WO2020218412A1 - ペプチド化合物の製造方法 - Google Patents

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WO2020218412A1 PCT/JP2020/017477 JP2020017477W WO2020218412A1 WO 2020218412 A1 WO2020218412 A1 WO 2020218412A1 JP 2020017477 W JP2020017477 W JP 2020017477W WO 2020218412 A1 WO2020218412 A1 WO 2020218412A1
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peptide
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phe
formula
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道玄 半田
翔太 村瀬
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Nissan Chemical Corp
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for producing a peptide using a flow reactor.
  • Non-Patent Document 1 A method is known in which a C-terminal carboxy group in a peptide is activated with an alkyl chloroformate and reacted with a silylated amino acid or peptide to synthesize a peptide in which the carboxylic acid is liberated in one step (Patent Document 1, Patent Document 1, 2). It is known that the activated intermediate can be stably extracted by the method of activating the C-terminal carboxy group in the amino acid whose N-terminal is protected with an alkoxycarbonyl group using an alkyl chloroformate. (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 1 a method of continuously performing chemical synthesis while flowing a solution by using a small reaction device called a flow reactor or a microreactor is known.
  • Non-Patent Document 5 As an example of synthesizing a peptide, a method of synthesizing a dipeptide using triphosgene as a condensing agent and extending the peptide chain toward the N-terminal direction is known (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • the activation of the carboxy group is limited to the amino acid in which the amino group is protected, and the extension to the C-terminal side by the activation of the carboxy group at the peptide terminal having an amide bond, which easily forms azlactone, has been studied. Absent. Further, in the flow formulas described in Patent Documents 3 and 4, the C-terminal of the obtained peptide is an alkylamide that is difficult to deprotect, and is not suitable for the method of extending the peptide chain toward the C-terminal side. Then, it was found that when the peptide in which the C-terminal carboxy group was activated in HBTU was reacted with the silylated amino acid or peptide, the flow path was blocked due to solid precipitation.
  • the present invention provides a novel method for producing a peptide, which extends a peptide chain from the C-terminal side using a flow reactor.
  • the present inventors activated the C-terminal carboxy group of the peptide in a flow reactor using an acid halide and an organic tertiary amine having a specific structure, and the C-terminal carboxy group was activated.
  • the present invention is characterized by the following.
  • One of the alkylene chains may be replaced with O or NR 8 (R 8 represents an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent)], a tertiary amine and an acid.
  • R 8 represents an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent
  • AA 2 represents a silylated amino acid or peptide obtained by reacting an amino acid or peptide represented by [AA 2 represents an amino acid or a group derived from a peptide consisting of 2 to 20 residues] with a silylating agent. The process of reacting in a flow reactor.
  • the amount of the tertiary amine represented by the formula (II) to be used is 0.05 molar equivalent to 1 molar equivalent with respect to the N-protected peptide represented by the formula (I), and further, the formula (IV).
  • R 4 , R 5 and R 6 are aliphatic hydrocarbon groups (excluding methyl groups) which may independently have substituents, respectively, and among R 4 , R 5 and R 6 .
  • the two may form a C 5-6 alkylene chain to form a 6-7-membered ring together with the nitrogen atoms attached to them, at which time one of the alkylene chains is , O or NR 8 (where R 8 may be substituted for an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent)], according to [1].
  • Method for producing the peptide of. [3] The combined amount of the tertiary amine represented by the formula (IV) and the tertiary amine represented by the formula (II) is 1.0 to 1.0 to the N-protected peptide represented by the formula (I). The method for producing a peptide according to [2], which is 10 molar equivalents.
  • [4] The method for producing a peptide according to any one of [1] to [3], wherein the acid halide is an alkyl chloroformate, a carboxyl chloride, a sulfonate or a phosphate.
  • the acid halide is C 1-6 alkyl chloroformic acid.
  • the acid halide is isobutyl chloroformate.
  • the tertiary amine represented by the formula (II) is N, N-dimethylbutylamine, N, N-dimethylbenzylamine, N-methyldiethylamine, N-methylpiperidine or N-methylmorpholine, [1] to [ 6]
  • n- is normal, "i-” is iso, “s-" and “sec-” are secondary, “t-” and “tert-” are tertiary, and “c-” is cyclo.
  • P- is para, "Me” is methyl, “Bu” is butyl, “Pr” is propyl, "Bn” is benzyl, “Ph” is phenyl, “Boc” is t-butoxycarbonyl, “Cbz” is Benzyloxycarbonyl, “Fmoc” means 9-fluorenylmethoxycarbonyl, "Trt” means trityl, "Ac” means acetyl.
  • Halogen means fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • C 1-6 alkyl group means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group. Examples thereof include a group, an n-butyl group, an isobutyl group, an s-butyl group, a t-butyl group, an n-pentyl group, and an n-hexyl group.
  • the "aliphatic hydrocarbon group” is a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, which includes an alkyl group, a cycloalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aralkyl group and the like. Specific examples thereof include a C 1-10 alkyl group, a C 3-6 cycloalkyl group, a C 2-6 alkenyl group, a C 2-6 alkynyl group, a C 7-14 aralkyl group and the like.
  • the "C 1-10 alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and specific examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group. Examples thereof include groups, n-butyl groups, isobutyl groups, s-butyl groups, t-butyl groups, n-pentyl groups, n-hexyl groups, octyl groups and decyl groups.
  • C 2-6 alkyl group means a linear or branched alkyl group having 2 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and n.
  • -Butyl group, isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and the like can be mentioned.
  • C 2-6 alkenyl group means a linear or branched alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a vinyl group, a 1-propenyl group, an allyl group, and an iso. Examples thereof include a propenyl group, a butenyl group and an isobutenyl group.
  • C 2-6 alkynyl group means a linear or branched alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include an ethynyl group and a 1-propynyl group.
  • C 3-6 cycloalkyl group means a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • C 7-14 aralkyl group means an aralkyl group having 7 to 14 carbon atoms, and specific examples thereof include a benzyl group, a 1-phenylethyl group, a 2-phenylethyl group, and a 1-phenylpropyl group. Examples include a group, a naphthylmethyl group, a 1-naphthylethyl group, a 1-naphthylpropyl group and the like.
  • tri-C 1-6 alkylsilyl group means a group in which the same or different three “C 1-6 alkyl groups” are bonded to a silyl group, and specific examples thereof include a trimethylsilyl group and a triethylsilyl group. , Triisopropylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group and the like.
  • tri-C 1-6 alkylsilyloxy group means a group in which the same or different three "C 1-6 alkyl groups" are bonded to a silyloxy group, and specific examples thereof include a trimethylsilyloxy group and a triethyl. Examples thereof include a silyloxy group, a triisopropylsilyloxy group, and a t-butyldimethylsilyloxy group.
  • di C 1-6 alkylamino group means a group in which two identical or different "C 1-6 alkyl groups” are bonded to an amino group, and specific examples thereof include a dimethylamino group and a diethylamino group.
  • Di-n-propylamino group diisopropylamino group, di-n-butylamino group, diisobutylamino group, di-t-butylamino group, di-n-pentylamino group, di-n-hexylamino group, N -Ethyl-N-methylamino group, N-methyl-Nn-propylamino group, N-isopropyl-N-methylamino group, Nn-butyl-N-methylamino group, N-isobutyl-N-methyl Amino group, Nt-butyl-N-methylamino group, N-methyl-Nn-pentylamino group, Nn-hexyl-N-methylamino group, N-ethyl-Nn-propylamino group , N-ethyl-N-isopropylamino group, Nn-butyl-N-ethylamino group,
  • the "5-10-membered heterocyclic group” has 5 to 10 atoms constituting the ring and is independent of the group consisting of nitrogen atom, oxygen atom and sulfur atom in the atom constituting the ring. It means a heterocyclic group of a monocyclic system or a fused polycyclic system containing 1 to 4 heteroatoms selected in the above.
  • the heterocyclic group may be saturated, partially unsaturated or unsaturated, and specific examples thereof include a pyrrolidinyl group, a tetrahydrofuryl group, a tetrahydrothienyl group, a piperidyl group, a tetrahydropyranyl group and a tetrahydrothiopyranyl group.
  • Pyrrolyl group frill group, thienyl group, pyridyl group, pyrimidinyl group, pyridadinyl group, azepanyl group, oxepanyl group, thiepanyl group, azepinyl group, oxepynyl group, thiepinyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, oxazolyl group, thiazolyl group, imidazolyl group.
  • Examples thereof include a group, a pyrazinyl group, a morpholinyl group, a thiazinyl group, an indrill group, an isoindrill group, a benzoimidazolyl group, a prynyl group, a quinolyl group, an isoquinolyl group, a quinoxalinyl group, a cinnolinyl group, a pteridinyl group, a chromenyl group and an isochromenyl group.
  • the "C 6-14 aryl group” means an aromatic hydrocarbon group having 6 to 14 carbon atoms, and specific examples thereof include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, and a 1-. Examples thereof include an anthrasenyl group, a 2-anthrasenyl group, a 9-anthrasenyl group and a biphenyl group.
  • the "C 6-14 aryloxy group” means an aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms, and specific examples thereof include a phenoxy group, a 1-naphthyloxy group, a 2-naphthyloxy group, and a 1-. Examples thereof include an anthrasenyloxy group, a 2-anthrasenyloxy group, a 9-anthrasenyloxy group and a biphenyloxy group.
  • C 1-6 alkoxy group means a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, and an iso. Examples thereof include a propoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, a t-butoxy group, an n-pentyloxy group and an n-hexyloxy group.
  • C 3-6 cycloalkoxy group means a cycloalkoxy group having 3 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a cyclopropoxy group, a cyclobutoxy group, a cyclopentyloxy group, and a cyclohexyloxy group. Can be mentioned.
  • C 1-6 alkoxycarbonyl group means a linear or branched alkoxycarbonyl group having 1 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and n-. Examples thereof include a propoxycarbonyl group, an isopropoxycarbonyl group, an n-butoxycarbonyl group, an isobutoxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, an n-pentyloxycarbonyl group, and an n-hexyloxycarbonyl group.
  • arbitrary substituent is not particularly limited as long as it is a substituent that does not adversely affect the reaction targeted by the present invention.
  • Examples of the "substituent" in the "aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent” include a C 6-14 aryl group, a C 6-14 aryloxy group, a 5-10-membered heterocyclic group, and a hydroxy.
  • C 1-6 alkoxy group C 3-6 cycloalkoxy group, acetoxy group, benzoyloxy group, amino group, N-acetylamino group, di C 1-6 alkylamino group, halogen atom, C 1-6 alkoxy
  • Examples thereof include a carbonyl group, a phenoxycarbonyl group, an N-methylcarbamoyl group, an N-phenylcarbamoyl group, a tri-C 1-6 alkylsilyl group, a tri-C 1-6 alkylsilyloxy group, a cyano group, a nitro group and a carboxyl group.
  • C 6-14 aryl group Preferably C 6-14 aryl group, C 1-6 alkoxy group, di C 1-6 alkylamino group, tri C 1-6 alkylsilyl group, tri C 1-6 alkylsilyloxy group, more preferably.
  • N-protected peptide means a peptide in which the N-terminal amino group is protected and the C-terminal carboxyl group is unprotected.
  • R 1 , R 2 and R 3 when one of R 1 , R 2 and R 3 is a methyl group, the remaining two together form a C 5-6 alkylene chain to form a nitrogen atom to which they are bonded.
  • a 6-7-membered ring may be formed together with, at which time one of the alkylene chains represents O or NR 8 (R 8 represents an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent. ) May be replaced with, and examples thereof include piperidine, azepan, morpholin, N-methylpiperazin, and the like.
  • the amino acid used in the present invention is an organic compound having both functional groups of an amino group and a carboxy group, preferably ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid or ⁇ -amino acid, and more preferably ⁇ . -Amino acid or ⁇ -amino acid, more preferably ⁇ -amino acid.
  • the amino group of the amino acid used in the present invention may be substituted, preferably substituted with an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent, more preferably C 1-6 alkyl. It may be substituted with a group or a C 7-14 aralkyl group, more preferably a methyl group.
  • amino acids constituting the peptide used in the present invention are the above-mentioned amino acids.
  • the three-dimensional structure of ⁇ -amino acid is not particularly limited, but it is preferably L-form.
  • the C-terminal carboxy group of an N-protected peptide is activated in a flow reactor using an organic tertiary amine having a specific structure, and the silylated amino acid or peptide is reacted in the flow reactor.
  • This is a production method for obtaining a peptide having an elongated C-terminal.
  • the activation reaction of the C-terminal carboxy group of the N-protected peptide using an organic tertiary amine having a specific structure can be carried out in the presence of an acid chloride.
  • an organic tertiary amine having a specific structure is used as a catalyst, other bases can coexist.
  • the "organic tertiary amines having a specific structure” is an amine compound represented by the formula (II), preferably of R 1, R 2 and R 3, 1 or Two are methyl groups and the rest are amines that are C 1-6 alkyl groups that may have substituents, or one of R 1 , R 2 and R 3 is a methyl group and the other two by forming the alkylene chain of C 5 together, they form a 6-membered ring together with the nitrogen atom to which they are attached this time one of the alkylene chain represents an optionally amine be replaced with O , More preferably N, N-dimethylbutylamine, N, N-dimethylbenzylamine, N-methyldiethylamine, N-methylpiperidin or N-methylmorpholin.
  • the acid halide used in the present invention is preferably an alkyl chloroformate, a carboxyl chloride, a sulfonate, or a phosphate, more preferably an alkyl chloroformate, a carboxyl chloride, and even more preferably. It is C 1-6 alkyl chloroformate, particularly preferably isobutyl chloroformate.
  • the "other base” used in the present invention is an amine compound represented by the above formula (IV), and preferably R 4 , R 5 and R 6 independently have a substituent.
  • Amine which is a C 2-6 alkyl group, or two of R 4 , R 5 and R 6 together form a C 5 alkylene chain, which together with the nitrogen atom to which they are attached is 6 members. forms a ring, one of the alkylene chain at this time is replaced with O is also good amines, more preferably, R 4, R 5 and R 6, independently, C 2-6 alkyl
  • the amine is the base, more preferably N, N-diisopropylethylamine or tri-n-propylamine.
  • the amount of the "organic tertiary amine having a specific structure" used in the present invention is preferably 0.01 to 50 equivalents, more preferably 50 equivalents, relative to the N-protected peptide represented by the formula (I). It is 0.1 to 20 equivalents, more preferably 0.2 to 5 equivalents.
  • the amount of the "organic tertiary amine having a specific structure" used in the present invention is less than 1 equivalent with respect to the N-protected peptide represented by the formula (I), it is referred to as "other base”.
  • the combined amount used is preferably 0.9 to 50 equivalents, more preferably 0.95 to 20 equivalents, and even more preferably 1.0 equivalent, relative to the N-protected peptide represented by the formula (I). To 5 equivalents.
  • the amount of the acidified product used in the present invention is preferably 0.9 to 50 equivalents, more preferably 0.95 to 20 equivalents, relative to the N-protected peptide represented by the formula (I). More preferably, it is 1.0 to 5 equivalents.
  • silylated amino acid or peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it does not interfere with the reaction, but is prepared by, for example, the method described in Patent Documents 1 and 2 with an amino acid or peptide and a silylating agent.
  • the silylating agent used in the present invention is not particularly limited as long as it does not interfere with the reaction, and is, for example, N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide, N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide, hexamethyldisilazane, N-.
  • Methyl-N-trimethylsilylacetamide N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide, N- (trimethylsilyl) acetamido, N- (trimethylsilyl) diethylamine, N- (trimethylsilyl) dimethylamine, 1- (trimethylsilyl) imidazole, 3- (Trimethylsilyl) -2-oxazolidone, trimethylsilyl cyanide, chlorotrimerylsilane, trimethylsilane bromide, trimethylsilane iodide, trimethylsilyltrifurate, preferably N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide.
  • the solvent used in the present invention is not particularly limited as long as it does not interfere with the reaction, and examples thereof include halogen-containing hydrocarbon solvents (for example, dichloromethane and chloroform), aromatic hydrocarbon solvents (for example, toluene and xylene), and ethers.
  • Solvents eg, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, cyclopentylmethyl ether, methyl-t-butyl ether
  • amide solvents eg, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone
  • nitrile solvents eg, acetonitrile
  • It is preferably a nitrile solvent, an amide solvent, or an ether solvent, and more preferably acetonitrile, tetrahydrofuran, or N-methylpyrrolidone.
  • the amount of the solvent used in the present invention is preferably 100 times by mass or less, more preferably 1 to 50 times by mass, and further, with respect to the N-protected peptide represented by the formula (I). It is preferably 5 to 20 times by mass.
  • the flow reactor used in the present invention is a device capable of continuously feeding a reagent into the reactor and continuously taking out a reactant, and usually uses an elongated flow path having an inner diameter of about 10 ⁇ m to 3 cm.
  • a device commonly referred to as a microria tacu is a type of flow reactor.
  • the shape and material of the mixer and the flow path are not particularly limited.
  • a static mixer such as a T-shaped tube, a static mixer manufactured by Techno Applications Co., Ltd. (trade name C CincinnatimetX-01), a static mixer manufactured by Noritake (trade name C type, T type), and a static mixer manufactured by YMC Co., Ltd.
  • a helix type mixer such as a helix type mixer (trade name Spica) can be used, and a static type mixer (trade name C CincinnatimetX-01) manufactured by Techno Applications Co., Ltd. is preferable.
  • Stainless steel, glass, and polytetrafluoroethylene resin are preferable as the material of the mixer used in the present invention.
  • the flow path used in the present invention is not particularly limited, but a tube having a cross-sectional area of 80 ⁇ m 2 to 7 cm 2 and a length of 1 cm to 300 m is preferable, and a tube having a cross-sectional area of 0.2 mm 2 to 80 mm 2 and a length of 0. It is a tube of 1 m to 10 m.
  • the flow velocity used in the present invention is not particularly limited, but is, for example, 0.1 mL to 1 L per minute, preferably 5 mL to 500 mL per minute.
  • the reaction temperature in the present invention is not particularly limited, but can range from ⁇ 40 ° C. to the boiling point of the solvent used, but is preferably in the range of 0 to 40 ° C.
  • the mixer section may be set to a lower temperature than the subsequent sections.
  • reaction substrate has a hydroxy group, a mercapto group, an amino group, a carboxyl group or a carbonyl group (particularly when the side chain of the amino acid or peptide has a functional group), these groups are generally used in peptide chemistry and the like.
  • a protective group such as that used in the above may be introduced, and the target compound can be obtained by removing the protective group if necessary after the reaction.
  • Protection and deprotection use commonly known protecting groups to protect and deprotect reactions (eg, Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth edition). , Green (TW Greene), John Wiley & Sons Inc. (see John Wiley & Sons Inc.) (2006), etc.).
  • the proton nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) of the examples is JNM-ECP300 manufactured by Nippon Electronics (JEOL), JNM-ECX300 manufactured by Nippon Electronics (JEOL), or Bruker.
  • Ascend TM 500 manufactured by Ascend TM 500 was used to measure in a heavy chloroform or a heavy dimethylsulfoxide solvent, and the chemical shift was shown by the ⁇ value (ppm) when tetramethylsilane was used as the internal standard (0.0 ppm).
  • ESI + means a positive mode of electrospray ionization
  • M + H means a proton adduct
  • M + Na means a sodium adduct.
  • ESI- is a negative mode of electrospray ionization
  • MH means a proton deficient.
  • silica gel column chromatography used either a Hi-Flash column manufactured by Yamazen, SNAP Ultra Silka Cartridge manufactured by Biotage, silica gel 60 manufactured by Merck, or PSQ60B manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd.
  • the mixer used in this embodiment is a static mixer (trade name: C CincinnatimetX-01) manufactured by Techno Applications Co., Ltd.
  • Phenylalanine (0.74 g, 4.49 mm réellel) is mixed with acetonitrile (7.86 g), N, O-bistrimethylsilylacetamide (1.83 g, 8.98 mm réellel) is added, and then at 50 ° C. After stirring for 1 hour to homogenize, the mixture was cooled to room temperature to prepare solution 3.
  • Solution 1 was delivered at 12.1 mL / min and solution 2 at 5.80 mL / min, mixed with a mixer, and placed in a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 0.3 m.
  • the solution was passed, and solution 3 was further fed to the obtained mixed solution at 7.14 mL / min, mixed with a mixer, and contained in a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 1.0 m.
  • the solution was passed through, and the obtained solution was collected in a container to which water (1.0 mL) was previously added for 1.5 minutes.
  • the obtained solution was homogenized by adding N-methylpyrrolidone, and the quantitative yield of Fmnchc-Phe-Phe-Phe-OH in the obtained solution was 97.6%, and the diastereomer excess rate was 99. It was 8% de.
  • Quantitative analysis was carried out by the absolute calibration curve method using Fm Reasonc-Phe-Phe-Phe-OH synthesized by the following procedure as a standard substance.
  • a part of the N-methylpyrrolidone solution obtained in the reaction was withdrawn, concentrated under reduced pressure, diluted with methylene chloride (10.0 g), and washed twice with water (5.0 g).
  • the obtained organic layer was concentrated under reduced pressure, acetonitrile (5.0 g) was added, the mixture was stirred, and a solid was obtained by filtration. Then, it was dried under reduced pressure to obtain Fmnchc-Phe-Phe-Phe-OH (0.41 g) as a white solid.
  • the NMR of the standard substance is shown.
  • the solution 3 was further fed to the obtained mixed solution at 11.1 mL / min, mixed with a mixer, and contained in a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 1.0 m.
  • the solution was passed through, and the obtained solution was collected for 125 seconds in a container to which a 10% aqueous potassium carbonate solution (10 mL) was previously added.
  • the obtained solution was separated, and a 10% aqueous potassium carbonate solution (15 g) was added again to separate the solution, and the organic layer was washed with a 10% aqueous sodium chloride solution (10 g).
  • ⁇ Analysis Condition D> High Performance Liquid Chromatography: HPLC LC-20A manufactured by SHIMADZU Column: Agilent's Poroshell 120EC-C18 (2.7 ⁇ m, 3.0 x 100 mm) Column oven temperature: 40 ° C Eluent: Acetonitrile: 0.05 v Chromel% aqueous phosphoric acid solution 58:42 (0-27 minutes), 58: 42-95: 5 (27-32 minutes), 95: 5 (32-34 minutes) (v / v) Eluent rate: 0.9 mL / min Detection wavelength: 210 nm
  • the solution 3 was further fed to the obtained mixed solution at 7.8 mL / min, mixed with a mixer, and contained in a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 1.0 m.
  • the solution was passed through, and the obtained solution was collected for 105 seconds in a container to which water (2 mL) was previously added.
  • Acetonitrile (80 g) was mixed with the obtained solution, and the precipitated solid was filtered and dried to obtain Fmnchc-Phe-D-Phg-OH (1.50 g, yield 62%) as a white solid.
  • Phenylalanine (0.19 g, 1.06 mm Cincinnatil) is mixed with acetonitrile (1.97 g), N, O-bistrimethylsilylacetamide (0.469 g, 2.30 mm réellel) is added, and then at 50 ° C. After stirring for 1 hour to homogenize, the mixture was cooled to room temperature to prepare solution 3.
  • Solution 1 was delivered at 11.9 mL / min and solution 2 at 5.8 mL / min, mixed with a mixer, and placed in a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 0.3 m.
  • the diastereomer excess was calculated by analysis using high performance liquid chromatography ⁇ analysis condition C>.
  • the solution is passed, and the solution 3 is further fed to the obtained mixed solution at 73 mL / min, mixed with a mixer, and passed through a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 1.0 m.
  • the solution was liquefied, and the obtained solution was collected in a container to which 5 mass% hydrochloric acid (5 g) was previously added for 100 seconds.
  • the obtained solution was concentrated under reduced pressure, ethyl acetate (30 g) was added to separate the solutions, and the organic layer was washed twice with a 10 mass% sodium chloride aqueous solution (5 g).
  • the diastereomer excess was calculated by analysis using high performance liquid chromatography ⁇ Analysis Condition A>.
  • H-Phe-Phe-Leu-OH (0.255 g, 0.60 mm Cincinnatil) was mixed with acetonitrile (2.16 g) and N, O-bistrimethylsilylacetamide (0.244 g, 1.20 mm réellel). was added, and the mixture was stirred at room temperature to homogenize to prepare solution 3.
  • Solution 1 was delivered at 12.3 mL / min and solution 2 at 5.8 mL / min, mixed with a mixer, and placed in a tube made of polytetrafluoroethylene resin having an inner diameter of 1 mm and a length of 0.3 m.
  • ⁇ Analysis condition F> High Performance Liquid Chromatography: HPLC LC-20A manufactured by SHIMADZU Column: Agilent's Poroshell 120EC-C18 (2.7 ⁇ m, 3.0 x 100 mm) Column oven temperature: 40 ° C Eluent: Acetonitrile: 0.05 v Chromel% aqueous phosphoric acid solution 80:20 (0-27 minutes), 80: 20-95: 5 (27-32 minutes), 95: 5 (32-34 minutes) (v / v) Eluent rate: 0.9 mL / min Detection wavelength: 210 nm
  • the diastereomer excess was calculated by analysis using high performance liquid chromatography ⁇ Analysis Condition A>.

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Abstract

本発明は、ペプチドの高効率な製造方法を提供することを課題とする。　下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法： （１） 式（Ｉ）： で表されるＮ－保護ペプチドに、 式（ＩＩ）： で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、 式（ＩＩＩ）： で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程［式（Ｉ）～（ＩＩＩ）中、ＡＡ１、ＡＡ２、Ｐ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、本明細書及び特許請求の範囲に記載のとおりである］。

Description

ペプチド化合物の製造方法
　本発明は、フローリアクターを用いる、ペプチドの新規な製造方法に関する。
　ペプチド中のＣ末端カルボキシ基をクロロギ酸アルキルで活性化し、シリル化されたアミノ酸またはペプチドと反応させて、カルボン酸が遊離したペプチドを一段階で合成する方法が知られている（特許文献１、２）。なお、Ｎ末端をアルコキシカルボニル基で保護されたアミノ酸中のＣ末端カルボキシ基を、クロロギ酸アルキルを用いて活性化する方法では、活性化された中間体を安定に取り出すことができることが知られている（非特許文献１、２）。一方、例えばペプチドのようなＮ末端にアミド構造を有するアミノ酸中のＣ末端カルボキシ基を、クロロギ酸アルキルを用いて活性化する方法では、活性化された中間体を安定に取り出すことができず、アズラクトン(オキサゾロン)の形成が進行することが知られている（非特許文献１）。
　また、バッチ式とは異なる反応形式として連続式があり、その中でもフローリアクターやマイクロリアクターと呼ばれる小型反応装置を用いて、溶液を流しながら連続的に化学合成を行う方法が知られている。フローリアクターは、従来実施されているバッチ方式と比べて、小さな反応容器を用いて反応を行うため、精密な温度制御及び反応時間制御が可能であり、混合効率も良いという利点を有することが知られている（非特許文献５）。ペプチドを合成する例としては、縮合剤としてトリホスゲンを用いてジペプチドを合成し、Ｎ末端方向へペプチド鎖を伸長する方法が知られている（非特許文献３、４）。また、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）を縮合剤として用いて、ペプチド同士を縮合する方法が知られている（特許文献３、４）。
特許第５５３５９２８号 米国特許第５７１４４８４号 特開２００６－１６９１６５号公報 国際公開第２００７／０５９９２２号
インターナショナル　ジャーナル　オブ　ペプチド　アンド　プロテイン　リサーチ、１９８８年、３１巻、３３９－３４４頁 カナディアン　ジャーナル　オブ　ケミストリー、１９８７年、６７巻、６１９－６２４ アンゲヴァンテ　ケミー　インターナショナル　エディション、２０１４年、５３巻、８５１－８５５ ネイチャー　コミュニケーションズ、２０１６年、７、１３４２９ マイクロリアクターの開発と応用、２００３年、３－９頁
　本発明者らが確認したところ、特許文献１、２に記載のバッチ式では、カルボキシ基が活性化されたペプチドと、シリル化されたアミノ酸またはペプチドとの反応での発熱を制御するため、試薬の滴下に時間がかかり、副生物であるアズラクトンが生成して収率が低下し、工業的に実施するには不向きであることが見出された。
　一方、非特許文献３、４に記載のフロー式では、Ｃ末端がアルキル基で保護されたアミノ酸を用いているため、Ｃ末端方向にペプチドを伸長させる場合、Ｃ末端の脱保護が必要とされる。また、カルボキシ基の活性化は、アミノ基が保護されたアミノ酸のみであり、アズラクトンが生成しやすい、アミド結合を有するペプチド末端のカルボキシ基活性化による、Ｃ末端側への伸長の検討はなされていない。
　また、特許文献３、４に記載のフロー式では、得られたペプチドのＣ末端が、脱保護が難しいアルキルアミドであり、Ｃ末端側にペプチド鎖を伸長させる方法には適していない。そして、ＨＢＴＵでＣ末端カルボキシ基を活性化したペプチドと、シリル化されたアミノ酸またはペプチドとの反応を行うと、固体析出による流路の閉塞を発生させることが見出された。
　さらにフロー式において、クロロギ酸アルキルでカルボキシ基を活性化する際に用いられる有機３級アミンとして、バッチ式で使用されているトリエチルアミンやジイソプロピルエチルアミンを用いた場合、反応が十分に進行しないことが見出された。
　本発明は、フローリアクターを用いて、Ｃ末端側からペプチド鎖を伸長する、ペプチドの新規な製造方法を提供する。
　本発明者らは鋭意検討した結果、ペプチドのＣ末端カルボキシ基を酸ハロゲン化物と、特定の構造を有する有機３級アミンを用いてフローリアクター中で活性化し、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、シリル化されたアミノ酸又はペプチドとの反応をフローリアクター中で行うことにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下を特徴とするものである。
［１］
　下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法：
（１）
式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［式中、ＡＡ１は２～２０個のアミノ酸からなるペプチド由来の基を表し、ＰはＮ末端保護基を表す］で表されるＮ－保護ペプチドに、
式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、
式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中、ＡＡ2はアミノ酸又は、２～２０残基からなるペプチド由来の基を表す］で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程。
［２］
　式（ＩＩ）で表される３級アミンの使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して０．０５モル当量乃至１モル当量であり、さらに
式（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［式中、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、それぞれ置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基（ただし、メチル基を除く）であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、Ｃ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらと結合する窒素原子と一緒になって６－７員環を形成していてもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミンを使用する、［１］に記載のペプチドの製造方法。
［３］
　式（ＩＶ）で表される３級アミンと、式（ＩＩ）で表される３級アミンの合わせた使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１．０乃至１０モル当量である、［２］に記載のペプチドの製造方法。
［４］
　酸ハロゲン化物が、クロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物又はリン酸塩化物である、［１］乃至［３］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［５］
　酸ハロゲン化物が、クロロギ酸Ｃ１－６アルキルである、［１］乃至［４］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［６］
　酸ハロゲン化物が、クロロギ酸イソブチルである、［１］乃至［５］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［７］
　式（ＩＩ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである、［１］乃至［６］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［８］
　式（ＩＶ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである、［２］乃至［７］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［９］
　アミノ酸又はペプチドがα－アミノ酸で構成される、［１］乃至［８］のいずれか１つに記載のペプチドの製造方法。
［１０］
　Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、カルバメート系保護基である、［１］乃至［９］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１１］
　Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、［１］乃至［１０］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１２］
　シリル化剤が、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである、［１］乃至［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
　本発明により、フローリアクターによるペプチドの新規な製造方法を提供することができた。
　本明細書における「ｎ－」はノルマル、「ｉ－」はイソ、「ｓ－」及び「ｓｅｃ－」はセカンダリー、「ｔ－」及び「ｔｅｒｔ－」はターシャリー、「ｃ－」はシクロ、「ｐ－」はパラ、「Ｍｅ」はメチル、「Ｂｕ」はブチル、「Ｐｒ」はプロピル、「Ｂｎ」はベンジル、「Ｐｈ」はフェニル、「Ｂｏｃ」はｔ－ブトキシカルボニル、「Ｃｂｚ」はベンジルオキシカルボニル、「Ｆｍｏｃ」は９－フルオレニルメトキシカルボニル、「Ｔｒｔ」はトリチル、「Ａｃ」はアセチルを意味する。
　「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
　「Ｃ１－６アルキル基」とは、炭素数が１乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などが挙げられる。
　「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖、分岐鎖状又は環状の、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であり、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基等が挙げられ、具体例としては、Ｃ１－１０アルキル基、Ｃ３－６シクロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６アルキニル基、Ｃ７－１４アラルキル基等が挙げられる。
　「Ｃ１－１０アルキル基」とは、炭素数が１乃至１０個である直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、オクチル基、デシル基などが挙げられる。
　「Ｃ２－６アルキル基」とは、炭素数が２乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体例としては、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などが挙げられる。
　「Ｃ２－６アルケニル基」とは、炭素数が２乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルケニル基を意味し、具体例としては、ビニル基、１－プロペニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基などが挙げられる。
　「Ｃ２－６アルキニル基」とは、炭素数が２乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルキニル基を意味し、具体例としては、エチニル基、１－プロピニル基などが挙げられる。
　「Ｃ３－６シクロアルキル基」とは、炭素数が３乃至６個であるシクロアルキル基を意味し、具体例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　「Ｃ７－１４アラルキル基」とは、炭素数が７乃至１４個であるアラルキル基を意味し、具体例としては、ベンジル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、１－フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、１－ナフチルエチル基、１－ナフチルプロピル基などが挙げられる。
　「トリＣ１－６アルキルシリル基」とは、同一又は異なる３個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がシリル基に結合した基を意味し、具体例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基などが挙げられる。
　「トリＣ１－６アルキルシリルオキシ基」とは、同一又は異なる３個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がシリルオキシ基に結合した基を意味し、具体例としては、トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基、トリイソプロピルシリルオキシ基、ｔ－ブチルジメチルシリルオキシ基などが挙げられる。
　「ジＣ１－６アルキルアミノ基」とは、同一又は異なる２個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がアミノ基に結合した基を意味し、具体例としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ－ｎ－プロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジ－ｎ－ブチルアミノ基、ジイソブチルアミノ基、ジ－ｔ－ブチルアミノ基、ジ－ｎ－ペンチルアミノ基、ジ－ｎ－ヘキシルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－ｎ－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－イソブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－t－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－ペンチルアミノ基、Ｎ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルアミノ基、Ｎ－ｎ－ブチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－イソブチルアミノ基、Ｎ－t－ブチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－ペンチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－ヘキシルアミノ基などが挙げられる。
　「５－１０員複素環基」とは、環を構成する原子の数が５乃至１０個であり、かつ環を構成する原子中に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群より独立して選ばれる１乃至４個のヘテロ原子を含有する単環系又は縮合多環系の複素環基を意味する。この複素環基は飽和、部分不飽和、不飽和のいずれであってもよく、具体例としては、ピロリジニル基、テトラヒドロフリル基、テトラヒドロチエニル基、ピペリジル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、ピロリル基、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、アゼパニル基、オキセパニル基、チエパニル基、アゼピニル基、オキセピニル基、チエピニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、イミダゾリニル基、ピラジニル基、モルホリニル基、チアジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、クロメニル基、イソクロメニル基などが挙げられる。
　「Ｃ６－１４アリール基」とは、炭素数が６乃至１４個である芳香族炭化水素基を意味し、その具体例としては、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－アントラセニル基、２－アントラセニル基、９－アントラセニル基、ビフェニル基などが挙げられる。
　「Ｃ６－１４アリールオキシ基」とは、炭素数が６乃至１４個であるアリールオキシ基を意味し、具体例としては、フェノキシ基、１－ナフチルオキシ基、２－ナフチルオキシ基、１－アントラセニルオキシ基、２－アントラセニルオキシ基、９－アントラセニルオキシ基、ビフェニルオキシ基などが挙げられる。
　「Ｃ１－６アルコキシ基」とは、炭素数が１乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルコキシ基を意味し、具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基などが挙げられる。
　「Ｃ３－６シクロアルコキシ基」とは、炭素数が３乃至６個であるシクロアルコキシ基を意味し、具体例としては、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。
　「Ｃ１－６アルコキシカルボニル基」とは、炭素数が１乃至６個である直鎖又は分岐鎖状のアルコキシカルボニル基を意味し、具体例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ｎ－ペンチルオキシカルボニル基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　「置換基を有していてもよい」とは、無置換であるか、又は任意の数の任意の置換基で置換されていることを意味する。
　上記の「任意の置換基」は、本発明が対象とする反応に悪影響を与えない置換基であれば特に種類は限定されない。
　「置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基」における「置換基」としては、例えば、Ｃ６－１４アリール基、Ｃ６－１４アリールオキシ基、５－１０員複素環基、ヒドロキシ基、Ｃ１－６アルコキシ基、Ｃ３－６シクロアルコキシ基、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基、アミノ基、Ｎ－アセチルアミノ基、ジＣ１－６アルキルアミノ基、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、フェノキシカルボニル基、Ｎ－メチルカルバモイル基、Ｎ－フェニルカルバモイル基、トリＣ１－６アルキルシリル基、トリＣ１－６アルキルシリルオキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシル基等が挙げられ、好ましくは、Ｃ６－１４アリール基、Ｃ１－６アルコキシ基、ジＣ１－６アルキルアミノ基、トリＣ１－６アルキルシリル基、トリＣ１－６アルキルシリルオキシ基であり、より好ましくは、Ｃ６－１４アリール基、Ｃ１－６アルコキシ基、トリＣ１－６アルキルシリル基である。
　「Ｎ－保護ペプチド」とは、Ｎ末端のアミノ基が保護されており、Ｃ末端のカルボキシル基が無保護のペプチドを意味する。
　本明細書における、「Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す。）に置き換えられてもよい」の表記の具体例としては、ピペリジン、アゼパン、モルホリン、Ｎ－メチルピペラジン等が挙げられる。
　本発明で使用されるアミノ酸は、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を持つ有機化合物であり、好ましくはα－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸又はδ－アミノ酸であり、より好ましくはα－アミノ酸又はβ－アミノ酸であり、更に好ましくはα－アミノ酸である。
　本発明で使用されるアミノ酸のアミノ基は置換されていてもよく、好ましくは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基で置換されていてもよく、より好ましくはＣ１－６アルキル基又はＣ７－１４アラルキル基で置換されていてもよく、更に好ましくはメチル基で置換されていてもよい。
　本発明で使用されるペプチドを構成するアミノ酸は、上述のアミノ酸である。
　α－アミノ酸の立体構造は特に限定されないが、好ましくはＬ体である。
　本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
（本発明のペプチドの製造法の具体的な説明）
　以下に本発明のペプチドの製造法について説明する。
　本具体的な説明は以下に基づき説明される。
（ａ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記と同義である。
（ｂ）反応の具体的な条件は、本発明のペプチドの製造が達成される限りにおいて特に制限されない。各反応における好ましい条件は適宜詳述される。
（ｃ）各反応で記載される溶媒は、単独で用いても、２種類以上を混合して用いても良い。
　本発明は、Ｎ－保護ペプチドのＣ末端のカルボキシ基を特定の構造を有する有機３級アミンを用いてフローリアクター中で活性化させ、これにシリル化されたアミノ酸またはペプチドをフローリアクター中で反応させて、Ｃ末端が伸長されたペプチドを得る製造法である。
　特定の構造を有する有機３級アミンを用いたＮ－保護ペプチドのＣ末端カルボキシ基の活性化反応は、酸塩化物の存在下で実施することができる。また特定の構造を有する有機３級アミンを触媒として用いて実施する場合は、その他の塩基を共存させて実施することができる。
　本明細書中、「特定の構造を有する有機３級アミン」とは、上記式（ＩＩ）で表されるアミン化合物であり、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りが置換基を有していてもよいＣ１－６アルキル基であるアミン、又はＲ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基であり、残りの２つが一緒になってＣ５のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６員環を形成し、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏに置き換えられてもよいアミンであり、より好ましくは、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである。
　本発明で使用する酸ハロゲン化物は、好ましくはクロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物、リン酸塩化物であり、より好ましくはクロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物であり、さらに好ましくはクロロギ酸Ｃ１－６アルキルであり、特に好ましくはクロロギ酸イソブチルである。
　本発明で使用する「その他の塩基」とは、上記式（ＩＶ）で表されるアミン化合物であり、好ましくはＲ４、Ｒ５及びＲ６が、独立して、置換基を有していてもよいＣ２－６アルキル基であるアミン、又はＲ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、一緒になってＣ５のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６員環を形成し、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏに置き換えられてもよいアミンであり、より好ましくは、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、独立して、Ｃ２－６アルキル基であるアミンであり、さらに好ましくは、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである。
　本発明で使用する「特定の構造を有する有機３級アミン」の使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは０.０１当量乃至５０当量、より好ましくは０．１当量乃至２０当量、さらに好ましくは０．２当量乃至５当量である。
　本発明で使用する「特定の構造を有する有機３級アミン」の使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１当量未満である場合は、「その他の塩基」と合わせた使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは０.９当量乃至５０当量、より好ましくは０．９５当量乃至２０当量、さらに好ましくは１．０当量乃至５当量である。
　本発明で使用する酸塩化物の使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは０.９当量乃至５０当量、より好ましくは０．９５当量乃至２０当量、さらに好ましくは１．０当量乃至５当量である。
　本発明で使用するシリル化されたアミノ酸又はペプチドは、反応を妨げない限り特に限定されないが、例えば特許文献１、２に記載の方法で、アミノ酸またはペプチドとシリル化剤により調製される。
　本発明で使用するシリル化剤は、反応を妨げない限り特に限定されないが、例えばＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ヘキサメチルジシラザン、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルアセトアミド（ＭＳＡ）、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、Ｎ－（トリメチルシリル）アセトアミド、Ｎ－（トリメチルシリル）ジエチルアミン、Ｎ－（トリメチルシリル）ジメチルアミン、１－（トリメチルシリル）イミダゾール、３－（トリメチルシリル）－２－オキサゾリドン、トリメチルシリルシアニド、クロロトリメリルシラン、臭化トリメチルシラン、ヨウ化トリメチルシラン、トリメチルシリルトリフラートであり、好ましくはＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである。
　本発明で使用する溶媒は、反応を妨げない限り特に限定されないが、その例としては、含ハロゲン炭化水素溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム）、芳香族炭化水素溶媒（例えば、トルエン、キシレン）、エーテル溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、メチル－ｔ－ブチルエーテル）、アミド溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン）、ニトリル溶媒（例えば、アセトニトリル）等が挙げられる。好ましくはニトリル溶媒、アミド溶媒、又はエーテル溶媒であり、より好ましくはアセトニトリル、テトラヒドロフラン、又はＮ－メチルピロリドンである。
　本発明で使用する溶媒の使用量は、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して、好ましくは１００質量倍以下であり、より好ましくは１質量倍乃至５０質量倍であり、さらに好ましくは５質量倍乃至２０質量倍である。
　本発明で使用するフローリアクターとは、連続的にリアクターへ試剤を送入し連続的に反応物を取り出せるようにした装置であり、通常内径１０μｍから３ｃｍ程度の細長い流通路を用いる。一般にマイクロリアタクーと呼ばれる装置は、フローリアクターの一種である。
　本発明において、ミキサーおよび流通路の形状、材質は特に限定されるものではない。たとえばミキサーとしては、Ｔ字管、（株）テクノアプリケーションズ製スタティック型ミキサー（商品名ＣоｍｅｔＸ－０１）、ノリタケ製スタティックミキサー（商品名Ｃタイプ、Ｔタイプ）などのスタティック型ミキサー、（株）ワイエムシィ製へリックス型ミキサー（商品名スピカ）などのヘリックス型ミキサー等を用いることができ、好ましくは（株）テクノアプリケーションズ製スタティック型ミキサー（商品名ＣоｍｅｔＸ－０１）である。
　本発明で使用するミキサーの材質としてはステンレス、ガラス、ポリテトラフルオロエチレン樹脂が好ましい。
　本発明で使用する流通路としては、特に限定されないが、断面積８０μｍ２から７ｃｍ２、長さ１ｃｍから３００ｍのチューブが好ましく、より好ましくは断面積０.２ｍｍ２から８０ｍｍ２、長さ０．１ｍから１０ｍのチューブである。
　本発明で使用する流通路の材質としてはガラス、ステンレス、ポリテトラフルオロエチレン樹脂が好ましい。
　本発明で使用する流速は、特に限定されないが、たとえば毎分０．１ｍＬから１Ｌであり、好ましくは毎分５ｍＬから５００ｍＬである。
　本発明における反応温度は、特に限定されないが、－４０℃から使用する溶媒の沸点まで可能であるが、好ましくは０～４０℃の範囲で行うのがよい。除熱効率を上げるために、ミキサー部をそれ以降の部分よりも低温に設定してもよい。
　本発明で得られる、「Ｃ末端が伸長されたペプチド」は、式（Ｖ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［式中、各記号は上記と同義である。］で表される化合物である。
　各反応において、反応基質がヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基又はカルボニル基を有する場合（特にアミノ酸又はペプチドの側鎖に官能基を有する場合）、これらの基にペプチド化学等で一般的に用いられるような保護基が導入されていてもよく、反応後に必要に応じて保護基を除去することにより目的化合物を得ることができる。
　保護及び脱保護は、一般的に知られている保護基を用いて、保護・脱保護反応（例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第４版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｆｏｕｒｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．）（２００６年）など参照）を行うことにより実施することができる。
　以下に参考合成例、合成例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。
　実施例のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）は、特に記述が無い場合は、日本電子（ＪＥＯＬ）社製ＪＮＭ－ＥＣＰ３００、又は日本電子（ＪＥＯＬ）社製ＪＮＭ－ＥＣＸ３００、又は、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社製ＡｓｃｅｎｄＴＭ５００を用いて重クロロホルム又は重ジメチルスルホキシド溶媒中で測定し、化学シフトは、テトラメチルシランを内部標準（０．０ｐｐｍ）としたときのδ値（ｐｐｍ）で示した。
　ＮＭＲスペクトルの記載において、「ｓ」はシングレット、「ｄ」はダブレット、「ｔ」はトリプレット、「ｑ」はカルテット、「ｄｄ」はダブレット　オブ　ダブレット、「ｄｔ」はダブレット　オブ　トリプレット、「ｍ」はマルチプレット、「ｂｒ」はブロード、「Ｊ」はカップリング定数、「Ｈｚ」はヘルツ、「ＣＤＣｌ３」は重クロロホルムを意味する。
　高速液体クロマトグラフィー／質量分析は、特に記載が無い場合は、Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＱＤａ、Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＳＱＤ２、又は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製ＬＣ－２０ＡＤ／Ｔｒｉｐｌｅ　Ｔｏｆ５６００のいずれかを用いて測定した。
　高速液体クロマトグラフィー／質量分析の記載において、ＥＳＩ＋はエレクトロスプレーイオン化法のポジティブモードであり、Ｍ＋Ｈはプロトン付加体、Ｍ＋Ｎａはナトリウム付加体を意味する。
　高速液体クロマトグラフィー／質量分析の記載において、ＥＳＩ－はエレクトロスプレーイオン化法のネガティブモードであり、Ｍ－Ｈはプロトン欠損体を意味する。
　シリカゲルカラムクロマトグラフィーでの精製は、特に記述がない場合は、山善製Ｈｉ－Ｆｌａｓｈカラム、バイオタージ製ＳＮＡＰ　Ｕｌｔｒａ　Ｓｉｌｉｃａ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、メルク製シリカゲル６０又は富士シリシア化学製ＰＳＱ６０Ｂのいずれかを用いた。
　なお、本実施例中で用いられるミキサーは、断りが無い場合は、（株）テクノアプリケーションズ製スタティック型ミキサー（商品名ＣоｍｅｔＸ－０１）である。
参考合成例１：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　フェニルアラニン（１２．８　ｇ、　７８．５　ｍｍоｌ）をテトラヒドロフラン（７５．０　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３１．５　ｇ、１５７　ｍｍоｌ）を加えた後、４０℃で１時間撹拌し、０℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２５．０　ｇ、６４．５　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（７．８３　ｇ、７８．５　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１２５　ｇ）と混合させ、０℃に冷却して、クロロギ酸イソブチル（９．７０　ｇ、７１．０　ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、２分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を加え、１時間撹拌した。得られた反応液へ、水（５０　ｇ）を加え、減圧濃縮した。濃縮した液を酢酸エチル（１３０ｇ）で２回抽出して、得られた有機層の水での洗浄を３回実施した。得られた有機層を減圧濃縮してアセトニトリル（１５０　ｇ）を加え再度減圧濃縮し、アセトニトリル（１３０　ｇ）を加えて０．５時間撹拌した後、ろ過を行い、白色固体を得た。得られた固体にアセトニトリル（１５０　ｇ）を加えて０．５時間撹拌した後、ろ過で固体を得た後、減圧乾燥を行い、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２６．７　ｇ、収率７８％、ジアステレオマー過剰率９９．７％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５３５．３４（Ｍ＋Ｈ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ａ＞によって算出した。
＜分析条件Ａ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製　ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
４５：５５（０－１５分）、４５：５５－９５：５（１５－１８分）、９５：５（１８－２２分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．８　ｍＬ／分
検出波長：２１０　ｎｍ
合成例１：Ｎ－メチルモルホリンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００　ｇ、３．７４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．４５　ｇ、４．４９　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９　ｇ）及びアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．５６　ｇ、４．１１　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．７４　ｇ、　４．４９　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（１．８３　ｇ、８．９８　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．１　ｍＬ、溶液２を毎分５．８０　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．１４　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（１．０　ｍＬ）を加えた容器に１．５分間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９７．６％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．８％ｄｅであった。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６８２．５（Ｍ＋Ｈ）＋
　定量収率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｂ＞による定量分析法にて算出した。
＜分析条件Ｂ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製　ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７　μｍ、３．０×１００　ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
１０：９０（０分）、１０：９０－９５：５（０－１１分）、９５：５（１１－１５分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．７　ｍＬ／分
検出波長：２１０　ｎｍ
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｃ＞によって算出した。
＜分析条件Ｃ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製　ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
５０：５０（０－１５分）、５０：５０－９５：５（１５－１８分）、９５：５（１８－２２分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．７　ｍＬ／分
検出波長：２１０　ｎｍ
　定量分析は、以下の手順で合成したＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨを標準物質とした絶対検量線法にて、定量分析を行った。
　反応で得られたＮ－メチルピロリドン溶液を一部抜き取り、減圧濃縮して塩化メチレン（１０．０　ｇ）に希釈し、水（５．０　ｇ）で２回洗浄した。得られた有機層を減圧濃縮し、アセトニトリル（５．０　ｇ）を加えて撹拌し、ろ過で固体を得た。次いで、減圧乾燥を行い白色固体としてＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．４１　ｇ）を得た。
標準物質のＮＭＲを示す。
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ１２．８（１Ｈ，ｓ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５２－７．６２（２Ｈ，ｍ），７．１１－７．４２（２０Ｈ，ｍ），４．４２－７．６２（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．２２（４Ｈ，ｍ），２．６２－３．１０（６Ｈ，ｍ），
参考合成例２：Ｎ－エチルモルホリンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチルモルホリン（０．１２９　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は１９．３％であった。
合成例２：Ｎ－メチルピペリジンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルピペリジン（０．１１２　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９３．０％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．６％ｄｅであった。
参考合成例３：Ｎ－エチルピペリジンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチルピペリジン（０．１２７　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は１９．３％であった。
合成例３：Ｎ－メチルジエチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルジエチルアミン（０．０９８　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９５．４％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．７％ｄｅであった。
参考合成例４：トリエチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１１４　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は３３．２％であった。
合成例４：Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン（０．１１４　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９５．４％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．８％ｄｅであった。
合成例５：Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン（０．１５２　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９２．２％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．５％ｄｅであった。
合成例６：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン及びＮ－メチルモルホリンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１２１　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（０．０１９　ｇ、０．１９　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は９７．３％であり、ジアステレオマー過剰率は９９．８％ｄｅであった。
参考合成例５：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを用いたＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９４　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１４５　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びクロロホルム（３．７３　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１５３　ｇ、１．１３　ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３．７３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１８５　ｇ、　１．１３　ｍｍоｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４５７　ｇ、２．２６　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．０　ｍＬ、溶液２を毎分５．９３　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．０２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（０．５　ｍＬ）を加えた容器に１８秒間捕集した。得られた溶液をＮ－メチルピロリドンを加えて均一化させ、得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は２．０％であった。
参考合成例６：バッチ式でのＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 　フェニルアラニン（０．０７４　ｇ、　０．４４　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．１８３　ｇ、０．８８　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．２０　ｇ、０．３７　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．０４５　ｇ、０．４４　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．８９　ｇ）及びアセトニトリル（０．７９　ｇ）と混合させ、０℃に冷却して、クロロギ酸イソブチル（０．０６１　ｇ、０．４４　ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、３０分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を２時間かけて加え、３０分撹拌した。得られた反応液へ、水（１　ｇ）、Ｎ－メチルピロリドンを加えて均一化させた。得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は４２．０％であり、ジアステレオマー過剰率は９５．６％ｄｅであった。
参考合成例７：バッチ式でのＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　フェニルアラニン（０．０７４　ｇ、　０．４４　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１．５８　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．１８３　ｇ、０．８８　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却した（シリル化アミノ酸溶液）。Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．２０　ｇ、０．３７　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．０４５　ｇ、０．４４　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．８９　ｇ）及びアセトニトリル（０．７９　ｇ）と混合させ、２５℃でクロロギ酸イソブチル（０．０６１　ｇ、０．４４　ｍｍｏｌ）を一括で加えた後、３０分攪拌して、シリルアミノ酸溶液を２時間かけて加え、３０分撹拌した。得られた反応液へ、水（１　ｇ）、Ｎ－メチルピロリドンを加えて均一化させて得られた溶液のＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨの定量収率は２１．７％であり、ジアステレオマー過剰率は３０．１％ｄｅであった。
合成例７：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００　ｇ、３．７４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．４５４　ｇ、４．４９　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９　ｇ）及びアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．５６２　ｇ、４．１１　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｓ－トリチルシステイン（１．６３２　ｇ、　４．４９　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１７．３　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（１．８２７　ｇ、８．９８　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分９．４　ｍＬ、溶液２を毎分４．５　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分１１．１　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め１０％炭酸カリウム水溶液（１０　ｍＬ）を加えた容器に１２５秒間捕集した。得られた溶液を分液し、再度１０％炭酸カリウム水溶液（１５　ｇ）を加えて分液し、１０％塩化ナトリウム水溶液（１０　ｇ）で有機層を洗浄した。得られた有機層に１０％塩化ナトリウム水溶液（５　ｇ）、１０％塩化アンモニウム水溶液（５　ｇ）を加え２回分液した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフにて精製し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．７４　ｇ、収率９４％、ジアステレオマー過剰率９９．２％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；９０２．３６（Ｍ＋Ｎａ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｄ＞によって算出した。
＜分析条件Ｄ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製　ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
５８：４２（０－２７分）、５８：４２－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９　ｍＬ／分
検出波長：２１０　ｎｍ
合成例８：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２．００　ｇ、２．２７　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．２７６　ｇ、２．７２　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９　ｇ）及びアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．３４１　ｇ、２．５０　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｏ－ｔ-Ｂｕ－チロシン（０．６４７　ｇ、　２．７２　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（１．１１０　ｇ、５．４５　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２．４　ｍＬ、溶液２を毎分５．８　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分６．８　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め１０％炭酸カリウム水溶液（１０　ｍＬ）を加えた容器に９０秒間捕集した。得られた溶液を分液し、再度１０％炭酸カリウム水溶液（１５　ｇ）を加えて分液し、１０％塩化ナトリウム水溶液（１０　ｇ）で有機層を洗浄した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフにて精製し、捕集した溶液を濃縮した後、ヘキサン（４０　ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ（１．９５　ｇ、収率９２％、ジアステレオマー過剰率９９．６％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；１１２１．６４（Ｍ＋Ｎａ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｅ＞によって算出した。
＜分析条件Ｅ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製　ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
７０：４３０（０－２７分）、７０：３０－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９　ｍＬ／分
検出波長：２１０　ｎｍ
参考合成例８：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００　ｇ、５．１６　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．６２７　ｇ、６．１９　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９　ｇ）及びアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．７７６　ｇ、５．６８　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｄ－フェニルグリシン（０．９３６　ｇ、　６．１９　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３．２５５　ｇ、１２．４　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．５　ｍＬ、溶液２を毎分５．６　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．８　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（２　ｍＬ）を加えた容器に１０５秒間捕集した。得られた溶液にアセトニトリル（８０　ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨ（１．５０　ｇ、収率６２％）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５２１．３（Ｍ＋Ｎａ）＋
合成例９：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－Ｐｈｅ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－ＯＨ（０．５０　ｇ、０．９６　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．１１７　ｇ、１．１５　ｍｍｏｌ）をＮ－メチルピロリドン（２．５８　ｇ）及びアセトニトリル（１．９７　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．１４４　ｇ、１．０６　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．９７　ｇ）に溶解させ溶液２とした。フェニルアラニン（０．１９　ｇ、　１．０６　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（１．９７　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．４６９　ｇ、２．３０　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．９　ｍＬ、溶液２を毎分５．８　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．２　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（１　ｍＬ）を加えた容器に２０秒間捕集した。得られた溶液を減圧濃縮し、アセトニトリル（２５　ｇ）を混合し、析出した固体をろ過、乾燥し、Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｐｈｇ－Ｐｈｅ－ＯＨ（０．４５　ｇ、収率９５％）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６６８．４（Ｍ＋Ｎａ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｃ＞によって算出した。
合成例１０：Ｃｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　Ｃｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００　ｇ、４．４８　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．５９１　ｇ、５．３８　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９　ｇ）及びアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．６４１　ｇ、４．９３　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。ロイシン（０．７０５　ｇ、　５．３８　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（２．１８７　ｇ、１０．８　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１２.０　ｍＬ、溶液２を毎分５．８　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７３　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め５質量％塩酸（５　ｇ）を加えた容器に１００秒間捕集した。得られた溶液を減圧濃縮して酢酸エチル（３０　ｇ）を加え分液し、１０質量％塩化ナトリウム水溶液（５　ｇ）で有機層を２回洗浄した。得られた有機層を濃縮し、ヘキサン（４０　ｇ）を加え撹拌して析出した固体をろ過、乾燥してＣｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（２．１７　ｇ、収率９６％、ジアステレオマー過剰率１００％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；５６０．４（Ｍ＋Ｈ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ａ＞によって算出した。
参考合成例９：Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　Ｃｂｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１．５０　ｇ、２．６８　ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１０　ｇ）及びメタノール（１０　ｇ）に加えて溶解させ、１０質量％パラジウム炭素（０．１５　ｇ、ＮＥケムキャット製、ＰＥタイプ）を加え、２１℃にて水素置換して１時間撹拌した。得られた溶液をろ過し、ろ物にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０　ｇ）を加えて撹拌後、ろ過してろ液１を得た。得られたろ物に再度Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０　ｇ）を加えて撹拌後、ろ過してろ液２を得た。ろ液１とろ液２を混合して減圧濃縮し、アセトニトリル（２０　ｇ）を加えて撹拌した後、ろ過を行い、得られた固体を乾燥して、Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１．０３　ｇ、収率９０％）を灰色固体としてを得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；４２６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
合成例１１：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨ（０．５５　ｇ、０．５０　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．０６６　ｇ、０．６０　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２．４５　ｇ）及びアセトニトリル（２．１６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．０７５　ｇ、０．５５　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．１６　ｇ）に溶解させ溶液２とした。Ｈ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（０．２５５　ｇ、　０．６０　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（２．１６　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（０．２４４　ｇ、１．２０　ｍｍоｌ）を加えた後、室温で撹拌し均一化させ溶液３とした。溶液１を毎分１２．３　ｍＬ、溶液２を毎分５．８　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分６．９　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め水（１　ｇ）を加えた容器に２０秒間捕集した。得られた溶液に水（４　ｇ）を混合して撹拌し、析出した固体をろ過、乾燥してＦｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨ（０．４３　ｇ、収率８４％、ジアステレオマー過剰率９９．４％ｄｅ）を白色固体としてを得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；１５０７（Ｍ＋Ｈ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ｆ＞によって算出した。
＜分析条件Ｆ＞
高速液体クロマトグラフィー：ＳＨＩＭＡＤＺＵ製　ＨＰＬＣ ＬＣ－２０Ａ
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０ＥＣ－Ｃ１８（２．７μｍ、３．０×１００ｍｍ）
カラムオーブン温度：４０℃
溶離液：アセトニトリル：０．０５ｖоｌ％ リン酸水溶液
８０：２０（０－２７分）、８０：２０－９５：５（２７－３２分）、９５：５（３２－３４分）（ｖ／ｖ）
溶離液速度：０．９　ｍＬ／分
検出波長：２１０　ｎｍ
合成例１２：Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＭｅＧｌｙ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　Ｆｍоｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ（２．００　ｇ、３．７４　ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（０．４５４　ｇ、４．４９　ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８．８９　ｇ）及びアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、均一化して溶液１とした。クロロギ酸イソブチル（０．５６２　ｇ、４．１１　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（７．８６３　ｇ）に溶解させ溶液２とした。サルコシン（０．６６７　ｇ、　７．４８　ｍｍоｌ）をアセトニトリル（７．８６　ｇ）と混合させ、Ｎ，Ｏ－ビストリメチルシリルアセトアミド（３．０４　ｇ、１５．０　ｍｍоｌ）を加えた後、５０℃で１時間撹拌し均一化させた後、室温に冷却して溶液３とした。溶液１を毎分１１．７　ｍＬ、溶液２を毎分５．６　ｍＬでそれぞれ送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ０．３ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた混合溶液へさらに溶液３を毎分７．７　ｍＬで送液し、ミキサーで混合し、内径１　ｍｍの長さ１．０　ｍのポリテトラフルオロエチレン樹脂製のチューブ内を通液させ、得られた溶液を、予め５質量％塩酸（１０　ｇ）を加えた容器に１０７秒間捕集した。得られた溶液を減圧濃縮して酢酸エチル（３０　ｇ）を加え分液し、１０質量％塩化ナトリウム水溶液（１０　ｇ）で有機層を２回洗浄した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフにて精製してＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＭｅＧｌｙ－ＯＨ（２．０６　ｇ、収率９６％、ジアステレオマー過剰率９９．７％ｄｅ）を白色固体として得た。
ＭＡＳＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ；６０６．４（Ｍ＋Ｈ）＋
　ジアステレオマー過剰率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた分析＜分析条件Ａ＞によって算出した。
　本発明により、ペプチドの高効率な製造方法を提供することができる。

Claims (12)

  1. 　下記工程（１）を含む、ペプチドの製造方法：
    （１）
    式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、ＡＡ１は２～２０個のアミノ酸からなるペプチド由来の基を表し、ＰはＮ末端保護基を表す］で表されるＮ－保護ペプチドに、
    式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ［式中、
    Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内、１つ又は２つがメチル基であり、残りは置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内１つがメチル基のとき、残りの２つが一緒になってＣ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらが結合する窒素原子と共に６－７員環を形成してもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミン及び酸ハロゲン化物をフローリアクター中で反応させて得られる、Ｃ末端カルボキシ基が活性化されたペプチドと、
    式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    ［式中、ＡＡ2はアミノ酸又は、２～２０残基からなるペプチド由来の基を表す］で表されるアミノ酸又はペプチドにシリル化剤を反応させて得られるシリル化されたアミノ酸又はペプチドを、フローリアクター中で反応させる工程。
  2. 　式（ＩＩ）で表される３級アミンの使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して０．０５モル当量乃至１モル当量であり、さらに
    式（ＩＶ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    ［式中、
    Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、それぞれ置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基（ただし、メチル基を除く）であり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の内２つが、Ｃ５－６のアルキレン鎖を形成することにより、それらと結合する窒素原子と一緒になって６－７員環を形成していてもよく、このときこのアルキレン鎖の内１つは、Ｏ又はＮＲ８（Ｒ８は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を表す）に置き換えられてもよい］で表される３級アミンを使用する、請求項１に記載のペプチドの製造方法。
  3. 　式（ＩＶ）で表される３級アミンと、式（ＩＩ）で表される３級アミンの合わせた使用量が、式（Ｉ）で表されるＮ－保護ペプチドに対して１．０乃至１０モル当量である、請求項２に記載のペプチドの製造方法。
  4. 　酸ハロゲン化物が、クロロギ酸アルキル、カルボン酸塩化物、スルホン酸塩化物又はリン酸塩化物である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  5. 　酸ハロゲン化物が、クロロギ酸Ｃ１－６アルキルである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  6. 　酸ハロゲン化物が、クロロギ酸イソブチルである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  7. 　式（ＩＩ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチルブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、Ｎ－メチルジエチルアミン、Ｎ－メチルピペリジン又はＮ－メチルモルホリンである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  8. 　式（ＩＶ）で表される３級アミンが、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン又はトリ－ｎ－プロピルアミンである、請求項２乃至７のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  9. 　アミノ酸又はペプチドがα－アミノ酸で構成される、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  10. 　Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、カルバメート系保護基である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　Ｎ－保護ペプチドのＮ末端の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　シリル化剤が、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の製造方法。
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