WO2020171346A1 - 자가항체-항원 결합체를 이용한 폐암 진단용 면역학적 조성물, 이를 사용한 폐암 진단 방법 및 이를 포함하는 폐암 진단용 키트 - Google Patents

자가항체-항원 결합체를 이용한 폐암 진단용 면역학적 조성물, 이를 사용한 폐암 진단 방법 및 이를 포함하는 폐암 진단용 키트 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an immunological composition for diagnosing lung cancer using an autoantibody-antigen conjugate, a method for diagnosing lung cancer using the same, and a kit for lung cancer diagnosis comprising the same.
  • Lung cancer is known to kill 1 million people annually. Diagnosis and treatment technologies have been developed over the past decades, but there are no special symptoms and are mostly found in advanced cancers or metastases to other sites, so the cure rate of lung cancer patients is less than 30%, and the prognosis is very poor.
  • Imaging methods (X-ray, CT, MRI): Currently, it is highly dependent on imaging methods for lung cancer diagnosis, but sensitivity and specificity are not good for early diagnosis of lung cancer.
  • Biopsy methods include sputum cytology, bronchoscopy, fine needle aspiration, and mediastinal endoscopy, and it is an invasive and cytological detection method that requires biopsy tissue. There are drawbacks.
  • Tumor marker test A non-invasive diagnostic method for diagnosing malignant tumors, it is widely used as a good factor in predicting prognosis and determining treatment effect.
  • CYFRA21-1 is a segment of cytokeratin 19, and since it was presented as a lung cancer marker in 1993, studies on its usefulness have been continuing, and many studies have been recognized as a marker of non-small cell lung cancer.
  • most of the tumor markers have a limit in the accuracy of distinguishing between normal and cancer patients because they use a cut-off value that is judged as cancer when the concentration is higher than a certain level and otherwise normal.
  • the tumor marker test is based on the antigen detection method, and research on tumor markers has been continuously studied, but the quantitative change of tumor markers in the blood by only the tumor marker test appears very small until the stage 0 to 3 of the cancer stage, and there is a quantitative difference at the level of 4 It is not easy to distinguish between normal and cancer because the quantitative change is low with 89% specificity and 43% sensitivity only by using only antigens, which are microscopic tumor markers. It is difficult.
  • Autoantibodies that react specifically to antigens appear to increase in quantity when cancer occurs.In the early stage of cancer (stage 0 ⁇ 1), the immune system is active, so the quantity of autoantibodies is the largest and 5 ⁇ 10 compared to normal. It shows an increase of more than twice.
  • the present invention aims to develop a method for distinguishing between normal and cancer by measuring autoantibodies that show a very large increase in blood volume in case of cancer compared to normal.
  • the present invention provides an anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene and an anti-CYFRA21-1 secondary antibody-antibody composition A containing a measurement label; And anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene and anti-human IgG antibody- antibody composition B containing the measurement label; provides an immunological composition for lung cancer diagnosis comprising.
  • the present invention provides a method for diagnosing lung cancer in a human biological sample using the above-described immunological composition for lung cancer diagnosis, comprising the following steps:
  • the composition for lung cancer diagnosis and the method for diagnosing lung cancer according to the present invention can diagnose whether the onset of stage 0-4 lung cancer in a non-invasive biological sample is diagnosed with a specificity of 90% or more and a sensitivity of 75% or more, and in particular, the concentration rapidly increases in the early stages of lung cancer. Because of the use of autoantibodies, it is possible to diagnose initial lung cancer stage 0-1 with a sensitivity of 76% or more.
  • Figure 1 shows the ratio of ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate> and ⁇ CYFRA21-1 antigen> obtained using the autoantibody-antigen conjugate and antigen assay method of the present invention in normal and cancer patients It is a graph.
  • Figure 2 shows ⁇ anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene> and ⁇ anti-CYFRA21-1 secondary antibody-measuring label> bind to ⁇ CYFRA21-1 antigen> in a biological sample, and ⁇ anti-CYFRA21-1 1 It is a conceptual diagram showing the formation of a secondary antibody-gene>: ⁇ CYFRA21-1 antigen>: ⁇ anti-CYFRA21-1 secondary antibody-Cy5> complex.
  • Figure 3 shows ⁇ anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene> and ⁇ anti-human IgG antibody-Cy5> bind to ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen> in a biological sample, and ⁇ anti-CYFRA21-1 It is a conceptual diagram showing the formation of a primary antibody-gene>: ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate>: ⁇ anti-human IgG antibody-Cy5> complex.
  • Figure 5 shows the detection form of the anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate on the 9G DNA member lane.
  • FIG. 6 is a graph showing quantitative changes in blood of cancer antigens (Ag) and autoantibodies (autoantibodies, AAb) according to normal and lung cancer stages (0 to 3).
  • FIG. 7 is a graph of antigen concentration by an antigen test (ELISA method), showing difficulty in distinguishing between normal and cancer patients.
  • FIG. 8 is a graph of the concentration of ⁇ autoantibody-antigen conjugate> and ⁇ antigen> according to the present invention, as ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate> and ⁇ CYFRA21-1 antigen> appear in separate regions, so normal And cancer patients can be easily distinguished.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram of antibody composition A comprising ⁇ anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene> and ⁇ anti-CYFRA21-1 secondary antibody-Cy5>; And ⁇ anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene> and ⁇ anti-human IgG antibody-Cy5> respectively.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram showing a process in which ⁇ CYFRA21-1 antigen> is detected when the lung cancer diagnosis method according to the present invention is performed on a 9G DNA member lane.
  • FIG. 11 is a conceptual diagram showing a process in which ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate> is detected when the lung cancer diagnosis method according to the present invention is performed on a 9G DNA member lane.
  • FIG. 12 is a view showing a form in which the lung cancer diagnostic kit according to the present invention is applied to a 9G DNA member lane.
  • FIG. 13 is a photograph showing a process of detecting and reading a lung cancer diagnostic kit applied to a 9G DNA member lane.
  • FIG. 14 is a graph showing hospital clinical results obtained by measuring lung cancer sensitivity by applying the lung cancer diagnostic composition according to the present invention to 200 normal samples and 50 samples of lung cancer stage 1-4.
  • the present invention relates to an antibody composition A containing an anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene and an anti-CYFRA21-1 secondary antibody-measurement label; And anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene and anti-human IgG antibody- antibody composition B containing the measurement label; provides an immunological composition for lung cancer diagnosis comprising.
  • the measurement label may be any one selected from the group consisting of a color developing enzyme, a fluorescent material, a fluorescent bead, a radioactive isotope, and a colloid, and preferably, may be selected from a fluorescent material.
  • the present invention provides a method for diagnosing lung cancer in a human biological sample using the above-described immunological composition for lung cancer diagnosis, and includes the following steps:
  • the present invention provides a lung cancer diagnostic kit comprising the above-described immunological composition for lung cancer diagnosis and a biochip.
  • the present invention relates to a method for detecting anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate and CYFRA21-1 antigen in a biological sample, and also using the ratio of anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate and CYFRA21-1 antigen It relates to a diagnostic kit and a diagnostic method for diagnosing lung cancer including stage 0 to 1.
  • a first object of the present invention is an antibody composition A containing an anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene and an anti-CYFRA21-1 secondary antibody-measurement label; And anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene and anti-human IgG antibody- antibody composition B containing the measurement label; provides an immunological composition for lung cancer diagnosis comprising.
  • the marker for detection may be detected in a manner such as color development, light emission, or fluorescence.
  • the measurement label may be any one selected from the group consisting of a fluorescent material, a fluorescent bead, a radioactive isotope, and a colloid.
  • the above-described colloid is generally a marker for visual measurement, for example, a nano-metal colloid such as a nano gold colloid may be used.
  • the measurement label may be selected from fluorescent materials, for example, cyanine Cy3 (570 nm emission), Cy5 (670 nm emission), FAM, VIC, TET, JOE, HEX, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 and NED can be used.
  • fluorescent materials for example, cyanine Cy3 (570 nm emission), Cy5 (670 nm emission), FAM, VIC, TET, JOE, HEX, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 and NED can be used.
  • a second object of the present invention is to provide a method for diagnosing lung cancer in a human biological sample using the above-described immunological composition for lung cancer diagnosis, including the following steps:
  • ⁇ anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene> and ⁇ anti-CYFRA21-1 secondary antibody-measurement label> contained in antibody composition A are biological samples.
  • ⁇ anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene>: ⁇ CYFRA21-1 antigen>: ⁇ anti-CYFRA21-1 secondary antibody-measurement label> complex is formed by binding to ⁇ CYFRA21-1 antigen> in The concentration of -1 antigen> can be measured.
  • concentration of ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate> can be measured.
  • the ratio of ⁇ anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate>/ ⁇ CYFRA21-1 antigen> is cut off, for example, 1 or more, If it is higher than a value that can be selected from preferably 1.5 or more, more preferably 2 or more, specifically 1 to 4, more specifically 1.5 to 3, it can be selected as lung cancer or determined to be in the onset or progression of lung cancer. have.
  • the biological sample may be any one selected from the group consisting of whole blood, serum, plasma, saliva, urine, sputum, lymph fluid, cerebrospinal fluid, and cell fluid.
  • the antigen-antibody complex formed in (a) and (b) may be immobilized on a solid support.
  • the solid support may include a 9G member lane or a 9G DNA member lane.
  • the antigen specific for the anti-CYFRA21-1 autoantibody may be a CYFRA21-1 protein.
  • the immune complex may be further bound to the ⁇ anti-CFYRA21-1 autoantibody-antigen> conjugate.
  • the ⁇ anti-CFYRA21-1 autoantibody-antigen> conjugate is a human autoantibody-antigen conjugate
  • the molecule that binds to the anti-CFYRA21-1 autoantibody-antigen conjugate is an anti-human IgG antibody.
  • the present invention uses a platform to which DAGON technology ( Chemical Communications 2011, 47, 7616 ) based on 9G DNA technology ( Chemical Communications 2011, 47, 7104 ) is applied, and lung cancer is 0 to 1 through measurement using blood, which is a non-invasive method.
  • the purpose is to increase the survival rate and improve the quality of life by discovering it in the period.
  • a third object of the present invention is to provide a lung cancer diagnostic kit comprising the above-described immunological composition for lung cancer diagnosis and a biochip.
  • the biochip may include a 9G member lane or a 9G DNA member lane.
  • the term "9G member lane” refers to a glass fiber member lane in which the surface on which an oligo gene containing 9 consecutive guanines is immobilized is modified with a calix arene derivative
  • the term “9G DNA member lane” is It refers to a glass fiber member lane in which an oligo gene containing nine consecutive guanine is immobilized.
  • “9G member lane” and “9G DNA member lane” are based on the 9G DNA technology described above ( Chemical Communications 2011, 47, 7104) .
  • the present invention is a method for distinguishing between normal and cancer using a quantitative ratio with an antigen by measuring an autoantibody showing a very large increase in blood quantity in the case of cancer compared to normal.
  • CYFRA21-1 antigen When lung cancer occurs, there is a quantitative increase in CYFRA21-1 antigen, a cancer-related protein that exhibits a quantitative increase in the blood, and an anti-CYFRA21-1 autoantibody that specifically responds to this CYFRA21-1 antigen.
  • Antibodies exist as anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugates, which are antigen-binding forms.
  • the present invention accurately detects the amount of antigen conjugates bound to CYFRA21-1 antigens with little increase in quantity and anti-CYFRA21-1 autoantibodies with a very large increase in quantity in cancer stage 0-1, and uses their quantitative ratios to normalize. It provides a method for early detection of and cancer (see Fig. 1).
  • a kit for lung cancer diagnosis without interference and non-specific reactions was prepared using glass fibers with immobilized genes prepared by a method known in the present invention (Korea Patent Registration No. 10-0883763, 10-1682347), and a method of using the same is provided. .
  • the present invention relates to a fluorescence immunoassay method for measuring anti-CYFRA21-1 autoantibody-antibody conjugate and CYFRA21-1 antigen .
  • the present invention provides an immunoassay method comprising the following steps for assaying the presence and ratio of anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate and CFYRA21-1 antigen in a human biological sample:
  • the present invention uses non-invasive biological samples such as blood and plasma from normal and lung cancer patients, using the ratio of anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate and CYFRA21-1 antigen, with specificity of 91.7% and phase 1 of 76%, With a sensitivity of 80% in stage 2, 77% in stage 3, and 50% in stage 4, it is possible to diagnose the onset of stage 1-4 lung cancer, and a diagnostic kit and method of use are provided.
  • FIG. 6 is a graph showing quantitative changes in blood of cancer antigens (Ag) and autoantibodies (autoantibodies, AAb), which are lung cancer tumor markers according to normal and lung cancer stages (by stage 0-3).
  • Ag cancer antigens
  • AAb autoantibodies
  • cancer antigens do not change much from normal to lung cancer stage 0-3, and show a high change only in lung cancer stage 3-4, where lung cancer is significantly advanced. It can be seen that in the initial stage, it is not easy to diagnose the normal state and the onset of lung cancer using only the antigen test.
  • autoantibodies increase 5-10 times or more compared to the normal state in the early stages of lung cancer in the 0-1 stage, showing a clear amount of change, showing that lung cancer can be diagnosed in the early stage (0-1 stage).
  • the present invention is a "anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene" in which a gene is bound to an antibody to accurately detect the increase or decrease of the anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate and the CYFRA21-1 antigen marker in a biological sample.
  • a gene is bound to an antibody to accurately detect the increase or decrease of the anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate and the CYFRA21-1 antigen marker in a biological sample.
  • the antigen-antibody-gene complex is formed in a solution, since the solid substrate on which the gene is immobilized and the antigen-antibody-gene complex are immobilized, it can be immobilized without any interference or non-specific reaction in the biological sample. It is a way to accurately measure the quantitative change of
  • CYFRA21-1 primary antibody-gene binding The substances used for CYFRA21-1 primary antibody-gene binding are listed in Table 1 below, and the base sequence of the target gene (TD) used is shown in Table 2.
  • Example 1 Materials used in Example 1 Molecular Weight density CYFRA21-1 primary antibody 160,000 g/mol 7.1 mg/ml, 35 ⁇ l 2-iminothiolane 137 g/mol 4 mg/ml sulfo-SMCC 436 g/mol 80 mg/ml TD02 9000 g/mol 100 pmol/ml 10xPBS - - 500mM EDTA - -
  • CYFRA21-1 primary antibody-gene conjugate was prepared and purified according to a known method using the materials shown in Table 1 to obtain 80 ⁇ l of CYFRA21-1 primary antibody-gene conjugate 2 mg/ml. (Reference Korean Patent Registration 10-1682347, Example 1, Fig. 1)
  • a ⁇ antibody-measuring label> conjugate was prepared using a fluorescent material as a measurement label, and the materials used in the preparation thereof are shown in Table 3 below.
  • Example 1 Materials prepared in Example 1,2 density volume CYFRA21-1 primary antibody 2 mg/ml 80 ⁇ l CYFRA21-1 secondary antibody 2.5 mg/ml 70 ⁇ l Anti-human IgG antibody 3 mg/ml 60 ⁇ l
  • Table 4 lists the concentrations and volumes of the products obtained in Examples 1 and 2, respectively.
  • antibody compositions A and B were prepared. All antibody concentrations were diluted to 300 ⁇ l/ml and used.
  • Antibody composition Materials used density usage A Anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene 300 ⁇ g/ml 4 ⁇ l Anti-CYFRA21-1 secondary antibody-Cy5 300 ⁇ g/ml 4 ⁇ l 1XPBS - 3.992 ml B Anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene 300 ⁇ g/ml 4 ⁇ l Anti-human IgG antibody-Cy5 300 ⁇ g/ml 4 ⁇ l 1XPBS - 3.992 ml
  • Probe name Base sequence density HC probe GGGGGGGGG TTT ATA TTT CGGGCAG GCCATAGCGA 100 pmol/ ⁇ l
  • TD02 probe GGGGGGGGG TTT ATA TTT CCTACGA CTTGGGGAGG 100 pmol/ ⁇ l
  • FIGS. 4 and 5 The concept of the detection method of the CYFRA21-1 antigen protein and the anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate is schematically illustrated in FIGS. 4 and 5, and the experimental procedure in FIGS. 10 and 11.
  • Plasma samples of normal people and cancer patients were 200 normal samples and 50 samples of lung cancer stage 1-4 were used, and (IRB # KIRAMS 2018-10-006, 2018-06-016) samples were used at the Korea Atomic Energy Hospital (KOREA CANCER CENTER HOSPITAL). I did.
  • the cancer patient sample a plasma sample from a patient whose lung cancer was confirmed by biopsy was used.
  • the samples of normal subjects were samples from normal subjects who participated in the health examination. The materials used in the experiment are listed in Table 7.
  • the fluorescence sensitivity for detection of the CYFRA21-1 antigen in blood samples of normal people and lung cancer patients was confirmed, and is shown in Table 8.
  • the average value of fluorescence sensitivity for CYFRA21-1 antigen was found to be 26745 in normal blood samples and 19935 in lung cancer patient blood samples.
  • Anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen detection for anti-CYFRA21-1 autoantibody-antigen detection for blood samples of normal and lung cancer patients using antibody composition B was confirmed, and is shown in Table 9.
  • CYFRA21-1 Normal human blood sample Blood samples from lung cancer patients B. Autoantibody-antigen fluorescence sensitivity 26862 47167
  • the tumor marker CYFRA21-1 antigen test alone cannot differentiate between normal and cancer.
  • Most cancer-related antigens show a quantitative increase in the blood when cancer occurs, but the quantitative change from cancer stage 0 to 3 is very small, and the difference in quantitative change appears only in the 4 stage. It is not easy to distinguish between 0 and 1 cancers, and it is not possible to distinguish them further.
  • Anti-CYFRA21-1 autoantibodies are autoantibodies that react specifically when there is a CYFRA21-1 antigen for lung cancer, and their quantitative increase in the 0-1 stage of cancer is 5-10 times more than normal.
  • normal and cancer can be determined as cancer if it is more than a certain value (cut off) compared to normal by using the ratio of anti-CYFRA21-1 autoantibody and CYFRA21-1 antigen.
  • CYFRA21-1 Normal human blood sample Blood samples from lung cancer patients B. Autoantibody-antigen fluorescence sensitivity 26862 47167 A. Antigen fluorescence sensitivity 26745 19935 B/A ratio 1.03 2.15
  • CYFRA21-1 autoantibody-antigen conjugate/antigen ratio (B/A) was found to be 1.03 in normal and 2.15 in lung cancer patients, respectively. Based on the cut off 1.5 of the B/A ratio, 1.5 or less was determined as normal, and 1.5 or more was determined as lung cancer. A specificity of 91.7% was obtained for 200 normal subjects, and sensitivity of stage 1 76%, stage 2 80%, stage 3 77%, and stage 4 50% were obtained for 50 cancer patients.
  • 9G member lane A glass fiber member lane in which the surface on which oligogenes containing 9 consecutive guanines are immobilized is modified with a calix arene derivative
  • 2.9G DNA member lane A glass fiber member lane in which oligogenes containing 9 consecutive guanines are immobilized
  • Antigen A substance that triggers an immune response to produce antibodies, and is a total of substances that are generally considered foreign substances in the body.
  • Anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene Anti-CYFRA21-1 primary antibody-gene bound antibody-gene conjugate
  • Anti-CYFRA21-1 secondary antibody-Cy5 Anti-CYFRA21-1 secondary antibody with Cy5-dye (fluorescent marker) attached antibody-fluorescent marker conjugate
  • Autoantibody It refers to an antibody that reacts specifically with its own body composition, and is also called an autoantibody or an autoantibody.
  • Anti-CYFRA-21-1 Autoantibody An antibody that specifically responds to the CYFRA21-1 antigen, a protein related to lung cancer.
  • Anti-CYFRA-21-1 autoantibody-antigen conjugate Anti-CYFRA-21-1 autoantibody and CYFRA21-1 antigen combined form
  • Anti-Human IgG Antibodies that specifically react to human antibodies
  • Anti-human IgG antibody-Cy5 Anti-human IgG antibody with Cy5-dye (fluorescent marker) attached antibody-fluorescent marker conjugate

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Abstract

본 발명은 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>를 함유하는 항체조성물 A 및 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-측정표지>를 함유하는 항체조성물 B를 포함하는 폐암 진단용 면역학적 조성물; 이를 사용하여 인간의 생물학적 시료에서 폐암을 진단하는 방법, 및 이를 사용한 폐암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물 및 폐암 진단 방법은, 비침습적 생물학적 시료에서 폐암 0∼4기 발병 여부를 90% 이상의 특이도와 75% 이상의 민감도로 진단할 수 있으며, 특히 폐암 초기에 농도가 급격히 증가하는 자가항체를 이용하기 때문에, 초기 폐암 0∼1기 발병 여부를 76% 이상의 민감도로 진단할 수 있다.

Description

자가항체-항원 결합체를 이용한 폐암 진단용 면역학적 조성물, 이를 사용한 폐암 진단 방법 및 이를 포함하는 폐암 진단용 키트
본 발명은 자가항체-항원 결합체를 이용한 폐암 진단용 면역학적 조성물, 이를 사용한 폐암 진단 방법 및 이를 포함하는 폐암 진단용 키트에 관한 것이다.
폐암은 국제적으로 연간 100만명이 사망하는 것으로 알려져 있다. 지난 수십년 간 진단 및 치료 기술이 개발됐지만 특별한 자각증상이 없고 대부분 진행 암 또는 다른 부위에 전이된 상태에서 발견돼 폐암 환자의 완치율은 30% 이하로 예후가 매우 좋지 않다.
이러한 폐암이지만 조기 진단이 되면 생존율을 80% 이상 획기적으로 증가시킬 수 있으나, 현재 폐암 진단을 위해서는 이미징 방법(X-ray, CT, MRI 등)에 의존도가 높은 편으로 생화학적 지표로 사용될 수 있는 물질은 발견된 예가 적다.
현재 폐암 진단을 위해 바이오 마커라는 이름으로 제시된 물질들이 존재하지만, 여전히 충분한 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)을 나타내지 못하고 있다.
따라서 대내외적으로 급속도로 증가하고 있는 폐암의 유병률과 관련하여 선진국을 중심으로 폐암 바이오 마커 및 진단 키트의 개발 원천기술 확보는 반드시 필요하며 폐암을 조기 (0∼1기)에 발견할 수 있는 새로운 폐암 진단 방법 개발이 시급한 실정이다.
폐암의 진단 병법으로는 아래의 세가지가 있다:
1) 이미징 방법(X-ray, CT, MRI) : 현재 폐암 진단을 위해서는 이미징 방법에 의존도가 높은 편이나 폐암을 조기 진단하기에는 민감도 및 특이도가 좋지 못하다.
2) 조직검사 : 조직검사 방법으로는 가래 세포검사, 기관지 내시경검사, 세침 흡인 검사, 종 격동 내시경 검사 등이 있으며 생검 조직을 필요로 하는 병리학적, 세포학적 검출 방법으로 침습적이며, 반복 측정하기 어렵다는 단점이 있다.
3) 종양표지자 검사 : 악성 종양을 진단하는 비 침습적인 진단방법, 예후를 예측하고, 치료 효과를 판정하는 데에 좋은 인자로 널리 이용되고 있다. 이중 CYFRA21-1은 cytokeratin 19의 분절로 1993년 폐암 표지자로 제시된 이후 그 유용성에 관한 연구가 계속해서 진행되고 있으며, 많은 연구에서 비소세포성 폐암의 표지자로서 가치를 인정받고 있다. 그러나 대부분의 종양표지자는 농도가 일정 이상이 되면 암, 그렇지 않으면 정상으로 판단하는 기준치(cut off)를 이용하기 때문에 정상과 암환자를 구분하는 정확도에 있어서는 한계점을 가지고 있다.
정상 기준치 수치를 넘어섰다고 해도 암이라고 확신할 수 없으며 정상 기준치 이하라고 암이 아니라고 할 수도 없음. 때문에 암을 확진하기 위해서는 조직검사 등의 정밀검사가 필요하다.
종양표지자 검사는 항원 검출 방법을 기본으로 이루어져 있으며 종양표지자 대한 연구는 지속적으로 연구되어 왔으나 종양표지자 검사만으로는 혈액내 종양표지자의 양적 변화가 암 병기 0∼3기 까지는 매우 작게 나타나며 4기 수준에서 양적 차이가 나타나기 때문에 양적 변화가 미세한 종양표지자인 항원만을 이용한 검사만으로는 89% 특이도 및 43% 민감도로 낮게 나타나기 때문에 정상과 암을 구분하기 쉽지 않으며 특히 암 0∼1 기 단계에서는 정상과 암의 구분이 매우 어렵다.
따라서 정상과 암을 구분하기 위해서는 정상과 암이 발생한 경우에 혈액 내에서 양적 변화가 매우 크게 나타나는 새로운 종양표지자(marker) 및 이를 이용한 새로운 검출 및 진단 방법이 필요하게 되었다.
항원에 특이적으로 반응하는 자가항체는 암이 발생하게 되면 양적 증가가 나타나는데 암 병기 초기 (0∼1기)에서는 면역체계가 활발하기 때문에 자가항체의 양적 증가가 가장 크게 나타나며 정상일 때 보다 5∼10배 이상 증가폭을 나타낸다.
본 발명은 정상 대비 암인 경우에 혈액 내 양적 증가가 매우 크게 나타나는 자가항체를 측정하여 정상과 암을 구분하는 방법을 개발하고자 하였다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지가 포함되어 있는 항체조성물 A; 및 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-인간 IgG 항체-측정표지가 포함되어 있는 항체조성물 B;를 포함하는 폐암 진단용 면역학적 조성물을 제공한다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상술한 폐암 진단용 면역학적 조성물을 이용하여 인간의 생물학적 시료에서 폐암을 진단하는 방법이 제공되며, 하기 단계를 포함한다:
(a) 항체조성물 A를 이용하여 CYFRA21-1 항원의 농도를 측정하는 단계;
(b) 항체조성물 B를 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a)에서 얻어진 농도 및 상기 (b)에서 얻어진 농도의 비율로부터, 상기 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물 및 폐암 진단 방법은, 비침습적 생물학적 시료에서 폐암 0∼4기 발병 여부를 90% 이상의 특이도와 75% 이상의 민감도로 진단할 수 있으며, 특히 폐암 초기에 농도가 급격히 증가하는 자가항체를 이용하기 때문에, 초기 폐암 0∼1기 발병 여부를 76% 이상의 민감도로 진단할 수 있다.
도 1은 정상인과 암환자를 대상으로 본 발명의 자가항체-항원 결합체 및 항원 측정법을 이용하여 얻어진 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>와 <CYFRA21-1 항원>에 대한 비율을 도시한 그래프이다.
도 2는 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>가 생물학적 시료 내의 <CYFRA21-1 항원>에 결합하여, <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<CYFRA21-1 항원>:<항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5> 복합체를 형성하는 것을 보여주는 개념도이다.
도 3은 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-Cy5>가 생물학적 시료 내의 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원>에 결합하여, <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>:<항-인간 IgG 항체-Cy5> 복합체를 형성하는 것을 보여주는 개념도이다.
도 4는 9G DNA 멤버레인 상에서 CYFRA21-1 항원 검출 형태를 나타낸 것이다.
도 5는 9G DNA 멤버레인 상에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 검출 형태를 나타낸 것이다.
도 6은 정상 및 폐암 병기별(0∼3기별)에 따른 암항원(Ag) 및 자가항체(오토항체, AAb)의 혈액내 양적 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 항원 검사(ELISA 방식)에 의한 항원 농도 그래프로서, 정상과 암환자를 구분하기 어려움을 보여준다.
도 8은 본 발명에 따른 <자가항체-항원 결합체> 및 <항원>의 농도 그래프로서, <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체> 및 <CYFRA21-1 항원>이 별개의 영역에서 나타나므로 정상과 암환자를 용이하게 구분할 수 있음을 보여준다.
도 9는 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>와 <항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5>를 포함하는 항체조성물 A의 개념도; 및 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-Cy5>를 포함하는 항체조성물 B의 개념도를 각각 보여준다.
도 10은 본 발명에 따른 폐암 진단 방법을 9G DNA 멤버레인 상에서 수행하였을 때, <CYFRA21-1 항원>이 검출되는 과정을 보여주는 개념도이다.
도 11은 본 발명에 따른 폐암 진단 방법을 9G DNA 멤버레인 상에서 수행하였을 때, <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>가 검출되는 과정을 보여주는 개념도이다.
도 12는 본 발명에 따른 폐암 진단용 키트를 9G DNA 멤버레인에 적용한 형태를 보여주는 도면이다.
도 13은 9G DNA 멤버레인에 적용된 폐암 진단용 키트를 검출 및 판독하는 과정을 보여주는 사진이다.
도 14는 본 발명에 따른 폐암 진단 조성물을 정상 200 검체 및 폐암 1∼4기 50 검체에 적용하여 폐암 민감도를 측정한 병원 임상 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지가 포함되어 있는 항체조성물 A; 및 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-인간 IgG 항체-측정표지 가 포함되어 있는 항체조성물 B;를 포함하는 폐암 진단용 면역학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정표지는 발색효소, 형광물질, 형광비드, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 형광물질로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 상술한 폐암 진단용 면역학적 조성물을 사용하여 인간의 생물학적 시료에서 폐암을 진단하는 방법을 제공하며, 하기 단계를 포함한다:
(a) <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>를 포함하는 항체조성물 A를 이용하여, 상기 생물학적 시료 중의 <CYFRA21-1 항원>의 유무 또는 농도를 측정하는 단계;
(b) <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-측정표지>를 포함하는 항체조성물 B를 이용하여, 상기 생물학적 시료 중의 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>의 유무 또는 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a)에서 얻어진 농도 및 상기 (b)에서 얻어진 농도의 비율로부터, 상기 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a)에서 형성된 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<CYFRA21-1 항원>:<항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지> 복합체 및 상기 (b)에서 형성된 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<항-CYFRA21-1 자가항체-항원>:<항-인간 IgG 항체-측정표지> 복합체의 비율을 이용하여 상기 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정할 수 있다.
본 발명은 상술한 폐암 진단용 면역학적 조성물 및 바이오칩을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 생물학적 시료에서의 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원의 검출방법에 관한 것이며, 또한 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 0∼1기를 포함하는 폐암을 진단하는 진단용 키트와 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 생체 시료내의 CYFRA21-1 항원 및 이와 결합된 형태의 항-CYFRA21-1 자가항체-항체 결합체를 측정 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지가 포함되어 있는 항체조성물 A; 및 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-인간 IgG 항체-측정표지 가 포함되어 있는 항체조성물 B;를 포함하는 폐암 진단용 면역학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 측정표지(marker for detection)는 발색, 발광, 형광 등의 방식으로 검출될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정표지는 형광물질, 형광비드, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 상술한 콜로이드는 일반적으로 육안 측정을 위한 표지자로서, 예를들면 나노금 콜로이드와 같은 나노금속 콜로이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 측정표지는 형광물질로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 시아닌 Cy3 (570nm 방출), Cy5 (670nm 방출), FAM, VIC, TET, JOE, HEX, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED가 사용될 있다.
본 발명의 두번째 목적은, 상술한 폐암 진단용 면역학적 조성물을 사용하여 인간의 생물학적 시료에서 폐암을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 하기 단계를 포함한다:
(a) <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>를 포함하는 항체조성물 A를 이용하여, 상기 생물학적 시료 중의 <CYFRA21-1 항원>의 농도를 측정하는 단계;
(b) <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-측정표지>를 포함하는 항체조성물 B를 이용하여, 상기 생물학적 시료 중의 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>의 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a)에서 얻어진 농도 및 상기 (b)에서 얻어진 농도의 비율로부터, 상기 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a)에서, 항체조성물 A에 함유된 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>가 생물학적 시료내의 <CYFRA21-1 항원>과 결합하여 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<CYFRA21-1 항원>:<항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지> 복합체를 형성시켜서, <CYFRA21-1 항원>의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (b)에서, 항체조성물 B에 함유된 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-측정표지>가 생물학적 시료내의 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>와 결합하여 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<항-CYFRA21-1 자가항체-항원>:<항-인간 IgG 항체-측정표지> 복합체를 형성시켜서, <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (c)에서, <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<CYFRA21-1 항원>:<항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지> 복합체 및 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<항-CYFRA21-1 자가항체-항원>:<항-인간 IgG 항체-측정표지> 복합체의 비율을 이용하여, 상기 생물학적 시료가 정상상태인지 폐암 발병 상태인지를 결정할 수 있으며, 경우에 따라 폐암 진행 상태를 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (c)에서, <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>/<CYFRA21-1 항원>의 비율이 일정 수치(cut off), 예를 들어 1 이상, 바람직하게는 1.5 이상, 더욱 바람직하게는 2 이상, 구체적으로 1∼4, 더욱 구체적으로는 1.5∼3에서 선택될 수 있는 수치보다 보다 높은 경우, 폐암으로 선별하거나 폐암 발병 또는 진행 상태인 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 및 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체는 고형 지지체에 고정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고형 지지체는 9G 멤버레인 또는 9G DNA 멤버레인을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항-CYFRA21-1 자가항체에 특이적인 항원은 CYFRA21-1 단백질일 수 있다.
또한, 면역 복합체가 <항-CFYRA21-1자가항체-항원> 결합체에 추가로 결합될 수 있다. 상기 <항-CFYRA21-1 자가항체-항원> 결합체는 인간의 자가항체-항원 결합체이고, 항-CFYRA21-1 자가항체-항원 결합체에 결합하는 분자는 항-인간 IgG 항체이다.
본 발명은 9G DNA 기술(Chemical Communications 2011, 47, 7104)에 기반한 DAGON 기술(Chemical Communications 2011, 47, 7616)이 적용된 플랫폼을 이용하여 비침습적인 방법인 혈액을 이용한 측정을 통하여 폐암을 0∼1기에서 발견하여 생존율을 높이고 삶의 질을 높이고자 하는데 목적이 있다.
따라서, 본 발명의 세번째 목적은, 상술한 폐암 진단용 면역학적 조성물 및 바이오칩을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 바이오칩은 9G 멤버레인 또는 9G DNA 멤버레인을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "9G 멤버레인"은 연속된 9개의 구아닌이 포함된 올리고 유전자가 고정화 되는 표면이 캘릭스아렌 유도체로 변성된 유리 섬유 멤버레인을 의미하고, 용어 "9G DNA 멤버레인"은 연속된 9개의 구아닌이 포함된 올리고 유전자가 고정화된 유리섬유 멤버레인을 의미한다. "9G 멤버레인" 및 "9G DNA 멤버레인"은 상술한 9G DNA 기술(Chemical Communications 2011, 47, 7104)에 기반을 두고 있다.
이하에 본 발명은 실시예와 도면을 참조로 더욱 상세히 설명되나, 이들로 본 발명이 한정되지는 않는다.
본 발명은 정상 대비 암인 경우에 혈액 내 양적 증가가 매우 크게 나타나는 자가항체를 측정하여 항원과의 양적 비율을 이용하여 정상과 암을 구분하는 방법이다.
폐암이 발생되면 혈액내에서 양적 증가를 나타내는 암 관련 단백질인 CYFRA21-1 항원과 이 CYFRA21-1 항원에 특이적으로 반응하는 항-CYFRA21-1 자가항체의 양적 증가가 나타나게 되는데 항-CYFRA21-1 자가항체는 항원과 결합한 형태인 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체로 존재한다.
본 발명은 암 0∼1기에서 양적 증가가 거의 없는 CYFRA21-1 항원과 양적 증가 폭이 매우 큰 항-CYFRA21-1 자가항체와 결합한 항원 결합체의 양을 정확하게 검출하여 이들의 양적 비율을 이용하여 정상과 암을 조기에 발견할 수 있는 방법을 제공한다(도 1 참조).
정상과 암을 암 0∼1기 단계에서 구분하기 위해서는 생물학적 시료내의 항원 및 자가항체의 양적 변화를 정확하게 측정해야 하는데 이것은 시료내의 어떠한 간섭현상 및 비특이적인 반응이 없어야 한다.
본 발명에서 이미 알려진 방법으로(대한민국 등록특허 10-0883763, 10-1682347) 제조된 유전자가 고정화된 유리섬유를 이용하여 간섭현상 및 비특이적인 반응이 없는 폐암 진단용 키트를 제조하였고 이의 사용방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 생체 시료내의 CYFRA21-1 항원 및 이와 결합된 형태의 항-CYFRA21-1 자가항체-항체 결합체를 측정 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 항-CYFRA21-1 자가항체-항체 결합체 및 CYFRA21-1 항원 측정을 위한, 형광면역측정법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 인간의 생물학적 시료에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CFYRA21-1 항원의 유무 및 비율을 검정하는, 하기의 단계들을 포함하는 면역측정법을 제공한다:
(a) 항체조성물 A를 이용하여 CYFRA21-1 항원의 유무 또는 농도를 검정하는 단계: 상기의 단계에서는 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자) 및 (항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 가 생물학적 시료내의 (CYFRA21-1 항원)과 결합하여 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(CYFRA21-1 항원):(항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 복합체를 형성된다. (도2)
(b) 항체조성물 B를 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 유무 또는 농도를 검정하는 단계: 상기의 단계에서는 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자) 및 (항-인간 IgG 항체-Cy5) 가 생물학적 시료내의 (항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체)와 결합하여 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(항-CYFRA21-1 자가항체-항원):(항-인간 IgG 항체-Cy5) 복합체가 형성된다. (도3)
(c) 상기에서 형성된 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(항-CYFRA21-1 자가항체-항원):(항-인간 IgG 항체-Cy5) 복합체 및 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(CYFRA21-1 항원):(항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 복합체 비율을 이용하여 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계.
본 발명은 정상과 폐암환자의 혈액, 혈장과 같은 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 91.7%의 특이도와 1기 76%, 2기 80%, 3기 77%, 4기 50%의 민감도로 1∼4기 폐암의 발병 여부를 진단할 수 있으며 진단하는 키트와 사용방법을 제공한다.
특히 자가항체가 급격히 증가하는 시기인 암 병기 0∼1기에서 76 % 민감도 수준으로 폐암의 진단 효과가 높게 나타나기 때문에 폐암 초기단계인 0∼1기에서 폐암 진단에 매우 효과적이다.
첨부된 도 6은 정상 및 폐암 병기별(0∼3기별)에 따른 폐암 종양표지자인 암항원(Ag) 및 자가항체(오토항체, AAb)의 혈액내 양적 변화를 보여주는 그래프이다.
도 6을 참조하면, 암항원(Ag)은 정상 상태에서 폐암 0∼3기까지 변화량이 많지 않고, 폐암이 상당히 진행된 폐암 3∼4기에서야 높은 변화량을 나타내기 때문에, 적어도 폐암 0∼1기의 초기 단계에서는 항원 검사만으로는 정상 상태와 폐암 발병 상태를 구분하여 진단하는 것이 용이하지 않음을 알 수 있다. 반면, 자가항체(AAb)는 초기 단계인 폐암 0∼1기에 정상 상태에 비해 5∼10배 이상 증가하여 명확한 변화량을 보이므로, 폐암을 초기(0∼1기)에 진단할 수 있음을 보여준다.
본 발명은 생물학적 시료내의 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원 마커의 증감을 정확하게 검출할 수 있도록 항체에 유전자가 결합된 형태의 “항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자” 를 사용하였으며 용액상에서 항원-항체-유전자 복합체가 형성된 후 유전자가 고정된 고체 기질과 항원-항체-유전자 복합체가 고정되기 때문에 생물학적 시료내의 어떠한 간섭현상이나 비 특이적인 반응 없이 고정될 수 있어 혈액 내 마커의 양적 변화를 정확하게 측정할 수 있는 방법이다.
아래 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.
<실시예 1> CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합체 제조 및 정제
CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합에 사용한 물질은 아래의 표 1에 기재되어 있으며, 사용한 타겟 유전자(TD)의 염기서열은 표 2에 기재되어 있다
실시예 1에 사용한 물질 분자량 농도
CYFRA21-1 1차 항체 160,000 g/mol 7.1 mg/ml, 35㎕
2-iminothiolane 137 g/mol 4 mg/ml
sulfo-SMCC 436 g/mol 80 mg/ml
TD02 9000 g/mol 100 pmol/ml
10xPBS - -
500mM EDTA - -
타겟 유전자 염기서열
TD02 5'-NH2-TTTTTTTTTCCTCCCCAAGTCGTAGG
CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합체의 제조는 표1의 물질을 사용하여 이미 알려진 방법에 따라 제조 및 정제하여 CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합체 2mg/ml 농도 80 ㎕를 얻었다. (대한민국 등록특허 10-1682347, 실시예1, 도1 참조)
<실시예 2> 형광 표지물질이 부착된 항체-측정표지 결합체의 제조 및 정제
측정표지로서 형광물질을 사용하여 <항체-측정표지> 결합체를 제조하였으며, 이의 제조에 사용된 물질들을 하기 표 3에 기재한다.
실시예 2에 사용한 물질 분자량 농도
CYFRA21-1 2차 항체 160,000 g/mol 7.1 mg/ml, 35㎕
항-인간 IgG 항체 160,000 g/mol 7.6 mg/ml, 33㎕
Cy5-bis NHS ester(표지물질) 436 g/mol 1 pack in DMSO 20㎕
10xPBS - -
500mM EDTA - -
실시예 1,2에서 제조된 물질 농도 볼륨
CYFRA21-1 1차 항체 2 mg/ml 80㎕
CYFRA21-1 2차 항체 2.5 mg/ml 70㎕
항-인간 IgG 항체 3 mg/ml 60㎕
표 4에는 실시예 1 및 2에서 수득된 생성물의 농도 및 부피가 각각 기재되어 있다.
<실시예 3> 폐암 진단용 항체조성물 A 및 B의 제조
표 5에 기재된 물질을 사용하여, 항체조성물 A 및 B를 제조하였다. 항체의 농도는 모두 300 ㎕/ml로 희석하여 사용하였다.
항체조성물 사용물질 농도 사용량
A 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 300 ㎍/ml 4 ㎕
항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5 300 ㎍/ml 4 ㎕
1XPBS - 3.992 ml
B 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 300 ㎍/ml 4 ㎕
항-인간 IgG 항체-Cy5 300 ㎍/ml 4 ㎕
1XPBS - 3.992 ml
5ml 튜브(tube)에 각각의 구성 물질을 사용량에 따라 첨가하여 혼합하였다.
<실시예 4> 폐암 진단용 올리고 유전자 고정화 및 9G DNA 멤버레인 제조
하기 표 6에 탐침 유전자 염기서열을 기재한다.
탐침명 염기서열 농도
HC probe GGGGGGGGG TTT ATA TTT CGGGCAG GCCATAGCGA 100 pmol/㎕
TD02 probe GGGGGGGGG TTT ATA TTT CCTACGA CTTGGGGAGG 100 pmol/㎕
폐암 진단용 올리고 유전자 고정화 및 9G DNA 멤브레인 제조에 사용한 물질은 표 6에 기재되어 있으며 이미 알려진 방법에 따라 도 9와 같이 9G DNA 멤버레인을 제조하였다. (대한민국 등록특허 제10-0883763호, 실시예 2 및 3 참조)
<실시예 5> CYFRA21-1 항원 단백질 및 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 검출
CYFRA21-1 항원 단백질 및 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 검출 방법에 대한 개념은 도 4 및 도 5에, 그 실험 과정은 도 10 및 도 11에 도식적으로 설명되어 있다.
1)혈액샘플 및 사용물질 준비
정상인과 암환자의 혈액샘플은 정상 200 검체, 폐암 1∼4기 50 검체를 이용하였으며 원자력 병원 (KOREA CANCER CENTER HOSPITAL)에서 (IRB # KIRAMS 2018-10-006, 2018-06-016) 샘플을 이용하였다. 암환자 샘플은 조직검사로 폐암이 확진된 환자의 혈장샘플을 이용하였다. 정상인의 샘플은 건강검진에 참여한 정상인의 샘플을 이용하였다. 실험에 사용한 물질은 표 7에 기재되어 있다.
사용물질
CYFRA21-1 항원 검출용 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
혈액샘플 (20 ㎕) 혈액샘플 (20 ㎕)
항체조성물 A (100 ㎕) 항체조성물 B (100 ㎕)
R buffer (60 ㎕) R buffer (60 ㎕)
W buffer (180 ㎕) W buffer (180 ㎕)
항원 검출용 9G DNA 멤버레인 자가항체-항원 검출용 9G DNA 멤버레인
2) 샘플 혼합 및 인큐베이션
가. CYFRA21-1 항원 검출용
항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 표준물질 20 ㎕를 넣고 표7에서 준비한 항체조성물 A 100 ㎕를 혼합하여 11 분 동안 상온에서 인큐베이션 하였다.
나. 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
자가항체-항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 표준물질 20 ㎕를 넣고 표7에서 준비한 항체조성물 B 100 ㎕를 혼합하여 11 분 동안 상온에서 인큐베이션 하였다.
3) 샘플 로딩 및 교잡반응
가. CYFRA21-1 항원 검출용
반응물 120 ㎕ 가 들어있는 항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 R buffer 60 ㎕를 첨가 후 샘플을 모두 취하여 180 ㎕를 항원-검출용 도 12의 9G DNA 멤버레인의 샘플포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 교잡반응 하였다.
나. 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
반응물 120 ㎕ 가 들어있는 자가항체-항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 R buffer 60 ㎕를 첨가 후 샘플을 모두 취하여 180 ㎕를 자가항체-항원 검출용 도 12의 9G DNA 멤버레인 샘플포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 교잡반응 하였다.
4) 세척 및 스캔
가. CYFRA21-1 항원 검출용
W buffer 180 ㎕를 항원 검출용 9G DNA 멤버레인의 세척포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 세척 후 도 13에 나타난 것처럼 1D Scanner를 이용하여 판독하였다.
나. 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
W buffer 180 ㎕를 자가항체-항원 검출용 9G DNA 멤버레인의 세척포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 세척 후 도 13에 나타난 것처럼 1D Scanner를 이용하여 판독하였다.
5) 결과 분석
5.1) CYFRA21-1 항원 검출에 대한 형광감도 결과
항체조성물 A를 이용하여 정상인과 폐암환자의 혈액샘플에 대한 CYFRA21-1 항원 검출에 대한 형광감도를 확인하였으며 표 8에 나타나 있다.
CYFRA21-1 정상인 혈액샘플 폐암환자 혈액샘플
A. 항원 형광감도 26745 19935
CYFRA21-1 항원에 대한 형광감도의 평균값은 정상인 혈액샘플에서 26745로 나타나며 폐암환자 혈액샘플에서 19935로 나타나는 것을 확인하였다.
5.2) 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출에 대한 형광감도
항체조성물 B를 이용하여 정상인과 폐암환자의 혈액샘플에 대한 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출에 대한 형광감도를 확인하였으며 표 9에 나타나 있다.
CYFRA21-1 정상인 혈액샘플 폐암환자 혈액샘플
B. 자가항체-항원 형광감도 26862 47167
CYFRA21-1 자가항체-항원에 대한 형광감도의 평균값은 정상인 혈액샘플에서 26862로 나타나며 폐암환자 혈액샘플에서 47167로 나타나는 것을 확인하였다.
5.3) 혈액샘플에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원/CYFRA21-1 항원 비율 확인
도 7에 나타난 것처럼 종양표지자 CYFRA21-1 항원 검사만으로는 정상과 암을 구분할 수 없다. 대부분의 암 관련 항원 (종양표지자)은 암이 발생하면 혈액내 양적증가가 나타나는데 암 병기 0∼3기 까지의 양적 변화가 매우 작고 4기 단계가 되어서야 양적 변화의 차이가 나타나기 때문에 일반적으로 정상과 암의 구분이 쉽지 않으며 암 0∼1 기인 경우에는 더더욱 구분할 수 없다.
항-CYFRA21-1 자가항체는 폐암에 대한 CYFRA21-1 항원이 있을 때 특이 반응하는 자가항체로 암 0∼1 기에서 그 양적 증가는 정상일 때 보다 5 - 10배 이상 증가하게 된다.
그렇기 때문에 정상과 암을 항-CYFRA21-1 자가항체와 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 정상 대비 일정 수치 (cut off) 이상이면 암으로 판정할 수 있다.
CYFRA21-1 정상인 혈액샘플 폐암환자 혈액샘플
B. 자가항체-항원 형광감도 26862 47167
A. 항원 형광감도 26745 19935
B/A 비율 1.03 2.15
형광 감도 결과는 표10에 나타나 있으며 암병기에 따른 분석결과는 도 14에 나타나있다. CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 / 항원의 비율 (B/A )이 각각 정상인 1.03 및 폐암환자 2.15로 확인되었다. B/A 비율 값의 Cut off 1.5를 기준으로 1.5 이하는 정상으로 판정되며 1.5 이상은 폐암으로 판정하였다. 200명의 정상인에 대해 91.7%의 특이도를 얻었으며 50명의 암환자를 대상으로 1기 76%, 2기 80%, 3기 77%, 4기 50%의 민감도를 얻었다.
자가항체가 급격히 증가하는 시기인 암 병기 0∼1기에서는 76 % 민감도 수준으로 효과가 매우 크게 나타나서 폐암 조기 진단용 키트 개발에 효과가 있음을 증명하였다.
본 명세서에서 자주 사용되는 용어에 대한 간단한 설명을 아래에 부기하지만, 이들은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되며, 본 발명의 범위를 한정하거나 제한하는 의도로 사용되어서는 안된다.
1. 9G 멤버레인 : 연속된 9개의 구아닌이 포함된 올리고 유전자가 고정화 되는 표면이 캘릭스아렌 유도체로 변성된 유리 섬유 멤버레인
2.9G DNA 멤버레인 : 연속된 9개의 구아닌이 포함된 올리고 유전자가 고정화된 유리섬유 멤버레인
3.항원 (Antigen, Ag): 면역반응을 일으켜 항체를 생산하게끔 만드는 물질, 일반적으로 체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체.
4.CYFRA21-1 항원: 폐암 관련 종양표지자
5.항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 : 항-CYFRA21-1 1차 항체에 유전자가 결합된 항체-유전자 결합체
6.항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5 : 항-CYFRA21-1 2차 항체에 Cy5-dye (형광표지자)가 부착된 항체-형광표지자 결합체
7.자가항체(Autoantibody, AAb) : 자기의 체성분과 특이적으로 반응하는 항체를 의미하며, 자가항체 또는 오토항체 라고도 한다.
8.항-CYFRA-21-1 자가항체 (anti-CYFRA21-1 Autoantibody): 폐암 관련 단백질인 CYFRA21-1 항원에 특이적으로 반응하는 항체
9.항-CYFRA-21-1 자가항체-항원 결합체 : 항-CYFRA-21-1 자가항체와 CYFRA21-1 항원이 결합된 형태
10.항-인간 IgG 항체(anti-Human IgG) : 인간 항체에 특이적으로 반응하는 항체
11. 항-인간 IgG 항체-Cy5 : 항-인간 IgG 항체에 Cy5-dye (형광표지자)가 부착된 항체-형광표지자 결합체

Claims (15)

  1. 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지를 함유하는 항체조성물 A; 및
    항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 항-인간 IgG 항체-측정표지를 함유하는 항체조성물 B;
    를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 측정표지는 발색효소, 형광물질, 형광비드, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 측정표지는 형광물질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  4. 인간의 생물학적 시료에서, 제1항에 따른 폐암 진단용 조성물을 사용하는 폐암 진단 방법으로서,
    (a) <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>를 포함하는 항체조성물 A를 이용하여, 상기 생물학적 시료 중의 <CYFRA21-1 항원>의 유무 또는 농도를 측정하는 단계;
    (b) <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-측정표지>를 포함하는 항체조성물 B를 이용하여, 상기 생물학적 시료 중의 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>의 유무 또는 농도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (a)에서 얻어진 농도 및 상기 (b)에서 얻어진 농도의 비율로부터, 상기 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계;
    를 포함하는, 폐암 진단 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (a)에서, 항체조성물 A에 함유된 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지>가 생물학적 시료내의 <CYFRA21-1 항원>과 결합하여 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<CYFRA21-1 항원>:<항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지> 복합체를 형성시켜서, <CYFRA21-1 항원>의 유무 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (b)에서, 항체조성물 B에 함유된 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자> 및 <항-인간 IgG 항체-측정표지>가 생물학적 시료내의 <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>와 결합하여 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<항-CYFRA21-1 자가항체-항원>:<항-인간 IgG 항체-측정표지> 복합체를 형성시켜서, <항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체>의 유무 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 (c)에서, <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<CYFRA21-1 항원>:<항-CYFRA21-1 2차 항체-측정표지> 복합체 및 <항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자>:<항-CYFRA21-1 자가항체-항원>:<항-인간 IgG 항체-측정표지> 복합체의 비율을 이용하여 상기 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 및 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체는 고형 지지체에 고정되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 고형 지지체는 9G 멤버레인 또는 9G DNA 멤버레인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  11. 제4항에 있어서,
    상기 항-CYFRA21-1 자가항체에 특이적인 항원은 CYFRA21-1 단백질인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  12. 제4항에 있어서,
    상기 측정표지는 발색효소, 형광물질, 형광비드, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 측정표지는 형광물질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단 방법.
  14. 제1항에 폐암 진단용 면역학적 조성물 및 바이오칩을 포함하는 폐암 진단용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 바이오칩은 9G 멤버레인 또는 9G DNA 멤버레인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 키트.
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