WO2020189581A1 - 核酸増幅方法 - Google Patents

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秀典 永井
哲 岩浪
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • Nucleic acid detection is at the core of various fields such as drug research and development, forensic medicine, clinical testing, identification of crops and types of pathogenic microorganisms.
  • One of the most powerful basic techniques for detecting a small amount of nucleic acid, which is a gene, with high sensitivity is a method of analyzing a product obtained by exponentially replicating or amplifying a part or all of a nucleic acid sequence.
  • PCR is a powerful technique that selectively amplifies a specific region of DNA.
  • PCR can be used to generate millions of copies of DNA fragments from a single template DNA for the target DNA sequence in the template DNA.
  • PCR involves denaturing DNA into a single strand, annealing denatured DNA single strands and primers, and primers with a thermostable DNA polymerase enzyme by repeating three-phase or two-phase temperature conditions called a thermal cycle. The individual reactions of elongation are repeated in sequence. This cycle is repeated until sufficient copy number is obtained for the analysis. In principle, it is possible to double the copy number in a single PCR cycle.
  • the PCR method is a powerful method that can selectively amplify the target DNA, but in order to confirm the amplified DNA, a separate confirmation work such as gel electrophoresis was required after the completion of PCR. Therefore, as an improvement of the PCR method, a real-time PCR method that generates or quenches fluorescence according to the amplification amount of the target DNA has been developed, and the presence or absence of the target DNA in the sample can be easily confirmed.
  • the amount of template DNA in the sample before PCR exceeds a certain amount, the amount of amplified DNA after PCR often reaches a plateau, and the amount of template DNA before PCR can be quantified. Absent.
  • the real-time PCR method since the amount of amplified DNA during PCR can be detected in real time before reaching the plateau, it is possible to quantify the amount of template DNA before PCR from the state of DNA amplification. Therefore, the real-time PCR method is also called a quantitative PCR method.
  • the quantification of the target DNA amount by the real-time PCR method is particularly useful in clinical practice, and is used for monitoring the transition of the viral amount in order to confirm the therapeutic effect of virus infection such as AIDS virus (HIV).
  • virus infection such as AIDS virus (HIV).
  • HIV AIDS virus
  • DNA quantification by the real-time PCR method is also effective in diagnosing opportunistic infections that proliferate and develop due to physical weakness. is there.
  • the PCR method and the real-time PCR method are powerful methods for exponentially amplifying genes by a thermal cycle, but the general-purpose thermal cycler device used for PCR is due to the huge heat capacity of the aluminum block, which is a heater. Temperature control is slow, and 30-40 cycles of PCR operations typically require 1-2 hours, and in some cases even longer. Therefore, even if the latest genetic testing equipment is used, the total analysis usually takes one hour or more, and speeding up the PCR operation has been a major issue since the advent of the technology.
  • Patent Document 1 a reciprocal flow type nucleic acid amplification device that uses a microblower or the like as a liquid feeding mechanism for the purpose of speeding up the PCR operation.
  • multiplex PCR which simultaneously amplifies a plurality of gene regions by using a plurality of primer pairs in one PCR reaction system, is attracting attention.
  • Real-time multiplex PCR which is an evolution of multiplex PCR, detects each target in a distinctive manner without compromising the influence (crosstalk) of other targets and reducing sensitivity, and quantitatively detects multiple different target genes. The purpose is to obtain good results.
  • quantitative multiplex reactions of two or more types are often difficult due to the types of fluorescent substances that can be labeled and the problem of overlapping fluorescence wavelengths.
  • Patent Document 1 reports the result of measuring one point on the linear flow path of a minute flow path as a detection point using a multicolor fluorescence detector capable of simultaneously measuring three types of fluorescence as an example of multiplex PCR. ing.
  • An object of the present invention is to provide a real-time PCR method that is rapid and has reduced noise even when performing multiplex PCR.
  • the present inventors when performing real-time PCR, determine the fluorescence intensity for each thermal cycle at predetermined positions of microchannels in two temperature zones that are spatially separated. We found that the above problems could be solved by measuring. The present invention has been completed by further studying such a discovery.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A reciprocal flow type nucleic acid amplification method in which two spatially separated temperature zones are connected by a microchannel, and a sample solution is reciprocated between the two temperature zones in the microchannel to perform thermal cycling.
  • the two temperature zones are a denaturation temperature zone and an elongation / annealing temperature zone.
  • the microchannels include a curved flow path corresponding to a modification temperature zone, a curved flow path corresponding to an extension / annealing temperature zone, a curved flow path corresponding to the modification temperature zone, and a curved flow path corresponding to an extension / annealing temperature zone.
  • a method of performing real-time PCR by measuring the fluorescence intensity for each thermal cycle at a predetermined position of the flow path corresponding to the denaturation temperature zone and the flow path corresponding to the elongation / annealing temperature zone.
  • Step 1 A heater that can form a denaturing temperature zone and an elongation / annealing temperature zone.
  • a fluorescence detector capable of measuring the fluorescence intensity of a sample solution existing in the denaturation temperature range
  • a fluorescence detector capable of measuring the fluorescence intensity of the sample solution existing in the elongation / annealing temperature zone, enabling movement of the sample solution in the modification temperature zone and the elongation / annealing temperature zone, and at atmospheric pressure when the liquid feeding is stopped.
  • Liquid transfer mechanism that is opened, A substrate on which a nucleic acid amplification chip can be placed, Equipped with a control mechanism that controls the drive of the liquid feeding mechanism by sending an electric signal from the fluorescence detector regarding the movement of the sample liquid.
  • a reciprocal flow type nucleic acid amplification device which is characterized in that real-time PCR is performed by measuring the fluorescence intensity for each thermal cycle.
  • a curved flow path corresponding to the denaturation temperature zone and the extension / annealing temperature zone, a linear or curved intermediate flow path connecting the curved flow paths, and one or both ends of the flow path are fed by the nucleic acid amplification device.
  • Step 2 A step of connecting the liquid feeding mechanism connection portion of the minute flow path and the liquid feeding mechanism
  • Step 3 A step of performing thermal cycling by reciprocating the sample liquid between two curved flow paths of the minute flow path by the liquid feeding mechanism
  • Step 4 a flow path corresponding to the modification temperature zone and the extension / annealing.
  • Item 3 The nucleic acid amplification method according to Item 1 or 2, wherein the liquid feeding mechanism is a microblower or a blower.
  • Item 4 The nucleic acid amplification method according to any one of Items 1 to 3, wherein the intermediate flow path connecting the curved flow paths is linear.
  • Item 5 further provided with a fluorescence detector capable of measuring the fluorescence intensity of the sample solution passing through the intermediate flow path connecting the curved flow paths of the modification temperature zone and the extension / annealing temperature zone, and a predetermined of the intermediate flow path.
  • Item 4. The nucleic acid amplification method according to Item 4, which comprises a step of measuring the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle by the fluorescence detector at the position.
  • Item 6 The nucleic acid amplification method according to Item 5, wherein the distance between the fluorescence measurement point (P2) on the intermediate flow path and the fluorescence measurement point (P1) on the denaturation temperature zone is 8 mm or more.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is a method of performing thermal cycling by reciprocating a sample solution between two temperature zones in a microchannel. Such a nucleic acid amplification method may be referred to as a reciprocal flow type nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is a real-time PCR that can monitor the status of gene amplification during the PCR reaction among PCR (polymerase chain reaction).
  • PCR nucleic acid is amplified by utilizing denaturation of a plurality of cycles, annealing of a primer pair to a relative strand, and extension of a primer that causes an exponential increase in the number of copies of a target nucleic acid sequence.
  • the fluorescence intensity is measured for each thermal cycle. That is, the initial amount of target DNA is calculated by recording the change in fluorescence intensity for each cycle, which increases as the target DNA is amplified by thermal cycling, and calculating the number of cycles (Ct value) in which the fluorescence intensity exceeds a certain threshold value. Can be quantified.
  • the method of gene amplification that is, the number of cycles when a gene product increases exponentially, depends on the amount of the underlying template. Therefore, when an external standard DNA whose concentration is known in advance is used as a template. The abundance of the target gene in the sample can be calculated by comparing with the situation of gene amplification in.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention may use DNA as a template or RNA as a template.
  • DNA is used as a template
  • PCR is performed with the configuration of a nucleic acid amplification device as shown in FIG. 1
  • RNA is used as a template
  • real-time RT-PCR PCR is performed with the configuration of a nucleic acid amplification device as shown in FIG.
  • various known PCR kits and protocols can be used in which PCR is carried out after complementary DNA (cDNA) is generated (reverse transcription) from mRNA by reverse transcriptase.
  • cDNA complementary DNA
  • reverse transcriptase reverse transcriptase
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is real-time RT-PCR
  • One-Step RT-PCR which can perform reverse transcription reaction and PCR cycling in one step quickly and easily, can be used.
  • One of the preferred embodiments of the nucleic acid amplification method of the present invention is multiplex PCR, which simultaneously amplifies a plurality of gene regions by using a plurality of primer pairs in one PCR reaction system.
  • multiplex PCR which simultaneously amplifies two or three gene regions.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is carried out by moving the sample solution in a microchannel.
  • the microchannels for carrying out the nucleic acid amplification method of the present invention include a curved channel corresponding to the denaturation temperature zone and the extension / annealing temperature zone, and a curved channel and an extension / annealing temperature zone corresponding to the denaturation temperature zone. It is provided with at least a linear or curved intermediate flow path connecting the corresponding curved flow path, and a connection portion connectable to a liquid feeding mechanism for realizing the movement of the sample liquid.
  • the microchannel may also be provided with an opening for introducing the sample solution. The opening for introducing the sample solution can be optionally sealed by a seal, a valve, or the like.
  • the microchannels are (i) relatively highly thermally conductive, (ii) stable in the temperature range required for PCR, (iii) resistant to erosion by electrolyte solutions and organic solvents, and (iv) nucleic acids and proteins. It is preferably composed of a material that meets some or all of the requirements such as low adsorptivity. Specifically, various thermosetting and photocurable resins such as glass, quartz, silicon, and cycloolefin polymer (COP) are exemplified. Further, from the viewpoint of performing fluorescence detection, it is a transparent material having high transparency of light (particularly, excitation light and synchrotron radiation for performing fluorescence detection) (that is, less absorption, diffusion, reflection, etc.). Is preferable.
  • Grooves are formed in the material of the microchannel by machining such as cutting by NC processing, injection molding, nanoimprinting, soft lithography, etc., and a seal (preferably a transparent seal made of polyolefin, for example) is used. It can be a closed structure. Alternatively, a microchannel can be formed by three-dimensional printing.
  • the shape of the cross section of the microchannel is not particularly limited, and may be a semicircular shape, a circular shape, a rectangular shape, a wedge shape, a trapezoidal shape, a polygonal shape, or the like.
  • the cross section of the microchannel can be, for example, a width of about 10 to 1000 ⁇ m and a depth of about 10 to 1000 ⁇ m. Further, the width and the depth of the microchannels can be changed constantly or partially.
  • the shape of the curved flow path corresponding to the degeneration temperature zone and the curved flow path corresponding to the extension / annealing temperature zone provided in the minute flow path shall be the shape of a meandering flow path having a loop shape, a spiral flow path, or the like. Can be done.
  • the intermediate flow path connecting the curved flow path corresponding to the degeneration temperature zone and the curved flow path corresponding to the extension / annealing temperature zone can have either a linear shape or a curved shape.
  • the length of each of the curved flow path corresponding to the degeneration temperature zone and the curved flow path corresponding to the extension / annealing temperature zone is preferably 20 mm or more.
  • Each of the curved flow path corresponding to the degeneration temperature zone and the curved flow path corresponding to the elongation / annealing temperature zone provided in the microchannel is maintained at the corresponding temperature, and the temperature of the sample liquid that has moved to the temperature zone. To the temperature in the temperature range.
  • the denaturation temperature zone is maintained at the temperature required for the DNA denaturation reaction in PCR.
  • the temperature in the denaturation temperature range is preferably about 90 to 100 ° C, more preferably about 95 ° C.
  • the elongation / annealing temperature zone is maintained at the temperature required for the DNA annealing and elongation reactions in PCR.
  • the temperature in the elongation / annealing temperature range is preferably about 40 to 75 ° C, more preferably about 55 to 65 ° C.
  • each of the denaturation temperature zone and the elongation / annealing temperature zone is maintained at a constant temperature. Maintaining the temperature can be achieved by a heat source.
  • the heat source is, for example, built in the microchannel or is in contact with the microchannel. Specific examples of the heat source include a cartridge heater, a film heater, a Peltier heater, and the like.
  • the sample solution moves in a microchannel in a plug-like form.
  • the volume of the sample liquid moving in the microchannel is not particularly limited, and may be preferably about 5 to 50 ⁇ L, more preferably about 15 to 20 ⁇ L.
  • the sample solution contains components necessary for the PCR reaction, components necessary for fluorescence detection to realize real-time PCR, and the like.
  • the sample solution is an aqueous medium mainly composed of water, a template nucleic acid (which may be DNA or RNA) polymerase, an enzyme such as reverse transcriptase, and various deoxyribonucleotide triphosphates which may be labeled.
  • Components required for PCR reaction such as primer set corresponding to the target gene region; components required for fluorescence detection such as TaqMan probe, Cyclove probe, fluorescent probe such as E probe (registered trademark), dye such as SYBR GREEN, etc. include.
  • a buffer solution component for adjusting the pH and salt concentration may be contained.
  • the sample solution contains a primer set containing two or more types.
  • the "primer set” refers to a combination of a forward primer and a reverse primer, and usually one kind of forward primer and one kind of reverse primer are used corresponding to one target gene region.
  • the primer set according to the present invention is an amplification product in which the reverse primer corresponds to a different gene region (as a primer pair) in combination with two or more kinds of forward primers even when only one kind of reverse primer is contained. Can be used as a primer set for multiplex PCR when producing.
  • the dye used in the multiplex PCR of the present invention preferably contains at least one selected from the group consisting of ABY and HEX, for example, a combination of ABY, Cy5 and FAM or a combination of HEX, Cy5 and FAM. Can be mentioned.
  • the movement of the sample liquid in the nucleic acid amplification method of the present invention is realized by the liquid feeding mechanism that opens the atmospheric pressure when the liquid feeding is stopped. That is, for liquid transfer, which is configured to form an open system even during liquid transfer, instead of using a mechanism such as a syringe pump that requires the inside of the flow path to be a closed system so that pressure does not escape. Use the mechanism.
  • a liquid feeding mechanism By adopting such a liquid feeding mechanism, when the blowing is stopped, the pressure inside the flow path becomes instantly equal to the pressure outside the flow path, and the pressure acting on the plug-shaped sample liquid is lost, so the liquid feeding Will stop immediately. Therefore, accurate position control is possible without a plurality of pressure release valves for controlling the position of the sample liquid.
  • Examples of the liquid feeding mechanism that opens the atmospheric pressure when the liquid feeding is stopped include a micro blower and a fan.
  • a micro blower (also referred to as a piezoelectric micro blower) is a known device that sucks and discharges air, and is characterized by not having a closed structure (not having a check valve).
  • air suction and discharge are realized by bending and deforming the diaphragm by applying a voltage to the piezoelectric element.
  • the microblower for example, those manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd. can be used (MZB1001T02, MZB3004T04).
  • a fan is a device that blows air by the rotational movement of an impeller. Due to the structural characteristics of the impeller, the flow path is not a closed system.
  • the following [1] to [4] are set as one cycle to perform reciprocal flow type nucleic acid amplification.
  • [1] A process of operating the liquid feeding mechanism to move the sample liquid from the elongation / annealing temperature zone into the denatured temperature zone via the intermediate flow path.
  • [2] A process of stopping the liquid feeding mechanism and keeping the sample liquid in the denaturation temperature zone for a certain period of time.
  • [3] Operate the liquid feeding mechanism to move the sample liquid from the modification temperature zone to the elongation / annealing temperature zone via the intermediate flow path, and [4] Operate the liquid feeding mechanism. , A process of keeping the sample solution in the stretching / annealing temperature range for a certain period of time.
  • the above cycle is repeated at least once, preferably about 30 to 50 times, more preferably about 35 to 50 times, and thermal cycling is performed.
  • the number of cycles can be appropriately set according to the concentration of the template nucleic acid, the type of the target gene, and the like.
  • the speed of movement of the sample solution is, for example, about 25 mm / sec to 2.2 m / sec, more preferably 40 mm / sec. It can be about 1 m / sec and about 60 mm / sec to 300 mm / sec.
  • the time for holding the sample solution in the denaturation temperature zone and the time for holding the sample solution in the elongation / annealing temperature zone should be appropriately set according to the target gene region (gene type, region length, etc.). Can be done.
  • the time for holding the sample solution in the denaturation temperature zone can be about 2 to 10 seconds
  • the time for holding the sample solution in the elongation / annealing temperature zone can be about 2 to 60 seconds.
  • the liquid feeding mechanism is connected to a minute flow path, for example, via a connecting portion.
  • two liquid feeding mechanisms are connected to each of the two ends of the microchannel. That is, the first liquid feeding mechanism connected so as to feed the liquid from the elongation / annealing temperature zone toward the modification temperature zone is operated in the above step [1], and the elongation / annealing is performed from within the modification temperature zone.
  • the second liquid feeding mechanism connected so as to feed the liquid into the temperature zone is operated in the above step [3].
  • one liquid feeding mechanism is connected to two ends of the microchannel via a branched connecting flow path provided with a switching valve. That is, in the above step [1], the liquid feeding mechanism is operated in a state where the flow path is configured via the switching valve so that the liquid is fed from the extension / annealing temperature zone to the modification temperature zone. In the step [3], the liquid feeding mechanism is operated in a state where the flow path is configured via the switching valve so that the liquid is fed from the modification temperature zone toward the extension / annealing temperature zone.
  • the switching valve in the case of a three-way valve, two are connected to a microblower or fan that opens at atmospheric pressure when the liquid supply is stopped, and are arranged at both ends of the air flow path that divides in two directions at the branch point.
  • a microblower or fan that opens at atmospheric pressure when the liquid supply is stopped, and are arranged at both ends of the air flow path that divides in two directions at the branch point.
  • the three-way valve can send the sample liquid by blowing air with one valve closed and the other valve open.
  • a combination of 2-way valves or a multi-way valve such as 3-way, 4-way, or 5-way may be used depending on the combination of connection flow paths.
  • two liquid feeding mechanisms are at one end of a microchannel (air flow path) via a branched connecting flow path provided with a switching valve. It is connected to the extension / annealing temperature zone side). That is, in the above step [1], the liquid feeding mechanism (air discharging means) is operated via the switching valve so as to feed the liquid from the extension / annealing temperature zone toward the modification temperature zone, and the above step. In [3], the liquid feeding mechanism (air suction means) is operated via the switching valve so as to feed the liquid from the modification temperature zone toward the extension / annealing temperature zone.
  • a flow path corresponding to a denaturation temperature zone there are three flow paths: a flow path corresponding to a denaturation temperature zone; a flow path corresponding to an extension / annealing temperature zone, and a linear or curved intermediate flow path.
  • the fluorescence intensity of the sample solution is measured for each thermal cycle at predetermined positions in at least two of them.
  • a flow path corresponding to a modification temperature zone and a flow path corresponding to an extension / annealing temperature zone optionally, at a predetermined position of a linear or curved intermediate flow path, are thermally used.
  • the fluorescence intensity of the sample solution is measured for each cycle.
  • the predetermined position in the flow path corresponding to the denaturation temperature zone is not particularly limited, but is preferably a position where the intermediate flow path is folded back one to several times (2 to 4 times) or passed through the curved portion.
  • P1 in 3 can be mentioned.
  • the predetermined position in the flow path corresponding to the extension / annealing temperature zone is not particularly limited, but it is preferably a position where the intermediate flow path is folded back one to several times (2 to 4 times) or passed through the curved portion.
  • P3 in FIG. 3 can be mentioned.
  • the predetermined position of the linear intermediate flow path is not particularly limited, and P2 in FIG. 3 can be mentioned. Real-time PCR is realized as described above by measuring the fluorescence intensity for each thermal cycle.
  • the position where the fluorescence intensity is measured can be a linear or curved intermediate flow path with the flow path corresponding to the extension / annealing temperature zone.
  • the position where the fluorescence intensity is measured is between the flow path corresponding to the modification temperature zone and the flow path corresponding to the elongation / annealing temperature zone, which is linear or curved. There are three positions with the flow path.
  • the detection of the fluorescence intensity at one position preferably detects one type of fluorescence type (one type of wavelength).
  • At least one of the measurements of fluorescence intensity is to detect the movement of the sample solution in addition to monitoring the status of gene amplification during the PCR reaction. For example, it is possible to detect the movement of the sample solution in the denaturation temperature zone and the elongation / annealing temperature zone, and control the drive of the liquid feeding mechanism by an electric signal from the fluorescence detector regarding the movement of the sample solution.
  • the fluorescence intensity can be measured by detecting the synchrotron radiation (fluorescence) generated by the excitation light emitted from the light source toward the sample liquid in the microchannel with a fluorescence detector.
  • the fluorescence intensity detection position (P1) in the modification or elongation / annealing temperature range starts from the time when the sample liquid starts to pass through the fluorescence intensity detection position (P2) in the intermediate flow path.
  • the time passes through P3.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can be carried out using, for example, the following combination of a nucleic acid amplification device and a nucleic acid amplification chip:
  • Nucleic acid amplification device A heater that can form a denaturing temperature zone and an elongation / annealing temperature zone, A fluorescence detector capable of measuring the fluorescence intensity of a sample solution existing in the denaturation temperature range, Sample solution existing in the elongation / annealing temperature range A fluorescence detector capable of measuring the fluorescence intensity of a sample solution, A liquid feeding mechanism that enables the movement of the sample liquid between the two temperature zones and releases the atmospheric pressure when the liquid feeding is stopped.
  • a substrate on which a nucleic acid amplification chip can be placed Equipped with a control mechanism that controls the drive of the liquid feeding mechanism by sending an electric signal from the fluorescence detector regarding the movement of the sample liquid.
  • a reciprocal flow type nucleic acid amplification device characterized in that real-time PCR is performed by measuring the fluorescence intensity for each thermal cycle.
  • [Nucleic acid amplification chip] A curved flow path corresponding to the denaturation temperature zone and the extension / annealing temperature zone, a linear or curved intermediate flow path connecting the curved flow paths, and one or both ends of the flow path are fed by the nucleic acid amplification device.
  • a nucleic acid amplification chip having at least one microchannel having a connection that can be connected to a mechanism.
  • Step 1 The step of placing the nucleic acid amplification chip on the substrate of the nucleic acid amplification device
  • Step 2 A step of connecting the liquid feeding mechanism connection portion and the liquid feeding mechanism at one or both ends of the microchannel.
  • Step 3 The sample liquid is reciprocated between two curved flow paths of the minute flow path by the liquid feeding mechanism to perform thermal cycling.
  • Step 4 The flow path corresponding to the modification temperature zone and the extension / annealing temperature zone.
  • the nucleic acid amplification device includes a substrate on which a nucleic acid amplification chip is placed (not shown), a nucleic acid amplification chip temperature control unit, and a liquid feeding mechanism (for example, a microblower is shown as an example).
  • a fluorescence detector, and a small battery for a control computer power supply as a control mechanism can be provided.
  • the temperature control section for the nucleic acid amplification chip is spaced by 10 mm so that the two cartridge heaters are in contact with each of the sealing surface sides of the two curved flow path portions of the nucleic acid amplification chip without a gap.
  • a K-type thermocouple is joined to each heater.
  • the cartridge heater 1 is controlled by a control computer to a temperature required for the DNA denaturation reaction.
  • the cartridge heater 2 is controlled by a control computer to a temperature required for the DNA annealing reaction and elongation reaction.
  • the temperature zone for the DNA denaturation reaction and the temperature zone for the annealing reaction and the extension reaction can be maintained at a constant temperature by, for example, PID (proportional-integral-differential) control.
  • the fluorescence detector uses one point (P1 and P3 in FIG. 3) on the straight line of the microchannel in the modification temperature zone and the elongation / annealing temperature zone and one point (P2 in FIG. 3) as detection points. It is arranged to measure the fluorescence intensity, and the liquid feeding mechanism is stopped when or immediately after the sample liquid sent from one of the curved flow paths by pressurization reaches the detection point P1 or P3. The sample liquid can be held in the other curved flow path portion for a certain period of time.
  • the control computer can programmatically control the liquid feeding mechanism, and the sample liquid is set in the curved flow path portion on each heater while continuously monitoring the fluorescence intensity of the detection point at the center of each minute flow path.
  • Thermal cycling is performed by alternately switching the liquid feeding mechanism so that it moves alternately with time.
  • the control computer also simultaneously records the change in fluorescence intensity for each cycle, which increases as the target DNA is amplified by thermal cycling, and calculates the number of cycles (Ct value) in which the fluorescence intensity exceeds a certain threshold. By doing so, it is possible to quantify the initial amount of target DNA.
  • FIG. 3 shows a nucleic acid amplification chip provided with a microchannel.
  • two curved flow paths (serpentine flow paths) corresponding to the denaturation temperature zone and the extension / annealing temperature zone are connected by a linear intermediate flow path, and the detection points P1, P2, Sample solution fluorescence is detected at P3.
  • Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, template DNA for Mycoplasma pneumoniae uses a commercial control DNA AMPLIRUN (TM) STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE DNA CONTROL, AMPLIRUN (TM) HAEMOPHILUS DNA CONTROL, AMPLIRUN (R) Mycoplasma pneumoniae DNA CONTROL , Negative control (NTC) was mixed with sterile water instead and high speed real-time PCR was performed.
  • AMPLIRUN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE DNA CONTROL
  • AMPLIRUN (TM) HAEMOPHILUS DNA CONTROL AMPLIRUN (R) Mycoplasma pneumoniae DNA CONTROL
  • Negative control (NTC) was mixed with sterile water instead and high speed real-time PCR was performed.
  • Forward primer sequence for Streptococcus pneumoniae is 5'-AACTCTTACCGCATCTAGCAGATGAA-3'(SEQ ID NO: 1)
  • reverse primer sequence is 5'-CGTGCAATAACTCGTGCGTTTTA-3'(SEQ ID NO: 2)
  • the forward primer sequence for Haemophilus influenzae is 5'-GGAATCCCAATGCACAAGAAC A-3'(SEQ ID NO: 11)
  • the reverse primer sequence is 5'-GCTTTG GTCAACACATCAACCTT-3'(SEQ ID NO: 12)
  • the TaqMan® probe sequence is 5.
  • the forward primer sequence for Mycoplasma pneumoniae is 5'-CTTGGTTCTC CATACTAACTAAAATAAAAAACTC-3'(SEQ ID NO: 21)
  • the reverse primer sequence is 5'-GAACTACAAGCCGCTAATGCAG-3'(SEQ ID NO: 22)
  • the TaqMan® probe -GCCTTGAGGCTGGGTTTGCGCTA-3'(SEQ ID NO: 23).
  • Fluorescent probes for Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae, and Mycoplasma pneumoniae used Cy5, FAM, and ABY-labeled TaqMan® probes, respectively, and the final concentration in the PCR solution was 200 M.
  • the final concentrations of the two types of forward and reverse primers for Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae in the PCR solution were 1.5 ⁇ M each, and the final concentrations of the forward and reverse primers for Mycoplasma pneumoniae in the PCR solution were 2.0 ⁇ M each. ..
  • Takara Bio Inc.'s SpeedSTAR (registered trademark) HS DNA polymerase was used at a final concentration of 0.15 U / ⁇ L, and the attached FAST Buffer I and dNTP Mixture were mixed at the manual concentrations for PCR. It was a polymerization.
  • the thermal cycle conditions were set to heat for 10 seconds at 98 ° C. for hot start, and then repeat 50 cycles of 2 seconds at 98 ° C. and 6 seconds at 62 ° C.
  • the thermal cycle time of 50 cycles under this condition was 8 minutes 54 seconds.
  • the light source (LED) that irradiates the flow path (P1 in FIG. 3) in the degeneration temperature zone has an excitation wavelength of 525 nm
  • the light source (LED) that irradiates the intermediate flow path (P2 in FIG. 3) has an excitation wavelength of 470 nm and is elongated.
  • -A light source (LED) having a wavelength of 630 nm was used to irradiate the flow path (P3 in FIG. 3) in the annealing temperature range.
  • FIGS. 4-6 The results of multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae, as well as Mycoplasma pneumoniae using high-speed real-time PCR are shown in FIGS. 4-6.
  • FIG. 4 shows the change in fluorescence intensity of the Cy5-labeled TaqMan® probe as an amplification curve for Streptococcus pneumoniae
  • FIG. 5 shows the change in fluorescence intensity of the FAM-labeled TaqMan® probe as an amplification curve for Haemophilus influenzae.
  • Changes in the fluorescence intensity of the ABY-labeled TaqMan® probe as an amplification curve for Mycoplasma pneumoniae are shown in the solid lines of FIG. 6, and the NTC results are superimposed by broken lines. As shown by the solid line, when any of the three types of control DNA was contained, a clear amplification was obtained as compared with the fluorescence signal of NTC shown by the broken line, and simultaneous measurement of multiple items from the same sample was

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Abstract

空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行う、方法。

Description

核酸増幅方法
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０１９年３月１５日に出願された、日本国特許出願第２０１９－０４９００９号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、核酸増幅方法に関する。
　核酸の検出は、医薬品の研究開発、法医学、臨床検査、農作物や病原性微生物の種類の同定など、様々な分野において中核をなすものである。癌を含む種々の疾患、微生物の感染、分子系統解析に基づいた遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患及び発症リスク診断、マーカーの探索、食品や環境中の安全性評価、犯罪の立証、及び他の多くの技術にとって普遍的技術となっている。
　遺伝子である少量の核酸を高感度に検出する最も強力な基礎技術の１つは、核酸配列の一部又は全部を指数関数的に複製し増幅した産物を分析する手法である。
　ＰＣＲ法は、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する強力な技術である。ＰＣＲを用いると、テンプレートＤＮＡの中の標的とするＤＮＡ配列について、単一のテンプレートＤＮＡから数百万コピーのＤＮＡ断片を生成することができる。ＰＣＲは、サーマルサイクルと呼ばれる三相もしくは二相の温度条件を繰り返すことにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応が順次繰り返される。このサイクルは、分析に必要な十分なコピー数が得られるまで繰り返し行われる。原理上、ＰＣＲの1回のサイクルで、コピー数を倍にすることが可能である。実際には、サーマルサイクルが続くと、必要な反応試薬の濃度が減少するので、増幅されたＤＮＡ産物の集積が、最終的に止まる。ＰＣＲの一般的詳細については、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＰＣＲ」、Ｄｅｎｎｉｓ　Ｌｏ（編集）、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ所在）（１９９８年）、及び「ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンディエゴ所在）（１９９０年）を参照のこと。
　ＰＣＲ法は目的のＤＮＡを選択的に増幅できる強力な手法であるが、増幅したＤＮＡを確認するためには、ＰＣＲの終了後に別途ゲル電気泳動などによる確認作業が必要であった。そこで、ＰＣＲ法の改良として、目的のＤＮＡの増幅量に合わせ蛍光を発生もしくは消光させるリアルタイムＰＣＲ法が開発され、試料中の目的のＤＮＡの有無を簡便に確認できるようになった。従来のＰＣＲ法では、ＰＣＲ前の試料中のテンプレートＤＮＡ量が一定量を超えると、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ量はプラトーに達していることが多く、ＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することは出来ない。しかし、リアルタイムＰＣＲ法においては、プラトーに達する前に、ＰＣＲ途中の増幅ＤＮＡ量をリアルタイムに検出できるため、ＤＮＡ増幅の様子からＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することが可能である。そのためリアルタイムＰＣＲ法は、定量的ＰＣＲ法とも呼ばれる。
　リアルタイムＰＣＲ法による標的ＤＮＡ量の定量性は,臨床において特に有用であり、例えばエイズウイルス（ＨＩＶ）などウイルス感染の治療効果を確認する上で、ウイルス量の推移をモニタリングすること等に利用されている。また、ヘルペスウイルス（ＨＨＶ）のような、多くが幼児期より不顕性感染しているが、体力減衰等により増殖し発症する日和見感染症の診断においても、リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ定量が有効である。
　ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクルにより遺伝子を指数関数的に増幅する強力な手法であるが、ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。
　本願発明者らは、ＰＣＲ操作の高速化を図る目的からマイクロブロア等を送液用機構として使用するレシプロカルフロー型の核酸増幅装置を開発した(特許文献１)。
　一方、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を用いることで、複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲが注目されている。マルチプレックスＰＣＲを発展させたリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、それぞれのターゲットを、他のターゲットの影響（クロストーク）を受けにくく、感度を落とすことなく、複数の異なるターゲット遺伝子を区別して検出し、定量的な結果を得ることを目的としている。しかし、ラベル可能な蛍光物質の種類や、蛍光波長のオーバーラップの問題のために、２類以上の定量的マルチプレックス反応は、困難な場合が多いという報告がある。
　特許文献１では、マルチプレックスＰＣＲの例として３種類の蛍光の同時計測が可能な多色蛍光検出器を使用して微小流路の直線流路上の１点を検出点として計測した結果が報告されている。
ＷＯ２０１６／００６６１２
　しかしながら、マルチプレックスＰＣＲを行う際に、特許文献１のように多色蛍光検出器を使用し、直線流路上の１点を検出点として複数のプローブの蛍光強度を同時に計測すると、そのうちの1つのプローブから発光した蛍光波長のスペクトルが、同時に測定される別のプローブ由来の蛍光波長のスペクトルや、別のプローブに標識した蛍光色素を励起するための光源の波長のスペクトルと一部において重なり区別することができないため、正確な蛍光強度を計測するためには、このような蛍光同士や励起光との干渉が無いことが望ましい。
　また、このような干渉を防ぐために直線流路上に３つの測定ポイントを並べ、励起光源を時間差で点灯させ蛍光強度を測定することも可能である。しかし、干渉の発生を避ける目的から、送液スピードを遅くしなければならないという不都合が生じる。
　本発明の目的は、マルチプレックスＰＣＲを行う場合においても、迅速でありかつノイズの低下させたリアルタイムＰＣＲ法を提供することである。
　上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲを行う際に、空間的に離れた２つの温度帯の微小流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことで上記課題を解決できることを見いだした。本発明は、かかる発見にさらなる検討を重ねて完成したものである。
　本発明は、以下の態様を包含する。
　項１、空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、
前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、
前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、
　微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、
　前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行う、方法。
　項２、以下の工程を含む、核酸増幅方法：
　工程１：変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
核酸増幅用チップを載置可能な基板、
試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置の基板上に、
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップを載置する工程、
　工程２：微小流路の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
　工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
　工程４：前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。
　項３、前記送液用機構がマイクロブロア又は送風機である、項１又は２に記載の核酸増幅方法。
　項４、前記曲線流路をつなぐ中間流路が直線状である、項１～３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
　項５、さらに前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の曲線流路をつなぐ前記中間流路を通過する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器を備え、前記中間流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程を含む、項４に記載の核酸増幅方法。
　項６、前記中間流路上の蛍光測定点（Ｐ２）と前記変性温度帯上の蛍光測定点（Ｐ１）の距離が、８ｍｍ以上である、項５記載の核酸増幅方法。
　本発明によれば、マルチプレックスＰＣＲを行う場合においても、迅速でありかつノイズを低下させたリアルタイムＰＣＲ法を提供可能である。
核酸増幅装置の装置構成の例を示す図である（ヒーター２個）。 核酸増幅装置の装置構成の例を示す図である（ヒーター３個）。 ＰＣＲチップの変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯の曲線流路及びこれらをつなぐ直線状の中間流路の例を示す図である。 マルチプレックスｑＰＣＲ（Ｃｙ５検出）のグラフである。 マルチプレックスｑＰＣＲ（ＦＡＭ検出）のグラフである。 マルチプレックスｑＰＣＲ（ＡＢＹ検出）のグラフである。
　以下、本発明の核酸増幅方法について詳説する。
　本発明の核酸増幅方法は、試料液を微小流路中２つの温度帯間を往復移動させることによりサーマルサイクリングを行う方法である。このような核酸増幅方法を、レシプロカルフロー型の核酸増幅方法と呼ぶ場合もある。
　本発明の核酸増幅方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のうち、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることができるリアルタイムＰＣＲである。なお、ＰＣＲにおいては、複数回のサイクルの変性、プライマー対の相対鎖へのアニーリング、ターゲット核酸配列のコピー数の指数関数的な増加をもたらすプライマーの伸長を利用し、核酸の増幅を行う。
　リアルタイムＰＣＲを実現するために、サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行う。すなわち、サーマルサイクリングにより標的ＤＮＡが増幅するにつれ増加するサイクル毎の蛍光強度変化を経時的に記録し、蛍光強度がある閾値を超えるサイクル数（Ｃｔ値）を算出することで、初期の標的ＤＮＡ量を定量することが可能である。ＰＣＲにおいて、遺伝子増幅のされ方、即ち遺伝子産物が対数増殖的に増加するときのサイクル数は、基となる鋳型の量に依存するため、あらかじめ濃度が分かっている外部標準ＤＮＡを鋳型としたときの遺伝子増幅の状況と比較することで、試料中の標的遺伝子の存在量を算出することができる。
　本発明の核酸増幅方法は、ＤＮＡを鋳型とするものであっても、ＲＮＡを鋳型とするものであってもよい。ＤＮＡを鋳型とする場合は図１に示すような核酸増幅装置の構成によりＰＣＲが実施され、ＲＮＡを鋳型とする場合（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）は図２に示すような核酸増幅装置の構成により、まず逆転写酵素によりｍＲＮＡから相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成（逆転写）した後にＰＣＲが実施される
　ＰＣＲの各種キット及びプロトコールとして、各種公知のものを使用することができる。本発明の核酸増幅方法がリアルタイムＲＴ－ＰＣＲである場合、逆転写反応及びＰＣＲでのサイクリングを、ワンステップで迅速かつ簡便に行うことができるＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを用いることができる。
　本発明の核酸増幅方法はその好ましい態様の１つにおいて、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を用いることで、複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲである。２又は３種の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲであることが特に好ましい。
　本発明の核酸増幅方法は、試料液が微小流路中を移動することにより実施される。本発明の核酸増幅方法を実施するための微小流路は、変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備える。微小流路は、試料液を導入するための開口部を備えることもできる。試料液を導入するための開口部は、任意選択でシールや弁等により密閉可能とすることができる。
　微小流路は、（i）熱伝導性が比較的高い、（ii）ＰＣＲに必要な温度範囲において安定である、（iii）電解質溶液や有機溶媒に侵食されにくい、（iv）核酸やタンパク質の吸着性が低いなどの要件の一部又は全部を満たす材料から構成されることが好ましい。具体的には、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの熱硬化性や光硬化性の各種樹脂が例示される。また、蛍光検出を実施するとの観点から、光（特に、蛍光検出を行うための励起光及び放射光）の透過性が高い（すなわち、吸収、拡散、反射等が少ない）、透明な材料であることが好ましい。
　微小流路は、例えば、ＮＣ加工による切削などの機械加工、射出成形、ナノインプリンティング、ソフトリソグラフィーなどの方法により溝が素材に形成され、シール（好ましくは、例えばポリオレフィン製などの透明シール）により密閉された構造とすることができる。あるいは、三次元プリンティングにより微小流路を形成することもできる。微小流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、くさび形、台形、多角形などとすることができる。また、微小流路の断面は、例えば、幅１０～１０００μｍ程度、深さ１０～１０００μｍ程度とすることができる。また、微小流路の幅及び深さのそれぞれは、一定、又は、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。
　微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路の形状は、ループ形状を有する蛇行流路、渦巻き状などの曲線流路の形状とすることができる。変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ中間流路は、直線状又は曲線状のいずれの形状とすることができる。
　変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれの長さは、２０ｍｍ以上であることが好ましい。
　微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれは、対応する温度に維持されており、当該温度帯に移動してきた試料液の温度を当該温度帯の温度に変化させる。
　変性温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持されている。変性温度帯の温度は９０～１００℃程度が好ましく、９５℃程度がより好ましい。伸長・アニーリング温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持されている。伸長・アニーリング温度帯の温度は４０～７５℃程度が好ましく、５５～６５℃程度がより好ましい。
　変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯のそれぞれは、一定の温度に維持されていることが好ましい。温度の維持は、熱源により実現することができる。熱源は、例えば、微小流路に内蔵されている又は微小流路が接触している。熱源の具体例としては、カートリッジヒーター、フィルムヒーター、ペルチェヒーター等が例示される。
　本発明の核酸増幅方法において、試料液はプラグ状の形態で微小流路中を移動する。微小流路中を移動する試料液の容量は、特に限定されず、好ましくは５～５０μＬ程度、より好ましくは１５～２０μＬ程度とすることができる。
　試料液には、ＰＣＲの反応に必要な成分、リアルタイムＰＣＲを実現するための蛍光検出に必要な成分等が含まれている。例えば、試料液は水を主体とした水性媒体に、鋳型核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよい）ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、標識されていてもよい各種デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標的遺伝子領域に対応するプライマーセットなどのＰＣＲの反応に必要な成分；ＴａｑＭａｎプローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅプローブ、Ｅプローブ（登録商標）などの蛍光プローブ、ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮなどの色素などの蛍光検出に必要な成分などが含まれている。また、ｐＨ及び塩濃度を調整するための緩衝液成分が含まれていてもよい。
　本発明のＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである場合、試料液には２種類以上含むプライマーセットを含む。一般に、「プライマーセット」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを組み合わせたものをいい、通常は一つの標的遺伝子領域に対応して1種のフォワードプライマー及び1種のリバースプライマーを用いる。本発明に係るプライマーセットは、リバースプライマーを１種のみ含む場合であっても、そのリバースプライマーが２種以上のフォワードプライマーとの組み合わせで（プライマー対として）それぞれ別個の遺伝子領域に対応する増幅産物を生成するときは、マルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用することができる。
　蛍光検出に用いる色素（蛍光色素）の例としては、ＡＢＹ、アクリジン、アレクサフルーア４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、ＡＴＴＯ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ蛍光色素）、バイオサーチブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、クマリン、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＭ（例えば、５－ＦＡＭ、６－ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、ＧＰＦ、５－ＨＥＸ、６－ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＪＵＮ、マリーナブルー、ＮＥＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥＴ、パルサー、クエザー５７０、クエザー６７０、クエザー７０５、ローダミングリーン、ローダミンレッド、５－ＲＯＸ、６－ＲＯＸ、５－ＴＡＭＲＡ、６－ＴＡＭＲＡ、５－ＴＥＴ、６－ＴＥＴ、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＶＩＣが挙げられる。
　本発明のマルチプレックスＰＣＲに使用する色素として、ＡＢＹ及びＨＥＸからなる群から選択される少なくとも１種が含まれることが好ましく、例えば、ＡＢＹ、Ｃｙ５及びＦＡＭの組み合わせやＨＥＸ、Ｃｙ５及びＦＡＭの組み合わせを挙げることができる。
　本発明の核酸増幅方法における試料液の移動は、送液停止時には大気圧開放される送液用機構により実現される。すなわち、シリンジポンプ等の圧力が逃げないように流路内部を閉鎖系とする必要がある機構を用いるのではなく、送液時であっても開放系を形成するように構成される送液用機構を使用する。このような送液用機構を採用することで、送風を停止させると、流路内部の圧力が瞬時に流路外部の圧力と等しくなり、プラグ状試料液へ作用する圧力が失われるため送液はすぐに停止する。そのため、試料液の位置制御を行うための圧力開放用の複数の弁がなくても、正確な位置制御が可能となる。
　送液停止時には大気圧開放される送液用機構の例としては、マイクロブロア、ファンを挙げることができる。
　マイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置であり、密閉構造でない（逆止弁を有しない）ことを特徴とする。代表的なマイクロブロアにおいて、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現する。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４)。
　ファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置をいう。羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。
　本発明の核酸増幅方法において、下記［1］～［4］を１サイクルとして、レシプロカルフロー型の核酸増幅を行う。
［1］送液用機構を動作させ、試料液を伸長・アニーリング温度帯内から、中間流路を経由して、変性温度帯内へ移動させる工程、
［2］送液用機構を停止させ、試料液を変性温度帯内に一定時間保持させる工程、
［3］送液用機構を動作させ、試料液を変性温度帯内から、中間流路を経由して、伸長・アニーリング温度帯内へ移動させる工程、及び
［4］送液用機構を動作させ、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に一定時間保持させる工程。
　上記サイクルを少なくとも１回以上、好ましくは３０～５０回程度、より好ましくは３５～５０回程度繰り返して行い、サーマルサイクリングを行う。サイクル数は、鋳型核酸の濃度、標的遺伝子の種類などに応じて適宜設定することができる。
　本発明の核酸増幅方法において、試料液の移動の速度、特に試料液が前記中間流路を移動する際の速度は、例えば、２５ｍｍ／秒～２．２ｍ／秒程度、より好ましくは４０ｍｍ／秒～１ｍ／秒程度、６０ｍｍ／秒～３００ｍｍ／秒程度とすることができる。
　試料液を変性温度帯内に保持させる時間及び試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間のそれぞれは、標的遺伝子領域（遺伝子の種類、領域の長さ等）に応じて適宜設定することができる。例えば、試料液を変性温度帯内に保持させる時間としては、２～１０秒程度、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間としては、２～６０秒程度とすることができる。
　送液用機構は、例えば接続部を介して、微小流路と接続している。
　本発明の一つの態様においては、２つの送液用機構が、微小流路の２つの端のそれぞれに１つずつ接続されている。すなわち、伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように接続された第１の送液用機構を上記工程［1］において動作させ、変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように接続された第２の送液用機構を上記工程［3］において動作させる。
　本発明の別の態様においては、１つの送液用機構が、切替弁を備えた分岐した接続流路を介して、微小流路の２つの端に接続されている。すなわち、上記工程［1］においては伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して流路が構成された状態で送液用機構をさせ、上記工程［3］においては変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して流路が構成された状態で送液用機構をさせる。なお、切替弁については３方弁の場合であれば、送液停止時には大気圧開放されるマイクロブロアやファンに接続され、分岐点で２方向に分かれる空気流路の両端に配置された２つの３方弁を介し、微小流路の２つ端まで通じる２本の接続流路に対し、交互に送風を行うことで、微小流路内において試料液を往復送液することが可能となる。この場合、３方弁は、一方の弁を閉じて、他方の弁を開いた状態にて送風を行うことにより試料液を送液することが可能となる。また、３方弁は１つである方が望ましいが、接続流路の組み合わせにより２方弁の組み合わせや３方、４方、５方など多方弁で合っても良い。
　本発明の別の態様においては、２つの送液用機構（エアーの吐出手段とエアーの吸引手段）が、切替弁を備えた分岐した接続流路を介して、微小流路の１つの端（伸長・アニーリング温度帯側）に接続されている。すなわち、上記工程［1］においては伸長・アニーリング温度帯内から変性温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して送液用機構（エアーの吐出手段）を作動させ、上記工程［3］においては変性温度帯内から伸長・アニーリング温度帯内へ向かって送液を行うように切替弁を介して送液用機構（エアーの吸入手段）を作動させる。
　典型的な実施形態における本発明の核酸増幅方法においては、変性温度帯に対応する流路；伸長・アニーリング温度帯に対応する流路、及び直線状もしくは曲線状の中間流路の３つの流路のうち少なくとも２つにおける所定の位置で、サーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う。例えば、本発明の一実施形態において、変性温度帯に対応する流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する流路、任意選択で、直線状もしくは曲線状の中間流路の所定の位置で、サーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う。変性温度帯に対応する流路での所定の位置は、特に制限はないが、中間流路から１～数回（２～４回）の折り返しあるいは曲線部を通過した位置が好ましく、例えば、図３におけるＰ１を挙げることができる。また、伸長・アニーリング温度帯に対応する流路での所定の位置は、特に制限はないが、中間流路から１～数回（２～４回）の折り返しあるいは曲線部を通過した位置が好ましく、例えば、図３におけるＰ３を挙げることができる。直線状の中間流路の所定の位置は、特に制限はなく、図３におけるＰ２を挙げることができる。
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測により、前述のとおりリアルタイムＰＣＲが実現される。
　なお、２つの位置で蛍光強度の計測を行う場合、蛍光強度の計測を行う位置を、伸長・アニーリング温度帯に対応する流路と直線状もしくは曲線状の中間流路とすることもできる。
　また、３つの位置で蛍光強度の計測を行う場合、蛍光強度の計測を行う位置は、変性温度帯に対応する流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する流路と直線状もしくは曲線状の中間流路との３つの位置である。
　１つの位置での蛍光強度の検出は、１種の蛍光種（１種の波長）を検出するものであることが好ましい。
　蛍光強度の計測の少なくとも１つは、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることに加えて、試料液の移動を検出するものであることが好ましい。例えば、試料溶液の移動の検出を変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯で行い、試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号により送液用機構の駆動を制御することが可能である。
　試料液の送液制御の例を以下に示す。
［1］変性温度帯の流路を照射する光源（ＬＥＤ）を点灯させ、送液用機構により試料液を伸長・アニーリング温度帯から、中間流路を経由して、変性温度帯内へ移動させる工程、
［2］変性温度帯における試料液を検出したことの電気信号を蛍光検出器から制御機構が受信し送液用機構を停止させる工程、
［3］伸長・アニーリング温度帯の流路を照射する光源（ＬＥＤ）を点灯させ、送液用機構により試料液を変性温度帯内から、中間流路を経由して、伸長・アニーリング温度帯内へ移動させる工程、及び
［4］伸長・アニーリング温度帯における試料液を検出したことの電気信号を蛍光検出器から制御機構が受信し送液用機構を停止させる工程。
　蛍光強度の計測は、光源から微小流路中の試料液に向かって照射された励起光により生じた放射光（蛍光）を、蛍光検出器で検出することにより行うことができる。
なお、中間流路において蛍光強度を計測する場合、試料液が中間流路の蛍光強度の検出位置（Ｐ２）を通過し始めた時から変性又は伸長・アニーリング温度帯の蛍光強度の検出位置（Ｐ１又はＰ３）を通過する時までとすることが好ましい。上記のように蛍光強度の計測時間（期間）を規定することにより、Ｐ１又はＰ３を試料液が通過後まで蛍光強度を取得した場合と比較してノイズの少ない安定した測定結果を得ることができる。
　本発明の核酸増幅方法は、例えば、以下の核酸増幅装置と核酸増幅用チップの組み合わせを用いて実施することができる：
［核酸増幅装置］
変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料溶液試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記２つの温度帯間の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
核酸増幅用チップを載置可能な基板、
試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置。
［核酸増幅用チップ］
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップ。
　具体的には、以下の工程１～４により行うことができる：
工程１：上記核酸増幅装置の基板に上記核酸増幅用チップを載置する工程、
工程２：微小流路の一方又は両端部の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程
工程４：前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。
　以下、核酸増幅装置及び核酸増幅用チップの例を、図を参照しながら説明する。
　核酸増幅装置は、図１に示す通り、核酸増幅用チップを載置するための基板（図示せず）、核酸増幅用チップ温調部、送液用機構（例えば、一例としてマイクロブロアを示す）、蛍光検出器、制御機構としての制御用コンピュータ電源用小型バッテリーを備えることができる。
　図１において、核酸増幅用チップ用温調部は、カートリッジヒーター２本を、上記核酸増幅用チップの２つの曲線流路部のそれぞれのシール面側と隙間なく接触する様に、１０ｍｍの間隔をおいて平行に配置させた構成としており、２本のヒーターの温度制御のため、各ヒーターにはＫ型熱電対を接合させている。
　カートリッジヒーター１は、ＤＮＡ変性反応に必要な温度に制御用コンピュータにより制御されている。カートリッジヒーター２はＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に制御用コンピュータに制御されている。なお、ＤＮＡの変性反応のための温度帯、アニーリング反応及び伸長反応のための温度帯は、例えばＰＩＤ（比例－積分－微分）制御により定温保持することができる。
　蛍光検出器は、変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯の微小流路の直線上の各1点（図３のＰ１，Ｐ３）並びに中間流路上の１点（図３のＰ２）を検出点として蛍光強度を計測するように配置されており、加圧により一方の曲線流路部から送液された試料液が、検出点Ｐ１あるいはＰ３に到達した時点又はその直後に、送液用機構を停止させ、当該試料液を、他方の曲線流路部内に一定時間保持されることができる。
　制御用コンピュータは、送液用機構のプログラム制御が可能であり、各微小流路中心の上記検出点の蛍光強度を連続モニタリングしながら、当該試料液が各ヒーター上の曲線流路部へ設定した時間ずつ交互に移動する様、当該送液用機構について交互にスイッチングしサーマルサイクリングを行う。当該制御用コンピュータは、さらに、リアルタイムＰＣＲ法において、サーマルサイクリングにより標的ＤＮＡが増幅するにつれ増加するサイクル毎の蛍光強度変化も同時に記録し、蛍光強度がある閾値を超えるサイクル数（Ｃｔ値）を算出することで、初期の標的ＤＮＡ量を定量することが可能である。
　図３に微小流路を備えた核酸増幅用チップを示す。図３に示す核酸増幅用チップ用では、変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯に対応する２つの曲線流路（蛇行流路）を直線状の中間流路で連結され、検出点Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３において試料液蛍光を検出する。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　［実施例］肺炎起炎菌群の定量
　高速リアルタイムＰＣＲ用のＰＣＲチップ及び本発明の装置を用いて、肺炎起炎菌群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の標的遺伝子の定量を行った。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するテンプレートＤＮＡは、市販のコントロールＤＮＡであるＡＭＰＬＩＲＵＮ（登録商標）ＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＵＳ　ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ　ＤＮＡ　ＣＯＮＴＲＯＬ、ＡＭＰＬＩＲＵＮ（登録商標）ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳ　ＤＮＡ　ＣＯＮＴＲＯＬ、ＡＭＰＬＩＲＵＮ（登録商標）ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ　ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ　ＤＮＡ　ＣＯＮＴＲＯＬを使用し、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）には滅菌水を代わりに混合して高速リアルタイムＰＣＲを実施した。
　プライマー及びプローブの配列は、３種類の標的に対して以下の配列を使用した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォーワードプライマー配列は　５’－ＡＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＡＡＴＣＴＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡ－３’　（配列番号１）、リバースプライマー配列は５’－ＣＧＴＧＣＡＡＴＡＣＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡ－３’（配列番号２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は５’－ＣＣＧＡＡＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡ－３’（配列番号３）とした。また、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対するフォワードプライマー配列は５’－ＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＡＡＣ　Ａ－３’　（配列番号１１）、リバースプライマー配列は５’－ＧＣＴＴＴＧ　ＧＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＴＴ－３’（配列番号１２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は５’－ＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＧＣＡＧＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１３）とした。また、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォワードプライマー配列は５’－ＣＴＴＧＧＴＣＴＣ　ＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＣ－３’（配列番号２１）、リバースプライマー配列は５’－ＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＧＣＴＡＡＴＧＣＡＧ－３’（配列番号２２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は５’－ＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣＴＡ－３’（配列番号２３）とした。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ならびにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する蛍光プローブには、それぞれＣｙ５、ＦＡＭ、ＡＢＹ標識のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用し、ＰＣＲ溶液中の最終濃度は各２００ｎＭとした。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する２種類のフォワードプライマー並びにリバースプライマーのＰＣＲ溶液中の最終濃度は各１．５μＭとし、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォワードプライマー並びにリバースプライマーのＰＣＲ溶液中の最終濃度は各２．０μＭとした。その他の試薬については、タカラバイオ社のＳｐｅｅｄＳＴＡＲ（登録商標）　ＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを最終濃度０．１５Ｕ／μＬにて使用し、付属のＦＡＳＴ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ及びｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅをマニュアル通りの濃度で混合し、ＰＣＲ用プレミクスチャーとした。
　当該ＰＣＲ用プレミクスチャー１１μｌに、５．０ｘ１０３コピー／μＬに調製した３種類のコントロールＤＮＡについて各２μｌを、もしくはＮＴＣとして滅菌水を６μｌ添加し、全量２０μｌをリアルタイムマルチプレックスＰＣＲに使用した。
　サーマルサイクル条件は、ホットスタートに９８℃で１０秒加熱後、さらに９８℃で２秒と６２℃で６秒を５０サイクル繰り返す設定とした。この条件における５０サイクルのサーマルサイクル時間は、８分５４秒であった。
　変性温度帯の流路（図３のＰ１）を照射する光源（ＬＥＤ）は励起波長５２５ｎｍであり、中間流路（図３のＰ２）を照射する光源（ＬＥＤ）は励起波長４７０ｎｍであり、伸長・アニーリング温度帯の流路（図３のＰ３）を照射する光源（ＬＥＤ）は６３０ｎｍのものを使用した。
　高速リアルタイムＰＣＲを用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ならびにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するマルチプレックスＰＣＲの結果を図４～６に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する増幅曲線としてＣｙ５標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの蛍光強度の変化を図４に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する増幅曲線としてＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの蛍光強度の変化を図５に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する増幅曲線としてＡＢＹ標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの蛍光強度の変化を図６の各実線に示し、ＮＴＣの結果を破線で重ねている。
実線にて示す通り、３種類の何れのコントロールＤＮＡを含有させた場合には、破線で示すＮＴＣの蛍光シグナルに比べ明確な増幅が得られ、同一試料からの多項目同時計測を実現した。

Claims (6)

  1. 　空間的に離れた２つの温度帯が微小流路で結ばれており、試料液を微小流路中前記２つの温度帯間を往復移動させサーマルサイクリングを行うレシプロカルフロー型の核酸増幅方法において、
    前記２つの温度帯は変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯であり、
    前記微小流路は変性温度帯に対応する曲線流路、伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路、前記変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、並びに、試料液の移動を実現するための送液用機構に接続可能な接続部を少なくとも備え、
    　微小流路中での試料液の移動は送液停止時には大気圧開放される送液用機構により行われ、
    　前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置でサーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行う、方法。
  2. 以下の工程を含む、核酸増幅方法：
    　工程１：変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
    前記変性温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
    前記伸長・アニーリング温度帯に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
    核酸増幅用チップを載置可能な基板、
    試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
    サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするレシプロカルフロー型の核酸増幅装置の基板上に、
    前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップを載置する工程、
    　工程２：微小流路の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
    　工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程、及び
    　工程４：前記変性温度帯に対応する流路及び前記伸長・アニーリング温度帯に対応する流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。
  3. 　前記送液用機構がマイクロブロア又は送風機である、請求項１に記載の核酸増幅方法。
  4. 　前記曲線流路をつなぐ中間流路が直線状である、請求項１に記載の核酸増幅方法。
  5. 　さらに前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯の曲線流路をつなぐ前記中間流路を通過する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器を備え、前記中間流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程を含む、請求項４に記載の核酸増幅方法。
  6. 　前記中間流路上の蛍光測定点（Ｐ２）と前記変性温度帯上の蛍光測定点（Ｐ１）の距離が、８ｍｍ以上である、請求項５記載の核酸増幅方法。
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