WO2020171020A1 - 細胞の選抜方法、核酸の製造方法、組換え細胞の製造方法、目的物質の製造方法、医薬組成物の製造方法、及び試薬 - Google Patents

細胞の選抜方法、核酸の製造方法、組換え細胞の製造方法、目的物質の製造方法、医薬組成物の製造方法、及び試薬 Download PDF

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祐司 漆畑
喜好 ▲高▼山
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Definitions

  • the present invention relates to a cell selection method, a nucleic acid production method, a recombinant cell production method, a target substance production method, a pharmaceutical composition production method, and a reagent.
  • Cell membrane proteins such as G protein-coupled receptors (GPCRs), transporters, ion channels, and cytokine receptors are known to be involved in various diseases, and have attracted attention as target molecules for diagnostic agents and medical drugs. There is.
  • the cell membrane protein expresses a cell function or a pharmacological function by binding or binding to an extracellular substance, for example, a ligand composed of a low molecular weight compound, a peptide, a protein, or the like to activate or inhibit the function.
  • -Multiple transmembrane proteins are more difficult to isolate and purify because they contain more hydrophobic structures than soluble proteins (eg cytokines, hormones, enzymes, nuclear receptors).
  • soluble proteins eg cytokines, hormones, enzymes, nuclear receptors.
  • purification examples that have been proved to be capable of maintaining the structure existing in nature and maintaining the function of the multiple transmembrane protein.
  • a multi-pass transmembrane protein exerts its functionality in the state of being present in the lipid bilayer of cells.
  • a technique for searching for a substance that specifically binds to a cell membrane protein for example, there is a method of using a large amount of a soluble domain or a partial peptide, which is a part of the cell membrane protein exposed outside the cell, and is purified.
  • the purified soluble domain or partial peptide may be immobilized on a 96-well plate and the binding to a candidate specific binding substance may be evaluated by an ELISA method or the like.
  • the substance selected by such a method binds specifically to the target cell membrane protein present in the living body with high affinity.
  • the target cell membrane protein is produced in order to mimic the three-dimensional structure of the cell membrane protein in vivo. It is more effective to use mammalian cells that are expressed on the cell membrane of the cell.
  • substances such as peptide ligands, protein ligands and specific antibodies can be secreted into the culture supernatant by culturing cells derived from human or non-human animals or recombinant cells to which gene recombination technology is applied.
  • culturing cells derived from human or non-human animals or recombinant cells to which gene recombination technology is applied.
  • production cell populations for example, antibody-producing hybridoma library
  • Non-Patent Document 1 a method for identifying a specific antibody-producing cell applying a single cell analysis technique is being developed.
  • one antibody-producing cell and an antigen protein are enclosed in a hydrophobic microdroplet.
  • the presence or absence of binding between the antibody secreted from the antibody-producing cells and the antigen protein can be visualized, and the microdroplets containing the positive cells producing the specific antibody can be separated in an analyzer having a microchannel.
  • Non-Patent Document 2 describes the principle of a method for identifying specific antibody-producing cells by applying a microdroplet and a microchannel.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Patent Literature 2 describes a technique of contacting a cell population expressing a target cell membrane protein with a candidate cell population on a slide glass, and identifying a cell producing an antibody against the target cell membrane protein from the candidate cell population. Has been done. However, since this method also cannot perform the above-mentioned washing step, when targeting a cell membrane protein that is extremely expressed on the cell membrane surface, it is necessary to confirm the presence or absence of binding between the antibody and the cell membrane protein. Is difficult.
  • Patent Document 3 a candidate antibody-producing cell is introduced into a microwell coated with purified soluble cytokine receptor protein, and a desired antibody-producing cell having a binding property between the antibody secreted by the cell and the soluble cytokine receptor protein is disclosed.
  • a technique for selecting is disclosed.
  • the isolated and purified receptor protein does not always maintain the structure that exerts the function in the living body. Furthermore, it is extremely difficult to apply this method to a multiple transmembrane protein that is difficult to purify.
  • the present invention provides a technique for more rapidly and efficiently selecting cells that produce a target substance that specifically binds to a cell membrane protein, and the use of cells selected by the technique to achieve the purpose of antibodies and the like. It is intended to provide a technique for manufacturing a substance.
  • the target cells can be selected in a very short time.
  • One aspect of the present invention is a method for selecting cells from a population of second cells, which is a method for selecting target cells that produce a target substance that specifically binds to a desired cell membrane protein. a) providing a substrate having a plurality of microwells, b) attaching first cells expressing the cell membrane protein on the cell surface to each of the microwells, c) Subsequent to step b), one or two second cells isolated from the population are introduced into each of the microwells, and the first cells and the second cells are introduced into the microwells.
  • the step d) includes a visualization step of visualizing that the target substance has bound to the first cells.
  • the visualization step includes adding a labeling substance that specifically binds to the target substance to the microwell.
  • the labeling substance is a labeling antibody against the target substance.
  • the label in the labeling substance is a fluorescent label.
  • the labeling substance is an antibody labeled with a first fluorescent substance
  • the first cell label for labeling the first cells adhering to the microwell with a second fluorescent substance is different from the fluorescence wavelength of the fluorescence emitted by the second fluorescent substance.
  • the visualizing step includes visualizing a change in an intracellular signal transduction substance that accompanies activation of the cell membrane protein, which occurs when the target substance binds to the first cell.
  • the cell membrane protein is a multiple transmembrane protein.
  • the first cell is a cell into which a vector expressing the cell membrane protein has been introduced.
  • the first cell is a tumor cell that expresses the cell membrane protein.
  • the first cell is a non-tumor cell expressing the cell membrane protein.
  • the target substance is an antibody.
  • the second cell is derived from bone marrow, spleen, lymphoid tissue, or blood cell derived from a non-human animal immunized with the cell membrane protein or a nucleic acid encoding the cell membrane protein.
  • the second cell is an immortalized cell.
  • the second cell is a hybridoma.
  • the second cell is derived from human lymphatic tissue or blood.
  • the second cell is a cell immortalized by infection with Epstein-Barr virus.
  • the second cell is a recombinant cell having an exogenous antibody gene and expressing the antibody.
  • the antibody is a complete antibody, a functional antibody fragment, a single chain antibody, or a multispecific antibody.
  • the antibody is a fully human antibody, a humanized antibody, or a chimeric antibody.
  • the antibody is a feline antibody or a canine antibody.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a nucleic acid, in which a nucleic acid encoding the target substance is obtained from a target cell selected from the second cell population by the above method.
  • the target substance is an antibody.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a recombinant cell in which a nucleic acid produced by the above method is introduced into a host cell to obtain a recombinant cell expressing the target substance.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a target substance, which comprises culturing the recombinant cell produced by the above method and obtaining the target substance from the culture.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a target substance, which comprises culturing a target cell selected from a population of second cells by the above method and obtaining the target substance from the culture.
  • the target substance is an antibody.
  • Another aspect of the present invention is to obtain a pharmaceutical composition containing the nucleic acid as an active ingredient by combining the nucleic acid produced by the above method with a pharmaceutically acceptable carrier or additive. Is a manufacturing method.
  • Another aspect of the present invention is to obtain a pharmaceutical composition containing the target substance as an active ingredient by combining the target substance produced by the above method with a pharmaceutically acceptable carrier or additive. It is a method of manufacturing a product.
  • Another aspect of the present invention is a reagent for detecting the desired cell membrane protein containing the target substance produced by the above method.
  • cells producing a target substance that specifically binds to a cell membrane protein can be selected more quickly and efficiently. Furthermore, a target substance that specifically binds to a cell membrane protein, such as an antibody, can be easily produced.
  • FIG. 6 is a photograph showing an example of an image of positive microwells in Example 4, (a) is transmitted light, (b) is fluorescence derived from CytoRed, and (c) is a result obtained by observing fluorescence derived from Alexa Fluor 488.
  • 5 is a photograph showing an example of an image of a negative microwell in Example 4, where (a) is transmitted light, (b) is fluorescence from CytoRed, and (c) is fluorescence from Fluor 488.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of subjecting a recombinant antibody derived from a hybridoma recovered from positive microwells in Example 5 to flow cytometry.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of subjecting a hybridoma-derived recombinant antibody recovered from negative microwells in Example 5 to flow cytometry.
  • 9 is a photograph showing an example of an image of a positive microwell in Example 6, where (a) is transmitted light, (b) is fluorescence derived from CytoRed, and (c) is a result obtained by observing fluorescence derived from Alexa Fluor 488.
  • FIG. 9 is a photograph showing an example of an image of a negative microwell in Example 6, where (a) is transmitted light, (b) is fluorescence from CytoRed, and (c) is the result of observing fluorescence from Alexa Fluor 488.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of subjecting a lymphocyte-derived gene recombinant antibody recovered from positive microwells in Example 7 to flow cytometry.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of subjecting a lymphocyte-derived gene recombinant antibody collected from negative microwells in Example 7 to flow cytometry.
  • Example 9 is a photograph showing an example of an image of a microwell in Example 9, where (a) is the result of observation of transmitted light, (b) is the fluorescence derived from Alexa Fluor 488, and (c) is the fluorescence derived from DyLight 650.
  • the cell selection method of the present invention is to select a target cell that produces a target substance that specifically binds to a desired cell membrane protein from a second cell population.
  • the target cell may be referred to as a positive cell.
  • the desired cell membrane protein may be referred to as "target cell membrane protein”.
  • the target substance may be referred to as a "specific binding substance for cell membrane protein” or simply "specific binding substance”.
  • the phrase “selecting cells” can be restated as “identifying cells”.
  • FIG. 1 shows an outline of a cell selection method according to one embodiment of the present invention.
  • A shows a substrate 1 having a plurality of microwells 2.
  • B shows a state in which the first cells 3 are attached to the microwells 2.
  • C shows a state in which the first cells 3 and the second cells 5 coexist in the microwell 2.
  • D shows a state in which the target substance 6 secreted by the second cell 5 is bound to the surface of the first cell 3.
  • E represents a state in which the labeling substance 7 is bound to the target substance 6 on the surface of the first cell 3.
  • a substrate having a plurality of microwells is used.
  • a microwell refers to a micro-sized well (recess, recess) in which approximately 1 to 3 mammalian cells or avian cells are contained.
  • the microwell is a small hole having a bottom.
  • the inner diameter of the opening is about 10 ⁇ m to 50 ⁇ m, and the depth is about the same as the inner diameter of the opening.
  • the shape of the microwell is typically cylindrical.
  • it may be a cylindrical shape composed of a plurality of flat surfaces such as a polygonal prism such as a quadrangular prism or a hexagonal prism, or a mortar shape such as an inverted cone shape or an inverted pyramid shape.
  • a shape in which two or more of these shapes are combined and connected may be used.
  • the bottom surface of the cone serves as the opening of the microwell and a part of the apex is cut off (that is, a truncated cone shape or a truncated pyramid shape). ..
  • the diameter (inner diameter) of the opening can be appropriately determined in consideration of the type and number of cells stored in the microwell.
  • the diameter is preferably about 20 ⁇ m to 40 ⁇ m.
  • the depth of the microwell is preferably about the same as the diameter of the opening.
  • the number of microwells (density) per unit area on the substrate is not particularly limited, and can be appropriately determined in consideration of, for example, the total number of second cells to be searched per time and the expression frequency of target cells.
  • the number may be in the range of 20,000 to 200,000 per cm 2 .
  • the distance (pitch) between the microwells on the substrate is not particularly limited, and can be set as appropriate within a range that does not affect adjacent microwells.
  • the distance between the centers of the openings of adjacent microwells is preferably about 1.5 to 3 times the diameter of the openings.
  • the material of the substrate is not particularly limited, but when performing the visualization step described later, it is preferable that it is a transparent material that does not have autofluorescence.
  • Substrates with multiple microwells are available from the market.
  • a substrate (microwell chamber) having a plurality of microwells having a diameter of 10 ⁇ m, 20 ⁇ m, or 30 ⁇ m is commercially available from As One.
  • the target cell membrane protein in the present invention is not particularly limited, and all cell membrane proteins represented by multiple transmembrane proteins can be targeted.
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • ion channels transporters
  • CD antigens CD antigens
  • cell adhesion molecules CD antigens
  • cancer antigens cell adhesion molecules
  • cancer antigens viral antigens, etc.
  • animal species from which the cell membrane protein is derived is not particularly limited.
  • a first cell expressing a desired cell membrane protein on the cell surface is used by adhering it to a microwell.
  • the first cell is not particularly limited as long as the desired cell membrane protein is expressed on the cell surface.
  • One embodiment is a recombinant cell into which a vector expressing a target cell membrane protein has been introduced.
  • the gene for the full-length target cell membrane protein is inserted into an appropriate expression vector (eg pcDNA, pEF/FRT/V5-DEST, etc.).
  • this vector is introduced into cells such as CHO cells, COS cells, HEK293 cells, and NIH3T3 cells to obtain recombinant cells that transiently or stably express the target cell membrane protein on the cell membrane.
  • This recombinant cell can be used as the first cell.
  • the expression level of the target cell membrane protein on the cell membrane is preferably increased by a factor of 5 or more as compared with cells without the expression vector.
  • a tumor cell in which a target cell membrane protein is overexpressed as compared with a normal cell can be used as the first cell.
  • the tumor cell for example, a single cell obtained from a surgically excised organ can be used.
  • tumor cells can be obtained from ATCC and cell sales companies.
  • various cells derived from a normal tissue expressing a target cell membrane protein, for example, a non-human or human tissue can be used as the first cell.
  • a normal tissue expressing a target cell membrane protein for example, a non-human or human tissue
  • blood cells nerve cells, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, immune cells, adipocytes, skeletal muscle cells, lymphocyte cells, skin cells, etc.
  • blood cells may be converted into iPS by a known method, and then differentiated into specific tissue cells may be used as the first cells.
  • a target cell that produces a target substance that specifically binds to a desired cell membrane protein is selected from the second cell population.
  • the target substance includes a polypeptide having a known or unknown structure, a cyclic peptide, or a protein that selectively binds to a specific cell membrane protein. More specifically, specific binding substances consisting of peptide hormones, cytokines, antibodies, artificial polypeptides, artificial cyclic peptides, etc. are included.
  • the first cell and the second cell are allowed to coexist in the microwell.
  • the second cell will be specifically described below.
  • the second cell is not particularly limited as long as it is a cell expected to produce a desired target substance.
  • various cells derived from non-human or human tissues such as blood cells, nerve cells, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, immune cells, adipocytes, skeletal muscle cells, lymphocyte cells, skin cells, etc. It can be used as a cell.
  • the tissue of a non-human animal can be separated, treated with collagenase, and then filtered through a mesh of 30 to 100 ⁇ m to form a single cell, which can be used as the second cell.
  • a single cell obtained from human blood or a surgically excised organ can be used as the second cell.
  • tumor cells can be used as the second cells.
  • the tumor cell for example, a single cell obtained from a surgically excised organ can be used.
  • tumor cells can be obtained from ATCC and cell sales companies.
  • Recombinant cells can be used as the second cells.
  • a cDNA library containing a gene encoding a target substance is incorporated into an expression vector such as pcDNA, pEF/FRT/V5-DEST, or Mammalian PowerExpress System. Then, this vector is transiently introduced into cells such as CHO cells, COS cells, HEK293 cells and NSO cells to obtain recombinant cells. This recombinant cell can be used as the second cell.
  • a recombinant cell that has survived using the drug resistance gene retained in the vector and that constantly expresses a gene can be used as the second cell.
  • a cDNA library may be incorporated into a viral vector derived from adenovirus, lentivirus, etc., and this may be used to infect CHO cells, HEK293 cells, NIH3T3 cells, etc. as the second cells.
  • a gene encoding one kind of target substance is introduced into the recombinant cell.
  • the target substance (specific binding substance) is an antibody
  • the second cell is an antibody-producing cell
  • the term “antibody” can be replaced with “immunoglobulin”.
  • the antibody in the present invention includes a functional fragment thereof.
  • the “functional fragment of an antibody” refers to a partial fragment of an antibody (that is, an immunoglobulin) that retains at least one action on an antigen.
  • the partial fragment include F(ab′) 2 , Fab, Fv, disulfide bond Fv, single chain antibody (scFv, VH-VL), VH, and polymers thereof, and heavy chain CH3 thereof. Examples include fusion with regions.
  • the antibody in the present invention may be a multispecific antibody. An example thereof is a diabody (for example, WO 93/11161), which is a type of bispecific antibody.
  • the class (isotype) of the antibody in the present invention is not particularly limited.
  • it may be any class such as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the subclass of the antibody may be any subclass such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • the antibody may be a fully human antibody, a humanized antibody or a chimeric antibody.
  • Antibody-producing cells such as B cells and plasma cells derived from human lymphoid tissue or blood can be used as the second cells.
  • B cells and plasma cells collected from healthy people, patients with cancer, patients with known or unknown infectious diseases, patients with autoimmune diseases, vaccinated persons, etc. It can be used as a cell.
  • cell concentration may be performed in order to more efficiently identify antibody-producing cells for the target cell membrane protein.
  • activated B cells or plasma cells obtained from bone marrow, spleen, lymphoid tissue, or blood cells derived from a non-human animal immunized with a target cell membrane protein can be concentrated and used as the second cell population.
  • activated B cells or plasma cells obtained from human lymphoid tissue or blood-derived cells can be concentrated and used as a second cell population.
  • Enrichment of activated B cells or plasma cells can be performed using, for example, the cell surface CD antigen as an index.
  • antibody magnetic beads against a specific CD antigen can be used.
  • CD antigens examples include CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD34, CD40, CD43, CD45R, CD49b, CD56, CD61, CD79a, CD90.2, CD138, CD235a.
  • degree of enrichment examples include enrichment of activated B cells or plasma cells by 50 times or more from a population of about 10,000,000 lymphoid cells derived from lymphoid tissue.
  • DNA immunization a method of immunizing with an artificial bilayer membrane or virus-like nanoparticles presenting a target cell membrane protein as an antigen.
  • DNA immunization a method of immunizing a vector in which a cDNA sequence encoding a target cell membrane protein is inserted into a protein expression vector.
  • DNA immunization is preferable because it is possible to obtain a more specific antibody with high affinity.
  • Immortalized cells such as hybridomas can be used as the second cells.
  • a hybridoma is obtained by collecting immune cells from a non-human animal immunized with a target cell membrane protein and cell fusion of the immune cells with myeloma. This hybridoma can be used as the second cell.
  • Known methods can be used for cell fusion, selection of hybridomas, and cloning.
  • cell fusion can be performed by a method using polyethylene glycol or a method of applying a voltage to a mixed solution of immune cells and myeloma.
  • selection of hybridomas can be performed by culturing using a HAT selection medium.
  • Cells can be immortalized by methods other than the hybridoma method.
  • cells immortalized by Epstein-Barr virus infection can also be used as the second cells.
  • Recombinant cells into which the antibody gene has been introduced can be used as the second cells.
  • a cDNA library is prepared from B cells or plasma cells derived from the lymph tissue or blood cells of an immunized animal.
  • An antibody or antibody fragment gene is selectively amplified from this cDNA library.
  • the amplified genes are modified to produce an antibody gene library so as to express various forms of antibody molecules such as complete antibody, functional antibody fragment, single chain antibody, or multispecific antibody.
  • This gene library is incorporated into a vector such as pcDNA, pEF/FRT/V5-DEST, Mammalian Power Express System.
  • this vector is transiently introduced into cells such as CHO cells, COS cells, HEK293 cells and NSO cells to obtain recombinant cells.
  • This recombinant cell can be used as the second cell.
  • a recombinant cell that has survived using the drug resistance gene retained in the vector and that constantly expresses a gene can be used as the second cell.
  • the animal species from which the second cells are derived is not particularly limited, but mammalian cells or avian cells are preferably used.
  • mammals include mouse, rat, guinea pig, rabbit, monkey, cow, horse, dog, cat, goat, sheep, pig, camel, alpaca and the like.
  • birds include chickens, ducks and turkeys.
  • the above-mentioned first cells are adhered to microwells. This allows the first cell to be stored and immobilized in the microwell without impairing its cell function.
  • the number of the first cells adhered to the microwell is not limited as long as it can secure a space for receiving the second cells, but is preferably 1 to 2.
  • first cell and second cell ⁇ Coexistence of first cell and second cell>
  • one or two second cells are introduced into the microwell to which the first cells adhere, and the first cells and the second cells coexist.
  • the target substance produced (secreted) by the second cell comes into contact with the surface of the first cell. It is preferable to introduce one second cell into the microwell.
  • the incubation conditions can be determined, for example, in consideration of the properties of the target substance produced by the second cells and the survival time of the second cells.
  • a cytokine eg, IL-
  • the mixture is incubated at 25 to 37° C. for 15 minutes to 6 hours.
  • the microwell containing the first cell to which the target substance is bound (positive microwell) is specified. In other words, the presence or absence of binding between the target cell membrane protein expressed on the surface of the first cell and the substance secreted from the second cell in each microwell is detected.
  • a visualization method is preferably used. That is, a preferred embodiment includes a visualization step of visualizing that the specific binding substance has bound to the first cell.
  • the visualization method There is no particular limitation on the visualization method.
  • One example is the direct technique of visualizing the surface of the first cells.
  • Examples of the direct method include a method using a labeling substance that specifically binds to a target substance. That is, the labeling substance is brought into contact with the first cells that coexist with the second cells in the microwell.
  • the labeling substance is, for example, a labeled antibody.
  • a tag eg, FLAG, V5
  • Fc portion of the antibody is added to the specific binding substance.
  • a recombinant cell obtained by introducing this cDNA library into a CHO cell or the like is used as the second cell.
  • a labeled antibody eg, labeled anti-FLAG antibody, labeled anti-V5 antibody
  • a labeled anti-Fc antibody eg, labeled anti-IgG antibody
  • the first cell and the second cell are allowed to coexist in the microwell, and then incubated under predetermined conditions as necessary, and then the labeling substance is added.
  • a label with a fluorescent substance fluorescent complex
  • a fluorescent protein an enzyme, or the like
  • the fluorescent substance include Alexa Fluor (registered trademark), Aqua, Texas Red (registered trademark), fluorescein and its derivative, rhodamine and its derivative, Cascade Blue (registered trademark), phycoerythrin, and DyLight (registered trademark).
  • Alexa Fluor 488 is preferably used.
  • fluorescent proteins include green fluorescent protein (GFP).
  • the enzyme include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, luciferase, and the like.
  • the primary signal bound to the target substance can be detected using the strong signal emitted by the labeled substance (eg, labeled antibody) as an index. Then, a microwell containing a positive signal (positive microwell) can be specified according to the characteristics of the label using a fluorescence microscope, a light emission microscope, an inverted microscope, or a device including these micromanipulation devices.
  • the labeled substance eg, labeled antibody
  • the indirect method is, for example, a substance in which a specific binding substance promotes the function of a cell membrane protein (for example, an endogenous ligand, a polypeptide considered to have an agonist activity, a cyclic peptide, an antibody, a protein, etc.).
  • a reporter gene capable of visualizing changes in intracellular signal transduction substances accompanying activation of the target cell membrane protein is previously introduced into the first cells expressing the target cell membrane protein. Then, when the target substance binds to the target cell membrane protein, the change in the expression of the reporter gene can be visualized. As a result, the binding between the cell membrane protein and the target substance can be indirectly visualized.
  • a positive microwell can be identified using a light emission microscope or an instrument including a light emission microscope.
  • Another example that can be applied to the indirect method is to visualize changes in intracellular cAMP.
  • the fluctuation of intracellular cAMP amount was caused by the specific phosphorylation of CREB (cAMP response element binding protein) observed when a substance that activates a cell membrane protein was added, which was fluorescently labeled with an antiphosphorylation antibody. It can be detected with the following antibody.
  • visualization of changes in intracellular Ca can be mentioned.
  • the fluctuation of Ca in the cell can be indirectly visualized by the change in the fluorescence intensity of the intracellular fluorescent Ca indicator.
  • first fluorescent substance an antibody labeled with a fluorescent substance (first fluorescent substance) is adopted as the labeling substance, and the first cells are labeled with another fluorescent substance (second fluorescent substance).
  • second fluorescent substance a substance that emits a fluorescence different from the fluorescence wavelength of the fluorescence emitted by the first fluorescent substance is adopted. That is, the fluorescence wavelength of the fluorescence emitted by the first fluorescent substance is different from the fluorescence wavelength of the fluorescence emitted by the second fluorescent substance.
  • the second fluorescent substance Calcein-AM, Fluorescein diacetate (FDA), Carboxyfluorescein diacetate (CFDA), CytoRed, Propidium iodide (PI), Ethidium bromide (EB), Acridine orange (AO), DAPI, Hoechst 33342. Use Hoechst 33258.
  • Alexa Fluor 488 is used as the first fluorescent substance. Thereby, the first cell to which the labeled antibody is bound and the first cell to which the labeled antibody is not bound can be easily distinguished by the difference in the emitted fluorescence. Then, the positive microwell can be identified using a fluorescence microscope or an instrument including the fluorescence microscope.
  • -Antibodies are usually secreted extracellularly, but it is known that there are membrane-type antibodies that are not secreted extracellularly. Therefore, it is possible that non-secreted membrane-type antibody is present on the surface of the second cell. In this case, when the labeled anti-IgG antibody is added, not only the antibody bound to the first cell but also the membrane-type antibody on the second cell may be bound. However, according to the above-described embodiment using the first fluorescent substance and the second fluorescent substance, only the antibody bound to the first cell can be specifically detected.
  • the washing step after adding the labeling substance, it is preferable to perform a washing step to remove the excess labeling substance.
  • the washing is not particularly limited as long as it is performed under the condition that the first cell and the second cell are retained in the microwell (the condition that the first cell and the second cell are not washed out).
  • the microwells may be gently washed several times with phosphate buffer, HBSS, or cell culture medium.
  • the signal in which the target substance binds to the target cell membrane protein can be detected with high sensitivity even when the expression level of the target cell membrane protein on the cell membrane of the first cell is extremely low.
  • the second cells are collected as target cells.
  • the recovery of the second cells from the microwell can be performed using, for example, a micromanipulator.
  • a capillary having a diameter of several ⁇ m to 50 ⁇ m can be inserted into a positive microwell, and the second cells can be aspirated and collected alive.
  • the operation by the micromanipulator may be automatic or manual.
  • cell picking system As One
  • CellCelector Automated Lab Solution
  • the recovered second cells are preferably recovered in an appropriate medium for cell culture or in a cell lysate (Lysis buffer) for rapid extraction without degrading mRNA.
  • nucleic acids encoding two kinds of target substances are obtained and isolated by the method described below, and one of the nucleic acids is adopted as the target nucleic acid (target gene). can do.
  • the present invention includes a method for producing a nucleic acid that obtains a nucleic acid (gene) encoding a target substance from a target cell selected from a second cell population by the above method.
  • the present invention also includes a method for producing a recombinant cell in which the nucleic acid is introduced into a host cell to obtain a recombinant cell expressing the target substance.
  • the present invention includes a method for producing a target substance in which the recombinant cell is cultured and the target substance is obtained from the culture.
  • the target substance is an antibody.
  • a known method can be used. For example, a reverse transcription reaction and a PCR method are combined to synthesize cDNA. Then, the target nucleic acid can be isolated from the cDNA.
  • a known method can be used as a method for obtaining a recombinant cell that expresses the target substance.
  • the isolated target nucleic acid is incorporated into an appropriate vector.
  • This vector can be introduced into host cells such as Escherichia coli, yeast and mammalian cells (for example, CHO cells, HEK293 cells or NSO cells) to obtain the target recombinant cells.
  • the recombinant cell is cultured, and the target substance can be obtained from the culture (for example, culture supernatant).
  • Isolation of the antibody gene from the second cells can be performed, for example, by a combination of methods described in WO 2009/091048, WO 2009/110606, and WO 2011/027808, or Nobuyuki Kurosawa. , Megumi Yoshioka, Rika Fujimoto, Fuminori Yamagishi and Masaharu Isobe, "Rapid production of antigen-specific monoclonal antibodies from a variety of animals", BMC Biology, 10:80, 2012 method) (MAGrahd) it can.
  • a recombinant cell expressing a complete antibody, a functional antibody fragment, a single chain antibody, or a multispecific antibody.
  • recombinant cells expressing fully human, humanized, or chimeric antibodies can be constructed.
  • recombinant cells expressing feline or canine antibodies can be constructed.
  • the present invention includes a method for producing a target substance, which comprises culturing the target cell selected from the second cell population by the above method and obtaining the target substance from the culture.
  • a known method can be used. For example, various chromatographies such as affinity, ion exchange and gel filtration can be adopted. Examples of the ligand in affinity chromatography include protein A, protein G, anti-FLAG antibody, anti-V5 antibody and the like.
  • the present invention includes a method for producing a pharmaceutical composition, which comprises combining the nucleic acid produced by the above method with a pharmaceutically acceptable carrier or additive to obtain a pharmaceutical composition containing the nucleic acid as an active ingredient. To do.
  • the present invention also provides a method for producing a pharmaceutical composition, which comprises combining the target substance produced by the above method with a pharmaceutically acceptable carrier or additive to obtain a pharmaceutical composition containing the target substance as an active ingredient. Including a method.
  • the target substance produced by the present invention is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition (therapeutic agent).
  • the pharmaceutical composition may include a target substance such as the antibody produced by the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • the pharmaceutical composition blocks or activates a target cell membrane protein-specific intracellular signal transduction mechanism.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally, systemically or locally.
  • the administration form include injection type, nasal administration type, pulmonary administration type, transdermal administration type and the like.
  • it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the target substance is an antibody
  • the dose of the antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per 1 kg of body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected within the range of 0.001 to 100000 mg antibody/body per patient. However, the dose of the antibody is not limited to these ranges.
  • the aforementioned pharmaceutical composition can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A).
  • the carrier or additive include surfactants (PEG, Tween, etc.), excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), colorants, flavors, preservatives, stabilizers, buffers (phosphoric acid). , Citric acid, other organic acids, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), suspending agents, isotonic agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, and corrigents.
  • Examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts and the like. It may also contain other low molecular weight polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulins; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride. It may be used in combination with a suitable solubilizing agent such as alcohol (ethanol or the like), polyalcohol (propylene glycol, PEG or the like), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) or the like.
  • ethanol ethanol or the like
  • polyalcohol propylene glycol, PEG or the like
  • nonionic surfactant polysorbate 80, HCO-50
  • the active ingredient, antibody may be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly[methylmethacrylic acid]) or colloid drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions). , Nanoparticles, nanocapsules, etc.) (see “Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980), etc.). Further, a technique is known in which an antibody is directly fused to another drug to enhance the therapeutic effect, and it can be applied to the pharmaceutical composition.
  • nucleic acid (gene) obtained in the present invention for example, an antibody gene
  • a gene therapy vector to prepare a gene therapy drug.
  • retrovirus vector in addition to direct administration by Naked plasmid, administration by packaging in liposome or the like, retrovirus vector, adenovirus vector, vaccinia virus vector, poxvirus vector, Method of incorporating into various viral vectors such as adeno-associated virus vector and HVJ vector (see Adolph “Viral Genome Method”, CRC Press, Florid (1996)), coating on a bead carrier such as colloidal gold particles (International Publication No. 93 /17706) and the like, and the like.
  • the gene therapeutic agent may be administered by any method as long as an antibody as an active ingredient is expressed in vivo and the action can be exerted.
  • a sufficient amount is administered by a suitable parenteral route.
  • Parenteral routes include intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intracutaneous, adipose tissue, mammary gland tissue, inhalation, or intramuscular route via injection, infusion, or gas-induced particle bombardment (electron gun). Etc.), a method via a mucosal route such as a nasal drug, and the like.
  • the gene therapeutic agent is administered to cells using ex vivo liposome transfection, particle bombardment (US Pat. No. 4,945,050), or viral infection, and the cells are reintroduced into the animal. May be administered by administration.
  • the present invention includes a reagent for detecting a desired cell membrane protein containing the target substance produced by the above method.
  • the antibody is brought into contact with blood cells of human origin or non-human mammal origin using a reagent containing the antibody (target substance) produced by the method of the present invention.
  • a labeling substance composed of a fluorescent substance or a dye is brought into direct or indirect contact.
  • the expression of the desired cell membrane protein can be detected by flow cytometry or a plate reader.
  • the expression of a desired cell membrane protein can be detected by bringing the above antibody into contact with a pathological tissue piece derived from human or non-human mammal.
  • kits for detecting a cell membrane protein containing the above reagents.
  • a kit for detecting a cell membrane protein can be constructed by combining the above reagent with a labeling substance or the like.
  • the present invention includes a method for detecting the desired cell membrane protein, which uses the target substance produced by the above method.
  • the present invention includes the use of the target substance produced by the above method for detecting the desired cell membrane protein.
  • Examples 1 to 8 below cells that produce a specific binding antibody to an apelin receptor (hereinafter sometimes abbreviated as APLNR), which is one of human GPCRs, were mainly selected. Furthermore, an antibody gene was isolated from the selected cells to construct a recombinant cell expressing the antibody. Furthermore, the functionality of the antibody expressed by the recombinant cells was evaluated.
  • APLNR apelin receptor
  • APLNR expression vector An artificial synthetic gene (SEQ ID NO: 1) was prepared by optimizing the human APLNR gene sequence (NM_005161.4) registered in Gene Bank to the mouse amino acid codon. Using this artificially synthesized gene, a vector pCI-APLNR-GroEL containing a fusion gene of human APLNR gene and GroEL gene was constructed in accordance with the method described in International Publication No. 2012/043533 (Japanese Patent No. 5315495). did.
  • Flp-In-CHO cells were cultured in Ham's F-12 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin. Lipofectamin 2000 was used to simultaneously introduce pEF-FRT-APLNR and pOG44 plasmid (Invitrogen) into these cells. From the day after the introduction, the medium was changed to Ham's F-12 medium containing 500 ⁇ g/mL hygromycin (Invitrogen), and the cells were cultured for 2 weeks while changing the medium every 3rd day. Hygromycin resistant cells were cloned from the formed colonies by the limiting dilution method.
  • Phycoerythrin (PE)-labeled anti-mouse IgG antibody (Beckman Coulter, Inc.) was used as a secondary antibody, and the obtained hygromycin-resistant cells and anti-apelin antibody (R&D) or anti-V5 tag antibody (Invitrogen) were used. Binding was analyzed by flow cytometer. As a result, it was confirmed that the obtained hygromycin-resistant cells were PE-positive and stably expressed human APLNR. Hereinafter, this cell is referred to as a human APLNR stably expressing CHO cell line (first cell).
  • (2-2) Preparation of cell population (second cell) containing antibody-producing cells from spleen
  • the spleen is excised from the mouse immunized with DNA in (2-1) and collected in a 6-well plate containing refrigerated HBSS. did. After removing the attached connective tissue and adipose tissue, the spleen was loosened in fresh HBSS to release lymphocytes. The cells were harvested and resuspended in 10 mL HBSS. After the unbroken tissue was separated with a cell strainer, the cells were collected by centrifugation at 2000 rpm for 5 minutes. The collected cells were suspended in 1 mL of hemolysis solution and incubated at 37° C. for 5 minutes to remove red blood cells.
  • Lymphocyte cells were collected by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. Using the EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit (STEMCELL TECHNOLOGIES), approximately 1.3 ⁇ 10 5 cells containing the candidate of the desired antibody-producing cells (target cells) from 2.5 ⁇ 10 7 of the above lymphocyte cells. The cell population (second cell) was isolated.
  • Cell fusion of splenocytes and myeloma cells was carried out using a cell fusion device ECFG21 (Neppagene). After cell fusion, RPMI1640 medium (FBS-containing, antibiotic-free) in an amount twice that of the cell solution was added, and the mixture was allowed to stand in a CO 2 incubator for 1 hour. The cells were collected by centrifugation and suspended in HAT medium (RPMI1640 with 10% FBS, 2-mercaptomethanol (x500), HFCS (x100), HAT (x50)). Antibody-producing hybridoma cells were cloned and cultured by a conventional method using a 96-well plate, a 24-well plate and a 10 cm dish.
  • HAT medium RPMI1640 with 10% FBS, 2-mercaptomethanol (x500), HFCS (x100), HAT (x50)
  • a microwell chamber ASMC30-20P (Azuwan) was prepared.
  • This microwell chamber is a substrate in which 84,640 microwells having a diameter of 30 ⁇ m are arranged at equal intervals in an area of about 1.5 cm ⁇ about 2.4 cm.
  • the depth of each microwell is equal to the diameter of the microwell.
  • the pitch between the microwells is twice the diameter of the microwells.
  • it is general to store and use one cell in a microwell. However, in this example, the experiment was performed by storing the first cell and the second cell, that is, two or more cells in the microchamber. This will be described below.
  • Human APLNR stable expression CHO cells (first cells) were suspended in F-12 medium (containing 10% FBS, Penicillin/Streptomycin) to prepare a cell suspension of 3 ⁇ 10 5 cells/500 ⁇ L. This cell suspension was filled in each microwell. The microchamber was centrifuged twice at 300 rpm for 2 minutes to prepare 1 or 2 first cells in each microwell. After washing the microchamber with F-12 medium, 500 ⁇ L of F-12 medium was added. After incubating at 37° C. for 1 hour in a CO 2 incubator, the first cells were allowed to adhere to the bottom surface of the microwell while maintaining the functionality as cells.
  • F-12 medium containing 10% FBS, Penicillin/Streptomycin
  • CytoRed solution adjusted to a concentration of 10 nM with F-12 medium was added, and the mixture was further incubated at 37°C for 1 hour to stain the first cells. After washing with F-12 medium three times to remove excess CytoRed, 1 mL of F-12 medium was filled in the microchamber.
  • the hybridoma (second cell) population prepared in Example 3 was cultured to prepare a cell suspension of 3 ⁇ 10 5 cells/500 ⁇ L. This cell suspension was filled in each microwell. The microchamber was centrifuged twice at 300 rpm for 2 minutes to prepare 1 or 2 second cells in each microwell. After washing the microchamber with a medium, an appropriate amount of the medium was added and incubated at 37° C. for 30 minutes to allow the antibody to be secreted from the hybridoma.
  • Alexa Fluor 488-labeled anti-mouse IgG antibody (secondary antibody; labeling substance) diluted 500 times with RPMI1640 (containing 10% FBS) was applied, and the mixture was incubated at 37°C for 30 minutes. Incubated. After washing three times with RPMI1640 (phenol red-free, 1% FBS-containing), 1 mL of RPMI1640 was added. A microchamber was set in a cell picking system (As One Co., Ltd.), and information of transmitted light images of all microwells and two types of fluorescence images were acquired.
  • CytoRed fluorescence was detected under the conditions of an excitation wavelength of 543 nm and a fluorescence wavelength of 593 nm.
  • the fluorescence detection of Alexa Fluor 488 was performed under the conditions of excitation wavelength 482 nm and fluorescence wavelength 536 nm.
  • FIGS. 2(a) to 2(c) are examples of images of hybridomas that produce an antibody that specifically binds to APLNR on the surface of the first cell, that is, positive microwells determined to contain the target cells.
  • FIGS. 3(a) to 3(c) are images of a hybridoma producing an antibody that does not specifically bind to APLNR on the surface of the first cell, that is, an image of a negative microwell in which it was determined that cells of the non-target were stored. This is an example. 2 and 3, (a) shows transmitted light, (b) shows fluorescence derived from CytoRed, and (c) shows fluorescence derived from Alexa Fluor 488.
  • the fluorescence of Alexa Fluor 488 was observed at the same position as the CHO cells labeled with CytoRed. That is, the CHO cells in the microwell coexisting with the target cells were co-stained with Alexa Fluor 488 and Cyto Red. From this, it was confirmed that the Alexa Fluor 488-labeled anti-IgG antibody was bound to the surface of the CHO cells.
  • hybridoma was aspirated using a capillary having a diameter of several ⁇ m to several tens of ⁇ m and collected in the cell lysate. Finally, at least 3 independent hybridomas were selected.
  • the selection of hybridoma which normally takes about 60 days, could be completed within 7 days.
  • the oligo dT magnet was washed with a washing solution, and then cDNA synthesis was performed by a reverse transcription reaction. After cleaning the magnet, a 5'terminal translational reaction was performed.
  • the gene of the antibody heavy chain variable region (VH region) and the gene of the antibody light chain variable region (VL region) were isolated and amplified by the 5'race PCR method. The PCR was performed twice in order to increase the specificity of the amplification product.
  • the first forward primer (SEQ ID NO: 3) that commonly amplifies the VH region and the VL region, the first reverse primer (SEQ ID NO: 4) that specifically amplifies the VH region, and the VL region were A second reverse primer (SEQ ID NO: 5) that specifically amplifies was mixed and used.
  • a second forward primer SEQ ID NO: 6
  • a third reverse primer SEQ ID NO: 7
  • a second forward primer SEQ ID NO: 6
  • a fourth reverse primer SEQ ID NO: 8
  • the gene for the VL region amplified in (5-1), the gene for the antibody light chain constant region, and the promoter region necessary for gene expression are fused using PCR to express a full-length antibody light chain.
  • An antibody expression unit was constructed. By introducing these antibody expression units into mammalian cells, recombinant cells that transiently express the desired antibody (IgG) can be obtained.
  • HEK293FT cells were co-administered with the above two antibody expression units. Introduced. That is, HEK293FT cells were seeded on a collagen-coated 96-well plate at 1.5 ⁇ 10 4 cells/100 ⁇ L/well. Lipofectamine 2000 was used to co-introduce the two antibody expression units constructed in (5-2) into HEK293FT cells. Cell supernatants were collected 3 days after the introduction and used for the binding evaluation of the expressed antibody.
  • This cell suspension was mixed with the cell supernatant recovered in (5-3) in a 96-well plate and incubated at 4° C. for 1 hour. After incubation, the cells were washed twice with 100 ⁇ L FACS buffer. A dilution of a fluorescently labeled anti-IgG antibody (secondary antibody) was added to each well in an amount of 50 ⁇ L and incubated at 4° C. for 1 hour to bind the secondary antibody to the antibody bound to the CHO cell surface. After washing the cells twice with 100 ⁇ L of FACS buffer, the cells were suspended in 80 ⁇ L of FACS buffer, and the fluorescence intensity on the cell surface was measured by the flow cytometry method.
  • a fluorescently labeled anti-IgG antibody secondary antibody
  • FIG. 4 shows the results of flow cytometry. That is, the antibody expressed by the recombinant cells obtained in (5-3) had binding properties to human APLNR-expressing CHO cells. The antibody did not show binding to wild type CHO cells that did not express APLNR. On the other hand, as shown in FIG. 5, in the comparative example using the unintended hybridoma recovered from the negative microwell, the antibody expressed by the recombinant cell did not have the binding property to the human APLNR stably expressing CHO cell. .. From the above, it was shown that the antibody obtained in this example has specific binding properties to human APLNR-expressing CHO cells.
  • CHO cells stably expressing human APLNR (first cells) were adhered to the bottom surface of the microwell in the same manner as in Example 4. Further, the first cells were stained with CytoRed, and 1 mL of F-12 medium was filled in the microchamber.
  • the lymphocyte (second cell) population prepared in Example 2 was suspended in RPMI1640 to prepare a cell suspension of 3 ⁇ 10 5 cells/500 ⁇ L. This cell suspension was filled in each microwell. The microchamber was centrifuged twice at 300 rpm for 2 minutes, and the second cell was prepared so that one or two secondary cells were stored in each microwell. After washing the microchamber with RPMI1640, 1 mL of RPMI1640 was added and incubated at 37° C. for 30 minutes to promote antibody production from lymphocytes.
  • Alexa Fluor 488-labeled anti-mouse IgG antibody (secondary antibody; labeling substance) diluted 500 times with RPMI1640 (containing 10% FBS) was applied, and the mixture was incubated at 37°C for 30 minutes. Incubated. After washing three times with RPMI1640 (phenol red-free, 1% FBS-containing), 1 mL of RPMI1640 was added. A microchamber was set in a cell picking system (As One Co., Ltd.), and information of transmitted light images of all microwells and two types of fluorescence images were acquired.
  • FIGS. 6(a) to 6(c) are examples of images of positive microwells in which it is determined that lymphocytes that produce an antibody that specifically binds to APLNR on the surface of the first cell, that is, target cells are stored. ..
  • FIGS. 7(a) to 7(c) are images of lymphocytes that produce antibodies that do not specifically bind to APLNR on the surface of the first cell, that is, images of negative microwells in which it was determined that cells of the non-target were stored. Is an example. 6 and 7, (a) shows transmitted light, (b) shows fluorescence derived from CytoRed, and (c) shows fluorescence derived from Alexa Fluor 488.
  • Alexa Fluor 488 fluorescence was observed at the same position as the CHO cells labeled with CytoRed. That is, the CHO cells in the microwell coexisting with the target cells were co-stained with Alexa Fluor 488 and Cyto Red. In particular, the fluorescence of Alexa Fluor 488 was strongly observed near the target cells (lymphocytes). From this, it was confirmed that the Alexa Fluor 488-labeled anti-IgG antibody was bound to the surface of the CHO cells.
  • the fluorescence of AlexaFluor488 is observed at the same position as the CHO cells labeled with CytoRed. None, it was only observed from the cell membrane surface of lymphocytes. That is, the Alexa Fluor 488-labeled anti-IgG antibody did not bind to the surface of the CHO cells, and the CHO cells were not co-stained with Alexa Fluor 488 and CytoRed. From this, it was confirmed that the Alexa Fluor 488-labeled anti-IgG antibody was not bound to the surface of the CHO cells.
  • lymphocytes were aspirated from the selected microwell using a capillary having a diameter of several ⁇ m to several tens ⁇ m and collected in a cell lysate. Finally, at least 14 independent antibody-producing lymphocytes confirmed to bind to the target substance by flow cytometry were selected.
  • selection of desired lymphocytes from direct lymph tissue could be completed in only one day without using the conventional hybridoma method that takes about 60 days.
  • FIG. 8 shows the result of flow cytometry. That is, the antibody expressed by the recombinant cells obtained in (7-3) had binding properties to human APLNR-expressing CHO cells. The antibody did not show binding to wild type CHO cells that did not express APLNR. On the other hand, as shown in FIG. 9, in a comparative example using unintended lymphocytes collected from negative microwells, the antibody expressed by the recombinant cells did not have binding ability to CHO cells stably expressing human APLNR. It was
  • Example 6 The same examination was performed for the other lymphocytes (13 types) selected in Example 6. As a result, all the antibodies had binding properties to human APLNR-expressing CHO cells. Furthermore, 12 of these did not show binding to wild-type CHO cells that did not express APLNR.
  • the antibody obtained in this example has a specific binding property to human APLNR-expressing CHO cells.
  • cells expressing a target substance that specifically binds to a cell membrane protein that is difficult to purify can be selected more rapidly and efficiently regardless of immortalization.
  • a specific binding substance eg, antibody
  • CHO cells stably expressing human GLP-1 receptor prepared by a method similar to that in Example 1 were suspended in F-12 medium (containing 10% FBS, Penicillin/Streptomycin) to give 3 ⁇ 10 5 cells. /500 ⁇ L of cell suspension was prepared. This cell suspension was filled in each microwell. The microchamber was centrifuged twice at 300 rpm for 2 minutes to prepare 1 or 2 first cells in each microwell.
  • Rats were immunized in the same manner as in Example 2.
  • An antibody-producing hybridoma fused with mouse myeloma was prepared in the same manner as in Example 3, and the antibody was purified from the medium.
  • a solution was prepared by diluting the purified antibody in F-12 medium (containing penicillin/streptomycin) to 500 nM. 400 ⁇ L of this solution was added to the microwells.
  • a solution containing no purified antibody was similarly added to another microwell. After the addition of the solution, the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to allow the reaction between the first cells and antibody binding.
  • a ligand (GLP-1) adjusted to 500 pM with F-12 medium (containing penicillin/streptomycin) was added (GLP-1 final concentration 250 pM), and the mixture was incubated at 37° C. for 1 hour to human GLP-1 receptor Was activated.
  • 600 ⁇ L of 4% paraformaldehyde phosphate buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes to immobilize the first cells.
  • 600 ⁇ L of 90% methanol that had been ice-cooled was added and left standing on ice for 15 minutes to permeabilize the first cells.
  • rabbit anti-phosphorylation-CREB (Clone 87G3) that recognizes phosphorylation of Ser133 diluted 100 times with antibody diluent (1X PBS, 1% BSA, 0.3% Triton X-100). ) 500 ⁇ L of antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY) was added. The mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour to carry out a primary antibody reaction.
  • 200 fluorescence-labeled secondary antibodies for detecting rabbit anti-phospho-CREB antibody are Alexa Fluor 488-labeled anti-rabbit IgG antibody and DyLight 650-labeled anti-rat IgG antibody for detecting rat-derived antibody, respectively.
  • 500 ⁇ L of a secondary antibody solution was prepared by diluting the antibody with a diluting solution of 500 times. After the completion of the primary antibody reaction, the microwell was washed with PBS, and 500 ⁇ L of the prepared secondary antibody solution was added. After standing at room temperature for 1 hour, each antibody was visualized. After washing the microwell with PBS, 1 mL of PBS was added.
  • a microchamber was set in the cell picking system, and information of a transmitted light image and two types of fluorescence images were acquired.
  • the fluorescence detection of Alexa Fluor 488 was performed under the conditions of an excitation wavelength of 482 nm and a fluorescence wavelength of 536 nm.
  • the fluorescence detection of DyLight650 was performed under the conditions of an excitation wavelength of 628 nm and a fluorescence wavelength of 692 nm.
  • the fluorescence derived from Alexa Fluor 488 is derived from phosphorylated CREB via the increase of intracellular cAMP by the addition of the ligand (GLP-1). That is, the fluorescence derived from Alexa Fluor 488 reflects the presence or absence of activation of cell membrane protein (GLP-1 receptor). When the GLP-1 receptor is activated, the fluorescence intensity derived from Alexa Fluor 488 increases.
  • the fluorescence derived from DyLight650 is derived from the antibody on the surface of the first cell. That is, the fluorescence derived from DyLight650 reflects the presence or absence of binding of the added antibody to the surface of the first cell. When the antibody binds to the surface of the first cell, the fluorescence intensity derived from DyLight650 increases.
  • Table 1 shows the fluorescence intensity derived from Alexa Fluor 488 and the fluorescence intensity derived from DyLight 650 for 8 microwells.
  • FIG. 10 is a photograph showing images of two microwells (No. 1 and No. 5), (a) transmitted light, (b) Alexa Fluor 488-derived fluorescence, and (c) DyLight 650. It is the result of observing the origin fluorescence.
  • the fluorescence derived from Alexa Fluor 488 is No. 1 microwell was weaker. Further, as shown in Table 1, No. The fluorescence intensity derived from Alexa Fluor 488 of No. 1 is It was about 1/3 of 5 (84.1 vs. 255). This is No. In the microwell of No. 1, GLP-1 function (activation of GLP-1 receptor) was inhibited, while in No. 1 microwell. It shows that GLP-1 function is not inhibited in 5 microwells.
  • the fluorescence derived from DyLight650 is No.
  • the microwell of 1 was stronger.
  • the fluorescence intensity derived from DyLight 650 of No. 1 is It was about 18 times that of 5 (166.78 vs. 9/11). This is No. In 1 microwell, it is shown that the added antibody is strongly bound to the surface of the first cell. In addition, No. The 5 microwells show that the antibody is not bound to the first cell surface.
  • the fluorescence intensity of DyLight 650 was low in the microwells with high fluorescence intensity derived from Alexa Fluor 488 (see No. 5 to No. 8). From the above results, the relative decrease in fluorescence intensity corresponding to the amount of phosphorylated CREB indicates that the increase in intracellular cAMP due to activation of human GLP-1 receptor is inhibited.
  • the microwell containing the antibody that specifically binds to the human GLP-1 receptor on the surface of the first cell and inhibits the function of the receptor it is possible to identify the microwell containing the antibody that promotes the function of the receptor by the same principle.
  • a second cell such as a hybridoma (eg, Example 4) or an antibody-producing lymphocyte cell (eg, Example 6) was placed in a microwell to give a functional antibody (target substance).
  • the microwell containing the target cells to be produced can be identified. Then, the target cell can be separated as a single cell from the identified microwell.
  • the functional antibody includes both an antibody that inhibits the function of the receptor and an antibody that promotes the function of the receptor.

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Abstract

所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、より迅速かつ効率的に選抜する技術が提供される。　複数のマイクロウェル２を有する基板１を提供する。各マイクロウェル２に標的細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞３を接着させる。各々のマイクロウェル２に、目的細胞の候補である１又は２個の第二細胞５を導入し、マイクロウェル２内で第一細胞３と共存させ、第二細胞５が分泌した目的物質６を第一細胞３に接触させる。目的物質６が結合した第一細胞３を含むマイクロウェル２を特定する。特定されたマイクロウェル２から、目的細胞として第二細胞５を回収する。目的物質６として抗体が例示される。標識物質７を加えて可視化してもよい。

Description

細胞の選抜方法、核酸の製造方法、組換え細胞の製造方法、目的物質の製造方法、医薬組成物の製造方法、及び試薬
　本発明は、細胞の選抜方法、核酸の製造方法、組換え細胞の製造方法、目的物質の製造方法、医薬組成物の製造方法、及び試薬に関する。
　Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、トランスポーター、イオンチャンネル、サイトカイン受容体等の細胞膜タンパク質は、様々な疾患に関わることが知られており、診断薬や医療用医薬品の標的分子として注目されている。細胞膜タンパク質は、細胞外の物質、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質等からなるリガンドと結合することで、その機能が活性化あるいは阻害されることにより、細胞機能や薬理機能を発現する。
　加えて、近年では、細胞膜タンパク質に結合する特異抗体や抗体様分子（抗体断片、一本鎖抗体、二重特異性抗体，又は薬剤結合抗体など）が注目され、診断薬や医療用医薬品としての開発が進んでいる。
　細胞膜タンパク質の中でも、特に複数回膜貫通型タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ、トランスポーター、イオンチャンネル等）に対する特異的結合物質（例えば、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、特異抗体等）が、医薬品として開発中である。しかし、医薬品として実用化されているものは限定的である。
　複数回膜貫通型タンパク質は、可溶性タンパク質（例えば、サイトカイン、ホルモン、酵素、核内受容体）と比べて疎水性構造を多く含むため、単離精製することが格段に難しい。加えて、自然界に存在する構造を維持し、かつ複数回膜貫通型タンパク質の機能を維持できることが証明されている精製例は、限定的である。一般的に、複数回膜貫通型タンパク質は、細胞の脂質２重膜中に存在する状態で、その機能性を発揮する。
　細胞膜タンパク質に対する特異的結合物質を探索する技術としては、例えば、細胞膜タンパク質の一部であって、細胞外に露出した可溶性ドメイン又は部分ペプチドを大量に製造および精製したものを用いる方法がある。例えば、精製された前記可溶性ドメイン又は部分ペプチドを９６ウェルプレートに固相化し、候補となる特異的結合物質との結合をＥＬＩＳＡ法などで評価することが挙げられる。しかしながら、このような方法で選抜された物質が、生体内に存在する標的細胞膜タンパク質に特異的かつ高い親和性を兼ね備えて結合するかは、保証されるものではない。したがって、診断薬や医療用医薬品の開発を目的として、細胞膜タンパク質に対する有用な特異的結合物質を探索する場合には、生体内での細胞膜タンパク質の立体構造を模すために、標的細胞膜タンパク質が生細胞の細胞膜上で発現されている哺乳動物細胞を用いることがより有効である。
　一方、ペプチドリガンド、タンパク質リガンド、特異抗体といった物質は、ヒトあるいは非ヒト動物由来の細胞や、遺伝子組み換え技術を応用した組換え細胞を培養することで、培養上清中に分泌させることができる。ここで、標的細胞膜タンパク質に特異的に結合する未知の物質を発見する場合には、異なる物質を生産する数千～数万種類の産生細胞集団（例えば、抗体生産ハイブリドーマライブラリー）を調査対象とする必要がある。しかし近年、新規物質を探索するために調べるべき産生細胞数がますます増加する傾向があり、数万～数千万種類の細胞の調査が必要なこともある。そのため、産生細胞の培養や維持にかかるコスト、探索にかかる時間、等において、従来技術は大きな課題を有している。
　所望の細胞膜タンパク質に対する特異的抗体を探索する従来技術としては、ハイブリドーマ培養とフローサイトメーターを組み合わせた手法がある。例えば、数千種類に及ぶハイブリドーマの培養上清を調製し、標的細胞膜タンパク質を細胞表面に発現するＣＨＯ細胞と接触させ、フローサイトメーターを用いて結合性を評価する。そして、陽性と判定されたハイブリドーマを回収し、限界希釈法にてさらに培養を行う。そして、フローサイトメーターを用いた結合性評価を繰り返し、２か月程度かけて、所望の特異的抗体を産生する細胞を同定することができる（例えば、特許文献１）。
　しかし、非ヒト動物にＧＰＣＲ等の細胞膜タンパク質を抗原として免疫した場合、親和性と特異性の両方が高い抗体の出現頻度は極めて低いことが知られている。そのような出現頻度が低い特異抗体を産生する目的細胞を選抜するには、ハイブリドーマ法では数十万～数百万種類の産生細胞を培養し評価する必要がある。そのため、ハイブリドーマ培養とフローサイトメーターを利用した従来の方法は、能力の限界に近づいていると考えられる。
　別の技術として、シングル細胞解析技術を応用した、特異的抗体産生細胞の同定法が開発されつつある（非特許文献１）。例えば、疎水性のマイクロドロップレット中に１個の抗体産生細胞と抗原タンパク質を封じ込める。そして、抗体産生細胞から分泌される抗体と抗原タンパク質の結合の有無を可視化し、マイクロ流路を持つ分析機器中で特異的抗体を産生する陽性細胞を含むマイクロドロップレットを分離することができる。
　非特許文献２には、マイクロドロップレットとマイクロ流路を応用した、特異的抗体産生細胞を同定する方法の原理が記載されている。
　しかしながら、この方法では、マイクロドロップレット中で抗体と抗原タンパク質の結合の有無を可視化する過程において、洗浄工程を加えることができない。そのため、細胞膜表面上に発現する量が極めて少ない細胞膜タンパク質を標的とする場合には、バックグラウンドの蛍光シグナルに比べ、抗体と抗原タンパク質の結合による蛍光シグナルが弱いため、前記結合の有無を確認することが困難であるといった欠点が報告されている（非特許文献１）。
　また、マイクロドロップレット中での細胞の生存維持、特に、不死化していない骨髄組織、脾臓、リンパ組織、血液細胞由来のＢリンパ球や形質細胞、の生存維持は非常に困難であり、細胞種ごとに厳密な制御が必要である。
　加えて、一般的には、陽性細胞を含むマイクロドロップレット中には複数の陰性抗体産生細胞も含まれる。そのため、モノクローナル抗体を樹立するためには、複数回、スクリーニング操作を実施する必要がある。
　さらに、抗体と標的細胞膜タンパク質の結合の有無を可視化するための方法は、標的細胞膜タンパク質ごとに最適化する必要があり、汎用的に実用化されるためには改良の余地が残されている。
　特許文献２には、スライドグラス上で、標的細胞膜タンパク質を発現する細胞集団と、候補の細胞集団とを接触させ、候補の細胞集団から標的細胞膜タンパク質に対する抗体を産生する細胞を同定する技術が記載されている。しかし、この方法も、前記した洗浄工程を行うことができないため、細胞膜表面上に発現する量が極めて少ない細胞膜タンパク質を標的とする場合には、抗体と細胞膜タンパク質との結合の有無を確認することが困難である。
　特許文献３には、精製された可溶性サイトカイン受容体タンパク質をコートしたマイクロウェルに抗体産生細胞の候補を導入し、細胞が分泌した抗体と可溶性サイトカイン受容体タンパク質との結合性をもって所望の抗体産生細胞を選抜する技術が開示されている。しかし前述したように、単離精製された受容体タンパク質が、生体内で機能を発揮する構造を維持しているとは限らない。さらに、精製困難な複数回膜貫通型タンパク質にこの方法を適用することは、極めて困難である。
国際公開第２０１２／０４３６３４号 国際公開第２００４／０５１２６８号 特許第４１４８３６７号公報
Fitzgerald V, Leonard P., "Single cell screening approaches for antibody discovery", Methods, 116:34-42, 2017 Shembekar et al., "Single-Cell Droplet Microfluidic Screening for Antibodies Specifically Binding to Target Cells", Cell Reports 22, 2206-2215, February 20, 2018
　上記のように、細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する細胞を、より迅速かつ効率的に選抜する技術は、未だ完成しているとは言い難い。さらに、評価する細胞の母集団数の増加に対応すべく、細胞培養操作を出来るだけ軽減する必要がある。そこで本発明は、細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する細胞を、より迅速かつ効率的に選抜する技術、並びに、当該技術で選抜された細胞を用いて、抗体等の目的物質を製造する技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、直径２０～３０μｍのマイクロウェル内で、標的細胞膜タンパク質を発現する細胞と、細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞の候補を共存させることにより、非常に短時間で目的細胞を選抜できることを見出した。
　本発明の１つの様相は、所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、第二細胞の集団から選抜する細胞の選抜方法であって、下記工程：
　ａ）複数のマイクロウェルを有する基板を提供する工程、
　ｂ）前記細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞を、各々の前記マイクロウェルに接着させる工程、
　ｃ）工程ｂ）に続いて、各々の前記マイクロウェルに、前記集団から単離された１又は２個の第二細胞を導入し、前記マイクロウェル内で前記第一細胞と前記第二細胞を共存させる工程、
　ｄ）工程ｃ）に続いて、前記目的物質が結合した第一細胞を含むマイクロウェルを特定する工程、
　ｅ）工程ｄ）で特定されたマイクロウェルから、前記目的細胞として前記第二細胞を回収する工程、
を包含する、細胞の選抜方法である。
　好ましくは、前記工程ｄ）は、前記目的物質が前記第一細胞に結合したことを可視化する可視化工程を包含する。
　好ましくは、前記可視化工程は、前記マイクロウェルに、前記目的物質に対して特異的に結合する標識物質を添加することを含む。
　好ましくは、前記標識物質が前記目的物質に対する標識抗体である。
　好ましくは、前記標識物質における標識が蛍光標識である。
　好ましくは、前記標識物質は、第一蛍光物質で標識された抗体であり、前記工程ｂ）は、前記マイクロウェルに接着している前記第一細胞を第二蛍光物質で標識する第一細胞標識工程を含み、第一蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長は、第二蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長と異なる。
　好ましくは、前記可視化工程は、前記目的物質が前記第一細胞に結合した際に起きる、前記細胞膜タンパク質の活性化に伴う細胞内情報伝達物質の変動を可視化することを含む。
　好ましくは、前記細胞膜タンパク質が複数回膜貫通型タンパク質である。
　好ましくは、前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現するベクターを導入した細胞である。
　好ましくは、前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現する腫瘍細胞である。
　好ましくは、前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現する非腫瘍細胞である。
　好ましくは、前記目的物質が抗体である。
　好ましくは、前記第二細胞が、前記細胞膜タンパク質又はそれをコードする核酸で免疫した非ヒト動物由来の骨髄、脾臓、リンパ組織、又は血液細胞由来である。
　好ましくは、前記第二細胞が不死化された細胞である。
　好ましくは、前記第二細胞がハイブリドーマである。
　好ましくは、前記第二細胞が、ヒトのリンパ組織又は血液由来である。
　好ましくは、前記第二細胞が、エプスタイン・バール・ウイルス感染により不死化された細胞である。
　好ましくは、前記第二細胞が、外来性の抗体遺伝子を有し、当該抗体を発現する組換え細胞である。
　好ましくは、前記抗体が、完全抗体、機能的抗体断片、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体である。
　好ましくは、前記抗体が、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。
　好ましくは、前記抗体が、ネコ化抗体又はイヌ化抗体である。
　本発明の他の様相は、上記の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞から、前記目的物質をコードする核酸を取得する、核酸の製造方法である。
　好ましくは、前記目的物質が抗体である。
　本発明の他の様相は、上記の方法によって製造された核酸を宿主細胞に導入し、前記目的物質を発現する組換え細胞を取得する、組換え細胞の製造方法である。
　本発明の他の様相は、上記の方法によって製造された組換え細胞を培養し、その培養物から前記目的物質を取得する、目的物質の製造方法である。
　本発明の他の様相は、上記の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞を培養し、その培養物から前記目的物質を取得する、目的物質の製造方法である。
　好ましくは、前記目的物質が抗体である。
　本発明の他の様相は、上記の方法によって製造された核酸に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記核酸を有効成分として含有する医薬組成物を取得する、医薬組成物の製造方法である。
　本発明の他の様相は、上記方法によって製造された目的物質に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記目的物質を有効成分として含有する医薬組成物を取得する、医薬組成物の製造方法である。
　本発明の他の様相は、上記方法によって製造された目的物質を含む、前記所望の細胞膜タンパク質を検出するための試薬である。
　本発明によれば、細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する細胞を、より迅速かつ効率的に選抜することができる。さらに、細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質、例えば抗体を、容易に製造することができる。
本発明の一態様に係る細胞の選抜方法の概要を表す説明図であり、（ａ）～（ｅ）は各ステップを表す。 実施例４における陽性マイクロウェルの画像の一例を表す写真であり、（ａ）は透過光、（ｂ）はCytoRed由来の蛍光、（ｃ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光を観察した結果である。 実施例４における陰性マイクロウェルの画像の一例を表す写真であり、（ａ）は透過光、（ｂ）はCytoRed由来の蛍光、（ｃ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光を観察した結果である。 実施例５における陽性マイクロウェルから回収したハイブリドーマ由来の遺伝子組み換え抗体をフローサイトメトリーに供した結果を表す図である。 実施例５における陰性マイクロウェルから回収したハイブリドーマ由来の遺伝子組み換え抗体をフローサイトメトリーに供した結果を表す図である。 実施例６における陽性マイクロウェルの画像の一例を表す写真であり、（ａ）は透過光、（ｂ）はCytoRed由来の蛍光、（ｃ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光を観察した結果である。 実施例６における陰性マイクロウェルの画像の一例を表す写真であり、（ａ）は透過光、（ｂ）はCytoRed由来の蛍光、（ｃ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光を観察した結果である。 実施例７における陽性マイクロウェルから回収したリンパ球由来の遺伝子組み換え抗体をフローサイトメトリーに供した結果を表す図である。 実施例７における陰性マイクロウェルから回収したリンパ球由来の遺伝子組み換え抗体をフローサイトメトリーに供した結果を表す図である。 実施例９におけるマイクロウェルの画像の一例を表す写真であり、（ａ）は透過光、（ｂ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光、（ｃ）はDyLight 650由来の蛍光を観察した結果である。
　本発明の細胞の選抜方法は、所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、第二細胞の集団から選抜するものである。以下、前記目的細胞を、陽性細胞と称することがある。また前記所望の細胞膜タンパク質を「標的細胞膜タンパク質」と称することがある。また前記目的物質を、「細胞膜タンパク質に対する特異的結合物質」、または単に「特異的結合物質」と称することがある。また本発明において、「細胞を選抜する」という文言は「細胞を同定する」と言い換えることができる。
　図１に、本発明の一態様に係る細胞の選抜方法の概略を示す。（ａ）は複数のマイクロウェル２を有する基板１を表す。（ｂ）はマイクロウェル２に第一細胞３を接着させた状態を表す。（ｃ）はマイクロウェル２内で第一細胞３と第二細胞５を共存させた状態を表す。（ｄ）は第二細胞５が分泌した目的物質６が、第一細胞３の表面に結合した状態を表す。（ｅ）は第一細胞３の表面の目的物質６に、標識物質７が結合した状態を表す。
＜基板とマイクロウェル＞
　本発明では、複数のマイクロウェルを有する基板を用いる。マイクロウェルとは、哺乳動物細胞や鳥類細胞が１～３個程度入る微小サイズのウェル（窪み、凹部）を指す。マイクロウェルは有底の微小な穴であり、例えばその開口部の内径は１０μｍ～５０μｍ程度、深さは開口部の内径と同程度である。
　マイクロウェルの形状は、典型的には円筒形である。その他、四角柱、六角柱等の多角柱のような複数の平面で構成される筒状や、逆円錐形や逆角錐形等のすり鉢状であってもよい。また、これらの形状を２つ以上組み合わせて連結させた形状でもよい。逆円錐形や逆角錐形の場合は、錐の底面部分がマイクロウェルの開口部となり、頂点の一部が切り取られたような形状（すなわち、円錐台状や角錐台状）とすることができる。
　マイクロウェルが円筒形の場合、その開口部の直径（内径）は、マイクロウェルに格納する細胞の種類や数を考慮して適宜決定することができる。第一細胞がＣＨＯ細胞、第二細胞が非ヒト動物由来のＢリンパ球又は形質細胞である場合は、直径が２０μｍ～４０μｍ程度であることが好ましい。また、マイクロウェルの深さは、開口部の直径と同程度であることが好ましい。
　基板上の単位面積あたりのマイクロウェル数（密度）としては特に限定はなく、例えば、１回あたりに探索する第二細胞の総数と目的細胞の発現頻度を考慮して適宜決定することができる。例えば、１ｃｍ２あたり２０，０００個～２００，０００個の範囲とすることができる。
　基板上におけるマイクロウェル間の距離（ピッチ）としては特に限定はなく、隣接するマイクロウェルに影響を与えない範囲で適宜設定することができる。例えば、マイクロウェルが円筒型の場合、隣接するマイクロウェルの開口部中心間の距離は、開口部直径の１．５～３倍程度であることが好ましい。
　基板の材質としては特に限定はないが、後述する可視化工程を行う場合は、自家蛍光を有しない透明の材質であることが好ましい。
　複数のマイクロウェルを有する基板は市場から入手可能である。例えば、直径１０μｍ、２０μｍ、又は３０μｍの複数のマイクロウェルを有する基板（マイクロウェルチャンバー）がアズワン社から市販されている。
＜標的細胞膜タンパク質＞
　本発明における標的細胞膜タンパク質としては特に限定はなく、複数回膜貫通型タンパク質に代表される全ての細胞膜タンパク質が対象となりうる。例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、トランスポーター、ＣＤ抗原、細胞接着分子、癌抗原、ウイルス抗原などが対象となりうる。また細胞膜タンパク質の由来動物種に特に限定はない。また本発明では、精製法が確立していない、大量精製が困難、天然に存在する構造を維持した形での単離精製が困難、等の事情を有する細胞膜タンパク質であって、その一部が脂質２重膜層から細胞外に露出しているタンパク質、が対象となりうる。
＜第一細胞＞
　本発明では、所望の細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞を、マイクロウェルに接着させて使用する。
　第一細胞としては、所望の細胞膜タンパク質が細胞表面に発現するものであれば、特に限定はない。一つの実施形態として、標的細胞膜タンパク質を発現するベクターを導入した組換え細胞が挙げられる。例えば、完全長の標的細胞膜タンパク質の遺伝子を、適当な発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ、ｐＥＦ/ＦＲＴ/Ｖ５－ＤＥＳＴ等）に挿入する。そして、このベクターをＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの細胞に導入し、標的細胞膜タンパク質を細胞膜上に一過的又は安定的に発現する組換え細胞を取得する。この組換え細胞を第一細胞として用いることができる。この場合、標的細胞膜タンパク質の細胞膜上での発現量が、発現ベクターを有さない細胞と比較して、５倍以上に増強されていることが好ましい。
　他の実施形態として、標的細胞膜タンパク質が正常細胞に比べて過剰に発現している腫瘍細胞を、第一細胞として用いることができる。腫瘍細胞としては、例えば、手術摘出臓器から単一細胞化したものを用いることができる。その他、腫瘍細胞は、ＡＴＣＣや細胞販売会社から入手することができる。
　他の実施形態として、標的細胞膜タンパク質が発現している正常組織、例えば非ヒト又はヒト組織、に由来する各種の細胞（非腫瘍細胞）を、第一細胞として用いることができる。例えば、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、免疫細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、リンパ球細胞、皮膚細胞、などを第一細胞として用いることができる。また、血液細胞を公知の方法でｉＰＳ化した後、特定の組織細胞に分化させたものを第一細胞として用いてもよい。
＜目的物質＞
　本発明では、所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、第二細胞の集団から選抜する。前記目的物質（特異的結合物質）には、特定の細胞膜タンパク質に選択的に結合する、構造が既知又は未知のポリペプチド、環状ペプチド、タンパク質が含まれる。より具体的には、ペプチドホルモン、サイトカイン、抗体、人工ポリペプチド、人工環状ペプチド、等からなる特異的結合物質が含まれる。
＜第二細胞＞
　本発明では、マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させる。以下、第二細胞について具体的に説明する。
　まず、目的物質（特異的結合物質）が抗体以外である場合、換言すれば、第二細胞が抗体産生細胞以外である実施形態について説明する。
　第二細胞としては、所望の目的物質を生産することが予想される細胞であれば、特に限定はない。例えば、非ヒト又はヒト組織由来の各種の細胞、例えば血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、免疫細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、リンパ球細胞、皮膚細胞などを、第二細胞として用いることができる。例えば、非ヒト動物の組織を分離し、コラーゲナーゼ処理等の後、３０～１００μｍのメッシュでろ過し、単一細胞化したものを、第二細胞として用いることができる。例えば、ヒトの血液や手術摘出臓器から単一細胞化したものを、第二細胞として用いることができる。さらに、腫瘍細胞を第二細胞として用いることができる。腫瘍細胞は、例えば、手術摘出臓器から単一細胞化したものを用いることができる。その他、腫瘍細胞は、ＡＴＣＣや細胞販売会社から入手することができる。
　組換え細胞を第二細胞として用いることができる。例えば、目的物質をコードする遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを、ｐｃＤＮＡ、ｐＥＦ/ＦＲＴ/Ｖ５－ＤＥＳＴ、Mammalian PowerExpress System、などの発現ベクターに組み込む。そして、このベクターを一過的に、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞などの細胞に導入し、組換え細胞を得る。この組換え細胞を、第二細胞として用いることができる。さらに、前記組換え細胞において、ベクターに保持されている薬剤耐性遺伝子を用いて生存した、恒常的に遺伝子発現する組換え細胞を、第二細胞として用いることができる。また、アデノウイルス、レンチウイルス等に由来するウイルスベクターにｃＤＮＡライブラリーを組み込み、これをＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等に感染させたものを第二細胞として用いることができる。
　組換え細胞を第二細胞として用いる場合は、組換え細胞には１種類の目的物質をコードする遺伝子が導入されていることが好ましい。
　次に、目的物質（特異的結合物質）が抗体である場合、換言すれば、第二細胞が抗体産生細胞である実施形態について説明する。
　本発明において「抗体」という文言は、「免疫グロブリン」と置き換えることができる。本発明における抗体には、その機能的断片が含まれる。ここで「抗体の機能的断片」とは、抗体（すなわち免疫グロブリン）の部分断片であって、抗原に対する作用を少なくとも１つ保持するものを指す。前記部分断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、ＶＨ－ＶＬ）、ＶＨ、及びこれらの重合体、並びに、これらと重鎖ＣＨ３領域との融合体等が挙げられる。さらに本発明における抗体は、多重特異性抗体であってもよい。その例としては、二重特異性抗体の一種であるダイアボディ（Diabody）（例えば、国際公開第９３／１１１６１号）が挙げられる。本発明における抗体のクラス（アイソタイプ）は特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、抗体のサブクラスについても特に限定はない。例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のいずれのサブクラスであってもよい。さらに抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体のいずれの抗体であってもよい。
　ヒトのリンパ組織や血液に由来するＢ細胞や形質細胞等の抗体産生細胞を、第二細胞として用いることができる。例えば、健常人、がんに罹患した患者、既知あるいは未知の感染症に罹患した患者、自己免疫疾患に罹患した患者、ワクチンを接種した者、等から採取したＢ細胞や形質細胞を、第二細胞として用いることができる。
　なお、より効率よく標的細胞膜タンパク質に対する抗体産生細胞を同定するために、細胞濃縮を行ってもよい。例えば、標的細胞膜タンパク質で免疫した非ヒト動物由来の骨髄、脾臓、リンパ組織、又は血液細胞から得た活性化Ｂ細胞又は形質細胞を濃縮し、これを第二細胞の集団として用いることができる。例えば、ヒトのリンパ組織や血液由来細胞から得た活性化Ｂ細胞又は形質細胞を濃縮し、これを第二細胞の集団として用いることができる。活性化Ｂ細胞又は形質細胞の濃縮は、例えば、細胞表面のＣＤ抗原を指標として行うことができる。例えば、特定のＣＤ抗原に対する抗体磁気ビーズを用いることができる。ＣＤ抗原の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９０．２、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、が挙げられる。濃縮の程度としては、例えば、約１０，０００，０００個のリンパ組織由来のリンパ球細胞集団から、活性化Ｂ細胞又は形質細胞を５０倍以上に濃縮することが挙げられる。
　非ヒト動物を標的細胞膜タンパク質で免疫する方法については、Hutchings CJ, Koglin M, Olson WC, Marshall FH，"Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupled receptors", Nat Rev Drug Discov. 16(9)，2017. に示されているように様々な方法がある。例えば、細胞表面に露出している部分ペプチドや部分タンパク質を合成し、これを抗原として免疫する方法が挙げられる。また、細胞から標的細胞膜タンパク質を界面活性剤で可溶化して精製し、これを抗原として免疫する方法が挙げられる。また、標的細胞膜タンパク質を高発現した細胞自体を直接免疫する方法が挙げられる。また、人工２重膜やウイルス様ナノ粒子上に標的細胞膜タンパク質を提示したものを抗原として免疫する方法が挙げられる。さらに、タンパク質発現ベクターに標的細胞膜タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を挿入したベクターを免疫する方法（ＤＮＡ免疫）が挙げられる。このうち、ＤＮＡ免疫が、より特異的で高親和性の抗体を取得できる可能性があるので好ましい。
　ハイブリドーマ等の不死化した細胞を第二細胞として用いることができる。例えば、標的細胞膜タンパク質で免疫した非ヒト動物から免疫細胞を採取し、これをミエローマと細胞融合することによってハイブリドーマを得る。このハイブリドーマを、第二細胞として用いることができる。細胞融合、ハイブリドーマの選抜、クローニングについては、公知の方法を使用することができる。例えば、細胞融合はポリエチレングリコールを用いる方法や、免疫細胞とミエローマの混合液に電圧をかける方法により行うことができる。また、ハイブリドーマの選抜は、ＨＡＴ選択培地を用いた培養により行うことができる。
　ハイブリドーマ法以外の方法でも細胞を不死化することができる。例えば、ヒトのリンパ組織や血液に由来するＢ細胞の場合は、エプスタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）感染で不死化した細胞も、第二細胞として用いることができる。
　抗体遺伝子が導入された組換え細胞を第二細胞として用いることができる。例えば、免疫動物のリンパ組織や血液細胞に由来するＢ細胞や形質細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製する。このｃＤＮＡライブラリーから、抗体あるいは抗体断片の遺伝子を選択的に増幅する。完全抗体、機能的抗体断片、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体などの様々な形態の抗体分子を発現できるように、増幅した遺伝子を改変し、抗体遺伝子ライブラリーを作製する。この遺伝子ライブラリーを、ｐｃＤＮＡ、ｐＥＦ/ＦＲＴ/Ｖ５－ＤＥＳＴ、Mammalian PowerExpress System、などのベクターに組み込む。そして、このベクターを一過的に、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞などの細胞に導入し、組換え細胞を得る。この組換え細胞を、第二細胞として用いることができる。さらに、前記組換え細胞において、ベクターに保持されている薬剤耐性遺伝子を用いて生存した、恒常的に遺伝子発現する組換え細胞を、第二細胞として用いることができる。
　第二細胞の由来となる動物種としては特に限定はないが、哺乳動物細胞又は鳥類細胞が好ましく用いられる。哺乳動物としてはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、アルパカ等を挙げることができる。また、鳥類の例としては、ニワトリ、アヒル又は七面鳥を挙げることができる。
＜第一細胞の接着＞
　本発明では、上記した第一細胞をマイクロウェルに接着させる。これにより、第一細胞が、その細胞機能を損なうことなくマイクロウェル内に格納及び固定化される。マイクロウェルに接着させる第一細胞の数は、第二細胞を受け入れるスペースを確保できるものであれば限定されないが、好ましくは１～２個である。
＜第一細胞と第二細胞の共存＞
　本発明では、第一細胞が接着したマイクロウェルに１又は２個の第二細胞を導入し、第一細胞と第二細胞を共存させる。これにより、第二細胞が生産した（分泌した）目的物質が、第一細胞の表面に接触する。マイクロウェルには１個の第二細胞を導入することが好ましい。
　マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させた後、所定の条件でインキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、例えば、第二細胞が生産する目的物質の性質と第二細胞の生存時間を考慮して決定することができる。例えば、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ又は細胞培養液（例えばＲＰＭＩ培地、ＨＡＭ Ｆ－１２培地など）に必要に応じて牛血清、成長因子、特異的結合物質の産生を亢進させるサイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－２１、ＴＮＦ，ＩＦＮγ、ＣＤ４０リガンドなど）を添加し、２５～３７℃で１５分～６時間インキュベートすることが好ましい。
＜陽性マイクロウェルの特定＞
　マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させ、必要に応じてインキュベートした後、目的物質が結合した第一細胞を含むマイクロウェル（陽性マイクロウェル）を特定する。換言すれば、各マイクロウェルにおける、第一細胞の表面に発現した標的細胞膜タンパク質と、第二細胞から分泌された物質との結合の有無を検出する。
　第一細胞と目的物質との結合の有無を検出する方法としては、例えば、可視化による方法が好ましく用いられる。すなわち好ましい実施形態では、前記特異的結合物質が前記第一細胞に結合したことを可視化する可視化工程を包含する。
　前記可視化の手法としては特に限定はない。１つの例として、第一細胞の表面を可視化する直接的手法が挙げられる。別の例として、前記目的物質が前記第一細胞に結合した際に起きる、前記細胞膜タンパク質の活性化に伴う細胞内情報伝達物質の変動を可視化する間接的手法が挙げられる。
　前記直接的手法としては、目的物質に対して特異的に結合する標識物質を用いる方法が挙げられる。すなわち、マイクロウェル内で第二細胞と共存している第一細胞に対して、前記標識物質を接触させる。前記標識物質は、例えば標識抗体である。
　具体的手順を例示すると、まず、上記したｃＤＮＡライブラリーを作製する際に、特異的結合物質にタグ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｖ５）や抗体のＦｃ部分が付与されるように設計する。そして、このｃＤＮＡライブラリーをＣＨＯ細胞等に導入した組換え細胞を、第二細胞として用いる。タグが付与された目的物質に対しては、当該タグに対する標識抗体（例えば、標識抗ＦＬＡＧ抗体、標識抗Ｖ５抗体）を用いることができる。Ｆｃ部分が付与された目的物質に対しては、標識抗Ｆｃ抗体（例えば、標識抗ＩｇＧ抗体）を用いることができる。具体的操作としては、マイクロウェル内で第一細胞と第二細胞を共存させた後、必要に応じて所定の条件でインキュベートし、その後、標識物質を添加する。
　前記標識としては、蛍光物質（蛍光複合体）、蛍光タンパク質、酵素、等による標識を採用することができる。
　前記蛍光物質としては、Alexa Fluor（登録商標）、Aqua、Texas Red（登録商標）、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、Cascade Blue（登録商標）、フィコエリトリン、DyLight（登録商標）等が挙げられる。好ましくは、Alexa Fluor 488が用いられる。
　蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。
　前記酵素としては、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、等が挙げられる。
　標識物質（例えば、標識抗体）が発する強いシグナルを指標として、目的物質が結合した第一細胞を検出することができる。そして、標識の特性に合わせて、陽性シグナルを含むマイクロウェル（陽性マイクロウェル）を蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、倒立顕微鏡又はこれらの顕微操作装置を包含した機器を用いて特定することができる。
　一方、間接的手法は、例えば、特異的結合物質が細胞膜タンパク質の機能を促進する物質（例えば、内在性リガンドや、アゴニスト活性を保有すると考えられるポリペプチド、環状ペプチド、抗体、タンパク質など）である場合に適用できる。具体的手順を例示すると、標的細胞膜タンパク質を発現している第一細胞に、標的細胞膜タンパク質の活性化に伴う細胞内情報伝達物質の変動を可視化できるレポーター遺伝子を予め導入しておく。そうすると、目的物質が標的細胞膜タンパク質に結合したとき、レポーター遺伝子の発現の変化を可視化できる。その結果、細胞膜タンパク質と目的物質との結合を間接的に可視化することができる。例えば、プロメガ社製のpGL4 Signaling Vectorシリーズと発光基質としてルシフェリンを使うことで、間接的に可視化することができる。そして、発光顕微鏡又は発光顕微鏡を包含した機器を用いて、陽性マイクロウェルを特定することができる。
　間接的手法に適用できる他の例として、細胞内のｃＡＭＰの変動を可視化することが挙げられる。例えば、細胞内のｃＡＭＰ量の変動は、細胞膜タンパク質を活性化する物質を添加した際に見られるＣＲＥＢ（cAMP response element binding protein）の特異的リン酸化を、抗リン酸化抗体と蛍光標識された２次抗体とで検出することができる。また、さらに他の例として、細胞内のＣａの変動を可視化することが挙げられる。細胞内のＣａの変動は、細胞内蛍光Ｃａ指示薬の蛍光強度の変化をもって、間接的に可視化することができる。
　標識物質を添加する前に、第一細胞を予め蛍光標識しておくことにより、陽性マイクロウェルをより簡便かつ迅速に特定することができる。例えば、前記標識物質として蛍光物質（第一蛍光物質）で標識された抗体を採用し、第一細胞を別の蛍光物質（第二蛍光物質）で標識する。ここで、第二蛍光物質として、第一蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長と異なる蛍光を発するものを採用する。すなわち、第一蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長は、第二蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長と異なる。例えば、第二蛍光物質として、Calcein-AM、Fluorescein diacetate (FDA)、Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)、CytoRed、Propidium iodide (PI)、Ethidium bromide (EB)、Acridine orange (AO)、DAPI、Hoechst 33342、又はHoechst 33258を用いる。一方、第一蛍光物質としてAlexa Fluor 488を用いる。これにより、標識抗体が結合した第一細胞と、標識抗体が結合していない第一細胞とを、発する蛍光の違いをもって容易に区別できる。そして、蛍光顕微鏡又は蛍光顕微鏡を包含した機器を用いて、陽性マイクロウェルを特定することができる。
　抗体は通常、細胞外に分泌されるものであるが、細胞外に分泌されない膜型抗体が存在することが知られている。したがって、分泌されない膜型抗体が第二細胞の表面に存在することもあり得る。この場合、標識抗ＩｇＧ抗体を添加すると、第一細胞に結合した抗体のみならず、第二細胞上の膜型抗体にも結合してしまうおそれがある。しかし、上記した第一蛍光物質と第二蛍光物質を用いる実施形態によれば、第一細胞に結合した抗体のみを特異的に検出できる。
　可視化工程において、標識物質を添加した後、余剰の標識物質を除去するために洗浄工程を行うことが好ましい。洗浄は、マイクロウェル内に第一細胞と第二細胞が保持される条件（第一細胞と第二細胞が流失しない条件）で行うものであれば特に限定はない。例えば、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ、又は細胞培養液で数回、マイクロウェルを穏やかに洗浄することが挙げられる。洗浄工程を含むことにより、標的細胞膜タンパク質の第一細胞の細胞膜上の発現量が極めて低い場合においても、目的物質が標的細胞膜タンパク質に結合したシグナルを高感度で検出することができる。
＜第二細胞の回収＞
　陽性マイクロウェルを特定した後、目的細胞として第二細胞を回収する。マイクロウェルからの第二細胞の回収は、例えば、マイクロマニュピレーターを用いて行うことができる。例えば、直径が数μｍから５０μｍのキャピラリーを陽性マイクロウェルに挿入し、第二細胞を生きたまま吸引し、回収することができる。マイクロマニュピレーターによる操作は、自動と手動とを問わない。例えば、セルピッキングシステム（アズワン社）やCellCelector (Automated Lab Solution社)を用いて回収することが出来る。
　回収した第二細胞は、適切な細胞培養用の培地内、あるいはｍＲＮＡを分解させず素早く抽出するための細胞溶解液（Lysis緩衝液）内に回収することが好ましい。
　なお、陽性マイクロウェルに２個の第二細胞が導入されていた場合は、例えば、細胞培養用の培地内に２個の第二細胞を回収後、両者を分離し、いずれか一方を目的細胞として採用すればよい。あるいは、Lysis緩衝液内に２個の第二細胞を回収後、２種類の目的物質をコードする核酸を以下に述べる方法で取得単離し、いずれか一方の核酸を目的核酸（目的遺伝子）として採用することができる。
＜核酸、組換え細胞、特異的結合物質の製造方法＞
　本発明は、上記の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞から、目的物質をコードする核酸（遺伝子）を取得する核酸の製造方法を包含する。また本発明は、当該核酸を宿主細胞に導入し、目的物質を発現する組換え細胞を取得する組換え細胞の製造方法を包含する。さらに本発明は、当該組換え細胞を培養し、その培養物から目的物質を取得する目的物質の製造方法を包含する。好ましくは、前記目的物質は抗体である。
　第二細胞から目的物質をコードする核酸を取得する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、逆転写反応とＰＣＲ法を組み合わせてｃＤＮＡを合成する。そして当該ｃＤＮＡから、目的の核酸を単離することができる。
　目的物質を発現する組換え細胞を取得する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、単離した目的の核酸を適宜のベクターに組み込む。このベクターを大腸菌、酵母、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＮＳＯ細胞）などの宿主細胞に導入し、目的の組換え細胞を取得することができる。
　そして、当該組換え細胞を培養し、その培養物（例えば、培養上清）から目的物質を取得することができる。
　目的物質が抗体である場合について、さらに説明する。第二細胞からの抗体遺伝子の単離は、例えば、国際公開第２００９／０９１０４８号、国際公開第２００９／１１０６０６号、及び国際公開第２０１１／０２７８０８号に記載の方法の組み合わせによって、又は、Nobuyuki Kurosawa, Megumi Yoshioka, Rika Fujimoto, Fuminori Yamagishi and Masaharu Isobe, "Rapid production of antigen-specific monoclonal antibodies from a variety of animals", BMC Biology, 10:80, 2012に記載の方法（MAGrahd法）によって、行うことができる。
　単離した抗体遺伝子に改変を加え、完全抗体、機能的抗体断片、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体を発現する組換え細胞を構築することができる。同様に、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体を発現する組換え細胞を構築することができる。同様に、ネコ化抗体又はイヌ化抗体を発現する組換え細胞を構築することができる。
　第二細胞自体が安定的に培養可能な場合には、第二細胞自体を培養して、その培養物から抗体等の目的物質を取得することもできる。すなわち本発明は、上記の方法で第二細胞の集団より選抜された目的細胞を培養し、その培養物から目的物質を取得する目的物質の製造方法を包含する。
　培養物から抗体等の目的物質を精製する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを採用することができる。アフィニティクロマトグラフィーにおけるリガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗ＦＬＡＧ抗体、抗Ｖ５抗体、等が挙げられる。
＜医薬組成物の製造方法＞
　本発明は、上記の方法によって製造された核酸に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記核酸を有効成分として含有する医薬組成物を取得する医薬組成物の製造方法を包含する。また本発明は、上記の方法によって製造された目的物質に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記目的物質を有効成分として含有する医薬組成物を取得する医薬組成物の製造方法を包含する。
　本発明により製造された目的物質、例えば抗体は、医薬組成物（治療剤）の有効成分として有用である。前記医薬組成物は、本発明により製造された抗体等の目的物質と、薬学的に許容される担体や添加物とを含むことができる。好ましくは、前記医薬組成物は、標的細胞膜タンパク質特異的な細胞内情報伝達機構を遮断あるいは活性化するものである。
　前記医薬組成物は、経口あるいは非経口的に、全身あるいは局部的に投与することができる。投与の形態としては、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の場合には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより、全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢や症状により、適宜、投与方法を選択することができる。目的物質が抗体の場合、抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、例えば、患者あたり抗体０．００１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、抗体の投与量は、これらの範囲に限定されるものではない。
　前記医薬組成物は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。前記担体あるいは添加物の例としては、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等が挙げられる。また、その他の低分子量のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン等のアミノ酸、を含んでいてもよい。
　前記医薬組成物を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０）等と併用してもよい。また、必要に応じて、有効成分である抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル等）とすることもできる（"Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。
　さらに、抗体に他の薬剤を直接融合させて治療効果を高める技術が知られており、前記医薬組成物に適用し得る。
　また本発明で得られた核酸（遺伝子）、例えば抗体遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療薬とすることも考えられる。当該遺伝子治療薬（組換えベクター）の投与方法としては、Ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングして投与する方法、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターに組み込んで投与する方法（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（国際公開第９３／１７７０６号等）して投与する方法、等が挙げられる。
　すなわち、前記遺伝子治療薬は、生体内において有効成分たる抗体が発現され、その作用を発揮できる限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路により十分な量が投与される。非経口経路としては、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入、又は筋肉内の経路を介した、注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法、等が挙げられる。さらに、前記遺伝子治療薬は、ｅｘ　ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより投与してもよい。
＜細胞膜タンパク質検出用試薬＞
　本発明は、上記の方法によって製造された目的物質を含む、所望の細胞膜タンパク質を検出するための試薬を包含する。例えば、本発明の方法によって製造された抗体（目的物質）を含む試薬を用いて、ヒト由来又は非ヒト哺乳動物由来の血液細胞に前記抗体を接触させる。さらに、蛍光物質又は色素からなる標識物質を、直接的又は間接的に接触させる。そして、フローサイトメトリー又はプレートリーダーによって、所望の細胞膜タンパク質の発現を検出することができる。また前記試薬を用いて、ヒト由来又は非ヒト哺乳動物由来の病理組織片に前記抗体を接触させて、所望の細胞膜タンパク質の発現を検出することができる。
　さらに、上記試薬を含む、細胞膜タンパク質検出用キットを構築することができる。例えば、上記試薬に標識物質等を組み合わせて、細胞膜タンパク質検出用キットを構築することができる。
　本発明は、上記の方法によって製造された目的物質を用いる、前記所望の細胞膜タンパク質を検出する方法、を包含する。本発明は、上記の方法によって製造された目的物質の、前記所望の細胞膜タンパク質の検出のための使用、を包含する。
　以下の実施例１～８では、主として、ヒトＧＰＣＲの１つであるアペリン受容体（以下、ＡＰＬＮＲと略記することがある）に対する特異的結合抗体を産生する細胞の選抜を行った。さらに、選抜された細胞から抗体遺伝子を単離し、抗体を発現する組換え細胞を構築した。さらに当該組換え細胞が発現する抗体の機能性評価を行った。
（１－１）ＡＰＬＮＲ発現ベクターの調製
　ジーンバンクに登録されているヒトＡＰＬＮＲ遺伝子配列（NM_005161.4）をマウスのアミノ酸コドンに最適化した人工合成遺伝子（配列番号１）を作製した。この人工合成遺伝子を用い、国際公開第２０１２／０４３５３３号（日本国特許第５３１５４９５号）に記載の方法に準じて、ヒトＡＰＬＮＲ遺伝子とＧｒｏＥＬ遺伝子との融合遺伝子を含むベクターpCI-APLNR-GroELを構築した。
（１－２）ＡＰＬＮＲ安定発現細胞（第一細胞）の調製
　pEF5/FRT/V5-DESTベクター（インビトロジェン社）に上記人工合成遺伝子（配列番号１）を導入し、pEF-FRT-APLNRを構築した。pEF-FRT-APLNRから発現されるヒトＡＰＬＮＲは、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグが付加される。
　Ｆｌｐ-Ｉｎ-ＣＨＯ細胞（インビトロジェン社）を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ-１２培地（インビトロジェン社）にて培養した。この細胞に、リポフェクトアミン（Lipofectamin）２０００を用いて、pEF-FRT-APLNRとpOG44プラスミド（インビトロジェン社）を同時に導入した。導入の翌日から、５００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（インビトロジェン社）含むＨａｍ’ｓ Ｆ-１２培地に培地を交換し、３日目ごとに培地を交換しながら２週間培養した。形成されたコロニーから、限界希釈法によりハイグロマイシン耐性細胞をクローニングした。
　フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマン・コールター社）を２次抗体として使用し、得られたハイグロマイシン耐性細胞と抗アペリン抗体（Ｒ＆Ｄ社）又は抗Ｖ５タグ抗体（インビトロジェン社）との結合を、フローサイトメーターで解析した。その結果、得られたハイグロマイシン耐性細胞がＰＥ陽性を示し、ヒトＡＰＬＮＲを安定発現していることが確認された。以下、この細胞を、ヒトＡＰＬＮＲ安定発現ＣＨＯ細胞株（第一細胞）と記載する。
（２－１）ＤＮＡ免疫法による免疫動物の獲得
　国際公開第２０１２／０４３５３３号（日本国特許第５３１５４９５号）に記載の方法に準じて、８週齢のマウスＩＣＲ（雌）に、ベクターpCI-APLNR-GroELを複数回に分けて注射した（ＤＮＡ免疫）。
（２－２）脾臓からの抗体産生細胞を含む細胞集団（第二細胞）の調製
　（２－１）でＤＮＡ免疫を行ったマウスから脾臓を摘出し、冷蔵ＨＢＳＳを入れた６ウェルプレートに回収した。付着している結合組織や脂肪組織を除去した後、新しいＨＢＳＳ内で脾臓をほぐしてリンパ球を遊離させた。細胞を回収し、１０ｍＬのＨＢＳＳで再懸濁した。セルストレーナーにて未破壊組織を分離後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。回収した細胞を１ｍＬの溶血溶液に懸濁して３７℃で５分間インキュベートし、赤血球を除去した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、リンパ球細胞を回収した。
　EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit（STEMCELL TECHNOLOGIES社）を用いて、２．５×１０７個の上記リンパ球細胞から、所望の抗体産生細胞（目的細胞）の候補を含む約１．３×１０５個の細胞集団（第二細胞）を分離した。
（３－１）ハイブリドーマ細胞（第二細胞）の調製
　細胞融合に使用するミエローマ細胞（SP2/O）は、細胞融合の５日前に起眠し、２日前に一度継代を行ってから使用した。
　実施例２で取得した免疫済みマウスの凍結脾細胞を融解し、３７℃のＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ含有）で懸濁し、細胞数をカウントした。脾細胞とミエローマ細胞（SP2/O）を細胞数比１：１となるように混合した。なおミエローマ細胞は、細胞融合の５日前に起眠し、２日前に一度継代を行ってから使用した。細胞混合物を遠心分離した後、ＥＣＦバッファーで細胞を洗浄した。同様の洗浄をさらに２回行った。
　細胞融合装置ECFG21（ネッパジーン社）を用いて、脾細胞とミエローマ細胞の細胞融合を実施した。細胞融合後、細胞溶液の２倍量のＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ含有、抗生物質不含）を加え、ＣＯ２インキュベーター内で１時間静置した。遠心分離して細胞を回収し、ＨＡＴ培地（RPMI1640 with 10% FBS, 2-メルカプトメタノール(x500), HFCS(x100), HAT(x50)）で懸濁した。９６ウェルプレート、２４ウェルプレート及び１０ｃｍディッシュを用い、常法により、抗体産生ハイブリドーマ細胞のクローニングと培養を行った。
（４－１）マイクロウェルを用いた特異的抗体産生ハイブリドーマの選抜
　マイクロウェルチャンバーASMC30-20P（アズワン社）を準備した。このマイクロウェルチャンバーは、約１．５ｃｍ×約２．４ｃｍのエリアの中に直径３０μｍのマイクロウェル８４，６４０個が等間隔で配置されている基板である。各マイクロウェルの深さは、マイクロウェルの直径と等しい。マイクロウェル間のピッチは、マイクロウェルの直径の２倍である。従来技術では、マイクロウェルに１個の細胞を格納して用いるのが一般的である。しかし本実施例では、マイクロチャンバーに第一細胞と第二細胞、すなわち２個以上の細胞を格納して実験を行った。以下、説明する。
　ヒトＡＰＬＮＲ安定発現ＣＨＯ細胞（第一細胞）をF-12培地（10% FBS, Penicillin/Streptomycin含有）で懸濁し、３×１０５細胞／５００μＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を各マイクロウェルに充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで２分間、２回遠心し、第一細胞が各マイクロウェルに１又は２個格納されるように調製した。マイクロチャンバーをF-12培地で洗浄した後、５００μＬのF-12培地を入れた。ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベートし、マイクロウェルの底面に第一細胞を細胞としての機能性を維持したまま接着させた。F-12培地で１０ｎＭ濃度に調整したCytoRed溶液を加え、さらに３７℃で１時間インキュベートし、第一細胞を染色した。F-12培地で３回洗浄して余剰のCytoRedを除去した後、１ｍＬのF-12培地をマイクロチャンバー内に満たした。
　実施例３で調製したハイブリドーマ（第二細胞）の集団を培養し、３×１０５細胞／５００μＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を各マイクロウェルに充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで２分間、２回遠心し、第二細胞が各マイクロウェルに１又は２個格納されるように調製した。マイクロチャンバーを培地で洗浄した後、適量の培地を入れて３７℃で３０分間インキュベートし、ハイブリドーマから抗体を分泌させた。マイクロウェルを洗浄して上清を除去した後、ＲＰＭＩ１６４０（10% FBS含有）で５００倍希釈したAlexa Fluor 488標識抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体；標識物質）をアプライし、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッド不含, 1% FBS含有）にて３回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０を１ｍＬ入れた。セルピッキングシステム（アズワン社）にマイクロチャンバーをセットし、全てのマイクロウェルの透過光画像および２種類の蛍光画像の情報を取得した。CytoRedの蛍光検出は、励起波長５４３ｎｍ、蛍光波長５９３ｎｍの条件で行った。Alexa Fluor 488の蛍光検出は、励起波長４８２ｎｍ、蛍光波長５３６ｎｍの条件で行った
　図２（ａ）～（ｃ）は、第一細胞表面のＡＰＬＮＲに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ、すなわち目的細胞が格納されたと判断される陽性のマイクロウェルの画像の一例である。一方、図３（ａ）～（ｃ）は、第一細胞表面のＡＰＬＮＲに特異的に結合しない抗体を産生するハイブリドーマ、すなわち目的外の細胞が格納されたと判断される陰性のマイクロウェルの画像の一例である。図２、３において、（ａ）は透過光、（ｂ）はCytoRed由来の蛍光、（ｃ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光を観察したものである。
　図２（ｃ）に示すように、目的細胞とＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞とが共存したマイクロウェルでは、CytoRedで標識されたＣＨＯ細胞と同じ位置にAlexa Fluor 488の蛍光が観察された。すなわち、目的細胞と共存したマイクロウェル内のＣＨＯ細胞は、Alexa Fluor 488とCytoRedで共染色された。これにより、ＣＨＯ細胞の表面にAlexa Fluor 488標識抗ＩｇＧ抗体が結合していることが確認された。
　一方、図３（ｃ）に示すように、目的外の細胞とＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞とが共存しマイクロウェルでは、Alexa Fluor 488の蛍光は、CytoRedで標識されたＣＨＯ細胞と同じ位置には観察されなかった。すなわち、ＣＨＯ細胞の表面にAlexa Fluor 488標識抗ＩｇＧ抗体が結合せず、ＣＨＯ細胞はAlexa Fluor 488とCytoRedで共染色されなかった。これにより、ＣＨＯ細胞の表面にAlexa Fluor 488標識抗ＩｇＧ抗体が結合していないことが確認された。
　最終的に、８４６４０個のマイクロウェルから、目的細胞を含む陽性マイクロウェルが１６個特定された。
　陽性マイクロウェルのうち、ハイブリドーマが１個のみ含まれるものを選別した。選別したマイクロウェルから、直径数μｍ～数十μｍのキャピラリーを用いてハイブリドーマを吸引し、細胞溶解液内に回収した。最終的に、少なくとも３種の独立したハイブリドーマが選抜された。
　本実施例の方法によれば、通常は６０日程度かかるハイブリドーマの選抜を、７日以内に完了することができた。
（５－１）選抜したハイブリドーマからの抗体遺伝子の単離
　実施例４で選抜したハイブリドーマの１つから、MAGrahd法（Nobuyuki Kurosawa, Megumi Yoshioka, Rika Fujimoto, Fuminori Yamagishi and Masaharu Isobe, "Rapid production of antigen-specific monoclonal antibodies from a variety of animals", BMC Biology, 10:80, 2012）にて抗体遺伝子を取得した。すなわち、実施例４で得た細胞溶解液５μＬとオリゴｄＴマグネット５μｇとを混合し、オリゴｄＴマグネット上に細胞由来のｍＲＮＡを捕捉した。MAGrahdリアクタートレーとネオジム磁石を使い、オリゴｄＴマグネットを洗浄溶液で洗浄後、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成を行った。さらにマグネットを洗浄後、５’ターミナルトランスレーショナル反応を実施した。合成した上記ｃＤＮＡを用い、５’ｒａｃｅ ＰＣＲ法にて、抗体重鎖可変領域（ＶＨ領域）の遺伝子と、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）の遺伝子を単離増幅した。
　なお、増幅産物の特異性を高めるために、ＰＣＲは２回行った。１回目のＰＣＲでは、ＶＨ領域とＶＬ領域を共通して増幅させる第一フォワードプライマー（配列番号３）と、ＶＨ領域を特異的に増幅させる第一リバースプライマー（配列番号４）と、ＶＬ領域を特異的に増幅させる第二リバースプライマー（配列番号５）を混合して使用した。２回目のＰＣＲでは、１回目の増幅産物を鋳型とし、ＶＨ領域の増幅については、第二フォワードプライマー（配列番号６）と、ＶＨ領域を特異的に増幅させる第三リバースプライマー（配列番号７）、ＶＬ領域の増幅については第二フォワードプライマー（配列番号６）とＶＬ領域特異的に増幅させる第四リバースプライマー（配列番号８）をそれぞれプライマーとして使用した。
　２回目のＰＣＲ後のサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行ったところ、７５０ｂｐの位置にＶＨ領域、５５０ｂｐの位置にＶＬ領域に、それぞれ対応する増幅産物が確認できた。
（５－２）抗体発現ユニットの構築
　ＴＳ－ｊＰＣＲ法（Megumi Yoshioka, Nobuyuki Kurosawa and Masaharu Isobe, "Target-selective joint polymerase chain reaction: A robust and rapid method for high-throughput production of recombinant monoclonal antibodies from single cells", BMC Biotechnol. 2011 Jul 21;11:75）にて抗体発現ユニットを構築した。すなわち、（５－１）で増幅したＶＨ領域の遺伝子と、抗体重鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域とをＰＣＲを用いて融合し、完全長抗体重鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。同様に、（５－１）で増幅したＶＬ領域の遺伝子と、抗体軽鎖定常領域の遺伝子と、遺伝子発現に必要なプロモーター領域とをＰＣＲを用いて融合し、完全長抗体軽鎖を発現する抗体発現ユニットを構築した。これらの抗体発現ユニットを哺乳動物細胞に供導入することにより、所望の抗体（ＩｇＧ）を一過的に発現する組換え細胞を得ることができる。
（５－３）哺乳動物細胞への抗体発現ユニット導入
　上記文献（Nobuyuki Kurosawa et al., BMC Biology, 10:80, 2012）に記載の方法で、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に上記２種の抗体発現ユニットを共導入した。すなわち、コラーゲンコート９６ウェルプレートに、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を１．５×１０４細胞／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。リポフェクトアミン２０００を用いて、（５－２）で構築した２種の抗体発現ユニットをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に共導入した。導入３日目に細胞上清を回収して、発現された抗体の結合性評価に用いた。
　比較例として、陰性マイクロウェルから回収された目的外のハイブリドーマを用いて（５－１）～（５－３）と同じ操作を行い、細胞上清を回収した。
（５－４）フローサイトメトリーを用いたＡＰＬＮＲと抗体との結合性評価
　ヒトＡＰＬＮＲ安定発現ＣＨＯ細胞株を、直径１０ｃｍのディッシュ内で培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、細胞剥離用バッファーを１ｍＬ加え、３７℃で１５分間インキュベートした。剥離された細胞をＦＡＣＳバッファーで懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍＬとなるようにＦＡＣＳバッファーで再懸濁した。Fc Block（べクトン・ディッキンソン社）を細胞懸濁液の１／５００量加え、４℃で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、２×１０５細胞／５０μＬとなるように細胞を懸濁した。９６ウェルプレート内で、この細胞懸濁液を（５－３）で回収した細胞上清と混合し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回、細胞を洗浄した。蛍光標識抗ＩｇＧ抗体（２次抗体）の希釈液を各ウェルに５０μＬずつ加え、４℃で１時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞表面に結合した抗体に２次抗体を結合させた。１００μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄した後、８０μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー法にて細胞表面の蛍光強度を測定した。
　図４にフローサイトメトリーの結果を示す。すなわち、（５－３）で得られた組換え細胞が発現した抗体は、ヒトＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞に対する結合性を有していた。なお当該抗体は、ＡＰＬＮＲを発現していない野生型のＣＨＯ細胞に対する結合性は示さなかった。
　一方、図５に示すように、陰性マイクロウェルから回収された目的外のハイブリドーマを用いた比較例では、組換え細胞が発現した抗体は、ヒトＡＰＬＮＲ安定発現ＣＨＯ細胞に対する結合性を有さなかった。
　以上より、本実施例によって得られた抗体が、ヒトＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞に対する特異的結合性を有することが示された。
（６－１）マイクロウェルを用いた特異的抗体産生リンパ球細胞の選抜
　実施例４の方法に準じて、実施例２で調製した不死化していないリンパ球細胞（第二細胞）の集団から、目的の抗体を産生する細胞を選抜した。以下、説明する。
　実施例４と同様にして、ヒトＡＰＬＮＲ安定発現ＣＨＯ細胞（第一細胞）をマイクロウェルの底面に接着させた。さらに、CytoRedで第一細胞を染色し、１ｍＬのF-12培地をマイクロチャンバー内に満たした。
　実施例２で調製したリンパ球（第二細胞）の集団をＲＰＭＩ１６４０で懸濁し、３×１０５細胞／５００μＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を各マイクロウェルに充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで２分間、２回遠心し、第二細胞が各マイクロウェルに１個又は２個格納されるように調製した。マイクロチャンバーをＲＰＭＩ１６４０で洗浄した後、１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を入れて３７℃で３０分間インキュベートし、リンパ球からの抗体産生を促した。マイクロウェルを洗浄して上清を除去した後、ＲＰＭＩ１６４０（10% FBS含有）で５００倍希釈したAlexa Fluor 488標識抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体；標識物質）をアプライし、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッド不含, 1% FBS含有）にて３回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０を１ｍＬ入れた。セルピッキングシステム（アズワン社）にマイクロチャンバーをセットし、全てのマイクロウェルの透過光画像および２種類の蛍光画像の情報を取得した。
　図６（ａ）～（ｃ）は、第一細胞表面のＡＰＬＮＲに特異的に結合する抗体を産生するリンパ球、すなわち目的細胞が格納されたと判断される陽性のマイクロウェルの画像の一例である。一方、図７（ａ）～（ｃ）は、第一細胞表面のＡＰＬＮＲに特異的に結合しない抗体を産生するリンパ球、すなわち目的外の細胞が格納されたと判断される陰性のマイクロウェルの画像の一例である。図６、７において、（ａ）は透過光、（ｂ）はCytoRed由来の蛍光、（ｃ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光を観察したものである。
　図６（ｃ）に示すように、目的細胞とＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞とが共存したマイクロウェルでは、CytoRedで標識されたＣＨＯ細胞と同じ位置にAlexa Fluor 488の蛍光が観察された。すなわち、目的細胞と共存したマイクロウェル内のＣＨＯ細胞は、Alexa Fluor 488とCytoRedで共染色された。特に、目的細胞（リンパ球）に近い部分に強くAlexa Fluor 488の蛍光が観察された。これにより、ＣＨＯ細胞の表面にAlexa Fluor 488標識抗ＩｇＧ抗体が結合していることが確認された。
　一方、図７（ｃ）に示すように、目的外の細胞とＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞とが共存しマイクロウェルでは、Alexa Fluor 488の蛍光は、CytoRedで標識されたＣＨＯ細胞と同じ位置には観察されず、リンパ球の細胞膜表面から観察されたのみであった。すなわち、ＣＨＯ細胞の表面にAlexa Fluor 488標識抗ＩｇＧ抗体が結合せず、ＣＨＯ細胞はAlexa Fluor 488とCytoRedで共染色されなかった。これにより、ＣＨＯ細胞の表面にAlexa Fluor 488標識抗ＩｇＧ抗体が結合していないことが確認された。
　最終的に、８４６４０個のマイクロウェルから、目的細胞を含む陽性マイクロウェルが４０個特定された。
　陽性マイクロウェルのうち、リンパ球が１個のみ含まれるものを選別した。選別したマイクロウェルから、直径数μｍ～数十μｍのキャピラリーを用いてリンパ球を吸引し、細胞溶解液内に回収した。最終的に、フローサイトメトリーで目的物質に対する結合性が確認された、少なくとも１４種の独立した抗体産生リンパ球が選抜された。
　本実施例の方法によれば、従来の６０日程度かかるハイブリドーマ法を経ずに、直接リンパ組織より所望するリンパ球の選抜を、わずか１日で完了することができた。
（７－１）選抜したリンパ球からの抗体遺伝子の単離
　実施例５と同様の操作を行い、実施例６で選抜したリンパ球の１つから抗体遺伝子を取得した。
（７－２）抗体発現ユニットの構築
　実施例５と同様の操作を行い、（７－１）で得られた抗体遺伝子から完全長抗体重鎖と完全長抗体軽鎖を発現する２種の抗体発現ユニットを構築した。
（７－３）哺乳動物細胞への抗体発現ユニット導入
　実施例５と同様の操作を行い、（７－２）で得られた抗体発現ユニットをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に共導入した。導入４８時間後に細胞上清を回収して、発現された抗体の機能性評価に用いた。
（７－４）フローサイトメトリーを用いたＡＰＬＮＲと抗体との結合性評価
　実施例５と同様の操作を行い、（７－３）で得られた組換え細胞が発現する抗体の結合性評価を行った。
　図８にフローサイトメトリーの結果を示す。すなわち、（７－３）で得られた組換え細胞が発現した抗体は、ヒトＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞に対する結合性を有していた。なお当該抗体は、ＡＰＬＮＲを発現していない野生型のＣＨＯ細胞に対する結合性は示さなかった。
　一方、図９に示すように、陰性マイクロウェルから回収された目的外のリンパ球を用いた比較例では、組換え細胞が発現した抗体は、ヒトＡＰＬＮＲ安定発現ＣＨＯ細胞に対する結合性を有さなかった。
　実施例６で選抜した他のリンパ球（１３種）についても同様の検討を行った。その結果、全ての抗体がヒトＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞に対する結合性を有していた。さらに、このうち１２種は、ＡＰＬＮＲを発現していない野生型のＣＨＯ細胞に対する結合性は示さなかった。
　以上より、本実施例によって得られた抗体が、ヒトＡＰＬＮＲ発現ＣＨＯ細胞に対する特異的結合性を有することが示された。
　ＡＰＬＮＲ以外の標的細胞膜タンパク質についても本発明が有効であることを確認するために、ＡＰＬＮＲのリガンドとは別の生理活性脂質をリガンドとするＧＰＣＲについて、実施例１～５と同様の実験を行った。陽性細胞を含むと予想される２７個のマイクロウェルから回収した細胞を解析した。その結果、１８個のマイクロウェルで、標的細胞膜タンパク質を発現するＣＨＯ細胞に対して特異的な結合性を有する抗体を産生する陽性細胞が確認された。
　上記した実施例により、本発明によって、精製困難な細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を発現する細胞を、その不死化の如何に関わらず、より迅速かつ効率的に選抜できることが示された。さらに本発明によって、細胞膜タンパク質に対する特異的結合物質（例えば、抗体）を容易に製造できることが示された。
　本実施例では、第一細胞表面の細胞膜タンパク質に目的物質が特異的に結合した際に起きる、細胞膜タンパク質の活性化に伴う細胞内情報伝達物質の変動を可視化する間接的手法の一例を示す。細胞膜タンパク質としてヒトＧＬＰ－１（Glucagon-like peptide-1）受容体を用い、目的物質としてその特異的結合抗体を用いた。
　実施例１と類似の方法で作成した、ヒトＧＬＰ－１受容体安定発現ＣＨＯ細胞（第一細胞）をＦ－１２培地（10% FBS, Penicillin/Streptomycin含有）で懸濁し、３×１０５細胞／５００μＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を各マイクロウェルに充填した。マイクロチャンバーを３００ｒｐｍで２分間、２回遠心し、第一細胞が各マイクロウェルに１又は２個格納されるように調製した。
　実施例２と同様の方法でラットに免疫した。実施例３と同様の方法でマウスミエローマと融合した抗体産生ハイブリドーマを作成し、培地から抗体を精製した。精製抗体をＦ－１２培地（Penicillin/Streptomycin含有）で５００ｎＭに希釈した溶液を作成した。この溶液４００μＬをマイクロウェルに添加した。一方、精製抗体を含まない溶液を、同様に、別のマイクロウェルに添加した。溶液の添加後、室温で３０分間静置し、第一細胞と抗体結合との反応を行った。
　その後、Ｆ－１２培地（Penicillin/Streptomycin含有）で５００ｐＭに調整したリガンド（ＧＬＰ－１）を４００μＬ添加（ＧＬＰ－１最終濃度２５０ｐＭ）し、３７℃で１時間インキュベートし、ヒトＧＬＰ－１受容体を活性化させた。マイクロウェルをＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（和光純薬工業株式会社）を６００μＬ添加して室温で１５分間静置し、第一細胞の固定化を行った。マイクロウェルをＰＢＳで再度洗浄した後、氷冷しておいた９０％メタノールを６００μＬ添加して氷上に１５分間静置し、第一細胞の細胞膜透過処理を行った。マイクロウェルをＰＢＳで洗浄した後、抗体希釈液（1 X PBS, 1% BSA, 0.3% Triton X-100）で１００倍希釈した、Ｓｅｒ１３３のリン酸化を認識するウサギ抗リン酸化－ＣＲＥＢ（クローン87G3）抗体（Cell Signaling TECHNOLOGY）を５００μＬ添加した。室温で１時間静置し、１次抗体反応を実施した。
　ウサギ抗リン酸化－ＣＲＥＢ抗体を検出する蛍光標識２次抗体としてAlexa Fluor 488標識抗ウサギIｇＧ抗体と、ラット由来の抗体を検出する蛍光標識２次抗体としてDyLight 650標識抗ラットIｇＧ抗体が、それぞれ２００倍希釈と５００倍希釈になるように抗体希釈液で調整した２次抗体溶液を５００μＬ調製した。１次抗体反応終了後、マイクロウェルをＰＢＳで洗浄し、調製した２次抗体溶液を５００μＬ添加した。室温で１時間静置し、それぞれの抗体の可視化を実施した。マイクロウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳを１ｍＬ入れた。セルピッキングシステムにマイクロチャンバーをセットし、透過光画像および２種類の蛍光画像の情報を取得した。Alexa Fluor 488の蛍光検出は、励起波長４８２ｎｍ、蛍光波長５３６ｎｍの条件で行った。DyLight 650の蛍光検出は、励起波長６２８ｎｍ、蛍光波長６９２ｎｍの条件で行った。
　代表例として、８個のマイクロウェル（Ｎｏ．１～Ｎｏ．８）の蛍光強度と、２個のマイクロウェル（Ｎｏ．１とＮｏ．５）の蛍光画像を基にして、結果と考察を以下に記載する。ここで、Alexa Fluor 488由来の蛍光は、リガンド（ＧＬＰ－１）添加による細胞内ｃＡＭＰの上昇を介したリン酸化ＣＲＥＢに由来している。すなわち、Alexa Fluor 488由来の蛍光は、細胞膜タンパク質（ＧＬＰ－１受容体）の活性化の有無を反映している。ＧＬＰ－１受容体が活性化されると、Alexa Fluor 488由来の蛍光強度が高くなる。一方、DyLight 650由来の蛍光は、第一細胞表面における抗体に由来している。すなわち、DyLight 650由来の蛍光は、添加した抗体の第一細胞表面への結合の有無を反映している。抗体が第一細胞表面に結合すると、DyLight 650由来の蛍光強度が高くなる。
　表１は、８個のマイクロウェルについて、Alexa Fluor 488由来の蛍光強度と、DyLight 650由来の蛍光強度をまとめたものである。図１０は、２個のマイクロウェル（Ｎｏ．１とＮｏ．５）の画像を表す写真であり、（ａ）は透過光、（ｂ）はAlexa Fluor 488由来の蛍光、（ｃ）はDyLight 650由来の蛍光を観察した結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１０（ｂ）に示すように、Alexa Fluor 488由来の蛍光は、Ｎｏ．１のマイクロウェルの方が弱かった。また表１に示すように、Ｎｏ．１のAlexa Fluor 488由来の蛍光強度は、Ｎｏ．５の１／３程度であった（８４．１ 対 ２５５）。これは、Ｎｏ．１のマイクロウェルではＧＬＰ－１機能（ＧＬＰ－１受容体の活性化）が阻害され、一方、Ｎｏ．５のマイクロウェルではＧＬＰ－１機能が阻害されていないことを示している。
　図１０（ｃ）に示すように、DyLight 650由来の蛍光は、Ｎｏ．１のマイクロウェルの方が強かった。表１に示すように、Ｎｏ．１のDyLight 650由来の蛍光強度は、Ｎｏ．５の約１８倍であった（１６６．７８ 対 ９．１１）。これは、Ｎｏ．１のマイクロウェルでは、添加した抗体が第一細胞表面に強く結合していることを示している。またＮｏ．５のマイクロウェルでは、抗体が第一細胞表面に結合していないことを示している。
　また表１に示すように、Alexa Fluor 488由来の蛍光強度が強いマイクロウェルでは、DyLight 650の蛍光強度が低かった（Ｎｏ．５～Ｎｏ．８参照）。上記の結果より、リン酸化ＣＲＥＢ量に対応する蛍光強度の相対的低下は、ヒトＧＬＰ－１受容体活性化に起因する細胞内ｃＡＭＰの上昇が阻害されていることを示している。
　本実施例の方法により、第一細胞表面のヒトＧＬＰ－１受容体に特異的に結合して受容体の機能を阻害する抗体を含むマイクロウェルを同定することができる。また同様の原理で、受容体の機能を促進する抗体を含むマイクロウェルを同定することもできる。また、精製抗体の代わりに、ハイブリドーマ（例えば、実施例４）や抗体産生リンパ球細胞（例えば、実施例６）のような第二細胞をマイクロウェルに入れて、機能性抗体（目的物質）を生産する目的細胞を含むマイクロウェルを同定することができる。そして、同定されたマイクロウェルから、目的細胞を単一細胞として分離することができる。前記機能性抗体には、受容体の機能を阻害する抗体と、促進する抗体の両方が含まれる。
　１　基板
　２　マイクロウェル
　３　第一細胞
　５　第二細胞
　６　目的物質
　７　標識物質

Claims (30)

  1. 　所望の細胞膜タンパク質に対して特異的に結合する目的物質を生産する目的細胞を、第二細胞の集団から選抜する細胞の選抜方法であって、下記工程：
    　ａ）複数のマイクロウェルを有する基板を提供する工程、
    　ｂ）前記細胞膜タンパク質を細胞表面に発現する第一細胞を、各々の前記マイクロウェルに接着させる工程、
    　ｃ）工程ｂ）に続いて、各々の前記マイクロウェルに、前記集団から単離された１又は２個の第二細胞を導入し、前記マイクロウェル内で前記第一細胞と前記第二細胞を共存させる工程、
    　ｄ）工程ｃ）に続いて、前記目的物質が結合した第一細胞を含むマイクロウェルを特定する工程、
    　ｅ）工程ｄ）で特定されたマイクロウェルから、前記目的細胞として前記第二細胞を回収する工程、
    を包含する、細胞の選抜方法。
  2. 　前記工程ｄ）は、前記目的物質が前記第一細胞に結合したことを可視化する可視化工程を包含する、請求項１に記載の細胞の選抜方法。
  3. 　前記可視化工程は、前記マイクロウェルに、前記目的物質に対して特異的に結合する標識物質を添加することを含む、請求項２に記載の細胞の選抜方法。
  4. 　前記標識物質が前記目的物質に対する標識抗体である、請求項３に記載の細胞の選抜方法。
  5. 　前記標識物質における標識が蛍光標識である、請求項３又は４に記載の細胞の選抜方法。
  6. 　前記標識物質は、第一蛍光物質で標識された抗体であり、
    　前記工程ｂ）は、前記マイクロウェルに接着している前記第一細胞を第二蛍光物質で標識する第一細胞標識工程を含み、
    　第一蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長は、第二蛍光物質が発する蛍光の蛍光波長と異なる、請求項５に記載の細胞の選抜方法。
  7. 　前記可視化工程は、前記目的物質が前記第一細胞に結合した際に起きる、前記細胞膜タンパク質の活性化に伴う細胞内情報伝達物質の変動を可視化することを含む、請求項２に記載の細胞の選抜方法。
  8. 　前記細胞膜タンパク質が複数回膜貫通型タンパク質である、請求項１～７のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
  9. 　前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現するベクターを導入した細胞である、請求項１～８のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
  10. 　前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現する腫瘍細胞である、請求項１～８のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
  11. 　前記第一細胞が、前記細胞膜タンパク質を発現する非腫瘍細胞である、請求項１～８のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
  12. 　前記目的物質が抗体である、請求項１～１１のいずれかに記載の細胞の選抜方法。
  13. 　前記第二細胞が、前記細胞膜タンパク質又はそれをコードする核酸で免疫した非ヒト動物由来の骨髄、脾臓、リンパ組織、又は血液細胞由来である、請求項１２に記載の細胞の選抜方法。
  14. 　前記第二細胞が不死化された細胞である、請求項１３に記載の細胞の選抜方法。
  15. 　前記第二細胞がハイブリドーマである、請求項１４に記載の細胞の選抜方法。
  16. 　前記第二細胞が、ヒトのリンパ組織又は血液由来である、請求項１２に記載の細胞の選抜方法。
  17. 　前記第二細胞が、エプスタイン・バール・ウイルス感染により不死化された細胞である、請求項１６に記載の細胞の選抜方法。
  18. 　前記第二細胞が、外来性の抗体遺伝子を有し、当該抗体を発現する組換え細胞である、請求項１２に記載の細胞の選抜方法。
  19. 　前記抗体が、完全抗体、機能的抗体断片、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体である、請求項１８に記載の細胞の選抜方法。
  20. 　前記抗体が、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項１８又は１９に記載の細胞の選抜方法。
  21. 　前記抗体が、ネコ化抗体又はイヌ化抗体である、請求項１８又は１９に記載の細胞の選抜方法。
  22. 　請求項１～２１のいずれかに記載の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞から、前記目的物質をコードする核酸を取得する、核酸の製造方法。
  23. 　前記目的物質が抗体である、請求項２２に記載の核酸の製造方法。
  24. 　請求項２２又は２３に記載の方法によって製造された核酸を宿主細胞に導入し、前記目的物質を発現する組換え細胞を取得する、組換え細胞の製造方法。
  25. 　請求項２４に記載の方法によって製造された組換え細胞を培養し、その培養物から前記目的物質を取得する、目的物質の製造方法。
  26. 　請求項１～２１のいずれかに記載の方法によって第二細胞の集団より選抜された目的細胞を培養し、その培養物から前記目的物質を取得する、目的物質の製造方法。
  27. 　前記目的物質が抗体である、請求項２５又は２６に記載の目的物質の製造方法。
  28. 　請求項２２又は２３に記載の方法によって製造された核酸に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記核酸を有効成分として含有する医薬組成物を取得する、医薬組成物の製造方法。
  29. 　請求項２５～２７のいずれかに記載の方法によって製造された目的物質に、薬学的に許容される担体又は添加物を組み合わせて、前記目的物質を有効成分として含有する医薬組成物を取得する、医薬組成物の製造方法。
  30. 　請求項２５～２７のいずれかに記載の方法によって製造された目的物質を含む、前記所望の細胞膜タンパク質を検出するための試薬。
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