WO2020209759A2 - Способ получения nk-клеток с нокаутированным геном pd-1 и повышенной экспрессией trail или fas-лиганд - Google Patents

Способ получения nk-клеток с нокаутированным геном pd-1 и повышенной экспрессией trail или fas-лиганд Download PDF

Info

Publication number
WO2020209759A2
WO2020209759A2 PCT/RU2020/000188 RU2020000188W WO2020209759A2 WO 2020209759 A2 WO2020209759 A2 WO 2020209759A2 RU 2020000188 W RU2020000188 W RU 2020000188W WO 2020209759 A2 WO2020209759 A2 WO 2020209759A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
seq
gene
expression
base pairs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2020/000188
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2020209759A3 (ru
Inventor
Игорь Петрович Белецкий
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to US17/602,929 priority Critical patent/US12359171B2/en
Priority to EP20788293.7A priority patent/EP3954775A4/en
Publication of WO2020209759A2 publication Critical patent/WO2020209759A2/ru
Publication of WO2020209759A3 publication Critical patent/WO2020209759A3/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/15—Natural-killer [NK] cells; Natural-killer T [NKT] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine and genetic engineering, namely to guide RNA and DNA fragments and methods of cell selection that can be used in CRISPR-Cas9 systems to obtain natural killer cell lines with a knocked out PD-1 gene and increased production of TRAIL or Fas proteins -ligand.
  • a combination of PD-1 inhibitors includes methods of treating hematologic cancers using a combination of PD-1 or PD-L1 inhibitors and TIM-3, LAG-3 or CTLA-4.
  • a PD-1 or PD-L1 inhibitor is administered in combination with a TIM-3 inhibitor.
  • a PD-1 or PD-L1 inhibitor is administered in combination with a LAG-3 inhibitor.
  • a PD-1 or PD-L1 inhibitor is administered in combination with a CTLA-4 inhibitor [2].
  • bispecific monoclonal antibodies are made up of parts of two different monoclonal antibodies, so they can simultaneously attach to two different proteins.
  • the drug blinatumomab for the treatment of a rare form of acute lymphocytic leukemia.
  • One part of the drug molecule binds to CD 19, which is found in some leukemia and lymphoma cells, while the other part has an affinity for the CD3 protein found in normal T cells of the immune system.
  • the chimeric antigen-receptor-modified immune effector cell PD-L1 blocking agent may include: soluble PD-1; a soluble PD-1 fusion peptide and a hIgG4el-Fc CH3 domain; a fusion peptide of soluble PD-1 and hIgG4el-Fc; or a specific antibody anti-PD-Ll [3].
  • TRAIL protein containing a PD-L1-blocking antibody fragment genetically fused with the extracellular domain TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand), which belongs to the TNF family and is the second type of membrane proteins.
  • TRAIL tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand
  • TNF tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand
  • Fas ligand is a type II 40-KDA transmembrane protein that binds to the FAS (CD95 phenotype) receptor and promotes programmed cell death.
  • the use of FasL has been shown to induce a systemic antitumor response that delays or prevents progression and simultaneously attacks distant metastases.
  • NK - cells Natural, or natural killer cells
  • NK - cells are characterized as lymphocytes of innate immunity, possessing antiviral and antitumor cytotoxic activity. By means of a set of NK receptors, cells recognize molecules on the cell surface, the expression of which indicates viral infection, tumor formation or damage caused by cellular stress [9,10,1 1].
  • the objective of the present invention is the development of new genetic constructs that increase the effectiveness of tumor treatment using new types of natural killer cells, expanding the arsenal of new therapeutic agents.
  • the technical result consists in the fact that the claimed methods (variants) of obtaining a modified line of NK - cells with a knocked out PD-1 gene make it possible to increase the efficiency of apoptosis or lysis of mammalian cancer cells.
  • the claimed methods of application make it possible to expand the range of application of the developed genetically engineered constructs of modified NK cell lines to increase the effectiveness of treatment in mammals.
  • One aspect of the invention is a method of producing a modified PD-1 gene knockout NK cell line to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells.
  • the selection of guide RNA sequences specific to various sites of the PD-1 gene included in the group SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 is performed, construct expression plasmid vectors encoding the selected guide RNA and endonuclease Cas9 transfect the culture of NK cells with one of the plasmid vectors, stain the cells with anti-PD-1 antibodies, carry out cloning and selection, then carry out secondary cultivation of cell clones and select cells using immunoblotting with anti PD-1 antibodies.
  • the composition of the plasmid vector with the physical map shown in figure 1 includes: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp, Cas9 endonuclease; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp-fl ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp-bla; 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - sequence encoding the guide RNA.
  • Another aspect of the present invention is the use of a modified PD-1 gene knockout NK cell line to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells, comprising administering to the mammal an effective amount of a killer (NK) cell.
  • a modified PD-1 gene knockout NK cell line to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells, comprising administering to the mammal an effective amount of a killer (NK) cell.
  • Another aspect of the present invention is a method for selecting modified PD-1 knockout NK cells, which is carried out using a selective marker zeocin, wherein to inactivate the expression of the PD-1 gene, the selection of guide RNA sequences specific to different sites of the PD-1 gene is performed.
  • SEQ ID NO: 1 construct expression plasmid vectors encoding the selected guide RNA and Cas9 endonuclease, synthesize a fragment of donor DNA encoding an expression cassette for resistance cells to zeocin having the sequence according to SEQ ID NO: 9, transfection of the culture of NK cells with a mixture of the plasmid vector and a fragment of the donor DNA, culturing the cells in a selective medium with zeocin, staining the surviving cells with anti-PD-1 antibodies, selecting and cloning the cells with a minimum signal using a flow sorter, conduct a secondary cool Enabling cell clones and selecting cells by immunoblotting with anti-PD-1 antibodies.
  • the composition of the plasmid vector with the physical map shown in figure 1 includes: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp, Cas9 endonuclease; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl or /; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp-bla; 7425-8013 bp - ColEl on; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - sequence encoding the guide RNA.
  • the donor DNA with a size of 2.371 kb which inactivates the expression of the PD-1 gene with simultaneous activation of the expression in the NK cell of the zeocin protein, includes: a fragment containing the sequence of the first part of the pdl gene of 379 base pairs, characterized by a nucleotide sequence, shown in SEQ ID NO: 10; a fragment containing the sequence of CMV enhancer size 405 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11; a fragment containing the sequence - hFerL Promoter of 263 base pairs, characterizing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12; a fragment containing the sequence - Zeo - gene of resistance to zeocin size 375 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13; a fragment containing the sequence b ⁇ o poly A Signal size 401 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a modified PD-1 gene knockout NK cell line and constitutively increased expression of the Fas ligand, in which, in order to inactivate the expression of the PD-1 gene, the selection of guide RNA sequences specific to different sites of the PD-1 gene is performed.
  • SEQ ID NO: 1 included in the group SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, construct expression plasmid vectors encoding the selected guide RNA and Cas9 endonuclease, synthesize a fragment of donor DNA encoding an expression cassette for the Fas ligand having the sequence according to SEQ ID NO: 16, the culture of NK cells is transfected with a mixture of the plasmid vector and the donor DNA fragment, the cells are cultured, the surviving cells are stained with anti-PD-1 antibodies and anti-Fas-ligand with antibodies, selection and cloning cells with minimal signal for PD-1 and the maximum signal for Fas ligand using a flow sorter, secondary cultivation of cell clones and cell selection by immunoblotting with anti PD-1 antibodies and anti Fas ligand antibodies are performed.
  • the composition of the plasmid vector with the physical map shown in figure 1 includes: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - Cas9 endonuclease 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - P ori 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - sequence encoding the guide RNA.
  • the donor DNA with a size of 2.473 kb, providing inactivation of PD-1 gene expression with simultaneous activation of Fas-ligand protein expression in the NK cell includes: a fragment containing the sequence of the first part of the pdl gene of 379 base pairs, characterized by the nucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 10; a fragment containing the sequence CMV Promoter size 588 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17; a fragment containing the sequence - Fas-ligand size 846 base pairs characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18; a fragment containing the sequence - BGH polyA Signal of 225 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19; a fragment containing the sequence of the second part of the pdl gene of 276 base pairs in size, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • a further aspect of the present invention is the use of a modified NK cell line knocked out of the PD-1 gene and constitutively increased expression of the Fas ligand to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells, comprising administering to the mammal an effective amount of a killer (NK) cell.
  • a modified NK cell line knocked out of the PD-1 gene and constitutively increased expression of the Fas ligand to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a modified PD-1 gene knockout NK cell line and constitutively elevated TRAIL expression in order to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells.
  • inactivate expression gene PD-1 carry out the selection of sequences of guide RNAs specific to various sites of the gene PD-1 included in the group SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, construct expression plasmid vectors , encoding the selected guide RNA and Cas9 endonuclease, synthesize a fragment of donor DNA encoding an expression cassette for TRAIL having the sequence according to SEQ ID NO: 20, transfect the culture of NK cells with a mixture of the plasmid vector and a fragment of donor DNA, carry out cell cultivation, stain the surviving cells with anti PD-1 antibodies and anti TRAIL antibodies, selection and cloning of cells with a minimum signal for PD-1 and a maximum signal for TRAIL using
  • the composition of the plasmid vector with the physical map shown in figure 1 includes: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp, Cas9 endonuclease; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp-fl ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp-bla; 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - sequence encoding the guide RNA.
  • the donor DNA with a size of 2.473 kb which inactivates the expression of the PD-1 gene with simultaneous activation of the expression of the TRAIL protein in the NK cell, includes: a fragment containing the sequence of the first part of the pdl gene of 379 base pairs, characterized by the nucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 10; a fragment containing the sequence CMV Promoter size 588 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17; a fragment containing the sequence - TRAIL size 846 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21; a fragment containing the sequence - BGH polyA Signal of 225 base pairs, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19; a fragment containing the sequence of the second part of the pdl gene of 276 base pairs in size, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • a further aspect of the present invention is the use of a modified PD-1 gene knockout NK cell line and constitutively increased TRAIL expression to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells, comprising administering to the mammal an effective amount of a killer (NK) cell.
  • a modified PD-1 gene knockout NK cell line and constitutively increased TRAIL expression to induce apoptosis or lysis of mammalian cancer cells, comprising administering to the mammal an effective amount of a killer (NK) cell.
  • FIG. 1 Physical map of the plasmid vector, which includes: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - Cas9 endonuclease 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp-fl ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp-bla; 7425- 8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - guide RNA (gRNA) coding sequence.
  • gRNA guide RNA
  • FIG. 2. Map of the pdl-Zeo donor DNA fragment.
  • 1-379 bp is the sequence of a part of the pdl gene SEQ ID NO: 10; 395-799 bp CMV enh enhancer SEQ ID NO: l l; 806-1068 bp - hFerL Promoter SEQ ID NO: 12; 1291-1665 bp - Zeo - Zeocin resistance gene SEQ ID NO: 13; 1673-2073 bp - b ⁇ o polyA Signal SEQ ID NO: 14; 2096-2371 bp is the sequence of a portion of the pdl gene SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 3 Map of the pdl-FasL donor DNA fragment.
  • 1-379 bp - the sequence of a part of the pdl gene SEQ ID NO: 10; 389-976 bp CMV Promoter SEQ ID NO: 17; 1052-1897 bp - FasL SEQ ID NO: 18; 1969-2193 bp BGH polyA Signal SEQ ID NO: 19; 2198-2473 bp - sequence of a portion of pdl gene SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 4 Map of the pdl-TRAIL donor DNA fragment.
  • 1-379 bp - the sequence of a part of the pdl gene SEQ ID NO: 10; 389-976 bp CMV Promoter SEQ ID NO: 17; 1052-1897 bp TRAIL SEQ ID NO: 21; 1969-2193 bp BGH polyA Signal SEQ ID NO: 19; 2198-2473 bp - sequence of a portion of pdl gene SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 5 Micrographs of NK92 (A) and NK92-PD1 (B) cells incubated with K562 target cells in a 3: 1 ratio for 6 hours.
  • FIG. 6 Micrographs of NK92 (A) and NK92-PD1 (B) cells incubated with HeLa target cells in a ratio of 3: 1 for 6 hours.
  • FIG. 7 Percentage of surviving HeLa target cells after incubation with NK92 and NK92-PD1 cells for 6 hours. Data are presented as the mean of three experiments.
  • FIG. 8 Comparative growth kinetics of NK92 and NK92-PD1 cell cultures. Data are presented as the mean of three experiments.
  • FIG. 9 Percentage of surviving A172 target cells after 6 hours of cultivation in the presence of NK92 or NK92-PD1-TRIAL. Data are presented as the mean of three experiments.
  • FIG. 10 Percentage of surviving T98G target cells after 8 hours of culture in the presence of NK92 or NK92-PD1-TRIAL. Data are presented as the mean of three experiments.
  • the present invention relates to a cell or NK cell line of natural killer (NK) cells that have been genetically modified in such a way as to increase their cytotoxicity.
  • NK natural killer
  • NK - cells and NK - cell lines can be: a) isolated from peripheral blood, b) isolated from umbilical cord blood, c) obtained from pluripotent and embryonic stem cells (i.e. iPSCs and ESC) according to the method of Galat et al [9.10], d) obtained from pluripotent stem cells (iPSCs) according to the method of Kaufman et al. [eleven].
  • iPSCs and ESC pluripotent and embryonic stem cells
  • iPSCs pluripotent stem cells
  • NK - cells and NK - cell lines can be included in the group consisting of KH Y G-1 / C VCL 2976, NK-92 / CVCL_2142, NK-YS / CVCL_8461, NKL / CVCL_0466, NK3.3 / CVCL 7994, which includes but is not limited to other types of NK - cells and NK - cell lines.
  • the method for obtaining a line of PD-1 knockout NK cells includes several main stages:
  • composition of the plasmid vector with a physical map shown in figure 1 includes: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - Cas9 endonuclease 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp-fl on; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla *, 7425-8013 bp - ColEl or /; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - sequence encoding the guide RNA.
  • vector pGR304 SEQ ID NO: 4
  • DNA fragments encoding guide RNAs were synthesized using polymerase chain reaction with overlapping oligonucleotides. The resulting fragments were cloned into a plasmid vector intended for the expression of the components of the CRISPR-Cas9 system in mammalian cells. The vector was pre-digested at the Bbsl restriction endonuclease site. Selected plasmid vectors pGR301, pGR302, pGR303, pGR304 were sequenced to confirm the receipt of the planned genetic constructs.
  • NK cells were transfected with vectors pGR301, pGR302, pGR303, pGR304 using Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), cells were incubated in RPMI medium with 20% fetal bovine serum until a cell density of 4 6 x 105 cells / ml was reached.
  • a mixture of Lipofectamine 3000 lipagent and DNA was prepared (at the rate of 3 ⁇ l lipagent, 4 ⁇ g pGR301 or pGR302 or pGR303 or pGR304, 8 ⁇ l P3000 TM reagent, 100 ⁇ l Opti-MEM® Medium per 1 ml cell suspension). The mixture was incubated for 5 min and added to the cell suspension. The cells were incubated for 48 h at 37 ° C and 5% CO2.
  • PD-1 gene knockout cells 48 h after transfection, cells were incubated with anti-PD-1 antibodies labeled with fluorescein for 1 h. The cells were washed with culture medium and separated using a cell sorter. Single cells with minimal or no fluorescent signal were selected in the wells of a 96-well plate with RPMI medium with 20% fetal bovine serum. The cells were cultured in for 2 - 4 weeks at 37 ° C and 5% CO2 with replacement of the culture medium every 3-4 days.
  • Nontransfected NK cells were used as a positive control.
  • the cells were lysed using a buffer containing 25 mM Tris-HC1, 150 mM NaCl, 1 mMEDTA, 1% Triton-XI 00.
  • Cell lysates were centrifuged at 10,000 g for 10 min. The concentration of total protein in the supernatant was determined and aliquots corresponding to 100 ⁇ g of protein were separated by electrophoresis under denaturing conditions. Proteins were electrically transferred from the gel to a nitrocellulose membrane.
  • nitrocellulose membrane with immobilized proteins was washed with buffer I (20 mM Tris-HC1, pH 7.5; 150 mM NaCl; 0.05% Tween-20) and incubated for 1 h in 2% bovine serum albumin solution in buffer I. Then they were incubated for 16 h with primary antibodies to PD1 in 2% BSA in buffer I. After that, the membrane was washed with buffer I and incubated for 1 h with secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase (Bio-Rad manufacturer) in 1% milk solution in buffer I.
  • buffer I (20 mM Tris-HC1, pH 7.5; 150 mM NaCl; 0.05% Tween-20) and incubated for 1 h in 2% bovine serum albumin solution in buffer I. Then they were incubated for 16 h with primary antibodies to PD1 in 2% BSA in buffer I. After that, the membrane was washed with buffer I and incubated for 1 h with secondary antibodies conjugated with horseradish
  • the membrane was washed with buffer I and stained using a commercial ECL TM chemiluminescence detection kit. Clones were selected that did not show specific bands corresponding to PD-1.
  • a method for selecting NK cells using a selective marker zeocin is proposed.
  • the process includes several stages: 1. Selection of the sequence of the guide RNA specific to the PD-1 gene having the sequence according to SEQ ID NO: 1;
  • a mixture of the pGR301 vector and a pdl-Zeo DNA fragment, SEQ ID NO: 9, encoding the Zeocin resistance gene was used.
  • pdl-Zeo used overlapping primer polymerase chain reaction.
  • NK cells were transfected with Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific).
  • Lipofectamine 3000 cells were incubated in RPMI medium with 20% fetal bovine serum until a cell density of 4 6> ⁇ 105 cells / ml was achieved.
  • a mixture of Lipofectamine 3000 lipagent and DNA was prepared (at the rate of 3 ⁇ l lipagent, 2 ⁇ g pGR301 vector, 2 ⁇ g pdl-Zeo DNA fragment, 8 ⁇ l P3000 TM reagent, 100 ⁇ l Opti-MEM® Medium medium per 1 ml cell suspension). The mixture was incubated for 5 min and added to the cell suspension. The cells were incubated for 48 h at 37 ° C and 5% CO2.
  • NK cells knocked out for the PD-1 gene using a selective marker zeocin 48 h after transfection, the cells were transferred to a selective medium (RPMI supplemented with zeocin) and cultured for 2-4 weeks. Surviving cells were stained with fluorescein-labeled anti-PD-1 antibodies. Samples of stained cells were separated using a cell sorter. Single cells with minimal or no fluorescent signal were selected in the wells of a 96-well plate with RPMI medium with 20% fetal bovine serum. The cells were cultivated for 2-4 weeks at 37 ° C and 5% CO2 with replacement of the culture medium every 3-4 days.
  • the expression level of PD-1 in clones was assessed by immunoblotting with anti-PD-1 antibodies, similar to the protocol described for obtaining NK cells with knockout of the PD-1 gene.
  • NK cells To increase the activity of NK cells, a method is proposed for producing NK cells with knockout PD-1 gene and constitutive increased expression of Fas-ligand.
  • the process includes several stages:
  • a mixture of the pGR301 vector and a pdl-FasL DNA fragment having the sequence according to SEQ ID NO: 16, encoding an expression cassette for expressing the Fas ligand was used.
  • pdl-FasL overlapping primer polymerase chain reaction was used.
  • NK cells were transfected with Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific).
  • Lipofectamin 3000 cells were incubated in RPMI medium with 20% fetal bovine serum until a cell density of 4-6x10 5 cells / ml was reached.
  • a mixture of Lipofectamine was prepared 3000 and DNA (based on 3 ⁇ l lipagent, 2 ⁇ g pGR301 vector, 2 ⁇ g pdl-FasL DNA fragment, 8 ⁇ l P3000 TM reagent, 100 ⁇ l Opti-MEM® Medium per 1 ml cell suspension). The mixture was incubated for 5 min and added to the cell suspension. The cells were incubated for 48 h at 37 ° C and 5% CO2.
  • the expression level of PD-1 in clones was assessed by immunoblotting with anti-PD-1 antibodies, similar to the protocol described for obtaining NK cells with knockout of the PD-1 gene. In clones with confirmed PD-1 knockout, the expression level of the Fas ligand was assessed. Immunoblotting with aHTH-Fas ligand antibodies (Manufacturer BD Biosciences, clone G-247) was carried out in a manner similar to PD-1. As a result of the analysis, cells were selected in which the maximum signal of the bands corresponding to the Fas ligand was detected
  • NK cells To increase the activity of NK cells, a method is proposed for obtaining NK cells with knockout PD-1 gene and constitutive increased TRAIL expression.
  • the process includes several stages:
  • PD-1 having the sequence according to SEQ ID NO: 1;
  • a DNA fragment SEQ ID NO: 20
  • polymerase chain reaction with overlapping primers was used.
  • NK cells were transfected using the Lipofectamin 3000 lipagent (Thermo Fisher Scientific).
  • Lipofectamine 3000 lipagent cells were incubated in RPMI medium with 20% fetal bovine serum until a cell density of 4-6x 10 5 cells / ml was reached.
  • a mixture of Lipofectamine 3000 lipagent and DNA was prepared at the rate of 3 ⁇ l of lipagent, 2 ⁇ g of pGR301 vector, 2 ⁇ g of pdl-TRAIL DNA fragment, 8 ⁇ l of P3000 TM reagent, 100 ⁇ l of Opti-MEM® Medium per 1 ml of cell suspension. The mixture was incubated for 5 min and added to the cell suspension. The cells were incubated for 48 h at 37 ° C and 5% CO2.
  • the expression level of PD-1 in clones was assessed by immunoblotting with anti-PD-1 antibodies, similar to the protocol described for obtaining NK cells with knockout of the PD-1 gene. In clones with confirmed PD-1 knockout, the expression level of TRAIL was assessed. Immunoblotting was performed with anti-TRAIL antibodies (Manufacturer Abeam, clone 7541 1.11, cat. s abl0516) according to a procedure similar to PD-1. As a result of the analysis, cells were selected in which the maximum signal of the bands corresponding to TRAIL was detected.
  • HeLa human cervical adenocarcinoma
  • K562 human myeloid leukemia
  • a 172 human glioblastoma
  • T98G human glioblastoma
  • NK92-PD1, NK92-PD1-TRAIL cells The possibility of using the invention is illustrated by examples confirming the cytotoxic activity of NK92-PD1, NK92-PD1-TRAIL cells to induce apoptosis or lysis of various types of mammalian cancer cells.
  • Example 1 Evaluation of the cytotoxic activity of NK92 and NK92-PD1 cells incubated with K562 target cells (human myeloid leukemia), and with HeLa target cells (human cervical adenocarcinoma).
  • NK92 and NK92-PD1 cells were x 10 4 / moons
  • the cells were incubated for 6 hours at 37 ° C and 5% CO2 and visualized with a microscope in transmitted light (see Fig. 5 and Fig. 6).
  • Example 3 Assessment of the cytotoxic activity of NK92 and NK92-PD1-TRAIL cells on A 172 cells (human glioblastoma).
  • NK92 and NK92-PD1 -TRAIL cells (6 x 10 4 / moons) in medium supplemented with 2 Amemiya CMM L-glutamine, sodium bicarbonate (1.5 g / l), 0.2 mM inositol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 250 U / ml recombinant interleukin 2 (Prospec), 25% fetal calf serum (Hyclone).
  • the cells were incubated for 6 h at 37 ° C and 5% CO2 and visualized with a microscope in transmitted light.
  • Wells with A 172 cells were washed with buffered saline, the remaining cells were stained with a 0.2% neutral red solution and evaluated for light absorption (wavelength 540 nm) using a plate photometer. The percentage of surviving A 172 cells was determined as the ratio of the optical density of the experimental wells (A172 with NK92 or NK92-PD1 PD1 -TRAIL and the optical density of the control wells with A172 cells. shown in Fig. 9.
  • Example 4 Evaluation of the cytotoxic activity of NK92 and NK92-PD1-TRAIL cells on T98G cells (human glioblastoma).
  • T98G cells human glioblastoma
  • 100 ⁇ l of a suspension of T98G cells (2 * 10 4 / l) in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Hyclone) was added and incubated for 16 h at 37 ° C and 5% CO2.
  • NK92 and NK92-PD1 -TRAIL cells (6 x 10 4 / moons) Amemiya in medium supplemented with 2 mM L-glutamine, sodium bicarbonate (1.5 g / l), 0.2 CMM inositol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 250 U / ml recombinant interleukin 2 (Prospec), 25% fetal calf serum (Hyclone). The cells were incubated for 8 h at 37 ° C and 5% CO2 and visualized with a microscope in transmitted light.
  • T98G cells were washed with buffered saline, the remaining cells were stained with 0.2% neutral red solution and evaluated for light absorption (wavelength - 540 nm) using a plate photometer. The percentage of surviving cells was determined as the ratio of the optical density of the experimental wells (T98G with NK92 or NK92-PD1 PD1 -TRAIL) and the optical density of the control wells (T98G cells). The result of evaluating the cytotoxic activity of NK92 and NK92-PD1 -TRAIL cells incubated with T98G target cells is shown in FIG. ten.
  • modified NK cells, NK cell lines, or compositions thereof with increased cytotoxicity are intended for use in the treatment of cancer in a patient.
  • the modified NK cell, NK cell line, or a composition thereof is for use in the treatment of blood cancers, including acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), chronic myeloid leukemia (CML).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • the modified NK cell, NK cell line can be used in the treatment of: Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, including T-cell lymphomas, B-cell lymphomas, asymptomatic myelomas, smoldering multiple myelomas (SMM), active myeloma or myeloma light chains.
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma
  • non-Hodgkin's lymphoma including T-cell lymphomas, B-cell lymphomas, asymptomatic myelomas, smoldering multiple myelomas (SMM), active myeloma or myeloma light chains.
  • Japan Patent LUR6157574 (B2) (2017-07-05). ... JOHNSON BRYON D., MILLMAN R. METHODS FOR TREATING
  • pluripotent stem cell derivatives and reversion to pluripotency of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и генной инженерии, а именно к направляющим РНК и фрагментам ДНК и способам отбора клеток, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas9 для получения линий клеток натуральных киллеров с нокаутированным геном PD-1 и повышенной продукцией белков TRAIL или Fas-лиганд. Раскрыты способы получения модифицированных линий NK -клеток: с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas-лиганда, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL, а также описан способ отбора модифицированных NK-клеток с нокаутированным геном PD-1, который проводят с помощью селективного маркера зеоцина. Изобретение позволяет получить высокой выход модифицированных линий NK -клеток, обладающих высокой активностью по ингибированию роста клеток опухоли.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ NK-КЛЕТОК С НОКАУТИРОВАННЫМ ГЕНОМ PD-1 И ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ TRAIL ИЛИ FAS-ЛИГАНД
Область техники
Изобретение относится к области медицины и генной инженерии, а именно к направляющим РНК и фрагментам ДНК и способам отбора клеток, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas9 для получения линий клеток натуральных киллеров с нокаутированным геном PD-1 и повышенной продукцией белков TRAIL или Fas-лиганд.
Уровень техники
Способы лечения рака моноклональными антителами, развиваются с конца 1970-х годов, став основным направлением иммунотерапии, в основе которой лежит использование определенных звеньев иммунной системы для борьбы с опухолью. Способ иммунотерапии обладает преимуществами, но разработанные иммунотерапевтические препараты не универсальны и для одних типов рака подходят лучше, чем для других. Одни моноклональные антитела усиливают иммунный ответ на раковые клетки, присоединяясь к ним как сигнальный маячок, например препарат алемтузумаб, который связывается с антигеном CD52, присутствующим на лимфоцитах и который назначают при хроническом лимфоцитарном лейкозе. Другие блокируют опухолевые антигены, нарушая рост и размножение клетки, например, трастузумаб, который является антителом против поверхностного белка HER2 и помогает не разрастаться опухолям желудка и молочной железы, Третья подгруппа моноклональных антител нацелена на иммунные контрольные точки.
Один из наиболее перспективных подходов активации внутренних сил для борьбы с раком связан с применением моноклональных антител, блокирующих взаимодействие белков PD-1 и PD-L1, которое маскирует раковые клетки под здоровые. Известны два лекарственных средства на основе моноклональных антител против PD-1. Один производства компании MSD, другой - Bristol-Myers Sqibb. После нейтрализации PD-1 организм начинает распознавать опухолевые клетки как чужеродные и уничтожать их. Моноклональные антитела к PD-1 обладают большим терапевтическим потенциалом для лечения не только меланомы, но и немелкоклеточного рака легкого, почечно-клеточного рака. Известен патент Японии JP6157574 (2017-07-05) и заявка Кореи М° KR20180093990, опубликованная 2018-08-22. В них рассматриваются способы изготовления моноклональных антител к PD-1 и новая терапевтическая стратегия для терапии антителом против PD-1 [1].
Другие технические решения основаны на использовании комбинации ингибиторов PD-1. Изобретение US2016222121 (2016-08-04) описывает способы лечения гематологических раков с использованием комбинации ингибиторов PD-1 или PD-L1 и TIM-3, LAG-3 или CTLA-4. В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 или PD-L1 вводят в комбинации с ингибитором TIM-3. В другом варианте осуществления ингибитор PD-1 или PD-L1 вводят в комбинации с ингибитором LAG-3. В еще одном варианте осуществления ингибитор PD-1 или PD-L1 вводят в комбинации с ингибитором CTLA-4 [2].
Другой подход связан с применением биспецифических моноклональных антител. Эти препараты состоят из частей двух разных моноклональных антител, благодаря чему способны одновременно прикрепляться к двум различным белкам. Например, препарат блинатумомаб для лечения редкой формы острого лимфоцитарного лейкоза. Одна часть молекулы препарата соединяется с CD 19, который содержится в некоторых клетках лейкемии и лимфомы, другая часть имеет сродство к белку CD3, обнаруженному в нормальных Т-клетках иммунной системы.
Известна заявка ЕР3382009 (2018-10-03), в которой химерный антиген - рецептор-модифицированного иммунной эффекторной клетки PD-L1 блокирующий агент может включать в себя: растворимый PD-1; слитый пептид растворимого PD-1 и домен СНЗ hIgG4el-Fc; слитый пептид растворимого PD-1 и hIgG4el-Fc; или специфическое антитело анти-PD-Ll [3].
В работе Djoke Hendriksa et al. [4] описано получение и исследовано применение белка anti - PD-L1 :TRAIL, содержащий фрагмент PD-L1- блокирующего антитела, генетически сплавленного с внеклеточным доменом TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand), который принадлежит к семейству TNF и представляет собой второй тип мембранных белков. TRAIL осуществляет апопотоз при взаимодействии с рецепторами смерти. В отличие от других цитокинов он взаимодействует с комплексом рецепторов: проапоптическими, рецепторами смерти, антиапоптическими. Проверка действия слитого белка anti - PD-LLTRAIL показала увеличение активации т-клеток, что привело к увеличению умерщвления линий раковой клетки и основных пациент-производных раковых клеток в смешанных экспериментах по культурам Т-клетки/раковой клетки.
Применение моноклональных и бифункциональных антител связано с возникновением множества побочных эффектов, поскольку антитела являются белками, которые вызывают как минимум аллергические реакции.
Известны подходы к лечению опухолей основанных на местном использовании векторов доставки, которые достигают высокого уровня экспрессии в опухолевой среде. В работе Modiano JF [5] рассматривается перспектива применения Fas ligand в иммунотерапии. Fas лиганд (FasL, CD95L) - это 40-КДА типа II трансмембранный белок, который связывается с ФАС (фенотипом CD95) рецептора и способствует запрограммированной клеточной смерти. Показано, что применение FasL вызывает системный противоопухолевый ответ, который задерживает или предотвращает прогрессирование и одновременно атакует отдаленные метастазы.
В настоящее время идет активная разработка Т - клеток, экспрессирующих новые химерные рецепторы третьего поколения. Известна заявка Китая N° CN103820454 (2014-05-28) и статья Su S. et al. опубликованная 2016-01-28 [6,7], в которых описан способ нокаута гена PD1 человека с помощью системы редактирования генома CRISPR-Cas9 в Т-клетках. Изобретение относится к способу специфического нокаута гена PD1 человека с помощью CRISPR-Cas9 (кластеризованный регулярный промежуточный короткий палиндромный повтор) и sgRNA (однонаправленная РНК) в Т-клетках человека для лечения раковых больных.
Клинические данные, по применению CAR Т-клеток полученные при лечении рака, показали многообещающие результаты [8] . Тем не менее, существует высокий риск для пациента, а некоторые Т-клетки пациентов недостаточно эффективны для лечения даже после перенаправления TCR или CAR, вызывая модификацию аллогенных донорских Т-клеток. Этот подход ограничен временем и затратами на производство специфичных для пациента продуктов Т-клеток. Поэтому существует потребность в более безопасных способах модификации клеток, обойдя время и затраты на производство специфичных для пациента продуктов Т-клеток. Эти недостатки устраняются при применении клеток натуральных, или естественных киллеров. Натуральные, или естественные киллеры (NK - клетки) охарактеризованы как лимфоциты врожденного иммунитета, обладающие противовирусной и противоопухолевой цитотоксической активностью. Посредством набора рецепторов NK - клетки распознают на поверхности клеток молекулы, экспрессия которых указывает на вирусную инфекцию, опухолеобразование или повреждения, вызванные клеточным стрессом [9,10,1 1].
Известно изобретение O'Dwyer М. Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity приведенное в патенте США US10034925 (2018-07-31), в котором для повышения цитотоксичности при лечении рака NK - клетки генетически модифицируют для удаления контрольных точек экспрессии выбранных из ингибирующих рецепторов, например PD1 и модифицируют для увеличения экспрессии мутантного варианта TRAIL лиганда [12].
Задачей настоящего изобретения является разработка новых генетических конструкций повышающих эффективность лечения опухолей с помощью новых типов клеток натуральных киллеров расширяющих арсенал новых лечебных средств.
Технический результат состоит в том, что заявленные способы (варианты) получения модифицированной линии NK - клеток, с нокаутированным геном PD-1 позволяют повышать эффективность апоптоза или лизиса раковых клеток млекопитающего.
Заявленные способы применения позволяют расширить спектр использования разработанных генноинженерных конструкций модифицированных линий NK - клеток для повышения эффективности лечения млекопитающих.
Сущность изобретения
Одним из аспектов изобретения является способ получения модифицированной линии NK - клеток, с нокаутированным геном PD-1 для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего. При этом для инактивации экспрессии гена PD-1 осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, проводят трансфекцию культуры NK - клеток одним из плазмидных векторов, окрашивают клетки анти PD-1 антителами, осуществляют клонирование и отбор, затем проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами. При этом, в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение модифицированной линии NK - клеток, с нокаутированным геном PD-1 для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, включающее введение млекопитающему эффективного количества клетки-киллера (NK).
Следующим аспектом настоящего изобретения является способ отбора модифицированных NK-клеток с нокаутированным геном PD-1, который проводят с помощью селективного маркера зеоцина, при этом для инактивации экспрессии гена PD-1 осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, осуществляют синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для устойчивости клеток к зеоцину имеющей последовательность согласно SEQ ID NO:9, проводят трансфекцию культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК, осуществляют культивирование клеток в селективной среде с зеоцином, проводят окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами, осуществляют отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом с помощью проточного сортера, проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами. При этом, в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 Ьр - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl or/; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl on; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
При этом, в состав донорской ДНК размером 2,371 тыс. пар оснований, обеспечивающей инактивацию экспрессии гена PD-1 с одновременной активацией экспрессии в NK-клетке белка зеоцин, входят: фрагмент содержащий последовательность первой части гена pdl размером 379 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; фрагмент содержащий последовательность CMV энхансера размером 405 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11 ; фрагмент содержащий последовательность - hFerL Promoter размером 263 пар оснований характеризующий нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12; фрагмент содержащий последовательность - Zeo - ген резистентности к зеоцину размером 375 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 13; фрагмент содержащий последовательность bΰΐo poly A Signal размером 401 пара оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 14; фрагмент содержащий последовательность второй части гена pdl размером 276 пар оснований характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения модифицированной линии NK -клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas-лиганда, в котором, для инактивации экспрессии гена PD-1, осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO: l , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, осуществляют синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для Fas-лиганда имеющей последовательность согласно SEQ ID NO: 16, проводят трансфекцию культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК, осуществляют культивирование клеток, проводят окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами и анти Fas-лиганд антителами, осуществляют отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом для PD-1 и максимальным сигналом для Fas-лиганда с помощью проточного сортера, проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами и анти Fas-лиганд антителами.
При этом, в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - П ori 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК. Где в состав донорской ДНК размером 2,473 тыс. пар оснований, обеспечивающей инактивацию экспрессии гена PD-1 с одновременной активацией экспрессии в NK-клетке белка Fas-ligand входят: фрагмент содержащий последовательность первой части гена pdl размером 379 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; фрагмент содержащий последовательность CMV Promoter размером 588 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 17; фрагмент содержащий последовательность - Fas-ligand размером 846 пар оснований характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 18; фрагмент содержащий последовательность - BGH polyA Signal размером 225 пар оснований характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 19; фрагмент содержащий последовательность второй части гена pdl размером 276 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15.
Следующим аспектом настоящего изобретения является применение модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas-лиганда для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, включающее введение млекопитающему эффективного количества клетки-киллера (NK).
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения модифицированной линии NK -клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего. Где для инактивации экспрессии гена PD-1, осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, осуществляют синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для TRAIL имеющей последовательность согласно SEQ ID NO:20, проводят трансфекцию культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК, осуществляют культивирование клеток, проводят окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами и анти TRAIL антителами, осуществляют отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом для PD-1 и максимальным сигналом для TRAIL с помощью проточного сортера, проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами и анти TRAIL антителами. При этом в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
При этом в состав донорской ДНК размером 2,473 тыс. пар оснований, обеспечивающей инактивацию экспрессии гена PD-1 с одновременной активацией экспрессии в NK-клетке белка TRAIL входят: фрагмент содержащий последовательность первой части гена pdl размером 379 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; фрагмент содержащий последовательность CMV Promoter размером 588 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 17; фрагмент содержащий последовательность - TRAIL размером 846 пар оснований, характеризующейся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:21; фрагмент содержащий последовательность - BGH polyA Signal размером 225 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 19; фрагмент содержащий последовательность второй части гена pdl размером 276 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15. Следующим аспектом настоящего изобретения является применение модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, включающее введение млекопитающему эффективного количества клетки-киллера (NK).
Перечень фигур
Фиг. 1. Физическая карта плазмидного вектора в который входят: 295- 572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla ; 7425- 8013 bp - ColEl ori ; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК (gRNA).
Фиг. 2. Карта фрагмента донорской ДНК pdl-Zeo . Где: 1-379 Ьр - последовательность части гена pdl SEQ ID NO: 10; 395-799 bp - CMV enh энхансер SEQ ID NO:l l; 806-1068 bp - hFerL Promoter SEQ ID NO:12; 1291-1665 bp - Zeo - ген резистентности к зеоцину SEQ ID NO: 13; 1673-2073 bp - bΰΐo polyA Signal SEQ ID NO:14; 2096-2371 bp - последовательность части гена pdl SEQ ID NO:15.
Фиг. 3. Карта фрагмента донорской ДНК pdl-FasL. Где: 1-379 bp - последовательность части гена pdl SEQ ID NO: 10; 389-976 bp - CMV Promoter SEQ ID NO:17; 1052-1897 bp - FasL SEQ ID NO:18; 1969-2193 bp - BGH polyA Signal SEQ ID NO: 19; 2198-2473 bp - последовательность части гена pdl SEQ ID NO:15.
Фиг. 4. Карта фрагмента донорской ДНК pdl-TRAIL. Где: 1-379 bp - последовательность части гена pdl SEQ ID NO: 10; 389-976 bp - CMV Promoter SEQ ID NO:17; 1052-1897 bp - TRAIL SEQ ID NO:21; 1969-2193 bp - BGH polyA Signal SEQ ID NO: 19; 2198-2473 bp - последовательность части гена pdl SEQ ID NO:15.
Фиг. 5 Микрофотографии клеток линий NK92 (А) и NK92-PD1 (Б), проинкубированных с клетками-мишенями К562 в соотношении 3:1 в течение 6 часов.
Фиг. 6 Микрофотографии клеток линий NK92 (А) и NK92-PD1 (Б), проинкубированных с клетками-мишенями HeLa в соотношении 3:1 в течение 6 часов. Фиг. 7 Процент выживших клеток-мишеней HeLa после инкубации с клетками линий NK92 и NK92-PD1 в течение 6 часов. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов.
Фиг. 8 Сравнительная кинетика роста культур клеток NK92 и NK92-PD1. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов.
Фиг. 9 Процент выживших клеток-мишеней линии А172 через 6 часов культивирования в присутствии NK92 или NK92-PD1 -TRIAL. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов.
Фиг. 10 Процент выживших клеток-мишеней линии T98G через 8 часов культивирования в присутствии NK92 или NK92-PD1 -TRIAL. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к клетке или NK - клеточной линии природных киллеров (NK) , которые были генетически модифицированы, таким образом, чтобы увеличить свою цитотоксичность.
Указанные NK - клетки и NK - клеточные линии, могут быть: а) выделены из периферической крови, б) выделены из пуповинной крови, в) получены из плюрипотентных (pluripotent) и эмбриональных стволовых клеток (stem cells) (т.е. iPSCs и ESC) по методу Galat et al [9.10], г) получены из плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) по методу Kaufman et al. [11]. Указанные NK - клетки и NK - клеточные линии могут быть инфильтрованы в ткани и опухоли. Указанные NK - клетки и NK - клеточные линии могут входить в группу состоящую из КН Y G- 1 /С VCL 2976, NK-92/ CVCL_2142, NK-YS/CVCL_8461, NKL/ CVCL_0466, NK3.3/ CVCL 7994, которая включает, но не ограничивает других типов NK - клеток и NK - клеточных линий.
Получение NK-клеток с нокаутированным геном PD-1
Способ получения линии NK -клеток, нокаутных по гену PD-1 включает в себя несколько основных этапов:
1. Выбор последовательности направляющей РНК, специфичной к различным сайтам гена PD-1 имеющей последовательность согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4; 2. Конструирование экспрессионного плазмидного вектора, кодирующего выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9 (pGR301 или pGR302 или pGR303 или pGR304);
В состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9 5121- 5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl on; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394- 7254 bp - bla·, 7425-8013 bp - ColEl or/; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
3. Трансфекцию культуры NK -клеток одним из плазмидных векторов;
4. Окрашивание клеток анти PD-1 антителами, отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом с помощью проточного сортера.
5. Культивирование клонов клеток, вторичный отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами.
Для выбора оптимальных последовательностей направляющих РНК проводили анализ нуклеотидных последовательностей с использованием свободно-доступных web-ресурсов: CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), СНОРСНОР (http://chopchop.cbu.uib.no), E-CRISPR (http://www.e-crisp.Org/E- CRISP/designcrispr.html). Были выбраны последовательности направляющих РНК имеющих последовательности согласно SEQ ID NO: 1 - 4, специфичных к различным сайтам гена PD-1 имеющей последовательность согласно SEQ ID NO:5 - 8.
В векторе pGR301 SEQ ID NO: 1
GTCT GGGCGGTGCT AC A ACT GTTTT AG AGCT AG A A AT AGC A AGTT A A A AT AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
В векторе pGR302 SEQ ID NO:2
GGGCGGT GCT AC A ACT GGGC GTTTT AG AGCT AG A A AT AGC A AGTT A A A A TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
В векторе pGR303 SEQ ID NO:3
GGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
В векторе pGR304 SEQ ID NO:4
GCCCTGGCCAGTCGTCTGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC. Последовательности ДНК-мишеней (P AM-последовательности выделены): Для вектора pGR301 SEQ ID NO:5
GTCTGGGCGGTGCTACAACTGGG
Для вектора pGR302 SEQ ID NO:6
GGGCGGT GCT AC AACTGGGCTGG
Для вектора pGR303 SEQ ID NO:7
GGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGG
Для вектора pGR304 SEQ ID NO:8
GCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGG
Для получения плазмидных векторов, кодирующих комплексы эндонуклеазы Cas9 и направляющих РНК, проводили синтез фрагментов ДНК, кодирующих направляющие РНК при помощи полимеразной цепной реакции с перекрывающимися олигонуклеотидами. Полученные фрагменты были клонированы в плазмидный вектор, предназначенный для экспрессии компонентов системы CRISPR-Cas9 в клетках млекопитающих. Вектор предварительно гидролизовали по сайту для эндонуклеазы рестрикции Bbsl. Отобранные плазмидные вектора pGR301, pGR302, pGR303, pGR304 были секвенированы для подтверждения получения запланированных генетических конструкций.
Трансфекцию NK-клеток векторами pGR301, pGR302, pGR303, pGR304 проводили с помощью липагента Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), клетки инкубировали в среде RPMI с 20% фетальной бычьей сывороткой до достижения плотности клеток 4 6х 105 клеток/мл. Готовили смесь липагента Lipofectamine 3000 и ДНК (из расчета 3 мкл липагента, 4 мкг pGR301 или pGR302 или pGR303 или pGR304, 8 мкл реагента Р3000™, 100 мкл среды Opti-MEM® Medium на 1 мл суспензии клеток). Инкубировали смесь в течение 5 мин и добавляли в суспензию клеток. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 5% С02.
Для отбора клеток, нокаутных по гену PD-1 через 48 ч после трансфекции клетки инкубировали с анти-PD-l антителами, мечеными флуоресцеином в течение 1 ч. Клетки отмывали средой культивирования и разделяли с помощью клеточного сортера. Отбирали единичные клетки с минимальным или отсутствующим флуоресцентным сигналом в лунки 96-луночного планшета со средой RPMI с 20% фетальной бычьей сывороткой. Культивировали клетки в течение 2 - 4 недель при 37°С и 5% С02 с заменой культуральной среды через каждые 3-4 сут.
Для получения меченых анти-PD-l антител использовали моноклональные мышиные анти-PD-l антитела, клон NAT 105 (Производитель Abeam кат. N аЬ52587) и набор для конъюгирования белков Fluorescein-EX Protein Labeling Kit (Производитель Invitrogen™, кат. No FI 0240).
Уровень экспрессии PD-1 в клонах оценивали с помощью иммуноблот инга с anti-PD-1 антителами. В качестве положительного контроля использовали нетрансфицированные NK-клетки. Клетки лизировали с помощью буфера, содержащего 25 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 1 мМЭДТА, 1 % Тритон- XI 00. Лизаты клеток центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Определяли концентрацию тотального белка в супернатанте и аликвоты, соответствующие 100 мкг белка разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Проводили электроперенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану. Затем нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованными белками промывали буфером I (20 мМ Трис-НС1, pH 7,5; 150 мМ NaCl; 0,05 % твин-20) и инкубировали в течение 1 ч в 2 % растворе бычьего сывороточного альбумина в буфере I. Затем инкубировали в течение 16 ч с первичными антителами к PD1 в 2 % БСА в буфере I. После этого мембрану промывали буфером I и инкубировали в течение 1 ч с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Производитель Bio-Rad) в 1 % растворе молока в буфере I.
Мембрану промывали буфером I и окрашивали с использованием коммерческого набора ECL™ для хемилюминесцентной детекции. Отбирали клоны, в которых не обнаруживались специфические полосы, соответствующие PD-1.
Получение NK-клеток с нокаутированным геном PD-1 и устойчивостью к антибиотику зеоцину.
Для повышения эффективности процесса создания клеток с нокаутированным геном PD-1 предложен способ отбора NK-клеток с помощью селективного маркера зеоцина.
Процесс включает несколько этапов: 1. Выбор последовательности направляющей РНК, специфичной к гену PD-1 имеющей последовательность согласно SEQ ID NO: 1 ;
2. Конструирование экспрессионного плазмидного вектора, кодирующего выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9 (pGR301);
3. Синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для устойчивости клеток к зеоцину имеющей последовательность согласно SEQ ID NO:9;
4. Трансфекция культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК;
5. Культивирование клеток в селективной среде с зеоцином.
6. Окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами, отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом с помощью проточного сортера.
7. Культивирование клонов клеток, вторичный отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами.
Для трансфекции клеток использовали смесь вектора pGR301 и фрагмента ДНК pdl-Zeo, SEQ ID NO:9, кодирующего ген резистентности к зеоцину. Для синтеза фрагмента ДНК, pdl-Zeo использовали полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами. Трансфекцию NK-клеток проводили с помощью липагента Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific). Для трансфекции липагентом Lipofectamine 3000 клетки инкубировали в среде RPMI с 20% фетальной бычьей сывороткой до достижения плотности клеток 4 6><105 клеток/мл. Готовили смесь липагента Lipofectamine 3000 и ДНК (из расчета 3 мкл липагента, 2 мкг вектора pGR301, 2 мкг фрагмента ДНК pdl-Zeo, 8 мкл реагента Р3000™, 100 мкл среды Opti-MEM® Medium на 1 мл суспензии клеток). Инкубировали смесь в течение 5 мин и добавляли в суспензию клеток. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 5% С02.
Для отбора NK-клеток, нокаутных по гену PD-1 с помощью селективного маркера зеоцина через 48 ч после трансфекции клетки переносили в селективную среду (RPMI с добавлением зеоцина) и культивировали в течение 2-4 недель. Выжившие клетки окрашивали анти-PD-l антителами, мечеными флуоресцеином. Образцы окрашенных клеток разделяли с помощью клеточного сортера. Отбирали единичные клетки с минимальным или отсутствующим флуоресцентным сигналом в лунки 96-луночного планшета со средой RPMI с 20% фетальной бычьей сывороткой. Культивировали клетки в течение 2 - 4 недель при 37°С и 5% С02 с заменой культуральной среды через каждые 3-4 сут.
Уровень экспрессии PD-1 в клонах оценивали с помощью иммуноблоттинга с anti-PD-1 антителами, аналогично протоколу, описанному для получения NK-клеток с нокаутированным геном PD-1.
Получение NK-клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas- лиганда.
Для повышения активности NK-клеток предложен способ получения NK-клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas-ligand.
Процесс включает несколько этапов:
1. Выбор последовательности направляющей РНК, специфичной к гену PD-1 имеющей последовательность согласно SEQ ID NO: 1 ;
2. Конструирование экспрессионного плазмидного вектора, кодирующего выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9 (pGR301);
3. Синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для Fas-лиганда имеющей последовательность согласно SEQ ID NO: 16;
4. Трансфекция культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК;
5. Окрашивание клеток анти PD-1 антителами и анти Fas-лиганд антителами. Отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом для PD-1 и максимальным сигналом для Fas-лиганда с помощью проточного сортера.
6. Культивирование клонов клеток, вторичный отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 и анти Fas-лиганд антителами.
Для трансфекции клеток использовали смесь вектора pGR301 и фрагмента ДНК pdl-FasL имеющего последовательность согласно SEQ ID NO: 16, кодирующего экспрессионную кассету для экспрессии Fas-лиганда. Для синтеза фрагмента ДНК, pdl-FasL использовали полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами.
Трансфекцию NK-клеток проводили с помощью липагента Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific). Для трансфекции липагентом Lipofectamine 3000 клетки инкубировали в среде RPMI с 20% фетальной бычьей сывороткой до достижения плотности клеток 4 -6x105 клеток/мл. Готовили смесь липагента Lipofectamine 3000 и ДНК (из расчета 3 мкл липагента, 2 мкг вектора pGR301 , 2 мкг фрагмента ДНК pdl-FasL, 8 мкл реагента Р3000™, 100 мкл среды Opti-MEM® Medium на 1 мл суспензии клеток). Инкубировали смесь в течение 5 мин и добавляли в суспензию клеток. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 5% СО2.
Для отбора клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas-лиганда через 48 ч после трансфекции клетки окрашивали смесью anti-PD-1 антител, меченых флуоресцеином и anti-Fas-лиганд антител, меченых Alexa Fluor® 610-R-phycoerythrin. Отбирали и клонировали клетки с минимальным флуоресцентным сигналом флуоресцеина и максимальным сигналом Alexa Fluor® 610-R-phycoerythrin.
Для получения меченых анти-РаБ-лиганд антител использовали моноклональные мышиные aHTH-Fas-лиганд антитела (Производитель BD Biosciences, клон G-247) и набор Zenon™ Alexa Fluor™ 610— R-Phycoerythrin Mouse IgGl Labeling Kit (Производитель Invitrogen™, кат. No Z25020).
Уровень экспрессии PD-1 в клонах оценивали с помощью иммуноблоттинга с anti-PD-1 антителами, аналогично протоколу, описанному для получения NK-клеток с нокаутированным геном PD-1. В клонах с подтвержденным нокаутом PD-1 оценивали уровень экспрессии Fas-лиганда. Проводили иммуноблоттинг с aHTH-Fas-лиганд антителами (Производитель BD Biosciences, клон G-247) по методике, аналогичной PD-1. В результате анализа отбирали клетки, в которых детектировался максимальный сигнал полос, соответствующих Fas-лиганду
Получение NK-клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL.
Для повышения активности NK-клеток предложен способ получения NK- клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL.
Процесс включает несколько этапов:
1. Выбор последовательности направляющей РНК, специфичной к гену
PD-1 имеющей последовательность согласно SEQ ID NO: 1 ;
2. Конструирование экспрессионного плазмидного вектора, кодирующего выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9 (pGR301);
3. Синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для TRAIL имеющей последовательность согласно SEQ ID NO:20; 4. Трансфекция культуры NK-клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК;
5. Окрашивание клеток анти PD-1 антителами и анти TRAIL антителами. Отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом для PD-1 и максимальным сигналом для TRAIL с помощью проточного сортера.
6. Культивирование клонов клеток, вторичный отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 и анти TRAIL антителами.
Для трансфекции клеток использовали смесь вектора pGR301 и фрагмента ДНК pdl -TRAIL, SEQ ID NO:20, кодирующего экспрессионную кассету для экспрессии TRAIL. Для синтеза фрагмента ДНК, pdl -TRAIL использовали полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами.Трансфекцию NK-клеток проводили с помощью липагента Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific). Для трансфекции липагентом Lipofectamine 3000 клетки инкубировали в среде RPMI с 20% фетальной бычьей сывороткой до достижения плотности клеток 4 -6x 105 клеток/мл. Готовили смесь липагента Lipofectamine 3000 и ДНК из расчета 3 мкл липагента, 2 мкг вектора pGR301 , 2 мкг фрагмента ДНК pdl -TRAIL, 8 мкл реагента Р3000™, 100 мкл среды Opti-MEM® Medium на 1 мл суспензии клеток. Инкубировали смесь в течение 5 мин и добавляли в суспензию клеток. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 5% СО2.
Для отбора клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL через 48 ч после трансфекции клетки окрашивали смесью anti-PD-1 антител, меченых флуоресцеином и anti -TRAIL антител, меченых Alexa Fluor® 610-R-phycoerythrin. Отбирали и клонировали клетки с минимальным флуоресцентным сигналом флуоресцеина и максимальным сигналом Alexa Fluor® 610-R-phycoerythrin.
Для получения меченых анти-TRAIL антител использовали моноклональные мышиные анти-TRAIL антитела (Производитель Abeam, клон 2Е5, кат.ДЬ аЬ2219) и набор Zenon™ Alexa Fluor™ 610— R-Phycoerythrin Mouse IgGl Labeling Kit (Производитель Invitrogen™, кат.К Z25020).
Уровень экспрессии PD-1 в клонах оценивали с помощью иммуноблоттинга с anti-PD-1 антителами, аналогично протоколу, описанному для получения NK-клеток с нокаутированным геном PD-1. В клонах с подтвержденным нокаутом PD-1 оценивали уровень экспрессии TRAIL. Проводили иммуноблоттинг с анти- TRAIL антителами (Производитель Abeam, клон 7541 1.11, кат. з abl0516) по методике, аналогичной PD-1. В результате анализа отбирали клетки, в которых детектировался максимальный сигнал полос, соответствующих TRAIL.
Клеточные линии HeLa (аденокарцинома шейки матки человека), К562 (миелоидная лейкемия человека), А 172 (глиобластома человека) и T98G (глиобластома человека) были получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, подтверждающими цитотоксическую активность клеток NK92-PD1, NK92-PD1- TRAIL вызвать апоптоз или лизис разных типов раковых клеток млекопитающих.
Пример 1. Оценка цитотоксической активности клеток NK92 и NK92-PD1 проинкубированных с клетками-мишенями К562 (миелоидная лейкемия человека), и с клетками-мишенями HeLa (аденокарцинома шейки матки человека).
В лунки 96-луночного планшета добавляли по 100 мкл суспензии клеток HeLa или К562 (2* 104/лун) в средах DMEM (Gibco) или RPMI 1640 (Gibco), содержащих 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone), соответственно, и инкубировали в течение 16 ч при 37°С и 5% СОг. Затем в лунки с клетками вносили по 50 мкл суспензии клеток NK92 и NK92-PD1 (6* 104/лун) в среде аМЕМ с добавлением 2 шМ L-глутамина, бикарбоната натрия (1.5 г/л), 0.2 шМ инозитола, 0.1 шМ 2-меркаптоэтанола, 0.02 шМ фолиевой кислоты, 250 U/ml рекомбинантного интерлейкина 2 (Prospec), 25% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone). Клетки инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СО2 и визуализировали с помощью микроскопа в проходящем свете (см. Фиг. 5 и Фиг. 6). Лунки с клетками HeLa, промывали забуференным физиологическим раствором, окрашивали оставшиеся клетки 0,2% раствором нейтрального красного и оценивали по поглощению света (длина волны - 540 нм) с помощью планшетного фотометра. Процент выживших клеток определяли как соотношение оптической плотности экспериментальных лунок, в которых размещены клетки HeLa с клетками NK92 или NK92-PD1, и оптической плотности контрольных лунок с клетками HeLa. Результат оценки цитотоксической активности клеток NK92 и NK92-PD1 -TRAIL проинкубированных с клетками-мишенями HeLa представлен на фиг. 7. Пример 2. Сравнительная кинетика роста культур NK92 и NK92-PD1
Для оценки пролиферативной активности в лунки 96-луночного планшета добавляли по 100 мкл суспензии клеток NK92 или NK92-PD1 (1*104/лун) в среде аМЕМ с добавлением 2 тМ L-глутамина, бикарбоната натрия (1.5 г/л), 0.2 тМ инозитола, 0.1 тМ 2-меркаптоэтанола, 0.02 шМ фолиевой кислоты, 400 U/ml рекомбинантного интерлейкина 2 (Prospec), 25% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone) и инкубировали в течение 72 ч при 37°С и 5% С02. Каждые 24 ч отбирали аликвоты клеток из 5ти лунок для каждого типа клеток, добавляли к ним равный объем 0,4% раствора трипанового синего и подсчитывали количество живых клеток с помощью Камеры Горяева. Результат оценки кинетик роста культур NK92 и NK92-PD1 представлен на Фиг. 8.
Пример 3. Оценка цитотоксической активности клеток NK92 и NK92-PD1- TRAIL на клетки А 172 (глиобластома человека).
В лунки 96-луночного планшета добавляли по 100 мкл суспензии клеток А172 (2*104/лун) в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone) и инкубировали в течение 16 ч при 37°С и 5% СОг. Затем в лунки с клетками вносили по 50 мкл суспензии клеток NK92 и NK92-PD1 -TRAIL (6* 104/лун) в среде аМЕМ с добавлением 2 шМ L-глутамина, бикарбоната натрия (1.5 г/л), 0.2 тМ инозитола, 0.1 шМ 2-меркаптоэтанола, 0.02 шМ фолиевой кислоты, 250 U/ml рекомбинантного интерлейкина 2 (Prospec), 25% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone). Клетки инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СОг и визуализировали с помощью микроскопа в проходящем свете. Лунки с клетками А 172, промывали забуференным физиологическим раствором, окрашивали оставшиеся клетки 0,2% раствором нейтрального красного и оценивали по поглощению света (длина волны - 540 нм) с помощью планшетного фотометра. Процент выживших клеток А 172 определяли как соотношение оптической плотности экспериментальных лунок (А172 с NK92 или NK92-PD1 PD1 -TRAIL и оптической плотности контрольных лунок с клетками А172. Результат оценки цитотоксической активности клеток NK92 и NK92-PD1 -TRAIL проинкубированных с клетками-мишенями А172 представлен на фиг. 9.
Пример 4. Оценка цитотоксической активности клеток NK92 и NK92-PD1- TRAIL на клетки T98G (глиобластома человека). В лунки 96-луночного планшета добавляли по 100 мкл суспензии клеток T98G (2*104/лун) в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone) и инкубировали в течение 16 ч при 37°С и 5% СОг. Затем в лунки с клетками вносили по 50 мкл суспензии клеток NK92 и NK92-PD1 -TRAIL (6* 104/лун) в среде аМЕМ с добавлением 2 тМ L-глутамина, бикарбоната натрия (1.5 г/л), 0.2 шМ инозитола, 0.1 шМ 2-меркаптоэтанола, 0.02 шМ фолиевой кислоты, 250 U/ml рекомбинантного интерлейкина 2 (Prospec), 25% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone). Клетки инкубировали в течение 8 ч при 37°С и 5% СО2 и визуализировали с помощью микроскопа в проходящем свете. Лунки с клетками T98G, промывали забуференным физиологическим раствором, окрашивали оставшиеся клетки 0,2% раствором нейтрального красного и оценивали по поглощению света (длина волны - 540 нм) с помощью планшетного фотометра. Процент выживших клеток определяли как соотношение оптической плотности экспериментальных лунок (T98G с NK92 или NK92-PD1 PD1 -TRAIL) и оптической плотности контрольных лунок (клетки T98G). Результат оценки цитотоксической активности клеток NK92 и NK92-PD1 -TRAIL проинкубированных с клетками-мишенями T98G представлен на фиг. 10.
Промышленная применимость
В соответствии с объектом изобретения, модифицированные клетки NK, линии клеток NK или их композиции с увеличенной цитотоксичностью предназначены для их использования при лечении рака у пациента. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения модифицированная NK - клетка, NK - клеточная линия или их композиция предназначена для использования при лечении рака крови, включая острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ). Модифицированная NK - клетка, NK - клеточная линия может быть использована при лечении: лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, включая Т-клеточные лимфомы, В- клеточные лимфомы, бессимптомные миеломы, тлеющие множественные миеломы (SMM), активные миеломы или легкие цепи миеломы.
Источники информации
1. HONJO Т„ SHIBAYAMA S. SUBSTANCE SPECIFIC ТО HUMAN PD-1.
Патент Японии ЛУР6157574 (В2) (2017-07-05). . JOHNSON BRYON D., MILLMAN R. METHODS FOR TREATING
HEMATOLOGIC CANCERS. Заявка США X<>US2016222121A1 (2016-08- 04).
3. LI ZONGHAI P. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-MODIFIED IMMUNE EFFECTOR CELL CARRYING PD-L1 BLOCKING AGENT. Европейский патент X°EP3382009 (2018-10-03).
4. Djoke Hendriks et al. Programmed Death Ligand 1 (PD-Ll)-targeted TRAIL combines PD-L1 -mediated checkpoint inhibition with TRAIL-mediated apoptosis induction. Oncoimmunology. 2016 Aug; 5(8).
5. Modiano JF1, Bellgrau D. Fas ligand based immunotherapy: A potent and
effective neoadjuvant with checkpoint inhibitor properties, or a systemically toxic promoter of tumor growth? Discov Med. 2016 Feb; 21(114):109-16.
6. HU В IAN; HUANG XINGXU Method for human PD1 gene specific knockout through CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) and sgRNA(single guide RNA)for specially targeting PD 1 gene. Заявка Китая X°CN 103820454 (2014-05-28).
7. Su S et al. CRISPR-Cas9 mediated efficient PD-1 disruption on human primary T cells from cancer patients. Sci Rep. 2016, Jan 28.
8. Xiuyan Wang, Isabelle Riviere: Clinical manufacturing of CAR T cells:
foundation of a promising therapy. Oncolytics 2016.
9. Galat V, Galat Y, Perepitchka M, et al. Transgene reactivation in induced
pluripotent stem cell derivatives and reversion to pluripotency of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev.
2016;25:1060-72.
10. Galat, Y., Dambaeva, S., Elcheva, L, Khanolkar, A., Beaman, K., Iannaccone, P.M., Galat, V., Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Res Ther 8, 67 (2017).
11. Kaufman; Dan S. Knorr; David A. Method for developing natural killer cells from stem cells. Патент США » US9260696 (2016-02-16).
12. O'Dwyer M. Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity. Патент США » US10034925 (2018-07-31).

Claims

Формула
1. Способ получения модифицированной линии NK - клеток, с нокаутированным геном PD-1 для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, отличающийся тем, что для инактивации экспрессии гена PD-1 осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO: l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, проводят трансфекцию культуры NK - клеток одним из плазмидных векторов, окрашивают клетки анти PD-1 антителами, осуществляют клонирование и отбор, затем проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами.
2. Способ получения модифицированной линии NK - клеток по п.1 , отличающийся тем, что в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552-6007 bp - fl ori; 6289- 6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
3. Применение модифицированной линии NK - клеток, с нокаутированным геном PD-1 полученной способом по п. 1 для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, включающее введение млекопитающему эффективного количества клетки-киллера (NK).
4. Способ отбора модифицированных NK-клеток с нокаутированным геном PD-1, который проводят с помощью селективного маркера зеоцина, при этом для инактивации экспрессии гена PD-1 осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, осуществляют синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для устойчивости клеток к зеоцину, имеющую последовательность согласно SEQ ID NO:9, проводят трансфекцию культуры NK-клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК, осуществляют культивирование клеток в селективной среде с зеоцином, проводят окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами, осуществляют отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом с помощью проточного сортера, проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами.
5. Способ отбора модифицированных NK-клеток с нокаутированным геном PD-1 по п.4, отличающийся тем, что в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552- 6007 bp - fl on; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl ori; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
6. Способ отбора модифицированных NK-клеток с нокаутированным геном PD-1 по п.4, отличающийся тем, что в состав донорской ДНК размером 2,371 тыс. пар оснований, обеспечивающей инактивацию экспрессии гена PD-1 с одновременной активацией экспрессии в NK-клетке белка зеоцин, входят: фрагмент содержащий последовательность первой части гена pdl размером 379 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; фрагмент содержащий последовательность CMV энхансера размером 405 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 1 ; фрагмент содержащий последовательность - hFerL Promoter размером 263 пары оснований характеризующий нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12; фрагмент содержащий последовательность - Zeo - ген резистентности к зеоцину размером 375 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 13; фрагмент содержащий последовательность bΰΐo polyA Signal размером 401 пара оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 14; фрагмент содержащий последовательность второй части гена pdl размером 276 пар оснований характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15.
7. Способ получения модифицированной линии NK -клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas- лиганда, в котором, для инактивации экспрессии гена PD-1, осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ID NO: l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, осуществляют синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для Fas- лиганда, имеющую последовательность согласно SEQ ID NO: 16, проводят трансфекцию культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК, осуществляют культивирование клеток, проводят окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами и анти Fas-лиганд антителами, осуществляют отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом для PD-1 и максимальным сигналом для Fas-лиганда с помощью проточного сортера, проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами и анти Fas-лиганд антителами.
8. Способ получения модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas- лиганда по п.7, отличающийся тем, что в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9; 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552- 6007 bp - W ori; 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl ori ; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
9. Способ получения модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas- лиганда для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего по п.7, отличающийся тем, что в состав донорской ДНК размером 2,473 тыс. пар оснований, обеспечивающей инактивацию экспрессии гена PD-1 с одновременной активацией экспрессии в NK-клетке белка Fas-ligand входят: фрагмент содержащий последовательность первой части гена pdl размером 379 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; фрагмент содержащий последовательность CMV Promoter размером 588 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 17; фрагмент содержащий последовательность - Fas-ligand размером 846 пар оснований характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 18; фрагмент содержащий последовательность - BGH polyA Signal размером 225 пар оснований характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 19; фрагмент содержащий последовательность второй части гена pdl размером 276 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15.
10. Применение модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией Fas- лиганда полученной способом по п. 7 для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, включающее введение млекопитающему эффективного количества клетки-киллера (NK).
11. Способ получения модифицированной линии NK -клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, отличающийся тем, что для инактивации экспрессии гена PD- 1, осуществляют выбор последовательностей направляющих РНК, специфичных к различным сайтам гена PD-1 входящим в группу SEQ ГО NO:l , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, конструируют экспрессионные плазмидные вектора, кодирующие выбранную направляющую РНК и эндонуклеазу Cas9, осуществляют синтез фрагмента донорской ДНК, кодирующей экспрессионную кассету для TRAIL, имеющую последовательность согласно SEQ ID NO:20, проводят трансфекцию культуры NK -клеток смесью плазмидного вектора и фрагмента донорской ДНК, осуществляют культивирование клеток, проводят окрашивание выживших клеток анти PD-1 антителами и анти TRAIL антителами, осуществляют отбор и клонирование клеток с минимальным сигналом для PD-1 и максимальным сигналом для TRAIL с помощью проточного сортера, проводят вторичное культивирование клонов клеток и отбор клеток с помощью иммуноблоттинга с анти PD-1 антителами и анти TRAIL антителами.
12. Способ получения модифицированной линии NK -клеток с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIT, по п.11, отличающийся тем, что в состав плазмидного вектора с физической картой, представленной на фиг.1 входят: 295-572 bp - CBh promoter; 819-5090 bp - эндонуклеаза Cas9 5121-5328 bp - PolyA Signal; 5552- 6007 bp - fl ori 6289-6393 bp - bla promoter; 6394-7254 bp - bla; 7425-8013 bp - ColEl on; 8075-8315 bp - U6 promoter; 8322-8419 bp - последовательность, кодирующая направляющую РНК.
13. Способ получения модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL по п.11, отличающийся тем, что в состав донорской ДНК размером 2,473 тыс. пар оснований, обеспечивающей инактивацию экспрессии гена PD-1 с одновременной активацией экспрессии в NK-клетке белка TRAIL входят: фрагмент содержащий последовательность первой части гена pdl размером 379 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10; фрагмент содержащий последовательность CMV Promoter размером 588 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 17; фрагмент содержащий последовательность - TRAIL размером 846 пар оснований, характеризующейся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:21 ; фрагмент содержащий последовательность - BGH polyA Signal размером 225 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 19; фрагмент содержащий последовательность второй части гена pdl размером 276 пар оснований, характеризующийся нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15.
14. Применение модифицированной линии NK -клеток, с нокаутированным геном PD-1 и конститутивной повышенной экспрессией TRAIL полученной способом по п. 1 1 для того, чтобы вызвать апоптоз или лизис раковых клеток млекопитающего, включающее введение млекопитающему эффективного количества клетки-киллера (NK).
PCT/RU2020/000188 2019-04-12 2020-04-09 Способ получения nk-клеток с нокаутированным геном pd-1 и повышенной экспрессией trail или fas-лиганд Ceased WO2020209759A2 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/602,929 US12359171B2 (en) 2019-04-12 2020-04-09 Method for producing NK cells with PD-1 knockout gene and trail or FAS-ligand overexpression
EP20788293.7A EP3954775A4 (en) 2019-04-12 2020-04-09 METHOD FOR PRODUCING NK CELLS WITH PD-1 KNOCKOUT GENE AND TRAIL OR FAS LIGAND OVEREXPRESSION

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019111060 2019-04-12
RU2019111060A RU2731293C1 (ru) 2019-04-12 2019-04-12 Способ получения генно-модифицированных линий клеток натуральных киллеров с нокаутированным геном PD-1 и повышенной экспрессией белков семейства Фактора Некроза Опухолей для иммунотерапии онкологических заболеваний

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2020209759A2 true WO2020209759A2 (ru) 2020-10-15
WO2020209759A3 WO2020209759A3 (ru) 2020-12-03

Family

ID=72421539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/000188 Ceased WO2020209759A2 (ru) 2019-04-12 2020-04-09 Способ получения nk-клеток с нокаутированным геном pd-1 и повышенной экспрессией trail или fas-лиганд

Country Status (4)

Country Link
US (1) US12359171B2 (ru)
EP (1) EP3954775A4 (ru)
RU (1) RU2731293C1 (ru)
WO (1) WO2020209759A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11459372B2 (en) 2020-11-30 2022-10-04 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
US12241087B2 (en) 2020-12-30 2025-03-04 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into NK cells

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI131854B1 (en) * 2023-05-29 2026-01-12 Onni Biotechnologies Oy Modified natural killer cells with enhanced cytotoxic activity and greater survival
CN116970647A (zh) * 2023-07-24 2023-10-31 华北理工大学 一种wsb2基因敲除单克隆细胞株的构建方法及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6157574B2 (ru) 1973-06-11 1986-12-08 Technicon Instr
CN103820454A (zh) 2014-03-04 2014-05-28 黄行许 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
US9260696B2 (en) 2012-04-24 2016-02-16 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
US20160222121A1 (en) 2013-09-26 2016-08-04 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
JP6157574B2 (ja) 2003-01-23 2017-07-05 小野薬品工業株式会社 ヒトｐｄ−１に対し特異性を有する物質
US10034925B2 (en) 2015-07-29 2018-07-31 Onkimmune Limited Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity
KR20180093990A (ko) 2015-12-07 2018-08-22 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 Pd-1 시그널 저해제의 병용 요법
EP3382009A1 (en) 2015-11-13 2018-10-03 Carsgen Therapeutics Ltd Chimeric antigen receptor-modified immune effector cell carrying pd-l1 blocking agent

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1220900A2 (de) * 1999-10-12 2002-07-10 Fritz Schwarzmann Gentransfervektoren zur therapie von autoimmunerkrankungen und erkrankungen mit immunpathogenese
CN102229962B (zh) * 2011-05-26 2014-04-23 陕西师范大学 纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体及构建方法和应用
AU2014290361B2 (en) * 2013-07-18 2019-04-18 Taurus Biosciences, Llc Humanized antibodies with ultralong complementarity determining regions
EP4043556B1 (en) * 2015-06-30 2024-02-07 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
EA201891338A1 (ru) 2015-12-04 2018-12-28 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
CN116850305A (zh) * 2016-05-06 2023-10-10 朱诺治疗学股份有限公司 基因工程化细胞及其制备方法
US20200208111A1 (en) * 2016-06-09 2020-07-02 Branden S. Moriarity Genome-edited nk cell and methods of making and using
CN107586777A (zh) 2016-07-08 2018-01-16 上海吉倍生物技术有限公司 人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物
CN109593721B (zh) 2017-09-30 2022-11-01 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞
CN108753817A (zh) * 2018-04-13 2018-11-06 北京华伟康信生物科技有限公司 增强细胞的抗癌能力的方法及采用该方法获得的增强型细胞

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6157574B2 (ru) 1973-06-11 1986-12-08 Technicon Instr
JP6157574B2 (ja) 2003-01-23 2017-07-05 小野薬品工業株式会社 ヒトｐｄ−１に対し特異性を有する物質
US9260696B2 (en) 2012-04-24 2016-02-16 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
US20160222121A1 (en) 2013-09-26 2016-08-04 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
CN103820454A (zh) 2014-03-04 2014-05-28 黄行许 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
US10034925B2 (en) 2015-07-29 2018-07-31 Onkimmune Limited Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity
EP3382009A1 (en) 2015-11-13 2018-10-03 Carsgen Therapeutics Ltd Chimeric antigen receptor-modified immune effector cell carrying pd-l1 blocking agent
KR20180093990A (ko) 2015-12-07 2018-08-22 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 Pd-1 시그널 저해제의 병용 요법

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DJOKE HENDRIKS ET AL.: "Programmed Death Ligand 1 (PD-Ll)-targeted TRAIL combines PD-L1-mediated checkpoint inhibition with TRAIL-mediated apoptosis induction", ONCOIMMUNOLOGY, vol. 5, no. 8, August 2016 (2016-08-01), XP055475948, DOI: 10.1080/2162402X.2016.1202390
GALAT VGALAT YPEREPITCHKA M ET AL.: "Transgene reactivation in induced pluripotent stem cell derivatives and reversion to pluripotency of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells", STEM CELLS DEV, vol. 25, 2016, pages 1060 - 72
GALAT, Y.DAMBAEVA, S.ELCHEVA, I.KHANOLKAR, A.BEAMAN, K.IANNACCONE, P.M.GALAT, V.: "Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential", STEM CELL RES THER, vol. 8, 2017, pages 67, XP055701621, DOI: 10.1186/s13287-017-0519-0
MODIANO JF1BELLGRAU D: "Fas ligand-based immunotherapy: A potent and effective neoadjuvant with checkpoint inhibitor properties, or a systemically toxic promoter of tumor growth?", DISCOV MED, vol. 21, no. 114, February 2016 (2016-02-01), pages 109 - 16
SU S ET AL.: "CRISPR-Cas9 mediated efficient PD-1 disruption on human primary T cells from cancer patients", SCI REP, 28 January 2016 (2016-01-28)
XIUYAN WANG: "Isabelle Riviere: Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy", ONCOLYTICS, 2016

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11459372B2 (en) 2020-11-30 2022-10-04 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
US11591381B2 (en) 2020-11-30 2023-02-28 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
US12344655B2 (en) 2020-11-30 2025-07-01 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
US12241087B2 (en) 2020-12-30 2025-03-04 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into NK cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP3954775A4 (en) 2024-01-17
US20220288117A1 (en) 2022-09-15
US12359171B2 (en) 2025-07-15
EP3954775A2 (en) 2022-02-16
WO2020209759A3 (ru) 2020-12-03
RU2731293C1 (ru) 2020-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250242020A1 (en) Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
US12359171B2 (en) Method for producing NK cells with PD-1 knockout gene and trail or FAS-ligand overexpression
JP2022116230A (ja) 免疫療法用改変細胞
CN109824778B (zh) 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN113614108A (zh) G蛋白偶合受体c类5族成员d(gprc5d)特异性嵌合抗原受体
SG11202111130SA (en) Chimeric receptors and methods of use thereof
JP2024069500A (ja) 抗ｇｐｃ３一本鎖抗体を含むｃａｒ
JP7471289B2 (ja) 抗ｌｉｖ１免疫細胞癌療法
CA3082010A1 (en) Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen (bcma)
CN112028996A (zh) 靶向bcma的单域抗体及其用途
JP2022502043A (ja) 抗ｃｄ１９／ｃｄ２２免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法
WO2020108644A1 (en) Cd19-and cd22-based combined car-t immunotherapy
US20120027763A1 (en) Antibody for Targeted induction of Apoptosis, CDC and ADCC mediated killing of Cancer cells, TBL-CLN1
CN109651511A (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
JP2021518104A (ja) 操作された細胞、ｔ細胞免疫調節抗体、およびそれらの使用方法
CN120051298A (zh) Gprc5d和bcma特异性嵌合抗原受体
US20230242638A1 (en) Chimeric antigen receptor targeting cldn18.2 and use thereof
CN104829725A (zh) 一种双特异性抗体cd133×cd3的构建及应用
CN114126719A (zh) 用于治疗非小细胞肺癌的方法和组合物
WO2019129174A1 (zh) 靶向cd19且高水平稳定表达cd40抗体的car-t细胞及其用途
JP2023509765A (ja) 工学的修飾ｔ細胞、その調製および応用
CN119278049A (zh) 遗传工程化b细胞及其使用方法
JP2024534795A (ja) 二重特異性抗体およびその使用
JP2015092865A (ja) ヒト化抗ｃｄ２０キメラ抗原レセプター
JP2022514815A (ja) ＣＤＲ１領域に突然変異したヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖを有するＣＡＲ－Ｔ細胞

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020788293

Country of ref document: EP

Effective date: 20211112

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20788293

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 17602929

Country of ref document: US