WO2020190104A1 - 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating diseases of the cranial nerve system.
  • degenerative neurological diseases such as stroke, dementia, and Alzheimer's disease
  • decreases in memory, attention, cognitive ability, and emotional control are observed, which are the result of neuronal death and atrophy of nerve branches.
  • the elongation of the nerve branch of the nerve cell plays an important role in the memory and learning functions of the neural circuit by increasing the neuroplasticity. Accordingly, it is predicted that the active ingredient that promotes nerve branch elongation and nerve regeneration of nerve cells may be developed as a new therapeutic agent for degenerative neurological diseases.
  • a binding molecule that specifically binds to Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein present in regulatory T cells (Treg cells) is used as an active ingredient. It relates to a composition for preventing, improving, or treating diseases of the cranial nerve system, including.
  • the "binding molecule" used in the present invention is an intact immunoglobulin including a monoclonal antibody such as a chimeric, humanized or human monoclonal antibody, or an immunoglomline that binds to an antigen, for example It refers to a variable domain comprising an immunoglobulin fragment that competes with an intact immunoglobulin for binding to the monomeric HA or trimeric HA of the influenza A virus. Regardless of structure, the antigen-binding fragment binds the same antigen recognized by the intact immunoglobulin.
  • Antigen-binding fragments include two or more consecutive groups of the amino acid sequence of the binding molecule, 20 or more consecutive amino acid residues, 25 or more consecutive amino acid residues, 30 or more consecutive amino acid residues, 35 or more consecutive amino acid residues, 40 or more consecutive amino acid residues.
  • amino acid residues 50 or more consecutive amino acid residues, 60 or more consecutive amino acid residues, 70 or more consecutive amino acid residues, 80 or more consecutive amino acid residues, 90 or more consecutive amino acid residues, 100 or more consecutive amino acid residues, 125 or more consecutive amino acid residues, Peptides or polypeptides comprising an amino acid sequence of 150 or more contiguous amino acid residues, 175 or more contiguous amino acid residues, 200 or more contiguous amino acid residues, or 250 or more contiguous amino acid residues.
  • Antigen-binding fragment is in particular Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, complementarity determining region (CDR) fragment, single-chain antibody (scFv), bivalent Single-chain antibodies, single-chain phage antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, polypeptides containing one or more fragments of an immunoglobulin sufficient to bind a specific antigen to the polypeptide, and the like.
  • the fragments can be produced synthetically or by enzymatic or chemical degradation of complete immunoglobulins, or can be produced genetically by recombinant DNA technology. Methods of production are well known in the art.
  • the "Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein” is a transmembrane protein consisting of 1091 amino acids present on the surface of regulatory T cells, and a leucine repeat sequence on the extracellular or lumen side (leucine-rich repeat (LRR)), three immunoglobulin-like domains, a transmembrane sequence, and a cytoplasmic tail.
  • the LRIG gene family includes LRIG1, LRIG2 and LRIG3, and amino acids between them are very conservatively composed.
  • the LRIG1 gene is highly expressed in normal skin and can be expressed in basal and hair follicle cells to regulate the proliferation of epithelial stem cells.
  • the Lrig-1 protein may be a protein present in humans or mice, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein may be a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 derived from human or a polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 derived from a mouse, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1 may be encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3 may be encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 13
  • Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 14
  • a heavy chain variable region comprising; a heavy chain CDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 15;
  • Light chain CDR1 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 16
  • Light chain CDR2 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 17
  • It may be a binding molecule comprising a light chain variable region including; light chain CDR3 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 18.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 15; a heavy chain variable region selected from the group consisting of;
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 18; a light chain variable region selected from the group consisting of; It may be a binding molecule.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 5, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 7; And a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 8, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 10; And
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 15;
  • a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 16 a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 17, and a light chain variable region comprising a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 18; may be a binding molecule selected from the group consisting of: have.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 19;
  • It may be a binding molecule including a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 20.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a binding molecule comprising a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 12;
  • It may be a binding molecule selected from the group consisting of; a binding molecule including a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 19 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 20.
  • the binding molecule may further include an Fc region (fragment crystallization region) or a constant region (constant region).
  • the Fc region may be an Fc region of an IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody, may be derived therefrom, or may be a hybrid Fc region.
  • the Fc region may be a mammalian-derived IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody Fc region, preferably human-derived IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, It may be the Fc region of an IgG3 or IgG4 antibody, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a mouse-derived IgG2a constant region represented by SEQ ID NO: 21, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a mouse-derived immunoglobulin kappa constant region represented by SEQ ID NO: 22, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a human-derived IgG1 constant region represented by SEQ ID NO: 23 or 24, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a human-derived immunoglobulin kappa constant region represented by SEQ ID NO: 25, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a human-derived IgG2 constant region represented by SEQ ID NO: 26, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a human-derived IgG3 constant region represented by SEQ ID NO: 27, but is not limited thereto.
  • the constant region may be a human-derived IgG4 constant region represented by SEQ ID NO: 28, but is not limited thereto.
  • the Fc region may be a human-derived immunoglobulin lambda constant region, but is not limited thereto.
  • the "hybrid Fc" may be derived from a combination of human IgG subclass or a combination of human IgD and IgG.
  • the hybrid Fc binds to a biologically active molecule, a polypeptide, etc., not only increases the serum half-life of the biologically active molecule, but also increases the expression level of the polypeptide when the nucleotide encoding the Fc-polypeptide fusion protein is expressed.
  • the hybrid Fc region may be a hybrid Fc represented by SEQ ID NO: 29, but is not limited thereto.
  • the Fc or constant region may be linked to the variable region by a linker.
  • a linker is connected to the C-terminus of the Fc or constant region, and the N-terminus of the binding molecule of the present invention may be connected to the linker, but is not limited thereto.
  • the "linker” may include a sequence that can be cleaved by an enzyme overexpressed in a tissue or cell of a target disease. When it can be cleaved by the enzyme overexpressed as described above, it is possible to effectively prevent the activity of the polypeptide from being lowered due to the Fc or the constant region.
  • a peptide linker consisting of 33 amino acids located at the 282 th to 314 th part of human albumin most frequently present in the blood, more preferably 13 amino acids located at the 292 th to 304 th part It may be a peptide linker, and this portion is a portion that is mostly exposed to the outside due to a three-dimensional structure, and the possibility of inducing an immune response in the body is minimized. However, it is not limited thereto.
  • the binding molecule of the present invention may further include a heavy chain constant region consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 23, 24, 26, 27, 28 and 29.
  • the binding molecule of the present invention may further include a light chain constant region consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 or 25.
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21;
  • It may further include a light chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a heavy chain constant region consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, 24, 26, 27 or 28;
  • It may further include a light chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • It may further include a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a binding molecule comprising a heavy chain represented by SEQ ID NO: 30 and a light chain represented by SEQ ID NO: 31;
  • a binding molecule comprising a heavy chain represented by SEQ ID NO: 32 and a light chain represented by SEQ ID NO: 33;
  • It may be a binding molecule selected from the group consisting of; a binding molecule including a heavy chain represented by SEQ ID NO: 34 and a light chain represented by SEQ ID NO: 35.
  • the binding molecule of the present invention is characterized in that it is an antibody, but is not limited thereto.
  • the antibody has the ability to bind to the Lrig-1 protein as a monoclonal antibody, a full-length antibody, or a part of the antibody, and binds to the Lrig-1 antigen determining site competitively with the binding molecule of the present invention. Includes all possible antibody fragments.
  • the "antibody” refers to a protein molecule that acts as a receptor for specifically recognizing an antigen, including immunoglobulin molecules that are immunologically reactive with a specific antigen.
  • the antigen may be a Lrig-1 protein present on the surface of regulatory T cells. Preferably, it may specifically recognize the leucine rich region or immunoglobulin-like domain of the Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • the "immunoglobulin” has a heavy chain and a light chain, and each of the heavy and light chains includes a constant region and a variable region.
  • the variable regions of the light and heavy chains include three multivariable regions and four framework regions, referred to as complementarity determining regions (hereinafter referred to as "CDR").
  • CDRs mainly play a role in binding to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 sequentially starting from the N-terminus, and are also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the "monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, and indicates a single binding specificity and affinity for a specific epitope.
  • the "full-length antibody” is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain is connected by a heavy chain and a disulfide bond, IgA, IgD, IgE, IgM, and IgG.
  • the IgG is a subtype, and includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the "antibody fragment” refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, Fab', F(ab') 2 and Fv.
  • the Fab has a structure having a variable region of a light and heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region of a heavy chain (CH1 domain), and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region including at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab') 2 antibodies are produced by disulfide bonds between cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Fv (Variable fragment) refers to the smallest antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the double-chain Fv (dsFv) is a disulfide bond to connect the heavy chain variable region and the light chain variable region
  • the single-chain Fv (scFv) is generally covalently linked to the heavy chain variable region and the light chain variable region through a peptide linker.
  • the antibody fragment can obtain a Fab or F(ab') 2 fragment, and can be produced through gene recombination technology.
  • the antibody is a chimeric antibody, humanized antibody, bivalent, bispecific molecule, minibody, domain antibody, bispecific antibody, antibody mimic, uni It may be a unibody diabody, a triabody, a tetrabody, or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the "chimeric antibody” is an antibody obtained by recombining the variable region of a mouse antibody and the constant region of a human antibody, and has an improved immune response compared to a mouse antibody.
  • the "humanized antibody” refers to an antibody in which the protein sequence of an antibody derived from a non-human species is modified to resemble an antibody variant naturally produced in humans.
  • the humanized antibody can be prepared by recombining a mouse-derived CDR with a human antibody-derived FR to produce a humanized variable region, and then recombining it with a preferred human antibody constant region to produce a humanized antibody.
  • the binding molecule may bind to Lrig-1 protein, and may also be provided as a bispecific antibody or bispecific antigen-binding fragment capable of binding to other proteins.
  • the bispecific antibody and bispecific antigen-binding fragment may include the binding molecule according to the present invention.
  • the bispecific antibody and the bispecific antigen-binding fragment include an antigen-binding domain capable of binding to Lrig-1 protein, wherein the antigen-binding domain capable of binding to Lrig-1 protein is It may comprise or consist of a binding molecule according to the invention.
  • the bispecific antibody and bispecific antigen-binding fragment provided by the present invention comprises an antigen-binding domain, which is a binding molecule capable of binding to the Lrig-1 protein according to the present invention, and an antigen-binding domain capable of binding to other target proteins.
  • the antigen-binding domain capable of binding to another target protein is a protein other than the Lrig-1 protein, but is not limited thereto, for example, PD-1 or an antigen-binding domain capable of binding to a cell surface receptor. However, it is not limited thereto.
  • bispecific antibodies and bispecific antigen binding fragments according to the invention can be in any suitable format, e.g., Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197, incorporated herein by reference in its entirety. It can be provided in the format described in.
  • a bispecific antibody or bispecific antigen binding fragment may be a bispecific antibody conjugate (e.g., IgG2, F(ab')2 or CovX-body), a bispecific IgG or IgG-type molecule (e.g.
  • Db diabody
  • dsDb dsDb
  • DART scDb
  • tandAbs tandem scFv
  • tandem dAb/VHH triple body
  • Fab-scFv Fab-scFv
  • F(ab')2-scFv2 bispecific Fc and CH3 fusion proteins
  • taFv-Fc di-diabody, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, or scFv-kih-CH3), or a bispecific fusion protein (e.g., scFv2-albumin , scDb-albumin, taFv-toxin, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-cytokine2).
  • a bispecific fusion protein e.g., scFv2-albumin , scDb-albumin, taFv-toxin, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-cytokine2.
  • Fig. 2 of Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19 One of skill in the art can design and prepare bispecific antibodies and bispecific antigen binding
  • the method for producing the bispecific antibody in the present invention is described in, for example, Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV: 2.13:2.13.1-2.13.16) and chemical crosslinking of the antibody or antibody fragment with a reducing disulfide or non-reducing thioether linkage.
  • a reducing disulfide or non-reducing thioether linkage For example, N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionate (SPDP) is a disulfide linked bispecific F(ab)2 heterodimer, for example, It can be used to chemically crosslink Fab fragments through hinge region SH-groups.
  • bispecific antibodies in the present invention are described, for example, in DM and Bast, BJ 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13 .1-2.13.16), comprising fusion of antibody-producing hybridomas, for example with polyethylene glycol, to generate quadroma cells capable of secreting bispecific antibodies.
  • Bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments according to the invention can also be used, for example, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), both of which are incorporated herein by reference in their entirety. ), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), or French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339), as described in For example, it can be produced recombinantly by expression from a nucleic acid construct encoding a polypeptide for an antigen binding molecule.
  • two antigen binding domains i.e., a light and heavy chain variable domain for an antigen binding domain capable of binding to PD-1, etc., and a light and heavy chain variable domain for an antigen binding domain capable of binding other target proteins.
  • a DNA construct comprising a sequence encoding a dimerization domain or a suitable linker between the antigen binding domains
  • Recombinant bispecific antibodies can then be produced by expression of the construct (eg, in vitro) in a suitable host cell (eg mammalian host cell), and the expressed recombinant bispecific antibody can then be optionally purified.
  • Antibodies can be produced by an affinity maturation process in which a modified antibody with improved affinity of the antibody for an antigen is produced compared to an unmodified parental antibody.
  • Affinity matured antibodies are described in the art, for example, Marks et al., Rio/Technology 10:779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809- 3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-159 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)).
  • the binding molecule provided by the present invention may include a variant of the amino acid sequence as long as it can specifically bind to the Lrig-1 protein.
  • changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties. Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the hydropathic index of the amino acid can be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine/cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in imparting an interactive biological function of a protein. It is a known fact that similar biological activities can be retained only by substitution with amino acids having a similar hydrophobicity index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids having a hydrophobicity index difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • the binding molecule of the present invention is interpreted to include a sequence exhibiting substantial identity with the sequence listed in the sequence listing.
  • the term "substantial identity” means that the sequence of the present invention and any other sequence are parallel to each other as much as possible, and when the parallel sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, at least 61% It means a sequence showing homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol.
  • NBCI National Center for Biological Information
  • blastp blasm
  • It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx.
  • the BLSAT is accessible at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • sequence homology comparison method using this program can be confirmed online (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html).
  • the binding molecule preferably the antibody
  • the binding molecule may be produced by a conventional method for producing an antibody, but may be produced by affinity maturation.
  • the affinity maturation refers to a process in which activated B cells produce an antibody with increased affinity for an antigen during an immune response.
  • the affinity maturation may be the same as a process occurring in nature, and an antibody or antibody fragment generated by affinity maturation may be generated based on the principle of mutation and selection.
  • the binding molecule, preferably the antibody, provided by the present invention can effectively prevent, improve or treat neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases, particularly as neurological disorders.
  • a nucleic acid molecule encoding the binding molecule provided in the present invention;
  • a host cell line transfected with the expression vector it provides a composition for preventing, improving or treating cranial nervous system diseases comprising as an active ingredient.
  • the nucleic acid molecule of the present invention includes all nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of the binding molecule provided by the present invention is translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences can be prepared by ORF (open reading frame), all of which are also included in the nucleic acid molecule of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • the "vector” is a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector which refers to circular double-stranded DNA to which additional DNA segments can be ligated.
  • a phage vector Another type of vector is a viral vector, in which additional DNA segments can be ligated to the viral genome.
  • Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they have been introduced (eg, bacterial vectors are episomal mammalian vectors with bacterial origin of replication).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors can be incorporated into the host cell's genome as it enters the host cell, thereby replicating with the host genome.
  • some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operative.
  • Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” or simply “expression vectors”.
  • expression vectors useful in recombinant DNA techniques often exist in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” may be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used form of vectors.
  • the expression vector in the present invention include commercially widely used pCDNA vector, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vector; Cosmid; Phages such as lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; It may be selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto, and all expression vectors known as expression vectors to those skilled in the art can be used in the present invention, and when selecting an expression vector, it depends on the properties of the target host cell.
  • the vector When the vector is introduced into the host cell, it may be performed by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-dextran control transfection, lipofectamine transfection or electroporation, but is not limited thereto, and those skilled in the art use
  • An introduction method suitable for an expression vector and a host cell can be selected and used.
  • the vector contains one or more selection markers, but is not limited thereto, and may be selected depending on whether or not the product is produced using a vector that does not contain a selection marker.
  • the selection of the selection marker is selected by the host cell of interest, and the present invention is not limited thereto because it uses a method already known to those skilled in the art.
  • a tag sequence may be inserted and fused onto an expression vector.
  • the tags include, but are not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag, and tags that facilitate purification known to those skilled in the art are all available in the present invention.
  • the "host cell” includes individual cells or cell cultures that may be recipients of the vector(s) for incorporation of the polypeptide insert or were recipients.
  • a host cell includes the progeny of a single host cell, which progeny may not necessarily be completely identical (morphologically or in genomic DNA complement) to the original parental cell because of natural, accidental or deliberate mutations.
  • Host cells include cells transfected in vivo with the polypeptide(s) herein.
  • the host cells may include cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin, and include bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium; Fungal cells such as yeast cells and pichia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; CHO (Chinese hamster ovary cells), SP2/0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, Bow melanoma cells, HT-1080, BHK (Baby Hamster Kidney cells), HEK (Human Embryonic Kidney cells) or PERC.6 (Human Retinal Cells) animal cells; Alternatively, it may be a plant cell, but is not limited thereto, and all cells that can be used as host cell lines known to those skilled in the art may be used.
  • bacterial cells such as Escherichia coli
  • compositions for preventing, improving or treating cranial nervous system diseases comprising an antibody-drug conjugate (ADC) containing the antibody and drug provided in the present invention as an active ingredient
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the "antibody-drug conjugate (ADC)" refers to a form in which a drug and an antibody are chemically linked without reducing the biological activity of the antibody and the drug.
  • the antibody-drug conjugate is a form in which a drug is bound to an amino acid residue at the N-terminus of the heavy and/or light chain of an antibody, specifically, a drug at the N-terminus, an ⁇ -amine group of the heavy and/or light chain of the antibody It refers to this combined form.
  • the "drug” may mean any substance having a specific biological activity in a cell, which is a concept including DNA, RNA, or peptide.
  • the drug may be a form including a reactive group capable of crosslinking by reacting with an ⁇ -amine group, and also includes a form in which a linker including a reactive group capable of crosslinking by reacting with an ⁇ -amine group is connected.
  • an example of a reactive group capable of crosslinking by reacting with the ⁇ -amine group is not particularly limited as long as it can be crosslinked by reacting with an ⁇ -amine group at the N-terminal of the heavy or light chain of an antibody. All types that react with known amine groups are included. Examples include Isothiocyanate, Isocyanates, Acyl azide, NHS ester, Sulfonyl chloride, Aldehyde, Glyoxal, Epoxide, Oxirane, Carbonate, Aryl halide, Imidoester, Carbodiimide, Anhydride, and Fluorophenyl ester), but is not limited thereto.
  • the drug may be included irrespective of its kind as long as it is a drug capable of treating a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • composition provided by the present invention may be a neurodegenerative disease or a neuro-inflammatory disease for the prevention, improvement or treatment of neurological disorders.
  • the “nerve degenerative disease” may mean a disease caused by a decrease or loss of the function of nerve cells
  • the “nerve inflammatory disease” may mean a disease caused by an excessive inflammatory reaction of the nervous system.
  • Specific examples of the neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease in the present invention include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, and Niemann-Pick disease.
  • composition provided by the present invention may be used as a pharmaceutical composition or a food composition, but is not limited thereto.
  • the “prevention” of the present invention may be included without limitation, as long as it blocks symptoms caused by neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases by using the composition of the present invention, or suppresses or delays the symptoms.
  • treatment and “improvement” of the present invention include, without limitation, any action that enables or benefits symptoms caused by neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases using the composition of the present invention. I can.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders, or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized in that for humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. have.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, coloring agents, flavoring agents, etc. for oral administration, and buffers, preservatives, painlessness, etc. for injections.
  • Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, and the like can be mixed and used, and in the case of topical administration, a base agent, excipient, lubricant, preservative, etc. can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixir, suspension, syrup, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have.
  • Others, solutions, suspensions, tablets, capsules can be formulated as sustained-release preparations.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-aggregating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents, preservatives, and the like may additionally be included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on a number of factors including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, excretion rate, drug formulation and the severity of the specific disease to be prevented or treated.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg/kg per day or It can be administered at 0.001 to 50 mg/kg.
  • the administration may be administered once or several times a day. The above dosage does not in any way limit the scope of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • the food composition comprising the composition of the present invention as an active ingredient can be prepared in the form of various foods, for example, beverages, gum, tea, vitamin complexes, powders, granules, tablets, capsules, confectionery, rice cakes, and bread. . Since the food composition of the present invention is composed of plant extracts with little toxicity and side effects, it can be safely used even when taken for a long time for prophylactic purposes.
  • the amount may be added in a proportion of 0.1 to 50% of the total weight.
  • the food composition is prepared in the form of a beverage
  • various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. may be included as in a conventional beverage. That is, as natural carbohydrates, monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, and common sugars such as sucrose and polysaccharides, dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol are included. can do.
  • flavoring agent examples include natural flavoring agents (taumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavors and natural flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners. , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonates used in carbonated beverages, and the like.
  • These components may be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not so important, but is generally selected in the range of 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the binding molecule provided by the present invention; A nucleic acid molecule encoding the binding molecule; An expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted; A host cell line transfected with the expression vector; Or it provides a method for preventing, improving, or treating cranial nervous system diseases comprising administering an antibody-drug conjugate (ADC) provided by the present invention.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the "individual” is an individual suspected of developing a cranial nervous system disease
  • the suspicious individual of the disease refers to a mammal including mice, livestock, etc., including humans who have or may develop the disease.
  • Subjects that can be treated with the effective substance provided by the present invention are included without limitation.
  • the cranial nervous system disease treated by the method of the present invention may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease, and specific examples thereof include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease. ), Niemann-Pick disease, multiple sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewis dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis , Paraneoplastic syndrome, basal cortical degeneration, multiple system atrophy, progressive nuclear paralysis, autoimmune disease of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury spinal cord injury) and tauopathy may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the method of the present invention comprises a binding molecule provided by the present invention; A nucleic acid molecule encoding the binding molecule; An expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted; A host cell line transfected with the expression vector; Or it may include administering the antibody-drug conjugate (ADC) provided by the present invention in a pharmaceutically effective amount.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • a specific therapeutically effective amount for a specific patient is a composition containing the active ingredient, the age of the patient, including the type and degree of the reaction to be achieved, whether other agents are used in some cases, Body weight, general health status, sex and diet, administration time, administration route, and secretion rate of a composition containing the active ingredient, treatment period, various factors including drugs used or concurrently used with a specific composition and well known in the field of medicine It is desirable to apply differently depending on the similarity factor.
  • the method of preventing or treating a cranial nervous system disease may be a combination therapy further comprising administering a compound or substance having therapeutic activity against one or more diseases.
  • the "combination" should be understood to represent simultaneous, individual or sequential administration.
  • the interval between administrations of the second component should be such that the beneficial effects of the combination are not lost.
  • the dosage of the antibody-drug conjugate may be about 0.0001 ⁇ g to 500 mg per 1 kg of the patient's body weight, but is not limited thereto.
  • composition for diagnosis of neurological disorders including the binding molecule provided by the present invention.
  • the "diagnosis” means to confirm the presence or characteristics of a pathological condition, and for the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm the presence or absence of a cranial nervous system disease, particularly a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • the present invention by measuring the expression level of the Lrig-1 protein using the binding molecule, it is possible to diagnose neurological disorders.
  • a diagnostic kit for cranial nervous system diseases comprising the diagnostic composition of the present invention.
  • the kit refers to a set of compositions and accessories necessary for a specific purpose.
  • the kit of the present invention can diagnose the disease by checking the expression level of the Lrig-1 protein.
  • the kit of the present invention includes a primer for measuring the expression level of a diagnostic marker of an immune-related disease, a probe, or an antibody that selectively recognizes the marker, as well as one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the assay method. I can.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the diagnostic kit of the present invention may further include one kind or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method.
  • the diagnostic kit of the present invention may further include essential elements necessary to perform a reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit contains a pair of primers specific for the gene encoding the marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp.
  • a primer specific to the nucleic acid sequence of the control gene may be included.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (various pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor DEPC. - May include DEPC-water, sterilized water, etc.
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements necessary to perform a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently labeled probe.
  • the substrate may include a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or a fragment thereof.
  • the diagnostic kit of the present invention may contain essential elements necessary for performing ELISA.
  • ELISA kits contain antibodies specific for the protein. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for a marker protein and have little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal, polyclonal, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit may contain an antibody specific for a control protein.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or antibodies capable of binding. Other materials may be included.
  • the "object of interest” refers to a cranial nervous system disease, in particular, an individual whose onset of a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease is uncertain, and refers to an individual with a high probability of onset.
  • the "biological sample” is any material, tissue, cell, whole blood, serum, plasma, tissue autopsy sample (brain, skin, lymph node, spinal cord, etc.) obtained from or derived from an individual, cell culture supernatant, rupture Eukaryotic cells and bacterial expression systems are mentioned, but they may be preferably regulatory T cells.
  • the present invention as a method for measuring or comparing the expression level of the Lrig-1 protein, protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI -TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radiation immunity analysis, radiation immunity diffusion method, octeroni immunity diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation analysis, two-dimensional electrophoresis analysis , Liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting or ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), etc. It is not limited.
  • MALDI-TOF Microx Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • the expression level of the Lrig-1 protein measured for the biological sample of the object of the present invention is increased or decreased compared to the normal control, predicting that the possibility of developing neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases is high. can do.
  • the cranial nervous system disease which is a disease to be diagnosed through the diagnostic composition, the diagnostic kit, or the information providing method, may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • Alzheimer's disease Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease, multiple sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontal head Temporal dementia, Louis dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, paraneoplastic syndrome, cortical basal degeneration, multiple system atrophy, progressive nuclear paralysis, autoimmune neurological disorder, spinocerebellar ataxia , Inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury, and tauopathy may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the binding molecules provided by the present invention can specifically prevent, improve, or treat various neurodegenerative or neuroinflammatory diseases, as well as provide a method for diagnosing them.
  • FIG 1 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 3 shows the results of predicting the epitope of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of predicting the antigenic determinant (epitope) of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the level of expression of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows the level of expression of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 shows the expression levels of Lrig-1, Lrig-2, and Lrig-3 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 10 shows the expression of Lrig-1 protein on the surface of regulatory T cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows the results of analyzing the binding ability of the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibody to the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing an experimental design for confirming the effect of treating multiple sclerosis of the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibody according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the therapeutic effect of multiple sclerosis after administration of the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibody according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 16 shows the results of analyzing the therapeutic effect of Alzheimer's after administration of the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibody according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 17 shows the results of analyzing the therapeutic effect of Alzheimer's after administration of the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibody according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention comprises as an active ingredient a binding molecule that specifically binds to Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein present in regulatory T cells (Treg cells) It relates to a composition for preventing, improving or treating diseases.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • the binding molecule is,
  • Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 13
  • Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 14
  • a heavy chain variable region comprising; a heavy chain CDR3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 15;
  • Light chain CDR1 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 16
  • Light chain CDR2 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 17
  • It may be a binding molecule comprising a light chain variable region including; light chain CDR3 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 18.
  • T cell subtypes Th0, Th1, Th2, Th17 and iTreg were prepared.
  • the iTreg refers to cells artificially induced differentiation in a medium containing the following composition, unlike naturally isolated nTregs.
  • T cells The subtype of T cells is RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) containing 10% fetal bovine serum (FBS; hyclone, logan, UT) after separating naive T cells obtained from the spleen of mice.
  • FBS fetal bovine serum
  • Table 1 Each of the components of Table 1 below was further included in the nutrient medium to induce differentiation into each cell through culture for 72 hours in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • the three-dimensional structure of the extracellular domain of the Lrig-1 protein was predicted.
  • LRR1 to LRR15 were present in the Lrig-LRR domain (amino acid sequence 41 to 494) of the extracellular domain of the Lrig-1 protein.
  • LRR domains consisted of 23 to 27 amino acids, and 3 to 5 leucines were present.
  • three immunoglobulin-like domains were present in amino acid sequences 494 to 781 of the Lrig-1 protein among the extracellular domains of the Lrig-1 protein.
  • the nucleotide sequence was predicted using the Ellipro server (http://tools.iedb.org/ellipro/), which is epitope prediction software based on the structure of the Lrig-1 protein.
  • the Ellipro search engine corresponds to a search engine known to have the highest reliability among algorithms for predicting existing antigenic determinants and uses it.
  • Example 1 After inputting the extracellular domain analyzed in Example 1 into the epitope prediction software, the predicted contiguous or discontinuous amino acid sequences of the predicted epitope are shown in FIGS. 3 and 4.
  • An antibody specific for the Lrig-1 protein according to the present invention was prepared. This antibody was not produced by specifying a specific antigenic determinant, and an antibody capable of binding to the Lrig-1 protein at any site was produced.
  • the antibody cells expressing the Lrig-1 protein were prepared. More specifically, after cutting the DNA fragment and pcDNA (hygro) corresponding to SEQ ID NO: 2 with a cleavage enzyme, incubating at 37°C for ligation, and inserting the DNA sequence of the Lrig-1 protein The prepared pcDNA was produced. The prepared pcDNA into which SEQ ID NO: 2 was inserted was introduced into L cells through transfection to allow the Lrig-1 protein to be expressed on the surface of the L cells.
  • pcDNA hygro
  • a total of eight heavy chains and light chains were selected by selecting the sequence of the light chain and heavy chain amino acids capable of binding to Lrig-1 expressed on the cell surface in the Human scFv library.
  • the selected heavy and light chain amino acid sequences were fused with the mlgG2a Fc region to prepare a monoclonal antibody.
  • the sequence of the monoclonal antibody is shown in Table 2 below.
  • Lrig-1 protein can act as a specific biomarker for regulatory T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen of mice using a magnet-activated cell sorting (MACS) through CD4 beads. Thereafter, control T (CD4 + CD25 + T) cells and non-regulated T (CD4 + CD25 - T) cells were isolated using a fluorescent active cell sorter (FACS) using a CD25 antibody.
  • FACS fluorescent active cell sorter
  • mRNA was extracted using Trizol, and then, for genomic RNA, gDNA was removed by a protocol provided by the manufacturer using a gDNA extraction kit (Qiagen). . The mRNA from which gDNA was removed was synthesized as cDNA through the BDsprint cDNA synthesis kit (Clonetech).
  • the real-time polymerase chain reaction was performed under the conditions of 40 cycles at 95°C for 3 minutes, 61°C for 15 seconds, and 72°C for 30 seconds according to the protocol provided by the manufacturer using SYBR Green (Molecular Probes). Primers were used, and the relative gene expression levels were calculated using the ⁇ CT method, and normalized using HPRT, and the results are shown in FIGS. 5 to 8.
  • Lrig-1 As shown in Fig. 5, it can be seen that the expression of Lrig-1 is 18.1 times higher in regulatory T ((CD4 + CD25 + T) cells than in non-regulated T (CD4 + CD25 - T) cells. Compared to the known regulatory T cell markers Lag3 and Ikzf4, the expression level was about 10 times higher. In addition, as shown in Figs. 6 and 7, compared to other types of immune cells, regulatory T cells, especially induction, were induced. The expression of Lrig-1 mRNA was remarkably higher in the naturally isolated regulatory T cells (nTreg) compared to the controlled T cells (iTreg).
  • Lrig-1 was highest among Lrig-1, Lrig-2, and Lrig-3 corresponding to the Lrig family.
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells, particularly naturally occurring regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein expressed from Lrig-1 mRNA was specifically expressed only in regulatory T cells.
  • a magnet-activated cell sorter (magnet-activated) from the spleen of the mouse to CD4 beads.
  • CD4 + T cells were isolated using cell sorting; MACS). Thereafter, using the RFP protein, controlled T (CD4 + RFP + T) cells and non-regulated T (CD4 + RFP - T) cells were separated and obtained through a fluorescent active cell sorter (FACS). Each of the cells was stained with the purchased Lrig-1 antibody and the negative control isotype, and the expression level of Lrig-1 was measured with a fluorescently active cell sorter, and the results are shown in FIG. 9.
  • RFP red fluorescence protein
  • the non-regulatory T cells indicated by the dotted line showed almost the same expression level of Lrig-1 as the negative control, but in the case of the regulatory T cells, there were a number of cells with high Lrig-1 expression levels. .
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells.
  • the Lrig-1 protein In order for the Lrig-1 protein to become a target for cell therapy, it must be expressed on the surface of regulatory T cells for more effective target treatment, so it was confirmed whether the Lrig-1 protein was expressed on the surface.
  • Each of the differentiated T cell subtypes of Preparation Example 1 was stained with anti-CD4-APC and anti-Lrig-1-PE antibodies, and the surface of each cell using a fluorescence-activated cell sorter (FACS). The expression level of Lrig-1 was measured, and the results are shown in FIG. 10.
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is not only specifically expressed in regulatory T cell (Treg) cells, but also more highly expressed on the surface of Treg cells.
  • each of the antibodies of Preparation Examples 1 to 8 was added to L cells stably expressing Lrig-1. After binding, a secondary antibody conjugated with eFlour 670 while being able to recognize a mouse antibody was added, and the binding force of the monoclonal antibody to the Lrig-1 protein was analyzed using FACS. Is shown in FIG. 11.
  • mice is immobile, but one forelimb is responsive to stimulation
  • a group was designed as shown in Table 4 below. Specifically, 7-month-old Alzheimer-induced 5xFAD mice were injected intravenously with GTC110-04 antibody and GTC210-01 antibody in an amount of 10 mpk, respectively, for 1 month. 8-month-old Alzheimer's mice were injected subcutaneously for 3 weeks with glatiramer acetate (GA, Copaxone®) as a positive control in an amount of 100 ug.
  • GTC110-04 antibody and GTC210-01 antibody 8-month-old Alzheimer's mice were injected subcutaneously for 3 weeks with glatiramer acetate (GA, Copaxone®) as a positive control in an amount of 100 ug.
  • the normal control group (G1) was measured as 0.51 ⁇ 0.06
  • the G2 group (vehicle) was measured as 0.42 ⁇ 0.04
  • the Alzheimer-inducing group (G2) was measured as the normal control group (G1).
  • the preference value was observed to be lower than that.
  • the antibodies according to the present invention GTC210-01 and GTC110-04 antibodies
  • the underwater maze test was conducted based on a method devised by Morris. Water (22 ⁇ 1 °C) was filled in a stainless steel pool (diameter 90 cm, height 50 cm) so that the water level was 30 cm. The hidden platform (diameter 5 cm) was positioned 1 cm below the water surface. On the first day of evaluation, three to four training sessions were conducted. The total swimming time per individual was set to 60 seconds, and individuals who found the platform within 60 seconds were allowed to stay on the platform for 10 seconds to induce memory. Objects that cannot find the platform even after 60 seconds are artificially guided to the platform to stay on the platform for 10 seconds, and the escape time at this time is set to 60 seconds.
  • a probe test was conducted on the 6th day after swimming practice, and the amount of time spent in the quadrant with the platform was calculated as a percentage of the total swimming time (Percentage of time in SW area, %) , The time taken to reach the location where the platform was (Latency to target, sec) was measured, and the results are shown in FIGS. 16 and 17.
  • the analysis was performed using SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA). The criteria to be excluded from the interpretation of the results were set as individuals who turn only a specific area without searching through swimming.
  • the time spent in the quadrant with the platform was calculated as a percentage of the total swimming time (Percentage of time in SW area, %) was significantly increased, and the time taken to reach the location where the platform was (Latency to target, sec) was significantly reduced to a level similar to that of the normal control group.
  • the antibody according to the present invention has an effect of preventing, improving or treating cranial and nervous system diseases.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating diseases of the cranial nerve system.
  • LDLNRNRIRL IEGLTFQGLN
  • SLEVLKLQRN NISKLTDGAF WGLSKMHVLH LEYNSLVEVN 240
  • RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 240
  • VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK 120
  • TLVTVSSAST TAPSVYPLAP VCGDTTGSSV TLGCLVKGYF PEPVTLTWNS GSLSSGVHTF 180

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자를 이용하여 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중, 치매, 알츠하이머병 등의 퇴행성 뇌신경질환에서 기억력, 주의력, 인지능력, 감정조절 등의 저하가 관찰되며 이는 신경세포의 사멸 및 신경 분지의 위축에 의한 결과이다. 신경세포의 신경분지의 신장은 신경가소성을 증대함으로써 신경회로의 기억, 학습 기능에 중요한 역할을 하고 있다. 이에 신경세포의 신경분지 신장과 신경 재생을 촉진하는 유효성분은 퇴행성 뇌신경 질환의 새로운 치료제로 개발 가능성이 있다고 예측된다.
노령화 인구가 급증함에 따라 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병 추세도 증가추세에 있으며 의학의 혁신적인 발전에도 불구하고 아직 퇴행성 뇌신경계 질환에 대한 예방법과 치료법이 분명치 않고 결정적인 효과를 가진 약제를 발견하지 못하고 있는 실정이다. 현재 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제와 치료법이 개발되고 있지만 장기 복용에 따른 부작용 및 독성을 나타내는 경우가 많고, 치료보다는 증상을 경감시키는 효과만 있기 때문에 부작용 및 독성을 감소하고 치료할 수 있는 소재의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 목적은 뇌신경계 질환으로, 특히 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 다양한 용도의 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg cells)에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 유효 성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 "결합 분자"는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로믈린, 예를 들면 인플루엔자 A 바이러스의 단량체 HA 또는 삼량체 HA와의 결합을 위해 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. "항원-결합 단편"은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 "Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질" 은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 1091개의 아미노산으로 이루어진 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역 체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 이들간의 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재 시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 인간 또는 쥐에 존재하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Lrig-1 단백질은 인간 유래인 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드이거나, 마우스 유래인 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 Lrig-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질은 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
(a) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역; 및
(c) 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
(1) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
(2) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서, 상기 결합 분자는,
서열번호 11 또는 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 12 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
서열번호 19로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Fc 영역(Fragment crystallization region) 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역이거나, 그로부터 유래된 것일 수 있고, 혹은 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역일 수 있다.
본 발명에서 상기 Fc 영역은 포유동물 유래 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역일 수 있고, 바람직하게는 인간 유래 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 21로 표시되는 마우스 유래 IgG2a 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 22로 표시되는 마우스 유래 면역글로불린 카파(kappa) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 23 또는 24로 표시되는 인간 유래 IgG1 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 25로 표시되는 인간 유래 면역글로불린 카파(kappa) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 26으로 표시되는 인간 유래 IgG2 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 27로 표시되는 인간 유래 IgG3 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 불변 영역은 서열번호 28로 표시되는 인간 유래 IgG4 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 인간 유래 면역글로불린 람다(lambda) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "하이브리드 Fc"는 인간 IgG 서브클래스의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유도될 수 있다. 상기 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자, 폴리펩티드 등에 결합하는 경우, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 높이는 효과가 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 하이브리드 Fc 영역은 서열번호 29로 표시되는 하이브리드 Fc 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 결합 분자에서 상기 Fc 또는 불변 영역은 상기 가변 영역에 링커(linker)로 연결될 수 있다. 이때 상기 Fc 또는 불변 영역의 C-말단에 링커가 연결되며, 상기 링커에 본 발명의 결합 분자의 N-말단이 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "링커(linker)"는 목적하는 질환의 조직 또는 세포 내에서 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같이 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 경우에는 Fc 또는 불변 영역으로 인하여 폴리펩티드의 활성이 저하되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다. 본 발명에서는 링커의 바람직한 예로, 혈액 내에 가장 많이 존재하는 인간 알부민의 282번 내지 314번째 부분에 위치한 33개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 292번 내지 304번째 부분에 위치한 13개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커일 수 있으며, 이러한 부분은 3차원적인 구조상 대부분 외부에 노출된 부분으로서 체내에서 면역반응을 유도할 가능성이 최소화된 부분이다. 단, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 결합 분자는, 서열번호 21, 23, 24, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는, 서열번호 22 또는 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 23, 24, 26, 27 또는 28로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 30으로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 31로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;
서열번호 32로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자; 및
서열번호 34로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 35로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 항체인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 전장 항체 (full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로서 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합할 수 있는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항체의 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. 또한, Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(Variable fragment)는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 다이설파이드 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 상기 항체 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody) 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있고, 그 외의 다른 단백질에도 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편으로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 일 예시로, 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 결합 분자인 항원 결합 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함한다. 여기서, 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 Lrig-1 단백질 이외의 다른 단백질로, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, PD-1 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 임의의 적합한 포맷, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197)에 기재된 포맷으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(예: IgG2, F(ab')2 또는 CovX-바디), 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 또는 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 Tandemab common LC), 비대칭성 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍 또는 SEED-바디), 소형 이중특이적 항체 분자(예: 디아바디(Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv (taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디, 트리플 헤드, Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예: taFv-Fc, 디-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예: scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 특히, 문헌(참조: Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19)의 도 2를 참조한다. 당업자는 본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편을 설계하고 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하는 방법은, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16)에 기재된 바와 같이 환원성 디설파이드 또는 비환원성 티오에테르 결합과 항체 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 디설파이드 연결된 이중특이적 F(ab)2 헤테로다이머를 생성하기 위해, 예를 들면, 힌지 영역 SH- 그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하기 위한 다른 방법은, 예를 들면, 문헌(참조: D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16)에 기재된 바와 같이, 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마 세포를 생성하기 위해 항체-생산 하이브리도마를, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시킴을 포함한다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 또한, 예를 들면, 둘 다 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), 또는 French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339)에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 항원 결합 분자를 위한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로부터 발현에 의해 재조합으로 생산될 수 있다.
예를 들면, 2개의 항원 결합 도메인(즉, PD-1 등에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 이중특이적 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포) 중에서 작제물의 발현(예: 시험관내)에 의해 생산될 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 임의로 정제될 수 있다.
항체는, 비변형된 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙 공정에 의해 생성될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야, 예를 들면, 문헌(참조: Marks et al., Rio/Technology 10:779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-159 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992))에 공지된 절차로 생산될 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 결합 분자는, Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 수행할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York (1979)). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Gln/Glu 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 결합 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서 용어 "실질적인 동일성"이란, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 병렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 병렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio.48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 온라인(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html)을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자, 바람직하게 상기 항체는, 항체를 생산하는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있지만, 친화도 성숙(Affinity maturation)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "친화도 성숙(Affinity maturation)"은, 활성화된 B 세포가 면역 반응 과정에서 항원에 대한 친화도가 증가된 항체를 생산하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 친화도 성숙은 자연에서 일어나는 과정과 동일하게, 돌연변이와 선택의 원리에 기초하여 친화도 성숙으로 인해 생성된 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 결합 분자, 바람직하게 항체는 뇌신경계 질환으로 특히, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주;를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 결합 분자의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명에서 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명에서 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약물은 뇌신경계 질환으로, 특히 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 치료할 수 있는 약물이라면 그 종류에 관계없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하기 위한 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명에서 상기 “신경 퇴행성 질환”은 신경 세포들의 기능 감소 또는 소실에 의해 발생되는 질환을 의미할 수 있고, 상기 “신경 염증성 질환”으로는 신경계의 과도한 염증 반응에 의하여 발생되는 질환을 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 구체적인 예시로는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 “예방”은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환에 의해 기인된 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 “치료” 및 “개선”은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환에 의해 기인된 증상이 호전될 수 있도록 하거나, 이롭게 될 수 있도록 하는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 투여가 필요한 개체에게, 본 발명에서 제공하는 결합 분자; 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주; 또는 본 발명에서 제공하는 항체-약물 결합체(ADC)를 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 "개체"는 뇌신경계 질환의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 질환 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명에서 제공하는 유효 물질로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법을 통해 치료되는 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있고, 그 구체적인 예시로는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 방법은 본 발명에서 제공하는 결합 분자; 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주; 또는 본 발명에서 제공하는 항체-약물 결합체(ADC)를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 상기 유효성분을 포함하는 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 상기 유효성분을 포함하는 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 결합 분자; 또는 항체-약물 결합체의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 결합 분자를 포함하는, 뇌신경계 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 뇌신경계 질환, 특히는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 발병 유무를 확인하는 것이다.
본 발명에서는 상기 결합 분자를 이용하여 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경계 질환의 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 "키트"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 상기 질환을 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 면역 관련 질환의 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 결합 분자를 이용하여 목적하는 개체의 생물학적 시료에 존재하는 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하여 뇌신경계 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 뇌신경계 질환으로, 특히는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 발병 여부가 불확실한 개체로, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 조절 T 세포일 수 있다.
본 발명에 상기 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 Lrig-1 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가 또는 감소된 경우, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 진단용 조성물, 진단 키트 또는 상기 정보 제공 방법을 통해 진단의 대상이 되는 질환인 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있고, 그 구체적인 예시로는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 결합 분자는 다양한 신경 퇴행성 또는 신경 염증성 질환 등의 뇌신경계 질환을 특이적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 진단하기 위한 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 다발성 경화증 치료 효과를 확인하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 투여 후 다발성 경화증의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 투여 후 알츠하이머의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 투여 후 알츠하이머의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 투여 후 알츠하이머의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체의 투여 후 알츠하이머의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은, 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg cells)에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 유효 성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
여기서, 상기 결합 분자는,
서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFβ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(http://www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 항원 결정기(epitope) 아미노산 서열 예측
상기 염기서열의 예측은 Lrig-1 단백질의 구조를 기반으로 하는 항원 결정기 예측 소프트웨어(epitope prediction software)인 Ellipro 서버(http://tools.iedb.org/ellipro/)를 이용하였다. 상기 Ellipro 검색 엔진은 현존하는 항원 결정기를 예측하는 알고리즘 중에서 가장 신뢰도가 높다고 알려진 검색엔진에 해당하여 이를 이용하였다.
항원 결정기 예측 소프트웨어에 상기 실시예 1에서 분석된 세포외 도메인을 입력한 뒤, 예측된 항원 결정기의 예측된 연속 또는 불연속 아미노산 서열을 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3 및 4에서 보는 바와 같이, 연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 총 22개가 예측되었고, 불연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 총 8개가 예측되었다.
[제조예 1 내지 8] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Lright chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하여, 총 8개의 중쇄 및 경쇄를 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 mlgG2a Fc 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일 클론 항체의 서열은 하기 표 2와 같다.
구분 클론 위치 아미노산 서열 서열정보
제조예 1 GTC210-01clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKGLEWVSLIYPDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGLSWAGAFDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- 서열번호 30
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- 서열번호 31
제조예 2 GTC210-02clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISPGDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLYSNPNEPFDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- -
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLNGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- -
제조예 3 GTC210-03clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISPDGSNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVGLRCRYEACSYAYGMDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- -
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDSSLNGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- -
제조예 4 GTC210-04clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISPSSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLDAFWRPSFDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- -
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNNVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- -
제조예 5 GTC110-01clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQVPGKGLEWVSWISHGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGLCKTGLCYYYDAMDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- -
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNSVTWYQQLPGTAPKLLIYADNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- -
제조예 6 GTC110-02clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHWTTFDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- -
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYANSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- -
제조예 7 GTC110-03clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDILPCPWGRCYYDYAMDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- -
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSDSSSNIGSNTVSWYQQLPGTAPKLLIYADNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- -
제조예 8 GTC110-04clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISHGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVISNCHLGVCYYSNGMDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK- 서열번호 32
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC- 서열번호 33
제조예 9 GTC110-04인간화 항체 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISHGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVISNCHLGVCYYSNGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKY 서열번호 34
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 서열번호 35
[실시예 3] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T)세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T)세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 ΔCT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다.
프라이머 서열
쥐 Lrig-1 Forward 5' - GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT - 3'
Reverse 5' - CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG - 3'
쥐 Lrig-2 forward 5' - TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA- 3'
reverse 5' - GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA- 3'
쥐 Lrig-3 forward 5' - CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC - 3'
reverse 5' - CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG - 3'
쥐 FOXP3 forward 5' - CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC - 3'
reverse 5' - ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC - 3'
ACTG1 forward 5' - GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG - 3'
reverse 5' - ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA - 3'
도 5에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T)세포에 비하여 조절 T((CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.또한, 도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 8에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T)세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T)를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비-조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 5] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 Treg 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합능 평가
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1을 잘 인식하는 지를 확인하기 위하여, Lrig-1을 안정하게 발현하는 L 세포에 상기 제조예 1 내지 8의 항체 각각을 결합시킨 뒤 마우스 항체를 인식할 수 있으면서 eFlour 670이 컨쥬게이션(conjugation)된 2차 항체(secondary antibody)를 넣은 후 FACS를 이용하여 상기 단일클론항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC110-04 및 GTC210-01) 모두 L 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질을 효과적으로 인식하여 결합한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 본 발명에 따른 항체의 다발성 경화증 치료능 평가
1. 다발성 경화증 마우스 모델의 제작
다발성 경화증 마우스 모델을 제작하기 위하여 도 12에 나타낸 실험 설계도에 따라 실험을 수행하였다. 0 일째에 7 주령 C57BL/6 마우스에 MOG 펩타이드를 피하 주사하고, 결핵균 독소를 복강 내에 주사하였다. 2 일째에 마우스의 면역 시스템을 증강하기 위하여 결핵균 독소를 한번 더 주사하였다. 9 일째에 마우스에 제조예 1에서 제작된 GTC210-01 항체를 투여하였고, 양성 대조군으로는 항-IL-17a 항체를 투여하였다.
2. 다발성 경화증 치료 효과 평가
7 일째부터 아래의 평가 기준에 따라 임상적 점수를 계산하여 마우스의 다발성 경화증 치료 효과를 평가하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
<평가 기준>
0점: 아무 증상이 없으며 정상적으로 움직임
1점: 꼬리의 끝부분 일부가 마비되어 아래로 쳐져 있음
2점: 꼬리의 전체가 마비되어 꼬리 전체가 쳐져 있음
3점: 뒷다리 한쪽이 일부 마비되었으나 자극에 반응을 할 수 있음
4점: 뒷다리 한쪽이 완전히 마비되어 자극에 반응하지 않으며 다리를 끌고 다님
5점: 뒷다리가 모두 마비되어 앞다리로 몸을 끌고 다님
6점: 앞다리로 몸을 끄는 것이 힘들어지지만 아직 앞다리는 자극에 반응이 있음
7점: 마우스가 움직이지 못하지만 한쪽 앞다리는 자극에 반응이 있음
8점: 마우스가 움직이지 못하며 양쪽 앞다리 모두 자극에 반응이 없음
9점: 마우스가 움직이지 못하며 호흡이 불규칙함
10점: 마우스가 죽음
그 결과, 다발성 경화증 유도 모델에 본 발명에 따른 항체를 투여한 경우 다발성 경화증이 현저히 치료되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 22 일 및 23 일째에는 정상 마우스와 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] 본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능 평가
본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능을 평가하기 위하여, 하기 표 4와 같이 군을 설계하였다. 구체적으로, 7 개월된 알츠하이머 유도 5xFAD 마우스에 GTC110-04 항체와 GTC210-01 항체를 각각 10 mpk의 양으로 1 개월 동안 정맥에 주사하였다. 8 개월된 알츠하이머 마우스에 양성 대조군으로 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate, GA, Copaxone®)을 100 ug의 양으로 3 주 동안 피하 주사하였다.
그룹 n/그룹 투여 경로 용량
G1 WT 대조군 14 - -
G2 5xFAD 대조군 13 - -
G3 GTC110-04 항체 11 IV 10mpk
G4 GTC210-01 항체 11 IV 10mpk
G5 GA(양성 대조군) 11 SC 100ug
1. Y자 미로 시험(Y-maze test)
Y자 미로 시험은 40 cm의 길이(벽의 높이 15cm)의 동일한 3개의 암(arm)을 120도의 각도로 배치하여 만든 미로틀을 이용하였다. 이 실험은 설치류의 본능적인 탐색 습성을 이용한 행동 실험이며, 새로운 영역을 탐색할 가능성이 높은 것에 착안한 방법이었다. 바로 전에 탐색한 암(arm)을 기억하여 동일한 암(arm)에 들어가지 않을 수록 높은 기억력의 수치를 나타내었다. 개체당 8분의 탐색 시간을 제공하며, 최종 결과는 도 14에 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값으로 표현하였다. 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값은 다음과 같은 식 1로 계산하였다. 여기서 행동 패턴의 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
[식 1]
Spontaneous alternation (%) = The number of triplet / (total arm entry-2)
그 결과, 실험동물이 주변의 단서를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 본 실험에 있어서, 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명에 따른 항체(GTC210-01 및 GTC110-04 항체)를 투여한 경우 정상 대조군과 유사한 수준으로 자발적 교대 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
2. 신규 물체 인식 시험(Novel Object Recognition)
신규 물체 인식 시험은 40 cm x 40 cm의 아크릴 케이지에 상이한 2개의 물체를 이용하여 기억력을 평가하였다. 아크릴 케이지 내를 익숙하게 한 후, 2개의 물체를 일정한 위치에 위치하여 자유롭게 인지하게 한 후, 각 물체를 탐색한 시간을 측정하였다. 24 시간의 지연 시간을 개체별로 주고 다시 동일한 위치에 한 가지 물체만 다른 물체로 변경하였다. 이 때 변경한 물체를 신규 물체로 인식하여 탐색 시간이 길수록 기억력이 좋은 것으로 판단할 수 있다. 24 시간 전의 물체를 기억하지 못한다면 신규 물체와 기존 물체를 구분하지 못하고 양쪽 물체 모두 균일하게 탐색할 가능성이 있다. 총 10분간 자유롭게 탐색하도록 하며, 결과는 선호도 수치(preference index = Novel object exploring time/total exploring time)로 도 15에 나타내었다. 이때 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
그 결과, 새로운 물체에 대한 선호도 수치(Preference Index)에서 정상 대조군(G1)은 0.51 ± 0.06, G2군(vehicle)은 0.42 ± 0.04 로 측정되었고, 알츠하이머 유도 군(G2)은 정상 대조군(G1)에 비해 선호도 수치가 낮게 관찰되었다. 그런데 본 발명에 따른 항체(GTC210-01 및 GTC110-04 항체)를 투여한 경우 정상 대조군 이상으로 선호도 수치가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
3. 수중 미로 시험(Water maze test)
수중 미로 시험은 Morris에 의해 고안된 방법을 기초로 하여 실시하였다. 스테인레스 풀(pool)(직경 90cm, 높이 50 cm)에 물(22 ± 1 ℃)을 채워 수면 높이를 30 cm가 되도록 하였다. 숨겨진 플랫폼(platform)(직경 5cm)은 수면 아래 1 cm 지점에 위치하도록 하였다. 평가 첫 날 3 번 ~ 4 번의 훈련을 실시하였다. 한 개체 당 전체 수영 시간은 60 초로 설정하였으며, 60 초 이내에 플랫폼을 찾은 개체는 10 초간 플랫폼 위에서 머무르도록 하여 기억을 유도하였다. 60 초가 지나도 플랫폼을 찾지 못하는 개체는 인위적으로 플랫폼으로 안내하여 플랫폼 위에서 10 초간 머무르도록 하며 이때의 탈출 시간은 60 초로 하였다. 수영 연습을 시킨 후 6 일차에 프로브 테스트(probe test)를 실시하여 공간지각능력으로, 플랫폼이 있던 사 분면 내 머물렀던 시간을 전체 수영 시간 중 비율로 계산한 값(Percentage of time in SW area, %), 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(Latency to target, sec)을 측정하고, 그 결과는 도 16 및 17에 나타내었다. 이때 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다. 결과 해석에서 제외시키는 기준은 수영을 통한 탐색을 하지 않고 특정 부위만 선회하는 개체로 설정하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 항체(GTC210-01 및 GTC110-04 항체)를 투여한 경우 플랫폼이 있던 사 분면 내 머물렀던 시간을 전체 수영 시간 중 비율로 계산한 값값(Percentage of time in SW area, %)이 현저히 증가하였고, 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(Latency to target, sec)은 정상 대조군과 유사한 수준으로 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이러한 실험들을 통하여 본 발명에 따른 항체는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
서열번호 1:
GPRAPCAAAC TCAGDSLDCG GRGLAALPGD LPSWTRSLNL SYNKLSEIDP AGFEDLPNLQ 60
EVYLNNNELT AVPSLGAASS HVVSLFLQHN KIRSVEGSQL KAYLSLEVLD LSLNNITEVR 120
NTCFPHGPPI KELNLAGNRI GTLELGAFDG LSRSLLTLRL SKNRITQLPV RAFKLPRLTQ 180
LDLNRNRIRL IEGLTFQGLN SLEVLKLQRN NISKLTDGAF WGLSKMHVLH LEYNSLVEVN 240
SGSLYGLTAL HQLHLSNNSI ARIHRKGWSF CQKLHELVLS FNNLTRLDEE SLAELSSLSV 300
LRLSHNSISH IAEGAFKGLR SLRVLDLDHN EISGTIEDTS GAFSGLDSLS KLTLFGNKIK 360
SVAKRAFSGL EGLEHLNLGG NAIRSVQFDA FVKMKNLKEL HISSDSFLCD CQLKWLPPWL 420
IGRMLQAFVT ATCAHPESLK GQSIFSVPPE SFVCDDFLKP QIITQPETTM AMVGKDIRFT 480
CSAASSSSSP MTFAWKKDNE VLTNADMENF VHVHAQDGEV MEYTTILHLR QVTFGHEGRY 540
QCVITNHFGS TYSHKARLTV NVLPSFTKTP HDITIRTTTV ARLECAATGH PNPQIAWQKD 600
GGTDFPAARE RRMHVMPDDD VFFITDVKID DAGVYSCTAQ NSAGSISANA TLTVLETPSL 660
VVPLEDRVVS VGETVALQCK ATGNPPPRIT WFKGDRPLSL TERHHLTPDN QLLVVQNVVA 720
EDAGRYTCEM SNTLGTERAH SQLSVLPAAG CRKDGTTVG
서열번호 2:
ggcccgcggg cgccctgcgc ggccgcctgc acttgcgctg gggactcgct ggactgcggt 60
gggcgcgggc tggctgcgtt gcccggggac ctgccctcct ggacgcggag cctaaacctg 120
agttacaaca aactctctga gattgaccct gctggttttg aggacttgcc gaacctacag 180
gaagtgtacc tcaataataa tgagttgaca gcggtaccat ccctgggcgc tgcttcatca 240
catgtcgtct ctctctttct gcagcacaac aagattcgca gcgtggaggg gagccagctg 300
aaggcctacc tttccttaga agtgttagat ctgagtttga acaacatcac ggaagtgcgg 360
aacacctgct ttccacacgg accgcctata aaggagctca acctggcagg caatcggatt 420
ggcaccctgg agttgggagc atttgatggt ctgtcacggt cgctgctaac tcttcgcctg 480
agcaaaaaca ggatcaccca gcttcctgta agagcattca agctacccag gctgacacaa 540
ctggacctca atcggaacag gattcggctg atagagggcc tcaccttcca ggggctcaac 600
agcttggagg tgctgaagct tcagcgaaac aacatcagca aactgacaga tggggccttc 660
tggggactgt ccaagatgca tgtgctgcac ctggagtaca acagcctggt agaagtgaac 720
agcggctcgc tctacggcct cacggccctg catcagctcc acctcagcaa caattccatc 780
gctcgcattc accgcaaggg ctggagcttc tgccagaagc tgcatgagtt ggtcctgtcc 840
ttcaacaacc tgacacggct ggacgaggag agcctggccg agctgagcag cctgagtgtc 900
ctgcgtctca gccacaattc catcagccac attgcggagg gtgccttcaa gggactcagg 960
agcctgcgag tcttggatct ggaccataac gagatttcgg gcacaataga ggacacgagc 1020
ggcgccttct cagggctcga cagcctcagc aagctgactc tgtttggaaa caagatcaag 1080
tctgtggcta agagagcatt ctcggggctg gaaggcctgg agcacctgaa ccttggaggg 1140
aatgcgatca gatctgtcca gtttgatgcc tttgtgaaga tgaagaatct taaagagctc 1200
catatcagca gcgacagctt cctgtgtgac tgccagctga agtggctgcc cccgtggcta 1260
attggcagga tgctgcaggc ctttgtgaca gccacctgtg cccacccaga atcactgaag 1320
ggtcagagca ttttctctgt gccaccagag agtttcgtgt gcgatgactt cctgaagcca 1380
cagatcatca cccagccaga aaccaccatg gctatggtgg gcaaggacat ccggtttaca 1440
tgctcagcag ccagcagcag cagctccccc atgacctttg cctggaagaa agacaatgaa 1500
gtcctgacca atgcagacat ggagaacttt gtccacgtcc acgcgcagga cggggaagtg 1560
atggagtaca ccaccatcct gcacctccgt caggtcactt tcgggcacga gggccgctac 1620
caatgtgtca tcaccaacca ctttggctcc acctattcac ataaggccag gctcaccgtg 1680
aatgtgttgc catcattcac caaaacgccc cacgacataa ccatccggac caccaccgtg 1740
gcccgcctcg aatgtgctgc cacaggtcac ccaaaccctc agattgcctg gcagaaggat 1800
ggaggcacgg atttccccgc tgcccgtgag cgacgcatgc atgtcatgcc ggatgacgac 1860
gtgtttttca tcactgatgt gaaaatagat gacgcagggg tttacagctg tactgctcag 1920
aactcagccg gttctatttc agctaatgcc accctgactg tcctagagac cccatccttg 1980
gtggtcccct tggaagaccg tgtggtatct gtgggagaaa cagtggccct ccaatgcaaa 2040
gccacgggga accctccgcc ccgcatcacc tggttcaagg gggaccgccc gctgagcctc 2100
actgagcggc accacctgac ccctgacaac cagctcctgg tggttcagaa cgtggtggca 2160
gaggatgcgg gccgatatac ctgtgagatg tccaacaccc tgggcacgga gcgagctcac 2220
agccagctga gcgtcctgcc cgcagcaggc tgcaggaagg atgggaccac ggtaggcatc 2280
ttcaccattg ctgtcgtgag cagcatcgtc ctgacgtcac tggtctgggt gtgcatcatc 2340
taccagacca ggaagaagag tgaagagtac agtgtcacca acacagatga aaccgtc
서열번호 3:
QAGPRAPCAA ACTCAGDSLD CSGRGLATLP RDLPSWTRSL NLSYNRLSEI DSAAFEDLTN 60
LQEVYLNSNE LTAIPSLGAA SIGVVSLFLQ HNKILSVDGS QLKSYLSLEV LDLSSNNITE 120
IRSSCFPNGL RIRELNLASN RISILESGAF DGLSRSLLTL RLSKNRITQL PVKAFKLPRL 180
TQLDLNRNRI RLIEGLTFQG LDSLEVLRLQ RNNISRLTDG AFWGLSKMHV LHLEYNSLVE 240
VNSGSLYGLT ALHQLHLSNN SISRIQRDGW SFCQKLHELI LSFNNLTRLD EESLAELSSL 300
SILRLSHNAI SHIAEGAFKG LKSLRVLDLD HNEISGTIED TSGAFTGLDN LSKLTLFGNK 360
IKSVAKRAFS GLESLEHLNL GENAIRSVQF DAFAKMKNLK ELYISSESFL CDCQLKWLPP 420
WLMGRMLQAF VTATCAHPES LKGQSIFSVL PDSFVCDDFP KPQIITQPET TMAVVGKDIR 480
FTCSAASSSS SPMTFAWKKD NEVLANADME NFAHVRAQDG EVMEYTTILH LRHVTFGHEG 540
RYQCIITNHF GSTYSHKARL TVNVLPSFTK IPHDIAIRTG TTARLECAAT GHPNPQIAWQ 600
KDGGTDFPAA RERRMHVMPD DDVFFITDVK IDDMGVYSCT AQNSAGSVSA NATLTVLETP 660
SLAVPLEDRV VTVGETVAFQ CKATGSPTPR ITWLKGGRPL SLTERHHFTP GNQLLVVQNV 720
MIDDAGRYTC EMSNPLGTER AHSQLSILPT PGCRKDGTTV G
서열번호 4:
caggctggcc cgcgggcccc ctgcgcggcc gcctgcactt gcgccgggga ctcgctggac 60
tgcagtgggc gcgggctggc gacgctgccc cgggacctgc cctcctggac gcgcagccta 120
aacctgagtt ataacagact ctccgagatc gactctgctg cttttgagga cttgacgaat 180
ctgcaggaag tgtacctcaa cagcaatgag ctgacagcca taccatcact gggcgctgct 240
tccataggag ttgtctctct ctttttgcag cacaacaaga tccttagtgt ggatgggagc 300
cagctgaagt cgtacctgtc cttggaagtg ctggatctga gttccaacaa catcacggaa 360
attcggagct cctgtttccc gaacggcctg cgtataaggg aactcaactt ggcgagcaac 420
cgcatcagca tcctggagtc tggagcattt gatggtctgt cgcggtcact gctgactctc 480
cgtctgagca aaaacaggat cacccagctt cctgtgaaag cgttcaagct acccaggctg 540
acacaactag acctgaatcg gaatcggatt cggctgattg aaggcctcac gttccagggg 600
ctcgacagct tagaggtgct gaggcttcag aggaacaaca tcagcaggct gacggacggg 660
gccttctggg ggctgtctaa gatgcacgtg ctgcacctgg agtacaacag tctggtggaa 720
gtgaacagtg gctccctcta tggcctcaca gccctgcacc agctgcacct cagcaacaac 780
tccatctctc gaattcagcg tgatggctgg agcttctgcc aaaagctgca tgagttgatt 840
ctgtccttca acaacctcac gcggctggat gaggagagtc tagcggagtt gagcagcctc 900
agtatcctgc gcctcagtca caacgccatc agtcacattg ctgaaggcgc cttcaaggga 960
ctcaagagtc tgcgggtctt ggacctggac cataacgaga tctcgggtac aatcgaggat 1020
accagtggtg cctttacggg gcttgacaac ctcagcaagc tgactctgtt tggaaacaag 1080
atcaaatctg tggctaagag agccttctcg ggcctggaaa gcctggaaca cctgaacctt 1140
ggagagaatg caatcaggtc tgtccagttt gatgcctttg caaagatgaa gaaccttaaa 1200
gagctctaca tcagcagtga gagcttcctg tgtgactgcc agctcaagtg gctgccccca 1260
tggctaatgg gtaggatgct gcaggccttt gtgacagcca cctgtgccca tccagagtcg 1320
ctgaagggcc agagcatttt ctcagtgctg ccagacagct ttgtgtgtga tgactttcca 1380
aagccacaga tcatcaccca gcctgagacg accatggctg tggtgggcaa ggacatccgt 1440
ttcacatgct ccgcagccag cagcagcagc tcaccaatga ccttcgcctg gaagaaggac 1500
aatgaggtcc tggccaatgc agacatggag aactttgccc acgtccgtgc acaggacggc 1560
gaagtgatgg agtataccac tatcctgcac ctccgtcacg tcacctttgg gcacgagggc 1620
cgctaccagt gtatcatcac aaaccacttt ggctccacat actcccacaa agccaggctc 1680
actgtgaatg tgttgccatc attcactaaa ataccccatg acattgccat ccggactggc 1740
accacagccc gcctcgagtg tgctgccacg ggccacccta accctcagat tgcctggcag 1800
aaggatggag gcaccgattt cccggcagct cgtgagcgac gcatgcatgt tatgccagac 1860
gatgatgtgt tcttcatcac tgatgtgaaa atagacgaca tgggggtcta cagctgcact 1920
gcccagaact cggcaggctc ggtttcagcc aacgctaccc tcacagtctt agaaactcca 1980
tccttggcag tgcctctgga agaccgtgtg gtaactgtgg gagaaacagt ggccttccag 2040
tgcaaagcaa ccgggagccc cacaccacgc atcacctggc ttaagggagg tcgcccattg 2100
agcctcacag agcgccacca tttcactcca ggcaaccagc tgctggttgt tcagaatgtg 2160
atgatagacg atgcagggcg gtatacctgt gagatgtcta atcccctggg cactgagcga 2220
gcacatagcc agctgagcat tttacctacc cctggctgcc ggaaggatgg gaccaccgta 2280
ggc
서열번호 5:
GFTFSGYD
서열번호 6:
LIYPDSGNK
서열번호 7:
ARDAGLSWAG AFDY
서열번호 8:
SSNIGSNY
서열번호 9:
SDS
서열번호 10:
GSWDYSLSAY V
서열번호 11:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYDMSWVRQA PGKGLEWVSL IYPDSGNKYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDA GLSWAGAFDY WGQGTLVTVS 120
S
서열번호 12:
QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNYVTWYQQL PGTAPKLLIY SDSHRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLQ SEDEADYYCG SWDYSLSAYV FGGGTKLTVL
서열번호 13:
GFTFSNYA
서열번호 14:
VISHGGGST
서열번호 15:
ARVISNCHLG VCYYSNGMDV
서열번호 16:
SSNIGNND
서열번호 17:
SDS
서열번호 18:
GTWDYSLSGY V
서열번호 19:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSV ISHGGGSTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVI SNCHLGVCYY SNGMDVWGQG 120
TLVTVSS
서열번호 20:
QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG NNDVYWYQQL PGTAPKLLIY SDSQRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLSGYV FGGGTKLTVL
서열번호 21:
TTAPSVYPLA PVCGDTTGSS VTLGCLVKGY FPEPVTLTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY 60
TLSSSVTVTS STWPSQSITC NVAHPASSTK VDKKIEPRGP TIKPCPPCKC PAPNLLGGPS 120
VFIFPPKIKD VLMISLSPIV TCVVVDVSED DPDVQISWFV NNVEVHTAQT QTHREDYNST 180
LRVVSALPIQ HQDWMSGKEF KCKVNNKDLP APIERTISKP KGSVRAPQVY VLPPPEEEMT 240
KKQVTLTCMV TDFMPEDIYV EWTNNGKTEL NYKNTEPVLD SDGSYFMYSK LRVEKKNWVE 300
RNSYSCSVVH EGLHNHHTTK SFSRTPGK
서열번호 22:
RTVAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD 60
SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC
서열번호 23:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 60
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 180
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 240
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
서열번호 24:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 60
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 180
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 240
MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 300
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
서열번호 25:
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD 60
SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
서열번호 26:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 60
GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF 120
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR 180
VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN 240
QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN 300
VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
서열번호 27:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 60
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRVEL KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC 120
DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT 180
LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH 240
QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK 300
GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 360
ALHNRFTQKS LSLSPGK
서열번호 28:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 60
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP APEFLGGPSV 120
FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 180
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 240
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 300
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
서열번호 29:
RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV 60
VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK 120
VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 180
SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS 240
LSLGK
서열번호 30:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYDMSWVRQA PGKGLEWVSL IYPDSGNKYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDA GLSWAGAFDY WGQGTLVTVS 120
SASTTAPSVY PLAPVCGDTT GSSVTLGCLV KGYFPEPVTL TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS 180
DLYTLSSSVT VTSSTWPSQS ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGPTIKPCPP CKCPAPNLLG 240
GPSVFIFPPK IKDVLMISLS PIVTCVVVDV SEDDPDVQIS WFVNNVEVHT AQTQTHREDY 300
NSTLRVVSAL PIQHQDWMSG KEFKCKVNNK DLPAPIERTI SKPKGSVRAP QVYVLPPPEE 360
EMTKKQVTLT CMVTDFMPED IYVEWTNNGK TELNYKNTEP VLDSDGSYFM YSKLRVEKKN 420
WVERNSYSCS VVHEGLHNHH TTKSFSRTPG K
서열번호 31:
QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNYVTWYQQL PGTAPKLLIY SDSHRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLQ SEDEADYYCG SWDYSLSAYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC
서열번호 32:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSV ISHGGGSTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVI SNCHLGVCYY SNGMDVWGQG 120
TLVTVSSAST TAPSVYPLAP VCGDTTGSSV TLGCLVKGYF PEPVTLTWNS GSLSSGVHTF 180
PAVLQSDLYT LSSSVTVTSS TWPSQSITCN VAHPASSTKV DKKIEPRGPT IKPCPPCKCP 240
APNLLGGPSV FIFPPKIKDV LMISLSPIVT CVVVDVSEDD PDVQISWFVN NVEVHTAQTQ 300
THREDYNSTL RVVSALPIQH QDWMSGKEFK CKVNNKDLPA PIERTISKPK GSVRAPQVYV 360
LPPPEEEMTK KQVTLTCMVT DFMPEDIYVE WTNNGKTELN YKNTEPVLDS DGSYFMYSKL 420
RVEKKNWVER NSYSCSVVHE GLHNHHTTKS FSRTPGK
서열번호 33:
QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG NNDVYWYQQL PGTAPKLLIY SDSQRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLSGYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC
서열번호 34:
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSV ISHGGGSTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVI SNCHLGVCYY SNGMDVWGQG 120
TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF 180
PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP 240
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK 300
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT 360
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL 420
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKY
서열번호 35:
QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG NNDVYWYQQL PGTAPKLLIY SDSQRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLSGYV FGGGTKLTVL RTVAAPSVFI 120
FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 180
TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

Claims (26)

  1. 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg cells)에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 유효 성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    (a) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역; 및
    (c) 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    (d) 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    (1) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
    (2) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 11 또는 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 12 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
    서열번호 19로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 Fc 영역 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함하는, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역, 또는 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역인, 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 21, 23, 24, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 22 또는 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
    서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 23, 24, 26, 27 또는 28로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
    서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 30으로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 31로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;
    서열번호 32로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자; 및
    서열번호 34로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 35로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그 단편인, 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  21. 서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 유효 성분으로 포함하는, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 포함하는, 뇌신경계 질환의 진단용 조성물.
  24. 제23항의 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경계 질환의 진단 키트.
  25. 서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 이용하여 목적하는 개체의 생물학적 시료에 존재하는 Lrig-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 뇌신경계 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  26. 투여가 필요한 개체에게,
    서열번호 5 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7 또는 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 17로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10 또는 18로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법.
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