WO2020197319A1 - 면역세포의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents

면역세포의 제조방법 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2020197319A1
WO2020197319A1 PCT/KR2020/004198 KR2020004198W WO2020197319A1 WO 2020197319 A1 WO2020197319 A1 WO 2020197319A1 KR 2020004198 W KR2020004198 W KR 2020004198W WO 2020197319 A1 WO2020197319 A1 WO 2020197319A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cancer
inkt
cell
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2020/004198
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조이숙
김한섭
김재윤
설빛나
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB filed Critical Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority to JP2021557872A priority Critical patent/JP7429713B2/ja
Priority to EP20777770.7A priority patent/EP3950935A4/en
Priority to CN202080038913.6A priority patent/CN113874492B/zh
Priority to US17/598,917 priority patent/US12435117B2/en
Publication of WO2020197319A1 publication Critical patent/WO2020197319A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/15—Natural-killer [NK] cells; Natural-killer T [NKT] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4203—Receptors for growth factors
    • A61K40/4205—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K40/4255—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/28—Expressing multiple CARs, TCRs or antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention directly reprograms isolated human somatic cells to produce iNKT cells into which CAR genes encoding induced Natural Killer T cells (iNKT) and chimeric antigen receptors (CARs) are introduced It relates to a method, iNKT cells prepared by the above method, a cell therapy composition comprising the iNKT cells, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • iNKT induced Natural Killer T cells
  • CARs chimeric antigen receptors
  • Natural Killer T (NKT) cells present in various tissues and organs such as bone marrow, lymph glands, liver, spleen, blood, etc. have the characteristics of T lymphocytes and Natural Killer (NK) cells.
  • T lymphocytes As a type of T cell, it is known to express both T-cell receptor and surface antigen of T cells such as NK1.1 or NK cells.
  • Typical T cells recognize antigens presented by Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I/MHC Class II, but NKT cells are glycolipids presented by CD1d (MHC-like Molecule) ( ⁇ -GalCer; alpha- Galactosylceramide). Therefore, NKT, which has cytotoxicity such as T cells and NK cells, does not induce Graft-versus-host Disease (GVHD), although it is a type of T cell, so it is not only self-derived but also allogeneic-derived cell therapy. It is recognized as a useful cell resource for development.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • ⁇ -GalCer alpha- Galactosylceramide
  • Activated NKT cells are IFN (Interferon), IL (Interleukin)-4, GM-CSF (Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor), IL-2, IL-13, IL-17, IL-21, TNF (Tumor Necrosis).
  • IFN Interferon
  • IL Interleukin
  • GM-CSF Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor
  • IL-2 IL-13
  • IL-17 IL-21
  • TNF Tumor Necrosis
  • TNF Tumor Necrosis
  • Factor secreting various types of cytokines and chemokines to regulate the immune function of NKT cells and various immune cells (NK cells, T cells, B cells, macrophages, etc.) It is known to perform an intermediary function of acquired immunity.
  • NKT cells present in the human body can be obtained through a primary culture method that is produced by simple separation and amplification, but fundamentally, NKT cells are very small (about 0.1-0.01% in leukocytes of peripheral blood). ) It is known to exist in a limited manner, and problems such as heterogeneity of cell types between batches according to cell sources, complexity and variability of the production process, etc. have been pointed out. As an alternative, efforts are being made to secure stem cells with differentiation ability into NKT cells, but low production efficiency, relatively large amount of time and cost, and complexity of the production process are pointed out as problems to be overcome. . Therefore, in order to promote the use of NKT cells with excellent potential as an immune cell therapy agent, it is first necessary to secure new NKT cell resources or develop a production method.
  • CAR cancer cell targeting chimeric antigen receptor
  • NKT cells with engineered expression of chimeric antigen receptor (CAR) unlike T cells that exhibit anticancer enhancing effects dependent on CAR-specific mechanisms of action, induce maturation of dendritic cells, NK and By inducing CD8 + T cell activation cytokine secretion, high anticancer effects can be exhibited directly or indirectly.
  • CAR-NKT chimeric antigen receptor
  • NKT and CAR-NKT cells can be produced from human somatic cells, and it was confirmed that the produced NKT cells exhibit excellent cancer cell killing ability and thus can be applied to cancer prevention or treatment, and the present invention was completed.
  • It is an object of the present invention to I) reprogramming factor (Reprogramming Factor) or II) reprogramming factor (Reprogramming Factor) and CAR (Chimeric Antigen Receptor) genes are introduced isolated cells a) growth factor, cytokine and GSK3 ⁇ (Glycogen) Synthase Kinase 3 beta) a first medium containing an inhibitor (Inhibitor); And b) (1) growth factor, cytokine and AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor) agonist (Agonist), or (2) growth factor, cytokine, and a second medium containing anti-CD3 antibody; sequentially cultured in NKT It is to provide a method for producing iNKT (induced Natural Killer T) cells, comprising the step of reprogramming directly into cells.
  • iNKT induced Natural Killer T
  • Another object of the present invention is to provide iNKT cells prepared according to the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapy composition for preventing or treating cancer, comprising as an active ingredient iNKT cells prepared according to the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising as an active ingredient iNKT cells prepared according to the above method.
  • Another object of the present invention is a) a first container containing a first medium containing a growth factor, a cytokine and a GSK3 ⁇ inhibitor; And b) (1) a growth factor, a cytokine and an AHR agonist, or (2) a growth factor, a cytokine, and a second container containing a second medium containing an anti-CD3 antibody; direct li for iNKT cell production comprising It is to provide a programming badge kit.
  • the method according to the present invention simplifies the production process and shortens the production time by producing iNKT cells or iNKT cells into which the CAR gene has been introduced from cells isolated through direct reprogramming, thereby reducing cost, and excellent NKT cell production efficiency. And, as it is produced without passing through the induced pluripotent stem cells, safety is secured, and there is an excellent NKT cell production effect that is differentiated from the conventional reprogramming technology.
  • iNKT cells prepared by the above method or iNKT cells into which the CAR gene has been introduced have excellent cancer cell killing ability, and thus can be usefully used as a cell therapy composition or pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for preparing iNKT by (A) direct reprogramming of somatic cells, (B) results of confirming iNKT cells prepared from PBMC cells.
  • FIG. 8 is a diagram showing the constituent domains of four types of CAR genes.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of a method for producing CAR-iNKT by direct somatic cell reprogramming and CAR gene introduction.
  • the present invention provides an isolated cell into which I) a reprogramming factor or II) a reprogramming factor and a CAR (Chimeric Antigen Receptor) gene are introduced.
  • iNKT induced Natural Killer T
  • NKT Natural killer T cells
  • TCR T Cell Receptor
  • type I NKT cells are also called constant NKT cells, which use an invariant TCR chain with a limited TCR ⁇ -chain repertoire
  • type II NKT cells have various TCRs. It expresses a wide range of chain combinations.
  • NKT cells are known to be able to immediately attack and remove target cells such as infected cells or tumor cells, and are recognized as major target cells in the development of immune cell therapy products along with T and NK cells.
  • NKT cells have anti-cancer effects that directly or indirectly kill various cancer cells, they are useful resources for overcoming the limitations of existing anti-cancer therapies such as therapeutics targeting cancer diseases and inhibitors of recurrence.
  • a technology for producing NKT cells through simple separation and amplification from peripheral blood or differentiation-inducing culture from stem cells is being developed, but problems such as low productivity and time and cost are still emerging, and new NKT cells There is a high need for resource development.
  • NKT cells or CAR-NKT cells
  • CARs chimeric antigen receptors
  • the present inventors attempted to prepare NKT cells under in vitro culture conditions, and as a result, for the first time, a method of directly inducing and producing NKT cells through direct reprogramming was identified.
  • iNKT induced natural killer T cells
  • NKT Natural killer T
  • CAR-iNKT induced natural killer T cells
  • NKT Natural killer T
  • the term "reprogramming" refers to a method of converting a lineage into a target cell having completely different characteristics by controlling a global gene expression pattern of a specific cell.
  • Reprogramming may include, but is not limited to, dedifferentiation of cells, direct reprogramming or direct conversion, or trans-differentiation.
  • the reprogramming may be performed by introducing a vector containing a foreign gene or DNA into a cell.
  • the “conversion” means that the cell is changed to a different state
  • the “differentiation” means a phenomenon in which daughter cells made by dividing the cell acquire a function different from the original parent cell, and in the present invention, the “conversion” and “Differentiation” can be used interchangeably with “induction”.
  • the term "direct reprogramming” refers to a method of inducing direct conversion to a desired cell by culturing a specific cell in a reprogramming medium.
  • NKT cells which are target cells using conventional reprogramming techniques
  • 3) NKT cells, which are target cells had to be differentiated and produced from differentiated stem (progenitor) cells.
  • the conventional technology has a disadvantage in that production efficiency is low and time and cost are large because it has to go through a complicated culture process sequentially.
  • the present invention is differentiated from the prior art by directly producing NKT cells, which are target cells, from somatic cells isolated through direct reprogramming, so that production time is short, cost is reduced, efficiency is excellent, and safety is ensured, It can provide an alternative to overcome this problem.
  • the direct reprogramming may be used interchangeably with direct dedifferentiation, direct differentiation, direct conversion, direct cross-differentiation, and cross-differentiation, and in the present invention, the direct reprogramming is direct dedifferentiation or crossing from isolated somatic cells to NKT cells. It may mean differentiation, but is not limited thereto.
  • the term "differentiated cell” refers to a cell whose structure or function is specialized, ie, a cell, a tissue, etc. of an organism that has been changed into a form and function suitable for performing a role given to each.
  • ectoderm, mesoderm, and endoderm cells derived from pluripotent stem cells such as embryonic stem cells are differentiated cells, and narrowly, red blood cells, white blood cells, platelets, etc. derived from hematopoietic stem cells may be differentiated cells. .
  • the term "lineage-transformed cell” refers to a cell that has been converted into a cell type having other lineage characteristics by changing the inherent phylogenetic characteristics of the cell through embryological or artificial methods (eg, reprogramming, etc.) As, it has the characteristics of a cell type completely different from that of the cell type before conversion.
  • the cell in which the lineage is converted may be a target cell.
  • non-NKT lymphocyte cells in peripheral blood mononuclear cells may be converted to NKT cells in a reprogramming medium, but is not limited thereto.
  • the method comprises I) a reprogramming factor or II) a reprogramming factor and the isolated cells into which the CAR (Chimeric Antigen Receptor) genes are introduced into the first medium of a); And b) of (1) a second medium containing an AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor) agonist (Agonist), or (2) a second medium containing an anti-CD3 antibody; sequentially cultured in and reprogrammed directly into NKT cells It may be to let you do.
  • AHR Aryl Hydrocarbon Receptor
  • isolated cell of the present invention is not particularly limited, but specifically, may be a cell whose lineage has already been specified, such as a reproductive cell, a somatic cell, or a progenitor cell.
  • the "somatic cell” refers to all cells that have completed differentiation that constitutes animals and plants excluding germ cells, and the "progenitor cell” expresses a differentiation trait when it is found that the cell corresponding to the progeny expresses a specific differentiation trait. It does not, but refers to a parent cell that has its differentiation fate. For example, for neurons (neurons), neuroblasts (neuron stem cells) correspond to progenitor cells, and for myotube cells, myoblasts correspond to progenitor cells.
  • the isolated cells may be cells derived from humans, but are not limited thereto, and cells derived from various individuals may also fall within the scope of the present invention.
  • the isolated cells of the present invention may include both in vivo or ex vivo cells.
  • the isolated cells may be somatic cells, and more specifically, somatic cells excluding NKT cells, but are not limited thereto.
  • reprogramming factor refers to a gene (or polynucleotide) that can be introduced into a cell to induce reprogramming, or a protein encoded therefrom.
  • the reprogramming factor may vary depending on the target cell to be obtained through reprogramming and the type of cell before reprogramming.
  • the reprogramming factors introduced into the isolated somatic cells are Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct4, Oct3, Sox2, Klf4, Myc, and these It may include any one or more selected from the group consisting of a combination of, and specifically, Oct4, Sox2, Klf4, and Myc, but is not limited thereto, and a reprogramming factor capable of inducing the isolated somatic cells to NKT cells All factors known in the art may be included.
  • Reprogramming using the reprogramming factor controls the entire gene expression pattern of the cell to induce conversion to the target cell.By introducing the reprogramming factor into the cell and culturing the cell for a certain period of time, Cells can be reprogrammed with target cells having a gene expression pattern.
  • the term "introduction of a reprogramming factor” refers to a method of administering a reprogramming factor to a culture medium of a cell; A method of directly injecting reprogramming factors into cells; A method of increasing the expression level of a reprogramming factor present in a cell; A method of transforming a cell with an expression vector containing a gene encoding a reprogramming factor; A method of modifying a gene sequence such that expression of a gene encoding a reprogramming factor is increased; A method of introducing a foreign-expressed gene encoding a reprogramming factor, a method of treating a substance having an effect of inducing expression of a reprogramming factor; And a method of increasing the expression level of the reprogramming factor in cells through a combination thereof, but is not limited thereto as long as the expression level of the reprogramming factor can be increased.
  • the introduction of the reprogramming factor may be to induce the expression of the reprogramming factor under a desired time and condition.
  • the method of introducing the reprogramming factor into a cell may be a method of administering a reprogramming factor to a culture medium of a cell, or a method of transforming an expression vector containing a gene encoding a reprogramming factor into a cell. Not limited.
  • the method of directly injecting the reprogramming factor into cells may be used by selecting any method known in the art, but is not limited thereto, but is not limited to, but is not limited to, microinjection, electroporation, and particle injection ( Particle bombardment), Direct Muscle Injection, Insulator, and Transposon can be appropriately selected and applied.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a suitable control sequence and a base sequence of the protein or polypeptide of interest so that the protein or polypeptide of interest can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter, an operator, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an enhancer.
  • the vector of the present invention includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion, and can be variously prepared according to the purpose.
  • the promoter of the vector can be constitutive or inducible.
  • the vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable vector, the origin of replication. The vector can be transformed into a suitable host cell, then replicated or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in host cells, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include viral vectors, episomal vectors, plasmid vectors, and cosmid vectors in a natural or recombinant state.
  • the viral vectors include Sendai Virus, Lentivirus, Human Immunodeficiency Virus (HIV), Murineleukemia Virus (MLV), Avian Sarcoma/Leukosis (ASLV), Spleen Necrosis Virus (SNV), and RSV ( Rous Sarcoma Virus), MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus), etc., Retrovirus, Adenovirus, Adeno-associated Virus, Herpes Simplex Virus, etc. It may include, and more specifically, may be an RNA-based viral vector, but is not limited thereto.
  • the episomal vector is a non-viral, non-insertable vector, and is known to have a characteristic capable of expressing a gene included in the vector without being inserted into a chromosome. Accordingly, the cell containing the episomal vector may include all cases in which the episomal vector is inserted into the genome or is present in the cell without being inserted into the genome.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest to perform a general function.
  • the operative linkage with a recombinant vector can be prepared using gene recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage use enzymes generally known in the art.
  • the term "culture” means growing cells under controlled environmental conditions, and the culturing process of the present invention may be performed according to a medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the selected cells.
  • the composition of the first medium or the second medium for culturing the cells into which the reprogramming factors have been introduced is Compositions suitable for conversion into cells, for example, growth factors, cytokines, GSK3 ⁇ inhibitors, AHR agonists or anti-CD3 antibodies, and the like may be included, but are not limited thereto.
  • the first medium of a) may be one containing a growth factor, a cytokine, and a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the term "growth factor” refers to a polypeptide that promotes division, growth and differentiation of several cells.
  • the growth factors are, for example, EGF (Epidermal Growth Factor), PDGF-AA (Platelet-derived Growth Factor-AA), IGF-1 (Insulin-like Growth Factor 1), TGF- ⁇ (Transforming Growth Factor- ⁇ ) , FGF (Fibroblast Growth Factors), SCF (Stem Cell Factor), and FLT3 (FMS-like Tyrosine Kinase), and the like, and specifically, it may be any one or more selected from the group consisting of SCF, FLT3, and combinations thereof. Not limited.
  • cytokine is a relatively small sized variety of proteins produced in cells and used for cell signal transduction, and may affect other cells, including itself. It is generally known to be associated with an immune response to inflammation or infection.
  • the cytokine is, for example, IL (Interleukin)-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), activin A (Acivin A), Notch Ligand, G-CSF (Granulocyte-colony Stimulating Factor), SDF-1 (Stromal Cell-derived Factor-1), etc., specifically IL-3, IL-6, IL -2, IL-7, IL-15, and may be any one or more selected from the group consisting of a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the growth factors and cytokines are included in a medium for direct reprogramming of isolated cells to target cells, and the types of growth factors and cytokines are not particularly limited as long as they can be directly used for reprogramming. .
  • GSK3 ⁇ (Glycogen Synthase Kinase 3 beta, Glycogen Synthase Kinase-3 ⁇ ) inhibitor (Inhibitor) refers to a substance that inhibits or inhibits the activity of glycogen synthase kinase 3 beta.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor is, for example, 1-Azakenpaullone, 2-D08, 3F8, 5-Bromoindole, 6-Bio, A 1070722, Aloisine A, AR-A014418, Alsterpaullone, AZD-1080, AZD2858, Bikinin, BIO, BIO- acetoxime, Bisindolylmaleimide I, Bisindolylmaleimide I Hydrochloride, CAS 556813-39-9, Cazpaullone, CHIR98014, CHIR98023, CHIR99021(CT99021), CP21R7, Dibromocantherelline, GSK-3 ⁇ Inhibitor I, VI, VII, X, XI,XV, GSK-3 Inhibitor IX, XVI, Hymenidin, Hymenialdisine, HMK-32, I3M (Indirubin-3-monoxime, Indirubin, Indole-3-acetamide, IM-12, Kenpaull
  • the first medium of a) may include SCF, FLT3, IL-3, IL-6, and CHIR99021, but is not limited thereto.
  • the first medium of a) may further contain one or more selected from the group consisting of Fetal Bovine Serum (FBS), antibiotics, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the antibiotic may be penicillin/streptomycin, but is not limited thereto.
  • the first medium of a) may be one containing FBS, penicillin/streptomycin, SCF, FLT3, IL-3, IL-6 and CHIR99021, but is not limited thereto.
  • the first medium of a) is 8 to 12% of FBS, 0.1 to 2% of penicillin/streptomycin, 50 to 200 ng/ml of human SCF, 50 to 200 ng/ml of human FLT3, 10 To 30 ng/ml human IL-3, 10 to 30 ng/ml human IL-6, 2 to 8 uM of CHIR99021 may be StemSpan SFEM II, more specifically 10% FBS, 1% StemSpan containing penicillin/streptomycin, 100 ng/ml of human SCF, 100 ng/ml of human FLT3, 20 ng/ml of human IL-3, 20 ng/ml of human IL-6, 5 uM of CHIR99021 It may be SFEM II, but is not limited thereto.
  • the second medium of b) may contain (1) a growth factor, a cytokine, and an AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor) agonist, or (2) a growth factor, a cytokine, and an anti-CD3 antibody.
  • AHR Aryl Hydrocarbon Receptor
  • growth factor and "cytokine” are as described above.
  • AHR Aryl Hydrocarbon Receptor
  • TCDD Dioxin (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)
  • TCDD Dioxin (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)
  • the AHR agonist is, for example, TCDD (2,8-dihydroxyquinoline, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin), FICZ (6-Formylindolo[3,2-b]carbazole), biocanin A And the like, and specifically, it may be any one or more selected from the group consisting of FICZ, biokanin A, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • anti-CD3 antibody is a protein that specifically reacts to CD3 antigen, a group of molecules that bind to T Cell Receptor (TCR) to form an antigen recognition complex, and CD3 molecules are compared with TCR. Therefore, it has a long intracellular region and is known to transmit antigen recognition signals into cells.
  • the anti-CD3 antibody may be, for example, OKT-3, UCHT1, HIT3a, and the like, and specifically, may be any one or more selected from the group consisting of OKT3, UCHT1, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the second medium of b) (1) in the case of a second medium containing an AHR agonist may contain SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, FICZ and biokanin A, Or (2) in the case of a second medium containing an anti-CD3 antibody, it may include, but is not limited to, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, OKT3, and UCHT1.
  • the second medium of b) may further contain at least one selected from the group consisting of FBS, antibiotics, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the antibiotic may be penicillin/streptomycin, but is not limited thereto.
  • the second medium of b) is (1) a second medium containing an AHR agonist, FBS, penicillin/streptomycin, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, FICZ and Biokanin A may be included, or (2) in the case of a second medium containing an anti-CD3 antibody, FBS, penicillin / streptomycin, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, It may include OKT3 and UCHT1, but is not limited thereto.
  • the second medium containing an AHR agonist is 8 to 12% of FBS, 0.1 to 2% of penicillin/streptomycin, and 10 to 30 ng/ml of human SCF, 10 to 30 ng/ml of human FLT3, 100 to 500 IU/ml of human IL-2, 10 to 30 ng/ml of human IL-7, 10 to 30 ng/ml of human IL-15, 1 to It may be StemSpan SFEM II containing 3 uM of FICZ and 10 to 30 ⁇ g/ml of biocanin A, and more specifically, 10% of FBS, 1% of penicillin/streptomycin, 20 ng/ml of human SCF , 20 ng/ml of human FLT3, 200 IU/ml of human IL-2, 20 ng/ml of human IL-7, 20 ng/ml of human IL-15, 2 uM of FICZ and a ratio of 20 ⁇ g/ml Stem
  • the second medium containing the anti-CD3 antibody is 8 to 12% FBS, 0.1 to 2% penicillin/streptomycin, 10 to 30 ng/ml human SCF, 10-30 ng/ml human FLT3, 100-500 IU/ml human IL-2, 10-30 ng/ml human IL-7, 10-30 ng/ml human IL-15, 5-15 ng
  • It may be StemSpan SFEM II comprising /ml OKT3 and 5-15 ng/ml UCHT1, more specifically 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 20 ng/ml human SCF, 20 ng /ml of human FLT3, 200 IU/ml of human IL-2, 20 ng/ml of human IL-7, 20 ng/ml of human IL-15, 10 ng/ml of OKT3 and 10 ng/ml of UCHT1.
  • StemSpan SFEM II may be included, but is not limited thereto.
  • the isolated cells into which the reprogramming factor has been introduced may be cultured in the first medium of a) for 4 to 8 days, and then cultured in the second medium of b) for 12 days or longer. Not limited.
  • a Sendai virus expressing a reprogramming factor is used to transform a reprogramming factor into a CD3+CD8- cell group, a T cell subtype constituting peripheral blood mononuclear cells or peripheral blood mononuclear cells.
  • iNKT second medium containing AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor) agonist (Agonist) or iNKT second containing anti-CD3 antibody As a result of induction into NKT cells by culturing in a medium for 12 to 35 days, it was confirmed that 62% of peripheral blood mononuclear cells and 94.1% of the CD3+CD8-cell group were induced into iNKT cells (Fig. 1B, Fig. 2).
  • the production efficiency of iNKT cells is 3.7 to 4.7 times or more superior to the case where the AHR agonist is contained in the second iNKT medium or the case where the anti-CD3 antibody is not contained (Fig. 4). This confirmed that the AHR agonist or anti-CD3 antibody plays an important role in the method for preparing NKT through direct reprogramming.
  • CAR gene includes a gene encoding an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain including an antibody domain (scFv), and refers to the extracellular domain, transmembrane domain, and intracellular domain. It means a gene encoding a chimeric antigen receptor (Chimeric Antigen Receptor).
  • the CAR gene of the present invention is a CD19-CAR1 gene or CD19-CAR2 gene including CD19 scFv, MSLN-CAR gene including MSLN (mesothelin) scFv, and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) scFv It may be any one or more selected from the group consisting of the HER2-CAR gene including, but is not limited thereto.
  • CAR targeting factors for solid tumors include EGFRvIII (Morgan RA, Hum Gene Ther. 2012; 23:1043-1053), MUC-1 (Wilkie S, J Immunol. 2008; 180:4901-4909), MAGE (Willemsen).
  • RA Gene Ther. 2001;8:1601-1608
  • CEA Emtage PC, Clin Cancer Res. 2008; 14:8112-8122
  • PSMA PSMA, GD2, CA125, Her2 and MSLN, FAP, VEGFR (Kakarla S, Cancer J. 2014;20:151-155), etc. are known to be available.
  • CD19 is a cluster of differentiation (CD), which is assigned the number 19 to identify cell surface molecules according to immunophenotypes, and CD19 refers to a marker of B lymphocytes. It is known that CD19 is expressed in most B-cell malignant tumor cancer cells and provides an ideal target for these carcinomas.
  • the CAR gene includes i) a CD8 leader, CD19 scFv, CD8 hinge, a CD8 transmembrane domain, and a CAR gene (CD19-CAR1 gene) including an Fc- ⁇ (Gamma) receptor; ii) CAR gene (CD19-CAR2 gene) including CD8 leader, CD19 scFv, CD8 hinge, CD8 transmembrane domain, CD28 intracellular domain, CD3 ⁇ and Internal Ribosome Entry Site (IRS); iii) CAR gene (MSLN-CAR gene) including CD8 leader, MSLN (Mesothelin) scFv, CD8 hinge, CD8 transmembrane domain, CD28 intracellular domain, CD3 ⁇ and IRES; And iV) CD8 leader, HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv, CD8 hinge, CD8 transmembrane domain, CD28 intracellular domain, CD3 ⁇ and CAR gene
  • the CD8 leader is SEQ ID NO: 1, CD19 scFv is SEQ ID NO: 2, MSLN scFv is SEQ ID NO: 3, HER2 scFv is SEQ ID NO: 4, CD8 hinge is SEQ ID NO: 5, CD8 transmembrane domain is SEQ ID NO: 6, Fc- ⁇ receptor SEQ ID NO: 7, CD28 intracellular domain is SEQ ID NO: 8, CD3 ⁇ is SEQ ID NO: 9, the IRES inserted to clone the CAR gene into the vector constituting the double cistron may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10. , Is not limited thereto.
  • the CAR gene may additionally include a GFP (Green Fluorescent Protein), but is not limited thereto.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the GFP may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 11 can be identified in NCBI Genbank, a known database.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 11 is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% with SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 11 , Or it may include a base sequence having 99% or more homology (Homology) or identity (Identity).
  • a nucleotide sequence that has such homology or identity and exhibits a function corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 11 a sequence having a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added is also a It is obvious to be included within the scope.
  • homology and Identity of the present invention mean the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related and may be expressed as a percentage.
  • homology and identity can often be used interchangeably.
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and the default gap penalty established by the program used can be used together.
  • Substantially, homologous or Identical sequences are generally at least about 50%, 60%, 70%, 80% of the sequence total or full-length in medium or high stringent conditions. Or it can hybridize to 90% or more. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotide.
  • homology or identity to the polypeptide or polynucleotide sequence can be determined, for example, by the algorithm BLAST by literature [see Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)], or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63, 1990). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the CAR gene may be introduced into the cell in the same manner as the above-described method of introducing the reprogramming factor, and in particular, the reprogramming factor and the CAR gene may be introduced simultaneously or sequentially under a desired time and condition. .
  • the CAR gene may be introduced into the isolated cells at any one point selected from the time of the introduction of the reprogramming factor, the culture in the first medium of a) or the culture in the second medium of b). , Is not limited thereto.
  • the lentivirus expressing CAR is cultivated in the first medium of iNKT first medium (a) after introduction of the reprogramming factor at the same time (Day 0) or
  • PBMCs in the process of converting to iNKT cells or cells in the process of inducing lipograms may be transformed.
  • the method according to the present invention is significant in that it is possible to produce NKT cells expressing CAR by introducing a CAR gene into an isolated cell other than an NKT cell with a reprogramming factor.
  • the timing of introducing the CAR gene can be determined as desired by a person skilled in the art during the reprogramming culture process.
  • the CAR gene is NKT inducing the CAR gene by further culturing for 4 to 28 days after addition when the virus vector expressing it is added to any one or more of the first medium culturing step or the second medium culturing step. It may be transformed into cells, but is not limited thereto.
  • Sendai virus containing a gene encoding a reprogramming factor is cultured with peripheral blood mononuclear cells for 1 day, and transformed.
  • the cells were cultured in iNKT 1 medium for 5-6 days and then cultured in iNKT 2 medium containing anti-CD3 antibody or iNKT 2 medium containing AHR agonist for 12-35 days (FIG. 9).
  • a lentivirus expressing the CD19-CAR1 gene, CD19-CAR2 gene, MSLN-CAR gene, or HER2-CAR gene is transformed into the reprogramming factor at the same time or after the introduction of the reprogramming factor to produce CAR-iNKT cells. (Fig. 9).
  • CD19-CAR-iNKT cells at an efficiency of 20.3% (Fig. 10)
  • MSLN-CAR-iNKT cells at an efficiency of 28.8% ( 11)
  • HER2-CAR-iNKT cells were prepared with an efficiency of 33.1% (FIG. 12).
  • the iNKT cells prepared according to the method of the present invention may express any one or more selected from the group consisting of CD56+, CD3+, and combinations thereof, but are not limited thereto.
  • CD56+ and CD3+ are indicators on the surface of NKT cells, and in the present invention, expression of CD56+, CD3+ and combinations thereof was analyzed through flow cytometry to confirm that NKT cells were prepared ( 1B, 2, 4, 10 to 12).
  • iNKT cells prepared according to the method of the present invention may be excellent in killing ability against various cancer cells.
  • the frequency (%) of CD107a + cells having cancer cell lysis ability in cancer cells co-cultured with iNKT cells is increased (FIG. 5), and hematologic cancer cell line, colon cancer cell line, prostate cancer cell line, liver cancer cell line ,
  • iNKT cells against lung cancer cell lines and pancreatic cancer cell lines
  • FIG. 6 the tumor size was significantly reduced on the 14th day after iNKT cell injection into the mouse model in which pancreatic cancer occurred compared to the control group not injected with iNKT cells.
  • iNKT cells into which the CD19-CAR2 gene, MSLN-CAR gene, or HER2-CAR gene were introduced exhibit higher cancer cell killing ability than iNKT cells to which the CAR gene was not introduced ( 13-15).
  • Another aspect of the present invention provides iNKT cells prepared according to the above method.
  • the iNKT cells may be excellent in killing ability against various cancer cells.
  • Another aspect of the present invention provides a cell therapy composition for preventing or treating cancer comprising iNKT cells prepared according to the above method as an active ingredient.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the occurrence of cancer by administration of the composition.
  • treatment refers to any action in which symptoms caused by cancer are improved or beneficially changed by the administration of the composition.
  • cell therapy refers to a drug used for treatment, diagnosis, and prevention (US FDA regulations) with cells and tissues manufactured through isolation, culture, and special manipulation from an individual. It refers to a drug used for treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating and screening live autologous, allogeneic, or heterogeneous cells in vitro to restore or altering the biological properties of cells by other methods.
  • the cell therapy composition may have cancer prevention or treatment efficacy by including iNKT cells prepared according to the method of the present invention.
  • the cell therapy composition may contain the iNKT cells at 1.0x10 4 to 1.0x10 10 cells/ml, preferably 1.0x10 5 to 1.0x10 9 cells/ml based on the total weight of the composition, but is not limited thereto. .
  • the cell therapy composition may be formulated and administered in a unit dosage form suitable for administration in the body of a patient according to a conventional method in the field of pharmacy, and the formulation includes an effective dose by one or several administrations. do.
  • Formulations suitable for this purpose include injections such as ampoules for injection, infusions such as infusion bags, and sprays such as aerosol formulations as parenteral formulations.
  • the ampoule for injection may be mixed with an injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, Ringer's solution, and the like may be used as the injection solution.
  • the injection bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene, and Baxter, Becton Dickinson, Medcep, National Hospital Products, or Terumo The company's infusion bag can be illustrated.
  • one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers for example, preservatives, painless agents, solubilizers or stabilizers in the case of injections, and in the case of topical administration formulations It may further include a base, an excipient, a lubricant or a preservative.
  • the cell therapy composition or pharmaceutical preparation thereof of the present invention thus prepared may be administered with other cells used for cancer treatment or in the form of a mixture with such cells using an administration method commonly used in the art.
  • an administration method commonly used in the art.
  • the administration may be non-surgical administration using a catheter and surgical administration methods such as injection or transplantation after incision in the diseased area.
  • implantation by intravascular injection is also possible.
  • the cell therapy composition may be administered in a dose of 0.0001 to 1000 mg/kg per day, specifically 0.001 to 100 mg/kg, and the administration may be administered once or several times a day.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in the light of various related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the weight, age, and sex of the patient. It is not intended to limit the scope of the present invention to any aspect.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, comprising as an active ingredient iNKT cells prepared according to the above method.
  • the cancer may be a cancer showing a result of prevention or treatment by an immune response of iNKT cells.
  • the cancer is, for example, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, bone marrow cancer, myeloma, myelodysplasia, lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, hematologic cancer, melanoma, chordoma, angiosarcoma.
  • Endothelial sarcoma lymphangiosarcoma, lymphangioendothelial sarcoma, synovial tumor, mesothelioma, Ewing sarcoma, gastric cancer, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic biliary cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, liver cancer Breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, prostate cancer, lymphoma, proleukemia, leukemia, acute leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia (BALL), T-cell acute lymphocytic leukemia (TALL), small lymphocytic leukemia (SLL), Acute lymphocytic leukemia (ALL); Chronic leukemia, chronic myelogenous leukemia (CML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), squamous cell carcinoma,
  • the cancer may be a cancer that shows the result of prevention or treatment by an immune response of CAR-iNKT cells, for example, a cancer associated with the expression of any one or more of CD19, MSLN or HER2, for example, myelodysplasia, Myelodysplastic syndrome.
  • Proleukemia hematologic cancer, acute leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia (BALL), T-cell acute lymphocytic leukemia (TALL), small lymphocytic leukemia (SLL), acute lymphocytic leukemia (ALL); Chronic leukemia, chronic myelogenous leukemia (CML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), non-Hodgkin's lymphoma, lymphoma, myeloma, pancreatic cancer, biliary tract cancer, lung cancer, ovarian cancer, breast cancer, uterine cancer, rectal cancer, colon cancer, colon cancer, bone marrow cancer , Liver cancer, brain cancer, prostate cancer, gastric cancer, glioma, melanoma, squamous cell carcinoma, head and neck cancer, renal cell carcinoma, glioblastoma, medulloblastoma, sarcoma, and any one or more selected from the group consisting of a combination
  • the pharmaceutical composition may be effective in preventing or treating cancer by including iNKT cells prepared according to the method of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the iNKT cells at 1.0x10 4 to 1.0x10 10 cells/ml, preferably 1.0x10 5 to 1.0x10 9 cells/ml based on the total weight of the composition, but is not limited thereto. Does not.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions, and the carrier may include a non-naturally occuring carrier.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • the pharmaceutical compositions are each tablet, pill, powder, granule, capsule, suspension, solution, emulsion, syrup, sterilized aqueous solution, non-aqueous solvent, suspension, emulsion, freeze-dried, transdermal, respectively, according to a conventional method. It can be formulated and used in the form of absorbents, gels, lotions, ointments, creams, patches, cataplasmas, pastes, sprays, skin emulsions, skin suspensions, transdermal delivery patches, drug-containing bandages or suppositories.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. These solid preparations may be prepared by mixing at least one or more excipients, such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyloleate, and the like can be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, Sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition may be administered at a dose of 0.0001 to 1000 mg/kg per day, specifically 0.001 to 100 mg/kg, and the administration may be administered once or several times a day.
  • the pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the "administration” means introducing the composition of the present invention to an individual by any suitable method, and the route of administration of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the "individual” means all animals including humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, mice, rabbits or guinea pigs who have or may develop cancer. . If the disease can be effectively prevented or treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject, the type of subject may be included without limitation.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering the cell therapy composition or the pharmaceutical composition to an individual other than a human.
  • Another aspect of the present invention is a) a first container containing a first medium containing a growth factor, a cytokine and a GSK3 ⁇ inhibitor; And b) (1) a growth factor, a cytokine and an AHR agonist, or (2) a growth factor, a cytokine, and a second container containing a second medium containing an anti-CD3 antibody; direct li for iNKT cell production comprising Provides a programming badge kit.
  • the kit of the present invention means a tool that can be used as a direct reprogramming medium for producing iNKT cells, including a first container containing the first medium and a second container containing a second medium containing the first medium.
  • the kind of the kit is not particularly limited, and a kit in a form commonly used in the art may be used.
  • the kit of the present invention may be packaged in a form in which the first medium and the second medium are each contained in individual containers, or contained in one container divided into one or more compartments, and the first medium and the second medium Each may be packaged in a unit dosage form of a single dose.
  • the first medium and the second medium in the kit may be sequentially administered at an appropriate time according to an experiment plan of a person skilled in the art.
  • the kit of the present invention may further include an instruction manual describing the amount of each of the first medium and the second medium, the addition method, and the addition frequency.
  • the present invention simplifies the production process by directly producing NKT cells from cells isolated through direct reprogramming, and the production time is at least 18-22 days, which is shorter than the method used to produce NKT cells using conventional reprogramming techniques.
  • cost is reduced, and NKT cell production efficiency is excellent at up to 94.1% (33.1% when additional CAR gene is introduced), and safety is secured as it is produced without passing through induced pluripotent stem cells, differentiating from conventional reprogramming technology.
  • NKT cells are cultured in a reprogramming medium by culturing cells that are different in lineage from NKT cells and are easy to collect. Since it can be manufactured directly, it is meaningful that it can provide a wide range of options for cell types and quality.
  • iNKT cells prepared according to the method of the present invention have excellent cancer cell killing ability as described above, and can be provided as a cell therapy composition and pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer including the same.
  • Example 1 Direct reprogramming from PBMC to NKT cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Sendai virus system expressing reprogramming factors to transform reprogramming factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) into the PBMC cells [Oct4, Sox2, Klf4 and Myc-expressing RNA-based Sendai virus (CytoTune 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Thermo Scientific); OSKM-SeV] was used.
  • the Sendai virus (5 MOI), PBMC cells, and polybrene (4 ⁇ g/ml) were cultured together for 1 day in a standard culture medium (SCM medium), and then fresh medium Replaced with.
  • SCM medium standard culture medium
  • iNKT 1 medium (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin), 100 ng/ml human SCF, 100 ng/ml human FLT3.
  • NKT cells were prepared through the direct reprogramming
  • the cells were stained with CD56 antibody and CD3 antibody, and then NKT cells (CD56+ and CD3+) groups were analyzed using flow cytometry.
  • a phosphate buffer containing 1% Bovine Serum Albumin (BSA) and 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) to which NKT (iNKT) cells induced through direct reprogramming were added with antibodies against fluorescently attached CD56 and CD3
  • FACS buffer After reaction at room temperature for 20 minutes with (FACS buffer), the cells were washed and recovered using a centrifuge, and then analyzed by FACS (BD Bioscience).
  • CD56 + CD3 + NKT cells were produced with an efficiency of about 62% through direct reprogramming from PBMC (FIG. 1B).
  • Example 2 Direct reprogramming from T cell subtypes to NKT cells
  • PBMCs were separated into CD3+CD8-, CD3+CD8+, CD3-CD8-, and CD3-CD8+ cell groups using FACSAriaII (BD). Reprogramming was performed directly by the method. On the 24th day after direct reprogramming, FACS analysis was performed by the method of Example 1, and it was confirmed that CD56 + CD3 + NKT cells were produced with an efficiency of about 94.1% through direct reprogramming from CD3 + CD8- cells (Fig. 2).
  • NKT cells were directly prepared from somatic cells isolated by direct reprogramming according to the introduction of reprogramming factors.
  • NKT production efficiency was confirmed according to whether CHIR99021 (CT), SR1 (SR), and FICZ were added. Specifically, as shown in the table of FIG. 3, medium A to F in which CHIR99021 (CT) and SR1 (SR) were added or not in the iNKT first medium and second medium were prepared. For media C and F, the AHR agonist FICZ was added instead of SR1 (SR).
  • PBMC cells were directly reprogrammed by the method of Example 1 using iNKT first medium and second medium prepared in different medium compositions, and the production efficiency of NKT cells was analyzed.
  • CHIR99021 was added only to the iNKT first medium, and it was confirmed that the iNKT production efficiency was excellent at 40.5%, respectively, in the medium C to which FICZ was added to the iNKT second medium.
  • the NKT production efficiency was confirmed when the AHR agonist FICZ or Biokanin A, and the anti-CD3 antibody OKT3 or UCHT1 were added. Specifically,
  • cancer cells HCT116 Human Colon Cancer cells
  • NIC-H460 Human Lung Cancer Cells
  • HepG2 Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cells
  • Mia-paca-2 Human Pancreas Ductal Adenocarcinoma cells
  • the frequency of CD107a+ cells was confirmed through flow cytometry. Specifically, the frequency of CD107a+ cells was determined by reacting iNKT cells with fluorescently attached CD56-PE, CD3-APC and CD107a-FITC antibody-added FACS buffer for 20 minutes at room temperature, and then gating the CD56+CD3+ cell group by FACS. ) And analyzed.
  • the frequency (%) of CD107a+ cells was increased in iNKT cells co-cultured compared to the control group not co-cultured with cancer cells (FIG. 5).
  • Example 5 Measurement of cancer cell killing ability of iNKT cells
  • a cell killing ability measurement method using calcein-AM (Calcein-AM) was performed. Specifically, cancer cells Raji (Raji B, Human B Lymphocyte; Burkitt's Lymphoma), SNU-817 (Human B-lymphoblastoid Cells), K562 (Human Immortalized Myelogenous Leukemia Cells), HCT116, PC3 (Human Prostate Cancer Cells), HepG2, NIC-H460 and Mia-paca-2 were diluted to 1 ⁇ 10 5 cells/ml each in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, then calcein-AM was added to 25 ⁇ M, and then at 37° C. for 1 hour After cultivation, the cells were washed with DMEM medium to prepare calcein-labeled target cancer cells.
  • Cancer cell killing ability (%) ⁇ (measured value-minimum value)/(maximum value-minimum value) ⁇ x100
  • the minimum value is a measurement value of a well in which only calcein-labeled target cancer cells are present
  • the maximum value is a measurement value of a well in which the cells are completely dissolved by adding 0.1% TritonX-100 to the calcein-labeled target cancer cells.
  • iNKT cells have high killing ability against cancer cells, and it was confirmed that the cancer cell killing ability increased in proportion to the number of cells of iNKT cells (FIG. 6).
  • Example 6 In vivo cancer cell killing ability verification of iNKT cells
  • CFPAC-1 Human Huctal Pancreatic Adenocarcinoma Cells 2x10 6 cells/ml 5 ml expressing luciferase on the back of nude mice at 8 weeks of age (Balb/c-nude Mouse, average weight 20-25 g).
  • a pancreatic cancer cell xenograft mouse animal model was prepared. The next day, after injecting 200 ul of PBS as a negative control or iNKT (1 ⁇ 10 7 cells/200 ul PBS) as a negative control group, the tumor size was confirmed through IVIS 100 (PerkinElmer) at 7 days intervals.
  • the tumor size formed in the iNKT experimental group (8.01x10 9 radiance) was significantly reduced compared to the tumor size formed in the negative control group [1.21x10 10 radiance] on the 14th day after PBS or iNKT injection ( Fig. 7).
  • Example 7 Construction of a dual cistronic lentiviral vector encoding CAR
  • CAR Chimeric Antigen Receptor
  • CD8 Leader SEQ ID NO: 1
  • CD19 scFv SEQ ID NO: 2
  • CD8 Hinge SEQ ID NO: 5
  • CD8 Transmembrane SEQ ID NO: 6
  • CD19-CAR1 gene containing Fc- ⁇ Gamma
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • CD8 reader SEQ ID NO: 1
  • CD19 scFv SEQ ID NO: 2
  • CD8 hinge SEQ ID NO: 5
  • CD8 transmembrane domain SEQ ID NO: 6
  • CD28 Intracellular domain SEQ ID NO: 8
  • CD19-CAR2 gene including CD3 ⁇ (Zetta) (SEQ ID NO: 9), IRES (Internal Ribosome Entry Site) (SEQ ID NO: 10) and GFP (SEQ ID NO: 11);
  • CD8 reader SEQ ID NO: 1
  • MSLN Mesothelin
  • scFv SEQ ID NO: 3
  • CD8 hinge SEQ ID NO: 5
  • CD8 transmembrane domain SEQ ID NO: 6
  • CD28 intracellular domain SEQ ID NO: 8
  • CD3 ⁇ MSLN-CAR gene including (SEQ ID NO: 9), IRES (SEQ ID NO: 10) and GFP (SEQ ID NO: 11);
  • CD8 reader SEQ ID NO: 1
  • HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
  • scFv SEQ ID NO: 4
  • CD8 hinge SEQ ID NO: 5
  • CD8 transmembrane domain SEQ ID NO: 6
  • CD28 intracellular domain SEQ ID NO: Number 8
  • CD3 ⁇ SEQ ID NO: 9
  • IRES SEQ ID NO: 10
  • HER2-CAR gene containing GFP SEQ ID NO: 11
  • the IRES was inserted to clone the CAR gene into a vector constituting a double cistron.
  • Example 8 Preparation of CAR-iNKT using direct reprogramming from PBMC to NKT cells
  • PBMC in culture (2.5% StemPro-34 Nutrient Supplement, 2 mM Glutamax I, 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml human IL-3, 20 ng/ml human IL-6, 100 ng/ml human SCF, 100 ng /ml in Stempro SFEM II containing human FLT3), cultured for 4 days with medium exchange every 2 days.
  • Reprogramming factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and the CD19-CAR1 gene, CD19-CAR2 gene, MSLN-CAR gene, or HER2-CAR gene produced in Example 7 to transform the PBMC cells Sendai virus system expressing [Oct4, Sox2, Klf4 and Myc expression RNA-based Sendai virus (CytoTune 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Thermo Scientific); OSKM-SeV] and 4 types of lentiviruses expressing the 4 types of CARs of Example 7 were used.
  • the Sendai virus (5 MOI), PBMC cells, and polybrene (4 ⁇ g/ml) were cultivated together in a standard culture medium (SCM medium) for 1 day, and then a fresh medium Replaced with.
  • SCM medium standard culture medium
  • iNKT 2 medium containing anti-CD3 antibody or AHR agonist
  • lentivirus (2 MOI) and polybrene expressing CD19-CAR1 gene, CD19-CAR2 gene, MSLN-CAR gene or HER2-CAR gene 4 mg/ml was added and cultured for an additional 4-28 days, so that the induced NKT cells were transduced with the CAR gene (CAR-iNKT cells) (Fig. 9).
  • lentivirus 2 MOI
  • polybrene expressing CD19-CAR1 gene, CD19-CAR2 gene, MSLN-CAR gene or HER2-CAR gene 4 mg/ml
  • the lentivirus expressing CAR is inoculated into the culture medium by selecting from the step of culturing in the iNKT first medium or the step of culturing in the iNKT second medium after introduction of the reprogramming factor at the same time as (Day 0).
  • the cells in the reprogramming process were transformed from PBMC cells to NKT cells.
  • CD56 antibody, CD3 antibody, CD19 antigen, MSLN antigen, HER2 After staining the cells with antigen, the CD56 + CD3 + CD19-CAR-iNKT cell group, the CD56 + CD3 + MSLN-CAR-iNKT cell group, and the CD56 + CD3 + HER2-CAR-iNKT cell group were analyzed using a flow cytometer.
  • iNKT cells into which the CD19-CAR1 gene was introduced CD19-CAR-iNKT cells
  • FACS analysis was performed in the same manner as in Example 1.
  • MSLN-CAR-iNKT cells MSLN-CAR-iNKT cells
  • HER2-CAR-iNKT cells iNKT cells into which the HER2-CAR gene has been introduced
  • CD3-PE BD Bioscience
  • MSLN antigens are primarily -After 20 minutes reaction at room temperature with biotin or HER2 antigen-biotin-added FACS buffer, the cells were washed and recovered using a centrifuge. Secondly, after 20 minutes reaction at room temperature with a FACS buffer to which avidin-APC (Allophycocyanin) was added, the cells were washed and recovered using a centrifuge and analyzed by FACS.
  • CD56 + CD3 + CD19-CAR-iNKT cells with an efficiency of 20.3% (Fig. 10)
  • Fig. 11 CD56 + CD3 + HER2-CAR- It was confirmed that iNKT cells were prepared with an efficiency of 33.1% (FIG. 12).
  • Example 9 Measurement of cancer cell killing ability of iNKT cells introduced with CD19-CAR2
  • the iNKT cells of Example 1 and the iNKT cells (CD19-CAR2-iNKT cells) introduced with CD19-CAR2 of Example 8 were each cultured to a cell density of 0.25 ⁇ 10 5 cells/ml or 1 ⁇ 10 5 cells/ml After dilution with, 100 ul each was dispensed into a 96-well plate.
  • a cell density 0.25 ⁇ 10 5 cells/ml or 1 ⁇ 10 5 cells/ml
  • 100 ul each was dispensed into a 96-well plate.
  • calcein-labeled target cancer cells were prepared by the method of Example 5. After adding 1 ⁇ 10 5 cells/ml of calcein-labeled target cancer cells to a 96-well plate at 100 ul/well, the cancer cell killing ability was measured by the method of Example 5.
  • CD19-CAR2-iNKT cells exhibited higher killing ability than control iNKT cells against target cancer cells (FIG. 13).
  • Example 10 Measurement of cancer cell killing ability of iNKT cells introduced with MSLN-CAR or HER2-CAR
  • Example 1 INKT cells of Example 1, iNKT cells into which MSLN-CAR of Example 8 was introduced (MSLN-CAR-iNKT cells) and iNKT cells into which HER2-CAR of Example 8 was introduced (HER2-CAR-iNKT cells), respectively After diluting with a culture solution to a density of 0.25 ⁇ 10 5 cells/ml or 1 ⁇ 10 5 cells/ml, each 100 ul was dispensed into a 96-well plate. Using cancer cells PC3 (PC-3), CFPAC-1, and HepG2, calcein-labeled target cancer cells were prepared by the method of Example 5. After adding 1 ⁇ 10 5 cells/ml of calcein-labeled target cancer cells to a 96-well plate at 100 ul/well, the cancer cell killing ability was measured by the method of Example 5.
  • PC3 PC-3
  • CFPAC-1 CFPAC-1
  • HepG2 HepG2
  • MSLN-CAR-iNKT cells or HER2-CAR-iNKT cells exhibited higher killing ability than control iNKT cells for target cancer cells (FIGS. 14 to 15 ).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 면역세포, 특히, 분리된 체세포를 직접 리프로그래밍하여 유도된 자연살해 T(induced Natural Killer T; iNKT) 세포 및 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 코딩하는 CAR 유전자가 도입된 CAR-iNKT 세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 iNKT 세포, 상기 iNKT 세포를 포함하는 세포치료제 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 iNKT 세포 또는 CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포를 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 세포로부터 생산함으로써 생산 공정이 간소화되고 생산 시간이 짧아 이에 따라 비용이 절감되며, NKT 세포 생산 효율이 우수하고, 유도 만능 줄기세포를 경유하지 않고 생산됨에 따라 안전성이 확보되어, 종래 리프로그래밍 기술과 차별화되는 우수한 NKT 세포 생산 효과가 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된, iNKT 세포 또는 CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포는 암세포 살상능이 우수한 바, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 혹은 약학 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

면역세포의 제조방법 및 그의 용도
본 발명은 분리된 인간 체세포를 직접 리프로그래밍하여 유도된 자연살해 T 세포(induced Natural Killer T cell, iNKT) 및 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 코딩하는 CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 iNKT 세포, 상기 iNKT 세포를 포함하는 세포치료제 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
골수, 림프선, 간, 비장, 혈액 등 다양한 조직 및 기관에 존재하는 자연살해 T(Natural Killer T, NKT) 세포는 T 림프구(Lymphocyte)와 자연살해(Natural Killer, NK) 세포의 특징을 함께 가지고 있는 T 세포의 일종으로, T 세포 수용체(T-cell receptor)와 NK1.1 등의 T 세포 또는 NK 세포의 표면항원을 같이 발현하는 것으로 알려져 있다.
일반적인 T 세포는 MHC(Major Histocompatibility Complex) 클래스(Class) I/MHC 클래스 II에 의해 제시되는 항원을 인지하지만, NKT 세포는 CD1d(MHC-like Molecule)에 의해 제시되는 당지질(α-GalCer; 알파-갈락토실세라마이드)을 인지한다. 따라서, T 세포 및 NK 세포와 같은 세포독성을 가진 NKT는 T 세포의 일종임에도 불구하고 이식편대숙주병(Graft-versus-host Disease, GVHD)을 유발하지 않아 자가-유래 뿐만이 아니라 동종-유래 세포치료제 개발에 유용한 세포자원으로 인정되고 있다. 활성화된 NKT 세포는 IFN(Interferon), IL(Interleukin)-4, GM-CSF(Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor), IL-2, IL-13, IL-17, IL-21, TNF(Tumor Necrosis Factor)과 같은 다양한 종류의 사이토카인(Cytokine) 및 케모카인(Chemokine)을 분비하여 NKT 세포 및 다양한 면역세포들(NK 세포, T 세포, B 세포, 대식세포 등)의 면역기능을 조절함으로써 선천면역과 후천면역의 중개적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.
인체(말초 혈액 등)에 존재하는 환자 또는 동종 유래 NKT 세포는 단순 분리, 증폭하여 생산하는 일차 배양 방법을 통해 확보 가능하나, 근본적으로 NKT 세포가 극히 소량(말초 혈액의 백핵구내 0.1-0.01% 정도) 제한적으로 존재하는 것으로 알려져 있고 세포 소스에 따른 배치(Batch) 간 세포 타입의 이질성, 생산공정의 복잡성 및 가변성 등이 문제점이 지적되고 있다. 대안으로 NKT 세포로의 분화능을 가진 줄기세포의 분화를 통해 확보하려는 노력이 진행되고 있지만, 낮은 생산 효율, 상대적으로 많은 시간 및 비용 소요, 생산공정이 복잡하다는 등이 극복되어야 할 문제점으로 지적되고 있다. 따라서, 면역세포치료제로서의 잠재력이 우수한 NKT 세포의 활용을 증진하기 위해서는 우선적으로 새로운 NKT 세포 자원의 확보 또는 생산 방법의 개발이 필요한 실정이다.
최근, 타겟 암세포에 대한 특이성과 활성화를 촉진하고 결과적으로 항암 치료 효용성을 증진하기 위한 방법으로 단일 클론 항체와 유사하게 특정 암 표면 항원을 표적으로 하는 암세포 표적 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR) 유전자를 도입하여 생산된 면역 세포(CAR-T, CAR-NK 세포)의 개선된 항암 효과가 입증되면서 CAR-면역세포치료제 개발에 대한 관심이 대두되고 있다. 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현이 조작된 NKT 세포(CAR-NKT)는 CAR-특이적인 작용 기전에 의존적으로 항암 증진 효과를 나타내는 T 세포와는 달리 수지상 세포(Dendritic Cell)의 성숙 유도, NK 및 CD8+ T 세포 활성화 사이토카인 분비를 유도함으로써 직간접적으로 높은 항암 효과를 나타낼 수 있다. 또한, MHC와 상호작용하지 않아 동종 항암면역세포치료제 개발의 주요한 자원으로 부상하고 있다. 하지만 기능적으로 개선된 CAR-NKT 세포를 생산하기 위한 초기 NKT 세포 자원이 매우 제한적으로 새로운 NKT 세포 자원의 확보 또는 생산 방법의 개발이 필요한 실정이다.
최근, 체세포 리프로그래밍 기술을 이용하여 비교적 확보가 용이한 초기 인간 체세포로부터 이와 다른 계통의 특성을 가진 고부가가치 인간 조직-특이 표적 세포를 직접 생산하는 기술이 급발전하고 있다. 하지만, 아직까지 직접 리프로그래밍을 통해 분화 공정 과정 없이 NKT 세포를 생산하는 기술에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명자들은 인간 NKT 세포를 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, NKT 특이적인 리프로그래밍 배지 및 리로그래밍 배양조건을 개발하였고, 이를 통해 초기세포자원의 제한이 없이 분화 공정 과정에 필요하지 않은 방법으로 인간 체세포로부터 NKT 및 CAR-NKT 세포를 제작할 수 있으며, 생산된 NKT 세포가 우수한 암세포 살상능을 나타내어 암 예방 또는 치료에 적용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 I) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 또는 II) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 도입된 분리된 세포를 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 저해제(Inhibitor)를 포함하는 제 1 배지; 및 b) (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist), 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지;에서 순차적으로 배양하여 NKT 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, iNKT(induced Natural Killer T) 세포 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제 1 배지를 함유하는 제 1 용기; 및 b) (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR 작용제, 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지를 함유하는 제 2 용기;를 포함하는 iNKT 세포 제조용 직접 리프로그래밍 배지 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법은 iNKT 세포 또는 CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포를 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 세포로부터 생산함으로써 생산 공정이 간소화되고 생산 시간이 짧아 이에 따라 비용이 절감되며, NKT 세포 생산 효율이 우수하고, 유도 만능 줄기세포를 경유하지 않고 생산됨에 따라 안전성이 확보되어, 종래 리프로그래밍 기술과 차별화되는 우수한 NKT 세포 생산 효과가 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된, iNKT 세포 또는 CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포는 암세포 살상능이 우수한 바, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 혹은 약학 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 (A) 체세포 직접 리프로그래밍에 의한 iNKT 제조방법의 모식도, (B) PBMC 세포로부터 제조한 iNKT 세포를 확인한 결과이다.
도 2는 CD3+CD8- 세포로부터 제조한 iNKT 세포를 확인한 결과이다.
도 3은 iNKT 제 1 배지 및 제 2 배지의 조성에 따른 iNKT 생산 효율을 확인한 결과이다.
도 4는 AHR 작용제 또는 항-CD3 항체 첨가 여부에 따른 iNKT 생산 효율을 확인한 결과이다.
도 5는 제조된 iNKT 세포와 암세포의 공배양시 CD107a 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 6은 제조된 iNKT 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 7은 췌장암 세포 이종이식 마우스 동물 모델에서 상기 iNKT 세포의 종양 성장 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 CAR 유전자 4종의 구성 도메인을 나타낸 도이다.
도 9는 체세포 직접 리프로그래밍 및 CAR 유전자 도입에 의한 CAR-iNKT 제조방법의 모식도이다.
도 10은 CD19-CAR2 세포가 도입되어 제조된 CD19-CAR-iNKT 세포를 확인한 결과이다.
도 11은 MSLN-CAR 세포가 도입되어 제조된 MSLN-CAR-iNKT 세포를 확인한 결과이다.
도 12는 HER2-CAR 세포가 도입되어 제조된 HER2-CAR-iNKT 세포를 확인한 결과이다.
도 13은 제조된 CD19-CAR2-iNKT 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 14는 제조된 MSLN-CAR-iNKT 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 15는 제조된 HER2-CAR-iNKT 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 I) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 또는 II) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 도입된 분리된 세포를 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 저해제(Inhibitor)를 포함하는 제 1 배지; 및 b) (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist), 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지;에서 순차적으로 배양하여 NKT 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, iNKT(induced Natural Killer T) 세포 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "NKT(Natural killer T) 세포"는 선천면역 및 후천면역을 담당하는 T 림프구 세포의 일종으로서, 신체의 여러 조직에서 발견된다. 이는 TCR(T Cell Receptor) 사슬에 따라 두 그룹으로 나뉘어지며, 유형 I NKT 세포는 불변 NKT 세포라고도 불리는데, 제한된 TCR β-사슬 레퍼토리를 갖는 불변의 TCR 사슬을 사용하고, 유형 II NKT 세포는 다양한 TCR 사슬 조합을 광범위하게 발현한다. NKT 세포는 감염된 세포나 종양세포 등 표적 세포를 인지하면 즉각적으로 공격하여 제거할 수 있는 것으로 알려져 있어 T, NK 세포와 함께 면역세포치료제 개발의 주요한 타겟 세포로 인정되고 있다.
NKT 세포는 다양한 암세포를 직간접적으로 살상하는 항암 효과를 가지고 있어, 암 질환을 대상으로 하는 치료제 및 재발 억제제 등 기존 항암 치료법의 한계를 극복하기 위한 유용한 자원이다. 주로 말초혈액에서 단순 분리, 증폭하거나 줄기세포로부터 분화 유도 배양을 통해 NKT 세포를 생산하는 기술이 개발되고 있으나, 여전히 생산성이 낮고, 시간 및 비용이 많이 소요된다는 등의 문제점이 부각되고 있어 새로운 NKT 세포 자원의 개발에 대한 니즈가 높은 실정이다.
또한, 암세포에 대한 특이성과 활성화를 촉진하기 위한 방안으로 다양한 암의 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 발현하는 NKT 세포(또는 CAR-NKT 세포)를 제작하고, 이를 항암면역세포치료제로 개발하기 위한 관심이 급증하고 있으나, 상기 CAR-NKT 세포를 제조하는 방법으로 일차 배양한 NK 세포에 직접 CAR 유전자를 도입하는 방법이 사용되고 있어 전술한 바와 같이 생산성이 매우 낮다는 등의 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 NKT 세포를 생체외 배양 조건에서 제조하고자 하였으며, 그 결과 직접 리프로그래밍을 통해 NKT 세포를 직접 유도 및 생산할 수 있는 방법을 최초로 규명하였다.
본 발명에서 용어, "iNKT(induced Natural killer T) 세포"는 본 발명의 방법에 따라 직접 리프로그래밍을 통해 유도된(induced) NKT(Natural killer T) 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, "CAR-iNKT(induced Natural killer T) 세포"는 본 발명의 방법에 따라 직접 리프로그래밍을 통해 유도되고(induced), CAR 유전자가 도입된 NKT(Natural killer T) 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍(Reprogramming)"은 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴(Global Gene Expression Pattern) 등을 조절하여, 전혀 다른 특성을 가지는 목적하는 세포로 계통을 전환시키는 방법을 의미한다. 리프로그래밍은 세포의 역분화(Dedifferentiation), 직접 리프로그래밍(Direct Reprogramming 또는 Direct Conversion), 또는 직접 교차분화(Trans-differentiation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 "전환"은 세포가 다른 상태로 바뀌는 것을 의미하고, 상기 "분화"는 세포가 분열하여 만들어진 딸 세포들이 원래의 모 세포와 다른 기능을 얻는 현상을 의미하며, 본 발명에서 상기 "전환"과 "분화"는 "유도"와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "직접 리프로그래밍(Direct Reprogramming)"은 특정 세포를 리프로그래밍 배지에서 배양하여 목적하는 세포로의 직접 전환을 유도하는 방법을 의미한다. 종래의 리프로그래밍 기술을 이용하여 목적 세포인 NKT 세포를 생산하기 위해서는 1) 분리된 체세포로부터 유도 만능 줄기세포를 생산하고, 2) 유도 만능 줄기세포로부터 중간체인 조혈 줄기(전구)세포를 분화 생산한 후, 3) 분화된 줄기(전구)세포로부터 목적 세포인 NKT 세포를 분화 생산해야 했다. 이와 같이 종래 기술은 복잡한 배양 과정을 순차적으로 거쳐야 하기 때문에 생산 효율이 낮고 시간적, 비용적 소모가 크다는 단점이 있다. 또한, 전분화능을 가진 유도 만능 줄기세포를 경유하여 생산되기 때문에 미분화 세포의 잔류 여부, 안전성 확보 여부가 검증되어야 할 중요한 쟁점이다. 이에 반해, 본 발명은 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 체세포로부터 목적 세포인 NKT 세포를 직접 생산함으로써 생산 시간이 짧고, 비용이 절감되며, 효율이 우수하고 안전성이 확보되는 바, 종래 기술과 차별화되며, 이의 문제점을 극복할 수 있는 대안을 제공할 수 있다. 상기 직접 리프로그래밍은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 직접 리프로그래밍은 분리된 체세포로부터 NKT 세포로의 직접 역분화 또는 교차 분화를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "분화된 세포"는 구조나 기능이 특수화된 세포, 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변화된 상태를 의미한다. 예를 들어, 넓게는 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포로부터 유래된 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포가 분화된 세포이고, 좁게는 조혈모세포로부터 유래된 적혈구, 백혈구, 혈소판 등이 분화된 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "계통이 전환된 세포"는 세포가 가지고 있던 고유의 계통 특성이 발생학적으로 또는 인위적인 방법(예를 들면, 리프로그래밍 등)으로 바뀌어 다른 계통 특성을 가진 세포 유형으로 전환된 세포로서, 전환되기 전의 세포 유형의 특성과는 전혀 다른 세포 유형의 특성을 가진다. 본 발명에 있어서, 상기 계통이 전환된 세포는 목적 세포일 수 있다. 예를 들면, 말초혈액 단핵세포내 비-NKT 림프구 세포가 리프로그래밍 배지에서의 NKT 세포로 전환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 I) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 또는 II) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 도입된 분리된 세포를 a)의 제 1 배지; 및 b)의 (1) AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist)를 포함하는 제 2 배지, 또는 (2) 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지;에서 순차적으로 배양하여 NKT 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "분리된 세포"는 특별한 제한은 없으나, 구체적으로는 생식세포, 체세포(Somatic cell) 또는 전구세포(Progenitor Cell) 등 이미 계통(Lineage)이 특정된 세포일 수 있다. 상기 "체세포"는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 상기 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(Fate)를 가지고 있는 모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다.
상기 분리된 세포는 인간에게서 유래한 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다양한 개체에서 유래된 세포 역시 본 발명의 범위 내에 속할 수 있다. 또한, 본 발명의 분리된 세포에는 생체내 또는 생체외의 세포가 모두 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 세포는 체세포일 수 있고, 보다 구체적으로 NKT 세포를 제외한 체세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor)"는 세포에 도입되어 리프로그래밍을 유도할 수 있는 유전자(혹은 폴리뉴클레오티드), 또는 이로부터 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 인자는 리프로그래밍을 통해 얻고자 하는 목적 세포에 따라, 그리고 리프로그래밍되기 전의 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 분리된 체세포를 NKT 세포로 유도하고자 할 경우, 상기 분리된 체세포에 도입되는 리프로그래밍 인자는 Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct4, Oct3, Sox2, Klf4, Myc 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 분리된 체세포를 NKT 세포로 유도할 수 있는 리프로그래밍 인자라면 당업계에 공지된 모든 인자를 포함할 수 있다. 상기 리프로그래밍 인자를 이용한 리프로그래밍은 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하여 목적 세포로의 전환을 유도하는 것으로, 상기 리프로그래밍 인자를 세포에 도입하고 세포를 일정 기간 배양함으로써 목적하는 종류의 세포의 유전자 발현 패턴을 가지는 목적 세포로 세포를 리프로그래밍시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자의 도입"은 리프로그래밍 인자를 세포의 배양액에 투여하는 방법; 리프로그래밍 인자를 세포에 직접 주입하는 방법; 세포 내에 존재하는 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법; 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 세포에 형질전환시키는 방법; 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 유전자 서열을 변형하는 방법; 리프로그래밍 인자를 코딩하는 외래 발현 유전자를 도입하는 방법, 리프로그래밍 인자의 발현 유도 효과를 가지는 물질을 처리하는 방법; 및 이들의 조합을 통하여 세포 내의 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법일 수도 있으나, 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 특히, 리프로그래밍 인자의 도입은 원하는 시간 및 조건 하에서 리프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 리프로그래밍 인자를 세포에 도입하는 방법은 리프로그래밍 인자를 세포의 배양액에 투여하는 방법, 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 세포에 형질전환시키는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 리프로그래밍 인자를 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(Microinjection), 전기천공법(Electroporation), 입자분사법(Particle bombardment), 직접근육주입법(Direct Muscle Injection), 인슐레이터(Insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록, 적합한 조절 서열 및 상기 목적 단백질 또는 폴리펩티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 바이러스 벡터, 에피솜 벡터(Episomal Vector), 플라스미드 벡터(Plasmid Vector), 코즈미드 벡터(Cosmid Vector) 등을 들 수 있다.
구체적으로, 상기 바이러스 벡터는 센다이바이러스(Sendai Virus), 렌티바이러스(Lentivirus), HIV(Human Immunodeficiency Virus), MLV(Murineleukemia Virus), ASLV(Avian Sarcoma/Leukosis), SNV(Spleen Necrosis Virus), RSV(Rous Sarcoma Virus), MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus) 등의 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated Virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로, RNA 기반 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 에피솜 벡터는 비바이러스성 비삽입성 벡터로서, 염색체 내에 삽입되지 않고 벡터에 포함된 유전자를 발현시킬 수 있는 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 에피솜 벡터를 포함하는 세포는, 에피솜 벡터가 유전체 내에 삽입되거나, 또는 유전체 내에 삽입되지 않은 상태로 세포 내 존재하는 경우를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결된(Operably Linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(Functional Linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 용어, "배양"은 세포를 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 본 발명의 배양 과정은 당업계에 알려진 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 세포에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 배양은 리프로그래밍 인자가 도입된 세포를 다른 계통의 목적 세포로 전환하는 과정이므로, 상기 리프로그래밍 인자가 도입된 세포를 배양하는 제 1 배지 또는 제 2 배지의 조성은 목적 세포로 전환되기에 적합한 조성, 예를 들면, 성장인자, 사이토카인, GSK3β 저해제, AHR 작용제 또는 항-CD3 항체 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a)의 제 1 배지는 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β 저해제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "성장인자"는 여러 세포의 분열, 성장 및 분화를 촉진하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 성장인자는 예를 들면, EGF(Epidermal Growth Factor), PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor-AA), IGF-1(Insulin-like Growth Factor 1), TGF-β(Transforming Growth Factor-β), FGF(Fibroblast Growth Factors), SCF(Stem Cell Factor) 및 FLT3(FMS-like Tyrosine Kinase) 등일 수 있고, 구체적으로, SCF, FLT3 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "사이토카인"은 세포에서 생산되어 세포 신호 전달에 사용되는 비교적 작은 크기의 다양한 단백질로서, 자신을 포함하는 다른 세포에 영향을 끼칠 수 있다. 일반적으로 염증 또는 감염에 대한 면역 반응과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 사이토카인은 예를 들면, IL(Interleukin)-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), 액티빈 A(Acivin A), 노치 리간드(Notch Ligand), G-CSF(Granulocyte-colony Stimulating Factor), SDF-1(Stromal Cell-derived Factor-1) 등일 수 있고, 구체적으로 IL-3, IL-6, IL-2, IL-7, IL-15 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 성장인자 및 사이토카인은 분리된 세포를 목적 세포로 직접 리프로그래밍하는 배지에 포함되며, 성장인자 및 사이토카인의 종류는 직접 리프로그래밍에 이용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta, Glycogen Synthase Kinase-3β) 저해제(Inhibitor)"는 글리코겐 신타제 키나제 3 베타의 활성을 저해 또는 억제하는 물질을 의미한다. 상기 GSK3β 저해제는 예를 들면, 1-Azakenpaullone, 2-D08, 3F8, 5-Bromoindole, 6-Bio, A 1070722, Aloisine A, AR-A014418, Alsterpaullone, AZD-1080, AZD2858, Bikinin, BIO, BIO-acetoxime, Bisindolylmaleimide I, Bisindolylmaleimide I Hydrochloride, CAS 556813-39-9, Cazpaullone, CHIR98014, CHIR98023, CHIR99021(CT99021), CP21R7, Dibromocantherelline, GSK-3β Inhibitor I, VI, VII, X, XI,XV, GSK-3 Inhibitor IX, XVI, Hymenidin, Hymenialdisine, HMK-32, I3M(Indirubin-3-monoxime, Indirubin, Indole-3-acetamide, IM-12, Kenpaullone, L803-mts, Leucettine L41, Lithium, Lithium Carbonate, LY-2090314, Manzamine A MeBIO, Meridianine A, NP00111, NP031115, NP031111, NSC 693868, Palinurin, Ro 31-8220 Methanesulfonate, SB-216763, SB-415286, TC-G 24, TCS 2002, TCS 21311, Tideglusib, Tricantin, Trihydrochloride, Tungstate, TWS-119, TZDZ-8, Zinc 등일 수 있고, 구체적으로 CHIR99021일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a)의 제 1 배지는 SCF, FLT3, IL-3, IL-6 및 CHIR99021를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a)의 제 1 배지는 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 a)의 제 1 배지는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, SCF, FLT3, IL-3, IL-6 및 CHIR99021를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 a)의 제 1 배지는 8 내지 12%의 FBS, 0.1 내지 2%의 페니실린/스트렙토마이신, 50 내지 200 ng/ml의 인간 SCF, 50 내지 200 ng/ml의 인간 FLT3, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-3, 10 내지 30의 ng/ml 인간 IL-6, 2 내지 8 uM의 CHIR99021을 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있고, 더욱 구체적으로, 10%의 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 100 ng/ml의 인간 SCF, 100 ng/ml의 인간 FLT3, 20 ng/ml의 인간 IL-3, 20 ng/ml의 인간 IL-6, 5 uM의 CHIR99021을 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b)의 제 2 배지는 (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist), 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 용어 "성장인자" 및 "사이토카인"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist)"는 TCDD(Dioxin(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin))에 의해 활성화되는 리간드-활성화 전사인자(Transcription Factor)인 AHR에 결합하여 활성화시키는 물질을 의미한다. 상기 AHR 작용제는 예를 들면, TCDD(2,8-dihydroxyquinoline, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin), FICZ(6-Formylindolo[3,2-b]carbazole), 비오카닌 A 등일 수 있고, 구체적으로 FICZ, 비오카닌 A 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "항-CD3 항체"는 T 세포 수용체(T Cell Receptor, TCR)과 결합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 반응하는 단백질로서, CD3 분자는 TCR과 비교하여 세포 내 영역이 길고 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 것으로 알려져 있다. 상기 항-CD3 항체는 예를 들면, OKT-3, UCHT1, HIT3a 등일 수 있고, 구체적으로 OKT3, UCHT1 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b)의 제 2 배지는 (1) AHR 작용제를 포함하는 제 2 배지인 경우, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, FICZ 및 비오카닌 A를 포함할 수 있고, 또는 (2) 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지인 경우, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, OKT3 및 UCHT1를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b)의 제 2 배지는 FBS, 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린/스트렙토마이신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 b)의 제 2 배지는 (1) AHR 작용제를 포함하는 제 2 배지인 경우, FBS, 페니실린/스트렙토마이신, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, FICZ 및 비오카닌 A를 포함할 수 있고, 또는 (2) 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지인 경우, FBS, 페니실린/스트렙토마이신, SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, OKT3 및 UCHT1를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 b)의 제 2 배지 중, (1) AHR 작용제를 포함하는 제 2 배지는 8 내지 12%의 FBS, 0.1 내지 2%의 페니실린/스트렙토마이신, 10 내지 30 ng/ml의 인간 SCF, 10 내지 30 ng/ml의 인간 FLT3, 100 내지 500 IU/ml의 인간 IL-2, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-7, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-15, 1 내지 3 uM의 FICZ 및 10 내지 30 μg/ml의 비오카닌 A를 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있고, 더욱 구체적으로, 10%의 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml의 인간 SCF, 20 ng/ml의 인간 FLT3, 200 IU/ml의 인간 IL-2, 20 ng/ml의 인간 IL-7, 20 ng/ml의 인간 IL-15, 2 uM의 FICZ 및 20 μg/ml의 비오카닌 A를 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b)의 제 2 배지 중, (1) 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지는 8 내지 12 %의 FBS, 0.1 내지 2%의 페니실린/스트렙토마이신, 10 내지 30 ng/ml의 인간 SCF, 10 내지 30 ng/ml의 인간 FLT3, 100 내지 500 IU/ml의 인간 IL-2, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-7, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-15, 5 내지 15 ng/ml의 OKT3 및 5 내지 15 ng/ml의 UCHT1를 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있고, 더욱 구체적으로, 10 %의 FBS, 1 %의 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml의 인간 SCF, 20 ng/ml의 인간 FLT3, 200 IU/ml의 인간 IL-2, 20 ng/ml의 인간 IL-7, 20 ng/ml의 인간 IL-15, 10 ng/ml의 OKT3 및 10 ng/ml의 UCHT1를 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 리프로그래밍 인자가 도입된 분리된 세포는 상기 a)의 제 1 배지에서 4 내지 8 일 동안 배양한 후, 상기 b)의 제 2 배지에서 12 일 이상 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 말초혈액 단핵세포 또는 말초혈액 단핵세포를 구성하는 T 세포 아형인 CD3+CD8- 세포군에 리프로그래밍 인자를 형질전환하기 위해 리프로그래밍 인자를 발현하는 센다이바이러스를 상기 세포와 1 일 동안 배양하고, 형질전환된 세포를 iNKT 제 1 배지에서 5 일간 배양한 후, AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist)를 포함하는 iNKT 제 2 배지 또는 항-CD3 항체를 포함하는 iNKT 제 2 배지에서 12 내지 35 일간 배양하여 NKT 세포로 유도한 결과, 말초혈액 단핵세포 중 62%, CD3+CD8- 세포군중 94.1%가 iNKT 세포로 유도되었음을 확인하였다(도 1B, 도 2).
본 발명의 다른 일 실시예에서는, iNKT 제 2 배지에 AHR 작용제가 포함된 경우 또는 항-CD3 항체가 포함된 경우가 미포함된 경우보다 iNKT 세포 제조 효율이 3.7 ~ 4.7 배 이상 우수함을 확인하였다(도 4). 이는 AHR 작용제 또는 항-CD3 항체가 직접 리프로그래밍을 통한 NKT 제조방법에서 중요한 역할을 함을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "CAR 유전자"는 항체 도메인(scFv)을 포함하는 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하여, 상기 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인으로 이루어지는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 CAR 유전자는 CD19 scFv을 포함하는 CD19-CAR1 유전자 또는 CD19-CAR2 유전자, MSLN(mesothelin) scFv를 포함하는 MSLN-CAR 유전자 및 HER2(human epidermal growth factor receptor 2) scFv를 포함하는 HER2-CAR 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
고형 종양에 대한 CAR의 표적 인자로는 EGFRvIII(Morgan RA, Hum Gene Ther. 2012;23:1043-1053), MUC-1(Wilkie S, J Immunol. 2008;180:4901-4909), MAGE(Willemsen RA, Gene Ther. 2001;8:1601-1608), CEA(Emtage PC, Clin Cancer Res. 2008;14:8112-8122), PSMA, GD2, CA125, Her2 및 MSLN, FAP, VEGFR(Kakarla S, Cancer J. 2014;20:151-155) 등을 이용할 수 있다고 알려져 있다.
또한, 상기 CD19는 세포표면항원무리(Cluster of Differentiation; CD)로서 면역표현형에 따라 세포 표면 분자를 식별하는 번호 19를 할당한 것으로, 상기 CD19는 B 림프구의 표지자를 의미한다. 상기 CD19는 대부분의 B-세포 악성 종양 암세포에서 발현하여 이들 암종에 대한 이상적인 표적을 제공하는 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 상기 CAR 유전자는 i) CD8 리더(Leader), CD19 scFv, CD8 힌지(Hinge), CD8 막 관통 도메인 및 Fc-γ(Gamma) 수용체를 포함하는 CAR 유전자(CD19-CAR1 유전자); ii) CD8 리더, CD19 scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 포함하는 CAR 유전자(CD19-CAR2 유전자); iii) CD8 리더, MSLN(Mesothelin) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자(MSLN-CAR 유전자); 및 iV) CD8 리더, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자(HER2-CAR 유전자);로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CD8 리더는 서열번호 1, CD19 scFv는 서열번호 2, MSLN scFv는 서열번호 3, HER2 scFv는 서열번호 4, CD8 힌지는 서열번호 5, CD8 막 관통 도메인은 서열번호 6, Fc-γ 수용체는 서열번호 7, CD28 세포내 도메인은 서열번호 8, CD3ζ은 서열번호 9, 상기 CAR 유전자를 이중 시스트론을 구성하는 벡터에 클로닝하기 위해 삽입하는 IRES는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CAR 유전자는 GFP(Green Fluorescent Protein)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 GFP는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 11의 염기서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11의 염기서열은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(Homology) 또는 동일성(Identity)을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11의 염기서열과 상응하는 기능을 나타내는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 용어 "상동성(Homology) 및 동일성(Identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(Conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(Homologous) 또는 동일한(Identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(Stringent Condition)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology).
본 발명에 있어서, 상기 CAR 유전자는 전술한 리프로그래밍 인자의 도입 방법과 동일한 방법으로 세포 내에 도입될 수 있으며, 특히, 리프로그래밍 인자와 CAR 유전자는 원하는 시간 및 조건 하에서 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다.
상기 CAR 유전자는 상기 리프로그래밍 인자 도입시, 상기 a)의 제 1 배지에서 배양시 또는 상기 b)의 제 2 배지에서 배양시 중 선택되는 어느 하나의 시점에서 상기 분리된 세포에 도입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 도 9의 파란색으로 표시된 바와 같이 CAR를 발현하는 렌티바이러스는 리프로그래밍 인자와 동시에(Day 0), 리프로그래밍 인자 도입 후 iNKT 제 1 배지(a)의 제 1 배지)에서 배양하는 단계 또는 iNKT 제 2 배지(b)의 제 2 배지)에서 배양하는 단계 중 선택하여 배양 배지에 접종함으로써 iNKT 세포로 전환되는 과정의 PBMC 또는 리포그래밍 유도 과정의 세포에 형질전환될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 NKT 세포가 아닌 분리된 세포에 CAR 유전자를 리프로그래밍 인자와 도입하여 CAR를 발현하는 NKT 세포를 생산할 수 있다는데 의의가 있다. 또한, CAR 유전자를 도입하는 시기를 리프로그래밍 배양 과정에서 당업자가 원하는 대로 정할 수 있는 것에 의의가 있다.
또한, 상기 CAR 유전자는 이를 발현하는 바이러스 벡터를 상기 제 1 배지 배양 단계 또는 제 2 배지 배양 단계 중 어느 하나 이상의 배양 단계에 첨가한 경우, 첨가 후 4 내지 28 일간 더 배양하여 CAR 유전자를 유도 중인 NKT 세포에 형질전환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 말초혈액 단핵세포를 CAR-NKT 세포로 리프로그래밍 유도하기 위해 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 센다이바이러스를 말초혈액 단핵세포와 함께 1 일 동안 배양하고, 형질전환된 세포를 iNKT 제 1 배지에서 5-6 일간 배양한 후, 항-CD3 항체를 포함하는 iNKT 제 2 배지 또는 AHR 작용제를 포함하는 iNKT 제 2 배지에서 12-35 일간 배양하였다(도 9). 이 과정에서, CD19-CAR1 유전자, CD19-CAR2 유전자, MSLN-CAR 유전자 또는 HER2-CAR 유전자를 발현하는 렌티바이러스를 리프로그래밍 인자와 동시에 또는 리프로그래밍 인자 도입 후 형질전환 도입하여 CAR-iNKT 세포를 제조하였다(도 9).
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 방법에 따라 CAR-iNKT 세포 제조시 CD19-CAR-iNKT 세포가 20.3%의 효율로(도 10), MSLN-CAR-iNKT 세포가 28.8%의 효율로(도 11), HER2-CAR-iNKT 세포가 33.1%의 효율로(도 12) 제조됨을 확인하였다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포는 CD56+, CD3+ 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "CD56+" 및 "CD3+"은 NKT 세포의 표면에 있는 지표로서, 본 발명에서는 CD56+, CD3+ 및 이들의 조합의 발현을 유세포 분석기(Flow Cytometry)를 통해 분석하여 NKT 세포가 제조된 것을 확인하였다(도 1B, 도 2, 도 4, 도 10 ~ 12).
또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포는 다양한 암세포에 대한 살상능이 우수한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, iNKT 세포와 공배양된 암세포에서 암세포 용해능을 갖는 CD107a+세포의 빈도(%)가 증가하고(도 5), 혈액암 세포주, 대장암 세포주, 전립선암 세포주, 간암 세포주, 폐암 세포주, 췌장암 세포주에 대한 iNKT 세포의 살상능을 확인한 결과, 우수한 살상능을 나타내는 것을 확인하였다(도 6). 또한, 췌장암이 발생한 마우스 모델에 iNKT 세포 주입 후 14일차에 종양 크기가 iNKT 세포를 주입하지 않은 대조군에 비해 현저히 감소한 것을 확인하였다(도 7).
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에서는, CD19-CAR2 유전자, MSLN-CAR 유전자 또는 HER2-CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포가 CAR 유전자가 도입되지 않은 iNKT 세포보다 높은 암세포 살상능을 나타내는 것을 확인하였다(도 13 ~ 15).
본 발명의 다른 양태는 상기 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 iNKT 세포는 전술한 바와 같이, 다양한 암세포에 대한 살상능이 우수한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 세포치료제 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 포함함으로써 암 예방 또는 치료 효능이 있는 것일 수 있다.
상기 세포치료제 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 iNKT 세포를 1.0x104 내지 1.0x1010개 세포/ml, 바람직하게는 1.0x105 내지 1.0x109개 세포/ml로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포치료제 조성물은 약학 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 약학 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터(Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(Base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제 조성물 또는 이의 약학 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 암 치료에 사용되는 다른 세포와 함께 또는 그러한 세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 세포치료제 조성물은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 구체적으로 0.001 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 iNKT 세포의 면역반응 등에 의해 예방 또는 치료의 결과를 나타내는 암일 수 있다. 상기 암은 예를 들면, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종암, 골원성 육종, 골수암, 골수종, 골수이형성증, 림프종, 비-호지킨 림프종, 혈액암, 흑색종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프혈관내피육종, 활액막종, 중피종, 어윙 육종, 위암, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 결장암, 대장암, 직장암, 췌담관암, 췌장암, 담도암, 담낭암, 간암, 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 림프종, 전백혈병, 백혈병, 급성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), 급성 림프성 백혈병(ALL); 만성 백혈병, 만성 골수 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선암종, 갑상선유두암, 낭종암, 갑상선 수질암, 기관지원성암종, 신장 세포 암종, 간암, 담즙 관 암종, 융모 막암종, 정상피종, 태생성 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 폐암, 소세포 폐암종, 방광 암종, 상피 암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 성상세포종, 신세포암, 교모세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 육종일 수 있고, 구체적으로는 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 대장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 결장암, 신경교종, 흑색종, 림프종, 직장암, 혈액암 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 혈액암, 대장암, 전립선암, 간암, 폐암, 췌장암 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 암은 CAR-iNKT 세포의 면역반응 등에 의해 예방 또는 치료의 결과를 나타내는 암일 수 있으며, 예를 들면, CD19, MSLN 또는 HER2 중 어느 하나 이상의 발현과 연관된 암, 예를 들면, 골수이형성증, 골수이형성 증후군. 전백혈병, 혈액암, 급성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), 급성 림프성 백혈병(ALL); 만성 백혈병, 만성 골수 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종, 림프종, 골수종, 췌장암, 담도암, 폐암, 난소암, 유방암, 자궁암, 직장암, 대장암, 결장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 신경교종, 흑색종, 편평세포 암종, 두경부암, 신세포암, 교모세포종, 수모세포종, 육종 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 혈액암, 대장암, 전립선암, 간암, 폐암, 췌장암 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 포함함으로써 암 예방 또는 치료 효능이 있는 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 iNKT 세포를 1.0x104 내지 1.0x1010개 세포/ml, 바람직하게는 1.0x105 내지 1.0x109개 세포/ml로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(Non-naturally Ocuring Carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 또는 좌제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 구체적으로 0.001 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 "개체"는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 세포치료제 조성물 또는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 하나의 양태는, a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제 1 배지를 함유하는 제 1 용기; 및 b) (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR 작용제, 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지를 함유하는 제 2 용기;를 포함하는 iNKT 세포 제조용 직접 리프로그래밍 배지 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 상기 제 1 배지를 함유하는 제 1 용기 및 포함하는 제 2 배지를 함유하는 제 2 용기를 포함하여 iNKT 세포 제조용 직접 리프로그래밍 배지로 사용될 수 있는 도구를 의미한다. 상기 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 제 1 배지 및 제 2 배지가 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있으며, 상기 제 1 배지 및 제 2 배지는 각각 1회 투여 용량의 단위 용량 형태로 포장되어 있을 수 있다.
상기 키트 내의 상기 제 1 배지 및 제 2 배지는 당업자의 실험 계획에 따라 적절한 시기에 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 제 1 배지 및 제 2 배지 각각의 첨가량, 첨가 방법과 첨가 빈도 등을 기재한 사용설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 세포로부터 NKT 세포를 직접 생산함으로써 생산 공정이 간소화되고 생산 시간이 최소 18-22 일 정도로 종래의 리프로그래밍 기술을 이용하여 NKT 세포를 생산하였던 방법에 비해 짧아 이에 따라 비용이 절감되며, NKT 세포 생산 효율이 최대 94.1%로 우수하고(CAR 유전자를 추가 도입시 33.1%), 유도 만능 줄기세포를 경유하지 않고 생산됨에 따라 안전성이 확보되어, 종래 리프로그래밍 기술과 차별화되는 우수한 NKT 세포 생산 효과가 있다.
아울러, 본 발명은 종래의 직접 체취, 줄기세포 분화 과정 등을 통해 NKT 세포를 수득하는 방법과는 달리, NKT 세포와 계통이 다르고 수집이 용이한 세포를 리프로그래밍 배지에서의 배양을 통해 NKT 세포를 직접 제조할 수 있는 바, 세포 종류, 품질에 대한 광범위한 선택지를 제공할 수 있음에 의의가 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포는 전술한 바와 같이 암세포 살상능이 우수한 바, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 및 약학 조성물로 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: PBMC로부터 NKT 세포로의 직접 리프로그래밍
분리된 말초혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell: PBMC)를 배양액에서 2 일에 한번씩 배지를 교환하며 4 일간 배양하였다.
상기 PBMC 세포에 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)를 형질전환하기 위해 리프로그래밍 인자를 발현하는 센다이바이러스 시스템[Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc 발현 RNA 기반 센다이바이러스(CytoTune 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Thermo Scientific); OSKM-SeV]을 이용하였다. 구체적으로, PBMC 세포를 리프로그래밍 인자로 형질 전환시키기 위해 상기 센다이바이러스(5 MOI), PBMC 세포 및 폴리브렌(4 μg/ml)을 함께 1 일 동안 표준 배양 배지(SCM 배지)에서 배양 후 신선한 배지로 교체하였다. 다음 날 48-웰 플레이트에 2x105 개의 상기 형질전환된 세포를 iNKT 제 1 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin), 100 ng/ml 인간 SCF, 100 ng/ml 인간 FLT3, 20 ng/ml 인간 IL-3, 20 ng/ml 인간 IL-6, 5 uM CHIR99021을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 5 일간 배양한 후, AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist)를 포함하는 iNKT 제 2 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml 인간 SCF, 20 ng/ml 인간 FLT3, 200 IU/ml 인간 IL-2, 20 ng/ml 인간 IL-7, 20 ng/ml 인간 IL-15, 2 uM FICZ(6-formylindolo[3,2-b]carbazole) 및 20 μg/ml 비오카닌 A(Biochaninin A)를 포함하는 StemSpan SFEM II) 또는 항-CD3 항체를 포함하는 iNKT 제 2 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml 인간 SCF, 20 ng/ml 인간 FLT3, 200 IU/ml 인간 IL-2, 20 ng/ml 인간 IL-7, 20 ng/ml 인간 IL-15, 10 ng/ml OKT3 및 10 ng/ml UCHT1를 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 12-35 일간 배양하여 NKT 세포로 유도하였다(도 1A).
상기 직접 리프로그래밍을 통해 NKT 세포가 제조되었는지 확인하기 위해, CD56 항체, CD3 항체로 상기 세포를 염색 후 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 NKT 세포(CD56+ 및 CD3+)군을 분석하였다. 구체적으로, 직접 리프로그래밍을 통해 유도된 NKT(iNKT) 세포를 형광이 부착된 CD56 및 CD3에 대한 항체가 첨가된, 1% BSA(Bovine Serum Albumin) 및 2 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid)를 포함한 인산염완충액(FACS 완충액)으로 20분간 상온에서 반응 후, 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수한 후, FACS(BD Bioscience)로 분석하였다.
그 결과, PBMC로부터 직접 리프로그래밍을 통해 약 62% 효율로 CD56+CD3+ NKT 세포가 제조됨을 확인하였다(도 1B).
실시예 2: T 세포 아형으로부터 NKT 세포로의 직접 리프로그래밍
PBMC를 구성하는 T 세포 아형의 NKT 제조 효율을 분석하기 위해 FACSAriaII(BD)를 이용하여 PBMC를 CD3+CD8-, CD3+CD8+, CD3-CD8-, CD3-CD8+ 세포군으로 분리한 후 실시예 1의 방법으로 직접 리프로그래밍을 실시하였다. 직접 리프로그래밍 후 24 일째, 실시예 1의 방법으로 FACS 분석을 실시한 결과, CD3+CD8- 세포로부터 직접 리프로그래밍을 통해 약 94.1% 효율로 CD56+CD3+ NKT 세포가 제조됨을 확인하였다(도 2).
상기 실시예 1 및 2의 결과를 통해, 리프로그래밍 인자의 도입에 따른 직접 리프로그래밍에 의해 분리된 체세포로부터 NKT 세포가 직접 제조됨을 확인하였다.
실시예 3: 리프로그래밍 배지 최적화
3-1: iNKT 제 1 배지 및 제 2 배지의 조성 최적화
실시예 1의 iNKT 제 1 배지 및 제 2 배지의 조성에서 CHIR99021(CT), SR1(SR), FICZ 첨가 여부에 따른 NKT 생산 효율을 확인하였다. 구체적으로, 도 3의 표와 같이 iNKT 제 1 배지 및 제 2 배지 내 CHIR99021(CT), SR1(SR) 첨가 유무를 각각 달리한 배지 A ~ F를 제조하였다. 배지 C 및 F의 경우 SR1(SR) 대신 AHR 작용제인 FICZ를 첨가하였다. PBMC 세포를 서로 다른 배지 조성으로 제조한 iNKT 제 1 배지 및 제 2 배지를 이용하여 실시예 1의 방법으로 직접 리프로그래밍을 실시하고 NKT 세포의 제조 효율을 분석하였다.
그 결과, 도 3과 같이 CHIR99021(CT)는 iNKT 제 1 배지에만 첨가하고, iNKT 제 2 배지에는 FICZ를 첨가한 배지 C에서 iNKT 생산 효율이 각각 40.5%로 우수한 것을 확인하였다.
3-2: iNKT 제 2 배지의 AHR 작용제 또는 항-CD3 항체 첨가 여부에 따른 NKT 생산 효율
실시예 1의 iNKT 제 2 배지의 조성에서 AHR 작용제인 FICZ 또는 비오카닌 A, 항-CD3 항체인 OKT3 또는 UCHT1를 첨가하였을 때의 NKT 생산 효율을 확인하였다. 구체적으로,
iNKT 제 2 배지에 AHR 작용제 또는 항-CD3 항체를 첨가한 경우, 첨가하지 않은 경우에 비해 NKT 생산 효율이 3.7 ~ 4.7 배 이상 증가됨(무첨가시 10.0% -> FICZ 첨가시 42.9%, 비오카닌 A 첨가시 39.6%, OKT3 첨가시 47.7%, UCHT1 첨가시 36.9%)을 확인하였다(도 4).
상기 실시예의 결과는 NKT 세포로의 직접 리프로그래밍 단계에서 AHR 작용제 또는 항-CD3 항체가 NKT 생산 수율을 증진하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: CD107a+ 세포 정량 분석
실시예 1에서 제조된 iNKT 세포의 암세포 살상능을 검증하기 위해, iNKT 세포를 암세포와 공배양한 후 발현되는, 암세포 용해능을 갖는 CD107a+ 세포의 빈도를 정량 분석하였다. 구체적으로, 암세포인 HCT116(Human Colon Cancer cells), NIC-H460(Human Lung Cancer Cells), HepG2(Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cells), Mia-paca-2(Human Pancreas Ductal Adenocarcinoma cells) 각각 1x106개 세포/ml와 iNKT 세포 1x106개 세포/ml를 6-웰 플레이트에 각각 1 ml씩 분주한 후, 400g로 1분간 원심분리하고, 이를 2 시간 또는 16 시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에서 배양한 후, 유세포 분석기를 통해 CD107a+ 세포의 빈도를 확인하였다. 구체적으로, CD107a+ 세포의 빈도는 iNKT 세포를 형광이 부착된 CD56-PE, CD3-APC 및 CD107a-FITC 항체가 첨가된 FACS 완충액으로 상온에서 20분간 반응 후, FACS로 CD56+CD3+ 세포군을 게이팅(Gating)하여 분석하였다.
그 결과, 암세포와 공배양이 이루어지지 않은 대조군에 비하여 공배양된 iNKT 세포에서 CD107a+ 세포의 빈도(%)가 증가하였다(도 5).
실시예 5: iNKT 세포의 암세포 살상능 측정
실시예 1에서 제조된 iNKT 세포의 암세포 살상능을 측정하기 위해, 칼세인-AM(Calcein-AM)을 사용한 세포 살상능 측정법을 실시하였다. 구체적으로, 암세포인 Raji(Raji B, Human B Lymphocyte; Burkitt's Lymphoma), SNU-817(Human B-lymphoblastoid Cells), K562(Human Immortalised Myelogenous Leukemia Cells), HCT116, PC3(Human Prostate Cancer Cells), HepG2, NIC-H460, Mia-paca-2를 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 각각 1x105개 세포/ml이 되도록 희석한 후, 25μM이 되도록 칼세인-AM을 첨가하고, 37℃에서 1 시간 배양 후에 DMEM 배지로 세척하여, 칼세인 표지 표적 암세포를 제작하였다.
iNKT 세포를 배양액을 이용하여 각각 0.25x105개 세포/ml, 1x105개 세포/ml, 2.5x105개 세포/ml의 밀도로 희석하여 준비한 후에 96-웰 플레이트에 각각 100ml씩 분주하였다. 제작한 칼세인 표지 표적 암세포(1x105개 세포/ml)를 100ul/well씩 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 400g로 1 분간 원심분리하고, 이를 4 시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에 배양한 후, 각 웰로부터 상층액 100 ul를 취하여 형광 플레이터 리더(485 nm/535 nm)로 측정하였다. 세포살상능(%)은 아래 수식에 따라서 산출하였다.　
암세포 살상능(%)={(측정값-최소값)/(최대값-최소값)}x100
상기 식에서, 최소값은 칼세인 표지 표적 암세포만 존재하는 웰의 측정값이고, 최대값은 칼세인 표지 표적 암세포에 0.1% TritonX-100을 첨가해서 세포를 완전 용해한 웰의 측정값이다.
그 결과, iNKT 세포가 암세포에 대하여 높은 살상능을 보유하는 것을 확인하였으며, iNKT 세포의 세포수에 비례하게 암세포 살상능이 증가함을 확인하였다(도 6).
실시예 6: iNKT 세포의 생체내 암세포 살상능 검증
생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25 g)의 등에 루시퍼라제(Luciferase)를 발현하는 CFPAC-1(Human Huctal Pancreatic Adenocarcinoma Cells) 2x106개 세포/ml 5 ml을 피하 주입(Subcutaneous Injection)하여, 췌장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였다. 다음날, 음성 대조군으로 PBS 200 ul 또는 실험군으로 iNKT(1x107개 세포/200 ul PBS)를 주입한 후 7일 간격으로 종양 크기를 IVIS 100(PerkinElmer)를 통해 확인하였다.
그 결과, PBS 또는 iNKT 주입 후 14일차에서 음성 대조군에서 형성된 종양 크기[1.21x1010 복사휘도(Radiance)]에 비해 iNKT 실험군에서 형성된 종양 크기(8.01x109 복사휘도)가 현저히 감소하였음을 확인하였다(도 7).
실시예 7: CAR를 코딩하는 이중 시스트론 렌티바이러스 벡터 구축
CAR(Chimeric Antigen Receptor)를 코딩하는 이중 시스트론 렌티바이러스 벡터를 제작하기 위해, CD19, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) 또는 MSLN(Mesothelin)에 각각 결합하는 4종의 CAR 유전자를 제작하였다. 상기 각 CAR 유전자는 항체 도메인(scFv)을 포함하는 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하여 구성되었다. 구체적으로, 상기 각 CAR 유전자는 하기와 같이 구성되었다(도 8).
i) CD8 리더(Leader)(서열번호 1), CD19 scFv(서열번호 2), CD8 힌지(Hinge)(서열번호 5), CD8 막 관통(Transmembrane, TM) 도메인(Domain)(서열번호 6), Fc-γ(Gamma) 수용체(서열번호 7) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)(서열번호 11)를 포함하는 CD19-CAR1 유전자;
ii) CD8 리더(서열번호 1), CD19 scFv(서열번호 2), CD8 힌지(서열번호 5), CD8 막 관통 도메인)(서열번호 6), CD28 세포내(Intracellular) 도메인(서열번호 8), CD3ζ(Zetta)(서열번호 9), IRES(Internal Ribosome Entry Site)(서열번호 10) 및 GFP(서열번호 11)를 포함하는 CD19-CAR2 유전자;
iii) CD8 리더(서열번호 1), MSLN(Mesothelin) scFv(서열번호 3), CD8 힌지(서열번호 5), CD8 막 관통 도메인(서열번호 6), CD28 세포내 도메인(서열번호 8), CD3ζ(서열번호 9), IRES(서열번호 10) 및 GFP(서열번호 11)를 포함하는 MSLN-CAR 유전자; 및
iV) CD8 리더(서열번호 1), HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv(서열번호 4), CD8 힌지(서열번호 5), CD8 막 관통 도메인(서열번호 6), CD28 세포내 도메인(서열번호 8), CD3ζ(서열번호 9), IRES(서열번호 10) 및 GFP(서열번호 11)를 포함하는 HER2-CAR 유전자.
상기 IRES는 CAR 유전자를 이중 시스트론을 구성하는 벡터에 클로닝하기 위해 삽입하였다. 상기 4종의 CAR 유전자를 포함하는 각 벡터는 CAR1(Addgene ID:113014)로부터 도 8의 각 도메인을 합성하고 오버랩 PCR(Overlap PCR, Gibson Assembly)을 통해 CAR를 발현하는 렌티바이러스를 제작하였다.
실시예 8: PBMC로부터 NKT 세포로의 직접 리프로그래밍을 이용한 CAR-iNKT 제조
PBMC를 배양액(2.5% StemPro-34 Nutrient Supplement, 2 mM Glutamax I, 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml 인간 IL-3, 20 ng/ml 인간 IL-6, 100 ng/ml 인간 SCF, 100 ng/ml 인간 FLT3을 포함하는 Stempro SFEM II)에서 2일에 한번씩 배지 교환하며 4 일간 배양하였다.　
상기 PBMC 세포에 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc) 및 실시예 7에서 제작한 CD19-CAR1 유전자, CD19-CAR2 유전자, MSLN-CAR 유전자 또는 HER2-CAR 유전자를 형질전환하기 위해 리프로그래밍 인자를 발현하는 센다이바이러스 시스템[Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc 발현 RNA 기반 센다이바이러스(CytoTune 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Thermo Scientific); OSKM-SeV]와 실시예 7의 4종의 CAR를 발현하는 4종의 렌티바이러스를 이용하였다. 구체적으로, PBMC 세포를 리프로그래밍 인자로 형질전환시키기 위해 상기 센다이바이러스(5 MOI), PBMC 세포 및 폴리브렌(4 μg/ml)을 함께 1 일 동안 표준 배양 배지(SCM 배지)에서 배양 후 신선한 배지로 교체하였다. 다음 날 48-웰 플레이트에 2x105 개의 상기 형질전환된 세포를 실시예 1의 iNKT 제 1 배지에서 5-6 일간 배양한 후, 항-CD3 항체를 포함하는 iNKT 제 2 배지 또는 AHR 작용제를 포함하는 iNKT 제 2 배지에서 12-35 일간 배양하여 NKT 세포로 유도하는 과정에서, CD19-CAR1 유전자, CD19-CAR2 유전자, MSLN-CAR 유전자 또는 HER2-CAR 유전자를 발현하는 렌티바이러스(2 MOI) 및 폴리브렌(4 mg/ml)을 첨가하고 4-28 일간 더 배양하여, 유도된 NKT 세포에 CAR 유전자가 형질도입되도록 하였다(CAR-iNKT 세포)(도 9). CAR를 발현하는 렌티바이러스는 도 9와 같이 리프로그래밍 인자와 동시에(Day 0), 리프로그래밍 인자 도입 후 iNKT 제 1 배지에서 배양하는 단계 또는 iNKT 제 2 배지에서 배양하는 단계 중 선택하여 배양 배지에 접종함으로써 PBMC 세포로부터 NKT 세포로 전환되는 리프로그래밍 과정의 세포에 형질전환되었다.
상기 직접 리프로그래밍을 통해 CD19-CAR1 유전자, CD19-CAR2 유전자, MSLN-CAR 유전자 또는 HER2-CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포가 제조되었는지 확인하기 위해, CD56 항체, CD3 항체, CD19 항원, MSLN 항원, HER2 항원으로 상기 세포를 염색 후 유세포 분석기를 이용하여 CD56+CD3+ CD19-CAR-iNKT 세포군, CD56+CD3+ MSLN-CAR-iNKT 세포군, CD56+CD3+ HER2-CAR-iNKT 세포군을 분석하였다. 구체적으로, CD19-CAR1 유전자가 도입된 iNKT 세포(CD19-CAR-iNKT 세포)의 경우, 실시예 1과 동일한 방법으로 FACS 분석하였다. MSLN-CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포(MSLN-CAR-iNKT 세포) 또는 HER2-CAR 유전자가 도입된 iNKT 세포(HER2-CAR-iNKT 세포)의 경우, 1차로 CD3-PE(BD Bioscience) 및 MSLN 항원-비오틴(Biotin) 또는 HER2 항원-비오틴이 첨가된 FACS 완충액으로 상온에서 20분 반응 후, 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수하였다. 2차로 아비딘(Avidin)-APC(Allophycocyanin)가 첨가된 FACS 완충액으로 상온에서 20분 반응 후, 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수하고 FACS 분석하였다.
그 결과, CD56+CD3+ CD19-CAR-iNKT 세포가 20.3%의 효율로(도 10), CD56+CD3+ MSLN-CAR-iNKT 세포가 28.8%의 효율로(도 11), CD56+CD3+ HER2-CAR-iNKT 세포가 33.1%의 효율로(도 12) 제조됨을 확인하였다.
실시예 9: CD19-CAR2가 도입된 iNKT 세포의 암세포 살상능 측정
실시예 1의 iNKT 세포 및 실시예 8의 CD19-CAR2가 도입된 iNKT 세포(CD19-CAR2-iNKT 세포)를 각각 0.25x105개 세포/ml 또는 1x105개 세포/ml의 세포수 밀도가 되도록 배양액으로 희석한 후, 96-웰 플레이트에 각각 100 ul씩 분주하였다. 암세포인 Raji(Raji B), SNU-817를 이용하여 실시예 5의 방법으로 칼세인 표지 표적 암세포를 제작하였다.　칼세인 표지 표적 암세포 1x105개 세포/ml를 100ul/well씩 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 실시예 5의 방법으로 암세포 살상능을 측정하였다.
그 결과, 표적 암세포에 대해 CD19-CAR2-iNKT 세포가 대조군 iNKT 세포보다 높은 살상능을 나타내는 것을 확인하였다(도 13).
실시예 10: MSLN-CAR 또는 HER2-CAR가 도입된 iNKT 세포의 암세포 살상능 측정
실시예 1의 iNKT 세포, 실시예 8의 MSLN-CAR가 도입된 iNKT 세포(MSLN-CAR-iNKT 세포) 및 실시예 8의 HER2-CAR가 도입된 iNKT 세포(HER2-CAR-iNKT 세포)를 각각 0.25x105개 세포/ml 또는 1x105개 세포/ml의 세포수 밀도가 되도록 배양액으로 희석한 후, 96-웰 플레이트에 각각 100 ul씩 분주하였다. 암세포인 PC3(PC-3), CFPAC-1, HepG2를 이용하여 실시예 5의 방법으로 칼세인 표지 표적 암세포를 제작하였다.　칼세인 표지 표적 암세포 1x105개 세포/ml를 100ul/well씩 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 실시예 5의 방법으로 암세포 살상능을 측정하였다.
그 결과, 표적 암세포에 대해 MSLN-CAR-iNKT 세포 또는 HER2-CAR-iNKT 세포가 대조군 iNKT 세포보다 높은 살상능을 나타내는 것을 확인하였다(도 14 ~ 15).
상기 실시예의 결과로부터, 분리된 세포를 직접 리프로그래밍을 이용하여 항암 활성을 나타내는 NKT 세포로 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 직접 리프로그래밍 시 CAR 유전자를 도입하여 항암 활성이 더욱 우수한 CAR 유전자가 도입된 NKT 세포를 제조할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. I) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 또는 II) 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 도입된 분리된 세포를 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 저해제(Inhibitor)를 포함하는 제 1 배지; 및 b) (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 작용제(Agonist), 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지;에서 순차적으로 배양하여 NKT 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, iNKT(induced Natural Killer T) 세포 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 성장인자는 SCF(Stem Cell Factor), FLT3(FMS-like Tyrosine Kinase) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, iNKT 세포 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL(Interleukin)-3, IL-6, IL-2, IL-7, IL-15 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, iNKT 세포 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 a)의 제 1 배지는 SCF, FLT3, IL-3, IL-6 및 CHIR99021를 포함하는 배지인, iNKT 세포 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 b)의 제 2 배지는 (1) SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, OKT3 및 UCHT1를 포함하는 배지, 또는 (2) SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, FICZ 및 비오카닌 A를 포함하는 배지 중 선택되는 어느 하나인, iNKT 세포 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 a)의 제 1 배지 또는 b)의 제 2 배지는 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, iNKT 세포 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 리프로그래밍 인자가 도입된 분리된 세포는 상기 a)의 제 1 배지에서 4 내지 8 일 동안 배양한 후, 상기 b)의 제 2 배지에서 12 일 이상 배양하는 것인, iNKT 세포 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct4, Oct3, Sox2, Klf4, Myc 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, iNKT 세포 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc인, iNKT 세포 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자가 도입되는 분리된 세포는 NKT 세포를 제외한 체세포인 것인, iNKT 세포 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 CAR 유전자는 상기 리프로그래밍 인자 도입시, 상기 a)의 제 1 배지에서 배양시 또는 상기 b)의 제 2 배지에서 배양시 중 선택되는 어느 하나의 시점에서 상기 분리된 세포에 도입되는 것인, iNKT 세포 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 CAR 유전자는
    i) CD8 리더(Leader), CD19 scFv, CD8 힌지(Hinge), CD8 막 관통 도메인 및 Fc-γ 수용체를 포함하는 CAR 유전자;
    ii) CD8 리더, CD19 scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 포함하는 CAR 유전자;
    iii) CD8 리더, MSLN(Mesothelin) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자; 및
    iV) CD8 리더, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, iNKT 세포 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CAR 유전자는 GFP(Green Fluorescent Protein)를 추가로 포함하는 것인, iNKT 세포 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제조된 iNKT 세포는 CD56+, CD3+ 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 것인, iNKT 세포 제조방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 iNKT 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 대장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 결장암, 신경교종, 흑색종, 림프종, 직장암, 혈액암 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 암 치료용 약학 조성물.
  19. a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제 1 배지를 함유하는 제 1 용기; 및 b) (1) 성장인자, 사이토카인 및 AHR 작용제, 또는 (2) 성장인자, 사이토카인 및 항-CD3 항체를 포함하는 제 2 배지를 함유하는 제 2 용기;를 포함하는 iNKT 세포 제조용 직접 리프로그래밍 배지 키트.
PCT/KR2020/004198 2019-03-28 2020-03-27 면역세포의 제조방법 및 그의 용도 Ceased WO2020197319A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021557872A JP7429713B2 (ja) 2019-03-28 2020-03-27 免疫細胞の製造方法及びその使用
EP20777770.7A EP3950935A4 (en) 2019-03-28 2020-03-27 Method for producing immunocytes, and use thereof
CN202080038913.6A CN113874492B (zh) 2019-03-28 2020-03-27 用于产生免疫细胞的方法及其用途
US17/598,917 US12435117B2 (en) 2019-03-28 2020-03-27 Method for producing immune cells and use thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0036265 2019-03-28
KR20190036264 2019-03-28
KR10-2019-0036264 2019-03-28
KR20190036265 2019-03-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020197319A1 true WO2020197319A1 (ko) 2020-10-01

Family

ID=72610717

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/004197 Ceased WO2020197318A1 (ko) 2019-03-28 2020-03-27 Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도
PCT/KR2020/004198 Ceased WO2020197319A1 (ko) 2019-03-28 2020-03-27 면역세포의 제조방법 및 그의 용도

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/004197 Ceased WO2020197318A1 (ko) 2019-03-28 2020-03-27 Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (2) US12435117B2 (ko)
EP (2) EP3954762A4 (ko)
JP (3) JP2022527932A (ko)
KR (2) KR102298639B1 (ko)
CN (2) CN113874493B (ko)
WO (2) WO2020197318A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4351598A4 (en) * 2021-05-14 2025-05-07 Appia Bio, Inc. MANIPULATION OF STEM CELLS FOR ALLOGENEIC CAR-T CELL THERAPIES

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112656789A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 中国科学院生态环境研究中心 Ficz在抑制肿瘤细胞迁移中的应用
KR20230039789A (ko) * 2021-09-10 2023-03-21 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 이의 감염성 질환 예방 또는 치료 용도
KR102604208B1 (ko) * 2021-09-10 2023-11-23 한국생명공학연구원 유도 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
US20250009879A1 (en) * 2021-11-22 2025-01-09 The Asan Foundation Natural killer cell-specific chimeric antigen receptor and use thereof
CN114350608B (zh) * 2022-01-27 2024-05-28 昭泰英基生物医药（香港）有限公司 一种诱导t细胞重编程为类nk细胞的组合物及其应用
CN114958771B (zh) * 2022-06-27 2023-12-05 广东康盾创新产业集团股份公司 一种ipsc-car-nk细胞的制备方法
KR20240066123A (ko) 2022-11-07 2024-05-14 마루테라퓨틱스 주식회사 Nk 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법
WO2024102860A1 (en) * 2022-11-09 2024-05-16 Shoreline Biosciences, Inc. Engineered cells for therapy
CN115804776A (zh) * 2022-12-16 2023-03-17 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 一种芳香烃受体抑制剂和5-氟尿嘧啶合用在治疗抑制肿瘤药物中的应用
WO2024153172A1 (zh) * 2023-01-19 2024-07-25 中国科学院动物研究所 一种靶向msln art-nk细胞及其制备方法
WO2025033948A1 (ko) * 2023-08-07 2025-02-13 마루테라퓨틱스 주식회사 유전자 고효율 발현이 가능한 비바이러스성 듀얼 플라스미드 벡터와 이를 발현하는 줄기세포 및 분화된 조혈계 세포
AU2024201132A1 (en) * 2023-09-20 2025-04-10 Uci Therapeutics Inc. Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
CN117660335A (zh) * 2023-12-14 2024-03-08 广州百康细胞生命科技有限公司 一种使用化学重编辑法将体细胞转化成免疫细胞的方法
WO2025130895A1 (zh) * 2023-12-19 2025-06-26 苏州沙砾生物科技有限公司 一种免疫细胞的制备方法及其用途
CN118186007B (zh) * 2024-03-18 2025-02-25 广州市新一代生物工程有限公司 一种基于prf1基因提高car-nk细胞治疗效果的方法
CN118240758B (zh) * 2024-04-12 2025-04-01 深圳泽医细胞治疗集团有限公司 一种免疫细胞的培养基及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150087727A (ko) * 2014-01-22 2015-07-30 한국생명공학연구원 섬유아세포로부터 조혈줄기세포로의 직접 역분화 유도 방법
KR20180063333A (ko) * 2015-10-20 2018-06-11 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 면역 세포로의 만능 줄기 세포의 지정된 분화 방법
WO2018195175A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-25 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Antigen-specific immune effector cells

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2438160T3 (en) * 2009-06-05 2016-01-11 Cellular Dynamics Int Inc Reprogramming of T cells and hematopoietic cells
ES2754394T3 (es) 2010-09-08 2020-04-17 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Receptores de antígenos quiméricos con una región bisagra optimizada
EP2841563B1 (en) * 2012-04-24 2019-06-12 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
EP3134515B1 (en) 2014-04-24 2019-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products
NZ733213A (en) * 2014-12-31 2022-10-28 Celularity Inc Natural killer cells and uses thereof
CN113862292B (zh) * 2015-01-29 2024-12-27 明尼苏达大学董事会 嵌合抗原受体、组合物以及方法
CN106349389B (zh) 2015-07-21 2019-11-15 科济生物医药（上海）有限公司 肿瘤特异性抗egfr抗体及其应用
JP7114490B2 (ja) 2016-06-24 2022-08-08 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
US20200155609A1 (en) * 2017-05-22 2020-05-21 Transfusion Health Llc Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using pten inhibitors
CN107384949B (zh) * 2017-06-27 2019-01-15 闾民 表达GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞及制备、应用
KR102167548B1 (ko) * 2017-09-21 2020-10-19 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
WO2019059713A2 (ko) * 2017-09-21 2019-03-28 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150087727A (ko) * 2014-01-22 2015-07-30 한국생명공학연구원 섬유아세포로부터 조혈줄기세포로의 직접 역분화 유도 방법
KR20180063333A (ko) * 2015-10-20 2018-06-11 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 면역 세포로의 만능 줄기 세포의 지정된 분화 방법
WO2018195175A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-25 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Antigen-specific immune effector cells

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGELOS, MATHEW G. ET AL.: "Aryl hydrocarbon receptor inhibition promotes hematolymphoid development from human pluripotent stem cells", BLOOD, vol. 129, no. 26, 2017, pages 3428 - 3439, XP055743540 *
CAS, no. 556813-39-9
EMTAGE PC, CLIN CANCER RES, vol. 14, 2008, pages 8112 - 8122
F.M. AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
KAKARLA S, CANCER J, vol. 20, 2014, pages 151 - 155
KARLINALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
METHODS ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
MORGAN RA, HUM GENE THER, vol. 23, 2012, pages 1043 - 1053
See also references of EP3950935A4
WILKIE S, J IMMUNOL., vol. 180, 2008, pages 4901 - 4909
WILLEMSEN RA, GENE THER, vol. 8, 2001, pages 1601 - 1608
YE LI; HERMANSON DAVID L; MORIARITY BRANDEN S; KAUFMAN DAN S: "Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity", CELL STEM CELL, vol. 23, no. 2, 1 August 2018 (2018-08-01), pages 181 - 192, XP055700643, ISSN: 1934-5909, DOI: 10.1016/j.stem.2018.06.002 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4351598A4 (en) * 2021-05-14 2025-05-07 Appia Bio, Inc. MANIPULATION OF STEM CELLS FOR ALLOGENEIC CAR-T CELL THERAPIES

Also Published As

Publication number Publication date
EP3954762A4 (en) 2023-01-18
CN113874493A (zh) 2021-12-31
EP3950935A4 (en) 2023-06-07
CN113874492A (zh) 2021-12-31
JP7429713B2 (ja) 2024-02-08
KR102298640B1 (ko) 2021-09-07
CN113874493B (zh) 2024-05-10
EP3954762A1 (en) 2022-02-16
KR102298639B1 (ko) 2021-09-07
US12435117B2 (en) 2025-10-07
CN113874492B (zh) 2024-03-19
EP3950935A1 (en) 2022-02-09
JP2022528086A (ja) 2022-06-08
US20220160769A1 (en) 2022-05-26
WO2020197318A1 (ko) 2020-10-01
US20220184128A1 (en) 2022-06-16
JP2022527932A (ja) 2022-06-07
KR20200115358A (ko) 2020-10-07
KR20200115357A (ko) 2020-10-07
JP2023179554A (ja) 2023-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020197319A1 (ko) 면역세포의 제조방법 및 그의 용도
WO2018217064A2 (ko) 형질전환된 t세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
JP7058728B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の製造方法及びその用途
WO2020101361A1 (ko) 형질전환된 t세포를 이용한 제대혈 유래 자연살해세포의 배양방법
WO2016048107A1 (ko) 인터페론-감마 또는 인터류킨-1베타를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2017146538A1 (ko) 조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2023172077A1 (ko) Pd-l1 특이적 키메라 항원 수용체 및 이를 포함하는 면역세포
WO2019216667A1 (ko) Sox2, c-Myc를 이용하여 비신경 세포로부터 직접 리프로그래밍된 유도신경줄기세포를 제조하는 방법
WO2019059713A2 (ko) 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
WO2016117960A1 (ko) 면역질환 치료 효능을 갖는 grim19이 과발현된 중간엽줄기세포 및 이의 용도
WO2023038476A1 (ko) 자연살해세포의 제조방법 및 이의 감염성 질환 예방 또는 치료 용도
WO2023038475A1 (ko) 유도 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
WO2023167575A1 (ko) 저면역원성 줄기세포, 줄기세포로부터 분화되거나 유래된 저면역원성 세포 및 이의 제조방법
WO2022158800A1 (ko) 면역세포 관용성 조절인자 과발현 줄기세포 및 이의 용도
WO2022215920A1 (ko) 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
WO2021107234A1 (ko) Hiv 감염 치료 또는 예방을 위한 ccr5/cxcr4 유전자 동시 넉아웃 환자맞춤형 조혈모세포 및 이의 제조방법
WO2024151006A1 (ko) Fto 유전자의 발현이 억제된 줄기세포 및 이로부터 분화된 면역세포
WO2025121610A1 (ko) 자연살해 (natural killer, nk) 세포를 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물
WO2024107010A1 (ko) 미분화 줄기세포로부터 자연 살해 세포로의 분화 방법 및 이의 용도
WO2025079987A9 (ko) 키메라 항원 수용체를 발현하는 자연 살해 세포를 이용한 종양 미세환경의 주피세포를 표적하는 항암 세포 치료 기법 및 치료 효능 평가를 위한 종양 미세환경 오가노이드 모델 제작 기술
WO2024014721A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 항암 조성물 및 이의 제조방법
WO2026005479A1 (ko) 자연살해세포 및 car-nk 세포의 제조 방법, 이에 따라 제조된 자연살해세포 및 car-nk 세포, 및 이의 용도
WO2024080726A1 (ko) 자연살해세포 및 토포이소머라제 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물
WO2022010220A1 (ko) 면역원성이 감소된 신규한 이식용 세포
WO2022211376A1 (ko) 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20777770

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021557872

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020777770

Country of ref document: EP

Effective date: 20211028

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 17598917

Country of ref document: US