WO2020241679A1 - 脂質ナノ粒子 - Google Patents

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悠介 佐藤
原島　秀吉
学 渡慶次
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Hokkaido University NUC
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    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Definitions

  • the present invention relates to lipid nanoparticles useful as carriers of RNA-protein complexes (ribonucleoproteins; RNPs) used for genome editing by the CRISPR system.
  • RNPs ribonucleoproteins
  • Genome editing technology is a biotechnology that can selectively introduce mutations or insert arbitrary DNA sequences containing genes into any target genomic DNA region. Genome editing technology is eagerly desired to be applied to medicine because it leads to the realization of fundamental treatments for various intractable diseases such as hereditary diseases and infectious diseases. Among them, the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) / Cas9 (CRISPR-associatedproteins9) system, which is the third-generation genome editing technology, is currently receiving the most attention due to its excellent gene knockout efficiency and ease of design. Is.
  • This system is a gRNA (guide) that is a chimeric RNA consisting of Cas9 protein with DNA double-strand break (DSB) activity and bacterial-derived crRNA (CRISPRRNA) and tracrRNA (trans-activating CRISPRRNA). Functions as an RNP with RNA). Therefore, it is possible to induce a gene knockout of interest by expressing RNP in the target cell or delivering the RNP itself into the target cell. Furthermore, by simultaneously delivering the donor DNA, it is possible to induce gene knock-in.
  • gRNA guide
  • CRISPRRNA bacterial-derived crRNA
  • tracrRNA trans-activating CRISPRRNA
  • Non-Patent Document 1 a method using DNA Nanoclews (Non-Patent Document 1), a method using in vivo reducing lipid nanoparticles (Non-Patent Document 2), a method using a conjugate with gold nanoparticles (Non-Patent Document 3), and liposome.
  • Non-Patent Document 4 a method using in vivo reducing lipid nanoparticles
  • Non-Patent Document 3 a method using a conjugate with gold nanoparticles
  • Non-Patent Document 5 a method using lecithin nano-liposomal particles
  • CRISPR-Gold Non-Patent Document 6
  • CRISPR-Gold has been reported as an example of inducing gene knock-in.
  • a high concentration of Cas9 is required to induce gene knockdown in cultured cells, and there remains a problem in genome editing efficiency.
  • lipid nanoparticles containing nucleic acids and the like there is a method based on an alcohol dilution method using a flow path.
  • lipid nanoparticles having a diameter of about 30 nm can be reproducibly produced by using a microchannel having a built-in three-dimensional micromixer capable of achieving instantaneous mixing of two liquids (Non-Patent Document 7).
  • lipid nanoparticles carrying nucleic acids such as fat-soluble drugs and siRNA (short interfering RNA) or mRNA.
  • LNPs lipid nanoparticles
  • siRNA short interfering RNA
  • lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipids as constituent lipids have been reported as lipid nanoparticles serving as carriers for efficiently delivering nucleic acids such as siRNA into target cells (Patent Document 2).
  • Proteins such as RNP are irreversible due to various physical parameters during particle production such as organic solvents such as alcohol, pH of buffer solution, salt concentration, temperature, etc., compared to small molecule drugs and nucleic acids that have been used so far. Susceptible to inactivation. Therefore, to date, there have been no reports on the production of RNP-loaded lipid nanoparticle preparations based on the alcohol dilution method.
  • An object of the present invention is to provide lipid nanoparticles containing nucleic acids and the like necessary for genome editing, which can be produced by an alcohol dilution method using a flow path, and have excellent genome editing efficiency. And.
  • RNP which is a complex of crRNA, tracrRNA, and Cas9 protein
  • ssON single-stranded oligonucleotide
  • the present invention provides the following lipid nanoparticles.
  • lipid component Containing a lipid component, a DNA nuclease, a guide RNA, and a single-strand oligonucleotide
  • the lipid component has the following general formula (I).
  • d represents an integer of 0 to 3; R 3 and R 4 are independently C 1-4 alkyl groups or C 2-4 alkenyl groups (the C 1-4 alkyl groups or C 2), respectively.
  • the -4 alkenyl group indicates that one or two hydrogen atoms may be substituted with a phenyl group), whereas R 3 and R 4 are bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle (the).
  • One or two hydrogen atoms on the ring may be substituted with a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group)).
  • a group represented by or a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (however, the group is bonded to (O-CO) b- by a carbon atom, and one or two hydrogen atoms of the ring are C. It may be substituted with a 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group)] It contains a pH-sensitive cationic lipid represented by, a neutral phospholipid, and a polyalkylene glycol-modified lipid. The ratio of the pH-sensitive cationic lipid to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles is 30 to 50 mol%.
  • the ratio of the neutral phospholipid to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles is 20 to 50 mol%.
  • Lipid nanoparticles in which the ratio of the polyalkylene glycol-modified lipid to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles is 1 to 4 mol%.
  • the DNA nuclease is a Cas9 protein.
  • the Cas9 protein is a protein having only one of RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity.
  • the first introduction path into which the first fluid is introduced and the second introduction path into which the second fluid is introduced, which are independent of each other, have a certain length and merge with each other. It forms one dilution channel and
  • the dilution channel has a two-dimensionally bent channel portion at least in a part thereof.
  • the axial direction of the dilution flow path upstream from this or its extension direction is the X direction
  • the width direction of the dilution flow path perpendicular to the X direction is the Y direction, and upstream of this.
  • the substantially Y direction (approximately + Y direction, approximately ⁇ Y direction) is alternately directed toward the center side of the flow path from both side walls of the dilution flow paths facing each other in the Y direction. )
  • the structure that regulates the flow path width of the above is formed by providing at least two or more structure elements at regular intervals d 1 , d 2 ...
  • the pH of the lipid solution containing the lipid component dissolved in ethanol from the first introduction route and the DNA nuclease, the guide RNA, and the single-stranded oligonucleotide from the second introduction route is 5.0 or more.
  • a method for producing lipid nanoparticles wherein the total flow rate of the aqueous solution is 1 ⁇ L / min to 100 mL / min, and the ratio of the flow velocity of the aqueous solution to the flow velocity of the lipid-dissolved solution is 7 or more.
  • the flow path structure further has a third introduction path for introducing a third fluid.
  • the first introduction path, the second introduction path, and the third introduction path meet with each other having a certain length so as to form one dilution flow path.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are mounted on lipid nanoparticles having a specific composition of lipid membrane structure containing pH-sensitive cationic lipids, RNP can efficiently edit the genome of target cells. Further, the lipid nanoparticles according to the present invention can be produced by an alcohol dilution method because the RNP mounted on the lipid membrane structure contains ssON and is negatively charged.
  • Example 1 the measurement result of the ratio ([KI (%)] / [KO (%)]) of the knock-in efficiency (%) to the knockout efficiency (%) of each RNP-loaded lipid nanoparticles with respect to HeLa-GFP cells was obtained. It is a figure shown. In Example 2, it is a figure which showed the measurement result of the GFP knockout efficiency (%) with respect to the HeLa-GFP cell of each RNP-loaded lipid nanoparticle in the primary screening. In Example 2, it is a figure which showed the prediction profile of the number average particle diameter when the factor which significantly influences the number average particle diameter in the primary screening was changed. It is a figure which showed the prediction profile of the encapsulation rate when the factor which significantly influences the encapsulation rate in the primary screening was changed in Example 2.
  • Example 2 it is a figure which showed the prediction profile of the gene knockout activity when the factor which significantly influences the gene knockout activity in the primary screening was changed.
  • Example 2 it is a figure which showed the prediction profile of the number average particle diameter when the factor which significantly influences the number average particle diameter in the secondary screening was changed.
  • Example 2 it is a figure which showed the prediction profile of the encapsulation rate when the factor which significantly influences the encapsulation rate in the secondary screening was changed.
  • Example 2 it is a figure which showed the prediction profile of the gene knockout activity when the factor which significantly influences the gene knockout activity in the secondary screening was changed.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring the zeta potential and PdI over time by storing cells to which RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 were added in Example 3 at 4 ° C.
  • Example 3 it is the figure which showed the measurement result of the GFP knockout efficiency (%) with respect to the HeLa-GFP cell of the RNP-carrying lipid nanoparticles B-9 before and after storage at 4 degreeC.
  • Example 4 measurement of GFP knockout efficiency (%) in HeLa-GFP cells cultured by adding RNP-loaded lipid nanoparticles B-4 or B-9 to a medium so as to have a Cas9 protein concentration of 0.1 nM. It is a figure which showed the result.
  • Example 4 measurement of GFP knockout efficiency (%) in HeLa-GFP cells cultured by adding RNP-loaded lipid nanoparticles B-4 or B-9 to a medium so as to have a Cas9 protein concentration of 0.3 nM. It is a figure which showed the result.
  • Example 5 the measurement result of the GFP knockout efficiency (%) in HeLa-GFP cells cultured by adding RNP-loaded lipid nanoparticles to a medium so that the Cpf1 protein concentration was 0.5, 1, or 2 nM was obtained. It is a figure shown.
  • Example 6 RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cas9n protein or RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cas9 protein were added to the medium so that the concentration of Cas9n protein or the like was 0.1, 0.3, 1, or 2 nM. It is a figure which showed the measurement result of the GFP knockout efficiency (%) in the HeLa-GFP cell cultured by.
  • Example 7 GFP in HEK-GFP cells cultured by adding RNP-loaded lipid nanoparticles B-4 or B-9 to a medium so that the Cas9 protein concentration was 0.5, 1, 3, or 5 nM. It is a figure which showed the measurement result of the knockout efficiency (%).
  • Example 8 the result (A) of the flow cytometry of the GFP constitutive expression BMDM before the introduction of the RNP-loaded lipid nanoparticles and the result of the flow cytometry of the GFP constitutive expression BMDM after the introduction of the RNP-loaded lipid nanoparticles. It is a figure which showed (B).
  • Example 9 the GFP knockout efficiency (GFP knockout efficiency) in HeLa-GFP cells cultured by adding each RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 to a medium so that the Cas9 protein concentration was 0.1, 0.3, or 1 nM. %) Is the figure which showed the measurement result.
  • Example 10 It is a figure which showed the measurement result of the GFP knockout efficiency (%) in the HeLa-GFP cell cultured by adding the RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cas9 protein in Example 10. In Example 10, it is a figure which showed the measurement result of the GFP knockout efficiency (%) in the HeLa-GFP cell which was cultured by adding the RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cpf1 protein.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are used as carriers for introducing RNP into target cells in the CRISPR system, and are a complex of DNA nuclease, guide RNA (gRNA) and ssON used for genome editing.
  • RNPs are lipid nanoparticles that are loaded into a lipid membrane structure of a particular composition, including pH-sensitive cationic lipids. Examples of the RNP mounted on the lipid nanoparticles include a complex of Cas9 protein, crRNA, tracrRNA, and ssON.
  • RNP itself is directly mounted on lipid nanoparticles and introduced into a target cell, the off-target action is smaller than that of a method in which a gene encoding a DNA nuclease such as Cas9 protein is introduced into the target cell and expressed.
  • the DNA nuclease loaded on the lipid nanoparticles binds to the DNA in a gRNA-dependent manner, and recognizes and cleaves the double-stranded DNA formed by pairing with a part of the gRNA. It is an enzyme.
  • the DNA nuclease include Cas9 and Cpf1.
  • the Cas9 protein is a protein that binds to DNA in a gRNA-dependent manner and has at least one of RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity.
  • a Cas9 protein with both RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity cleaves double strands of genomic DNA.
  • a Cas9 protein having only one of RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity cleaves only one of the double strands of genomic DNA.
  • the Cas9 protein used in the present invention may be a wild-type Cas9 protein derived from a CRISPR-based bacterium, or a mutant protein obtained by modifying the wild-type protein.
  • bacteria having a CRISPR system include Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, and Geobacillus stearomophilus. Geobacillus stearothermophilus), Streptococcus thermophilus, Treponema denticola, etc.
  • mutant protein obtained by modifying the wild-type Cas9 protein examples include mutants into which a mutation that inactivates either the RuvC nuclease activity or the HNH nuclease activity has been introduced.
  • mutants into which a mutation that inactivates either the RuvC nuclease activity or the HNH nuclease activity examples include a mutant (Cas9 (D10A)) in which the 10th aspartic acid of the wild-type Cas9 protein is replaced with alanine.
  • Cas9 (D10A) is also called Cas9 nickase (Cas9n) because it functions as a DNA nickase.
  • the Cas9 protein used in the present invention may be a wild-type Cas9 protein or a mutant protein thereof to which various peptides are added, or may be a chimeric protein fused with another protein.
  • the peptide include tag peptides such as His tag, Myc tag and Flag tag, and signal peptides such as nuclear localization signal peptide.
  • Other proteins to be fused with the wild-type or mutant Cas9 protein include, for example, GST, fluorescent protein and the like.
  • the Cpf1 protein is a protein that binds to DNA in a gRNA-dependent manner and has only RuvC nuclease activity.
  • Cas9 proteins with both RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity cleave double strands of genomic DNA to form blunt ends, whereas Cpf1 proteins form 5'protruding ends.
  • the Cpf1 protein used in the present invention may be a wild-type Cpf1 protein derived from a bacterium having a CRISPR / Cpf1 system, or may be a mutant protein obtained by modifying the wild-type protein.
  • the bacterium having the CRISPR / Cpf1 system include Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium and the like.
  • the mutant protein obtained by modifying the wild-type Cpf1 protein include a mutant in which a mutation that increases nuclease activity is introduced and a mutant protein in which a mutation that does not affect the nuclease activity is introduced. ..
  • the Cpf1 protein used in the present invention may be a wild-type Cpf1 protein or a mutant protein thereof to which various peptides are added, or may be a chimeric protein fused with another protein.
  • the peptide and other proteins the same ones as those mentioned in Cas9 protein can be used.
  • a gRNA is an RNA having a base sequence capable of pairing with a target sequence (base sequence of a target for genome editing) on genomic DNA to be cleaved by DNA nucleose.
  • the "base sequence capable of pairing with the target sequence” is usually a base sequence homologous (identical) or complementary to the target sequence in order to suppress recognition of a region other than the target sequence.
  • the gRNA may consist of one RNA, or may be a complex of two or more RNAs.
  • crRNA and tracrRNA can be used as the gRNA.
  • crRNA is derived from a bacterium having a CRISPR system, and consists of a region consisting of a base sequence complementary to a part of tracrRNA (binding region with tracrRNA) and a base sequence homologous or complementary to the target sequence on genomic DNA. It is a single-stranded RNA containing a region (genome DNA binding region).
  • TracrRNA is derived from a bacterium that also has a CRISPR system, has a region consisting of a base sequence complementary to a part of crRNA (binding region with crRNA), and hybridizes with crRNA in the region to form a hairpin structure. It is a single-stranded RNA that forms.
  • the Cas9 protein recognizes the hairpin structure and RNP is formed.
  • the crRNA and tracrRNA may be independent single-stranded RNAs, or both may be single-stranded RNAs linked via an appropriate RNA linker. Examples of bacteria having a CRISPR system include those as described above.
  • the Cas9 protein, crRNA and tracrRNA may all be derived from the same type of bacteria or may be derived from different bacteria. Further, crRNA and tracrRNA may consist only of natural RNA as long as the function of the CRISPR / Cas9 system is not impaired, and a part or all of the modified RNA or artificial nucleic acid may be contained.
  • the gRNA may be RNA containing a target sequence as in crRNA, and tracrRNA is unnecessary. Therefore, the gRNA can be shorter than when using the Cas9 protein. Further, the gRNA may consist only of natural RNA as long as the function of the CRISPR / Cpf1 system is not impaired, and a modified RNA or artificial nucleic acid may be contained in a part or all of the gRNA.
  • the target sequence As the target sequence, the base sequence of the region immediately following the PAM sequence is usually selected.
  • the PAM sequence is a sequence recognized by a DNA nuclease such as Cas9 protein, and is determined depending on the DNA nuclease such as Cas9 protein used.
  • the PAM sequence recognized by the Cas9 protein includes 5'-NGG (N: A, G, C, T)
  • the PAM sequence recognized by the Cpf1 protein includes 5'-TTTV (V: A,).
  • G, C), 5'-TTTN N: A, G, C, T.
  • the base length of the target sequence in gRNA such as crRNA is not particularly limited, and can be, for example, about 15 to 30 base lengths, preferably 18 to 22 base lengths.
  • the ssON used in the present invention contains a region that can be paired with a part of gRNA. As a result, it contains a region capable of pairing with the gRNA in a state of forming a complex with the DNA nuclease mounted on the lipid nanoparticles. As a result, RNP, which is a complex of DNA nuclease, gRNA, and ssON, is formed.
  • ssON may be an oligonucleotide consisting only of DNA, an oligonucleotide consisting only of RNA, or a chimeric oligonucleotide containing both DNA and RNA. Further, ssON may consist only of natural RNA or DNA as long as it does not impair the function of the CRISPR system used, or may contain modified nucleic acid or artificial nucleic acid in part or all of it. ..
  • the DNA nuclease loaded on the lipid nanoparticles is Cas9 protein
  • it contains a partial region of crRNA other than the binding region with tracrRNA and a region consisting of a complementary base sequence.
  • SsON and crRNA hybridize through a region complementary to this crRNA (a region that binds to crRNA). That is, the RNP mounted on the lipid nanoparticles according to the present invention is a complex of crRNA and tracrRNA, and crRNA and ssON hybridized with each other, and the formed tripartite complex and Cas9 protein.
  • the region in the crRNA that hybridizes with ssON (the region that binds to ssON) can hybridize with tracrRNA at the same time as ssON to form a tripartite complex, and this tripartite complex is recognized by the Cas9 protein.
  • the hairpin structure is not particularly limited as long as it can be formed.
  • the binding region with ssON in crRNA may include a part or all of the genomic DNA binding region, or may be the same as the genomic DNA binding region.
  • ssON uses two types that hybridize to each guide RNA.
  • ssON can also be used as the knocked-in donor DNA.
  • ssON having a region in which 40 to 60 bp homologous sequence regions (homology arms) for homologous recombination are added to both ends of a gene fragment to be knocked in, in addition to a region that binds to gRNA such as crRNA. Functions as donor DNA.
  • the nucleic acid complexed with DNA nuclease such as Cas9 protein includes not only gRNA such as crRNA and tracrRNA but also ssON.
  • the amount of nucleic acid contained in RNP is large, the positive charge of RNP is suppressed and the negative charge becomes strong, so that it can be efficiently mounted on lipid nanoparticles containing pH-sensitive cationic lipid.
  • the base length of ssON used in the present invention may be long enough to negatively charge RNP, and is appropriate in consideration of the base lengths of gRNA, for example, crRNA and tracrRNA, the type of Cas9 protein, and the like. Can be decided.
  • the length of ssON can be, for example, about 50 to 500 bases.
  • gRNA can be designed using a design tool such as CRISPRDesignTool (HorizonDiscovery) or TrueDesignGenomeEditor (Invitrogen).
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are lipid nanoparticles in which RNP is mounted on a lipid film structure.
  • the lipid component constituting the lipid membrane structure contains at least a pH-sensitive cationic lipid, a neutral phospholipid, and a polyalkylene glycol-modified lipid.
  • pH-sensitive cationic lipid contained in the lipid nanoparticles according to the present invention may be referred to as a cationic lipid represented by the following general formula (I) (hereinafter, “pH-sensitive cationic lipid of the present invention”. ).
  • a represents an integer of 3 to 5, but is preferably 4.
  • b indicates 0 or 1. When b is 0, it means that the -O-CO- group does not exist and it is a single bond.
  • R 1 and R 2 each independently represent a group represented by the following general formula (A).
  • q represents an integer from 1 to 9; r represents 0 or 1; s represents an integer from 1 to 3; t represents 0 or 1; u represents an integer from 1 to 8.
  • Indicates; c indicates 0 or 1; v indicates an integer of 4-12. However, when b and c are 0 at the same time, q is an integer of 3 to 5, r and t are 1, s is 1, and u + v is an integer of 6 to 10. except.
  • the hydrocarbon chains of R 1 and R 2 are preferably relatively long chains from the viewpoint of the stability of the lipid nanoparticles according to the present invention.
  • R 1 and R 2 are groups having 20 or more carbon atoms, that is, in the general formula (A), q + 2r + s + 2t + u + c + v is an integer of 19 or more. Is preferable.
  • q + 2r + s + 2t + u + c + v is preferably an integer of 19 to 33, more preferably an integer of 19 to 31, and even more preferably an integer of 21 to 31. , 21-27, more preferably.
  • R 1 and R 2 pH-sensitive cationic lipids of the present invention in the general formula (A), r is 1, t is 0, q is 5-11 integer, preferably from 6 to 10 A group in which s + u is an integer of 5 to 11, preferably an integer of 6 to 10, c is 1, v is an integer of 4 to 12, and q + s + u + v is an integer of 16 or more; 0, t is 1, q + s is an integer of 5 to 11, preferably an integer of 6 to 10, u is an integer of 5 to 8, c is 1, and v is 4 to 12.
  • a group that is an integer and q + s + u + v is an integer of 16 or more; r and t are 0, q + s + u is an integer of 13 to 23, preferably 15 to 21, c is 1, and v is 4 to 12.
  • a group that is an integer and q + s + u + v is an integer of 18 or more; r and t are 0, q + s + u is an integer of 13 to 23, preferably 15 to 21, c is 1, and v is 6 to 10.
  • a group that is an integer and q + s + u + v is an integer of 18 or more is preferable.
  • R 1 and R 2 may be groups represented by the general formula (A) and may be different groups from each other, but the same group is preferable.
  • X represents a group represented by the following general formula (B) or a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group.
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group indicated by X is bonded to (O-CO) b- by a carbon atom.
  • d represents an integer of 0 to 3. When d is 0, it means that the-(CH 2 ) -group does not exist and it is a single bond.
  • R 3 and R 4 independently form a C 1-4 alkyl group (alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) or a C 2-4 alkenyl group (alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms), respectively. Shown.
  • the C 1-4 alkyl group or C 2-4 alkenyl group indicated by R 3 and R 4 may have one or two hydrogen atoms substituted with a phenyl group.
  • Examples of the C 1-4 alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group and a t-butyl group.
  • the C2-4 alkenyl group includes a vinyl group, a 1-propenyl group, a 2-propenyl group, a 1-methylvinyl group, a 2-methyl-1-propenyl group, a 1-butenyl group, a 2-butenyl group and a 3-butenyl group. The group is mentioned.
  • R 3 and R 4 may be bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle.
  • Examples of the 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle formed by binding R 3 and R 4 to each other include 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, and 1-piperazinyl group. ..
  • one or two hydrogen atoms in the ring are converted into a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group. It may be replaced.
  • two hydrogen atoms in the ring are substituted with a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group, they may be substituted with the same group or different groups. May be good.
  • heteroatom contained in the heterocyclic group examples include a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom and the like. ..
  • the heteroatom constituting the heterocycle in the heterocyclic group may be one, and the same or different heteroatoms may be two or more.
  • the heterocycle in the heterocyclic group may be a saturated heterocycle or may contain one or more double bonds, but the heterocycle does not become an aromatic ring.
  • a is an integer of 3 to 5
  • b is 1
  • X is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (however, hetero). It is attached to (O-CO) b- by the carbon atom in the ring group), preferably 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group (by the carbon atom in the ring ( It is bonded to O-CO) b-, and one hydrogen atom may be substituted with a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group), and R 1 and R 2 are respectively.
  • r is 1, t is 0, q is an integer of 5 to 11, preferably an integer of 6 to 10, and s + u is an integer of 5 to 11, preferably.
  • Is a group of 6 to 10 integers, c is 1, v is an integer of 4 to 12, and q + s + u + v is an integer of 16 or more; in the general formula (I), a is 3 to It is an integer of 5, b is 1, and X is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (where carbon atoms in the heterocyclic group bind to (O-CO) b-), preferably.
  • An integer, preferably an integer of 6 to 10, s + u is an integer of 5 to 11, preferably an integer of 6 to 10, c is 1, v is an integer of 4 to 12, and q + s + u + v is 16 or more.
  • R 1 and R 2 are independent of each other, and in the general formula (A), r is 0, t is 1, q + s is an integer of 5 to 11, preferably an integer of 6 to 10, and u. Is an integer of 5 to 8, c is 1, v is an integer of 4 to 12, and q + s + u + v is an integer of 16 or more.
  • the lipid R 1 and R 2 are the same group, more preferably a pH-sensitive cationic lipids of the general formula (I), R 1 and R 2 are the same group, And a lipid having a of 4 is particularly preferable.
  • the pKa of the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I) is not particularly limited, but is, for example, about 4.0 to 9.0, preferably about 4.5 to 8.5, and more preferably about 6 to 8. It is preferable to select the type of each substituent so as to give a pKa in this range.
  • the pH-sensitive cationic lipid represented by the general formula (I) can be easily produced, for example, by the method specifically shown in the examples of the present specification. Those skilled in the art can easily produce any lipid included in the range of the general formula (I) by appropriately selecting the raw material compound, the reagent, the reaction conditions and the like with reference to this production method.
  • neutral phospholipid of the present invention has a neutral charge as a whole and is a phosphate group.
  • glycerophospholipid or sphingolipid is preferable.
  • the neutral glycerophospholipid include phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, cardiolipin, plasmalogen and the like.
  • the neutral sphingolipid include sphingomyelin, ceramide phosphoryl glycerol, and ceramide phosphoryl ethanolamine.
  • the fatty acid residues in these neutral glycerophospholipids or neutral sphingolin lipids are not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 24 carbon atoms and having 14 to 20 carbon atoms. Saturated or unsaturated fatty acid residues are preferred.
  • acyl groups derived from fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, arachidonic acid, bechenic acid, and lignoseric acid. Can be done. When these glycerolipids or sphingolipids have two or more fatty acid residues, all the fatty acid residues may be the same group or different groups from each other.
  • neutral phospholipid of the present invention a neutral glycerophospholipid having a saturated or unsaturated fatty acid residue having 12 to 24 carbon atoms is preferable, and a neutral glycerophospholipid having 12 to 24 carbon atoms is preferable from the viewpoint of further improving the efficiency of genome editing.
  • Neutral glycerophospholipids or neutral sphingolin phospholipids having unsaturated fatty acid residues are more preferred, and neutral glycerophospholipids having unsaturated fatty acid residues having 12 to 24 carbon atoms are even more preferred.
  • phosphatidylethanolamine having an unsaturated fatty acid residue having 12 to 24 carbon atoms having an unsaturated fatty acid residue having 12 to 24 carbon atoms is preferable, and phosphatidylethanolamine having a fatty acid residue having 14 to 20 carbon atoms is preferable. Is more preferable, and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) is particularly preferable.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the polyalkylene glycol-modified lipid contained in the lipid component of the lipid nanoparticles according to the present invention (hereinafter, may be referred to as “polyalkylene glycol-modified lipid of the present invention”) is a lipid modified with polyalkylene glycol.
  • the polyalkylene glycol is a hydrophilic polymer, and the surface of the lipid nanoparticles can be modified with the polyalkylene glycol by constructing the lipid nanoparticles using the polyalkylene glycol-modified lipid as the lipid film-constituting lipid.
  • surface modification with polyalkylene glycol it may be possible to enhance the stability of lipid nanoparticles such as retention in blood.
  • polyethylene glycol for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol and the like can be used.
  • the weight average molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.
  • stearyllated polyethylene glycol for example, PEG45 stearate (STR-PEG45)
  • PEG45 stearate STR-PEG45
  • lipids other than the pH-sensitive cationic lipid of the present invention, the neutral phospholipid of the present invention, and the polyalkylene glycol-modified lipid of the present invention generally form liposomes.
  • the lipids used in this can be used. Examples of such lipids include positively or negatively charged phospholipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of positively or negatively charged phospholipids include phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, and phosphatidic acid.
  • Examples of sterols include animal-derived sterols such as cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, and dihydrocholesterol; plant-derived sterols such as stigmasterol, cytosterol, campesterol, and brushcasterol (phytosterols); Examples thereof include sterols derived from microorganisms such as thymosterol and ergosterol.
  • the pH-sensitive cationic lipid of the present invention, the neutral lipid, and the polyalkylene glycol-modified lipid of the present invention, which constitute the lipid nanoparticles according to the present invention may be of only one type or two or more types, respectively. May be good.
  • the amount of the pH-sensitive cationic lipids of the present invention is the present among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles. It means the total amount of lipid molecules corresponding to the pH-sensitive cationic lipids of the present invention.
  • the amount of the neutral lipids of the present invention is the present invention among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles. It means the total amount of lipid molecules corresponding to triglycerides.
  • the amount of the polyalkylene glycol-modified lipids of the present invention is the present among the lipid molecules constituting the lipid nanoparticles. It means the total amount of lipid molecules corresponding to the polyalkylene glycol-modified lipid of the invention.
  • the ratio of the pH-sensitive cationic lipid of the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles according to the present invention ([Amount of pH-sensitive cationic lipid of the present invention (mol)). ] / ([Amount of total lipids constituting lipid nanoparticles (mol)]) ⁇ 100%) is 30 to 50 mol%, and the neutral phospholipid of the present invention with respect to the total amount of lipids constituting lipid nanoparticles.
  • the ratio ([amount of neutral phospholipid of the present invention (mol)] / ([amount of total lipids constituting lipid nanoparticles (mol)]) ⁇ 100%) is 20 to 50 mol%, and the lipid nanoparticles.
  • Ratio of the polyalkylene glycol-modified lipid of the present invention to the total amount of lipids constituting the above is preferably 1.0 to 4.0 mol%, and the ratio of the pH-sensitive cationic lipid of the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles according to the present invention is 40 to 50 mol.
  • the ratio of the neutral phospholipid of the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles is 20 to 50 mol%, and the polyalkylene glycol-modified lipid of the present invention to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles. More preferably, the ratio of is 1.5 to 2.0.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be appropriately surface-modified, if necessary.
  • modifying the surface of the lipid nanoparticles according to the present invention with a hydrophilic polymer or the like the retention in blood can be enhanced.
  • surface modification can be performed by using a lipid modified with these modifying groups as a constituent lipid of lipid nanoparticles.
  • lipid derivatives for enhancing blood retention for example, glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glutamic acid derivative, glutamic acid derivative, polyglycerin phospholipid derivative and the like. Can also be used.
  • polyalkylene glycol as a hydrophilic polymer for enhancing blood retention, dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride copolymer, and divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer , Amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextran, pectin, carrageenan and the like can also be used for surface modification.
  • the lipid nanoparticles can be surface-modified with an oligosaccharide compound having 3 or more sugars.
  • the type of oligosaccharide compound having 3 or more sugars is not particularly limited, but for example, an oligosaccharide compound in which about 3 to 10 sugar units are bound can be used, and preferably about 3 to 6 sugar units are bound. Oligosaccharide compounds can be used.
  • an oligosaccharide compound which is preferably a trimer or a hexamer of glucose can be used, and more preferably an oligosaccharide compound which is a trimer or a tetramer of glucose can be used.
  • isomaltotriose, isopanone, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and the like can be preferably used, and among these, malto with ⁇ 1-4 bond of glucose can be preferably used. More preferred are triose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose.
  • the amount of surface modification of the lipid nanoparticles by the oligosaccharide compound is not particularly limited, but for example, it is about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably about 5 to 10 mol% with respect to the total amount of lipid. Is.
  • the method for surface-modifying lipid nanoparticles with an oligosaccharide compound is not particularly limited.
  • liposomes International Publication No. 2007/102481
  • lipid nanoparticles are surface-modified with a monosaccharide such as galactose or mannose are known. Therefore, the surface modification method described in this publication can be adopted. All disclosures of the above publications are included as disclosures herein by reference.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be imparted with any one or more or more functions such as a temperature change sensitive function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitive function.
  • a temperature change sensitive function such as a temperature change sensitive function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitive function.
  • the retention of lipid nanoparticles in blood is improved, the capture rate by reticular endothelial tissues such as the liver and spleen is reduced, and after endocytosis in target cells.
  • Lipid nanoparticles can be efficiently escaped from endosomes and translocated into the nucleus, and high genome editing activity can be achieved in the nucleus.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be modified with a substance such as an antibody capable of specifically binding to a receptor or an antigen on the cell surface, improving the efficiency of delivering the substance into the nucleus of the cell. can do.
  • a substance such as an antibody capable of specifically binding to a receptor or an antigen on the cell surface, improving the efficiency of delivering the substance into the nucleus of the cell. can do.
  • a lipid derivative capable of reacting with a mercapto group in a monoclonal antibody or a fragment thereof for example, poly (ethylene glycol) - ⁇ -Distearoyl phosphatidylethanolamine- ⁇ -male imide, ⁇ - [N- (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoryl-ethyl) carboxamide)- ⁇ - [3- [2- (2) , 5-dihydro-2,5-dioxo-1H-pyrrole-1-yl) ethanecarboxamide] propyl ⁇ -poly (oxy-1,2-ethandyl) by containing a lipid derivative having a maleimide structure.
  • Monoclonal antibodies can be attached to the surface of the membrane of lipid lipid nanoparticles.
  • the surface of the lipid nanoparticles according to the present invention may be modified with a polypeptide containing a plurality of consecutive arginine residues (hereinafter, referred to as "polyarginine").
  • polyarginine preferably a polypeptide containing 4 to 20 consecutive arginine residues, more preferably a polypeptide consisting of only 4 to 20 consecutive arginine residues, particularly preferably octaarginine or the like is used. Can be done.
  • lipid nanoparticles such as liposomes By modifying the surface of lipid nanoparticles such as liposomes with polyarginine such as octaarginine, the intracellular delivery efficiency of RNP encapsulated in liposomes can be improved (Journal of Controlled Release, 98, pp.317-). 323, 2004; International Publication No. 2005/32593). Modification of the surface of lipid nanoparticles with polyarginine can be facilitated by using, for example, lipid-modified polyarginine, such as steallylated octaarginine, as constituent lipids of lipid nanoparticles according to the methods described in the publications above. Can be done. The disclosure of the above publications and the disclosures of all references cited in this publication are included as disclosures herein by reference.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are one or more selected from the group consisting of antioxidants such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene, charged substances, and membrane polypeptides. It may further contain the substance of.
  • antioxidants such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene
  • charged substances and membrane polypeptides. It may further contain the substance of.
  • the charged substance that imparts a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane; and cationic polymers.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include disetyl phosphate, cholesteryl hemiscusinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidylic acid.
  • Examples of the membrane polypeptide include a membrane superficial polypeptide, a membrane endogenous polypeptide, and the like. The blending amount of these substances is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are lipid membrane structures composed of lipid components and carry RNP. Since the encapsulation rate of RNP in lipid nanoparticles is further increased, the ratio of RNP mounted on the lipid nanoparticles to the total amount of lipids constituting the lipid nanoparticles according to the present invention ([Amount of RNP (mol)). )] / ([Amount of total lipids constituting lipid nanoparticles (mol)]) ⁇ 100%) is preferably 1.8 to 3.6 ⁇ 10-2 mol%.
  • the average particle size of the lipid nanoparticles is 80 nm or less, and the average particle size is 80 nm or less, because high delivery efficiency can be easily obtained even when the target cells are present in a relatively deep part in the living body.
  • the particle size is more preferably 50 nm or less, further preferably 40 nm or less, further preferably 30 nm or less, and particularly preferably 10 to 30 nm.
  • the average particle size of the lipid nanoparticles means the number average particle size measured by a dynamic light scattering (DLS) method. The measurement by the dynamic light scattering method can be performed by a conventional method using a commercially available DLS apparatus or the like.
  • the polydispersity index (PDI) of the lipid nanoparticles according to the present invention is about 0.05 to 0.1, preferably about 0.06 to 0.08, and more preferably about 0.07.
  • the zeta potential can be in the range of 5.5 mV to 6.0 mV, preferably about 5.8 mV.
  • the form of the lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include monomembrane liposomes, multilamellar liposomes, spherical micelles, and atypical layered structures as the forms dispersed in an aqueous solvent.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are preferably single membrane liposomes and multilamellar liposomes.
  • the method for producing lipid nanoparticles according to the present invention is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be adopted.
  • all lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and a lipid film is formed by vacuum drying with an evaporator or spray drying with a spray dryer, and then the aqueous solvent containing RNP or the like is dried.
  • It can be produced by adding it to the above-mentioned mixture and further emulsifying it with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure injection emulsifier.
  • lipid nanoparticles it can also be produced by a well-known method for producing liposomes, such as a reverse phase evaporation method. If it is desired to control the size of the lipid nanoparticles, it may be subjected to extrusion (extrusion filtration) under high pressure using a membrane filter having a uniform pore size or the like.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be produced by an alcohol dilution method using a flow path.
  • the flow path used for production may be a microchannel with a built-in three-dimensional micromixer capable of achieving instantaneous mixing of two solutions, but since it is possible to form a nano-sized lipid particle formation system with high particle size controllability.
  • flow path structure of the present invention On the upstream side (left side of the drawing), the first introduction path 10 for introducing the first fluid and the second introduction path 20 for introducing the second fluid, which are independent of each other, each have a constant length. Then, they merge to form one dilution flow path 30 toward the downstream side thereof.
  • the dilution flow path 30 has a flow path portion 50 that is two-dimensionally bent at least in a part thereof, and the bending flow path portion 50 extends in the axial direction or the extension direction of the dilution flow path upstream of the dilution flow path portion 50.
  • the flow path widths y 1 , y 2 ... of the dilution flow path are 1 / 2y 0 during the constant lengths x 1 , x 2 ... in the X direction.
  • it will be regulated to 1 / 2y 0 or less and 1 / 40y 0 or more.
  • the flow path structure of the present invention has a shape in which substantially rectangular baffles are alternately arranged from both side surfaces in a micro-sized flow path as illustrated in FIG. 1A and described above.
  • it is not limited to the one configured by arranging a separate baffle on the flow path in this way. That is, the configuration of the structure element 40 is not particularly limited as long as a flow path having a similar shape is formed so as to correspond to the flow path formed by arranging such a baffle, as described above.
  • the wall surface of the flow path structure is bent into a predetermined shape (while maintaining a substantially constant wall thickness) and integrally formed so as to form the structure element 40 as described above.
  • the flow path of such a two-dimensional structure can be, for example, injection molding using a thermoplastic resin, a thermosetting resin, an ultraviolet curable resin, a metal or a glassy material, casting molding, or molding using a three-dimensional printer. It can be formed relatively easily by such means.
  • the flow path width y 0 of the dilution flow path 30 after the first introduction path 10 and the second introduction path 20 merge is also influenced to some extent by the size of the particle size of the nano-sized lipid particles to be formed. However, it is typically about 20 to 1000 ⁇ m, more preferably about 100 to 200 ⁇ m. Desired nanosized, in obtaining the lipid particles having a particle diameter size within the particle size range and specific examples about 10 ⁇ 100 nm, flow path width y 0 in the lipid solution diluent medium in the range as described above It is a necessary condition to dilute with.
  • each structure 40 The heights h 1 , h 2 ... (length in the Y direction) of each structure 40 are 1 / 2y 0 or more and 1 y with respect to the flow path width y 0 of the dilution flow path 30 on the upstream side thereof. Less than 0 , preferably 1 / 2y 0 or more and 39 / 40y 0 or less, more preferably 1 / 2y 0 or more and 3/4y 0 or less, and the presence of each of the structure elements 40 on the upstream side thereof. From the flow path width y 0 of the dilution flow path 30, the flow path widths y 1 , y 2 ... are reduced to a width less than 1 / 2y 0 and larger than 0.
  • the heights h 1 , h 2 ... of the structure elements 40 provided in the bent flow path portion 50 do not necessarily have to be the same, as long as the above-mentioned predetermined conditions are satisfied. Each may be different.
  • the flow path widths y 1 , y 2 ... formed by this may also be different. For example, even in a mode in which the widths h 1 , h 2 ... of each structure member 40 gradually increase and the flow path widths y 1 , y 2 ... become narrower toward the downstream direction. Good.
  • the heights h 1 , h 2 ... (length in the Y direction) of each structure element 40 are predetermined, and the flow path widths y 1 , y 2 ... of these existing parts are 1 / 2y. By narrowing down to a width less than 0 , the efficiency of molecular diffusion is improved.
  • each structure element 40 includes the size of the lipid particle to be obtained, the number of structure elements 40, and the height h of each structure element 40.
  • the respective widths x 1 , x 2 ... Is preferably about 20 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the widths x 1 , x 2 ... of each structure member 40 do not necessarily have to be the same, and may be different as long as the above-mentioned predetermined conditions are satisfied.
  • the width x 1 , x 2 ... may gradually increase toward the downstream direction.
  • the intervals d 1 , d 2 ... between the adjacent structure elements 40 include the size of the lipid particles to be obtained, the number of structure elements 40, and the heights h 1 , h 2 of each structure element 40. ... (length in the Y direction), width of each structure 40 (length in the X direction) x 1 , x 2 ..., etc., depending on other conditions, but the flow of the upstream dilution channel to road width y 0, it is preferred that a length of the extent 1 / 10y 0 or 5y 0 or less.
  • the intervals between the adjacent structure 40s d 1 , d 2 . are 20 to 1000 ⁇ m, typically 200 ⁇ m. It is desirable that the value is about 20 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the intervals d 1 , d 2 ... between the adjacent structure 40s do not necessarily have to be the same, and may be different as long as the above-mentioned predetermined conditions are satisfied.
  • the mode may be such that the intervals d 1 , d 2 ... gradually become narrower toward the downstream direction.
  • each structure member 40 is alternately extended from the wall surfaces on both sides in the substantially Y direction (approximately + Y direction, approximately ⁇ Y direction) toward the center side of the flow path, and is substantially extended in the flow path direction (X direction).
  • the angle does not necessarily have to be exactly 90 °, and even if it is inclined to some extent, it can be an effective configuration, and it is not particularly limited.
  • each structure member 40 is in the range of about 30 to 150 °, more preferably 40 to 140 °, and particularly preferably 80 to 100 °.
  • shape of the corner portion on the center side of the flow path of each structure member 40 is also allowed to have a certain degree of roundness and is not particularly limited, but is, for example, R50 ⁇ m or less, more preferably R20 ⁇ m or less. It may be acceptable. However, in order to obtain more controllable and uniform nano-sized lipid particles, it is desirable that these tolerances are as small as possible. Further, in the embodiment shown in FIG.
  • the axial direction of the upstream dilution flow path in the flow path structure or the X direction which is an extension direction thereof is represented by a linear line for convenience, but this X direction is merely linear. It indicates the axial direction of the dilution flow path, and is not limited to such a linear one in practice, and may be curved with a certain curvature, for example. In such a case, the Y direction, which is the width direction of the dilution flow path that intersects the X direction perpendicularly, points to the direction perpendicular to the X direction at the portion having the unit length.
  • the size of the flow path in the depth direction is particularly limited. However, for example, it is preferably about 10 to 1000 ⁇ m, more preferably about 50 to 200 ⁇ m.
  • the dilution flow path 30 in the flow path structure shown in FIG. 1A can generate a three-dimensional flow. If it is a road, it is not particularly limited.
  • the flow path structure of the present invention is chaotic by grooves or microprojections formed on the wall surface of the flow path in place of the two-dimensionally bent flow path portion 50 in at least a part of the dilution flow path 30. It may be a chaotic micromixer (staggered herringbone mixer) (Non-Patent Document 8) in which a flow is generated.
  • the first introduction path 10 into which the first fluid is introduced and the second introduction path 20 into which the second fluid is introduced have a constant length, respectively.
  • a lipid solution in which a lipid component is dissolved in ethanol is used from the first introduction route, and Cas9 protein, crRNA and tracrRNA are added from the second introduction route.
  • An aqueous solution containing ssON (an aqueous solution containing RNP) is introduced.
  • the lipid solution is diluted with an RNP-containing aqueous solution, and in this process, lipid nanoparticles carrying RNP are produced.
  • the flow path structure of the present invention has a plurality of introduction paths independent of each other, and it is sufficient that these introduction paths have a constant length and merge to form one dilution flow path. It may have three introduction paths.
  • the first fluid introduced from the first introduction path is before merging with the second fluid introduced from the second introduction path.
  • the first introduction path, the second introduction path, and the third introduction path merge with each other having a certain length so as to come into contact with the third fluid introduced from the third introduction path, and one diluted flow flows.
  • a road can be formed.
  • the introduction paths where the confluence points to the dilution flow paths 30 are farthest from each other are designated as the first introduction path 10 and the second introduction path 20, and the remaining introduction paths are designated as the third introduction path 60.
  • the lipid solution obtained by dissolving the lipid component in ethanol from the first introduction path 10 the RNP-containing aqueous solution from the second introduction path 20, and the aqueous solvent used for preparing the RNP-containing aqueous solution from the third introduction path 60 are used. , Introduce each.
  • the lipid solution introduced from the first introduction path 10 first merges with the aqueous solvent introduced from the third introduction path 60, and then merges with the RNP-containing aqueous solution introduced from the second introduction path 20. Since it is possible to prevent the RNP-containing aqueous solution from coming into direct contact with the lipid solution, which is a high-concentration ethanol solution, it is possible to prevent the proteins in the RNP-containing aqueous solution from being aggregated by the high-concentration ethanol in the dilution channel 30, especially near the inlet thereof. it can.
  • Dilution in the flow path structure of the present invention depends on molecular diffusion.
  • the RNP-containing aqueous solution can be prepared by dissolving Cas9 protein, crRNA, tracrRNA and ssON in an aqueous solvent.
  • the aqueous solvent is not particularly limited as long as it is an aqueous solvent in which RNP can be mixed with a lipid solution while maintaining genome editing activity, and the produced lipid nanoparticles can be stably dispersed.
  • the aqueous solvent include a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered physiological saline solution, a physiological saline solution, and a medium for cell culture.
  • aqueous solvents further include monosaccharides of glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, and xylose sugar; disaccharides such as lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, and maltose; Sugars; polysaccharides such as cyclodextrin; sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, martitol; glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, Polyhydric alcohols such as ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol monoalkyl ether, and 1,3-butylene glycol; etc. may be added.
  • the pH of the RNP-containing aqueous solution is preferably 5.0 or higher, more preferably in the range of 5.0 to 8.5, and even more preferably in the range of 5.0 to 8.0. It is even more preferably in the range of 5.0 to 7.5.
  • the pH of the RNP-containing aqueous solution is preferably 6 or more, more preferably in the range of 6 to 8.5, further preferably in the range of 6 to 8, and in the range of 6 to 7.5. Is even more preferable.
  • the flow velocity ratio between the lipid solution and the RNP-containing aqueous solution affects the dilution rate of the lipid solution, which in turn affects the size of the lipid particles produced.
  • the ratio of the flow velocity of the RNP-containing aqueous solution to the flow velocity of the lipid solution is from the viewpoint of producing lipid nanoparticles having a sufficiently small average particle size and high uptake efficiency into target cells. , 7 or more is preferable, 7 to 10 is more preferable, and 7 to 9 is further preferable.
  • the total flow rate of the lipid solution and the RNP-containing aqueous solution is not particularly limited, and can be appropriately adjusted within the range of 1 ⁇ L / min to 100 mL / min.
  • the total flow rate of the lipid solution and the RNP-containing aqueous solution is preferably in the range of 50 ⁇ L / min to 1 mL / min, more preferably in the range of 50 to 800 ⁇ L / min, and is in the range of 50 to 800 ⁇ L / min.
  • the range of 600 ⁇ L / min is more preferable, and the range of 50 to 500 ⁇ L / min is even more preferable.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention are carriers that deliver RNP for genome editing to target cells. Genome editing can be performed by introducing the lipid nanoparticles according to the present invention into a target cell. When the target cell is a cultured cell, the lipid nanoparticles according to the present invention are added to the culture medium. When the target cell is a cell in the body of an animal, the lipid nanoparticles according to the present invention are administered to the animal.
  • the administration route is not particularly limited, but parenteral administration such as intravenous administration, enteral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, nasal administration, and pulmonary administration is preferable.
  • the animal to which the lipid nanoparticles according to the present invention are administered is not particularly limited, and may be a human or a non-human animal.
  • non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters and guinea pigs, and birds such as chickens, quails and ducks.
  • FIG. 2 schematically shows the structure of the manufacturing equipment actually used.
  • FIG. 2A is a schematic view of the entire structure
  • FIG. 2B is a perspective view of a microchannel (channel structure) with a built-in mixer
  • FIG. 2C is one of the dilution channels 104c. It is an enlarged view of a part.
  • a syringe 101 equipped with a lipid solution and a syringe 102 equipped with an RNP solution are respectively installed in the flow control device 103, and these are installed in the first introduction path of the microchannel 104 with a built-in mixer.
  • the injection port 104a of the above and the injection port 104b of the second introduction path were connected by a tube 105, and the injection port 104d of the dilution flow path 104c was connected to the collection container 106 for collecting the produced lipid nanoparticles by the tube 105.
  • lipid solution Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes (160 kDa) (product name: "Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3", manufactured by Integrated DNA technologies) and a target sequence (sequence) in the GFP (green fluorescent protein) gene.
  • RNP solution Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes (160 kDa) (product name: "Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3", manufactured by Integrated DNA technologies) and a target sequence (sequence) in the GFP (green fluorescent protein) gene.
  • tracrRNA SEQ ID NO: A solution (RNP solution) in which 3,67 base length) was dissolved in a buffer solution so as to have a molar ratio of 1: 1: 1 was used.
  • crRNA and racrRNA were obtained by amplification by PCR using the genomic DNA of GFP stable expression HeLa (HeLa-GFP) cells as a template.
  • the pH 6 buffer is MES buffer (20 mM MES, 50 mM NaCl, pH 6.0), and the pH 4.0, 5.0, or 5.5 buffer is citric acid buffer (20 mM citric acid, 50 mM NaCl, pH 4.0, 5.0, or 5.5) was used.
  • the solution discharged from the dilution channel is collected and placed in a dialysis membrane (MWCO: 12,000-14,000).
  • Buffer exchange and alcohol removal were performed by dialysis in PBS ( ⁇ ) at 4 ° C. for 2 hours or longer.
  • the RNP solution was converted into double-stranded DNA (dsDNA) containing the target sequence (SEQ ID NO: 4, 0.25 pmol) in terms of Cas9 protein amount. The mixture was mixed so as to have 2 or 5 equivalents (molar ratio), and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution after the reaction was subjected to agarose gel electrophoresis to evaluate the DNA cleavage efficiency.
  • the dsDNA not mixed with RNP was used as a negative control, and the sample obtained by adding RNP not passed through the microchannel to the dsDNA was used as a positive control.
  • the relative cleavage activity was calculated when the cleavage activity in the sample to which 5 equivalents of RNP was added to the target dsDNA was set to 1 among the positive controls.
  • Image analysis software ImageJ was used for the quantitative analysis.
  • the RNP solution was prepared with a buffer solution having a pH of 6.0, the FRR was set to 9.0, and the experiment was conducted with the TFR in the range of 50 to 500 ⁇ L / min to investigate the effect of the TFR.
  • the results are shown in Table 1.
  • "NC” indicates the result of negative control
  • "PC” indicates the result of positive control.
  • the cleavage activity was similar to that of the positive control at any total flow velocity, and no effect of the total flow velocity on the DNA cleavage activity was observed. Therefore, in the subsequent experiments, the mixing rate was higher. A large 500 ⁇ L / min was adopted.
  • the RNP solution was prepared with a buffer solution having a pH of 6.0, the TFR was set to 500 ⁇ L / min, and the FRR was set to the range of 3.0 to 9.0, and the effect of FRR was investigated.
  • the results are shown in Table 2.
  • Table 2 in the range of FRR of 5.0 or less, a decrease in DNA cleavage activity was observed as the FRR decreased.
  • the range of FRR of 7.0 or more the activity was similar to that of the positive control, and the influence of the liquid feeding to the microchannel was not observed. From this result, FFR of 9.0 was adopted in the subsequent experiments.
  • the TFR was set to 500 ⁇ L / min, the FRR was set to 9.0, and the pH of the buffer solution for preparing the RNP solution was set in the range of 4.0 to 6.0, and the effect of the pH of the RNP solution was investigated.
  • the results are shown in Table 3.
  • Table 3 while the DNA cleavage activity was maintained at pH 6.0 to the same level as that of the positive control, a significant decrease in DNA cleavage activity was observed as the pH decreased in the pH range of 5.5 or less. From this result, in the subsequent experiments, a buffer solution having a pH of 6.0 was used for preparing the RNP solution.
  • FIG. 3A is a perspective view of a microchannel (channel structure) with a built-in chaotic mixer
  • FIG. 3B is an enlarged view of a part of the dilution channel 107c.
  • MES buffer (20 mM MES, 50 mM NaCl, pH 6.0) is used as the buffer for pH 6 to 6.6
  • citric acid buffer (20 mM citric acid, 50 mM NaCl, pH 5.5) is used as the buffer for pH 5.5.
  • the RNP solution and ethanol were sent into the microchannel of the manufacturing apparatus shown in FIG. 3 under the conditions of TFR of 500 ⁇ L / min and FRR of 9, and the RNP solution discharged from the dilution channel was recovered. Dialysis was performed in the same manner as in 1.
  • the RNP solution after dialysis was mixed with dsDNA to 5 equivalents (molar ratio) in terms of Cas9 protein amount in the same manner as in Reference Example 1, and reacted at 37 ° C. for 1 hour to evaluate the DNA cleavage efficiency.
  • the relative cleavage activity was calculated when the cleavage activity of the positive control by adding 5 equivalents of RNP to the target dsDNA was set to 1. The results are shown in Table 4. Similar to Reference Example 1, the DNA cleavage activity was maintained at pH 6.0 to the same level as that of the positive control, while the DNA cleavage activity was significantly reduced at pH 5.5.
  • the RNP solution was prepared with a buffer solution having a pH of 6.0, the TFR was set to 500 ⁇ L / min, the FRR was set to 5.0, 7.0, or 9.0, and the same experiment was performed to investigate the effect of the FRR.
  • the results are shown in Table 5.
  • the FRR was 5.0, the DNA cleavage activity was slightly low, whereas when the FRR was 7.0 or more, the activity was similar to that of the positive control, and the effect of sending the liquid to the microchannel was observed. There wasn't.
  • the lipid nanoparticles according to the present invention can be produced as lipid nanoparticles under the same conditions as when the production apparatus shown in FIG. 2 is used, even when the production apparatus shown in FIG. 3 is used. Became clear. That is, it was suggested that the structural selectivity of the mixer was low in the production of the lipid nanoparticles according to the present invention.
  • Example 1 Lipid nanoparticles with different lipid compositions equipped with RNP for knockout of the GFP gene were produced, and the GFP knockout activity against HeLa-GFP cells was examined.
  • lipid nanoparticles having different lipid compositions equipped with RNP for knocking in to modify the GFP gene into a BFP (blue fluorescent protein) gene were produced, and the GFP knockin activity against HeLa-GFP cells was examined.
  • the lipid nanoparticles were produced using the production apparatus used in Reference Example 1.
  • CL4H6 (pKa-6.25, Patent Document 2) as a pH-sensitive cationic lipid, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DSPC) or 1 as a neutral phospholipid as constituent lipids of lipid nanoparticles.
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine
  • DOPE 2-diore oil-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine
  • cholesterol cholesterol
  • PEG-DMG 1,2-dimiristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000
  • the lipid components of the five types of lipid compositions shown in Table 6 were used for the production of lipid nanoparticles.
  • the Cas9 protein, crRNA, and tracrRNA used were the same as those used in Reference Example 1.
  • a 132-base long DNA (sequence) consisting of the same base sequence as a partial region of genomic DNA containing the target sequence (SEQ ID NO: 1) is used as ssON for GFP knockout.
  • the region Nos. 5 and 68 to 87 have the same base sequence as the target sequence).
  • mutations are introduced into the three bases (65th, 67, and 72nd bases) of ssON used for knockout as ssON for BFP knock-in. DNA (SEQ ID NO: 6) was used.
  • HDR homology-dependent repair
  • Each RNP-loaded lipid nanoparticle was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cas9 protein concentration was 0.3, 1, or 5 nM, and cultured. After exchanging the medium 2 days after the addition of the RNP-loaded lipid nanoparticles, the cells were collected 1 day later, and the GFP knockout efficiency (%) by flow cytometry (the ratio of cells not emitting GFP fluorescence to the whole cells). (%)) was measured.
  • a commercially available transfection reagent “Lipofectamine RNAiMAX” manufactured by Thermo Fisher Scientific, which has been used for introducing RNP, was used.
  • RNP-loaded lipid nanoparticles containing DOPE as a neutral phospholipid showed higher knockout activity than RNP-loaded lipid nanoparticles containing DSPC.
  • RNP-loaded lipid nanoparticles having a high neutral phospholipid content or containing DOPE as a neutral phospholipid showed higher knockout activity than "Lipofectamine RNAiMAX".
  • ssON for knock-in is used, and the lipid composition is 20% DSPC content (“20% (DSPC)” in Table 6) or 20% DOPE content (Table 6).
  • RNP-loaded lipid nanoparticles were produced in the same manner except that "20% (DOPE)"). Each RNP-loaded lipid nanoparticle was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cas9 protein concentration was 0.3, 1, or 5 nM, and cultured.
  • FIG. 5 shows the results of determining the ratio ([KI (%)] / [KO (%)]) of the knock-in efficiency (%) to the knock-out efficiency (%) for each RNP-loaded lipid nanoparticle.
  • Example 2 The effect of the formulation of lipid nanoparticles on gene knockout activity was investigated.
  • the items to be examined were pH-sensitive cationic lipid (CL) content (30, 40, 50 mol%), neutral phospholipid (PL) content (20, 35, 50 mol%), and PEG-DMG content (1, 2). .5, 4 mol%), type of pH-sensitive cationic lipid (CL4H6 or CL15H6 (pKa to 7.25, Patent Document 2)), type of neutral phospholipid (DSPC or DOPE), and RNP / lipid ratio (1.8).
  • the six factors were 2.7, 3.6 ⁇ 10 -4 mol).
  • RNP-loaded lipid nanoparticles for GFP knockout were produced in the same manner as the RNP-loaded lipid nanoparticles for GFP knockout in Example 1 except that the ratio of the lipid component, the lipid, and the RNP was set in the formulation shown in Table 8.
  • the number average particle diameter (nm) of the obtained RNP-loaded lipid nanoparticles and the encapsulation rate (%) of PdI, gRNA and ssON in the lipid nanoparticles were measured in the same manner as in Example 1.
  • each RNP-loaded lipid nanoparticle was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cas9 protein concentration was 0.1, 0.5, or 2 nM, and cultured. After changing the medium 2 days after the addition of the RNP-loaded lipid nanoparticles, the cells were collected 3 days later, and the GFP knockout efficiency (%) was measured by flow cytometry in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 9. Further, FIG. 6 shows the measurement result of the GFP knockout efficiency (%).
  • Table 10 shows the main effects that significantly affect the number average particle size and the results of the interaction between the two factors, and the prediction profile of the number average particle size when the factors that significantly affect the number average particle size are changed. Each is shown in FIG.
  • the pH-sensitive cationic lipid content, PEG-DMG content, type of pH-sensitive cationic lipid, and neutral phospholipid were detected as factors that significantly affected the particle size. More specifically, the pH-sensitive cationic lipid content is increased, the PEG-DMG content is set to around 2.5 mol%, CL4H6 is used as the pH-sensitive cationic lipid, and DOPE is used as the neutral phospholipid. It was clarified that the particle size can be controlled to be small by using it. In particular, it was clarified that the influence of the amount of PEG lipid and the type of neutral phospholipid is a large factor.
  • the encapsulation rate was similarly statistically analyzed.
  • Table 11 shows the results of the main effect and the interaction between the two factors that significantly affect the encapsulation rate
  • FIG. 8 shows the prediction profile of the encapsulation rate when the factors that significantly affect the encapsulation rate are changed. ..
  • all the factors significantly affected the encapsulation rate More specifically, increasing the pH-sensitive cationic lipid content, increasing the neutral phospholipid content, decreasing the PEG-DMG content, using CL15H6 as the pH-sensitive cationic lipid, as the neutral phospholipid. It was clarified that the encapsulation rate was improved by using DOPE and further lowering the RNP / lipid ratio. The type of neutral phospholipid was the most influential factor.
  • the gene knockout activity (%) was similarly statistically analyzed.
  • Table 12 shows the main effects that significantly affect the gene knockout activity (%) and the results of the interaction between the two factors.
  • Prediction profiles are shown in FIG. 9, respectively.
  • PEG-DMG content, pH-sensitive cationic lipid types, and neutral phospholipid types were identified as factors that significantly affected knockout activity. More specifically, it was revealed that the gene knockout activity is improved by setting the PEG-DMG content to about 1 mol%, the pH-sensitive cationic lipid to CL4H6, and the neutral phospholipid to DOPE. ..
  • the types of cationic lipids and the types of neutral phospholipids were the factors with the greatest influence.
  • A-7 and A-11 is a formulation that satisfies the condition for improving the gene knockout activity, shows high knockout activity compared with other lipid nanoparticles (FIG. 6), IC 50 of the RNP (50% inhibitory concentration) was 0.1 nM or less (Cas9 protein concentration conversion). In addition, the maximum knockout efficiency reached 95% or more (Fig. 6).
  • CL4H6 was used as the pH-sensitive cationic lipid
  • DOPE was used as the neutral phospholipid.
  • RNP-loaded lipid nanoparticles for GFP knockout were produced in the same manner as in the primary screening except that the ratio of lipid component, lipid, and RNP was set in the formulation shown in Table 13, and the number average particles of the obtained RNP-loaded lipid nanoparticles were obtained.
  • the encapsulation rate (%) of the diameter (nm), PdI, gRNA and ssON in lipid nanoparticles was measured.
  • each RNP-loaded lipid nanoparticle was added to HeLa-GFP cells, and the GFP knockout efficiency (%) was measured. The results are shown in Table 13.
  • FIG. 10 shows the prediction profile of the number average particle size when the factors that significantly affect the number average particle size are changed. .. It was clarified that the particle size can be controlled to be small by increasing the amount of PEG lipid.
  • the encapsulation rate was similarly statistically analyzed.
  • Table 15 shows the results of the main effects that significantly affect the encapsulation rate
  • FIG. 11 shows the prediction profile of the encapsulation rate when the factors that significantly affect the encapsulation rate are changed.
  • the encapsulation rate was improved by increasing the pH-sensitive cationic lipid content, increasing the neutral phospholipid content, or decreasing the PEG-DMG content.
  • the gene knockout activity (%) was similarly statistically analyzed.
  • Table 16 shows the results of the main effects that significantly affect the gene knockout activity (%), and the predicted profile of the gene knockout activity (%) when the factors that significantly affect the gene knockout activity (%) are changed. Each is shown in FIG. It was revealed that the gene knockout activity was improved by reducing the PEG-DMG content or increasing the pH-sensitive cationic lipid content to 40 mol% or more.
  • Example 3 The cytotoxicity and storage stability of the RNP-loaded lipid nanoparticles B-4 and B-9 produced in Example 2 were examined.
  • Each RNP-loaded lipid nanoparticle was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cas9 protein concentration was 0.3, 0.5, or 1 nM, and cultured.
  • the WST-8 assay was performed.
  • the WST-8 assay was performed using a cell count kit (product name: "Cell Counting Kit-8", manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.).
  • the WST-8 assay was similarly performed using cells in which PBS ( ⁇ ) was added to the medium of HeLa-GFP cells instead of RNP-loaded lipid nanoparticles as a control.
  • Example 4 The effect of the base length of ssON mounted on the RNP-loaded lipid nanoparticles on the knockout activity was investigated.
  • 132 base length DNA (SEQ ID NO: 5), 20 base length DNA (same base sequence as the 68th to 87th region of SEQ ID NO: 5), 60 base length used in Example 2 DNA (same base sequence as the 48th to 107th regions of SEQ ID NO: 5) or DNA having a length of 60 bases as RNA (SEQ ID NO: 7) was used.
  • the RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 and the RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 and B-4 was manufactured.
  • each RNP-loaded lipid nanoparticles was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cas9 protein concentration was 0.1 nM or 0.3 nM, and the cells were cultured.
  • the cells were collected and GFP knockout efficiency (%) (cells that do not emit GFP fluorescence in the whole cells) by flow cytometry. Percentage (%)) was measured.
  • FIG. 16A The results of cells into which RNP-loaded lipid nanoparticles were introduced so that the Cas9 protein concentration was 0.1 nM are shown in FIG. 16A, and the results of cells into which RNP-loaded lipid nanoparticles were introduced so that the Cas9 protein concentration was 0.3 nM are shown in FIG. Each is shown in FIG. 16B.
  • Example 5 Lipid nanoparticles carrying RNA-dependent DNA nuclease Cpf1 instead of Cas9 were produced and their gene knockout activity was examined.
  • Cpf1 protein product name: "Alt-R As Cas12a (Cpf1) Ultra", manufactured by Integrated DNA technologies
  • crRNA and tracrRNA used in Reference Example 1 as gRNA.
  • 41 base long RNA SEQ ID NO: 8
  • 100 base length RNA SEQ ID NO: 9
  • ssON 120 base length RNA
  • SEQ ID NO: 10 60 base length RNA
  • RNA-loaded lipid nanoparticles B-9 were produced in the same manner as in Example 2 except that the same base sequence as the 86th region was used. SEQ ID NO: 11) was used.
  • each RNP-loaded lipid nanoparticles was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cpf1 protein concentration was 0.5, 1, or 2 nM, and the cells were cultured. After exchanging the medium 2 days after the addition of the RNP-loaded lipid nanoparticles, and after culturing for another 3 days, the cells were collected and GFP knockout efficiency (%) (cells that do not emit GFP fluorescence in the whole cells) by flow cytometry. Percentage (%)) was measured.
  • NT indicates the results of cells cultured in a medium to which RNP-loaded lipid nanoparticles were not added.
  • GGFP is the result of cells cultured in a medium containing no RNP-loaded lipid nanoparticles using 41-base-long RNA (SEQ ID NO: 8), and "gGFP + 59” is 100-base-long RNA (SEQ ID NO: 9).
  • SEQ ID NO: 8 41-base-long RNA
  • gGFP + 59 is 100-base-long RNA
  • the results of the cells cultured in the medium to which the RNP-loaded lipid nanoparticles used were not added are shown.
  • ssON indicates the results of cells cultured in a medium containing no ssON-containing RNP-loaded lipid nanoparticles.
  • each of the 0.5 nM, 1 nM, and 2 nM columns shows the results of cells in which RNP-loaded lipid nanoparticles were added to the medium so that the Cpf1 protein concentration was 0.5, 1, or 2 nM, respectively.
  • the GFP knockout activity was improved by adding ssON to RNP as in the case of using Cas9 protein.
  • the longer the base length of ssON to be added the higher the knockout activity. From these results, it is clear that the lipid nanoparticles according to the present invention are useful as carriers for introducing RNP not only in the CRISPR / Cas9 system but also in the CRISPR / Cpf1 system.
  • Example 6 As a method for reducing the off-target effect (introduction of mutation into a non-targeted gRNA region) by Cas9, a double nicking method using two pairs of Cas9 nickase (Cas9n) inactivated by one of RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity It has been known. Lipid nanoparticles equipped with RNP used in this double nicking method were produced, and their gene knockout activity was investigated.
  • Cas9n protein product name: "Alt-R Sp Cas9 D10A Nickase V3", manufactured by Integrated DNA technologies
  • gRNA the tracrRNA used in Reference Example 1 and the tracrRNA in the GFP gene were used.
  • RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 were produced in the same manner as in Example 2 except that ssON was not used.
  • RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 loaded with RNP containing Cas9 protein were produced in the same manner as in Example 2.
  • each RNP-loaded lipid nanoparticles was added to the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the concentration of Cas9n protein or Cas9 protein was 0.1, 0.3, 1, or 2 nM, and cultured. was done.
  • the cells were collected and GFP knockout efficiency (%) (cells that do not emit GFP fluorescence in the whole cells) by flow cytometry. Percentage (%)) was measured.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the RNP-loaded lipid nanoparticles loaded with Cas9n protein also had high GFP knockout activity, similar to the RNP-loaded lipid nanoparticles loaded with Cas9 protein.
  • the GFP knockout efficiency was 98% in the cells added so that the Cas9n protein concentration was 2 nM. From this result, it is clear that the lipid nanoparticles having a specific lipid composition according to the present invention are useful as carriers for introducing RNP in the double nicking method using Cas9n protein, and the RNP in this double nicking method can be used.
  • RNP containing ssON that hybridizes with each gRNA is also useful as a carrier for introducing RNP in the double nicking method.
  • Example 7 The RNP-loaded lipid nanoparticles B-4 and B-9 produced in Example 2 were introduced into GFP-stable expression HEK (HEK-GFP) cells, and their knockout activity, knock-in activity, and cytotoxicity were examined.
  • HEK-GFP GFP-stable expression HEK
  • RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 and B-4 were produced in the same manner as in Example 2 except that the ssON for GFP knock-in used in Example 1 was used instead of the ssON for GFP knockout. ..
  • each RNP-loaded lipid nanoparticle was introduced into HEK-GFP cells and cultured in the same manner as in the above-mentioned measurement of GFP knockout activity, and then collected and flow cytometry was performed to perform knock-in efficiency (%) (over the entire cell). The percentage of cells emitting BFP fluorescence (%) was measured. The measurement result is shown in FIG. 19B. Cells introduced with either RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 or B-4 had a maximum knock-in efficiency of about 23%.
  • Example 8 The RNP-loaded lipid nanoparticles B-9 produced in Example 2 were introduced into bone marrow-derived macrophages (BMDM) that constitutively express GFP, and the GFP knockout activity was examined.
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • BMDM constitutively expressing GFP those recovered from GFP constitutive expression mice (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) mice) (female, 6 weeks old) were used. Specifically, bone marrow cells were collected from the femur and tibia of GFP constitutively expressing mice, passed through a 40 ⁇ m cell strainer, and then red blood cells were used using a solubilization buffer (product name: “ACK lysing buffer”, manufactured by Gibco). Was removed.
  • solubilization buffer product name: “ACK lysing buffer”, manufactured by Gibco).
  • the bone marrow cells were then cultured in a medium containing recombinant mouse M-CSF (final concentration: 50 ng / mL, manufactured by BioLegend) and deactivated FBS (final concentration: 10%) for 7 days to obtain BMDM. ..
  • FIG. 21 (A) The results of BMDM flow cytometry before the introduction of RNP-loaded lipid nanoparticles are shown in FIG. 21 (A), and the results of BMDM flow cytometry after the introduction of RNP-loaded lipid nanoparticles are shown in FIG. 21 (B). Each is shown.
  • BMDM before the introduction of RNP-loaded lipid nanoparticles almost all cells emitted GFP fluorescence, but in BMDM after introduction of RNP-loaded lipid nanoparticles, the proportion of cells that did not emit GFP fluorescence increased. .. From these results, it is clear that the lipid nanoparticles according to the present invention are also useful as carriers for introducing RNP used for genome editing and the like into cells collected from a living body.
  • Example 9 Using an apparatus in which the mixer-embedded microchannel 104 of the manufacturing apparatus shown in FIG. 2 used in Reference Example 1 and the like is replaced with a channel 107 having three introduction paths as shown in FIG. 1B. RNP-loaded lipid nanoparticles were produced and their physical properties and GFP knockout activity were investigated.
  • the number average particle diameter (nm) of the obtained RNP-loaded lipid nanoparticles and the encapsulation rate (%) of PdI, gRNA and ssON in the lipid nanoparticles were measured in the same manner as in Example 1. The measurement results are shown in Table 17. As a result, even when a manufacturing apparatus having three introduction paths is used, the RNP-loaded lipid nanoparticles having physical properties equal to or higher than those of the RNP-loaded lipid nanoparticles obtained in Example 2 using the manufacturing apparatus having two introduction paths. The particles could be produced.
  • the obtained RNP-loaded lipid nanoparticles were added to the medium so that the Cas9 protein concentration was 0.1, 0.3, or 1 nM in the same manner as in Example 4, and introduced into HeLa-GFP cells.
  • the GFP knockout activity was examined. The results are shown in FIG.
  • Each of the RNP-loaded lipid nanoparticles had a GFP knockout activity equal to or higher than that of the RNP-loaded lipid nanoparticles obtained in Example 2.
  • Example 10 The effect of the pH of the RNP solution at the time of producing the RNP-loaded lipid nanoparticles on the knockout activity of the produced RNP-loaded lipid nanoparticles was investigated.
  • a buffer solution for preparing the RNP solution use a MES buffer solution (20 mM MES, 50 mM NaCl, pH 6.0 or 6.3) as the buffer solution of pH 6.0 or 6.3, and pH 4.0, 5.0.
  • a citrate buffer (20 mM citrate, 50 mM NaCl, pH 4.0, 5.0, or 5.5) was used as the buffer of 5.5.
  • RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cas9 protein were prepared in the same manner as in particle B-9. Further, RNP-loaded lipid nanoparticles containing the Cpf1 protein were prepared in the same manner except that the Cpf1 protein used in Example 5 was used instead of the Cas9 protein.
  • each RNP-loaded lipid nanoparticles was placed in the medium of HeLa-GFP cells seeded the day before so that the Cas9 protein concentration was 0.1 nM or 0.3 nM, or the Cpf1 protein concentration was 0.5 nM, 1.0 nM. , Or 2.0 nM, and the cells were added and cultured.
  • the cells were collected after culturing for another 3 days, and the GFP knockout efficiency (%) (cells that do not emit GFP fluorescence in the whole cells) by flow cytometry. Percentage (%)) was measured.
  • FIG. 23A The results of cells into which RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cas9 protein have been introduced are shown in FIG. 23A, and the results of cells into which RNP-loaded lipid nanoparticles containing Cpf1 protein have been introduced are shown in FIG. 23B.
  • the gene knockout activity was retained in the RNP-loaded lipid nanoparticles containing either the Cas9 protein or the Cpf1 protein when the pH at the time of preparation was 5.0 or higher.

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Abstract

本発明は、ゲノム編集に必要な核酸等を内包しており、流路を用いたアルコール希釈法により製造することが可能であり、かつゲノム編集効率に優れた脂質ナノ粒子を提供することを課題とする。本発明は、脂質成分とＤＮＡヌクレアーゼとガイドＲＮＡと一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含有し、前記脂質成分がｐＨ感受性カチオン性脂質と中性リン脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質とを含有し、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が３０～５０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記中性リン脂質の割合が２０～５０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合が１～４モル％である、脂質ナノ粒子である。

Description

脂質ナノ粒子
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集に用いられるＲＮＡ－タンパク質複合体（ribonucleoprotein；ＲＮＰ）のキャリアとして有用な脂質ナノ粒子に関する。
　本願は、２０１９年５月３０日に、日本に出願された特願２０１９－１０１２０３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ゲノム編集技術は、目的とする任意のゲノムＤＮＡ領域に選択的に、変異の導入又は遺伝子を含む任意のＤＮＡ配列を挿入することが可能なバイオテクノロジーである。遺伝性疾患や感染症などの様々な難治性疾患に対する根本的な治療の実現につながることから、ゲノム編集技術は、医薬への応用が切望されている。中でも第３世代ゲノム編集技術であるＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）／Ｃａｓ９（CRISPR-associated proteins 9）システムは、優れた遺伝子ノックアウト効率や設計の簡便さから、現在最も着目を浴びている技術である。本システムは、ＤＮＡ二本鎖切断（double-strand break；ＤＳＢ）活性を有するＣａｓ９タンパク質と、細菌由来のｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating CRISPR RNA）からなるキメラＲＮＡであるｇＲＮＡ（guide RNA）とのＲＮＰとして機能する。したがって、標的細胞内でＲＮＰを発現させる、又はＲＮＰそのものを標的細胞内に送達することによって、目的とする遺伝子ノックアウトを誘導することが可能である。さらに、ドナーＤＮＡを同時に送達することにより、遺伝子ノックインを誘導することも可能となる。
　ゲノム編集技術における標的細胞内への送達手段としては、ＤＮＡ又はＲＮＡを導入することにより細胞内でＲＮＰを発現させる手法や、ＲＮＰそのものを細胞に直接導入する手法がある。前者の場合、ウイルスベクターや非ウイルスベクターなどの送達技術がある程度確立されているため、比較的容易に行えるが、Ｃａｓ９タンパク質の発現が比較的長時間に亘るため、意図しないＤＮＡ領域における変異の導入（オフターゲット作用）が生じやすい。一方で、後者の場合、ＲＮＰは標的ＤＮＡ領域における変異導入後、速やかに分解・消失するため、オフターゲット作用が最小限に抑えられる。特にＤＳＢを伴うゲノム編集では、編集された細胞が生存する限り永続的に影響が続く為、オフターゲット作用の抑制は極めて重要である。
　ＲＮＰそのものを送達可能な技術の開発は、複数報告されている。例えば、DNA Nanoclewsを用いる方法（非特許文献１）、生体内還元性脂質ナノ粒子を用いる方法（非特許文献２）、金ナノ粒子とのコンジュゲートを用いる方法（非特許文献３）、lipidoidを用いる方法（非特許文献４）、lecithin nano-liposomal particleを用いる方法（非特許文献５）がある。また、遺伝子ノックインを誘導した例としてはCRISPR-Gold（非特許文献６）が報告されている。ただし、いずれも培養細胞における遺伝子ノックダウンの誘導に、高濃度のＣａｓ９を要しているなど、ゲノム編集効率に課題が残されている。
　一方で、核酸等を内包する脂質ナノ粒子の製造方法としては、流路を用いたアルコール希釈法を原理とするものがある。例えば、２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることで直径３０ｎｍ程度の脂質ナノ粒子を再現良く製造可能であることが報告されている（非特許文献７）。また、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることにより、従来の三次元ミキサーを用いる流路構造体よりも、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることも報告されている（特許文献１）。これらのナノ粒子製剤の製造方法は、近年では主に、脂溶性薬物や、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）又はｍＲＮＡ等の核酸を搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製造に採用されている。例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸を効率的に標的細胞内へ送達するためのキャリアとなる脂質ナノ粒子として、ｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子が報告されている（特許文献２）。
国際公開第２０１８／１９０４２３号 国際公開第２０１８／２３０７１０号
Sun et al., Angewandte Chemie International Edition, 2015, vol.54, p.12029-12033. Wang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, vol.113, p.2868-2873. Mout et al., American Chemical Society Nano, 2017, vol.11, p.2452-2458. Li et al., Biomaterials, 2018, vol.178, p.652-662. Cho et al., Journal of Nanobiotechnology, 2019, vol.17, p.19. Lee et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, vol.1, p.889-901. Leung et al.，Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces，2012，vol.116(34)，p.18440-18450. Stroock et al., Science, 2002, vol.295, p.647-651
　ＲＮＰ等のタンパク質はこれまで用いられてきた低分子薬物や核酸と比較してアルコールなどの有機溶媒、緩衝液のｐＨ、塩濃度、温度などの粒子製造時の様々な物理的パラメータにより不可逆的な不活性化を受けやすい。このため、現在までにアルコール希釈法を原理とするＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子製剤の製造に関する報告はない。
　本発明は、ゲノム編集に必要な核酸等を内包しており、流路を用いたアルコール希釈法により製造することが可能であり、かつゲノム編集効率に優れた脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との複合体であるＲＮＰを、さらにｃｒＲＮＡと相補な塩基配列領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＮ）と複合体化して負に帯電させることにより、ｐＨ感受性カチオン性脂質を含む特定の組成の脂質膜構造からなる脂質ナノ粒子に効率的に搭載できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の脂質ナノ粒子を提供するものである。
［１］　脂質成分と、ＤＮＡヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含有し、
　前記脂質成分が、下記一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
〔式（Ｉ）中、ａは３～５の整数を示し；ｂは０又は１を示し；Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に下記一般式（Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式（Ａ）中、ｑは１～９の整数を示し；ｒは０又は１を示し；ｓは１～３の整数を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１～８の整数を示し；ｃは０又は１を示し：ｖは４～１２の整数を示し；ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｃ＋ｖが１９以上の整数であるが、ｂとｃが同時に０となる場合には、ｑが３～５の整数であり、ｒ及びｔが１であり、ｓが１であり、かつｕ＋ｖが６～１０の整数である場合を除く）
で表される基を示し；Ｘは、下記一般式（Ｂ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（該Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基に置換されていてもよい）を示すが、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を形成してもよい）
で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を示す〕
で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質と、中性リン脂質と、ポリアルキレングリコール修飾脂質と、を含有し、
　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が３０～５０モル％であり、
　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記中性リン脂質の割合が２０～５０モル％であり、
　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合が１～４モル％である、脂質ナノ粒子。
［２］　前記中性リン脂質が、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を有する中性グリセロリン脂質である、前記［１］の脂質ナノ粒子。
［３］　前記中性リン脂質が、炭素数１２～２４の不飽和の脂肪酸残基を有するホスファチジルエタノールアミンである、前記［１］の脂質ナノ粒子。
［４］　前記ｐＨ感受性カチオン性脂質が、ポリエチレングリコール修飾脂質である、前記［１］～［３］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［５］　前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとからなる、前記［１］～［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［６］　前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれか一方のみを有するタンパク質である、前記［５］の脂質ナノ粒子。
［７］　前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１タンパク質である、前記［１］～［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［８］　前記［１］～［７］のいずれかの脂質ナノ粒子を細胞内へ導入する、ゲノム編集方法。
［９］　前記［１］～［７］のいずれかの脂質ナノ粒子を、流路構造体を用いて製造する方法であって、
　前記流路構造体が、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成しており、
　前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
　当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をｙ０とした場合に、Ｙ方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に、１／２ｙ０以上１ｙ０未満の一定高さｈ１、ｈ２...を有し、かつＸ方向に一定幅ｘ１、ｘ２...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔ｄ１、ｄ２...をもって少なくとも２つ以上設けられていることで形成されており、
　前記第１導入路より前記脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液を、前記第２導入路より前記ＤＮＡヌクレアーゼと前記ガイドＲＮＡと前記一本鎖オリゴヌクレオチドとを含有するｐＨが５．０以上の水溶液を、総流量が１μＬ／分～１００ｍＬ／分であり、かつ前記脂質溶溶液の流速に対する前記水溶液の流速の比が７以上である、脂質ナノ粒子の製造方法。
［１０］　前記流路構造体が、さらに、第３の流動体を導入する第３導入路を有しており、
　前記第１導入路から導入された第１の流動体が、前記第２導入路から導入された第２の流動体と合流する前に、前記第３導入路から導入された第３の流動体と接触するように、前記第１導入路と前記第２導入路と前記第３導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成している、前記［９］の脂質ナノ粒子の製造方法。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、ＲＮＰがｐＨ感受性カチオン性脂質を含む特定の組成の脂質膜構造からなる脂質ナノ粒子に搭載されているため、標的細胞のゲノム編集を効率よく行うことができる。また、本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜構造に搭載されるＲＮＰがｓｓＯＮを含んでおり、負に帯電していることから、アルコール希釈法によって製造することができる。
本発明に係る脂質ナノ粒子の製造に用いられる流路構造体の一実施形態における構造を模式的に示す図面である。 本発明に係る脂質ナノ粒子の製造に用いられる流路構造体の一実施形態における構造を模式的に示す図面である。 参考例１及び実施例１において使用された流路構造体の構造の模式図である。 参考例２において使用された流路構造体の構造の模式図である。 実施例１において、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子のＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対するＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例１において、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子のＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対する、ノックアウト効率（％）に対するノックイン効率（％）の比（［ＫＩ（％）］／［ＫＯ（％）］）の測定結果を示した図である。 実施例２において、一次スクリーニングにおける各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子のＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対するＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例２において、一次スクリーニングにおける個数平均粒子径に有意に影響を与える因子を変化させた際の個数平均粒子径の予測プロファイルを示した図である。 実施例２において、一次スクリーニングにおける封入率に有意に影響を与える因子を変化させた際の封入率の予測プロファイルを示した図である。 実施例２において、一次スクリーニングにおける遺伝子ノックアウト活性に有意に影響を与える因子を変化させた際の遺伝子ノックアウト活性の予測プロファイルを示した図である。 実施例２において、二次スクリーニングにおける個数平均粒子径に有意に影響を与える因子を変化させた際の個数平均粒子径の予測プロファイルを示した図である。 実施例２において、二次スクリーニングにおける封入率に有意に影響を与える因子を変化させた際の封入率の予測プロファイルを示した図である。 実施例２において、二次スクリーニングにおける遺伝子ノックアウト活性に有意に影響を与える因子を変化させた際の遺伝子ノックアウト活性の予測プロファイルを示した図である。 実施例３において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４又はＢ－９を添加した細胞の細胞生存率（％）を測定した結果を示した図である。 実施例３において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を添加した細胞を４℃で保存し、ゼータ電位とＰｄＩを経時的に測定した結果を示した図である。 実施例３において、４℃の保存前後のＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９のＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対するＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例４において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４又はＢ－９を、培地にＣａｓ９タンパク質濃度が０．１ｎＭとなるように添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例４において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４又はＢ－９を、培地にＣａｓ９タンパク質濃度が０．３ｎＭとなるように添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例５において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、培地にＣｐｆ１タンパク質濃度が０．５、１、又は２ｎＭとなるように添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例６において、Ｃａｓ９ｎタンパク質を含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子又はＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を培地にＣａｓ９ｎタンパク質等の濃度が０．１、０．３、１、又は２ｎＭとなるように添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例７において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４又はＢ－９を、培地にＣａｓ９タンパク質濃度が０．５、１、３、又は５ｎＭとなるように添加して培養したＨＥＫ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例７において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４又はＢ－９を、培地にＣａｓ９タンパク質濃度が０．５、１、３、又は５ｎＭとなるように添加して培養したＨＥＫ－ＧＦＰ細胞におけるBＦＰ陽性細胞割合（％）の測定結果を示した図である。 実施例７において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４又はＢ－９を添加した細胞の細胞生存率（％）を測定した結果を示した図である。 実施例８において、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入する前のＧＦＰ恒常発現ＢＭＤＭのフローサイトメトリーの結果（Ａ）と、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入した後のＧＦＰ恒常発現ＢＭＤＭのフローサイトメトリーの結果（Ｂ）を示した図である。 実施例９において、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を、培地にＣａｓ９タンパク質濃度が０．１、０．３、又は１ｎＭとなるように添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例１０において、Ｃａｓ９タンパク質を含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。 実施例１０において、Ｃｐｆ１タンパク質を含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加して培養したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示した図である。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、標的細胞にＲＮＰを導入するキャリアとして使用されるものであり、ゲノム編集に用いられるＤＮＡヌクレアーゼとガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とｓｓＯＮとの複合体であるＲＮＰが、ｐＨ感受性カチオン性脂質を含む特定の組成の脂質膜構造に搭載されている脂質ナノ粒子である。当該脂質ナノ粒子に搭載されるＲＮＰとしては、Ｃａｓ９タンパク質とｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとｓｓＯＮとの複合体が挙げられる。ＲＮＰ自体を直接脂質ナノ粒子に搭載して標的細胞に導入するため、Ｃａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞内に導入して発現させる方法よりも、オフターゲット作用が小さい。
［ＤＮＡヌクレアーゼ］
　本発明及び本願明細書において、脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合し、ｇＲＮＡの一部と対合して形成された二本鎖ＤＮＡを認識して切断する酵素である。当該ＤＮＡヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等が挙げられる。
＜Ｃａｓ９タンパク質＞
　本発明及び本願明細書において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合し、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質である。ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を備えるＣａｓ９タンパク質は、ゲノムＤＮＡの二本鎖を切断する。ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれか一方のみを備えるＣａｓ９タンパク質は、ゲノムＤＮＡの二本鎖のうちのいずれか一方の鎖のみを切断する。
　本発明において用いられるＣａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来する野生型のＣａｓ９タンパク質であってもよく、野生型タンパク質を改変した変異型タンパク質であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌としては、例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）等が挙げられる。また、野生型のＣａｓ９タンパク質を改変した変異型タンパク質としては、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかを失活させるような変異が導入された変異体が挙げられる。当該変異体としては、例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１０番目のアスパラギン酸がアラニンに置換された変異体（Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ））が挙げられる。Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）は、ＤＮＡニッカーゼとして機能するため、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）とも呼ばれる。その他、野生型のＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に影響を与えない変異が導入された変異型タンパク質であってもよい。
　本発明において用いられるＣａｓ９タンパク質は、野生型のＣａｓ９タンパク質又はその変異型タンパク質に、各種ペプチドを付加したものであってもよく、他のタンパク質と融合させたキメラタンパク質であってもよい。当該ペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のタグペプチド、核移行シグナルペプチド等のシグナルペプチド等が挙げられる。野生型又は変異型のＣａｓ９タンパク質と融合させる他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ、蛍光タンパク質等が挙げられる。
＜Ｃｐｆ１タンパク質＞
　本発明及び本願明細書において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合し、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性のみを有するタンパク質である。ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を備えるＣａｓ９タンパク質が、ゲノムＤＮＡの二本鎖を切断して平滑末端を形成するのに対して、Ｃｐｆ１タンパク質は、５’突出末端を形成する。
　本発明において用いられるＣｐｆ１タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを有する細菌に由来する野生型のＣｐｆ１タンパク質であってもよく、野生型タンパク質を改変した変異型タンパク質であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを有する細菌としては、例えば、アシダミノコッカス属菌（Acidaminococcus sp.）、ラクノスピラ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）等が挙げられる。また、野生型のＣｐｆ１タンパク質を改変した変異型タンパク質としては、ヌクレアーゼ活性を増大させるような変異が導入された変異体や、ヌクレアーゼ活性に影響を与えない変異が導入された変異型タンパク質が挙げられる。
　本発明において用いられるＣｐｆ１タンパク質は、野生型のＣｐｆ１タンパク質又はその変異型タンパク質に、各種ペプチドを付加したものであってもよく、他のタンパク質と融合させたキメラタンパク質であってもよい。当該ペプチドや他のタンパク質としては、Ｃａｓ９タンパク質で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
［ｇＲＮＡ］
　本発明及び本願明細書において、ｇＲＮＡは、ＤＮＡヌクレーゼによって切断させるゲノムＤＮＡ上の標的配列（ゲノム編集する対象の塩基配列）に対合可能な塩基配列を有するＲＮＡである。「標的配列に対合可能な塩基配列」とは、標的配列以外の領域の認識を抑制するため、通常は、標的配列と相同的（同一）又は相補的な塩基配列である。ｇＲＮＡは、１本のＲＮＡからなるものであってもよく、２本以上のＲＮＡが複合体を形成しているものであってもよい。
＜ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ＞
　脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質の場合、ｇＲＮＡとしては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを用いることができる。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来し、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる領域（ｔｒａｃｒＲＮＡとの結合領域）と、ゲノムＤＮＡ上の標的配列と相同的又は相補的な塩基配列からなる領域（ゲノムＤＮＡ結合領域）とを含む１本鎖ＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、同じくＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来し、ｃｒＲＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる領域（ｃｒＲＮＡとの結合領域）を有しており、当該領域においてｃｒＲＮＡとハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する１本鎖ＲＮＡである。当該ヘアピン構造をＣａｓ９タンパク質が認識し、ＲＮＰが形成される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、それぞれ独立した１本鎖ＲＮＡであってもよく、両者が適当なＲＮＡリンカーを介して連結された１本鎖ＲＮＡであってもよい。なお、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌としては、前記の通りのものが挙げられる。Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、いずれも同種の細菌由来であってもよく、互いに異種の細菌由来であってもよい。また、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの機能を損なわない限り、天然のＲＮＡのみからなるものであってもよく、その一部又は全部に修飾ＲＮＡや人工核酸が含まれていてもよい。
＜Ｃｐｆ１タンパク質と用いられるｇＲＮＡ＞
　脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣｐｆ１タンパク質の場合、ｇＲＮＡとしては、ｃｒＲＮＡと同様に標的配列を含むＲＮＡであればよく、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。このため、ｇＲＮＡを、Ｃａｓ９タンパク質を用いる場合よりもより短いものとすることができる。また、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの機能を損なわない限り、天然のＲＮＡのみからなるものであってもよく、その一部又は全部に修飾ＲＮＡや人工核酸が含まれていてもよい。
＜標的配列＞
　標的配列は、通常、ＰＡＭ配列がその直後にくる領域の塩基配列を選択する。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼに認識される配列であり、用いられるＣａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼに依存して決定される。例えば、Ｃａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列としては、５'－ＮＧＧ（Ｎ：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）が挙げられ、Ｃｐｆ１タンパク質が認識するＰＡＭ配列としては、５'－ＴＴＴＶ（Ｖ：Ａ、Ｇ、Ｃ）、５'－ＴＴＴＮ（Ｎ：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）が挙げられる。ｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡ中の標的配列の塩基長は、特に限定されるものではなく、例えば、１５～３０塩基長程度にすることができ、１８～２２塩基長が好ましい。
［ｓｓＯＮ］
　本発明において用いられるｓｓＯＮは、ｇＲＮＡの一部と対合可能な領域を含む。これにより、脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼと複合体を形成している状態のｇＲＮＡと対合可能な領域を含む。これにより、ＤＮＡヌクレアーゼとｇＲＮＡとｓｓＯＮの複合体であるＲＮＰが形成される。ｓｓＯＮは、ＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むキメラオリゴヌクレオチドであってもよい。また、ｓｓＯＮは、使用されるＣＲＩＳＰＲシステムの機能を損なわない限り、天然のＲＮＡやＤＮＡのみからなるものであってもよく、その一部又は全部に修飾核酸や人工核酸が含まれていてもよい。
　脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質の場合、ｃｒＲＮＡのうち、ｔｒａｃｒＲＮＡとの結合領域以外の部分領域と、相補的な塩基配列からなる領域を含む。このｃｒＲＮＡと相補的な領域（ｃｒＲＮＡとの結合領域）を介して、ｓｓＯＮとｃｒＲＮＡはハイブリダイズする。つまり、本発明に係る脂質ナノ粒子に搭載されるＲＮＰは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡとｓｓＯＮが互いにハイブリダイズし、形成された３者複合体とＣａｓ９タンパク質が複合体化したものである。ｃｒＲＮＡ中のｓｓＯＮとハイブリダイズする領域（ｓｓＯＮとの結合領域）は、ｃｒＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡとｓｓＯＮと同時にハイブリダイズして３者複合体を形成でき、かつこの３者複合体がＣａｓ９タンパク質が認識するヘアピン構造を形成できるのであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃｒＲＮＡ中のｓｓＯＮとの結合領域は、ゲノムＤＮＡ結合領域の一部又は全部を含んでいてもよく、ゲノムＤＮＡ結合領域と同一であってもよい。また、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の一方を不活化したＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）を使用するダブルニッキング法の場合、ガイドＲＮＡは２種類用いられる。そこで、脂質ナノ粒子に搭載されるＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９ｎであり、ダブルニッキング法のためのＲＮＰを搭載した脂質ナノ粒子の場合、ｓｓＯＮは、それぞれのガイドＲＮＡにハイブリダイズする２種類を使用する。
　ＣＲＩＳＰＲシステムにより、切断されたゲノムＤＮＡに目的の遺伝子断片をノックインする場合、ｓｓＯＮは、このノックインされるドナーＤＮＡとして利用することもできる。例えば、ｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡとの結合領域以外に、ノックインされる遺伝子断片の両末端に相同組換えのための４０～６０ｂｐの相同配列領域（homology arms）が付加された領域を備えたｓｓＯＮは、ドナーＤＮＡとして機能する。
　Ｃａｓ９タンパク質やＣｐｆ１タンパク質は、核酸とは異なり正電荷を帯びているため、脂質膜を構成する脂質成分にｐＨ感受性カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子への搭載効率が低い。これに対して、本発明に係る脂質ナノ粒子では、Ｃａｓ９タンパク質等のＤＮＡヌクレアーゼと複合体化する核酸が、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡだけではなく、ｓｓＯＮも含まれる。このように、ＲＮＰに含まれている核酸量が多いため、ＲＮＰの正電荷が抑えられて負電荷が強くなり、ｐＨ感受性カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子へ効率よく搭載することができる。本発明において用いられるｓｓＯＮの塩基長は、ＲＮＰを負に帯電させるために十分な長さであればよく、ｇＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの塩基長や、Ｃａｓ９タンパク質等の種類等を考慮して適宜決定することができる。ｓｓＯＮの長さは、例えば、５０～５００塩基長程度とすることができる。
　ゲノムＤＮＡ上の標的配列の決定、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ等のｇＲＮＡの塩基配列の設計、ｓｓＯＮの塩基配列の設計等は、ゲノムＤＮＡの塩基配列情報に基づき、一般的に使用される分子生物学的ツールを利用して常法により行うことができる。例えば、ｇＲＮＡの設計は、CRISPR Design Tool（Horizon Discovery）、TrueDesign Genome Editor（Invitrogen）等の設計ツールを用いて行うことができる。
［脂質成分］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜構造体にＲＮＰが搭載された脂質ナノ粒子である。脂質膜構造体を構成する脂質成分には、少なくとも、ｐＨ感受性カチオン性脂質と、中性リン脂質と、ポリアルキレングリコール修飾脂質と、が含有されている。
＜ｐＨ感受性カチオン性脂質＞
　本発明に係る脂質ナノ粒子に含有されているｐＨ感受性カチオン性脂質は、下記一般式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質（以下、「本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質」ということがある。）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　一般式（Ｉ）において、ａは３～５の整数を示すが、好ましくは４である。
　ｂは０又は１を示す。ｂが０の場合には-O-CO-基が存在せず、単結合であることを意味する。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に下記一般式（Ａ）で表される基を示す。一般式（Ａ）において、ｑは１～９の整数を示し；ｒは０又は１を示し；ｓは１～３の整数を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１～８の整数を示し；ｃは０又は１を示し；ｖは４～１２の整数を示す。ただし、ｂとｃが同時に０となる場合には、ｑが３～５の整数であり、ｒ及びｔが１であり、ｓが１であり、かつｕ＋ｖが６～１０の整数である場合を除く。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、本発明に係る脂質ナノ粒子の安定性の点から、Ｒ１及びＲ２の炭化水素鎖が比較的長鎖であることが好ましい。具体的には、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質では、Ｒ１及びＲ２は、炭素数２０以上の基であること、すなわち、一般式（Ａ）において、ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｃ＋ｖは１９以上の整数であることが好ましい。なかでも、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｃ＋ｖが１９～３３の整数であることが好ましく、１９～３１の整数であることがより好ましく、２１～３１の整数であることがさらに好ましく、２１～２７の整数であることがよりさらに好ましい。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質のＲ１及びＲ２としては、一般式（Ａ）において、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基；ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基；ｒ及びｔが０であり、ｑ＋ｓ＋ｕが１３～２３の整数、好ましくは１５～２１であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１８以上の整数である基；ｒ及びｔが０であり、ｑ＋ｓ＋ｕが１３～２３の整数、好ましくは１５～２１であり、ｃが１であり、ｖが６～１０の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１８以上の整数である基；が好ましい。 
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質では、Ｒ１及びＲ２は、一般式（Ａ）で表される基であればよく、互いに異なる基であってもよいが、同じ基であるほうが好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｘは、下記一般式（Ｂ）で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基を示す。Ｘが示す５～７員非芳香族ヘテロ環基は、炭素原子により(O-CO)b-に結合する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　一般式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示す。ｄが０の場合には-(CH２)-基が存在せず、単結合であることを意味する。
　一般式（Ｂ）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基（炭素数１～４のアルキル基）又はＣ２－４アルケニル基（炭素数１～４のアルケニル基）を示す。Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい。
　Ｃ１－４アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基が挙げられる。Ｃ２－４アルケニル基としては、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチルビニル基、２－メチル－1－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基が挙げられる。
　一般式（Ｂ）中、Ｒ３及びＲ４は、互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成していてもよい。Ｒ３及びＲ４が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環としては、例えば、１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、及び１－ピペラジニル基が挙げられる。Ｒ３及びＲ４が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環は、環中の１個又は２個の水素原子がＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい。該環中の２個の水素原子がＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていている場合、互いに同じ基により置換されていてもよく、互いに異なる基により置換されていてもよい。
　一般式（Ｉ）において、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基である場合、該ヘテロ環基に含まれるヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子などを挙げることができる。該ヘテロ環基中のヘテロ環を構成するヘテロ原子は、１個でもよく、同一又は異なるヘテロ原子が２個以上でもよい。該ヘテロ環基中のヘテロ環は、飽和のヘテロ環であってもよく、１個又は２個以上の二重結合が含まれていてもよいが、ヘテロ環が芳香環となることはない。
　本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質としては、一般式（Ｉ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、ヘテロ環基中の炭素原子により(O-CO)b-に結合する。）、好ましくは１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ）のうち、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；一般式（Ｉ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが１であり、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、ヘテロ環基中の炭素原子により(O-CO)b-に結合する。）、好ましくは１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、又は１－ピペラジニル基（環中の炭素原子により(O-CO)b-に結合しており、１個の水素原子がＣ１－４アルキル基若しくはＣ２－４アルケニル基で置換されていてもよい。）であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ）のうち、ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；一般式（Ｉ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）において、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい）であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ）のうち、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；一般式（Ｉ）において、ａが３～５の整数であり、ｂが０であり、Ｘが一般式（Ｂ）において、ｄが０であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（Ｒ３及びＲ４が示すＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい）であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、一般式（Ａ）のうち、ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基、である脂質；が好ましい。これらの脂質のうち、Ｒ１及びＲ２が同一の基である脂質が、一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としてより好ましく、Ｒ１及びＲ２が同一の基であり、かつａが４である脂質が特に好ましい。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは特に限定されないが、例えば４．０～９．０程度、好ましくは４．５～８．５程度、より好ましくは６～８程度で選択することができ、この範囲のｐＫａを与えるように各置換基の種類を選択することが好ましい。
　一般式（Ｉ）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質は、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は一般式（Ｉ）の範囲に包含される任意の脂質を容易に製造することができる。
＜中性リン脂質＞
　本発明に係る脂質ナノ粒子の脂質成分に含まれる中性リン脂質（以下、「本発明の中性リン脂質」ということがある。）は、基全体として電荷が中性であり、リン酸基と正に帯電している基とが適当な連結基で連結された脂質である。正に帯電している基としては、例えば、アンモニウム基や４級アンモニウム基等が挙げられる。
　本発明の中性リン脂質としては、グリセロリン脂質又はスフィンゴリン脂質が好ましい。中性のグリセロリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、カルジオリピン、プラスマロゲン等が挙げられる。中性のスフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルエタノールアミン等が挙げられる。これらの中性グリセロリン脂質又は中性スフィンゴリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、炭素数１４～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。これらのグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が２以上の脂肪酸残基を有する場合、全ての脂肪酸残基が同一の基であってもよく、互いに異なる基であってもよい。
　本発明の中性リン脂質としては、ゲノム編集効率をより向上させられる点から、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を有する中性グリセロリン脂質が好ましく、炭素数１２～２４の不飽和の脂肪酸残基を有する中性グリセロリン脂質又は中性スフィンゴリン脂質がより好ましく、炭素数１２～２４の不飽和の脂肪酸残基を有する中性グリセロリン脂質がさらに好ましい。中でも、炭素数１２～２４の不飽和の脂肪酸残基を有する炭素数１２～２４の不飽和の脂肪酸残基を有するホスファチジルエタノールアミンが好ましく、炭素数１４～２０の脂肪酸残基を有するホスファチジルエタノールアミンがより好ましく、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が特に好ましい。
＜ポリアルキレングリコール修飾脂質＞
　本発明に係る脂質ナノ粒子の脂質成分に含まれるポリアルキレングリコール修飾脂質（以下、「本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質」ということがある。）は、ポリアルキレングリコールで修飾された脂質であれば特に限定されるものではないが、ｐＨ感受性カチオン性脂質及び中性リン脂質は除かれる。ポリアルキレングリコールは親水性ポリマーであり、ポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質ナノ粒子を構築することにより、脂質ナノ粒子の表面をポリアルキレングリコールで修飾することができる。ポリアルキレングリコールで表面修飾することにより、脂質ナノ粒子の血中滞留性などの安定性を高めることができる場合がある。
　ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの重量平均分子量は、例えば３００～１０，０００程度、好ましくは５００～１０，０００程度、さらに好ましくは１，０００～５，０００程度である。
　例えば、脂質のポリエチレングリコールによる修飾には、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸PEG45(STR-PEG45)など）を用いることができる。その他、N-[カルボニル－メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、n-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。
＜その他の脂質＞
　本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質と本発明の中性リン脂質と本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質以外の脂質としては、一般的にリポソームを形成する際に使用される脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えば、正又は負に帯電したリン脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　正又は負に帯電したリン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、ホスファチジン酸などを挙げることができる。ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールなどが挙げられる。
＜脂質組成＞
　　本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質、中性脂質及び本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質は、それぞれ、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質が２種類以上である場合、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。同様に、本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明の中性脂質が２種類以上である場合、本発明の中性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、本発明の中性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質が２種類以上である場合、本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。
　脂質ナノ粒子を構成する脂質分子（脂質成分）の全量に占める本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が多いほど、脂質ナノ粒子の粒子径が小さく、ＲＮＰの封入効率が高くなる傾向がある。また、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子の全量に占める本発明の中性リン脂質の割合が多いほど、ＲＮＰの封入効率が高くなる傾向がある。また、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子に本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質が少量含まれていることにより、脂質ナノ粒子の粒子径を充分に小さく、ＲＮＰの封入効率を充分に高く、ゲノム編集効率を充分に高くなる傾向にある。より高いゲノム編集効率を達成するために、本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の割合（［本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）が３０～５０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明の中性リン脂質の割合（［本発明の中性リン脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）が２０～５０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質の割合（［本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）が１．０～４．０モル％であることが好ましく、本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が４０～５０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明の中性リン脂質の割合が２０～５０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する本発明のポリアルキレングリコール修飾脂質の割合が１．５～２．０であることがより好ましい。
＜表面修飾＞
　本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面を親水性ポリマー等で修飾することにより、血中滞留性を高めることができる。これらの修飾基で修飾された脂質を脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子の核内移行を促進するために、例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３～１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３～６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。中でも、好ましくはグルコースの３量体ないし６量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの３量体又は４量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して１～３０モル％程度、好ましくは２～２０モル％程度、より好ましくは５～１０モル％程度である。
　オリゴ糖化合物で脂質ナノ粒子を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質ナノ粒子をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（国際公開第２００７／１０２４８１号）が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、脂質ナノ粒子の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や脾臓などの細網内皮系組織による捕捉率を低下させるとともに、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質ナノ粒子を脱出させて核内に移行させることができ、核内において高いゲノム編集活性を達成することが可能になる。
　また、本発明に係る脂質ナノ粒子は、細胞表面の受容体や抗原に対して特異的に結合可能な抗体などの物質で修飾を施すこともでき、細胞の核内への物質送達効率を改善することができる。例えば標的組織又は臓器に特異的に発現する生体成分に対するモノクローナル抗体を脂質ナノ粒子の表面に配置することが好ましい。この手法は、例えば、STEALTH LIPOSOME（第233-244頁、CRC Press, Inc.発行，Danilo Lasic及びFrank Martin編）などに記載されている。脂質ナノ粒子の構成成分として、モノクローナル抗体やそのフラグメント（例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、又はFab’フラグメントなど）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体、例えばポリ（エチレングリコール）-α-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ω-マレインイミド、α-［N-(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォリル-エチル）カルバミル)-ω-[３-[2-（2,5-ジヒドロ-2,5-ジオキソ-1H-ピロール-1-イル）エタンカルボキサミド］プロピル｝-ポリ（オキシ-1,2-エタンジル）などのマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含有させることにより、モノクローナル抗体を脂脂質ナノ粒子の膜の表面に結合させることができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の表面を、連続した複数個のアルギニン残基を含むポリペプチド（以下、「ポリアルギニン」と呼ぶ。）で修飾してもよい。ポリアルギニンとしては、好ましくは４～２０個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチド、さらに好ましくは４～２０個の連続したアルギニン残基のみからなるポリペプチド、特に好ましくはオクタアルギニンなどを用いることができる。リポソームなどの脂質ナノ粒子の表面をオクタアルギニンなどのポリアルギニンで修飾することにより、リポソームに封入されたＲＮＰの細胞内送達効率を向上させることができる（Journal of Controlled Release, 98, pp.317-323, 2004；国際公開第２００５／３２５９３号）。ポリアルギニンによる脂質ナノ粒子表面の修飾は、上記の刊行物に記載された方法に従って、例えば脂質修飾ポリアルギニン、例えばステアリル化オクタアルギニンなどを脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより容易に行うことができる。上記刊行物の開示及びこの刊行物において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
［その他の成分］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチドなどからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質をさらに含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和若しくは不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンなどの飽和若しくは不飽和カチオン性合成脂質；又は、カチオン性ポリマーなどを挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
［脂質ナノ粒子］
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質成分から構成される脂質膜構造体であって、ＲＮＰを搭載している。ＲＮＰの脂質ナノ粒子への封入率がより高められることから、本発明に係る脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、当該脂質ナノ粒子に搭載されているＲＮＰの割合（［ＲＮＰの量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は１．８～３．６×１０－２モル％であることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の大きさは、標的細胞が生体内の比較的深奥部に存在する場合でも高い送達効率が得られやすいことから、平均粒子径が８０ｎｍ以下であることが好ましく、平均粒子径が５０ｎｍ以下であることがより好ましく、４０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、３０ｎｍ以下であることがよりさらに好ましく、１０～３０ｎｍであることが特に好ましい。なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は０．０５～０．１程度、好ましくは０．０６～０．０８程度、さらに好ましくは約０．０７程度である。ゼータ電位は５．５ ｍＶ～６．０ ｍＶの範囲、好ましくは５．８ ｍＶ程度とすることができる。
　本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、球状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソームであることが好ましい。
［製造方法］
　本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、ＲＮＰ等を含む水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、流路を用いたアルコール希釈法により製造することができる。製造に使用する流路としては、２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路であってもよいが、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることから、特許文献１に記載されているような、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることが好ましい。
　具体的には、図１Ａに示すような流路構造体（以下、「本発明の流路構造体」ということがある。）を使用することが好ましい。その上流側（図面左側）おいて、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路１０と、第２の流動体を導入する第２導入路２０とが、それぞれ一定長を有して合流し、その下流側に向かって１つの希釈流路３０を形成している。前記希釈流路３０は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位５０を有し、当該屈曲した流路部位５０は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をｙ０とした場合に、Ｙ方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に、１／２ｙ０以上１ｙ０未満の一定高さｈ１、ｈ２...を有し、かつＸ方向に一定幅ｘ１、ｘ２...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子４０が、一定間隔ｄ１、ｄ２...をもって少なくとも２つ以上設けられていることで形成されているものである。すなわち、前記構造子４０が存在する部位においては、Ｘ方向において一定長さｘ１、ｘ２...の間、希釈流路の流路幅ｙ１、ｙ２...が１／２ｙ０以下、特に１／２ｙ０以下１／４０ｙ０以上に規制されることとなる。
　なお、本発明の流路構造体は、概念的には、図１Ａに例示し上記に説明したように、マイクロサイズの流路に略矩形形のバッフルを両側面より互い違いに配置したような形状であるが、実際上では、このように流路上に別体的なバッフルを配置することによって構成されるものに限られるものではない。すなわち、このようなバッフルを配置することで形成される流路に相応するように同様な形状の流路が形成される限り、構造子４０の構成としては特に限定されるものではなく、前記したような構造子４０を構成するように、流路構造体の壁面を（ほぼ一定肉厚を保ちながら）所定形状に屈曲させつつ、一体的に形成して、前記に規定したような屈折し縮拡する二次元構造の流路形状を構成するものであってもよく、本発明の流路構造体には、当然にこのような態様が含まれるものである。このような二次元構造の流路は、例えば、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、紫外線硬化性樹脂、金属ないしガラス質材料等を用いた射出成型、注型成形、三次元プリンターを用いた成型等によって比較的容易に形成し得るものである。
　第１導入路１０と第２導入路２０が合流した後の希釈流路３０の流路幅ｙ０は、形成しようとするナノサイズの脂質粒子の粒径の大きさによっても、ある程度左右されるが、代表的には２０～１０００μｍ程度、より好ましくは１００～２００μｍ程度とされることが好ましい。所望するナノサイズ、具体的には例えば約１０～１００ｎｍの粒径範囲内のサイズの粒径の脂質粒子を得る上では、上記したような範囲内の流路幅ｙ０で脂質溶液を希釈媒体で希釈することがある程度必要な条件である。
　また、各構造子４０の高さｈ１、ｈ２...（Ｙ方向長さ）としては、それより上流側における希釈流路３０の流路幅ｙ０に対して１／２ｙ０以上１ｙ０未満、好ましくは１／２ｙ０以上３９／４０ｙ０以下、さらに好ましくは１／２ｙ０以上３／４ｙ０以下のものとされ、当該各構造子４０が存在することにより、それより上流側における希釈流路３０の流路幅ｙ０から、流路幅ｙ１、ｙ２...を１／２ｙ０未満で０よりも大きい幅に縮小させるものとされる。なお、屈曲した流路部位５０において複数設けられる当該構造子４０のそれぞれの高さｈ１、ｈ２...は、必ずしも同一なものである必要はなく、上記した所定の条件を満たす限り、それぞれ異なるものであってもよい。これによって形成される流路幅ｙ１、ｙ２...もそれぞれ異なるものであってもよい。例えば、下流方向に行くに従って、各構造子４０のそれぞれの幅ｈ１、ｈ２...が漸次長くなり、流路幅ｙ１、ｙ２...が狭められるような態様であってもよい。各構造子４０の高さｈ１、ｈ２...（Ｙ方向長さ）が所定のものであって、これらの存在する部位の流路幅ｙ１、ｙ２...が１／２ｙ０未満の幅に絞られることで、分子拡散の効率が向上する。
　得ようとする脂質粒子の大きさや、構造子４０の数、各ミキサー構造子４０の幅（Ｘ方向長さ）ｘ１、ｘ２...、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ１、ｄ２...等のその他の条件によっても左右され、特に限定されるものでもないが、具体的には例えば、上流の希釈流路の流路幅ｙ０が２００μｍであった場合に、当該構造子４０のそれぞれの高さｈ１、ｈ２...は１００μｍ～２００μｍ未満とされることが望ましい。従って、各構造子４０が存在する位置での流路幅ｙ１、ｙ２...は、１／２ｙ０未満で０よりも大きい幅である、１００μｍ未満程度とされる。
　また、各構造子４０の幅（Ｘ方向長さ）ｘ１、ｘ２...、としては、得ようとする脂質粒子の大きさや、構造子４０の数、各構造子４０の高さｈ１、ｈ２...（Ｙ方向長さ）、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ１、ｄ２...等のその他の条件によっても左右されるが、上流の希釈流路の流路幅ｙ０に対し、１／１０ｙ０以上５ｙ０以下程度の長さとされることが好ましい。具体的には例えば、上流の希釈流路の流路幅ｙ０が、２０～１０００μｍ、代表的には２００μｍであった場合に、当該構造子４０のそれぞれの幅ｘ１、ｘ２...は２０μｍ～１０００μｍ程度とされることが望ましい。各構造子４０のそれぞれの幅ｘ１、ｘ２...は、必ずしも同一なものである必要はなく、上記した所定の条件を満たす限り、それぞれ異なるものであってもよい。例えば、下流方向に行くに従って漸次幅ｘ１、ｘ２...が長くなるような態様であってもよい。
　また、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ１、ｄ２...としては、得ようとする脂質粒子の大きさや、構造子４０の数、各構造子４０の高さｈ１、ｈ２...（Ｙ方向長さ）、各構造子４０の幅（Ｘ方向長さ）ｘ１、ｘ２...、等のその他の条件によっても左右されるが、上流の希釈流路の流路幅ｙ０に対し、１／１０ｙ０以上５ｙ０以下程度の長さとされることが好ましい。具体的には例えば、上流の希釈流路の流路幅ｙ０が、２０～１０００μｍ、代表的には２００μｍであった場合に、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ１、ｄ２...は２０μｍ～１０００μｍ程度とされることが望ましい。隣接する各構造子４０間の間隔ｄ１、ｄ２...は、必ずしも同一なものである必要はなく、上記した所定の条件を満たす限り、それぞれ異なるものであってもよい。例えば、下流方向に行くに従って漸次間隔ｄ１、ｄ２...が狭くなるような態様であってもよい。
　なお、本発明の流路構造体において、上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とした場合、前記したように各構造子４０は、両側壁面より交互に、流路中心側に向かって略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に延長されており、流路方向（Ｘ方向）に略直角に抗する壁面を有するものであるが、この角度としては必ずしも厳密に９０°である必要はなく、ある程度傾斜したものであっても有効な構成となり得るものであり、特に限定されるものではないが、具体的には例えば、３０～１５０°程度、より望ましくは４０～１４０°、特に望ましくは８０～１００°の範囲であれば許容されるものである。さらに、各構造子４０の流路中心側の角部の形状としてもある程度の丸みは許容されるものであり、特に限定されるものではないが、例えばＲ５０μｍ以下、より望ましくはＲ２０μｍ以下であれば許容される場合もあり得る。しかしながら、より制御性高く均一なナノサイズの脂質粒子を得る上では、これらの許容差はできるだけ少ない方が望ましい。また、図１Ａに示す実施形態においては、流路構造体における上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向であるＸ方向は便宜上で直線状に表わされているが、このＸ方向はあくまで希釈流路の軸線方向を示すものであって、実際上では、このような直線状なものに限られるものではなく、例えばある曲率をもって湾曲したものであってもよい。なお、このような場合には、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向であるＹ方向は、その単位長さの部位でのＸ方向と垂直な方向を指すこととなる。
　また、本発明の流路構造体は、上記したように二次元的構造の流路構造体であるから、その流路の深さ方向（図１Ａにおける紙厚方向）のサイズとしては、特に限定されるものではないが、例えば１０～１０００μｍ程度、より好ましくは５０～２００μｍ程度とすることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子をアルコール希釈法により製造する際に用いられる流路としては、図１Ａに示す流路構造体中の希釈流路３０が、三次元的な流れを生ずることができる流路であれば、特に限定されるものではない。例えば、本発明の流路構造体は、希釈流路３０の少なくともその一部において、二次元的に屈曲した流路部位５０に代えて、流路壁面に形成された溝又は微小突起によってカオティックな流れが生じるカオティックマイクロミキサー（スタッガードヘリンボーンミキサー）（非特許文献８）であってもよい。
　本発明の流路構造体が、図１Ａに示すように、第１の流動体を導入する第１導入路１０と、第２の流動体を導入する第２導入路２０とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成している場合には、第１導入路より脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液を、第２導入路よりＣａｓ９タンパク質とｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとｓｓＯＮとを含有する水溶液（ＲＮＰ含有水溶液）を、それぞれ導入する。希釈流路において、脂質溶液はＲＮＰ含有水溶液により希釈され、この過程でＲＮＰを搭載した脂質ナノ粒子が製造される。
　本発明の流路構造体は、互いに独立した複数の導入路を有しており、それらの導入路が、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成していればよく、３つの導入路を有していてもよい。本発明の流路構造体が３つの導入路を有する場合、第１導入路から導入された第１の流動体が、第２導入路から導入された第２の流動体と合流する前に、第３導入路から導入された第３の流動体と接触するように、第１導入路と第２導入路と第３導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成することができる。
　例えば、図１Ｂに示すように、希釈流路３０への合流地点が互いに最も離れている導入路を第１導入路１０及び第２導入路２０とし、残る導入路を第３導入路６０とした場合には、第１導入路１０より脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液を、第２導入路２０よりＲＮＰ含有水溶液を、第３導入路６０よりＲＮＰ含有水溶液の調製に用いた水系溶媒を、それぞれ導入する。第１導入路１０から導入された脂質溶液は、まず、第３導入路６０から導入された水系溶媒と合流し、その後に第２導入路２０から導入されたＲＮＰ含有水溶液と合流する。ＲＮＰ含有水溶液が、高濃度のエタノール溶液である脂質溶液と直接接触することが避けられるため、ＲＮＰ含有水溶液中のタンパク質が希釈流路３０、特にその入り口付近で高濃度エタノールによって凝集することを抑制できる。
　本発明の流路構造体における希釈は、分子拡散に依存するものとなる。原料となる脂質溶液の希釈速度が速いほど、生成する脂質粒子のサイズが小さいものとなる。従って、構造子（バッフル）の幅や長さ、配置を調整することによって、原料溶液の希釈速度を制御することができ、従来よりも粒径制御性が高い脂質ナノ粒子を形成することが可能である。
　ＲＮＰ含有水溶液は、Ｃａｓ９タンパク質とｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとｓｓＯＮとを、水系溶媒に溶解させることにより調製できる。当該水系溶媒は、ゲノム編集活性を保持した状態でＲＮＰを脂質溶液に混合可能な水系溶媒であり、かつ製造された脂質ナノ粒子が安定して分散可能であれば特に限定されるものではない。当該水系溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類；乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類；ラフィノース、メレジノースなどの三糖類；シクロデキストリンなどの多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコール；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール；などを加えてもよい。
　ＲＮＰ含有水溶液のｐＨが低いと、製造されたＲＮＰを搭載した脂質ナノ粒子のゲノム編集活性が低下する場合がある。このため、ＲＮＰ含有水溶液のｐＨは５．０以上が好ましく、５．０～８．５の範囲内であることがより好ましく、５．０～８．０の範囲内であることがさらに好ましく、５．０～７．５の範囲内であることがよりさらに好ましい。また、ＲＮＰ含有水溶液のｐＨは、６以上も好ましく、６～８．５の範囲内であることがより好ましく、６～８の範囲内であることがさらに好ましく、６～７．５の範囲内であることがよりさらに好ましい。
　脂質溶液とＲＮＰ含有水溶液の流速比は、脂質溶液の希釈速度に影響し、ひいては生成する脂質粒子のサイズに影響する。本発明に係る脂質ナノ粒子の製造においては、平均粒子径が充分に小さく、標的細胞への取り込み効率の高い脂質ナノ粒子を製造する点から、脂質溶液の流速に対するＲＮＰ含有水溶液の流速の比は、７以上が好ましく、７～１０がより好ましく、７～９がさらに好ましい。
　脂質溶液とＲＮＰ含有水溶液の総流量は、特に限定されるものではなく、１μＬ／分～１００ｍＬ／分の範囲内で適宜調整することができる。本発明に係る脂質ナノ粒子の製造においては、脂質溶液とＲＮＰ含有水溶液の総流量は、５０μＬ／分～１ｍＬ／分の範囲内が好ましく、５０～８００μＬ／分の範囲内がより好ましく、５０～６００μＬ／分の範囲内がさらに好ましく、５０～５００μＬ／分の範囲内がよりさらに好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子は、標的細胞へゲノム編集を行うためのＲＮＰを送達するキャリアである。本発明に係る脂質ナノ粒子を標的の細胞内へ導入することにより、ゲノム編集を行うことができる。標的細胞が培養細胞の場合、本発明に係る脂質ナノ粒子を、培養培地に添加する。標的細胞が動物の体内の細胞の場合、本発明に係る脂質ナノ粒子を、動物に投与する。投与経路は、特に限定されるものではないが、経静脈投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等の非経口投与であることが好ましい。
　本発明に係る脂質ナノ粒子が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
　図１Ａに示すような流路構造体を含む製造装置を用いて、ＲＮＰを搭載した脂質ナノ粒子を調製するための条件を検討した。具体的にはＲＮＰを溶解する緩衝液のｐＨ、エタノールに対するＲＮＰ溶液の流速比（flow rate ratio；ＦＲＲ）、及びエタノールとＲＮＰ溶液の総流速（total flow rate；ＴＦＲ）を検討した。
　図２に、実際に使用した製造装置の構造を模式的に示す。図２（Ａ）は全体の構造の模式図であり、図２（Ｂ）はミキサー内蔵マイクロ流路（流路構造体）の斜視図であり、図２（Ｃ）は希釈流路１０４ｃの一部の拡大図である。図２（Ａ）に示すように、脂質溶液を搭載したシリンジ１０１と、ＲＮＰ溶液を搭載したシリンジ１０２を、それぞれ流量制御装置１０３に設置し、これをミキサー内蔵マイクロ流路１０４の第１導入路の注入口１０４ａと第２導入路の注入口１０４ｂにチューブ１０５で連結し、希釈流路１０４ｃの注出口１０４ｄを製造された脂質ナノ粒子を回収する回収容器１０６にチューブ１０５で連結した。
　この条件検討においては、脂質による影響を除外するため、脂質溶液に代えて、エタノールを用いた。また、ＲＮＰ溶液として、化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９タンパク質（１６０ｋＤａ）（製品名：「Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3」、Integrated DNA technologies社製）と、ＧＦＰ（green fluorescent protein）遺伝子中の標的配列（配列番号１、２０塩基長）と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ（配列番号２、３６塩基長、１～２０番目の領域が標的配列と相補的な塩基配列である。）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号３、６７塩基長）とを、モル比１：１：１となるように緩衝液に溶解させた溶液（ＲＮＰ溶液）を用いた。ｃｒＲＮＡとｒａｃｒＲＮＡは、ＧＦＰ安定発現ＨｅＬａ（ＨｅＬａ－ＧＦＰ）細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅して得た。ｐＨ６の緩衝液はＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を用い、ｐＨ４．０、５．０、又は５．５の緩衝液はクエン酸緩衝液（２０ｍＭ　クエン酸、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ４．０、５．０、又は５．５）を用いた。
　ＲＮＰ溶液とエタノールをそれぞれ図２に記載の製造装置のマイクロ流路内に送液後、希釈流路より排出された溶液を回収し、透析膜（ＭＷＣＯ：１２，０００－１４，０００）に入れ、ＰＢＳ（－）中で４℃、２時間以上透析を行うことでバッファー交換とアルコールの除去を行った。フルオレスカミンにより、透析後のＲＮＰ溶液のＣａｓ９タンパク質濃度を定量した後、当該ＲＮＰ溶液を、標的配列を含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（配列番号４、０．２５ｐｍｏｌ）に、Ｃａｓ９タンパク質量換算で２又は５当量（モル比）となるように混合し、３７℃で１時間反応させた。反応後の反応溶液をアガロース電気泳動し、ＤＮＡ切断効率を評価した。ＲＮＰを混合していないｄｓＤＮＡをネガティブコントロールとし、マイクロ流路内に通していないＲＮＰをｄｓＤＮＡに加えたサンプルをポジティブコントロールとした。各サンプルについて、ポジティブコントロールの内、標的ｄｓＤＮＡに対して５当量のＲＮＰを加えたサンプルにおける切断活性を１とした時の相対的な切断活性を算出した。定量的な解析には画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊを用いた。
　ＲＮＰ溶液をｐＨ６．０の緩衝液で調製し、ＦＲＲは９．０とし、ＴＦＲを５０～５００μＬ／分の範囲として実験を行い、ＴＦＲの影響を調べた。結果を表１に示す。表中、「Ｎ．Ｃ．」はネガティブコントロールの結果を、「Ｐ．Ｃ．」はポジティブコントロールの結果を、それぞれ示す。表１に示すように、いずれの総流速においてもポジティブコントロールと同程度の切断活性を有しており、総流速によるＤＮＡ切断活性への影響は認められなかったため、以降の実験では、より混合速度の大きい５００μＬ／分を採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ＲＮＰ溶液をｐＨ６．０の緩衝液で調製し、ＴＦＲは５００μＬ／分とし、ＦＲＲを３．０～９．０の範囲として実験を行い、ＦＲＲの影響を調べた。結果を表２に示す。表２に示すように、ＦＲＲが５．０以下の範囲において、ＦＲＲの低下に伴ってＤＮＡ切断活性の低下が認められた。一方、ＦＲＲが７．０以上の範囲では、ポジティブコントロールと同程度の活性を示し、マイクロ流路への送液の影響は認められなかった。この結果から、以降の実験では、ＦＦＲは９．０を採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ＴＦＲは５００μＬ／分とし、ＦＲＲを９．０とし、ＲＮＰ溶液を調製する緩衝液のｐＨを４．０～６．０の範囲として実験を行い、ＲＮＰ溶液のｐＨの影響を調べた。結果を表３に示す。表３に示すように、ｐＨ６．０ではポジティブコントロールと同程度のＤＮＡ切断活性を維持した一方で、ｐＨ５．５以下の範囲でｐＨの低下に伴ってＤＮＡ切断活性の著しい低下が認められた。この結果から、以降の実験では、ＲＮＰ溶液の調製には、ｐＨ６．０の緩衝液を採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［参考例２］
　本発明に係る脂質ナノ粒子を、カオティックミキサーを搭載した製造装置を使用して製造可能かどうかを調べた。具体的には、ＲＮＰを溶解する緩衝液のｐＨ、エタノールに対するＲＮＰ溶液の流速比（ＦＲＲ）、及びエタノールとＲＮＰ溶液の総流速（ＴＦＲ）を検討した。脂質ナノ粒子の製造は、参考例１で使用した製造装置のうち、ミキサー内蔵マイクロ流路１０４が図３に記載のカオティックミキサー内蔵マイクロ流路１０７である製造装置を用いて行った。図３（Ａ）はカオティックミキサー内蔵マイクロ流路（流路構造体）の斜視図であり、図３（Ｂ）は希釈流路１０７ｃの一部の拡大図である。
　この条件検討においては、参考例１と同様に、脂質による影響を除外するため、脂質溶液に代えて、エタノールを用い、ＲＮＰ溶液として、化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９タンパク質（１６０ｋＤａ）と、ＧＦＰ遺伝子中の標的配列（配列番号１、２０塩基長）と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ（配列番号２、３６塩基長）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号３、６７塩基長）とを、モル比１：１：１となるように緩衝液に溶解させた溶液（ＲＮＰ溶液）を用いた。ｐＨ６～６．６の緩衝液はＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を用い、ｐＨ５．５の緩衝液はクエン酸緩衝液（２０ｍＭ　クエン酸、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いた。
　ＲＮＰ溶液とエタノールを図３に記載の製造装置のマイクロ流路内に、ＴＦＲが５００μＬ／分、ＦＲＲが９の条件で送液し、希釈流路より排出されたＲＮＰ溶液を回収し、参考例１と同様にして透析した。透析後のＲＮＰ溶液を、参考例１と同様にして、ｄｓＤＮＡにＣａｓ９タンパク質量換算で５当量（モル比）となるように混合し、３７℃で１時間反応させ、ＤＮＡ切断効率を評価した。各サンプルについて、標的ｄｓＤＮＡに対して５当量のＲＮＰを加えたポジティブコントロールの切断活性を１とした時の相対的な切断活性を算出した。結果を表４に示す。参考例１と同様に、ｐＨ６．０ではポジティブコントロールと同程度のＤＮＡ切断活性を維持した一方で、ｐＨ５．５ではＤＮＡ切断活性の著しい低下が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ＲＮＰ溶液をｐＨ６．０の緩衝液で調製し、ＴＦＲは５００μＬ／分とし、ＦＲＲを５．０、７．０、又は９．０として同様の実験を行い、ＦＲＲの影響を調べた。結果を表５に示す。ＦＲＲが５．０ではＤＮＡ切断活性はやや低かったのに対して、ＦＲＲが７．０以上の範囲では、ポジティブコントロールと同程度の活性を示し、マイクロ流路への送液の影響は認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　これらの結果から、本発明に係る脂質ナノ粒子は、図３に記載の製造装置を用いた場合でも、図２に記載の製造装置を用いた場合と同様の条件で、脂質ナノ粒子を製造できることが明らかとなった。すなわち、本発明に係る脂質ナノ粒子の製造において、ミキサーの構造選択性は低いことが示唆された。
［実施例１］
　ＧＦＰ遺伝子のノックアウトを行うためのＲＮＰを搭載した、脂質組成の異なる脂質ナノ粒子を製造し、ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対するＧＦＰノックアウト活性を調べた。また、ＧＦＰ遺伝子をＢＦＰ（blue fluorescent protein）遺伝子へ改変するノックインを行うためのＲＮＰを搭載した、脂質組成の異なる脂質ナノ粒子を製造し、ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に対するＧＦＰノックイン活性を調べた。脂質ナノ粒子の製造は、参考例１で使用した製造装置を用いて行った。
　脂質ナノ粒子の構成脂質として、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ４Ｈ６（pKa ～6.25、特許文献２）を、中性リン脂質として1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を、その他の脂質としてコレステロール（ｃｈｏｌ）及び1,2-ジミリストイル-rac-グリセロ-3-メトキシポリエチレングリコール-2000（ＰＥＧ－ＤＭＧ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　脂質ナノ粒子の製造には、表６に記載の５種類の脂質組成の脂質成分を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは参考例１で使用したものと同じものを用いた。
　ＧＦＰのノックアウトを行うためのＲＮＰを製造する際には、ＧＦＰノックアウト用のｓｓＯＮとして、標的配列（配列番号１）を含むゲノムＤＮＡの部分領域と同一の塩基配列からなる１３２塩基長のＤＮＡ（配列番号５、６８～８７番目の領域が標的配列と同一の塩基配列である。）を用いた。
　ＧＦＰからＢＦＰへ改変するノックインを行うためのＲＮＰを製造する際には、ＢＦＰノックイン用のｓｓＯＮとして、ノックアウト用に用いたｓｓＯＮの３塩基（６５、６７、及び７２番目の塩基）に変異を導入したＤＮＡ（配列番号６）を用いた。変異配列の導入により、ホモロジー依存的修復（homology-dependent repair；ＨＤＲ）経路が機能すると、ＧＦＰの蛍光団を構成するアミノ酸（スレオニン－チロシン－グリシン）がＢＦＰの蛍光団を構成するアミノ酸（セリン－ヒスチジン－グリシン）に置換される。
＜ＧＦＰノックアウト活性の測定＞
　１６０ｎＭのＣａｓ９タンパク質、１６０ｎＭのｃｒＲＮＡ、１６０ｎＭのｔｒａｃｒＲＮＡ、及び１６０ｎＭのｓｓＯＮを、参考例１で使用したｐＨ６．０の緩衝液に溶解させてＲＮＰ溶液を調製し、第２導入路の注入口１０４ｂに連結したシリンジ１０２に充填した。また、脂質のエタノール溶液（総脂質：８．２０ｍＭ）を第１導入路の注入口１０４ａに連結したシリンジ１０１に充填した。ＦＲＲが９．０、ＴＦＲが５００μＬ／分の送液条件でマイクロ流路内に送液し、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を製造した。製造されたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、参考例１と同様にして透析した後、粒子計測機「zetasizer nano ZS ZEN3600」（Marvern製）を用いて、動的光散乱法により、個数平均粒子径（ｎｍ）、多分散度指数（polydispersity index；ＰｄＩ）及びζ電位（ｍＶ）を測定した（ｎ＝３、Ｍｅａｎ±ＳＤ）。また、ｇＲＮＡ及びｓｓＯＮの脂質ナノ粒子への封入率（％）及び脂質ナノ粒子溶液中濃度を、Ribogreen assay（Thermo Fisher Scientific社製）により測定した（ｎ＝３、Ｍｅａｎ±ＳＤ）。ｇＲＮＡ及びｓｓＯＮの脂質ナノ粒子溶液中濃度の測定値から、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の製造に使用したｇＲＮＡ及びｓｓＯＮの総量に対する、図３に記載の装置による希釈及び透析による精製後に回収された核酸総量の割合（回収率：％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　測定結果を表７に示す。ＤＯＰＥ含有量が２０％の組成の脂質ナノ粒子において、粒子径が小さく、封入率が高い傾向が認められた。
　各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．３、１、又は５ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに１日後に細胞を回収して、フローサイトメトリーによりＧＦＰノックアウト効率（％）（細胞全体に占める、ＧＦＰ蛍光を発していない細胞の割合（％））を測定した。比較対象として、ＲＮＰの導入に使用実績のある市販のトランスフェクション試薬「Lipofectamine RNAiMAX」（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。
　各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子のＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果（ｎ＝３、Ｍｅａｎ±ＳＤ）を図４に示す。中性リン脂質含有量が多いほど、より高いノックアウト活性を示した。また、中性リン脂質としてＤＯＰＥを含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子のほうが、ＤＳＰＣを含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子よりも、より高いノックアウト活性を示した。また、中性リン脂質含有量が多い又は中性リン脂質としてＤＯＰＥを含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子は、「Lipofectamine RNAiMAX」よりも高いノックアウト活性を示した。
＜ＧＦＰノックイン活性の測定＞
　ＧＦＰノックアウト用のｓｓＯＮに代えて、ノックイン用ｓｓＯＮを用い、さらに脂質組成をＤＳＰＣ含有量が２０％（表６中、「20% (DSPC)」）又はＤＯＰＥ含有量が２０％（表６中、「20% (DOPE)」）とした以外は同様にして、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を製造した。各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．３、１、又は５ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに１日後に細胞を回収して、フローサイトメトリーによりノックイン効率（％）（細胞全体に占める、ＢＦＰ蛍光を発している細胞の割合（％））を測定した。ＢＦＰはＧＦＰよりも蛍光波長が短波長側であるため、ノックインによりＧＦＰ遺伝子がＢＦＰ遺伝子に改変された細胞は、フローサイトメトリーにより定量的に識別可能である。各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子について、ノックアウト効率（％）に対するノックイン効率（％）の比（［ＫＩ（％）］／［ＫＯ（％）］）を求めた結果を図５に示す。この結果、変異を導入したｓｓＯＮを用いた場合、いずれのＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子でも４～５％の遺伝子ノックイン効率を示した。
［実施例２］
　脂質ナノ粒子の製剤処方が遺伝子ノックアウト活性に及ぼす影響を調べた。
＜一次スクリーニング＞
　検討項目として、ｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ）含有量（３０、４０、５０ｍｏｌ％）、中性リン脂質（ＰＬ）含有量（２０、３５、５０ｍｏｌ％）、ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量（１、２．５、４ｍｏｌ％）、ｐＨ感受性カチオン性脂質の種類（ＣＬ４Ｈ６又はＣＬ１５Ｈ６（pKa ～7.25、特許文献２））、中性リン脂質の種類（ＤＳＰＣ又はＤＯＰＥ）、並びにＲＮＰ／ｌｉｐｉｄ比（１．８、２．７、３．６×１０－４ｍｏｌ）の６因子とした。
　連続変数については３水準、カテゴリカル因子については２水準を選出し、全組み合わせ３２４通りの内、実験計画法（Design of Experiment；ＤｏＥ）の一つである決定的スクリーニング計画により、表８に記載の１４通りの処方を選抜した。脂質組成は、ｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ）：中性リン脂質（ＰＬ）：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ＝Ｘ：Ｙ：（１００－Ｘ－Ｙ）：Ｚ（ｍｏｌ％）（Ｘ：表８中の「ＣＬ［％］」欄の数値、Ｙ：表８中の「ＰＬ［％］」欄の数値）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　脂質成分と脂質とＲＮＰの比率を表８の処方とした以外は、実施例１におけるＧＦＰノックアウト用ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子と同様にして、ＧＦＰノックアウト用のＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を製造した。得られたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ｇＲＮＡ及びｓｓＯＮの脂質ナノ粒子への封入率（％）を、実施例１と同様にして測定した。
　また、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．１、０．５、又は２ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに３日後に細胞を回収して、実施例１と同様にしてフローサイトメトリーによりＧＦＰノックアウト効率（％）を測定した。結果を表９に示す。また、図６に、ＧＦＰノックアウト効率（％）の測定結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　個数平均粒子径に関して統計解析を行った。個数平均粒子径に有意に影響を与える主効果及び２因子間交互作用の結果を表１０に、個数平均粒子径に有意に影響を与える因子を変化させた際の個数平均粒子径の予測プロファイルを図７に、それぞれ示す。ｐＨ感受性カチオン性脂質含有量、ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量、ｐＨ感受性カチオン性脂質の種類、及び中性リン脂質が、粒子径に有意に影響を与える因子として検出された。より詳細には、ｐＨ感受性カチオン性脂質含有量を増加させたり、ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量を２．５ｍｏｌ％近傍としたり、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ４Ｈ６を使用したり、中性リン脂質としてＤＯＰＥを使用したりすることで、粒子径を小さく制御できることが明らかとなった。特にＰＥＧ脂質量及び中性リン脂質の種類の影響が大きい因子であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　封入率について同様に統計解析を行った。封入率に有意に影響を与える主効果及び２因子間交互作用の結果を表１１に、封入率に有意に影響を与える因子を変化させた際の封入率の予測プロファイルを図８に、それぞれ示す。この結果、全ての因子が封入率に有意に影響を与えることが明らかとなった。より詳細には、ｐＨ感受性カチオン性脂質含有量を増加させる、中性リン脂質含有量を増加させる、ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量を減少させる、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ１５Ｈ６を用いる、中性リン脂質としてＤＯＰＥを用いる、さらに、ＲＮＰ／ｌｉｐｉｄ比を下げることによって、封入率が向上することが明らかとなった。中性リン脂質の種類が、最も大きな影響を与える因子であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　遺伝子ノックアウト活性（％）について同様に統計解析を行った。遺伝子ノックアウト活性（％）に有意に影響を与える主効果及び２因子間交互作用の結果を表１２に、遺伝子ノックアウト活性（％）に有意に影響を与える因子を変化させた際の遺伝子ノックアウト活性（％）の予測プロファイルを図９に、それぞれ示す。ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量、ｐＨ感受性カチオン性脂質の種類、及び中性リン脂質の種類が、ノックアウト活性に有意な影響を及ぼす因子として同定された。より詳細には、ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量を１ｍｏｌ％程度にする、ｐＨ感受性カチオン性脂質をＣＬ４Ｈ６にする、中性リン脂質をＤＯＰＥとすることによって、遺伝子ノックアウト活性が向上することが明らかとなった。特にカチオン性脂質の種類及び中性リン脂質の種類が、影響の大きい因子であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　実際に、遺伝子ノックアウト活性を向上させる条件を満たした処方であるＡ－７及びＡ－１１の処方では、他の脂質ナノ粒子と比較して高いノックアウト活性を示し（図６）、ＲＮＰのＩＣ５０（５０％抑制濃度）は０．１ｎＭ以下（Ｃａｓ９タンパク質濃度換算）であった。また、最大ノックアウト効率は９５％以上に達した（図６）。
＜二次スクリーニング＞
　一次スクローニングの結果を受けて、二次スクリーニングを行った。実験系は、一次スクリーニングと同様の実験系で評価した。
　検討項目として、ｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ）含有量（３０、４０、５０ｍｏｌ％）、中性リン脂質（ＰＬ）含有量（２０、３５、５０ｍｏｌ％）、及びＰＥＧ－ＤＭＧ含有量（１．０、２．０、３．０ｍｏｌ％）の３因子３水準とし、全組み合わせ２７通りの内、決定的スクリーニング計画により、表１３に記載の９通りの処方を選抜した。脂質組成は、ｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ）：中性リン脂質（ＰＬ）：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ＝Ｘ：Ｙ：（１００－Ｘ－Ｙ）：Ｚ（ｍｏｌ％）（Ｘ：表１３中の「ＣＬ［％］」欄の数値、Ｙ：表１３中の「ＰＬ［％］」欄の数値）とした。ｐＨ感受性カチオン性脂質はＣＬ４Ｈ６を、中性リン脂質はＤＯＰＥを、それぞれ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　脂質成分と脂質とＲＮＰの比率を表１３の処方とした以外は、一次スクリーニングと同様にして、ＧＦＰノックアウト用のＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を製造し、得られたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ｇＲＮＡ及びｓｓＯＮの脂質ナノ粒子への封入率（％）を測定した。さらに、一次スクリーニングと同様にして、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に添加し、ＧＦＰノックアウト効率（％）を測定した。結果を表１３に示す。
　個数平均粒子径に関して統計解析を行った。個数平均粒子径に有意に影響を与える主効果の結果を表１４に、個数平均粒子径に有意に影響を与える因子を変化させた際の個数平均粒子径の予測プロファイルを図１０に、それぞれ示す。ＰＥＧ脂質量を増加させることによって、粒子径を小さく制御できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　封入率について同様に統計解析を行った。封入率に有意に影響を与える主効果の結果を表１５に、封入率に有意に影響を与える因子を変化させた際の封入率の予測プロファイルを図１１に、それぞれ示す。この結果、ｐＨ感受性カチオン性脂質含有量を増加させる、中性リン脂質含有量を増加させる、又はＰＥＧ－ＤＭＧ含有量を減少させることによって、封入率が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　遺伝子ノックアウト活性（％）について同様に統計解析を行った。遺伝子ノックアウト活性（％）に有意に影響を与える主効果の結果を表１６に、遺伝子ノックアウト活性（％）に有意に影響を与える因子を変化させた際の遺伝子ノックアウト活性（％）の予測プロファイルを図１２に、それぞれ示す。ＰＥＧ－ＤＭＧ含有量を減少させる、又はｐＨ感受性カチオン性脂質含有量を４０ｍｏｌ％以上に増加させることによって、遺伝子ノックアウト活性が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　これらの結果から、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ４Ｈ６を用い、かつその含有量を４０～５０ｍｏｌ％とし、中性リン脂質としてＤＯＰＥを用い、かつその含有量を２０～５０ｍｏｌ％とし、ＰＥＧ脂質量を１．５～２．０ｍｏｌ％とし、ＲＮＰ／ｌｉｐｉｄ比を３．６×１０－４ｍｏｌ以上とすることによって、個数平均粒子径が小さく、ＲＮＰの封入効率が高く、遺伝子ノックアウト活性（％）も高い良好なＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子が得られることがわかった。
［実施例３］
　実施例２で製造したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４及びＢ－９について、細胞毒性や保存安定性を調べた。
＜細胞毒性の評価＞
　各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．３、０．５、又は１ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から１日後に、ＷＳＴ－８アッセイを行った。ＷＳＴ－８アッセイは、細胞数測定用キット（製品名：「Cell Counting Kit-8」、同仁化学社製）を用いて行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子に代えてＰＢＳ（－）をＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に添加した細胞をコントロールとして、同様にＷＳＴ－８アッセイを行った。
　各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加した細胞の細胞生存率（［ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加した細胞のＷＳＴ－８アッセイの測定値］／［コントロール細胞のＷＳＴ－８アッセイの測定値］×１００：％）を算出した。結果を図１３に示す。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の量にかかわらず、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４及びＢ－９を導入させた細胞の細胞生存率はほぼ１００％であった。すなわち、これらのＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子は、ＨｅＬａ細胞においては、顕著な細胞毒性を示さなかった。
＜保存安定性の評価＞
　実施例２と同様にして製造したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を、４℃で保存し、保存後の物性とノックアウト活性を調べた。具体的には、経時的にゼータ電位とＰｄＩを測定した。また、４℃保存前と４℃で２週間保存した後のＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．３ｎＭとなるように培地に添加することによってＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に導入し、ＧＦＰノックアウト活性を調べた。ゼータ電位、ＰｄＩ、及びＧＦＰノックアウト活性は、実施例１と同様にして測定した。
　ゼータ電位とＰｄＩの測定結果を図１４に、ＧＦＰノックアウト活性の測定結果を図１５に、それぞれ示す。この結果、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９は、４℃で保存することにより、製造後少なくとも２週間は物性とノックアウト活性の両方が、保存前と同程度の状態が維持されていた。これらの結果から、本発明に係るＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子が実用上十分な保存安定性を有していることが確認された。
［実施例４］
　ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子に搭載するｓｓＯＮの塩基長が、ノックアウト活性に与える影響を調べた。
　ＧＦＰノックアウト用のｓｓＯＮとして、実施例２でも用いた１３２塩基長のＤＮＡ（配列番号５）、２０塩基長のＤＮＡ（配列番号５の６８～８７番目の領域と同一の塩基配列）、６０塩基長のＤＮＡ（配列番号５の４８～１０７番目の領域と同一の塩基配列）、又は６０塩基長のＤＮＡをＲＮＡとしたもの（配列番号７）を用いた。
　まず、ｓｓＯＮとして、１３２塩基長のＤＮＡ、２０塩基長のＤＮＡ、６０塩基長のＤＮＡ、又は６０塩基長のＲＮＡを用いた以外は実施例２と同様にしてＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９及びＢ－４を製造した。次いで、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．１ｎＭ又は０．３ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに３日間培養した後に細胞を回収して、フローサイトメトリーによりＧＦＰノックアウト効率（％）（細胞全体に占める、ＧＦＰ蛍光を発していない細胞の割合（％））を測定した。Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．１ｎＭとなるようにＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入した細胞の結果を図１６Ａに、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．３ｎＭとなるようにＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入した細胞の結果を図１６Ｂに、それぞれ示す。
　この結果、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４及びＢ－９のいずれにおいても、ｓｓＯＮの塩基長が長くなるほど、遺伝子ノックアウト活性が増大する傾向が観察された。また、同じ塩基長の場合、ｓｓＯＮがＤＮＡの場合よりもＲＮＡのほうが、ノックアウト活性が高い傾向も観察された。
［実施例５］
　Ｃａｓ９に代えて、ＲＮＡ依存性ＤＮＡヌクレアーゼＣｐｆ１を搭載した脂質ナノ粒子を製造し、その遺伝子ノックアウト活性を調べた。
　まず、Ｃａｓ９タンパク質に代えて、Ｃｐｆ１タンパク質（製品名：「Alt-R A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra」、Integrated DNA technologies社製）を用い、ｇＲＮＡとして、参考例１で用いたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡに代えて、４１塩基長のＲＮＡ（配列番号８）又は１００塩基長のＲＮＡ（配列番号９）を用い、ｓｓＯＮとして、１２０塩基長のＲＮＡ（配列番号１０）又は６０塩基長のＲＮＡ（配列番号１０の２７～８６番目の領域と同一の塩基配列。配列番号１１）を用いた以外は、実施例２と同様にして、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を製造した。次いで、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃｐｆ１タンパク質濃度が０．５、１、又は２ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに３日間培養した後に細胞を回収して、フローサイトメトリーによりＧＦＰノックアウト効率（％）（細胞全体に占める、ＧＦＰ蛍光を発していない細胞の割合（％））を測定した。
　ＧＦＰノックアウト効率の測定結果を図１７に示す。図中、「ＮＴ」はＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加しない培地で培養した細胞の結果を示す。「ｇＧＦＰ」は、４１塩基長のＲＮＡ（配列番号８）を用いたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加しない培地で培養した細胞の結果、「ｇＧＦＰ＋５９」は、１００塩基長のＲＮＡ（配列番号９）を用いたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加しない培地で培養した細胞の結果を、それぞれ示す。「ｓｓＯＮ」欄中、「－」は、ｓｓＯＮを含まないＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を添加しない培地で培養した細胞の結果を示す。また、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭの各カラムは、それぞれ、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子をＣｐｆ１タンパク質濃度が０．５、１、又は２ｎＭとなるように培地に添加した細胞の結果を示す。
　図１７に示すように、Ｃａｓ９タンパク質を用いた場合と同様に、ＲＮＰにｓｓＯＮを加えることにより、ＧＦＰノックアウト活性が改善された。また、添加するｓｓＯＮの塩基長が長いほど、ノックアウト活性が増大する傾向が観察された。これらの結果から、本発明に係る脂質ナノ粒子は、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９システムのみならずＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃｐｆ１システムにおけるＲＮＰを導入するキャリアとして有用であることが明らかである。
［実施例６］
　Ｃａｓ９によるオフターゲット効果（標的としないｇＲＮＡ領域への変異導入）を減少させる手法として、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性の一方を不活化したＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）を２対組み合わせて使用するダブルニッキング法が知られている。このダブルニッキング法に使用するＲＮＰを搭載した脂質ナノ粒子を製造し、その遺伝子ノックアウト活性を調べた。
　まず、Ｃａｓ９タンパク質に代えて、Ｃａｓ９ｎタンパク質（製品名：「Alt-R S.p. Cas9 D10A Nickase V3」、Integrated DNA technologies社製）を用い、ｇＲＮＡとして、参考例１で使用したｔｒａｃｒＲＮＡと、ＧＦＰ遺伝子中の第１の標的配列と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ（配列番号１２、３６塩基長）と第２の標的配列と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ（配列番号１３、３６塩基長）を用い、ｓｓＯＮを使用しなかったこと以外は、実施例２と同様にして、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を製造した。比較対象として、実施例２と同様にして、Ｃａｓ９タンパク質を含むＲＮＰを搭載したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を製造した。
　次いで、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９ｎタンパク質又はＣａｓ９タンパク質の濃度が０．１、０．３、１、又は２ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに３日間培養した後に細胞を回収して、フローサイトメトリーによりＧＦＰノックアウト効率（％）（細胞全体に占める、ＧＦＰ蛍光を発していない細胞の割合（％））を測定した。
　測定結果を、図１８に示す。Ｃａｓ９ｎタンパク質を搭載したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子も、Ｃａｓ９タンパク質を搭載したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子と同様に高いＧＦＰノックアウト活性があった。特に、Ｃａｓ９ｎタンパク質濃度が２ｎＭとなるように添加した細胞では、ＧＦＰノックアウト効率は９８％であった。この結果から、本発明に係る特定の脂質組成の脂質ナノ粒子は、Ｃａｓ９ｎタンパク質を用いたダブルニッキング法におけるＲＮＰを導入するキャリアとして有用であることが明らかであり、このダブルニッキング法におけるＲＮＰに、さらに、それぞれのｇＲＮＡとハイブリダイズするｓｓＯＮを含有させたＲＮＰも、ダブルニッキング法におけるＲＮＰを導入するキャリアとしても有用であることが示唆された。
［実施例７］
　実施例２で製造したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４及びＢ－９について、ＧＦＰ安定発現ＨＥＫ（ＨＥＫ－ＧＦＰ）細胞に導入して、ノックアウト活性、ノックイン活性、及び細胞毒性を調べた。
＜ＧＦＰノックアウト活性の測定＞
　まず、実施例２と同様にして、ＧＦＰノックアウト用のｓｓＯＮを含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９及びＢ－４を製造した。次いで、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨＥＫ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．５、１、３、又は５ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から３日後に培地交換した後、さらに３日後に細胞を回収して、フローサイトメトリーにより、ノックアウト効率（％）（細胞全体に占める、ＧＦＰ蛍光を発していない細胞の割合（％））を測定した。測定結果を図１９Ａに示す。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９及びＢ－４のどちらを導入した細胞でも、最大で約９７％のノックアウト効率であった。
＜ＧＦＰノックイン活性の測定＞　
　まず、ＧＦＰノックアウト用のｓｓＯＮに代えて、実施例１で使用したＧＦＰノックイン用のｓｓＯＮを用いた以外は実施例２と同様にして、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９及びＢ－４を製造した。次いで、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前記のＧＦＰノックアウト活性の測定と同様にＨＥＫ－ＧＦＰ細胞に導入して培養した後、回収してフローサイトメトリーを行い、ノックイン効率（％）（細胞全体に占める、ＢＦＰ蛍光を発している細胞の割合（％））を測定した。測定結果を図１９Ｂに示す。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９及びＢ－４のどちらを導入した細胞でも、最大で約２３％のノックイン効率であった。
＜細胞毒性＞
　各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨＥＫ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．５、１、２、３、４、又は５ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から１日後に、実施例３と同様にしてＷＳＴ－８アッセイを行い、細胞生存率（％）を測定した。結果を図２０に示す。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の量にかかわらず、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－４及びＢ－９を導入させた細胞の細胞生存率はほぼ１００％であった。すなわち、これらのＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子は、ＨＥＫ細胞においてもＨｅＬａ細胞と同様に、顕著な細胞毒性を示さなかった。
［実施例８］
　実施例２で製造したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９について、ＧＦＰを恒常発現している骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）に導入して、ＧＦＰノックアウト活性を調べた。
＜ＧＦＰ恒常発現ＢＭＤＭ＞
　ＧＦＰを恒常発現しているＢＭＤＭは、ＧＦＰ恒常発現マウス（C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウス）（雌、６週齢）から回収したものを用いた。具体的には、ＧＦＰ恒常発現マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、４０μｍセルストレーナーを通した後、可溶化バッファー（製品名：「ACK lysing buffer」、Gibco社製）を用いて赤血球を除去した。次いで、当該骨髄細胞を、recombinant mouse M-CSF（終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ、BioLegend社製）及び非働化ＦＢＳ（終濃度：１０％）を含む培地で7日間培養することによって、ＢＭＤＭを得た。
＜ＧＦＰノックアウト活性の測定＞
　まず、実施例２と同様にして、ＧＦＰノックアウト用のｓｓＯＮを含むＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を製造した。次いで、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、ＢＭＤＭを培養している培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が８ｎＭとなるように添加し、培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から１日後に培地交換した後、さらに２日後に細胞を回収して、フローサイトメトリーを行った。
　ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入する前のＢＭＤＭのフローサイトメトリーの結果を図２１（Ａ）に、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入した後のＢＭＤＭのフローサイトメトリーの結果を図２１（Ｂ）に、それぞれ示す。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子導入前のＢＭＤＭは、ほぼ全ての細胞がＧＦＰの蛍光を発していたが、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子導入後のＢＭＤＭでは、ＧＦＰ蛍光を発さない細胞の割合が増大していた。これらの結果から、本発明に係る脂質ナノ粒子は、生体から採取された細胞に対しても、ゲノム編集等に用いられるＲＮＰを導入するキャリアとして有用であることが明らかである。
［実施例９］
　参考例１等で使用された図２に記載されている製造装置のミキサー内蔵マイクロ流路１０４が、図１Ｂに示すような三つの導入路を有する流路１０７に置換された装置を用いて、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を製造し、物性とＧＦＰノックアウト活性を調べた。
＜ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９の製造＞
　図１Ｂと同様に、第１の導入路（図中、上方の導入路）から脂質のエタノール溶液を、第２の導入路（図中、下方の導入路）からＲＮＰ溶液を、第３の導入路（図中、中央の導入路）からＰＢＳ（－）を、それぞれのＦＲＲ（流速比：［脂質のエタノール溶液の流速（ｘ）］／［ＰＢＳ（－）をの流速（ｙ）］／［ＲＮＰ溶液の流速（ｚ）］）が表１７に記載の通りとなるように導入した以外は、実施例２と同様にして、ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９を製造した。なお、表１６中、ＦＲＲがｘ／ｙ／ｚ＝９／０／１の場合には、参考例１で用いた２つの導入路の製造装置を用いて製造した。
　得られたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、ｇＲＮＡ及びｓｓＯＮの脂質ナノ粒子への封入率（％）を、実施例１と同様にして測定した。測定結果を表１７に示す。この結果、３つの導入路を有する製造装置を用いた場合でも、２つの導入路を有する製造装置を用いた実施例２で得られたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子と同等以上の物性のＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を製造することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　製造後の製造装置を確認したところ、参考例１で用いた２つの導入路の製造装置を使用した場合には、希釈流路の入り口付近において、脂質のエタノール溶液とＲＮＰ溶液との界面上に凝集物が形成されていた。これに対して、３つの導入路を有する製造装置を用いて、中央の導入路からＰＢＳを導入して製造した場合には、希釈流路に凝集物は確認されなかった。
　得られたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、実施例４と同様にして、培地にＣａｓ９タンパク質濃度が０．１、０．３、又は１ｎＭとなるように添加してＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞に導入して、ＧＦＰノックアウト活性を調べた。結果を図２２に示す。いずれのＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子も、実施例２で得られたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子と同等以上のＧＦＰノックアウト活性を有していた。
　これらの結果から、図１Ｂに示すような３つの導入路を有するミキサー内蔵マイクロ流路を用いることにより、充分な物性と遺伝子ノックアウト活性を示すＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、ミキサー内蔵マイクロ流路内での凝集物の生成を回避して、安定的に製造できることが確認された。
［実施例１０］
　ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子の製造時のＲＮＰ溶液のｐＨが、製造されたＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子のノックアウト活性に与える影響を調べた。
　ＲＮＰ溶液を調製する際の緩衝液として、ｐＨ６．０又は６．３の緩衝液はＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０又は６．３）を用い、ｐＨ４．０、５．０、又は５．５の緩衝液はクエン酸緩衝液（２０ｍＭ　クエン酸、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ４．０、５．０、又は５．５）を用いた以外は、実施例２で製造したＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子Ｂ－９と同様にして、Ｃａｓ９タンパク質を含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を調製した。また、Ｃａｓ９タンパク質に代えて、実施例５で使用したＣｐｆ１タンパク質を用いた以外は同様にして、Ｃｐｆ１タンパク質を含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を調製した。
　次いで、各ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を、前日に播種したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞の培地に、Ｃａｓ９タンパク質濃度が０．１ｎＭ又は０．３ｎＭとなるように、又はＣｐｆ１タンパク質濃度が０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、又は２．０ｎＭとなるように、添加して培養を行った。ＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子添加から２日後に培地交換した後、さらに３日間培養した後に細胞を回収して、フローサイトメトリーによりＧＦＰノックアウト効率（％）（細胞全体に占める、ＧＦＰ蛍光を発していない細胞の割合（％））を測定した。Ｃａｓ９タンパク質を含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入した細胞の結果を図２３Ａに、Ｃｐｆ１タンパク質を含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子を導入した細胞の結果を図２３Ｂに、それぞれ示す。
　この結果、Ｃａｓ９タンパク質とＣｐｆ１タンパク質のいずれを含有するＲＮＰ搭載脂質ナノ粒子でも、調製時のｐＨが５．０以上の場合に、遺伝子ノックアウト活性が保持されていた。
１０…第１導入路、２０…第２導入路、３０　希釈流路、３１…合流点、４０…構造子、５０…屈曲した流路部位、６０…第３導入路、１０１、１０２…シリンジ、１０３…流量制御装置、１０４…ミキサー内蔵マイクロ流路、１０４ａ…第１導入路の注入口、１０４ｂ…第２導入路の注入口、１０４ｃ…希釈流路、１０４ｄ…希釈流路の注出口、１０５…チューブ、１０６…回収容器、１０７…カオティックミキサー内蔵マイクロ流路、１０７ａ…第１導入路の注入口、１０７ｂ…第２導入路の注入口、１０７ｃ…希釈流路、１０７ｄ…希釈流路の注出口。

Claims (10)

  1. 　脂質成分と、ＤＮＡヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含有し、
    　前記脂質成分が、下記一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式（Ｉ）中、ａは３～５の整数を示し；ｂは０又は１を示し；Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に下記一般式（Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（Ａ）中、ｑは１～９の整数を示し；ｒは０又は１を示し；ｓは１～３の整数を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１～８の整数を示し；ｃは０又は１を示し：ｖは４～１２の整数を示し；ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｃ＋ｖが１９以上の整数であるが、ｂとｃが同時に０となる場合には、ｑが３～５の整数であり、ｒ及びｔが１であり、ｓが１であり、かつｕ＋ｖが６～１０の整数である場合を除く）
    で表される基を示し；Ｘは、下記一般式（Ｂ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にＣ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基（該Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基に置換されていてもよい）を示すが、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環（該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を形成してもよい）
    で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基（ただし、該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、該環の１個又は２個の水素原子が、Ｃ１－４アルキル基又はＣ２－４アルケニル基に置換されていてもよい）を示す〕
    で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質と、中性リン脂質と、ポリアルキレングリコール修飾脂質と、を含有し、
    　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ｐＨ感受性カチオン性脂質の割合が３０～５０モル％であり、
    　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記中性リン脂質の割合が２０～５０モル％であり、
    　脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の割合が１～４モル％である、脂質ナノ粒子。
  2. 　前記中性リン脂質が、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を有する中性グリセロリン脂質である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
  3. 　前記中性リン脂質が、炭素数１２～２４の不飽和の脂肪酸残基を有するホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
  4. 　前記ｐＨ感受性カチオン性脂質が、ポリエチレングリコール修飾脂質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  5. 　前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、
    　前記ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  6. 　前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性とＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれか一方のみを有するタンパク質である、請求項５に記載の脂質ナノ粒子。
  7. 　前記ＤＮＡヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１タンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を細胞内へ導入する、ゲノム編集方法。
  9. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を、流路構造体を用いて製造する方法であって、
    　前記流路構造体が、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成しており、
    　前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
    　当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をｙ０とした場合に、Ｙ方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に、１／２ｙ０以上１ｙ０未満の一定高さｈ１、ｈ２...を有し、かつＸ方向に一定幅ｘ１、ｘ２...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔ｄ１、ｄ２...をもって少なくとも２つ以上設けられていることで形成されており、
    　前記第１導入路より前記脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液を、前記第２導入路より前記ＤＮＡヌクレアーゼと前記ガイドＲＮＡと前記一本鎖オリゴヌクレオチドとを含有するｐＨが５．０以上の水溶液を、総流量が１μＬ／分～１００ｍＬ／分であり、かつ前記脂質溶溶液の流速に対する前記水溶液の流速の比が７以上である、脂質ナノ粒子の製造方法。
  10. 　前記流路構造体が、さらに、第３の流動体を導入する第３導入路を有しており、
    　前記第１導入路から導入された第１の流動体が、前記第２導入路から導入された第２の流動体と合流する前に、前記第３導入路から導入された第３の流動体と接触するように、前記第１導入路と前記第２導入路と前記第３導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成している、請求項９に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
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