rays, gamma rays and heat.
  • the acid treatment is selected as the virus inactivating treatment
  • the preferable pH range is a treatment for lowering the pH of the affinity chromatography pool solution to 3 to 4
  • a further preferable pH for the virus inactivating treatment is 3. It is 5.
  • the preferable treatment time is 60 to 120 minutes
  • the preferable treatment temperature is 15 to 30°C.
  • the activated carbon material in the step of is packed in a chromatography column.
  • the activated carbon material is of the filter type and is loaded into a disposable single-use device, such as the disposable form Millistak+® Pod.
  • the activated carbon material is filled in a cartridge or capsule.
  • activated carbon material is mixed with a filter medium having a strong structure such as a cellulose matrix.
  • activated carbon filters examples include Millistak+ (registered trademark) Pod CR40 (Merck Millipore), Zeta Plus activated carbon adsorbing depth filter (3M), and SUPRACap 50 Seitz (registered trademark) AKS filter (PALL).
  • the activated carbon material is not limited to the above.
  • the activated carbon filter has a structure that retains the activated carbon material in a cellulosic matrix. D1.
  • the pH of the solution to be loaded on the activated carbon material, the equilibration buffer of the activated carbon material and the washing buffer in the step of 4.5 is 4.5 to 7.5, and the more preferable pH is 4.5 to 5.5, and The preferred pH is 5.0. Also, d1.
  • the preferable electric conductivity of the solution loaded on the activated carbon material in the step of step 1, the equilibration buffer of the activated carbon material and the washing buffer is 2 to 10 mS/cm, and the more preferable electric conductivity is 2 to 5 mS/cm.
  • any one of resin, monolith column and membrane is selected.
  • the functional group of the cation exchange material is sulfopropyl, sulfoethyl, sulfoisobutyl, or carboxyl.
  • Examples of commercially available cation-exchange materials are POROSXS (Thermo Fisher Scientific), Eshmuno (registered trademark) CPX (Merck Millipore), Eshmuno (registered trademark) CP-FT (Merck MilliporeS), or Capless MilleporeS (Impact). Science), but is not limited to these cation exchange materials.
  • the activated carbon material pool liquid obtained in the above step is loaded in excess of the adsorption capacity of the cation exchange material.
  • the loading density can be selected in the range of 150 to 4000 g of protein mass per liter of cation exchange material, but the preferred loading density is in the range of 500 to 2000 g/L, and the more preferred loading density is 1000 to 1500 g/L. It is the range of L.
  • a preferable pH of the activated carbon material pool liquid to be loaded is pH 4 to 6, a more preferable pH is 4.5 to 5.5, and a further preferable pH is 5.0.
  • the preferred electrical conductivity of the solution loaded on the cation exchange material in the step (3) is 3 to 7 mS/cm, and the more preferred electrical conductivity is 3 to 5 mS/cm.
  • the process by the depth filter may be added during the process of.
  • the depth filter is a filter that can capture particles with a size of generally more than 1 ⁇ m from the two aspects of adsorption function and mechanical filtration effect of ordinary porous filter media, and it can be obtained from cellulose matrix and filter media such as diatomaceous earth. Become. It has a feature that an object can be trapped inside the filter by a thick filter medium having innumerable long flow paths.
  • the depth filter is loaded into a closed disposable device such as a Millistak+(R) Pod. Examples of commercially available depth filters include, but are not limited to, Millistak+(R) A1HC, D0HC, X0HC.
  • a method for purifying an antibody from a composition containing one or more impurities a2.
  • the cell culture supernatant is treated with an affinity chromatography resin to obtain an affinity chromatography pool containing antibody, c2.
  • Inactivating the virus in the affinity chromatography pool to obtain a virus inactivating solution, d2.
  • the virus inactivating liquid is treated with a depth filter to obtain a depth filter filtered pool liquid, e2.
  • the depth filter filtration pool is treated with an activated carbon material to obtain an activated carbon material pool liquid, f2.
  • the activated carbon material pool liquid is treated with a cation exchange material to obtain a cation exchange material pool liquid, A2.
  • C1. of improved method 2 which comprises the steps of Process and d1.
  • a method (hereinafter, referred to as improved method 1) in which a treatment with a depth filter is added during the step (1).
  • anion exchange material one of a resin, a monolith column and a membrane is selected, but in the case of a membrane, a Q membrane can be selected.
  • anion exchange materials are used in F/T mode. Examples of commercially available anion exchange materials can include, but are not limited to, NatriFlo® HD-Q, Mustang® Q, or Sartobind® Q. Not something.
  • the cation exchange material pool solution obtained in the step (1) may be further treated by hydrophobic interaction chromatography to obtain a pool solution (hereinafter, referred to as improved method 3).
  • d1 the improvement method 1 e2.
  • the activated carbon material pool solution obtained in step (1) is further treated by hydrophobic interaction chromatography to obtain a hydrophobic interaction chromatography pool solution, which is further treated with a cation exchange material to obtain a cation exchange material pool solution. It may be obtained (hereinafter referred to as improvement method 4).
  • the hydrophobic interaction chromatography described above is preferably in F/T mode.
  • hydrophobic interaction chromatography is carried out using a resin or membrane having a Phenyl group, a Benzyl group or a Hexyl group.
  • a resin or membrane having a Phenyl group, a Benzyl group or a Hexyl group examples of commercially available hydrophobic interaction chromatography material, Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Science), Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Science), Sartobind (TM) Phenyl (sartorius), ReadyToProcess Adsorber Phenyl (GE Healthcare Life Science), POROS Benzyl Ultra (Thermo Fisher Scientific), POROS Benzyl (Thermo Fisher Scientific), and Hexyl-650C which can be listed as mutual materials, Hexyl-650, which can be mentioned as mutual hydrophobic materials. Not a thing.
  • Some embodiments of any of the methods described herein further include recovering the purified antibody.
  • the purified antibody is recovered from any of the purification steps described herein.
  • At least one impurity selected from HCP, PLBL2, virus, virus-like particle, HMWS, LMWS, medium component, leached protein A and DNA is removed.
  • Example 1 General Method In this example, a general method commonly used in the examples shown in the second and subsequent examples will be described.
  • the antibody concentration was measured by the HPLC method using a PA ID Sensor Cartridge (2.1 mm ⁇ 3 mm, Applied Biosystems) column.
  • HCP measurement was performed by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a third-generation CHO host cell protein kit from Cygnus Technologies or a CHO
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Examples 2 to 5 a third-generation CHO host cell protein kit from Cygnus Technologies was used, and in Examples 6 to 8, a CHO
  • HMWS High molecular weight
  • LMWS low molecular weight
  • TSK gel G3000SWXL column 5 ⁇ m, 7.8 mm ⁇ 300 mm, Tosoh
  • the mobile phase used was 0.1 M phosphate buffer containing 0.4 M sodium chloride.
  • Protein A measurement It measured by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Protein A ELISA kit of Cygnus Technologies. The obtained protein A concentration was divided by the antibody concentration for comparison of the results, and converted into ng protein A/mg antibody.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Viral titer measurement and viral clearance ability Viral titer is 50%, which utilizes the phenomenon that cell shape changes upon infection with virus (cytopathic change).
  • the amount of virus that infects cells was measured by a method (tissue culture infectivity test; TCID 50 ).
  • the target viruses were mouse leukemia virus (MLV), mouse microvirus (MMV), pseudorabies virus (PRV), and reovirus type 3 (Reo3).
  • MMV mouse leukemia virus
  • MMV mouse microvirus
  • PRV pseudorabies virus
  • Reo3 reovirus type 3
  • As the indicator cells PG4 cells (MLV indicator cells), 324K cells or A9 cells (MMV indicator cells), Vero cells (PRV indicator cells), and L-929 cells (Reo3 indicator cells) were used.
  • LRV logarithmic elimination value
  • DNA measurement It was measured by the qPCR method using CHO-specific primers and probes. The obtained DNA concentration was divided by the antibody concentration and converted into pgDNA/mg antibody.
  • Example 2 Reference example (Mab A) purified by C/EX chromatography step in F/T mode This example illustrates the impurity clearance of a monoclonal antibody called Mab A in the purification flow shown in Table 1 below.
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab A was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.5, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivation treatment for 1 hour, the mixture was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution. The neutralized solution was loaded on a depth filter (Millistaka (registered trademark) Pod A1HC) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) in advance, and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0) to recover Mab A. did.
  • a depth filter Millistaka (registered trademark) Pod A1HC
  • the depth filter filtration pool solution was adjusted to pH 7.5 with an aqueous Tris solution to obtain an AEX material loading solution.
  • the AEX material load solution was passed through an AEX Membrane Adsorber (NatriFlo (registered trademark) HD-Q) that had been previously equilibrated with Tris buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride, and then Tris buffer (pH 7.5). Subsequently, Mab A was recovered by washing with Tris buffer (pH 7.5).
  • the recovered liquid was adjusted to pH 5.0 with acetic acid, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and stored as an AEX material pool liquid.
  • An AEX material pool solution was passed through a CEX column packed with POROS XS that had been equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0) containing 1 M sodium chloride in advance and subsequently with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the loading density on the CEX column was set to 2000 g/L resin or less. After loading, extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0). The absorbance at 280 mm was monitored, the fraction containing Mab A was obtained, and used as the CEX material pool solution in the F/T mode.
  • Example 3 Impurity clearance due to activated carbon materials (Mab A, Mab B, Mab C, Mab D)
  • This example describes the impurity clearance by activated carbon material of multiple antibodies called Mab A, Mab B, Mab C, or Mab D in the purification flow shown in Table 3 below.
  • the amino acid sequence of Mab A, Mab B, Mab C, or Mab D and the antigen to be bound are different.
  • the activated carbon filter was appropriately washed in advance according to the instruction manual, and then equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0). The flow rate after equilibration was set to 109 LMH. After equilibration, the activated carbon material loading solution in Mab B, about 300L / m 2, was loaded at about the Mab A 117L / m 2, after passing liquid was recovered Mab B and Mab A in acetate buffer (activated carbon material Pool fluid).
  • PLBL2 which is reported as a hitch-hike HCP that is difficult to reduce by a general antibody purification flow (International Publication No. WO2015/038888), is also reduced by activated carbon filter filtration due to interaction with the antibody. It was Since it is difficult to reduce PLBL2, which is a hitch-hike HCP by a general purification method, about 50% of the load solution is reduced by the activated carbon material, that is, the logarithmic removal value (LRV) of PLBL2 of 0.27 is reduced by the activated carbon material. There is great significance in obtaining it.
  • LUV logarithmic removal value
  • Viral clearance in activated carbon material was evaluated using Millistak+ (registered trademark) Pod CR40 as the activated carbon material. Viral clearance was confirmed by a spike test on Mab B, Mab C, and Mab D.
  • the viruses to be spiked were 4 viruses (MLV, MMV, Reo3 and PRV) that are commonly used in the virus clearance test of antibody drugs using CHO cells. As factors that may affect the virus clearance by filtration with an activated carbon filter, the flow rate, pH, and antibody type were raised, and a test for confirming those effects was planned.
  • the depth filter filtration pool liquid of Mab B, Mab C, and Mab D obtained according to the method shown in Example 2 was used as a load liquid (active carbon material load liquid) to the activated carbon filter (pH 5.0). Further, the pH of the load solution under the condition of pH 7.5 was adjusted to 7.5 with an aqueous Tris solution. The activated carbon filter was appropriately washed in advance according to the instruction manual, and then equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0) or Tris buffer (pH 7.5). The flow rate after the equilibration was set to 109 LMH or 54.5 LMH.
  • the activated carbon material load was loaded at about 55 L/m 2 or about 110 L/m 2 , and after passing through, Mab B, Mab C, and acetate buffer (pH 5.0) or Tris buffer (pH 7.5) were used.
  • Mab D was collected (activated carbon material pool solution), and virus logarithmic elimination value (LRV) was calculated from the virus titer of the activated carbon material load solution and the activated carbon material pool solution (Table 9). As a result, it was revealed that the activated carbon filter has a clearance ability for four kinds of viruses.
  • the virus clearance capacities at pH 5.0 and 7.5 in the evaluation of MLV it was found that the LRV was decreased at pH 7.5, and pH is an important parameter affecting virus clearance in activated carbon materials. It became clear.
  • Example 4 Purification Example by Improved Method 1 (Mab A, Mab C) This example illustrates the impurity clearance of a monoclonal antibody called Mab A or Mab C in the purification flow shown in Table 10 below.
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab A was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.5, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and stored (virus inactivating solution).
  • the virus inactivating solution was applied to a depth filter (Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC) which had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) at about 109 L/m 2 , followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0). It carried out and Mab A was collect
  • the depth filter filtration pool solution was loaded at 117 L/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) in advance, and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0). And Mab A was recovered. Then, it filtered with a 0.2-micrometer filter and preserve
  • an activated carbon filter Millistak+ (registered trademark) Pod CR40
  • the loading density on the CEX column was about 2000 g/L resin. After loading, extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0). The absorbance at 280 mm was monitored, the fraction containing Mab A was obtained, and used as the CEX material pool solution in the F/T mode.
  • the virus clearance was evaluated using the Mab C affinity chromatography pool solution, depth filter filtration pool solution, and activated carbon material pool solution prepared in Example 3.
  • the viruses to be spiked were 4 viruses (MLV, MMV, Reo3 and PRV) that are generally used in the virus clearance test of antibody drugs using CHO cells.
  • the virus logarithmic elimination value (LRV) was calculated from the virus titer.
  • Results Table 11 and Table 12 show the results of Mab A recovery rate and impurity clearance in the improved method 1. Further, with respect to Mab C, Table 13 shows the total clearance of the purification step of the step having the virus clearance ability in the improved method 1.
  • the recovery rate of Mab A in improvement method 1 was good. HMWS and LMWS were removed, resulting in high Monomer content antibodies. The HCP content was reduced appropriately. The PLBL2 content could also be reduced. It was also confirmed that DNA was also removed below the quantitation limit.
  • the purification process total clearance of the process having the virus clearance ability of Mab C in the improved method 1 also showed good results.
  • the number of manufacturing days could be shortened by one day. Manufacturing efficiency is essential for many pharmaceutical manufacturers, and it is important to maximize the number of manufacturing lots per year to improve manufacturing efficiency. Therefore, reducing the number of manufacturing days by one day is of great significance. is there.
  • Example 5 Example of purification by improved method 2 (Mab A, Mab D) This example illustrates the impurity clearance of the Mab A and Mab D monoclonal antibodies in the purification flow shown in Table 14 below, with depth filter filtration omitted from the purification flow in Table 10 of Example 4.
  • the amino acid sequence of Mab D and the antigen to which it binds are different from those of Mab A, Mab B or Mab C.
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing each antibody was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.5, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivation treatment for 1 hour, the solution was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and stored (virus inactivation solution).
  • the virus inactivating solution was loaded at 70 L/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) which had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) in advance, followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0). , Each antibody was collected. Then, it filtered with a 0.2-micrometer filter and preserve
  • an activated carbon filter Millistak+ (registered trademark) Pod CR40
  • the loading density on the CEX column was set at about 2000 g/L resin. After loading, extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0). The absorbance at 280 mm was monitored to obtain a fraction containing each antibody, which was subsequently filtered through a 0.2 ⁇ m filter to obtain a CEX material pool solution in F/T mode.
  • Mab D-producing CHO cell culture medium was clarified by removing cells by depth filter filtration.
  • the cell culture supernatant was purified by protein A chromatography using KanCap A resin.
  • a phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride After equilibrating the column with a phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride, the culture supernatant was loaded, and then a phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride was added, followed by 20 mM sodium chloride. It was washed with a phosphate buffer (pH 7.5) containing it.
  • Mab D was eluted from the column with acetate buffer (pH 3.6).
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing each antibody was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.4, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution and stored (virus inactivating solution). The virus inactivating solution was loaded onto an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) which had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) at 178 L/m 2 , followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0). , Each antibody was collected.
  • activated carbon filter Millistak+ (registered trademark) Pod CR40
  • An activated carbon material pool liquid was passed through a CEX column packed with POROS XS equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0) containing 1 M sodium chloride in advance and subsequently with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the loading density on the CEX column was set at about 1500 g/L resin.
  • extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the absorbance at 280 mm was monitored to obtain a fraction containing each antibody, which was subsequently filtered through a 0.2 ⁇ m filter to obtain a CEX material pool solution in F/T mode.
  • Results Tables 15 and 16 show the results of the Mab A recovery rate and impurity clearance in the improved method 2
  • Tables 17 and 18 show the Mab D recovery rate and the impurity clearance results.
  • the target step is the same as that in Table 13 of Example 4, and therefore the same clearance can be expected.
  • Example 6 Example of purification by improved method 3 (Mab F, Mab G) This example illustrates the impurity clearance of antibodies by the purification flow shown in Table 19 below with the addition of cation exchange chromatography followed by hydrophobic interaction chromatography in the purification flow of Table 10 of Example 4.
  • the amino acid sequences of Mab E, Mab F, and Mab G used in this example and the antigens to be bound are different from each other, and also different from Mab A, Mab B, Mab C, or Mab D.
  • Viral clearance in hydrophobic interaction chromatography
  • Mab E Viral clearance of a monoclonal antibody called Mab E in hydrophobic interaction chromatography. Viral clearance was assessed by the MLV, MMV spike test on Mab E using POROS Benzyl Ultra HIC resin.
  • the CHO cell culture medium that produced Mab E was clarified by removing the cells by depth filter filtration.
  • the cell culture supernatant was purified by protein A chromatography using KanCap A resin. After equilibrating the column with phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride, the culture supernatant was loaded, and then phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride was added, followed by 20 mM sodium chloride. It was washed with a phosphate buffer (pH 7.5) containing it.
  • Mab E was eluted from the column with acetate buffer (pH 3.6). The absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab E was obtained (affinity chromatography pool solution).
  • the depth filter filtration pool solution was loaded at 129 L/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) in advance, and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0). It was carried out, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and stored (activated carbon material pool solution). An activated carbon material pool liquid was passed through a HIC column packed with water for injection, and then POROS Benzyl Ultra equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0). The loading density on the HIC column was about 1000 g/L resin. After loading, extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0).
  • activated carbon filter Millistak+ (registered trademark) Pod CR40
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab E was obtained and used as the HIC material pool solution in the F/T mode.
  • the virus logarithmic elimination value (LRV) was calculated from the virus titers of the load solution and the pool solution (Table 20). As a result, it was revealed that the hydrophobic interaction chromatography has a clearance ability.
  • the CHO cell culture medium that produced Mab F was clarified by removing cells by depth filter filtration.
  • the cell culture supernatant was purified by protein A chromatography using KanCap A resin. After equilibrating the column with phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride, the culture supernatant was loaded, and then phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride was added, followed by 20 mM sodium chloride. It was washed with a phosphate buffer (pH 7.5) containing it.
  • Mab F was eluted from the column with acetate buffer (pH 3.6). The absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab F was obtained (affinity chromatography pool solution).
  • Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.7, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution (virus inactivating solution).
  • the virus inactivating solution was loaded at about 900 g/m 2 on a depth filter (Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC) previously washed with an acetate buffer (pH 5.0), followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0). It carried out and collected Mab F (depth filter filtration pool liquid).
  • the depth filter filtration pool solution was loaded at about 800 g/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) in advance, and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0). Was carried out, filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and stored (activated carbon material pool solution).
  • An activated carbon material pool liquid was passed through a CEX column packed with POROS XS equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0) containing 1 M sodium chloride in advance and subsequently with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the loading density on the CEX column was set at about 1300 g/L resin.
  • Table 21 shows the result of the impurity clearance in the improved method 3.
  • Monomer content was increased by hydrophobic interaction chromatography.
  • HCP and PLBL2 remaining after cation exchange chromatography were removed by hydrophobic interaction chromatography, especially PLBL2 was removed below the quantitation limit.
  • the CHO cell culture medium that produced Mab G was clarified by removing cells by depth filter filtration.
  • the cell culture supernatant was purified by protein A chromatography using KanCap A resin. After equilibrating the column with a phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride, the culture supernatant was loaded, and then a phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride was added, followed by 20 mM sodium chloride. It was washed with a phosphate buffer (pH 7.5) containing it.
  • Mab G was eluted from the column with acetate buffer (pH 3.6).
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab G was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.7, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution (virus inactivating solution). The virus inactivating solution was loaded onto a depth filter (Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC) which had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) at about 800 g/m 2 , followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0).
  • a depth filter Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC
  • the depth filter filtration pool solution was loaded at about 700 g/m 2 on an activated carbon filter (Millistak + (registered trademark) Pod CR40) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0), and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the activated carbon material pool liquid was passed through a CEX column packed with POROS XS equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0) containing 1 M sodium chloride in advance and subsequently with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the loading density on the CEX column was set at about 1500 g/L resin. After loading, extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0). The absorbance at 280 mm was monitored, the fraction containing Mab G was obtained, and subsequently filtered through a 0.2 ⁇ m filter to obtain a CEX material pool solution in the F/T mode.
  • the CEX material pool liquid was passed through a HIC column packed with POROS Benzyl Ultra previously equilibrated with water for injection and then with an acetate buffer (pH 5.0). The loading density on the HIC column was about 300 g/L resin. After loading, extrusion was carried out with an acetate buffer (pH 5.0). The absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab G was obtained and used as the HIC material pool solution in the F/T mode.
  • Table 22 shows the result of the impurity clearance in the improvement method 3.
  • Monomer content was increased by hydrophobic interaction chromatography.
  • HCP and PLBL2 remaining after cation exchange chromatography were removed by hydrophobic interaction chromatography, especially PLBL2 was removed to near the limit of quantification.
  • Example 7 Example of purification by improved method 4 (Mab F, Mab G) This example illustrates the impurity clearance of antibodies by the purification flow shown in Table 23 below, with hydrophobic interaction chromatography added prior to cation exchange chromatography in the purification flow of Table 10 of Example 4. ..
  • Impurity clearance (Mab F) by improved method 4 This example illustrates the impurity clearance of a monoclonal antibody called Mab F in the purification flow shown in Table 23.
  • the CHO cell culture medium that produced Mab F was clarified by removing cells by depth filter filtration.
  • the cell culture supernatant was purified by protein A chromatography using KanCap A resin. After equilibrating the column with a phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride, the culture supernatant was loaded, and then a phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride was added, followed by 20 mM sodium chloride. It was washed with a phosphate buffer (pH 7.5) containing it.
  • Mab F was eluted from the column with acetate buffer (pH 3.6).
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab F was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.7, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution (virus inactivating solution). The virus inactivating solution was loaded at about 900 g/m 2 on a depth filter (Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC) previously washed with an acetate buffer (pH 5.0), followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0).
  • a depth filter Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC
  • the depth filter filtration pool solution was loaded at about 800 g/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) in advance, and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the activated carbon material pool liquid was passed through a HIC column packed with water for injection and then POROS Benzyl Ultra equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the loading density on the HIC column was about 300 g/L resin.
  • Table 24 shows the result of the impurity clearance in the improved method 4.
  • Monomer content was increased by hydrophobic interaction chromatography.
  • HCP and PLBL2 remaining in the activated carbon material pool solution were removed by hydrophobic interaction chromatography, and particularly PLBL2 was removed up to near the quantification limit.
  • Impurity clearance according to improvement method 4 (Mab G) This example illustrates the impurity clearance of a monoclonal antibody called Mab G in the purification flow shown in Table 23.
  • the CHO cell culture medium that produced Mab G was clarified by removing cells by depth filter filtration.
  • the cell culture supernatant was purified by protein A chromatography using KanCap A resin. After equilibrating the column with a phosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM sodium chloride, the culture supernatant was loaded, and then a phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride was added, followed by 20 mM sodium chloride. It was washed with a phosphate buffer (pH 7.5) containing it.
  • Mab G was eluted from the column with acetate buffer (pH 3.6).
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab G was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.7, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution (virus inactivating solution). The virus inactivating solution was loaded onto a depth filter (Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0) at about 800 g/m 2 , followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0).
  • a depth filter Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC
  • the depth filter filtration pool was loaded at about 700 g/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) that had been washed with an acetate buffer (pH 5.0), and then extruded with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the activated carbon filter was passed through a HIC column packed with water for injection, and then POROS Benzyl Ultra equilibrated with an acetate buffer (pH 5.0).
  • the loading density on the HIC column was about 300 g/L resin.
  • Table 25 shows the result of the impurity clearance in the improved method 4. Monomer content was increased by hydrophobic interaction chromatography. HCP and PLBL2 remaining in the activated carbon material pool solution were removed by hydrophobic interaction chromatography, and particularly PLBL2 was removed up to near the quantification limit.
  • Example 8 Impurity clearance with activated carbon material (Mab A) This example illustrates the impurity clearance of a monoclonal antibody called Mab A with activated carbon material in the purification flow shown in Table 26 below.
  • the absorbance at 280 mm was monitored, and the fraction containing Mab A was obtained (affinity chromatography pool solution). Hydrochloric acid was added to the affinity chromatography pool solution to adjust the pH to 3.5, and virus inactivation treatment was performed for 1 hour. The process was performed at room temperature. After the virus inactivating treatment for 1 hour, it was neutralized to pH 5.0 with an aqueous Tris solution (virus inactivating solution). The virus inactivation solution was loaded at 124 L/m 2 on a depth filter (Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC) previously washed with an acetate buffer (pH 5.0), followed by extrusion with an acetate buffer (pH 5.0).
  • a depth filter Millistak+ (registered trademark) Pod A1HC
  • Mab A was recovered (depth filter filtration pool solution).
  • the depth filter filtration pool solution was adjusted to pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0 and pH 7.5 with hydrochloric acid or Tris aqueous solution, and filtered with a 0.2 ⁇ m filter. , And stored (pH adjusted activated carbon material loading solution).
  • Depth filter Filtration pool liquid was adjusted to electrical conductivity 2mS/cm, 4mS/cm, 5mS/cm, 6mS/cm, 8mS/cm, 10mS/cm by ultrafiltration/diafiltration, 0.2 ⁇ m filter It was filtered and stored (electrical conductivity adjusted activated carbon material loading solution).
  • pH-adjusted activated carbon material Activated carbon that has been washed with an acetic acid buffer (pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5) having the same pH as the loading solution in advance.
  • filter Millistak + (R) Pod CR40
  • 60L / m 2 or 100L / m 2 followed by the same pH as the load fluid acetate buffer (pH4.5, pH5.0, pH5.5, pH6.0 , PH 6.5, pH 7.0, pH 7.5) were respectively extruded to collect Mab A to obtain a pH-adjusted activated carbon material pool solution.
  • Electric conductivity adjusted activated carbon material loading solution was loaded at 60 L/m 2 on an activated carbon filter (Millistak+ (registered trademark) Pod CR40) washed with an acetate buffer (pH 5.0), respectively, and then loaded with an acetate buffer (pH 5.0). Each was extruded to recover Mab A to obtain an electric conductivity-adjusted activated carbon material pool liquid.
  • activated carbon filter Millistak+ (registered trademark) Pod CR40
  • Results Tables 27 and 28 show the results of impurity clearance in the activated carbon filter filtration with a load of 60 L/m 2 in the purification flow shown in Table 26.
  • the HCP removal rate was not significantly affected by pH and electrical conductivity.
  • the removal rate of PLBL2 tended to be higher as the pH was lower or the electric conductivity was lower.
  • the lower the pH of leached Protein A the higher the removal rate tended to be.
  • the removal rates of MLV and MMV tended to be higher as the pH was lower or the electric conductivity was lower. It was confirmed that the conditions of pH and electric conductivity of the activated carbon material load solution obtained by the purification flow shown in Table 26 are the conditions showing a high impurity removal rate in activated carbon filter filtration.
  • the antibody purification method of the present invention makes it possible to shorten the purification period, efficiently remove impurities, purify the antibody to a sufficient purity for use in human therapy, and reduce the manufacturing cost. It was

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Abstract

抗体の精製において製造コストを低減し、精製期間を短縮した上で、前記溶液に含まれる不純物を効率的に除去し、抗体をヒト治療用として使用するに充分な純度まで確実に精製する方法の提供。 活性炭材料により、混在する不純物の量又は種類によらず安定的に高純度に精製され、さらに確実に高いウイルスクリアランス能を達成できることを見出し、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程においてウイルスクリアランス能を有するＡＥＸクロマトグラフィー工程の代替として活性炭材料による処理を可能とした。これにより従来の精製方法と比較し、ヒト治療用として使用するに充分な純度まで、しかも製造コストを低減し、単純で効率的に抗体を精製することができる。

Description

活性炭材料を使用する工程を含む抗体精製方法
　本発明は、抗体を高純度に精製する方法に係わる。
　近年、医薬品としてのモノクローナル抗体への注目・期待が著しい。抗体は、標的抗原に対して特異的に結合することから、高い薬効と少ない副作用が期待され、特に抗がん剤として注目されている。
　多くの抗体医薬品はＣＨＯ細胞を宿主とした生産系によって製造されている（非特許文献１）が、培養上清には、目的物質である抗体の他に、宿主細胞由来不純物（タンパク質、ＤＮＡ等）、目的物質由来不純物（凝集体、類縁物質等）、及びウイルス様粒子が含まれている。宿主細胞由来タンパク質（Ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＣＰ）は、ヒトに対して異種タンパク質として認識され抗原性を呈すだけでなく、造腫瘍性リスクも存在することが知られている。また、宿主細胞由来ＤＮＡにも造腫瘍性の懸念がある。目的物質由来不純物である凝集体は、免疫原性の原因となる可能性があり、断片体及び目的タンパク質の翻訳後修飾体には安全性や薬効に悪影響を及ぼす懸念がある。加えて、内在性ウイルス及び内在性ウイルス由来のＤＮＡには感染性の懸念もある。また、外来性ウイルスの混入に対する対策も必要である。多くの場合、細胞基材（例えば主として生産に使用されるＣＨＯ細胞）、培地原材料、調製培地からの外来性ウイルス混入リスクの回避に様々な工夫を凝らし、各種ｉｎ　ｖｉｔｒｏウイルス試験、ｉｎ　ｖｉｖｏウイルス試験等で製造工程に混入する可能性のある代表的ウイルスの混入を否定することが重要となる。さらに、代表的モデルウイルスの精製プロセスにおける減衰率及び除去性能を評価することによって、最終的に得られる原薬中のウイルス混入リスクを限りなく低減し、安全な医薬品の製造を行うことが必要である。そのため、精製プロセスにおいては、目的物質である抗体を高収率で回収することに加え、不純物を再現性良く効果的に除去できる精製方法として完成させることが必要である。
　抗体の精製方法は、上記の目的のために、複数のクロマトグラフィーを含む工程を組み合わせて構築される。一般的には、プロテインＡをはじめとしたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が用いられる。これらのクロマトグラフィーは、目的物質と不純物の電荷、疎水性の度合い、若しくは分子サイズ、又は目的物質と固定化されたリガンドとの間の特異的結合作用に基づき、宿主細胞由来不純物、目的物質由来不純物、浸出プロテインＡ、ウイルス様粒子等を効率良く分離し、除去できる。
　特に、抗体精製法の一般的なクロマトグラフィー手法として、プロテインＡクロマトグラフィー、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー及び陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーの３ステップを組合せて抗体を高純度に精製する例が多く報告されている。これらのクロマトグラフィーは、一般的に結合／溶出（Ｂ／Ｅ）モード又はフロースルー（Ｆ／Ｔ）モードを用いて実施される。中でも、プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーにおいては、目的物質である抗体を樹脂等に吸着させた後、適切な条件で不純物との分離を行うＢ／Ｅモードが汎用され、上記の不純物のうち内在性ウイルスを含むウイルスの除去能以外は高度に目的物質を精製することを可能にした。しかし、Ｂ／Ｅモードでは目的物質を樹脂等に吸着させるため、大量の樹脂及び大型のカラムが必要となり、製造コスト高の一因となっていた。
　一方で、技術の進展とともに近年ＣＥＸクロマトグラフィーでは、オーバーロードモードを含むＦ／Ｔモードによる精製手法の例が報告されている。目的物質と比較して混入量が少ない不純物を樹脂等に吸着させた状態で目的物質である抗体を素通りさせることにより、カラムの小型化と作業工程の簡素化、効率化を実現し、その結果、クロマトグラフィー樹脂の使用量の低減によるコスト削減も達成できる可能性が示されている。実際に、これまでのＢ／Ｅモードでは高性能樹脂を使用したとしても１００ｇ／Ｌ樹脂以下での使用条件であったのに対し、Ｆ／Ｔモードではその１０倍量の１０００ｇ／Ｌ樹脂を超える条件によっても目的物質の精製に利用できる。すなわち、１／１０以下の樹脂容量で同等の精製性能を引き出せることから、カラムの小型化、低コスト化につながることが期待される。このようなカラムの小型化は、使用バッファー量の削減及び各種タンク容量のサイズダウンにもつながり、作業負荷の大幅低減による製造効率化に寄与すると報告されている（特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）。しかし、高効率精製工程として期待されるＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードは、混在する不純物を少量の樹脂等に吸着させ分離除去することから、Ｂ／Ｅモードと比較して、混在する不純物の量あるいは種類によって分離能が影響を受けることが課題であった。
　さらに近年、培養工程における生産性の向上により、多くの生成物がクロマトグラフィーカラムにロードされ、クロマトグラフィーカラムへの負担が増加している。これに対して、高効率精製工程として期待されるＡＥＸクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードに活性炭材料を組合せることによって、ＨＣＰを含む複数の不純物が低減され、結果としてクロマトグラフィーカラムの使用期間を延ばすことが報告されている（特許文献２）。
　しかし、これらの報告は、一般的な宿主細胞由来不純物（タンパク質、ＤＮＡ）及び目的物質由来不純物（凝集体、類縁物質等）を除去できる可能性のみに限定されており、本来の精製プロセスとして望まれる宿主細胞由来不純物及び目的物質由来不純物のより確実な除去、並びに内在性及び外来性ウイルスのより確実かつ安価な除去を実現する具体的な精製プロセスが望まれていた。
国際公開第WO2011/150110号 国際公開第WO2013/028330号
Reichert, J. (2012). Marketed therapeutic antibodies compendium. MABs 4:3, 413-415. Brown, A., Bill, J., Tully, T., Radhamohan, A., & Dowd, C. (2010). Overloading ion-exchange membranes as a purification step for monoclonal antibodies. Biotechnol. Appl. Biochem., 56:59-70. Liu, H.F., McCooey, B., Duarte, T., Myers, D.E., Hudson, T., Amanullah, A., van Reis, R., & Kelley, B.D. (2011). Exploration of overloaded cation exchange chromatography for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. A., 1218, 6943-6952.
発明の解決しようとしている課題
　高効率精製工程として期待されるＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードでは、Ｂ／Ｅモードと比較して、混在する不純物の量や種類が分離能へ影響を与えることが課題であった。また、ＡＥＸクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードに活性炭材料を組合せた抗体精製方法は、クロマトグラフィーカラムの使用期間を延ばすことはできるが、精製ステップ数が多いことが課題であった。すなわち、プロテインＡクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーの３ステップのクロマトグラフィーに加え、活性炭材料による処理を実施することから、精製ステップ数が多く、それにより製造コストが高くなり、また精製期間が長くなる。また、低コスト化を目指した精製プロセスの工程簡略化においては、宿主細胞由来不純物及び目的物質由来不純物の除去能の低下のみでなく、内在性及び外来性ウイルスクリアランス能の低下が懸念される。したがって、より確実な不純物の除去、特に内在性、外来性ウイルスクリアランスは重要な課題である。上記課題の解決は低コストかつ高効率な抗体医薬品の製造方法の提供だけでなく、高品質な抗体医薬品の安定供給につながり、結果として患者の安全性の確保が達成されるため、産業上、非常に重要である。
　本願発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、従来の精製方法と同等の品質を維持した上で、精製のステップ数を低減する効率的な精製方法を見出した。すなわち、ＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードに活性炭材料による処理を組合せることによって、活性炭材料により不純物が低減され、安価で利用できることが期待される一方で混在する不純物の量又は種類によって分離能が低下することが課題であったＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードにおいて、安定的かつ高純度に目的抗体医薬品等が精製できることを見出した。また、本願発明者らは、活性炭材料によりウイルスが確実に除去されることを見出し、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程において高いウイルスクリアランス能を有するＡＥＸクロマトグラフィー工程の機能を補完し、結果としてＡＥＸクロマトグラフィー工程の省略を可能とする製造プロセスを構築した。すなわち、本願発明者らは、プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＥＸクロマトグラフィーのＦ／Ｔモードの２ステップのクロマトグラフィーに活性炭材料による処理を組合せた効率的な精製方法を見出し、従来の精製方法と比較して精製ステップ数及び製造コストを低減し、抗体をヒト治療用途に十分な品質まで効率的に精製することを可能として、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は以下の通りである。
［１］　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含む方法。
［２］　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２．乃至ｆ２．の工程を含む［１］に記載の方法。
［３］　アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインＡ樹脂である［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　プロテインＡ樹脂が、ＫａｎＣａｐＡ、ＫａｎＣａｐＡ３Ｇ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＰｒｉｓｍＡ、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ　Ａ３である［３］に記載の方法。
［５］　ウイルス不活化が、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線及び熱での処理からなる群から選択される少なくともいずれか一つである、［１］乃至［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］　ウイルス不活化が、アフィニティークロマトグラフィープール液のｐＨを３～４に低下させることを含む［５］に記載の方法。
［７］　ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を６０～１２０分間インキュベートする［６］に記載の方法。
［８］　ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を１５～３０℃でインキュベートする［６］又は［７］に記載の方法。
［９］　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５～７．５である［１］乃至［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５～５．５である［９］に記載の方法。
［１１］　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２～１０ｍＳ／ｃｍである［１］乃至［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２～５ｍＳ／ｃｍである［１１］に記載の方法。
［１３］　活性炭材料による処理が、活性炭材料を含むフィルターを用いて行われる、［１］乃至［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］　フィルターが、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋　Ｐｏｄ　ＣＲ４０、Ｚｅｔａ　Ｐｌｕｓ活性炭吸着デプスフィルター、又はＳＵＰＲＡｃａｐ　５０　Ｓｅｉｔｚ　ＡＫＳ　ｆｉｌｔｅｒである［１３］に記載の方法。
［１５］　陽イオン交換材料に対し、活性炭材料プール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる［１］乃至［１４］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］　陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が、５００～２０００ｇ／Ｌである［１５］に記載の方法。
［１７］　陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が１０００～１５００ｇ／Ｌである［１６］に記載の方法。
［１８］　陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である［１］乃至［１７］のいずれか一つに記載の方法。
［１９］　陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである［１８］に記載の方法。
［２０］　陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ　ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ　ＩｍｐＡｃｔである［１９］に記載の方法。
［２１］　陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４～６である［１］乃至［２０］のいずれか一つに記載の方法。
［２２］　陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５～５．５である［２１］に記載の方法。
［２３］　陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～７ｍＳ/ｃｍである［１］乃至［２２］のいずれか一つに記載の方法。
［２４］　陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～５ｍＳ/ｃｍである［２３］に記載の方法。
［２５］　陽イオン交換材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得る［１］乃至［２４］のいずれか一つに記載の方法。
［２６］　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである［２５］に記載の方法。
［２７］　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される［２６］に記載の方法。
［２８］　疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する［２７］に記載の方法。
［２９］　疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、　ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ、　ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ　、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、　Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、　Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ　Ｐｈｅｎｙｌである［２８］に記載の方法。
［３０］　活性炭材料プール液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得、さらに陽イオン交換材料により処理して、プール液を得る［１］乃至［１４］のいずれか一つに記載の方法。
［３１］　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである［３０］に記載の方法。
［３２］　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される［３１］に記載の方法。
［３３］　疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する［３２］に記載の方法。　
［３４］　疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ、　ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ　、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、　Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、　Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ　Ｐｈｅｎｙｌである［３３］に記載の方法。
［３５］　陽イオン交換材料に対し、疎水性相互作用クロマトグラフィープール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる［３０］乃至［３４］のいずれか一つに記載の方法。
［３６］　陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が、５００～２０００ｇ／Ｌである［３５］に記載の方法。
［３７］　陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が１０００～１５００ｇ／Ｌである［３６］に記載の方法。
［３８］　陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である［３０］乃至［３７］のいずれか一つに記載の方法。
［３９］　陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである［３８］に記載の方法。
［４０］　陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ　ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ　ＩｍｐＡｃｔである［３９］に記載の方法。
［４１］　陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４～６である［３０］乃至［４０］のいずれか一つに記載の方法。
［４２］　陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５～５．５である［４１］に記載の方法。
［４３］　陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～７ｍＳ/ｃｍである［３０］乃至［４２］のいずれか一つに記載の方法。
［４４］　陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～５ｍＳ/ｃｍである［４３］に記載の方法。
［４５］　少なくとも一つの不純物が、宿主細胞由来タンパク質（Ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＣＰ）、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｂ－ｌｉｋｅ　２（ＰＬＢＬ２）、ウイルス、ウイルス様粒子、高分子量体（ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ；ＨＭＷＳ）、低分子量体（ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ；ＬＭＷＳ）、培地成分、浸出プロテインＡ及び／又はＤＮＡからなる群から選択される［１］乃至［４４］のいずれか一つに記載の方法。
［４６］　工程が連続的である［１］乃至［４５］のいずれか一つに記載の方法。
［４７］　［１］乃至［４６］のいずれか一つに記載の方法によって精製された抗体。
［４８］　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｄ１．の工程を含み、工程ｄ１を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
［４９］　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得る、
のａ２乃至ｅ２．の工程を含み、工程ｅ２を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
［５０］　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含み、工程ｄ１を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
［５１］　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２乃至ｆ２．の工程を含み、工程ｅ２を実施することによりＰＬＢＬ２クリアランス能が向上する、方法。
　本願発明者らは、従来までの抗体精製プロセスに活性炭材料による処理を追加することで、後段の精製工程への不純物負荷を低減し、混在する不純物の量又は種類によらず、抗体を安定的に目標とする純度にまで精製できることを見出した。さらに、本願発明者らは、活性炭材料による処理で高いウイルスクリアランス能を達成できることを見出し、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程においてウイルスクリアランス能を有するＡＥＸクロマトグラフィー工程の機能を補完し、結果としてＡＥＸクロマトグラフィーの省略を可能とする製造プロセスを構築した。これにより従来の精製方法と比較して精製ステップ数及び製造コストを低減し、ヒト治療に使用するに充分な純度まで効率的に抗体を精製することができた。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　　１．定義
　本明細書において、「抗体」なる用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（二重特異性抗体）、Ｆｃ融合タンパク質、及び生物学的活性を呈する抗体断片等を意味する。なお、本発明を適用可能な抗体は、該抗体が特異的に結合する抗原によって限定されるものではない。また、本発明を適用可能な抗体は、該抗体のアミノ酸配列によって限定されるものでもない。
　本明細書において、「結合／溶出（Ｂ／Ｅ）モード」なる用語は、試料中に含まれる少なくとも１つの生成物がクロマトグラフィー樹脂又は媒体に結合し、その後溶出される生成物分離技術を意味する。
　本明細書において、「フロースルー（Ｆ／Ｔ）モード」なる用語は、試料中の少なくとも１つの生成物がクロマトグラフィー樹脂又は媒体を通って流動することを意図するが、少なくとも１つの潜在的な成分がクロマトグラフィー樹脂又は媒体に結合する生成物分離技術を意味する。
　本明細書において、「オーバーロードモード」なる用語は、カラム等の吸着容量を超えてロードすることを意図し、目的物質と不純物の吸着量の強さの差を利用した生成物分離技術を意味する。本明細書においては、陽イオン交換材料に対し、抗体粗精製物が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる。陽イオン交換材料への抗体粗精製物の吸着容量は、陽イオン交換材料１Ｌ当たり約１００ｇの蛋白質量である。オーバーロードモードにおけるローディング密度は、陽イオン交換材料１Ｌ当たり１５０～４０００ｇの蛋白質量であるが、好適なローディング密度は５００～２０００ｇ／Ｌの範囲であり、さらに好適なローディング密度は１０００～１５００ｇ／Ｌの範囲である。
　本明細書において、「アフィニティークロマトグラフィー」なる用語は、標的タンパク質（例えば、目的のＦｃ領域を含有するタンパク質又は抗体）が、標的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合されるタンパク質分離技術を指す。抗体を精製する場合には、そのようなリガンドは、プロテインＡ若しくはプロテインＧ又はその機能的変異体であり、これはクロマトグラフィー固相材料に共有結合し、抗体溶液がクロマトグラフィー固相材料と接触する際に溶液中の抗体と結合する。
　本明細書において、「デプスフィルター」なる用語は、抗体溶液から粒子を除去する目的で使用される、次第に減少する孔径を有する連続的に配置された一連のフィルターを意味する。デプスフィルターの三次元マトリックスは抗体溶液が通過する迷路状経路を形成し、該マトリックスの深さ全体にわたってランダムに粒子を吸着し機械的に捕捉する。種々のデプスフィルターは、巻かれた綿、ポリプロピレン、レーヨンセルロース、ガラス繊維、焼結金属、磁器、珪藻土又は他の公知成分で構成される。
　本明細書において、「陽イオン交換材料」又は「ＣＥＸ（；ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）材料」なる用語は互換的に使用され、負に荷電し、かくして、固相上を又は固相中を通過した水性溶液中の陽イオンとの交換のための遊離陽イオンを有する固相を意味する。
　本明細書において、「陰イオン交換材料」又は「ＡＥＸ（；ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）材料」なる用語は互換的に使用され、固相に結合した、第一級、第二級、第三級又は第四級アミノ基等の１又は複数の正に荷電したリガンドを有する、正に荷電した固相を意味する。
　本明細書において、「疎水性相互作用クロマトグラフィー」又は「ＨＩＣ（；Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」なる用語は、分子の疎水性、すなわち、水性溶液から疎水性表面に吸着する分子の能力に基づいて分子を分離するためのプロセスを意味する。疎水性相互作用クロマトグラフィー、典型的には、溶質分子の表面上の疎水性基の差異に依存する。これらの疎水性基は、不溶性マトリックスの表面上の疎水性基に結合する傾向を有する。ＨＩＣは逆相液体クロマトグラフィーよりも極性が高く、変性が少ない環境を用いるため、しばしばイオン交換又はゲル濾過クロマトグラフィーと組合せることによって、抗体精製において一般的に使用される。
　本明細書において、「活性炭材料」なる用語は、炭素から構成された又は炭素を含有する任意の物質、活性炭を意味する。「活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃａｒｂｏｎ）」は、その細孔構造を強化するために処理された炭素質材料を意味する。活性炭は、非常に高い表面積を有する多孔質の固体である。これらは石炭、木材、ヤシ殻、木の実の殻、泥炭をはじめとする種々の供給源から得ることができる。活性炭は、制御された環境下での加熱を伴う物理的な活性化、又は強酸、塩基、又は酸化剤を使用する化学的活性化を使用して、これらの材料から製造することができる。活性化方法は、高い不純物クリアランス能を活性炭に与えるための高い表面積を有する多孔質構造を作り出す。ほとんどの他の吸着材料とは対照的に、活性炭は、比較的弱いファンデルワールス力を使用して分子と相互作用をすると考えられている。本発明の精製方法に用いられる活性炭としては、1種類の活性炭を単独で使用しても、2種類以上の活性炭を単独で又は混合して用いても良い。
　本明細書において、「連続的」なる用語は、直接連結された各材料間で連続的な流れを可能にする何らかの他の機構を有することを意味する。すなわち、１つのプロセスステップからの出力が、介入なくプロセス中の次のプロセスステップに直接流動するような２つ以上のプロセスステップ（又は単位操作）を含み、２つ以上のプロセスステップをその期間の少なくとも一部について同時に実施することができる、目的物質を精製するためのプロセスを意味する。
　本明細書において、「除去」、「低減」、「クリアランス」なる用語は互換的に使用され、精製されるべき抗体を含む試料中の１つ以上の不純物量を低下させることを意味する。
　本明細書において、「精製」、「純度を高めること」なる用語は互換的に使用され、試料から１つ以上の不純物を除去することにより、試料中の１つ以上の不純物に対する標的抗体の比を増加させることを意味する。
　本明細書において、「電気伝導度」なる用語は、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を意味する。溶液中で、電流はイオン輸送によって流れる。よって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると溶液はより高い電気伝導度を有することになる。電気伝導度は、電気伝導度測定器を使用して測定することができ、電気伝導度の測定単位は１センチメートル当たりのミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍ又はｍＳ）である。溶液の電気伝導度は、その中のイオンの濃度を変えることによって変更することができる。例えば、溶液中の緩衝液の濃度及び／又は塩の濃度は、所望の電気伝導度を達成するために変更することができる。好ましくは、種々の緩衝液の塩濃度は所望の電気伝導度を達成するように修正される。
　本明細書において、「画分」なる用語は、例えば活性炭材料に試料を負荷する工程において、標的抗体を含む試料を供した後に収集された小容量の液体を意味する。
　本明細書において、「ＨＣＰ；ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ」なる用語は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養液から誘導された宿主細胞由来タンパク質の混合物を意味する。ＨＣＰは一般的にはＣＨＯ細胞中で発現された抗体等の目的のタンパク質を含む細胞培養液中に不純物として存在する。
　本明細書において「ＨＭＷＳ；ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ」なる用語は、分子量の異なる抗体変異体のうち、単量体より高分子量領域側に溶出するものを意味する。
　本明細書において「ＬＭＷＳ；ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ」なる用語は、分子量の異なる抗体変異体のうち、単量体より低分子量領域側に溶出するものを意味する。
　本明細書において、「ウイルス」なる用語は、生きた細胞の内部でのみ複製することができる小型の感染体又は粒子を意味する。これらは一般的に、タンパク質のキャプシドの内側に封入された核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、及び場合により脂質エンベロープから構成される。
　本明細書において、「ウイルス様粒子」なる用語は、電子顕微鏡下で形態的に既知ウイルスとの関連性がうかがわれる構造体を意味する。
　本明細書において、「レトロウイルス」なる用語は、逆転写されたＤＮＡ中間体を介して感染した細胞のゲノムＤＮＡにその遺伝情報を統合することが可能なＲＮＡウイルスを意味する。
　本明細書において、「レトロウイルス様粒子」なる用語は、そのゲノム中にレトロウイルス由来のＤＮＡの部分を有する細胞によって生成された粒子を意味する。これらの粒子はレトロウイルスに似ているが多くの場合、非感染性である。本明細書の実施例で使用されるマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）は、モデルレトロウイルス又はレトロウイルス様粒子をあらわす。
　本明細書において、「パルボウイルス」なる用語は、５０００ヌクレオチドの平均ゲノムサイズ及び１８から２６ｎｍの直径を有する、直鎖、非セグメント化一本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスを指す。本明細書に記載されている方法において使用される典型的なパルボウイルスはマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）である。
　本明細書において、「対数除去値」又は「ＬＲＶ」なる用語は、既知量の不純物をカラム、フィルター等に通過させた時に、カラム、フィルター等による不純物の除去能力を表す値である。Ｃｆがフィード液中の不純物の濃度であり、Ｃｐがカラム、フィルターを通過した後の不純物の濃度であるとき、ＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）－ｌｏｇ（Ｃｐ）である。
　本明細書において、「培地成分」としては、血清、成長因子（インスリン等）、又は抗生物質等が挙げられる。
２．Ｆ／ＴモードＣＥＸクロマトグラフィーによるＨＣＰの除去
　特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３に示される先行技術にしたがい、プロテインＡクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィーに引き続き、Ｆ／ＴモードＣＥＸクロマトグラフィーで抗体培養液を精製したところ、抗体種（宿主細胞、あるいは培養方法の違いによる混在する不純物の量や種類の違いを含む）によってはＨＣＰが充分に除去できない例があることが分かった。プロテインＡクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィーに引き続き、Ｆ／ＴモードＣＥＸクロマトグラフィーからなるプロセスは、コスト、労力及び作業時間の面からは優れていたが、不純物、特にＨＣＰの除去という点で効果が安定していないことが明らかとなった。
　ＨＣＰは様々な機構を介して免疫原性を誘導する可能性があることが広く知られている。実際に、ソマトロピンのバイオ後続品の治験において、ＨＣＰの残留により患者の全てで抗ＨＣＰ抗体が産生され、患者の最大６０％で非中和抗ソマトロピン抗体が産生された報告がある（M. Pavlovic et al., Horm.Res. 69:14-21(2008)）。ＨＣＰをさらに除去することにより抗ソマトロピン抗体は他の成長ホルモン抗体で報告されている程度に改善された。また、ＣＨＯ細胞で産生させた組換え第ＩＸ因子の臨床試験において、抗ＨＣＰ抗体がかなりの高い割合で産生され、有害事象は報告されなかったものの規制当局から保留命令を受けたことが報告されている
(https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/UCM448429.pdf
Food and Drug Administration 
STATISTICAL REVIEW AND EVALUATION BLA FINAL, Product Name: IB1001, Indication(s): Control and prevention of bleeding episodes and perioperative management in patients with hemophilia B, CBER Receipt Date: Apr 6 2012
又はhttps://www.news-medical.net/news/20120710/Inspiration-receives-FDA-clinical-hold-order-for-IB1001-phase-III-studies-on-hemophilia-B.aspx
News-Medical.net - An AZoNetwork Site
Inspiration receives FDA clinical hold order for IB1001 phase III studies on hemophilia B, Jul 10 2012)。
　安全性に関連した有害事象が報告される場合はもちろん、安全性に関連した有害事象が報告されない場合でも規制当局は潜在的リスクの可能性を考慮し、残留するＨＣＰをさらに低減した後、臨床試験を実施するよう指示する可能性がある。さらに近年、残留するＨＣＰ（リポプロテインリパーゼ）により製剤中のポリソルベートが分解され、医薬品の安定性に影響した例が報告されており（T Hall et al., J. Chromatogr. A 105:1633-1642(2016)）、医薬品の安定性の面からも精製工程で適切にＨＣＰを除去することが重要である。
　ＨＣＰの残留による安全性及び安定性への影響については、宿主細胞の種類や残留するＨＣＰの種類に加え、製品の用法・用量によっても異なると考えられる。したがってＨＣＰの残留許容値については、製造工程、最大投与量、投与部位、投与頻度等を考慮し、製品毎に適切な値を設定する必要はあるが、製造工程で可能な限り低減することが望まれる。
　以上のことから、ＣＥＸクロマトグラフィーとしてＦ／Ｔモードを用いた精製フローにおいてもＨＣＰをはじめとした不純物を低減できる、抗体種に依らない汎用的な方法が望まれた。
３．活性炭材料の適用による不純物の除去
　本願発明者らは、製造コストを低減した上で抗体を確実に高純度に精製する方法を特定することを目指し、従来の精製工程に活性炭材料による処理を追加することで、抗体種によらず高純度に精製できることを見出した。
　ＨＣＰは、異種タンパク質としてヒトに対して抗原性を示し得ること、また哺乳動物細胞由来タンパク質には造腫瘍性リスクが存在すること、さらには医薬品中のポリソルベート分解による安定性への観点から、充分低いレベルまで精製工程で除去する必要があることは前述のとおりである。また、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｂ－ｌｉｋｅ　２（ＰＬＢＬ２）はＨＣＰの一種であるが、抗体との相互作用により残留するヒッチハイクＨＣＰとして報告されている（B. Tran et al., J. Chromatogr. A 1438:31-38(2016)）。さらに、抗体製剤中へのＰＬＢＬ２の残留により、レブリキズマブの臨床試験において抗ハムスターＰＬＢＬ２抗体が高頻度で発生した報告がある（国際公開第WO2015/038888号）。抗ハムスターＰＬＢＬ２抗体の発生についての臨床的重要性は知られておらず、レブリキズマブの臨床試験で抗ハムスターＰＬＢＬ２抗体が高頻度で発生しても安全性イベントと相関しなかった。しかし、依然として反復投与による長期曝露がアレルギー又は過敏症の患者集団において、アナフィラキシー、過敏症といった望ましくない影響を増大させる懸念があるため、製剤中のＰＬＢＬ２は可能な限り低減することが望ましいと考えられる。
　これらの要求に対して、活性炭材料による処理を追加することにより、ＣＥＸクロマトグラフィーへのこれらの不純物負荷が低減され、その結果、ＨＣＰを充分低いレベルまで除去できた。また、抗体との相互作用により残留するヒッチハイクＨＣＰであるＰＬＢＬ２は一般的な精製方法では低減することが難しいため、活性炭材料によりロード液の約５０％が低減されること、すなわち活性炭材料によりＰＬＢＬ２の対数除去値（ＬＲＶ）０．２７が得られることには大きな意義がある。
　さらに、活性炭材料により目的物質由来不純物であるＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが低減された。活性炭材料によるＨＭＷＳの低減により、ＣＥＸクロマトグラフィーへの負荷を減らすことが可能となり、結果として最終精製物中のＨＭＷＳ量を安定的に低減できることとなった。また、ＬＭＷＳは一般的な精製方法では低減することが難しいため、活性炭材料による最終精製物の純度向上に対する寄与が大きい。
　これらに加えて、活性炭材料にロードする抗体溶液のｐＨを調節することによってウイルスクリアランス能を向上させた。活性炭材料によりレトロウイルス及び/又はレトロウイルス様粒子、あるいは抗体溶液によって限定的ではあるがパルボウイルスを除去できる可能性があることが示されている（国際公開第WO2015/005961号）が、溶液ｐＨは７．０の条件である。一方、本発明ではｐＨ５．０の条件でウイルスが除去できることを見出しており、さらにｐＨ５．０の条件におけるウイルスクリアランス能は既報の条件よりも良好であることを示した。
　一般的な抗体の精製法ではプロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨによるウイルス不活化処理を実施しており、不活化後にｐＨ５．０付近に中和される場合がある。また後段のＣＥＸクロマトグラフィーではｐＨ５．０付近の条件で実施される例が多いことから、これらの工程間に活性炭材料による処理を実施する際、特別なｐＨ調整や希釈操作等を実施することなく活性炭材料による処理ができることは、製造作業を単純化することに大きく寄与する。さらに、抗体によってはｐＨ変化により不安定化する場合があることから、ｐＨ調整せずに活性炭処理ができることは、抗体の安定性の維持にも大きく寄与すると考えられる。
　ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品の精製工程において、一般的にＡＥＸクロマトグラフィー工程はウイルスクリアランス能を有することが知られているが、活性炭材料がＡＥＸクロマトグラフィーと同等のウイルスクリアランス能を有することが明らかとなったことから、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の代替として活性炭材料による処理が可能となり、これにより、ＡＥＸクロマトグラフィーを省略できる可能性が示された。ＡＥＸクロマトグラフィーをはじめとしたクロマトグラフィーはその作業性が煩雑であり、吸着フィルターとして活性炭材料を用いることで、作業性が煩雑なクロマトグラフィーを省略することができ、より単純で効率的なプロセスとなり得る。また、高価なＡＥＸ樹脂やＭｅｍｂｒａｎｅ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ等を安価な活性炭吸着フィルターとすることで、ランニングコストの大幅な低減が達成される。さらに、高額なクロマトグラフィー装置が不要で、安価なフィルターユニットに置き換えられることから、製造設備の初期投資の低減にも大きく寄与できると考えられる。
４．本発明で採用される精製工程
　本明細書においては、抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ１．乃至ｅ１．の工程を含む方法（以下、改良方法２）、を提供する。
　ｂ１．工程におけるアフィニティークロマトグラフィー樹脂の好適な例として、プロテインＡ樹脂を挙げることができる。採用可能なプロテインＡ樹脂として、プロテインＡ樹脂が、ＫａｎＣａｐＡ（ＫＡＮＥＫＡ）、ＫａｎＣａｐＡ３Ｇ（ＫＡＮＥＫＡ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ｐｃｃ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ　Ａ３（ＪＳＲ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　）を挙げることができるが、これらの樹脂に限定されるものではない。
　ｃ１．の工程におけるウイルス不活化については、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線及び熱での処理からなる群から選択されるいずれかひとつの方法を挙げることができる。ウイルス不活化処理として酸処理が選択される場合の好適なｐＨの範囲は、アフィニティークロマトグラフィープール液のｐＨを３～４に低下させる処理であり、ウイルス不活化処理としてさらに好適なｐＨは３．５である。この場合の好適な処理時間は６０～１２０分であり、好適な処理温度は１５～３０℃である。
　ｄ１．の工程における活性炭材料は、クロマトグラフィーカラム中に充填される。他の実施形態において、活性炭材料はフィルタータイプであり、ディスポーザブル形式のＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ等の密閉使い捨てデバイス中に充填される。さらに他の実施形態において、活性炭材料はカートリッジ又はカプセル中に充填される。フィルタータイプの多くは、セルロースマトリックス等の強度のある構造のろ材に活性炭材料が混合される。
　市販の活性炭フィルターの例として、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ 活性炭吸着デプスフィルター（３Ｍ）、ＳＵＰＲＡｃａｐ　５０　Ｓｅｉｔｚ（登録商標）　ＡＫＳ　ｆｉｌｔｅｒ（ＰＡＬＬ）を挙げることができるが、これらの活性炭材料に限定されるものではない。いくつかの実施形態において、活性炭フィルターはセルロースマトリックス中に活性炭材料を保持した構造を有する。　ｄ１．の工程における活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの好適なｐＨは４．５～７．５であり、より好適なｐＨは４．５～５．５であり、さらに好適なｐＨは５．０である。また、ｄ１．の工程の活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの好適な電気伝導度は２～１０ｍＳ／ｃｍであり、より好適な電気伝導度は２～５ｍＳ／ｃｍである。
　ｅ１．の工程における陽イオン交換材料は、樹脂、モノリスカラム、又は膜のいずれか一つが選択される。陽イオン交換材料の官能基は、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである。市販の陽イオン交換材料の例としては、ＰＯＲＯＳＸＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）　ＣＰＸ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）　ＣＰ－ＦＴ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又はＣａｐｔｏ　Ｓ　ＩｍｐＡｃｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を挙げることができるが、これらの陽イオン交換材料に限定されるものではない。
　ｅ１．の工程においては、ｄ１．の工程で得られた活性炭材料プール液が陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる。ローディング密度は、陽イオン交換材料１Ｌ当たり１５０～４０００ｇの蛋白質量の範囲で選択可能であるが、好適なローディング密度は５００～２０００ｇ／Ｌの範囲であり、さらに好適なローディング密度は１０００～１５００ｇ／Ｌの範囲である。ロードされる活性炭材料プール液の好適なｐＨはｐＨ４～６であり、より好適なｐＨは４．５～５．５であり、さらに好適なｐＨは５．０である。また、ｅ１．の工程の陽イオン交換材料にロードする溶液の好適な電気伝導度は３～７ｍＳ/ｃｍであり、より好適な電気伝導度は３～５ｍＳ/ｃｍである。
　上記改良方法２においては、ａ１．乃至ｅ１．の各工程の前後に１種類以上の任意の工程が追加されていても良い。
　例えば、改良方法２においては、ｃ１．の工程とｄ１．の工程の間にデプスフィルターによる処理が追加されていても良い。デプスフィルターは、吸着作用と通常の多孔性ろ材による機械的ろ過作用との二側面から、おおむね１　μｍを超えるサイズの粒子を捕捉することができるフィルターであり、セルロースマトリックスとケイソウ土等のろ材からなる。無数の長い流路を持つ厚みのあるろ材によって、フィルター内部で対象物をトラップできる特徴を有する。デプスフィルターは、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄ等の密閉使い捨てデバイス中に充填される。市販のデプスフィルターの例としては、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ａ１ＨＣ、Ｄ０ＨＣ、Ｘ０ＨＣを挙げることができるが、これらのデプスフィルターに限定されるものではない。
　デプスフィルターを追加した具体的な例として、抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
ｅ２．前記デプスフィルターろ過プールを活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
のａ２．乃至ｆ２．の工程を含むことからなる、改良方法２のｃ１．の工程とｄ１．の工程の間にデプスフィルターによる処理が追加された方法（以下、改良方法１）、を提供する。
　また、上記改良方法２のｃ１．の工程とｄ１．の工程の間、又は上記改良方法１のｄ２．の工程とｅ２．工程の間に陰イオン交換材料による処理が追加されていても良い。陰イオン交換材料は、樹脂、モノリスカラム、又は膜のいずれか一つが選択されるが、膜の場合はＱ膜を選択することができる。通常、陰イオン交換材料はＦ／Ｔモードで使用される。市販の陰イオン交換材料の例としては、ＮａｔｒｉＦｌｏ（登録商標）ＨＤ－Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑを挙げることができるが、これらの陰イオン交換材料に限定されるものではない。
　上記改良方法２のｅ１．の工程又は上記改良方法１のｆ２．の工程で得られた陽イオン交換材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理してプール液を得ても良い（以下、改良方法３）。また、上記改良方法２のｄ１．の工程又は上記改良方法１のｅ２．の工程で得られた活性炭材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して疎水性相互作用クロマトグラフィープール液を得、さらに陽イオン交換材料により処理して陽イオン交換材料プール液を得ても良い（以下、改良方法４）。前記の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、好ましくはＦ／Ｔモードである。また、前記の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基若しくはＨｅｘｙｌ基を有する樹脂又は膜を用いて実施される。市販の疎水性相互作用クロマトグラフィー材料の例としては、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ　Ｐｈｅｎｙｌ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ（東ソー）を挙げることができるが、これらの疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に限定されるものではない。
　ここに記載されている何れかの方法の幾つかの実施形態においては、精製された抗体を回収することを更に含む。幾つかの実施形態では、精製抗体は、ここに記載されている何れかの精製工程から回収される。
　上記の工程によって、ＨＣＰ、ＰＬＢＬ２、ウイルス、ウイルス様粒子、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳ、培地成分、浸出プロテインＡ及びＤＮＡから選択される少なくとも一つの不純物が除去される。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１．一般方法
　本実施例では、実施例２以降に示す実施例で共通して使用する一般的な方法について説明する。
１）抗体濃度測定
　抗体濃度は、ＰＡ　ＩＤ Ｓｅｎｓｏｒ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　（２．１ｍｍ×３ｍｍ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定した。
２）ＨＣＰ測定
　Ｃｙｇｎｕｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｔｈｉｒｄ-ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＣＨＯ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎキットあるいはＢｉｏＧＥＮＥＳ社のＣＨＯ|３６０　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。得られたＨＣＰ濃度を抗体濃度で除し、ｎｇＨＣＰ／ｍｇ抗体に換算した。
　実施例２～５では、Ｃｙｇｎｕｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｔｈｉｒｄ-ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＣＨＯ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎキットを、実施例６～８では、ＢｉｏＧＥＮＥＳ社のＣＨＯ|３６０　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡキットを使用した。
３）ＰＬＢＬ２測定
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ,　ＩＮＣ.のＨａｍｓｔｅｒ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｂ-Ｌｉｋｅ　２　(ＰＬＢＬ２)　ＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。得られたＰＬＢＬ２濃度を抗体濃度で除し、ｎｇＰＬＢＬ２／ｍｇ抗体に換算した。さらに各精製工程でのＰＬＢＬ２クリアランス能（対数除去値、Ｌｏｇ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｖａｌｕｅ；ＬＲＶ）を、以下の計算により算出した。Ｃｆがフィード液中のＰＬＢＬ２の濃度であり、Ｃｐがカラム、フィルターを通過した後のＰＬＢＬ２の濃度であるとき、ＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）－ｌｏｇ（Ｃｐ）とした。
４）高分子量体（ＨＭＷＳ）、低分子量体（ＬＭＷＳ）及びＭｏｎｏｍｅｒ（単量体）含量
　ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷＸＬ　ｃｏｌｕｍｎ　（５μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）又はＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＥＨ　ＳＥＣ　ｃｏｌｕｍｎ　（１．７μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いたＨＰＬＣ法により測定した。移動相は、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液を用いた。
５）プロテインＡ測定
　Ｃｙｇｎｕｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロテインＡ　ＥＬＩＳＡキットを用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。得られたプロテインＡ濃度を結果比較のために抗体濃度で除し、ｎｇプロテインＡ／ｍｇ抗体に換算した。
６）ウイルス力価測定及びウイルスクリアランス能（対数除去値、Ｌｏｇ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｖａｌｕｅ；ＬＲＶ）の算出
　ウイルス力価は、ウイルスに感染すると細胞の形状が変化する現象（細胞変性）を利用した、５０％の細胞に感染するウイルス量を測定する方法（組織培養感染性試験；ＴＣＩＤ５０）により測定した。対象ウイルスとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、レオウイルス３型（Ｒｅｏ３）とした。また指示細胞として、ＰＧ４細胞（ＭＬＶの指示細胞）、３２４Ｋ細胞あるいはＡ９細胞（ＭＭＶの指示細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（ＰＲＶの指示細胞）、Ｌ－９２９細胞（Ｒｅｏ３の指示細胞）を用いた。ウイルスクリアランス試験の前には、緩衝液やサンプルが指示細胞に望ましくない影響を及ぼしていないかを調べるために、ウイルス力価測定法に対する毒性作用又は干渉作用を評価した。ウイルスクリアランス能（対数除去値、ＬＲＶ）を、以下の計算により算出した。Ｃｆがフィード液中のウイルスの濃度であり、Ｃｐがカラム、フィルターを通過した後のウイルスの濃度であるとき、ＬＲＶ＝ｌｏｇ（Ｃｆ）－ｌｏｇ（Ｃｐ）とした。
７）ＤＮＡ測定
　ＣＨＯに特異的なプライマー、プローブを用いたｑＰＣＲ法により測定した。得られたＤＮＡ濃度を抗体濃度で除し、ｐｇＤＮＡ／ｍｇ抗体に換算した。
実施例２．ＣＥＸクロマトグラフィー工程をＦ／Ｔモードで精製した参考例（Ｍａｂ　Ａ）
　本実施例は、以下の表１に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ａと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
１）材料及び方法
　Ｍａｂ　Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化して細胞培養上清を得た。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ａを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。1時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した。中和液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）にロードし、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ａを回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液をトリス水溶液でｐＨ７．５に調整し、ＡＥＸ材料ロード液とした。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリスバッファー（ｐＨ７．５）、続いてトリスバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＡＥＸ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ（ＮａｔｒｉＦｌｏ（登録商標）　ＨＤ－Ｑ）にＡＥＸ材料ロード液を通液し、続いてトリスバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することによりＭａｂ　Ａを回収した。回収液は酢酸を用いてｐＨ５．０に調整した後、０．２μｍのフィルターでろ過し、ＡＥＸ材料プール液として保存した。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムにＡＥＸ材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は２０００ｇ／Ｌ樹脂以下と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ａを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。
２）結果
　ＣＥＸクロマトグラフィー工程のＦ／ＴモードによるＭａｂ　Ａ回収率は、９２％であった。不純物クリアランスの結果（表２）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
 
実施例３．活性炭材料による不純物クリアランス（Ｍａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ、Ｍａｂ　Ｄ）
　本実施例は、以下の表３に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ、又はＭａｂ　Ｄと呼ばれる複数の抗体の活性炭材料による不純物クリアランスについて説明する。なお、Ｍａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ、又はＭａｂ　Ｄのアミノ酸配列及び結合する抗原は、それぞれ異なっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
１）活性炭材料における不純物クリアランス（ウイルス以外）
　活性炭材料としてＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０を用いて、Ｍａｂ　Ｂ及びＭａｂ　Ａについて、抗体回収率及び不純物クリアランスの評価をおこなった。実施例２に示す方法に準じて得られたＭａｂ　Ｂ及びＭａｂ　Ａのデプスフィルターろ過プール液を活性炭フィルターへのロード液（活性炭材料ロード液）として用いた。ただし、活性炭フィルターでのＨＣＰのクリアランス能を評価しやすくするために、Ｍａｂ　ＢについてはプロテインＡクロマトグラフィーにおいて、培養上清をロード後の１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）による洗浄は実施しなかった。活性炭フィルターは予め取扱説明書にしたがって適切な洗浄を実施した後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化した。なお、平衡化以降の流速は、１０９ＬＭＨと設定した。平衡化後、活性炭材料ロード液をＭａｂ　Ｂでは、約３００Ｌ／ｍ２で、Ｍａｂ　Ａでは約１１７Ｌ／ｍ２で負荷し、通液後、酢酸バッファーでＭａｂ　Ｂ及びＭａｂ　Ａを回収した（活性炭材料プール液）。
　各抗体についての精製条件（表４）、抗体回収率（表５）、ＨＣＰクリアランス（表６）、ＰＬＢＬ２クリアランス（表７）、及びＨＭＷＳ，ＬＭＷＳクリアランス（表８）を示す。いずれの抗体でも、活性炭フィルターろ過によってＨＣＰ、ＰＬＢＬ２が低減された。さらにＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが低減され、Ｍｏｎｏｍｅｒ含量の向上が確認された。特にＨＣＰに関して活性炭フィルターろ過により大幅に低減された（実施例２では、ＡＥＸクロマトグラフィー処理の前後においてＨＣＰ除去の程度が低く、ＣＥＸクロマトグラフィーに対するＨＣＰの負荷が低減されていない）。さらに、抗体との相互作用により、一般的な抗体精製フローでは低減し難いヒッチハイクＨＣＰとして報告があるＰＬＢＬ２についても（国際公開第WO2015/038888号）、活性炭フィルターろ過で低減されることが明らかになった。ヒッチハイクＨＣＰであるＰＬＢＬ２は一般的な精製方法では低減することが難しいため、活性炭材料によりロード液の約５０％が低減されること、すなわち活性炭材料によりＰＬＢＬ２の対数除去値（ＬＲＶ）０．２７が得られることには大きな意義がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
２）活性炭材料におけるウイルスクリアランス
　活性炭材料としてＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０を用いて、ウイルスクリアランスを評価した。Ｍａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ、及びＭａｂ　Ｄへのスパイク試験によりウイルスクリアランス能を確認した。スパイク対象ウイルスとしては、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品のウイルスクリアランス試験で一般的に用いられている４ウイルス（ＭＬＶ，ＭＭＶ，Ｒｅｏ３及びＰＲＶ）とした。活性炭フィルターろ過によるウイルスクリアランス能に影響を及ぼす可能性がある因子として、流速、ｐＨ及び抗体種類をあげ、それらの影響を確認する試験を計画した。実施例２に示す方法に準じて得られたＭａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ、及びＭａｂ　Ｄのデプスフィルターろ過プール液を活性炭フィルターへのロード液（活性炭材料ロード液）として用いた（ｐＨ５．０）。さらに、ｐＨ７．５の条件のロード液については、トリス水溶液によりｐＨを７．５に調整した。活性炭フィルターは予め取扱説明書にしたがって適切な洗浄を実施した後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）あるいはトリスバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化した。なお、平衡化以降の流速は、１０９ＬＭＨあるいは５４．５ＬＭＨと設定した。平衡化後、活性炭材料ロードを約５５Ｌ／ｍ２あるいは約１１０Ｌ／ｍ２で負荷し、通液後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）あるいはトリスバッファー（ｐＨ７．５）でＭａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ、及びＭａｂ　Ｄを回収し（活性炭材料プール液）、活性炭材料ロード液及び活性炭材料プール液のウイルス力価からウイルス対数除去値（ＬＲＶ）を算出した（表９）。この結果、活性炭フィルターは４種のウイルスに対してクリアランス能を有することが判明した。ウイルスクリアランス能は、流速、共存する抗体種、及び負荷量によって影響を受けず、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品のウイルスクリアランス試験で用いる４種のウイルスについてＬＲＶがいずれも＞＝４と高いクリアランス能を有していた。一方、ＭＬＶの評価においてｐＨ５．０及び７．５でウイルスクリアランス能を比較した結果、ｐＨ７．５でＬＲＶが低下していることが分かり、ｐＨが活性炭材料におけるウイルスクリアランスに影響する重要パラメータであることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
実施例４．改良方法１による精製例（Ｍａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｃ）
　本実施例は、以下の表１０に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ａ又はＭａｂ　Ｃと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
１）材料及び方法
　Ｍａｂ　Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ａを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に約１０９Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ａを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。
　デプスフィルターろ過プール液を予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に１１７Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ａを回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約２０００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ａを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。
　実施例３で調製したＭａｂ　Ｃのアフィニティークロマトグラフィープール液、デプスフィルターろ過プール液及び活性炭材料プール液を用いて、ウイルスクリアランスを評価した。スパイク対象ウイルスとしては、ＣＨＯ細胞を用いた抗体医薬品のウイルスクリアランス試験で一般的に用いられている４ウイルス（ＭＬＶ，ＭＭＶ，Ｒｅｏ３及びＰＲＶ）とした。ウイルス力価からウイルス対数除去値（ＬＲＶ）を算出した。
２）結果
　改良方法１におけるＭａｂ　Ａ回収率、及び不純物クリアランスの結果を表１１及び表１２に示す。また、Ｍａｂ　Ｃについて、改良方法１におけるウイルスクリアランス能を有する工程の精製工程総クリアランスを表１３に示す。
　改良方法１におけるＭａｂ　Ａの回収率は良好であった。ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが除去され、高いＭｏｎｏｍｅｒ含量の抗体が得られた。ＨＣＰ含量は適切に低減された。ＰＬＢＬ２含量についても、低減できた。また、ＤＮＡについても定量限界未満まで除去されていることが確認された。
　改良方法１におけるＭａｂ　Ｃのウイルスクリアランス能を有する工程の精製工程総クリアランスも良好な結果を示した。
　活性炭材料による処理と組み合わせることで、高純度に精製できること、さらに活性炭材料による処理でウイルスが除去されることが見出されたため、実施例２に示す方法からＡＥＸクロマトグラフィーを活性炭材料に置き換えることが可能となった。製造コストについては、ＣＥＸクロマトグラフィーを一般的に使用されているＢ／ＥモードからＦ／Ｔモードとすることで、樹脂へのローディング密度が約１００ｇ／Ｌ樹脂から約２０００ｇ／Ｌ樹脂へと増大し、高価なＣＥＸ樹脂コストを約１／２０とすることが可能となった。また、高価なＡＥＸ樹脂や膜を安価な活性炭材料とすることで製造コスト低減が達成された。さらにＡＥＸクロマトグラフィーを削除し、フィルターカートリッジタイプのデプスフィルターに続けて同タイプの活性炭フィルターを使用することにより、製造日数も１日短縮できた。多くの医薬品メーカーにとって製造の効率化は必須であり、年間の製造ロット数を最大化することにより製造の効率化がはかられていることから、製造日数が１日短縮できることには大きな意義がある。
　該改良方法により、ヒト治療用として使用するに充分な純度まで、しかも製造コストを低減し、製造期間を短縮し、効率的に抗体を精製することが可能となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
実施例５．改良方法２による精製例（Ｍａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｄ）
　本実施例は、実施例４の表１０の精製フローよりデプスフィルターろ過を省略した、以下の表１４に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ａ及びＭａｂ　Ｄと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。なお、Ｍａｂ　Ｄのアミノ酸配列及び結合する抗原は、Ｍａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｂ又はＭａｂ　Ｃとは異なっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
１）材料及び方法
１）－１）Ｍａｂ　Ａの場合
　Ｍａｂ　Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。1時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に７０Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、各抗体を回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約２０００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。
１）－２）Ｍａｂ　Ｄの場合
　Ｍａｂ　Ｄを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ｄをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．４に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。1時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和し、保存した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に１７８Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、各抗体を回収した。続いて、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１５００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、各抗体を含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。
２）結果
　改良方法２におけるＭａｂ　Ａ回収率、及び不純物クリアランスの結果を表１５及び表１６に、Ｍａｂ　Ｄ回収率、及び不純物クリアランスの結果を表１７及び表１８に示す。なお、改良方法２におけるウイルスクリアランス能を有する工程の精製工程総クリアランスについては、実施例４の表１３と対象工程が同じであるため、同等のクリアランスが期待できる。
　Ｍａｂ　Ａ及びＭａｂ　Ｄともに、改良方法２における回収率は良好であった。また、ＨＭＷＳ及びＬＭＷＳが除去され、高いＭｏｎｏｍｅｒ含量の抗体が得られた。ＨＣＰ含量についても、Ｍａｂ　Ｄで充分に除去された。また、ＤＮＡについても定量限界未満まで除去されていることが確認された。さらに、ＰＬＢＬ２及び浸出プロテインＡの含量も低減できた。以上の結果から、抗体によっては該精製方法によりデプスフィルターろ過を実施しなくても高純度に精製できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
実施例６．改良方法３による精製例（Ｍａｂ　Ｆ、Ｍａｂ　Ｇ）
　本実施例は、実施例４の表１０の精製フローにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを追加した、以下の表１９に示される精製フローによる抗体の不純物クリアランスを例示する。なお、本実施例で使用されるＭａｂ　Ｅ、Ｍａｂ　Ｆ及びＭａｂ　Ｇのアミノ酸配列及び結合する抗原は、それぞれ異なっており、Ｍａｂ　Ａ、Ｍａｂ　Ｂ、Ｍａｂ　Ｃ又はＭａｂ　Ｄとも異なっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
１）疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるウイルスクリアランス（Ｍａｂ　Ｅ）
　本実施例は、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるＭａｂ　Ｅと呼ばれるモノクローナル抗体のウイルスクリアランスについて説明する。ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ　ＨＩＣ　樹脂を用いて、Ｍａｂ　ＥへのＭＬＶ，ＭＭＶのスパイク試験により、ウイルスクリアランスを評価した。
　Ｍａｂ　Ｅを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ｅをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｅを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．４に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に１１４Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ｅを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に１２９Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約１０００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｅを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。ロード液及びプール液のウイルス力価からウイルス対数除去値（ＬＲＶ）を算出した（表２０）。この結果、疎水性相互作用クロマトグラフィーはクリアランス能を有することが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
２）改良方法３による不純物クリアランス（Ｍａｂ　Ｆ）
本実施例は、表１９に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ｆと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。
　Ｍａｂ　Ｆを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ｆをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｆを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に約９００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ｆを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１３００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｆを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムにＣＥＸ材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｆを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。
　改良方法３における不純物クリアランスの結果を表２１に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。陽イオン交換クロマトグラフィー後に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界未満まで除去された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
３）改良方法３による不純物クリアランス（Ｍａｂ　Ｇ）
本実施例は、表１９に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ｇと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。
　Ｍａｂ　Ｇを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ｇをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｇを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、1時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ｇを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に約７００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め１　Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１５００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｇを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムにＣＥＸ材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｇを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。
　改良方法３における不純物クリアランスの結果を表２２に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。陽イオン交換クロマトグラフィー後に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界付近まで除去された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
実施例７．改良方法４による精製例（Ｍａｂ　Ｆ、Ｍａｂ　Ｇ）
　本実施例は、実施例４の表１０の精製フローにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの前に疎水性相互作用クロマトグラフィーを追加した、以下の表２３に示される精製フローによる抗体の不純物クリアランスを例示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
１）改良方法４による不純物クリアランス（Ｍａｂ　Ｆ）
本実施例は、表２３に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ｆと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。
　Ｍａｂ　Ｆを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ｆをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｆを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に約９００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ｆを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｆを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムにＨＩＣ材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１３００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｆを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。
　改良方法４における不純物クリアランスの結果を表２４に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。活性炭材料プール液に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界付近まで除去された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
２）改良方法４による不純物クリアランス（Ｍａｂ　Ｇ）
本実施例は、表２３に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ｇと呼ばれるモノクローナル抗体の不純物クリアランスについて説明する。
　Ｍａｂ　Ｇを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ｇをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｇを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．７に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に約８００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ｇを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に約７００ｇ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（活性炭材料プール液）。予め注射用水、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａを充填したＨＩＣカラムに活性炭材料プール液を通液した。ＨＩＣカラムへのローディング密度は約３００ｇ／Ｌ樹脂とした。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｇを含む画分を取得し、Ｆ／ＴモードによるＨＩＣ材料プール液とした。予め１Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ　ＸＳを充填したＣＥＸカラムにＨＩＣ材料プール液を通液した。ＣＥＸカラムへのローディング密度は約１３００ｇ／Ｌ樹脂と設定した。ロード後、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ｇを含む画分を取得し、続いて０．２μｍのフィルターでろ過しＦ／ＴモードによるＣＥＸ材料プール液とした。
　改良方法４における不純物クリアランスの結果を表２５に示す。疎水性相互作用クロマトグラフィーによってＭｏｎｏｍｅｒ含量は増加した。活性炭材料プール液に残留したＨＣＰ及びＰＬＢＬ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって除去され、特にＰＬＢＬ２は定量限界付近まで除去された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
実施例８．活性炭材料による不純物クリアランス（Ｍａｂ　Ａ）
　本実施例は、以下の表２６に示される精製フローにおけるＭａｂ　Ａと呼ばれるモノクローナル抗体の活性炭材料による不純物クリアランスについて説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
１）材料及び方法
　Ｍａｂ　Ａを産生したＣＨＯ細胞培養液について、デプスフィルターろ過により細胞を除去し、清澄化した。細胞培養上清を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した後、培養上清をロードし、その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、続いて２０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄を行った。酢酸バッファー（ｐＨ３．６）でＭａｂ　Ａをカラムから溶出した。２８０ｍｍの吸光度をモニタリングし、Ｍａｂ　Ａを含む画分を取得した（アフィニティークロマトグラフィープール液）。アフィニティークロマトグラフィープール液に塩酸を加え、ｐＨを３．５に調整し、１時間、ウイルス不活化処理を行った。該工程は室温で実施した。１時間のウイルス不活化処理の後、トリス水溶液を用いてｐＨ５．０に中和した（ウイルス不活化液）。ウイルス不活化液を、予め酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗浄したデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　Ａ１ＨＣ）に１２４Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ａを回収した（デプスフィルターろ過プール液）。デプスフィルターろ過プール液を塩酸又はトリス水溶液によりｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５に調整し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（ｐＨ調整活性炭材料ロード液）。デプスフィルターろ過プール液を限外ろ過・ダイアフィルトレーションにより電気伝導度２ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍに調整し、０．２μｍのフィルターでろ過し、保存した（電気伝導度調整活性炭材料ロード液）。
　ｐＨ調整活性炭材料ロード液を予めロード液と同じｐＨの酢酸バッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）でそれぞれ洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に６０Ｌ／ｍ２又は１００Ｌ／ｍ２で負荷し、続いてロード液と同じｐＨの酢酸バッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５）でそれぞれ押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ａを回収しｐＨ調整活性炭材料プール液とした。電気伝導度調整活性炭材料ロード液を酢酸バッファー（ｐＨ５．０）でそれぞれ洗浄した活性炭フィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）　Ｐｏｄ　ＣＲ４０）に６０Ｌ／ｍ２で負荷し、続いて酢酸バッファー（ｐＨ５．０）でそれぞれ押し出しを実施し、Ｍａｂ　Ａを回収し電気伝導度調整活性炭材料プール液とした。
 
２）結果
　表２６に示される精製フローのうち負荷量６０Ｌ／ｍ２の活性炭フィルターろ過における不純物クリアランスの結果を表２７及び表２８に示す。ｐＨ及び電気伝導度によりＨＣＰ除去率は大きな影響を受けなかった。ＰＬＢＬ２はｐＨが低いほど、又は電気伝導度が低いほど除去率が大きくなる傾向があった。浸出Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡはｐＨが低いほど、除去率が大きくなる傾向にあった。ＭＬＶ及びＭＭＶはｐＨが低いほど、又は電気伝導度が低いほど除去率が大きくなる傾向があった。表２６に示される精製フローで得られる活性炭材料ロード液のｐＨ及び電気伝導度の条件は、活性炭フィルターろ過において高い不純物除去率を示す条件であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
　本発明の抗体精製法によって、精製期間を短縮した上で不純物を効率的に除去し、抗体をヒト治療用として使用するに充分な純度まで精製し、かつ製造コストを低減することが可能となった。

Claims (47)

  1. 　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
    ａ１．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
    ｂ１．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
    ｃ１．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
    ｄ１．前記ウイルス不活化液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
    ｅ１．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
    のａ１．乃至ｅ１．の工程を含む方法。
  2. 　抗体を一又は複数の不純物を含む組成物から精製するための手法であって、
    ａ２．抗体を含有する細胞培養上清を用意し、
    ｂ２．前記細胞培養上清をアフィニティークロマトグラフィー樹脂により処理して、抗体を含むアフィニティークロマトグラフィープール液を得、
    ｃ２．前記アフィニティークロマトグラフィープール液においてウイルスを不活化して、ウイルス不活化液を得、
    ｄ２．前記ウイルス不活化液をデプスフィルターにより処理して、デプスフィルターろ過プール液を得、
    ｅ２．前記デプスフィルターろ過プール液を活性炭材料により処理して、活性炭材料プール液を得、
    ｆ２．前記活性炭材料プール液を陽イオン交換材料により処理して、陽イオン交換材料プール液を得る、
    のａ２．乃至ｆ２．の工程を含む請求項１に記載の方法。
  3. 　アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインＡ樹脂である請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　プロテインＡ樹脂が、ＫａｎＣａｐＡ、ＫａｎＣａｐＡ３Ｇ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＰｒｉｓｍＡ、又はＡｍｓｐｈｅｒｅ　Ａ３である請求項３に記載の方法。
  5. 　ウイルス不活化が、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線及び熱での処理からなる群から選択される少なくともいずれか一つである、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法。
  6. 　ウイルス不活化が、アフィニティークロマトグラフィープール液のｐＨを３～４に低下させることを含む請求項５に記載の方法。
  7. 　ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を６０～１２０分間インキュベートする請求項６に記載の方法。
  8. 　ウイルス不活化中に、アフィニティークロマトグラフィープール液を１５～３０℃でインキュベートする請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５～７．５である請求項１乃至８のいずれか一つに記載の方法。
  10. 　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーのｐＨが、４．５～５．５である請求項９に記載の方法。
  11. 　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２～１０ｍＳ／ｃｍである請求項１乃至１０のいずれか一つに記載の方法。
  12. 　活性炭材料にロードする溶液、活性炭材料の平衡化バッファー及び洗浄バッファーの電気伝導度が、２～５ｍＳ／ｃｍである請求項１１に記載の方法。
  13. 　活性炭材料による処理が、活性炭材料を含むフィルターを用いて行われる、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の方法。
  14. 　フィルターが、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋　Ｐｏｄ　ＣＲ４０、Ｚｅｔａ　Ｐｌｕｓ　活性炭吸着デプスフィルター、又はＳＵＰＲＡｃａｐ　５０　Ｓｅｉｔｚ　ＡＫＳ　ｆｉｌｔｅｒである請求項１３に記載の方法。
  15. 　陽イオン交換材料に対し、活性炭材料プール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる請求項１乃至１４のいずれか一つに記載の方法。
  16. 　陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が、５００～２０００ｇ／Ｌである請求項１５に記載の方法。
  17. 　　陽イオン交換材料に対する活性炭材料プール液のローディング密度が１０００～１５００ｇ／Ｌである請求項１６に記載の方法。
  18. 　陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である請求項１乃至１７のいずれか一つに記載の方法。
  19. 　陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである請求項１８に記載の方法。
  20. 　陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ　ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ　ＩｍｐＡｃｔである請求項１９に記載の方法。
  21. 　陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４～６である請求項１乃至２０のいずれか一つに記載の方法。
  22. 　陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５～５．５である請求項２１に記載の方法。
  23. 　陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～７ｍＳ/ｃｍである請求項１乃至２２のいずれか一つに記載の方法。
  24. 　陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～５ｍＳ/ｃｍである請求項２３に記載の方法。
  25. 　陽イオン交換材料プール液を、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得る請求項１乃至２４のいずれか一つに記載の方法。
  26. 　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである請求項２５に記載の方法。
  27. 　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される請求項２６に記載の方法。
  28. 　疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する請求項２７に記載の方法。
  29. 　疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ　、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ、　Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ　、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、　Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、　Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ　Ｐｈｅｎｙｌである請求項２８に記載の方法。
  30. 　活性炭材料プール液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより処理して、プール液を得、さらに陽イオン交換材料により処理して、プール液を得る請求項１乃至１４のいずれか一つに記載の方法。
  31. 　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フロースルーモードである請求項３０に記載の方法。
  32. 　疎水性相互作用クロマトグラフィーが、樹脂又は膜を用いて実施される請求項３１に記載の方法。
  33. 　疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂又は膜が、Ｐｈｅｎｙｌ基、Ｂｅｎｚｙｌ基又はＨｅｘｙｌ基を有する請求項３２に記載の方法。
  34. 　疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ　、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ、　Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ　、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、　Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、　Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｐｈｅｎｙｌ又はＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ　Ｐｈｅｎｙｌである請求項３３に記載の方法。
  35. 　陽イオン交換材料に対し、疎水性相互作用クロマトグラフィープール液が、該陽イオン交換材料の吸着容量を超えてロードされる請求項３０乃至３４のいずれか一つに記載の方法。
  36. 陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が、５００～２０００ｇ／Ｌである請求項３５に記載の方法。
  37. 陽イオン交換材料に対する疎水性相互作用クロマトグラフィープール液のローディング密度が１０００～１５００ｇ／Ｌである請求項３６に記載の方法。
  38. 陽イオン交換材料が、樹脂、モノリスカラム、又は膜である請求項３０乃至３７のいずれか一つに記載の方法。
  39. 陽イオン交換材料の官能基が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、又はカルボキシルである請求項３８に記載の方法。
  40. 陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ　ＸＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ、又はＣａｐｔｏＳ　ＩｍｐＡｃｔである請求項３９に記載の方法。
  41. 陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４～６である請求項３０乃至４０のいずれか一つに記載の方法。
  42. 陽イオン交換材料にロードする溶液のｐＨが、４．５～５．５である請求項４１に記載の方法。
  43. 陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～７ｍＳ/ｃｍである請求項３０乃至４２のいずれか一つに記載の方法。
  44. 陽イオン交換材料にロードする溶液の電気伝導度が、３～５ｍＳ/ｃｍである請求項４３に記載の方法。
  45. 　少なくとも一つの不純物が、宿主細胞由来タンパク質（Ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＣＰ）、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｂ－ｌｉｋｅ　２（ＰＬＢＬ２）、ウイルス、ウイルス様粒子、高分子量体（ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ；ＨＭＷＳ）、低分子量体（ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ；ＬＭＷＳ）、培地成分、浸出プロテインＡ及び／又はＤＮＡからなる群から選択される請求項１乃至４４のいずれか一つに記載の方法。
  46. 　工程が連続的である請求項１乃至４５のいずれか一つに記載の方法。
  47. 　請求項１乃至４６のいずれか一つに記載の方法によって精製された抗体。
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