WO2020175735A1 - 신규 프로모터 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법 - Google Patents

신규 프로모터 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법 Download PDF

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WO2020175735A1
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이지혜
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y603/04—Other carbon-nitrogen ligases (6.3.4)
    • C12Y603/04004—Adenylosuccinate synthase (6.3.4.4)

Definitions

  • the present application relates to a polynucleotide having a novel promoter activity, a composition for gene expression comprising the same, a microorganism, a method for preparing a purine nucleotide using the same, and a use of the polynucleotide.
  • IMP 5'-inosine monophosphate
  • GMP 5'-guanine monophosphate
  • a method of producing IMP As a method of producing IMP, a method of enzymatically decomposing ribonucleic acid extracted from yeast cells, a method of chemically phosphorylating inosine produced by fermentation (Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972), etc.) And a method of culturing a microorganism that directly produces IMP and recovering IMP in a culture solution.
  • the most widely used method is a method using a microorganism capable of directly producing IMP.
  • a method of manufacturing GMP a method of converting 5'-xanthosine monophosphate (XMP) produced by a microbial fermentation method into GMP using a coryneform microorganism, and XMP produced by a microbial fermentation method are essay.
  • XMP 5'-xanthosine monophosphate
  • the productivity of XMP, a precursor of the conversion reaction during microbial fermentation should be enhanced, and not only the produced XMP but also GMP already generated during the entire process of the conversion reaction Should not be lost.
  • enzymes in their natural state do not always exhibit optimal properties in terms of activity, stability, and substrate specificity for optical isomers required for industrial use. Therefore, various enzymes are improved suitable for the intended use through amino acid sequence mutations. Attempts have been made. Among them, rational design of enzymes and site-directed mutagenesis methods are applied to improve enzyme function, but in many cases, information on the structure of the target enzyme is insufficient or structure- It has a disadvantage that it cannot be effectively applied because the correlation between functions is not clear. In this case, it has been reported that the activity of the enzyme is improved by attempting to improve the enzyme through a directed evolution method of screening for an enzyme of a desired trait from a mutant enzyme library constructed through random mutation of an enzyme gene.
  • One object of the present application is to provide a polynucleotide having promoter activity.
  • Another object of the present application is to provide a composition for gene expression comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present application is to provide a vector comprising a gene encoding the polynucleotide and the protein of interest.
  • Another object of the present application is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium containing the vector.
  • Another object of the present application is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium comprising a gene encoding the polynucleotide and the protein of interest.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing purine nucleotides, including the step of culturing the microorganism in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a use of the polynucleotide for increasing the expression of a protein of interest.
  • the prepared purine nucleotides can be applied to various products such as human food or food additives, seasonings, pharmaceuticals, as well as animal feed or animal feed additives.
  • One aspect of the present application for achieving the above object is to provide a polynucleotide having promoter activity, including one or more nucleotide substitutions in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present application provides a polynucleotide having promoter activity including one or more nucleotide substitutions in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the polynucleotide substitution is a group consisting of substitution of 143 nucleotide and substitution of 189 nucleotide. It includes at least any one selected from.
  • a) the 143th nucleotide is substituted with thymine (T)
  • b) the 189th nucleotide is substituted with thymine (T)
  • c) the 143th nucleotide is It is to provide a polynucleotide having promoter activity in which thymine (T) is substituted and the 189th nucleotide is substituted with thymine (T).
  • polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide units are connected in a long chain by covalent bonds, and is a DNA strand having a predetermined length or more.
  • the term "polynucleotide having promoter activity" refers to a DNA region present near a site to which a target gene is transcribed, including a site to which an RNA polymerase or enhancer, etc. binds for the expression of the target gene to be linked later do.
  • the polynucleotide may be used as a universal weakening promoter. As an example, it can be used as a promoter capable of weakening the expression of adenilosuccinate synthetase.
  • the polynucleotide refers to a polynucleotide involved in producing or increasing purine nucleotides, but is not limited thereto.
  • SEQ ID NO: 1 refers to a polynucleotide sequence having promoter activity.
  • the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained from GenBank of NCBI, a known database. For example, it may be derived from Corynebacterium sp. , but is not limited thereto.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide in which the 143th and/or 189th nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with other nucleotides.
  • a polynucleotide is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology or identity with SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 1 ( identity) means that the 143th and/or 189th nucleotides in the nucleotide sequence are substituted with other nucleotides.
  • the nucleotide sequence having homology or identity may be a sequence having 100% identity excluded or less than 100% identity in the above categories.
  • the polynucleotide of the present application in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a) the 143th nucleotide is substituted with thymine (T), b) the 189th nucleotide is substituted with thymine (T), or c) the 143th nucleotide Is substituted with thymine (T) and the 189th nucleotide is substituted with thymine (T), but may have promoter activity, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide of the present application may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide in which the 143th nucleotide of the present application is substituted with thymine (T) is SEQ ID NO: 2
  • the polynucleotide in which the 189th nucleotide is substituted with thymine (T) is SEQ ID NO: 3 or the 143th nucleotide is thymine
  • the polynucleotide in which T) and the 189 nucleotide is substituted with thymine (T) may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology or identity with SEQ ID NO: 2, 3, or 4 ) May have.
  • the polynucleotide sequence having homology or identity may be a sequence having 100% identity excluded or less than 100% identity in the above categories.
  • Homology and identity refer to the degree to which two given base sequences are related and can be expressed as a percentage.
  • sequence homology or identity of conserved polynucleotides is determined by standard alignment algorithms, and the default gap penalty established by the program used can be used together.
  • Substantially, homologous or identical sequences are generally in moderate or high stringent conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the sequence or full-length. (stringent conditions) can be hybridized.
  • Polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in hybridizing polynucleotides are also contemplated.
  • GAP program defines the total number of symbols in the shorter of two sequences, divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a monolithic comparison matrix (contains values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. As disclosed by 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); And (3) no penalty for end gaps.
  • the term “homology” or “identity” refers to the relevance between sequences.
  • polynucleotide of the present application has various modifications to the coding region within a range that does not change the polynucleotide sequence due to the degeneracy of the codon or in consideration of the preferred codon in the organism to express the polynucleotide. This can be done. Any polynucleotide sequence in which the 143th and/or 189th nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with other nucleotides may be included without limitation.
  • a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence for all or a part of the nucleotide sequence and hydride under stringent conditions, the 143th and/or 189th in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • Any polynucleotide sequence in which nucleotides are substituted with other nucleotides may be included without limitation.
  • the "stringent condition” means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., homolog).
  • genes with high homology or identity 40% or more, specifically 80% or more, 85% or more, 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically Under conditions of hybridization between genes having more than 97%, in particular, more than 99% homology or identity, and not hybridizing between genes with lower homology or identity, or washing of ordinary southern hybridization Conditions 60°C, 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1XSSC, at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, once, specifically Conditions for washing 2 times to 3 times can be listed as examples.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have a complementary sequence, although a mismatch between bases is possible depending on the stringency of the hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art according to the purpose.
  • the appropriate stringency to hybridize a polynucleotide depends on the length and degree of complementarity of the polynucleotide, and the parameters are well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • Another aspect of the present application is to provide a composition for gene expression comprising the polynucleotide.
  • the composition for gene expression refers to a composition capable of expressing a gene that can be expressed by the promoter of the present application.
  • the composition for gene expression includes a polynucleotide having a novel promoter activity, and may further include, without limitation, a configuration capable of operating the polynucleotide as a promoter.
  • the polynucleotide may be in a form included in a vector so as to express an operably linked gene in the introduced host cell.
  • Another aspect of the present application includes a polynucleotide having the promoter activity, or a vector including a gene encoding the polynucleotide and a protein of interest.
  • the target protein may be adenilosuccinate synthetase, but is not limited thereto.
  • vector means a DNA preparation containing a base sequence encoding the target polynucleotide operably linked to a suitable control sequence so that the target polynucleotide can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • Vectors can be transformed into a suitable host cell and then replicated or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it can be replicated in the host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as a phage vector or a cosmid vector, and as a plasmid vector, pBR system, pUC system, pBluescriptII system , pGEM system, pTZ system, pCL system, pET system, etc. can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, and the like can be used.
  • Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for confirming whether the chromosome is inserted may be additionally included.
  • Selectable markers are used to select cells transformed with a vector, i.e., to confirm the insertion of a nucleic acid molecule of interest, and impart a selectable phenotype such as drug resistance, nutrient demand, resistance to cytotoxic agents or expression of surface polypeptides Markers can be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or exhibit other phenotypic traits, and thus transformed cells can be selected.
  • the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium, including a vector including a polynucleotide having a promoter activity of the present application and a gene encoding a protein of interest.
  • the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium, including a polynucleotide having a promoter activity of the present application and a gene encoding a protein of interest.
  • the microorganism is a microorganism produced by transformation with a vector containing a polynucleotide having the promoter activity and a gene encoding a protein of interest, or a polynucleotide having the promoter activity and a gene encoding the protein of interest are included It may be a microorganism, but is not limited thereto.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • Transformed polynucleotides may include all of them, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA or RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may generally include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replicating.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked in the above means that a promoter sequence for initiating and mediating transcription of a polynucleotide having promoter activity of the present application and the gene sequence are functionally linked.
  • a microorganism including a polynucleotide and a target protein refers to a microorganism in which expression of a target protein is regulated with the polynucleotide.
  • the microorganism may be a microorganism capable of producing purine nucleotides, a microorganism having a naturally weak purine nucleotide-producing ability, or a microorganism in which the purine nucleotide-producing ability is imparted to a parent strain that has no purine nucleotide-producing ability.
  • the microorganism may be a microorganism weakening adenilosuccinate synthetase, for example, a polynucleotide in which the 143th and/or 189th nucleotide in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another nucleotide. It may be a microorganism containing, but is not limited thereto.
  • the microorganism is a microorganism comprising a polynucleotide having a promoter activity including one or more nucleotide substitutions in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the polynucleotide substitution is the 143th nucleotide substitution with thymine (T). , And/or the 189th nucleotide may be substituted with thymine (T).
  • the host cells or microorganisms may belong to the scope of the present application as long as they are capable of producing purine nucleotides including the polynucleotide and the protein of interest for the purpose of the present application.
  • the microorganism producing purine nucleotides may be used in combination with a microorganism producing purine nucleotides and a microorganism having purine nucleotide-producing ability.
  • purine nucleotide means a nucleotide containing a purine-based structure.
  • it may be IMP, XMP or GMP, but is not limited thereto.
  • IMP 5'-inosine monophosphate
  • nucleic acid-based materials composed of the following formula (1).
  • 5'-inosine monophosphate 5'-inosine acid by the IUPAC name, and is widely used as a flavor enhancer along with XMP or GMP in food.
  • GMP (5'-guanine monophosphate) is one of nucleic acid-based substances composed of the following formula (2).
  • the IUPAC name is [(2R,3S,4R,5R)-5-(2-Amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydro-2-furanyl]methyl It is dihydrogen phosphate, and is also called 5'-guanidylic acid, 5'-Guanylic acid, or guanylic acid.
  • GMP is widely used as a food additive such as sodium guanyate, dipotassium guanyate, and calcium guanyate in the form of a salt, and when used as an additive with IMP, it has a synergistic effect to enhance taste.
  • GMP may be converted from XMP to be manufactured, but is not limited thereto.
  • the promoter of the present application can increase the production of XMP, and GMP can also be converted from the increased XMP to increase the production, and the GMP can also be used in the present application. It is obvious to be included in the scope.
  • XMP (5'-xanthosine monophosphate) is an intermediate substance for purine metabolism composed of the following formula (3).
  • IUPAC is also called 5'-inosine monophosphate, 5'-xanthylic acid, and is formed from IMP through the action of IMP dehydrogenase, or XMP can be converted to GMP through the action of GMP synthase.
  • XMP can be formed from XTP by (d) the enzyme deoxyribonucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase containing XTPase activity.
  • microorganism producing purine nucleotides includes all wild-type microorganisms or microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and causes such as insertion of an external gene or enhancement or inactivation of the activity of an endogenous gene. As a result, a specific mechanism is weakened or enhanced, and may be a microorganism having a genetic mutation or enhanced activity for the production of a desired purine nucleotide.
  • the microorganism producing the purine nucleotide is characterized in that the production capacity of the desired purine nucleotide is increased, including the polynucleotide, and may specifically be a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • a microorganism producing purine nucleotides or a microorganism having purine nucleotide-producing ability may be a microorganism in which a part of a gene in the purine nucleotide biosynthesis pathway is strengthened or weakened, or a part of a gene in the purine nucleotide degradation pathway is strengthened or weakened. have.
  • the microorganism may have enhanced expression of purF , a gene encoding phosphoribosylpyrrophosphate amidotransferase, or enhanced expression of purA .
  • the expression of guaB a gene encoding 5'-inosine dehydrogenase, may be regulated according to purine nucleotides. Specifically, when the purine nucleotide is IMP, guaB expression may be weakened, and when the purine nucleotide is XMP or GMP, guaB expression may be enhanced, but is not limited thereto.
  • the term "the genus Corynebacterium microorganism that produces purine nucleotides” may be a microorganism of the genus Corynebacterium that has the ability to produce purine nucleotides through natural or mutation.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having the ability to produce purine nucleotides is transformed with a vector containing a polynucleotide having a promoter activity of the present application or a gene encoding the polynucleotide and the target protein
  • it may be a microorganism of the genus Corynebacterium that has improved purine nucleotide production capability.
  • The'microorganism of the genus Corynebacterium that has improved purine nucleotide production ability' refers to a microorganism having improved purine nucleotide production ability than a parent strain or an unmodified microorganism before transformation.
  • The'unmodified microorganism' is a natural strain itself, or a microorganism that does not contain a protein variant that produces the purine nucleotide, or a microorganism that has not been transformed with a vector containing a gene encoding the polynucleotide and the target protein. do.
  • the "microorganisms of the genus Corynebacterium” specifically refers to Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Brevibacterium lactofermentum ( Brevibacterium lactofermentum ) , or the like Brevibacterium Plastic pan (Brevibacterium flavu m), Corynebacterium thermo amino to Ness (Corynebacterium thermoaminogenes), Corynebacterium epi syeonseu (Corynebacterium efficiens), Corynebacterium stay Ontario varnish (Corynebacterium stationis) , Is not necessarily limited thereto.
  • the method of the present application may further include the step of recovering the target material from the microorganism or medium after the culturing step.
  • the target substance may be a purine nucleotide, but is not limited thereto.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited, but may be performed by a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method, or the like.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) is used to provide an appropriate pH (eg, pH 5 to 9, specifically Is capable of adjusting pH 6 to 8, most specifically pH 6.8), and maintaining aerobic conditions by introducing oxygen or an oxygen-containing gas mixture into the culture.
  • a basic compound eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg, phosphoric acid or sulfuric acid
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45°C, specifically 25 to 40°C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • Purine nucleotides produced by the culture may be secreted into a medium or may remain in cells.
  • the culture medium used is a carbon source such as sugar and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molase, starch and cellulose), fats and fats (e.g., soybean oil, sunflower seeds). Oil, peanut oil and coconut oil), fatty acids (such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (such as glycerol and ethanol) and organic acids (such as acetic acid) can be used individually or in combination. , Is not limited thereto.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g. peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea), or inorganic compounds (e.g.
  • ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) or the like may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • Potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and a sodium-containing salt corresponding thereto may be used individually or in combination as a source of phosphorus, but are not limited thereto.
  • the medium may contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg, magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids and vitamins.
  • the method of recovering the purine nucleotides produced in the culturing step of the present application may collect the desired purine nucleotides from the culture medium by using a suitable method known in the art according to the culture method. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, and the like can be used, and desired purine nucleotides can be recovered from a medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a purification process, and may be performed using a suitable method known in the art. Accordingly, the recovered purine nucleotides may be purified form or microbial fermentation broth containing purine nucleotides (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
  • the production amount of the target substance is increased.
  • the wild-type Corynebacterium strain cannot produce purine nucleotides or can produce very trace amounts even if it produces purine nucleotides
  • the amount of purine nucleotide production can be increased through the polynucleotide having the promoter activity of the present application. have.
  • Example 1 Production of wild type-based IMP producers
  • an IMP producer was produced based on the wild-type Corynebacterium stationis ATCC6872. More specifically, an IMP-producing strain in which the activity of purF , a gene encoding phosphoribosylpyrrophosphate amidotransferase , and attenuated the activity of guaB , a gene encoding 5′-inosine dehydrogenase, was prepared. Was prepared.
  • Example 1-1 purF Enhancement strain production
  • an insertion vector containing purF was first prepared.
  • PCR is specifically performed using the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7 and SEQ ID NOs: 8 and 9 using the genomic DNA of Corynebacterium stationity ATCC6872 as a template. And, 30 seconds of denaturation at 94°C, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension of 2 minutes at 72°C were repeated 30 times.
  • PCR was again performed using SEQ ID NOs: 6 and 9 as primers.
  • PCR conditions were denatured at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension of 2 minutes at 72°C were repeated 30 times, and the obtained DNA fragment was digested with XbaI. Thereafter, it was cloned into a vector digested with the same restriction enzyme pDZ (Korean Patent No. 10-0924065 and International Patent Publication No. 2008-033001).
  • the vector produced by the above method was named pDZ-purF-g1a.
  • the strain in which the vector was inserted on the chromosome by recombination of the homologous sequence was kanamycin. (kanamycin) was selected in a medium containing 25 mg/L. The selected primary strain was again sequenced with the selected strain through the secondary crossover to finally select the strain into which the mutation was introduced, and the selected strain was named 6872-purF (g1a).
  • Example 1-2 guaB Production of weakened strains
  • an insertion vector containing guaB was first constructed.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium stationary ATCC6872 as a template, using primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 and SEQ ID NOs: 13 and 14, the PCR Using the product as a template, PCR was performed again using SEQ ID NOs: 11 and 14 as primers, and the obtained DNA fragment was cloned as in Example 1-1.
  • the constructed vector was named pDZ-guaB-a1t. This was introduced into 6872-purF (g1a) in the same way, and finally, the strain into which the mutation was introduced was selected.
  • the selected strain was named CJI2330.
  • ATCC6872 and CJI2330 were respectively inoculated and cultured with shaking at 30° C. for 24 hours to be used as a seed culture solution.
  • 29ml of fermentation medium was dispensed into a 250ml Erlenmeyer flask for shaking, sterilized under pressure at 121°C for 15 minutes, and then 2ml of seed culture was inoculated and cultured for 3 days. Culture conditions were adjusted to the number of revolutions 170rpm, temperature 30 °C, pH 7.5.
  • -Fermentation medium sodium glutamate 0.1%, ammonium chloride 1%, magnesium sulfate 1.2%, calcium chloride 0.01%, iron sulfate 20mg/l, manganese sulfate 20mg/l, zinc sulfate 20mg/l, copper sulfate 5mg/l, L-cysteine 23mg /l, alanine 24mg/l, nicotinic acid 8mg/l, biotin 45 ⁇ g/l, thiamine hydrochloric acid 5mg/l, adenine 30mg/l, phosphoric acid (85%) 1.9%, glucose 2.55%, fructose 1.45%. .
  • a promoter mutation library of purA which is a gene encoding it, was constructed and a promoter weakening mutation that increases the purine nucleotide production ability was to be discovered.
  • Example 2-1 purA Construction of a vector containing a promoter
  • a GFP (green fluorescent protein) expression vector containing the purA promoter of SEQ ID NO: 1 was first constructed. PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium stationary ATCC6872 as a template, using primers of SEQ ID NOs: 15 and 16, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and 72 At °C, an extension of 2 minutes was repeated 30 times. The obtained DNA fragment was digested with KpnI and EcoRV, and then cloned into a p117-gfp vector digested with the same restriction enzyme (Korea Patent Laid-Open No. 10-0620092). The vector produced by the above method was named p117-PpurA-gfp.
  • Example 2-2 purA Promoter Making a mutation library
  • a purA promoter mutation library was constructed.
  • the library was constructed using an error-prone PCR kit (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit). Under conditions in which mutation may occur, a PCR reaction was performed using SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 17 as primers. Specifically, pre-heating at 94° C. for 30 seconds under conditions in which 2 to 4 mutations occur per 1000 bp, followed by 30 seconds at 94° C. and 1 minute and 30 seconds at 68° C. were repeated 25 times.
  • the PCR product obtained at this time was used as megaprimer (500 ⁇ 125ng), repeated 25 times for 50 seconds at 95 °C, 50 seconds at 60 °C, 12 minutes at 68 °C, treated with DpnI, and transformed into E. coli DH5 ⁇ . It was spread on LB solid medium containing kanamycin (25mg/L). After selecting 20 transformed colonies, a plasmid was obtained and the polynucleotide sequence was analyzed. As a result, it was confirmed that mutations were introduced at different positions at a frequency of 3.5 mutations/kb. About 10,000 transformed E. coli colonies were taken and a plasmid was extracted, which was named p117-PpurA-gfp-library.
  • the p117-PpurA-gfp-library prepared in Example 2-2 was transformed into the strain CJI2330 prepared in Example 1 by electroporation, and then spread on a nutrient medium containing 25 mg/L of kanamycin, and the mutant vector 5,000 colonies of strains were obtained, and each colony was named from CJI2330_p117-PpurA (mt1) to CJI2330_p117-PpurA (mt5000).
  • the obtained 5,000 colonies were inoculated into 200 ⁇ l of each autoclaved seed medium and cultured in a 96 deep well plate with a microplate shaker (TAITEC) for 24 hours at 30°C and 1200 rpm for 24 hours. Used. After dispensing 290 ⁇ l of pressurized fermentation medium into a 96 deep well plate, 20 ⁇ l of seed culture solution was inoculated, and cultured with shaking for 72 hours in the same manner as the above conditions, followed by centrifugation to obtain cells.
  • TITEC microplate shaker
  • the recovered cells were washed in 1X phosphate buffer (10X phosphate-buffered saline: sodium chloride 80g, potassium chloride 2g, sodium phosphate 14.4g, potassium phosphate 2.4g, sterilized water 0.8L), resuspended in the same buffer, and then fluorescent. The strength was measured. The fluorescence intensity was measured using excitation light at 488 nm using a microplate reader, and 511 nm emission light to measure the expression level of the GFP gene. After measurement, two mutant colonies, PpurA (mt3) and PpurA (mt378), whose fluorescence intensity was weakened compared to the wild - type P purA-gfp were selected.
  • 1X phosphate buffer 10X phosphate-buffered saline: sodium chloride 80g, potassium chloride 2g, sodium phosphate 14.4g, potassium phosphate 2.4g, sterilized water 0.8L
  • PpurA (mt3) included a polynucleotide sequence in which the 189th nucleotide in the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was substituted with thymine (T).
  • PpurA (mt378) contained a polynucleotide sequence in which the 143th nucleotide in the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was substituted with thymine (t). Therefore, in the following examples, it was attempted to confirm whether the mutations affect the amount of purine nucleotides produced by microorganisms of the genus Corynebacterium, respectively.
  • Example 4 Confirmation of IMP-producing ability in IMP-producing strains derived from ATCC6872
  • An IMP-producing strain derived from ATCC6872 was prepared, and the mutation identified in Example 3 was introduced to confirm IMP-producing ability.
  • Example 4-1 Selection of IMP-producing strains derived from ATCC6872
  • ATCC6872 was suspended in a phosphate buffer (pH7.0) or a citrate buffer (pH5.5) at 10 7-10 8 cells/ml.
  • UV treatment was performed at room temperature or 32°C for 20 to 40 minutes to induce mutation.
  • colonies were obtained. Each colony was cultured in a nutrient medium and cultured in a seed medium for 24 hours. As a result of culturing in fermentation medium for 3 to 4 days, colonies with the best IMP production accumulated in the culture medium were selected.
  • -Minimum medium glucose 2%, sodium sulfate 0.3%, first potassium phosphate 0.1%, second potassium phosphate 0.3%, magnesium sulfate 0.3%, calcium chloride 10mg/l, iron sulfate 10mg/l, zinc sulfate 1mg/l, manganese chloride 3.6mg/l, L-cysteine 20mg/l, calcium pantothenate 10mg/l, thiamine hydrochloride 5mg/l, biotin 30ug/l, adenine 20mg/l, guanine 20mg/l, pH7.3.
  • the CJI2332 was deposited on June 22, 2018 with the Korean Microbiological Conservation Center, a trust organization under the Budapest Treaty, and was given the accession number KCCM12277P.
  • Example 4-2 CJI2332 fermentation titer experiment
  • ATCC6872 and CJI2332 were respectively inoculated and cultured with shaking at 30° C. for 24 hours to be used as seed culture solution.
  • 29ml of fermentation medium was dispensed into a 250ml Erlenmeyer flask for shaking, sterilized under pressure at 121°C for 15 minutes, and then 2ml of seed culture was inoculated and cultured for 3 days. Culture conditions were adjusted to the number of revolutions 170rpm, temperature 30 °C, pH 7.5.
  • Example 4-3 purA Construction of an insertion vector containing a promoter mutation
  • PCR was performed using the genomic DNA of the ATCC6872 strain as a template, using SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21. PCR was performed 20 times of denaturation at 94°C for 5 minutes, followed by 30 seconds at 94°C, 30 seconds at 55°C, and 1 minute at 72°C, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes. Using the resulting DNA fragment as a template, the gene fragment obtained by performing PCR in the same manner as described above using SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 21 was cut with XbaI.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the ATCC6872 strain as a template, using SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 21. PCR was performed 20 times of denaturation at 94°C for 5 minutes, followed by 30 seconds at 94°C, 30 seconds at 55°C, and 1 minute at 72°C, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the DNA fragment obtained by performing PCR in the same manner as described above using SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 21 was cut with XbaI.
  • T4 ligase the DNA fragment was cloned into a linear pDZ vector digested with XbaI restriction enzyme to prepare pDZ-purA(a189t)-purA.
  • a vector into which two mutations were introduced was constructed to see the effect when two mutations were introduced at the same time.
  • Site-directed mutagenesis was performed using the prepared pDZ-purA (c143t) as a backbone. Specifically, PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25, at which time denatured at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extended 12 minutes at 68°C. (extension) process was included, and the above processes were repeated 18 times.
  • the resulting product was treated with DpnI and then transformed into DH5 ⁇ to obtain a pDZ-PpurA(c143t, a189t)-purA vector.
  • Example 4-4 ATCC6872-derived CJI2330, and CJI2332 strains purA Introduction and evaluation of promoter variants
  • IMP production was evaluated by introducing a purA mutation into the wild-type-derived IMP-producing strain CJI2330 prepared in Example 1 and the strain CJI2332 selected in Example 4-1.
  • the genomic DNA of CJI2332 was amplified through PCR. Specifically, first, using the genomic DNA of CJI2332 as a template using the primers of SEQ ID NOs: 15 and 21, the conditions of polymerization with Taq DNA polymerase at 94°C for 1 minute, 58°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute were 28
  • the purA promoter fragment was amplified and sequenced through PCR repeated twice. Nucleotide sequence of the promoter of the purA CJI2332 strain was the same as purA promoter sequence of the wild type Corynebacterium stay Baltimore varnish ATCC6872.
  • pDZ-PpurA(c143t)-purA, pDZ-PpurA(a189t)-purA, pDZ-PpurA(c143t, a189t)-purA vector was transformed into CJI2330 and CJI2332, and the vector was transferred on the chromosome by recombination of the homologous sequence.
  • the inserted strain was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • the selected primary strain was again subjected to a secondary cross-over, and a strain into which the promoter mutation of the target gene was introduced was selected.
  • the produced strains were, respectively, CJI2330_PpurA(c143t)-purA, CJI2330_PpurA(a189t)-purA, CJI2330_PpurA(c143t, a189t)-purA, CJI2332_PpurA(c143t)-purA, CJI2332_PpurA(a189t, PpurA(a189t)_PpurA(a189t)-purA(a189t)-purA Named purA.
  • the CJI2332_PpurA(c143t)-purA is referred to as CJI2352, and was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center, a trust organization under the Budapest Treaty, on September 10, 2018, and was given the accession number KCCM12315P.
  • the produced CJI2332_PpurA(a189t)-purA is referred to as CJI2365, which was deposited with the Korean Microbiological Conservation Center, a trust organization under the Budapest Treaty, on September 10, 2018, and was given the accession number KCCM12314P.
  • IMP production capacity of each strain was evaluated. After completion of the culture, the production amount of IMP was measured by a method using HPLC, and the culture results are shown in Table 8 below.
  • Example 5 purA Confirmation of 5'-xanthylic acid production ability when introducing a promoter variant
  • Example 5-1 Selection of strains producing XMP derived from ATCC6872
  • Corynebacterium stationary ATCC6872 was suspended in a phosphate buffer (pH7.0) or a citrate buffer (pH5.5) at 10 7-10 8 cells/ml.
  • UV treatment was performed at room temperature or 32°C for 20 to 40 minutes to induce mutation.
  • colonies were obtained. Each colony was cultured in a nutrient medium and cultured in a seed medium for 24 hours.
  • colonies with the best XMP production accumulated in the culture medium were selected. Specifically, it was selected from among mutant strains that can be grown in a medium (added medium) to which fluorotryptophan is added by concentration, and more specifically, the concentration of 5'-xanthylic acid grown even at a concentration of 100 mg/l of fluorotryptophan is The improved strain was selected.
  • the selected strain was named CJX1664.
  • -Minimum medium glucose 20g/l, potassium phosphate 1g/l, potassium phosphate 2g/l, urea 2g/l, ammonium sulfate 3g/l, magnesium sulfate 1g/l, calcium chloride 100mg/l, iron sulfate 20mg /l, manganese sulfate 10mg/l, zinc sulfate 10mg/l, biotin 30ug/l, thiaminate 0.1mg/l, copper sulfate 0.8mg/l, adenine 20mg/l, guanine 20mg/l, pH 7.2
  • CJX1664 The biochemical properties of CJX1664 are shown in Table 9 below. Referring to Table 9, the CJX1664 can be grown even in a medium containing fluorotryptophan at a concentration of 100mg/l.
  • CJX1664 was deposited on July 6, 2018 with the Korea Microbial Conservation Center, a trust organization under the Budapest Treaty, and was given the accession number KCCM12285P.
  • Example 5-2 CJX1664 fermentation titer experiment
  • ATCC6872 and CJX1664 were respectively inoculated and cultured with shaking at 30° C. for 24 hours to be used as a seed culture solution.
  • 29ml of fermentation medium was dispensed into a 250ml Erlenmeyer flask for shaking, sterilized under pressure at 121°C for 15 minutes, and then 2ml of seed culture was inoculated and cultured for 3 days. Culture conditions were adjusted to the number of revolutions 170rpm, temperature 30 °C, pH 7.5.
  • CJX1664 genomic DNA was amplified through PCR to confirm whether the mutation in the purA promoter of the CJX1664 strain selected in Example 5-1 was included. Specifically, first, using the genomic DNA of CJX1664 as a template, using the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 21, denature at 94°C for 1 minute, bind at 58°C for 30 seconds, and polymerize with Taq DNA polymerase at 72°C for 1 minute. The purA promoter fragment was amplified and sequenced through a PCR method in which the above conditions were repeated 28 times. The nucleotide sequence of the promoter of the purA CJX1664 strain was the same as purA promoter sequence of the wild type Corynebacterium stay Baltimore varnish ATCC6872.
  • Each of the vectors prepared in Example 4-3 was transformed into CJX1664, and the strain into which the vector was inserted on the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin. The selected primary strain was again subjected to a secondary cross-over, and the strain into which the mutation of the target gene was introduced was selected. Whether or not the gene mutation was introduced in the final transformed strain was confirmed by analyzing the base sequence.
  • the CJX1664 and CJX1664_PpurA(c143t)-purA, CJX1664_PpurA(a189t)-purA, CJX1664_PpurA(c143t, a189t)-purA strains were evaluated for XMP production capacity. After completion of the culture, the production amount of XMP was measured by a method using HPLC, and the culture results are shown in Table 11 below.
  • the CJX1664_PpurA(c143t)-purA is referred to as CJX1680, and was deposited with the Korea Microbial Conservation Center, a trust organization under the Budapest Treaty, on September 10, 2018, and was given the accession number KCCM12311P.
  • the produced CJX1664_PpurA(a189t)-purA is referred to as CJX1668, and it was deposited with the Korea Microbial Conservation Center, a trust organization under the Budapest Treaty, on September 10, 2018, and was given the accession number KCCM12310P.
  • CJX1664_PpurA(c143t)-purA, CJX1664_PpurA(a189t)-purA, and CJX1664_PpurA(c143t, a189t)-purA strains confirmed that the XMP production increased by about 27% compared to CJX1664, an ATCC6872-based XMP-producing strain.

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Abstract

본 출원은 신규한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 유전자 발현용 조성물, 미생물, 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 프로모터 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법
본 출원은 신규한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 유전자 발현용 조성물, 미생물, 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법 및 상기 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
핵산계 물질 중 하나인 5'-이노신산 (5'-inosine monophosphate; 이하 IMP)은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있다. 또한, 5'-구아닐산 (5'-guanine monophosphate; 이하 GMP)과 더불어 식품 조미 첨가제 또는 식품용으로 널리 이용되고 있는 물질이다. IMP는 자체로 소고기 맛을 내는 것으로 알려져 있으며, GMP와 같이 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 정미성 핵산계 조미료로 각광을 받고 있다.
IMP를 제조하는 방법으로는, 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소적으로 분해하는 방법, 발효에 의해 생산된 이노신을 화학적으로 인산화하는 방법(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 등) 및 IMP를 직접 생산하는 미생물을 배양하고 배양액 내의 IMP를 회수하는 방법 등이 있다. 이러한 방법 중에서 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법은 IMP를 직접 생산 가능한 미생물을 이용한 방법이다.
또한, GMP를 제조하는 방법으로 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate; 이하, XMP)을 코리네형 미생물을 이용하여 GMP로 전환하는 방법, 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 에세리키아 콜리를 이용하여 GMP로 전환시키는 방법이 있다. 상기 방법 중 XMP를 생산한 후, GMP로 전환시키는 방법으로 생산시킬 경우, 미생물 발효 시 전환 반응의 전구체인 XMP의 생산성이 강화되어야 하고, 생산된 XMP 뿐만 아니라 전환 반응의 전 과정 동안 이미 생성된 GMP가 손실되지 않도록 하여야 한다.
한편, 자연상태에서 효소들은 산업적 활용에 있어서 요구되는 활성, 안정성, 광학 이성질체에 대한 기질 특이성 등에 있어 항상 최적의 특성을 나타내지 않으므로 아미노산 서열의 변이 등을 통해 목적하는 용도에 적합하게 효소를 개량하는 다양한 시도가 이루어져 왔다. 그 중, 효소의 합리적 디자인(rational design) 및 위치-지정 치환변이(site-directed mutagenesis) 방법이 효소 기능의 향상을 위해 적용된 예가 있으나, 많은 경우, 목적 효소의 구조에 대한 정보가 부족하거나 구조-기능의 상관관계가 명확하지 않아 효과적으로 적용될 수 없다는 단점을 가지고 있다. 이러한 경우, 효소 유전자의 무작위 변이를 통해 구축된 변이효소 라이브러리로부터 원하는 형질의 효소를 스크리닝하는 방향적 진화(directed evolution) 방법을 통해 효소의 개량을 시도하여 활성을 개선한다고 보고된 바 있다.
상기 미생물 발효를 통하여 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 방법으로 고수율의 퓨린 뉴클레오티드를 생산하기 위해 발명자들은 광범위한 연구를 수행하였고, 보다 높은 퓨린 뉴클레오티드 생산에 유용한 프로모터를 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 발현용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 목적 단백질 발현 증가를 위한, 상기 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 신규한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 경우, 고수율의 퓨린 뉴클레오티드 생산이 가능하다. 또한, 제조된 퓨린 뉴클레오티드는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 조미료, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 출원은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 치환은 143번째 뉴클레오티드의 치환 및 189번째 뉴클레오티드의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나를 포함한다.
본 출원의 또 하나의 양태는, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에서 a) 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환,b) 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환, 또는 c) 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환되고 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 가닥이다.
본 출원에서 용어, "프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드"는 뒤에 연결시키는 목적 유전자의 발현을 위해 RNA 폴리머라제 또는 인핸서 등이 결합하는 부위를 포함하는 목적 유전자의 전사시키는 부위 근처에 존재하는 DNA 영역을 의미한다. 본 출원의 목적상 상기 폴리뉴클레오티드는 범용적 약화 프로모터로 이용될 수 있다. 그 예로, 아데닐로석시네이트 신세타아제의 발현을 약화시킬 수 있는 프로모터로 사용될 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 퓨린 뉴클레오티드를 생산 또는 증가시키는데 관여하는 폴리뉴클레오티드를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 상기 서열번호 1은 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열에서 143번째 및/또는 189번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열에서 143번째 및/또는 189번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 것을 의미한다. 상동성 또는 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에서 a) 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환, b) 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환, 또는 c) 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환되고 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로는, 본 출원의 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환되고 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열번호 2, 3, 또는 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 것일 수 있다. 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 특정 활성을 부여하는 상기 특정 143번째 또는 189번째 변이 이외에 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리뉴클레오티드 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 143번째 및/또는 189번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 143번째 및/또는 189번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 발현용 조성물 제공하는 것이다.
상기 유전자 발현용 조성물은 본 출원의 프로모터에 의해 발현시킬 수 있는 유전자를 발현할 수 있는 조성물을 의미한다. 그 예로, 상기 유전자 발현용 조성물은 신규한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 추가로 상기 폴리뉴클레오티드를 프로모터로 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 본 출원의 유전자 발현용 조성물에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있게 벡터내에 포함된 형태일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함한다. 구체적으로, 상기 목적 단백질은 아데닐로석시네이트 신세타아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원은 또 하나의 양태로서, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
또한, 본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
구체적으로 상기 미생물은 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물이거나, 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 미생물 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 포함하는 미생물"이란, 상기 폴리뉴클레오티드로 목적 단백질의 발현이 조절된 미생물을 의미한다. 상기 미생물은, 퓨린 뉴클레오티드를 생산할 수 있는 미생물, 자연적으로 약한 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 퓨린 뉴클레오티드의 생산능이 없는 모균주에 퓨린 뉴클레오티드의 생산능이 부여된 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 아데닐로석시네이트 신세타아제를 약화한 미생물일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에서 143번째 및/또는 189번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 미생물은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물로서, 상기 상기 폴리뉴클레오티드 치환은 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환, 및/또는 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환을 포함하는 것일 수 있다.
상기 숙주세포 또는 미생물은, 본 출원의 목적상 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 포함하여 퓨린 뉴클레오티드를 생산할 수 있는 것이라면 모두 본 출원의 범주에 속할 수 있다.
본 출원에서 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상 "퓨린 뉴클레오티드"는 퓨린계 구조를 포함하고 있는 뉴클레오티드를 의미한다. 그 예로, IMP, XMP 또는 GMP일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 용어 "IMP(5'-inosine monophosphate)는 하기의 화학식1로 구성되어 있는 핵산계 물질 중의 하나이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019004119-appb-I000001
IUPAC명으로는 5'-inosine monophosphate, 5'-inosine acid라고도 불리워지며, 식품에서는 XMP, 또는 GMP와 더불어 풍미 증진제로 널리 사용되고 있다.
상기 용어 "GMP(5'-guanine monophosphate)"는 하기의 화학식 2로 구성되어 있는 핵산계 물질 중의 하나이다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019004119-appb-I000002
IUPAC명은 [(2R,3S,4R,5R)-5-(2-Amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydro-2-furanyl]methyl dihydrogen phosphate이며, 다른 이름으로는 5'-guanidylic acid, 5'-Guanylic acid, 또는 guanylic acid로 불리워진다.
GMP는 염의 형태로 구아닐산 나트륨, 구아닐산 디칼륨, 구아닐산 칼슘과 같은 식품 첨가제로 널리 이용되며, IMP와 함께 첨가물로 사용시 품미를 강화하는 시너지 효과를 갖는다. GMP는 XMP로부터 전환되어 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 일실시예서 확인된 바와 같이, 본 출원의 프로모터는 XMP의 생산을 증가시킬 수 있으며, 생산량이 증가된 XMP로부터 GMP 역시 전환되어 그 생산량이 증가될 수 있는 바, 상기 GMP 역시 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.
상기 용어, "XMP(5'-xanthosine monophosphate)"는 하기의 화학식 3으로 구성되어 있는 퓨린 대사의 중간체 물질이다. IUPAC명으로는 5'-inosine monophosphate, 5'-xanthylic acid라고도 불리워지며, IMP 탈수소 효소의 작용을 통해 IMP로부터 형성되거나, XMP는 GMP 신타제의 작용을 통해 GMP로 전환될 수 있다. 또한, XMP는 (d) XTPase 활성을 포함하는 효소 deoxyribonucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase에 의해 XTP로부터 형성될 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2019004119-appb-I000003
본 출원에서 용어, "퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 퓨린 뉴클레오티드 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다. 본 출원의 목적상 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 목적하는 퓨린 뉴클레오티드의 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 또는 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물은, 퓨린 뉴클레오티드 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 퓨린 뉴클레오티드 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물일 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물은, 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 purF의 발현이 강화되거나 purA의 발현이 강화된 것일 수 있다. 추가적으로 퓨린 뉴클레오티드에 따라 5'-이노신산 디하이드로게네이즈(inosine-5'-monophosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 guaB 발현이 조절될 수 있다. 구체적으로 퓨린 뉴클레오티드가 IMP인 경우 guaB 발현이 약화된 것일 수 있고 퓨린 뉴클레오티드가 XMP 또는 GMP인 경우에는 guaB 발현이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물 일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 상기 '향상된 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물'은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 균주 자체이거나, 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 단백질 변이체를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 일 예로, 본 출원의 방법은 상기 배양하는 단계 이후, 상기 미생물 또는 배지로부터 목적 물질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 목적 물질은 퓨린 뉴클레오티드 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨린 뉴클레오티드는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨린 뉴클레오티드를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 퓨린 뉴클레오티드를 수집(collect)할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 퓨린 뉴클레오티드를 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 퓨린 뉴클레오티드는 정제된 형태 또는 퓨린 뉴클레오티드를 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
또한, 본 출원의 목적상 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물의 경우, 목적 물질 생산량이 증가하는 것을 특징으로 한다. 특히, 야생형 코리네박테리움속 균주가 퓨린 뉴클레오티드를 생산하지 못하거나, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하더라도 아주 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 통해 퓨린 뉴클레오티드 생산량을 증가시킬 수 있다.
본 출원의 하나의 양태로서, 목적 단백질 발현 증가를 위한, 상기 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공하는 것이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1: 야생형 기반 IMP 생산주 제작
코리네박테리움 속 야생형의 균주는 IMP를 생산하지 못하거나, IMP를 생산하더라도 아주 극미량을 생산할 수 있다. 따라서, 야생형 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) ATCC6872를 기반으로 IMP 생산주를 제작하였다. 보다 구체적으로는, 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 purF의 활성을 강화시키고, 5'-이노신산 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자인 guaB의 활성을 약화시킨 IMP 생산 균주를 제조하였다.
실시예 1-1: purF 강화 균주 제작
purF의 개시코돈이 변경된 균주를 제작하기 위해 우선 purF가 포함된 삽입용 벡터를 제작하였다. 삽입용 벡터에 purF 유전자를 클로닝하기 위해 구체적으로 PCR은 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 게노믹 DNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 6와 7 및 서열번호 8와 9의 프라이머를 이용하여 수행되었으며, 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분의 연장(extension) 과정이 30회 반복 수행되었다. 상기 PCR 반응으로 획득한 2개의 DNA 절편을 주형으로 하여 서열번호 6와 9를 프라이머로 다시 PCR을 진행하였다. PCR 조건은94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분의 연장(extension) 과정이 30회 반복 수행하였고, 얻어진 DNA 단편을 XbaI으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단된 pDZ (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호) 벡터에 클로닝하였다. 상기 방법으로 제작된 벡터를 pDZ-purF-g1a라 명명하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
6 purF g1a-1 GCTCTAGACCACTCTAAGACGCGGCCACC
7 purF g1a-2 AAGTAGTGTTCACCATGACGCTGATTCTACTAAGTTT
8 purF g1a-3 AGTAGAATCAGCGTCATGGTGAACACTACTTTCCCCAG
9 purF g1a-4 GCTCTAGACTGTGCGCCCACGATATCCAG
코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) ATCC6872에 재조합 벡터 pDZ-purF-g1a를 전기천공법(electroporation)으로 형질전환 한 후, 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐 선정된 균주로 시컨싱을 진행하여 최종적으로 변이가 도입된 균주를 선별하였고, 선별균주는 6872-purF(g1a)으로 명명하였다.
실시예 1-2: guaB 약화 균주 제작
guaB의 개시코돈이 변경된 균주를 제작하기 위해 우선 guaB가 포함된 삽입용벡터를 제작하였다. 삽입용 벡터에 guaB 유전자를 클로닝하기 위해 구체적으로 PCR은 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 11과 12 및 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용하여 수행되었으며, 상기 PCR 산물을 주형으로 하여 서열번호 11와 14를 프라이머로 다시 PCR을 진행하였고, 얻어진 DNA 단편을 실시예 1-1 같이 클로닝을 진행하였다. 제작된 벡터를 pDZ-guaB-a1t라 명명하였다. 이를 같은 방법으로 6872-purF(g1a)에 도입하였고 최종적으로 변이가 도입된 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주는 CJI2330라 명명하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
11 guaB a1t-1 GCTCTAGACTACGACAACACGGTGCCTAA
12 guaB a1t-2 CACGATTTTCGGTCAATACGGGTCTTCTCCTTCGCAC
13 guaB a1t-3 AGGAGAAGACCCGTATTGACCGAAAATCGTGTTTCT
14 guaB a1t-4 GCTCTAGAATCGACAAGCAAGCCTGCACG
실시예 1-3: CJI2330의 발효역가 실험
종배지 2ml를 지름 18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, ATCC6872 및 CJI2330을 각각 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도 30℃, pH 7.5로 조절하였다.
배양 종료 후 HPLC (SHIMAZDU LC20A)를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 3와 같다. 하기와 같은 결과는 상기 CJI2330이 IMP 생산능을 갖는 것을 시사한다.
균주명 IMP (g/L)
ATCC6872 0
CJI2330 0.50
- 종배지: 포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH 7.5
- 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 포도당 2.55%, 과당 1.45% 되게 첨가하여 사용하였다.
실시예 2: purA 프로모터 활성 약화 변이 발굴
퓨린 뉴클레오티드 생산능을 향상시키기 위하여 아데닐로석시네이트 신테타아제의 발현을 약화시키고자, 이를 코딩하는 유전자인 purA의 프로모터 변이 라이브러리를 제작하고 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가하는 프로모터 약화 변이를 발굴하고자 하였다.
실시예 2-1: purA 프로모터를 포함하는 벡터 제작
purA 프로모터 변이 라이브러리를 제작하기 위해 우선 서열번호 1의 purA 프로모터를 포함하는 GFP(green fluorescent protein) 발현 벡터를 제작하였다. PCR은 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 15와 16의 프라이머를 이용하여, 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분의 연장(extension) 과정이 30회 반복 수행되었다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI과 EcoRV으로 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단된 p117-gfp 벡터(대한민국 공개특허 10-0620092)에 클로닝하였다. 상기 방법으로 제작된 벡터를 p117-PpurA-gfp라 명명하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
15 purA promoter F GGGGTACCGGCAAAATTGCCGCCGCAGCT
16 purA promoter R GGGATATCGGTTATTCACTTCCTAGATTT
17 purA promoter lib R TTATTTGTAGAGCTCATCCAT
실시예 2-2: purA 프로모터 변이 라이브러리 제작
상기 실시예 2-1에서 제작된 벡터를 기반으로 purA 프로모터 변이 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리는 error-prone PCR kit (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)를 이용하여 제작하였다. 변이가 발생할 수 있는 조건에서, 서열번호 15 및 서열번호 17을 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 구체적으로는, 1000bp 당 2에서 4개의 변이가 발생하는 조건으로 94 ℃에서 30초 pre-heating 후, 94 ℃에서 30초, 68 ℃에서 1분 30초의 과정을 25회 반복 수행하였다. 이 때 얻어진 PCR 산물을 megaprimer(500~125ng)로 하여 95 ℃에서 50초, 60 ℃에서 50초, 68 ℃에서 12분의 과정을 25회 반복 수행한 후 DpnI 처리하여, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환 된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 폴리뉴클레오티드 서열을 분석한 결과 3.5mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 10,000개의 형질전환 된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 p117-PpurA-gfp-library로 명명하였다.
실시예 3: 제작한 라이브러리 평가 및 변이체 선별
실시예 3-1: 라이브러리 평가
상기 실시예 2-2에서 제작된 p117-PpurA-gfp-library를 실시예 1에서 제작한 균주 CJI2330에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 영양배지에 도말하여 변이 벡터가 삽입된 균주 5,000개의 콜로니를 확보 하였으며, 각 콜로니를 CJI2330_p117-PpurA(mt1)부터 CJI2330_p117-PpurA(mt5000)까지로 명명하였다.
- 영양배지: 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모 엑기스 1%, 한천 2%, pH 7.2
확보된 5,000개의 콜로니를 각각 가압 살균한 종 배지 200㎕에 접종하여 96 deep well plate에서 마이크로플레이트 진탕기(Microplate shaker (TAITEC))를 이용하여 30℃ 온도, 1200rpm에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 가압 살균한 발효배지 290㎕를 96 deep well plate에 분주한 후 종 배양액 20㎕씩 접종하고, 상기 조건과 동일하게 72시간 진탕 배양하여 원심분리하여 세포를 얻었다. 다음으로 회수된 세포를 1X 포스페이트 버퍼(10X phosphate-buffered saline: 염화나트륨 80g, 염화칼륨 2g, 인산나트륨 14.4g, 인산칼륨 2.4g, 멸균수 0.8L)에 세척 후, 같은 버퍼에 재현탁 시킨 후, 형광강도를 측정하였다. 형광강도는 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여 488nm에서 여기광을 조사하고, 511nm 발출광을 이용하여 측정함으로써, GFP 유전자의 발현정도를 측정하였다. 측정 후, 야생형의 PpurA-gfp에 비해 형광강도가 약화된 2개의 변이 콜로니 PpurA(mt3) 및 PpurA(mt378)를 선별하였다.
실시예 3-2: purA 프로모터 변이 확인
상기 돌연변이 균주의 유전자 변이를 확인하기 위하여 서열번호 15와 17의 프라이머를 이용하여 PpurA(mt3) 및 PpurA(mt378) 각각에서 PCR을 수행하고 시퀀싱을 진행하여, purA 프로모터 내에 변이를 확인하였다.
구체적으로 PpurA(mt3)은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에서 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다. 또한, PpurA(mt378)은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에서 143번째 뉴클레오티드가 티민(t)으로 치환된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다. 따라서, 이하 실시예에서는, 상기 변이가 각각 코리네박테리움 속 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생성량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 4: ATCC6872 유래의 IMP 생산 균주에서의 IMP 생산능 확인
ATCC6872 유래의 IMP 생산 균주를 제작하고, 실시예 3에서 확인된 변이를 도입하여 IMP 생산능을 확인하였다.
실시예 4-1: ATCC6872 유래의 IMP 생산 균주 선별
ATCC6872 유래의 IMP 생산주를 제작하기 위해 ATCC6872를 인산염 완충액(pH7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH5.5)에 107~108 세포/ml로 현탁시켰다. 여기에 UV 처리하여 실온 또는 32℃에서 20~40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 2회에 걸쳐 0.85% 식염수로 세척하고, 1.7% 한천을 함유한 최소배지에 내성을 부여하고자 하는 물질을 적정 농도로 함유한 배지에 희석하여 도말 한 후 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지에서 배양하고 종배지에서 24시간 배양하였다. 발효배지에서 3~4일간 배양한 결과, 배양액에 축적된 IMP 생산량이 가장 우수한 콜로니를 선별하였다. 고농도 IMP 생산주를 제작하기 위해 아데닌 요구성, 구아닌 누출형, 라이소자임 감수성, 3,4-디하이드로프롤린 내성, 스트렙토마이신 내성, 설파구아니딘 내성, 노르발린 내성, 트리메조프림 내성을 부여하기 위해 상기 과정을 각각의 물질에 대해 순차적으로 수행하였으며, 상기 물질들에 대한 내성이 부여되고 IMP 생산능이 우수한 CJI2332을 최종 선별하였다. 표 5에 ATCC6872 대비 CJI2332의 내성 정도를 비교하여 나타냈다.
특성 ATCC6872 CJI2332
아데닌 요구성 비요구성 요구성
구아닌 누출형 비요구성 누출형
라이소자임 감수성 80 ug/ml 8ug/ml
3,4-디하이드로프롤린 내성 1000 ug/ml 3500ug/ml
스트렙토마이신 내성 500 ug/ml 2000ug/ml
설파구아니딘 내성 50 ug/ml 200ug/ml
노르발린 내성 0.2 mg/ml 2mg/ml
트리메조프림 내성 20 ug/ml 100ug/ml
- 최소배지: 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/l, 황산철 10mg/l, 황산아연 1mg/l, 염화망간 3.6mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘 판토테네이트 10mg/l, 티아민 염산염 5mg/l, 바이오틴 30ug/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH7.3되게 첨가하여 사용하였다.
상기 CJI2332는 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 6월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12277P를 부여받았다.
실시예 4-2: CJI2332 발효역가 실험
종배지 2ml를 지름18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, ATCC6872 및 CJI2332를 각각 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도30℃, pH 7.5로 조절하였다.
배양 종료 후 HPLC (SHIMAZDU LC20A)를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 6와 같다.
균주명 IMP (g/L)
ATCC6872 0
CJI2332 1.74
실시예 4-3: purA 프로모터 변이를 포함하는 삽입 벡터 제작
상기 실시예 3에서 선별된 변이를 균주내로 도입하기 위해 삽입용 벡터를 제작하고자 하였다. PpurA(c143t), PpurA(a189t), PpurA(c143t, a189t) 변이 도입용 벡터 제작 과정은 다음과 같다.
ATCC6872 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 하여 서열번호 18와 서열번호 19 및 서열번호 20과 서열번호21을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃ 에서 1분을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 얻어진 DNA 단편을 주형으로 하여 서열번호 18과 서열번호 21을 이용하여 상기와 같은 방법으로 PCR수행아여 얻더진 유전자 단편을 XbaI으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 DNA 단편을 XbaI 제한효소로 절단 시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여 pDZ-purA(c143t)-purA를 제작하였다. ATCC6872 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 하여 서열번호 18와 서열번호 22 및 서열번호 23과 서열번호21을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃ 에서 1분을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 얻어진 DNA 단편을 주형으로 하여 서열번호 18과 서열번호 21을 이용하여 상기와 같은 방법으로 PCR수행하여 얻어진 DNA 단편을 XbaI으로 절단하였다. T4 리가아제를 이용하여 상기 DNA 단편을 XbaI 제한효소로 절단 시킨 선상의 pDZ 벡터에 클로닝하여 pDZ-purA(a189t)-purA를 제작하였다.
또한, 두 변이가 동시에 도입되었을 때 영향성을 보기 위해 두 변이가 도입된 벡터를 제작하였다. 제작된 pDZ-purA(c143t)를 백본(backbone)으로 하여 위치선택적 돌연변이(Site-directed mutagenesis)를 수행하였다. 구체적으로는, 서열번호 24과 서열번호 25의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 이때 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 68℃에서 12분의 연장(extension) 과정을 포함하며, 상기 과정들은 18회 반복 수행되었다. 그 결과 얻어진 산물을 DpnI 처리 후, DH5α에 형질 전환하여 pDZ-PpurA(c143t, a189t)-purA 벡터를 획득하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
18 PDZ purA F GCTCTAGA ACGGTCACGCGCAAATCAG
19 purA c143t-1R CTACCTTTATCGCCAaTGATAATGTATTTAGCCATG
20 purA c143t-2F CTAAATACATTATCAtTGGCGATAAAGGTAGAGTT
21 PDZ purA R GCTCTAGA TCGTAGGCGACGCAAATAGG
22 purA a189t-1R GGTTATTCACTACCTAGATTTAAG
23 purA a189t-2F TTAAATCTAGGtAGTGAATAACC
24 Site-directed mutagenesis F TAGCCTTAAATCTAGGTAGTGAATAACCATGGCAGCTA
25 Site-directed mutagenesis R TAGCTGCCATGGTTATTCACTACCTAGATTTAAGGCTA
실시예 4-4: ATCC6872 유래의 CJI2330, 및 CJI2332 균주 내 purA 프로모터 변이체 도입 및 평가
상기 실시예 1에서 제작된 야생형 유래 IMP 생산 균주 CJI2330과 실시예 4-1에서 선별된 균주 CJI2332에 purA 변이를 도입하여 IMP 생산량을 평가하였다. CJI2332 균주의 purA 프로모터 내 변이가 포함되어 있는지를 확인하기 위해 CJI2332의 게노믹 DNA를 PCR을 통하여 증폭하였다. 구체적으로, 먼저 상기 CJI2332의 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 15와 21의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1분, 58℃에서 30초, 72 ℃에서 1분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 purA 프로모터 단편을 증폭하여 염기서열을 분석하였다. CJI2332 균주의 purA 프로모터의 염기서열은 야생형 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 purA 프로모터 서열과 동일하였다.
이후 pDZ-PpurA(c143t)-purA, pDZ-PpurA(a189t)-purA, pDZ-PpurA(c143t, a189t)-purA 벡터를 CJI2330과 CJI2332에 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 프로모터 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환 된 균주 내 변이 도입 여부는 서열번호 15와 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 염기서열을 분석함으로써 확인할 수 있었다. 제작된 균주는 각각, CJI2330_PpurA(c143t)-purA, CJI2330_PpurA(a189t)-purA, CJI2330_PpurA(c143t, a189t)-purA, CJI2332_PpurA(c143t)-purA, CJI2332_PpurA(a189t)-purA, CJI2332_PpurA(c143t, a189t)-purA로 명명하였다.
상기 CJI2332_PpurA(c143t)-purA는 CJI2352으로 지칭되며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 9월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12315P를 부여받았다. 또한, 상기 제작된 CJI2332_PpurA(a189t)-purA는 CJI2365로 지칭되며, 이를 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 9월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12314P를 부여받았다.
각각의 균주의 IMP 생산능을 평가하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 8과 같다.
균주명 IMP (g/L)
CJI2330 0.50
CJI2330_PpurA(c143t)-purA 0.58
CJI2330_PpurA(a189t)-purA 0.67
CJI2330_PpurA(c143t, a189t)-purA 0.72
CJI2332 1.74
CJI2332_PpurA(c143t)-purA 2.01
CJI2332_PpurA(a189t)-purA 2.29
CJI2332_PpurA(c143t, a189t)-purA 2.42
실시예 5: purA 프로모터 변이체 도입시 5'-크산틸산 생산능 확인
실시예 5-1: ATCC6872 유래의 XMP 생산 균주 선별
ATCC6872 유래의 XMP 생산주를 제작하기 위해 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872를 인산염 완충액(pH7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH5.5)에 107~108 세포/ml 로 현탁시켰다. 여기에 UV 처리하여 실온 또는 32℃에서 20~40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시켰다. 2회에 걸쳐 0.85% 식염수로 세척하고, 1.7% 한천을 함유한 최소배지에 내성을 부여하고자 하는 물질을 적정 농도로 함유한 배지에 희석하여 도말 한 후 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지에서 배양하고 종배지에서 24시간 배양하였다. 발효배지에서 3~4일간 배양한 결과, 배양액에 축적된 XMP 생산량이 가장 우수한 콜로니를 선별하였다. 구체적으로는, 플루오로트립토판이 농도별로 첨가된 배지(첨가배지)에서 생육할 수 있는 변이주들 중에서 선별하였으며, 보다 구체적으로는, 플루오로트립토판 농도 100mg/l에서도 생육하는 5'-크산틸산 농도가 향상된 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 CJX1664이라 명명되었다.
- 최소배지: 포도당 20g/l, 인산제1칼륨 1g/l, 인산제2칼륨 1g/l, 우레아 2g/l, 황산암모늄 3g/l, 황산마그네슘 1g/l, 염화칼슘 100mg/l, 황산철 20mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산아연 10mg/l, 비오틴 30ug/l, 티아민산염 0.1mg/l, 황산구리 0.8mg/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH 7.2
- 첨가배지: 최소배지에 플루오로트립토판 10, 20, 50, 70, 100, 200mg/l 첨가한 배지
상기 CJX1664의 생화학적 특성은 하기 표 9에 나타내었다. 표 9를 참고하면, 상기 CJX1664는 100mg/l 농도의 플루오로트립토판 첨가배지에서도 생육 가능하다.
특성 ATCC6872 CJX1664
플루오로트립토판 내성 10mg/l 100mg/l
상기 CJX1664는 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 7월 6일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12285P를 부여받았다.
실시예 5-2: CJX1664 발효역가 실험
종배지 2ml를 지름18mm 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, ATCC6872 및 CJX1664 를 각각 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도30℃, pH 7.5로 조절하였다.
배양 종료 후 HPLC(SHIMAZDU LC20A)를 이용한 방법에 의해 XMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 10과 같다.
균주명 XMP (g/L)
ATCC6872 0
CJX1664 4.72
실시예 5-3: CJX1664 균주 내 변이체 도입 및 평가
상기 실시예 5-1에서 선별된 CJX1664 균주의 purA 프로모터 내 변이가 포함되어 있는지 확인하기 위해 CJX1664 게노믹 DNA를 PCR을 통하여 증폭하였다. 구체적으로, 먼저 상기 CJX1664 의 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 15와 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 94 ℃에서 1 분간 변성, 58 ℃에서 30 초간 결합, 72 ℃에서 1 분간 Taq DNA 중합효소로 중합하는 조건을 28 회 반복하는 PCR 방법을 통하여 purA 프로모터 단편을 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 상기 CJX1664 균주의 purA 프로모터의 염기서열은 야생형 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 purA 프로모터 서열과 동일하였다.
상기 실시예 4-3에서 제작한 벡터들을 각각 CJX1664 에 형질전환하고, 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주를 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환 된 균주의 유전자 변이 도입 여부는 염기서열을 분석하여 확인하였다.
상기 CJX1664 및 CJX1664_PpurA(c143t)-purA, CJX1664_PpurA(a189t)-purA, CJX1664_PpurA(c143t, a189t)-purA 균주의 XMP 생산능을 평가하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP의 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 아래 표 11과 같다.
상기 CJX1664_PpurA(c143t)-purA는 CJX1680으로 지칭되며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 9월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12311P를 부여받았다. 또한, 상기 제작된 CJX1664_PpurA(a189t)-purA는 CJX1668로 지칭되며, 이를 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 9월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12310P를 부여받았다.
균주명 XMP (g/L)
CJX1664 4.72
CJX1664_PpurA(c143t)-purA 5.47
CJX1664_PpurA(a189t)-purA 5.91
CJX1664_PpurA(c143t, a189t)-purA 6.01
상기 표에서와 같이, CJX1664_PpurA(c143t)-purA, CJX1664_PpurA(a189t)-purA, CJX1664_PpurA(c143t, a189t)-purA 균주는 ATCC6872 기반 XMP 생산 균주인 CJX1664에 대비 XMP 생산량이 약 27% 증가한 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2019004119-appb-I000004
Figure PCTKR2019004119-appb-I000005
Figure PCTKR2019004119-appb-I000006
Figure PCTKR2019004119-appb-I000007
Figure PCTKR2019004119-appb-I000008
Figure PCTKR2019004119-appb-I000009

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에서 a) 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환, b) 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환, 또는 c) 143번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환되고 189번째 뉴클레오티드가 티민(T)으로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 발현용 조성물.
  4. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 목적 단백질은 아데닐로석시네이트 신세타아제인, 벡터.
  6. 제4항 또는 제5항의 벡터를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 목적 단백질은 아데닐로석시네이트 신세타아제인, 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis)인, 미생물.
  10. 제7항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양하는 단계 이후, 상기 미생물 또는 배지로부터 퓨린 뉴클레오티드을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드 제조방법.
  12. 목적 단백질 발현 증가를 위한, 제1항의 폴리뉴클레오티드의 용도.
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