WO2020246380A1 - 癌治療剤 - Google Patents

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cancer
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浩文 山本
しん 呉
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Cancerstem Tech Inc
Osaka University NUC
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Definitions

  • the present invention relates to a cancer therapeutic agent. More specifically, the present invention relates to a cancer therapeutic agent that has an excellent antitumor effect and can also reduce the stem cell property of cancer stem cells.
  • MiRNA is a small RNA consisting of 18 to 24 nucleotides that is widely present in eukaryotes, and the existence of thousands of miRNAs has been clarified in humans. miRNAs are short RNAs that are endogenously expressed, first reported in 1993. RNA with a loop structure called pri-miRNA is transcribed from DNA. The loop is enzymatically cleaved to make a pre-miRNA. This pre-miRNA is transported to the outside of the nucleus, and a miRNA sequence of about 20 to 25 bases is excised by Dicer.
  • RNA-induced silencing complex RISC
  • Argonoute protein RNA-induced silencing complex
  • miRNA-RISC complex binds to the 3'UTR of mRNA for gene expression.
  • Suppress Since the binding between miRNA and mRNA is incomplete, the number of target genes is not limited to one, and it is an important feature that multiple genes can be targeted and regulated.
  • miRNAs play an important role in the regulation of gene expression in vivo, and it has been clarified that abnormalities in the control system of miRNAs are involved in the causes and progression of many diseases. In particular, various miRNAs that are related to the onset and progression of cancer have been elucidated, and are attracting attention as a leader in nucleic acid drugs for cancer treatment.
  • cancer cells have the characteristic of having self-proliferating ability and being able to invade surrounding tissues and metastasize to distant tissues.
  • cancer stem cells exhibit undifferentiated surface traits, have self-renewal ability and pluripotency, and have the property of producing all cancer cells at various stages of differentiation that make up cancer tissue. .. That is, it is considered that cancer stem cells are the source of producing a large number of cancer cells by differentiation while maintaining the same cells as themselves by self-renewal in cancer tissues. Therefore, it is considered that targeting the cancer stem cells themselves as a therapeutic target leads to the eradication of cancer.
  • KLF5 is a member of the KLF family, which is a zinc finger transcription factor.
  • KLF5 is strongly expressed in the crypts in the normal intestinal tract, it has been shown to be widely expressed in the cancerous region and promote the growth of cancer cells by enhancing Wnt / Catnb signaling (non-patented). Document 1). It has also been reported that tumors are not formed when Klf5 is deficient in Lgr5-positive cells and mice (Non-Patent Document 1).
  • KLF5 is a necessary element for canceration, and it has been suggested that it is related to cancer stem cells, but conventionally, no miRNA that can bind to KLF5 and is effective in treating cancer has been found. Further, as shown in Test Example 2, there are many miRNAs that can bind to KLF5 but do not show a growth inhibitory effect on cancer cells. Under such circumstances, an object of the present invention is to provide a nucleic acid drug for cancer treatment that enables effective treatment of cancer.
  • miR-4711-5p As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors not only bind miR-4711-5p to KLF5 mRNA involved in canceration, but also change the cell cycle from G1 phase to S phase. It was found that it also has the property of binding to TFDP1 mRNA, which is important for migration. Furthermore, it was confirmed that miR-4711-5p suppresses the expression of MDM2, which suppresses p53, which is important for cell apoptosis and cell cycle control. miR-4711-5p can suppress the expression of KLF5, TFDP1, and MEM2, which effectively suppresses the growth, infiltration, and migration of cancer cells, keeps the cells in the G1 phase, and also apoptotic cancer cells. It was found that it can induce. It was also found that miR-4711-5p has an effect of lowering the stem cell property of cancer stem cells and is effective in suppressing the growth of cancer stem cells. The present invention has been completed by further studies based on these findings.
  • Item 1 A cancer therapeutic agent containing miR-4711-5p as an active ingredient.
  • Item 2. Item 3. The cancer therapeutic agent according to Item 1, wherein miR-4711-5p is a mature miRNA, pri-miRNA, or pre-miRNA.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. A cancer stem cell growth inhibitor containing miR-4711-5p as an active ingredient.
  • Item 5. Use of miR-4711-5p for the manufacture of therapeutic agents for cancer.
  • Item 6. MiR-4711-5p, used in treatment for the treatment of cancer.
  • a method for treating cancer by administering a therapeutically effective amount of miR-4711-5p to a cancer patient.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention binds not only to KLF5 mRNA involved in cancer stem cells, but also to TFDP1 required to shift the cell cycle from G1 phase to S phase and MDM2 mRNA that suppresses p53. Therefore, it has an excellent antitumor effect, suppresses the growth, infiltration, and migration of cancer cells, and can effectively induce the apoptosis of cancer cells. Further, since the cancer therapeutic agent of the present invention can reduce the stem cell property of cancer stem cells, it is possible to suppress the growth of cancer stem cells, and it is extremely highly clinically useful as a nucleic acid drug for cancer treatment.
  • Proteins involved in the regulation of G1 / S phase checkpoints in miR-4711-5p-transfected colon cancer cell lines (DLD-1 and HCT116) (TFDP1, E2F1, Rb, CCNE, CDK2, p53, p21, It is a figure which shows the result of having measured the expression level of p27, CCND1, CDK2, CDK6, and MDM2) and ⁇ -actin (ACTB) at a protein level. It is a figure which shows the result of having confirmed the binding of miR-4711-5p and TFDP1 by the dual luciferase assay.
  • DLD-1 and HCT116 Proteins involved in the regulation of G1 / S phase checkpoints in miR-4711-5p-transfected colon cancer cell lines (DLD-1 and HCT116) (TFDP1, E2F1, Rb, CCNE, CDK2, p53, p21, It is a figure which shows the result of having measured the expression level of p27, CC
  • mouse subcutaneous solid tumor model (colorectal cancer cell line DLD-1), it is a figure which shows the result of observing each tissue excised from a mouse on the 14th day by staining with hematoxylin and eosin. It is a figure which shows the result of having measured the amount of miR-4711-5p in a tumor in a mouse subcutaneous solid tumor model (colorectal cancer cell line DLD-1). It is a figure which shows the result of having measured the mRNA amount of KLF5, TFDP1, MDM2, and ACTB in a mouse in a mouse subcutaneous solid tumor model (colorectal cancer cell line DLD-1).
  • the cancer therapeutic agent of the present invention is characterized by containing miR-4711-5p as an active ingredient.
  • miR-4711-5p as an active ingredient.
  • miR-4711-5p is used as an active ingredient.
  • miR-4711-5p is a human-derived miRNA, and its nucleotide sequence is 5'-UGCAUCAGGCCAGAAGACAUGAG-3'(SEQ ID NO: 1) if it is a mature miRNA (mature-miRNA).
  • miR-4711-5p used as an active ingredient may be a mature miRNA, or a hairpin-type precursor miRNA (pri-miRNA) or a part of pri-miRNA. It may be a cleaved pre-miRNA.
  • the pri-miRNA and pre-miRNA are processed intracellularly to become mature miRNAs.
  • each of the miRNAs may form a double-stranded precursor composed of RNA having a complementary base sequence. The double-stranded precursor releases the mature miRNA by breaking the double strand in the cancer cell.
  • a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be set to be generated as a mature miRNA, and such a base sequence may be obtained by a person skilled in the art. Can be set as appropriate for.
  • the miRNA used as an active ingredient may be subjected to various modifications generally applied to nucleic acids, if necessary, in order to impart degradation resistance to the enzyme.
  • modifications include modification of the sugar chain moiety such as 2'-O methylation; modification of the base moiety; modification of the phosphoric acid moiety such as amination, lower alkyl amination, and acetylation.
  • the cancer type to which the cancer therapeutic agent for cancer stem cells of the present invention is applied is not particularly limited, but for example, colon cancer, esophageal cancer, colon cancer, gastric cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, and the like.
  • Solid cancers such as bladder cancer, prostate cancer, cervical cancer, kidney cancer, brain tumor, head and neck cancer, bile duct cancer, bile sac cancer, oral cancer; and hematological cancers such as leukemia and malignant lymphoma.
  • solid cancer is preferable, and colon cancer is more preferable.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention can suppress the growth of cancer stem cells, an effective therapeutic effect can be observed even for cancers for which chemotherapy has not been effective. Therefore, the cancer of the cancer stem cells of the present invention
  • One aspect of the application target of the therapeutic agent is cancer for which chemotherapy has not been effective.
  • the method for administering the therapeutic agent for cancer of the present invention is not particularly limited as long as miR-4711-5p can be delivered to the tissue or cell of the cancer in vivo, and is, for example, intravascular (intravenous or intravenous) injection. , Continuous infusion, subcutaneous administration, local administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration and the like. Among these, intraarteriovenous administration is preferable.
  • the dose of the cancer therapeutic agent of the present invention is appropriately determined according to the type of cancer stem cells to be applied, the sex, age, symptoms, etc. of the patient, and therefore cannot be unconditionally determined.
  • miR -4711-5p of mature miRNA amount is about 1 to 100 mg / m 2 (body surface area) per day.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention exerts a cancer therapeutic effect by delivering miR-4711-5p into cancer stem cells and expressing its function. Therefore, the cancer therapeutic agent of the present invention contains miR-4711-5p in cancer cells. It is desirable that it is formulated with a miRNA-introducing agent so that it can be easily delivered to.
  • the miRNA-introducing agent is not particularly limited, and may be, for example, any of carbonate apatite particles, lipofectamine, oligofectamine, RNAifect and the like. Among these miRNA-introducing agents, carbonic acid apatite particles can be accumulated in cancer cells in vivo to efficiently transfer miR-4711-5p into cancer cells, and thus the cancer therapeutic agent of the present invention.
  • miR-4711-5p exists in a mixed state with carbonate apatite particles, or miR-4711-5p exists in a composite particle state in which miR-4711-5p is composited (encapsulated) with carbonate apatite particles. Can be mentioned.
  • Carbonated apatite has a structure in which some of the hydroxyl groups of hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) is replaced with CO 3 , and the general formula Ca 10-m X m (PO 4 ) 6 ( CO 3 ) A compound represented by 1-n Y n .
  • X is an element that can partially replace Ca in carbonate apatite, and examples thereof include Sr, Mn, and rare earth elements.
  • m is usually a positive number of 0 or more and 1 or less, preferably 0 or more and 0.1 or less, more preferably 0 or more and 0.01 or less, and further preferably 0 or more and 0.001 or less.
  • Y is a group or element capable of partially substituting CO 3 in carbonate apatite, and examples thereof include OH, F, and Cl.
  • n is usually a positive number of 0 or more and 0.1 or less, preferably 0 or more and 0.01 or less, more preferably 0 or more and 0.001 or less, and further preferably 0 or more and 0.0001 or less.
  • the average particle size of the carbonate apatite particles used in the present invention is not particularly limited as long as it is large enough to be administered in vivo and transferred into cells. Specifically, the average particle size of the carbonate apatite particles used in the present invention is usually more than 30 nm, preferably 30 to 3000 nm, more preferably 30 to 2000 nm, and particularly preferably 30 to 1500 nm.
  • the average particle size of the carbonate apatite is a value measured by dynamic light scattering particle measurement (DLS). If there are large particles (eg, particle size 5 ⁇ m or larger) that are not suitable for measurement using DLS, they are removed from the measurement range. Further, in the present specification, the particle size means the particle size of an independent particle that can be recognized as a separate particle when measured with a scanning probe microscope. Therefore, when a plurality of particles are agglomerated, the aggregate thereof is determined to be one particle.
  • DLS dynamic light scattering particle measurement
  • Carbonated apatite particles can be obtained according to a known method. For example, it can be obtained by preparing by coexisting calcium ion, phosphate ion and hydrogen carbonate ion in an aqueous solution.
  • concentration of each ion in the aqueous solution is not particularly limited as long as the carbonate apatite particles are formed, and can be appropriately set with reference to the following.
  • the calcium ion concentration in the aqueous solution is usually 0.1 to 1000 mM, preferably 0.5 to 100 mM, and more preferably 1 to 10 mM.
  • the phosphate ion concentration in the aqueous solution is usually 0.1 to 1000 mM, preferably 0.5 to 100 mM, and more preferably 1 to 10 mM.
  • the hydrogen carbonate ion concentration in the aqueous solution is usually 1.0 to 10000 mM, preferably 5 to 1000 mM, and more preferably 10 to 100 mM.
  • the source of calcium ion, phosphate ion and hydrogen carbonate ion is not particularly limited as long as these ions can be supplied into the aqueous solution, and examples thereof include water-soluble salts of these ions.
  • the CaCl 2 that can be used as a source of calcium ions NaH 2 PO 4 ⁇ 2H 2 O can be used as the phosphate ion source can be used NaHCO 3 as carbonate ion source.
  • the aqueous solution for preparing the carbonate apatite particles may contain components other than the above-mentioned ion sources and other substances as long as the carbonate apatite particles are formed.
  • Ca or CO 3 in carbonate apatite may be partially replaced by adding fluorine ions, chlorine ions, Sr, Mn, etc. to the above composition in an aqueous solution.
  • the amount of fluorine ion, chlorine ion, Sr, and Mn added is preferably within a range that does not significantly affect the pH solubility and particle size range of the complex particles to be formed.
  • water may be used as a base, but various media for cell culture, a buffer, or the like may be used.
  • the mixing order of each ion source and other substances in the aqueous solution is not particularly limited, and the aqueous solution is in any mixing order as long as the desired carbonate apatite particles can be obtained.
  • a first solution containing calcium ions and other substances is prepared, and a second solution containing phosphate ions and hydrogen carbonate ions is separately prepared, and the first solution and the second solution are prepared.
  • Carbonated apatite particles can be obtained by adjusting the pH of the aqueous solution containing each of the above ions to the range of 6.0 to 9.0 and leaving (incubating) for a certain period of time.
  • the pH of the aqueous solution for forming the carbonate apatite particles is, for example, 6.5 to 9.0, preferably 6.7 to 8.8, more preferably 6.7 to 8.6, still more preferably 6.8 to 8.5, particularly preferably 7.0 to 8.5, and most preferably.
  • the temperature condition of the aqueous solution when forming the carbonate apatite particles is not particularly limited as long as the carbonate apatite particles are formed, but is usually 0 ° C. or higher, and examples thereof include 4 ° C. or higher or 37 ° C.
  • the incubation time of the aqueous solution for forming the carbonate apatite particles is not particularly limited as long as the carbonate apatite particles are formed, but is usually 1 minute to 24 hours, preferably 5 minutes to 1 hour.
  • the presence or absence of particle formation can be confirmed, for example, by observing under a microscope.
  • the method for controlling the average particle size of the carbonate apatite particles within the above range is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding a dispersant during the production process of the carbonate apatite particles or after the production of the carbonate apatite particles.
  • the type of dispersant is not particularly limited as long as the carbonate apatite particles can be dispersed, and any dispersant generally added to a pharmaceutical product may be used, and albumin is an example.
  • the dispersant may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the dispersant in the aqueous solution containing the carbonate apatite particles is not particularly limited as long as the effects of miniaturization and / or suppression of reaggregation can be obtained, but for example, 0.1 to 500 mg / ml, preferably 1 to 100 mg / ml. , More preferably about 1 to 10 mg / ml; or about 0.001 to 10% by weight.
  • the particle size control method there is a method of ultrasonically vibrating the carbonate apatite particles formed in the above-mentioned aqueous solution.
  • the ultrasonic vibration treatment is a process in which an ultrasonic vibrator such as an ultrasonic crusher is brought into direct contact with a sample to apply ultrasonic waves; an ultrasonic wave equipped with an ultrasonic vibrator and a water tank (cleaning tank).
  • a liquid for example, water
  • a container for example, a plastic tube
  • carbonic acid apatite particles is floated therein, and an aqueous solution containing carbonate apatite particles is superposed through the liquid.
  • Examples include the process of applying ultrasonic waves.
  • the conditions of the ultrasonic vibration treatment are not particularly limited as long as the particle size can be controlled within a predetermined range.
  • aquarium temperature for example 5 to 45 ° C, preferably 10 to 35 ° C, more preferably 20 to 30 ° C.
  • High frequency output For example, 10 to 500 W, preferably 20 to 400 W, more preferably 30 to 300 W, and more preferably 40 to 100 W.
  • Oscillation frequency For example, 10 to 60 Hz, preferably 20 to 50 Hz, and more preferably 30 to 40 Hz.
  • Processing time For example, 30 seconds to 30 minutes, preferably 1 to 20 minutes, more preferably 3 to 10 minutes.
  • the type of container containing carbonic acid apatite particles used for ultrasonic vibration treatment is not limited as long as the particles can be refined within a predetermined particle size range, and depends on the volume of the aqueous solution and the purpose of use. Can be selected as appropriate. For example, a plastic tube having a capacity of 1 to 1000 ml can be used.
  • the ultrasonic vibration treatment is performed in the presence of a dispersant (that is, the dispersant is added to an aqueous solution containing carbonic acid apatite particles).
  • a dispersant that is, the dispersant is added to an aqueous solution containing carbonic acid apatite particles.
  • composite particles in which miR-4711-5p and carbonate apatite particles are composited are used.
  • miR-4711-5p is accumulated in cancer cells in vivo by the action of carbonated apatite, and miR-4711-5p is incorporated into cancer cells. It becomes possible to introduce it efficiently.
  • miR-4711-5p can be released from the carbonate apatite particles inside the cell after being introduced into the cell, the antitumor effect of miR-4711-5p can be efficiently exerted.
  • the composite particle of miR-4711-5p and carbonate apatite particles refers to a state in which miR-4711-5p is adsorbed and supported on the carbonate apatite particles by ionic bonds, hydrogen bonds, or the like.
  • the method for forming a composite particle of miR-4711-5p and carbonate apatite particles is not particularly limited, but for example, a method of forming miR-4711-5p and carbonate apatite particles by coexisting in an aqueous solution; By coexisting miR-4711-5p together with calcium ion, phosphate ion and hydrogen carbonate ion in the prepared aqueous solution, carbonic acid apatite particles are formed and miR-4711-5p and carbonate apatite particles are compounded at the same time.
  • the method and the like can be mentioned.
  • miR-4711-5p When the composite particles of miR-4711-5p and carbonate apatite particles are formed at the same time, the formation of carbonate apatite particles and the composite of miR-4711-5p and carbonate apatite particles are performed in the aqueous solution used for the preparation of carbonate apatite.
  • miR-4711-5p may be added so as to be, for example, 0.1 to 1000 nM, preferably 0.5 to 500 nM, and more preferably 1 to 200 nM.
  • the ratio of miR-4711-5p and carbonate apatite particles is not particularly limited, and may be appropriately set according to the dose of miR-4711-5p and the like.
  • the ratio of miR-4711-5p and carbonate apatite particles is not particularly limited, and may be appropriately set according to the dose of miR-4711-5p and the like.
  • 5 mg of miR-4711-5p is added to 2.5 L of the aqueous solution for preparing the carbonated apatite particles described above to obtain the carbonated apatite particles.
  • the formation and compounding of miR-4711-5p and carbonate apatite particles may be performed at the same time.
  • miR-4711-5p complexed with carbonic acid apatite particles when used, it is used in a state of being dispersed in a solvent suitable for administration to a living body.
  • carbonate apatite particles are obtained by dissolving various ion supply substances in a solvent such as water, a medium, or a buffer, and the carbonate apatite particle dispersion solution thus obtained is obtained. From the viewpoint of osmotic pressure, buffering capacity, sterility, etc., it is not always suitable for administration to a living body (intravascular administration).
  • the carbonate apatite particles are usually separated from the solvent by centrifuge and recovered.
  • An operation to replace the solvent is required.
  • the carbonic acid apatite particles aggregate with each other and the particles become enormous, so that the state is changed to a state unsuitable for administration to a living body.
  • the composite particles of miR-4711-5p and the carbonate apatite particles are transferred to the living body. It can be dispersed in a solvent suitable for administration with an appropriate particle size (average particle size in the above-mentioned range).
  • the administration of the cancer therapeutic agent of the present invention uses the composite particles of miR-4711-5p and carbonate apatite particles. It is desirable that the particles are dispersed in the state of fine particles by ultrasonic vibration treatment and then promptly performed before the particles aggregate. For example, administration within 1 minute, preferably within 30 seconds after the ultrasonic vibration treatment is preferable. However, as described above, when the aggregation of carbonic acid apatite particles is suppressed by adding albumin, it can be administered several minutes to several tens of minutes after the ultrasonic vibration treatment.
  • the present invention further contains miR-4711-5p as an active ingredient. Provided is an agent for suppressing the growth of cancer stem cells.
  • the cancer stem cell growth inhibitor of the present invention is a nucleic acid drug used for suppressing the growth of cancer stem cells, and the active ingredient to be used, the cancer type to be applied, the administration method, the formulation and the like are described above. This is the same as in the case of "1. Cancer therapeutic agent”.
  • Test Example 1 Extraction of candidate miRNAs Two databases, miRBase and Target Scan, were used to extract miRNAs that may bind to KLF5. Among the extracted miRNAs, those related to any of Wnt / ⁇ -catenin signal, Wnt / Ca + signal, and Notch signal were extracted. As a result, 29 types of miRNAs were extracted from miRBase, and 31 types of miRNAs were extracted from Target Scan. Since there were 16 types of miRNAs extracted by miRBase and those extracted by Target Scan that overlapped, a total of 44 types of miRNAs were extracted. Of the 44 types of miRNAs, 3 types of miRNAs had already been functionally analyzed, so 41 types of miRNAs were selected as candidates by excluding them.
  • Test Example 2 Screening of miRNA A growth test of a colorectal cancer cell line was performed using the 41 types of candidate miRNAs extracted above. Specifically, first, three colorectal cancer cell lines DLD-1, HCT116, and HT29 were seeded in each well of a 96-well plate so as to be 5000 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine. Transfection was performed using 2000 (Invitrogen) with candidate miRNAs or negative control miRNAs (NC, 5'-AUCCGCGCGAUAGUACGUA-3', SEQ ID NO: 2). 72 hours after transfection, cell viability (%) was measured by GloMax-Multi + Detection System (Promega) using cell counting kit-8 (Dojin Chemical Laboratory).
  • the No. 20 candidate miRNA is miR-4711-5p.
  • miR-4711-5p has an excellent effect of suppressing the growth of colorectal cancer cell lines.
  • Test Example 3 Analysis of the effect of miR-4711-5p on the expression level of KLF5 at the mRNA level
  • two colorectal cancer cell lines, DLD-1 and HCT116 were seeded in each well of a 6-well plate so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and after overnight culture, Lipofectamine 2000 ( Invitrogen) was used for transfection with miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2).
  • NC negative control miRNA
  • Test Example 4 Analysis of the effect of miR-4711-5p on the expression level of KLF5 at the protein level The effect of miR-4711-5p on the expression level of KLF5 at the protein level was analyzed. Specifically, two colorectal cancer cell lines, DLD-1 and HCT116, were seeded in each well of a 6-well plate so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and after overnight culture, Lipofectamine 2000 ( Invitrogen) was used for transfection with miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2). Cells were harvested 48 hours after transfection, all intracellular proteins were extracted, and the expression level of KLF5 at the protein level was measured by Western blotting.
  • DLD-1 and HCT116 two colorectal cancer cell lines, DLD-1 and HCT116, were seeded in each well of a 6-well plate so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and after overnight culture, Lipofectamine 2000
  • Test Example 5 Confirmation of binding of miR-4711-5p and KLF5
  • pmirGLO Analysis was performed using Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega).
  • binding site 1 KLF5 3'UTR position 1186-1208, 5'-AAUAGUAAUGUGAUGCUGAUGCU-3'(SEQ ID NO: 3)
  • miR are expected to be strongly bound by miR-4711-5p.
  • FBS fetal bovine serum
  • Test Example 6 Cell Proliferation Test Using miR-4711-5p, a cell proliferation test of a colorectal cancer cell line was performed. Specifically, first, two colorectal cancer cell lines, DLD-1 and HCT116, were seeded in each well of a 96-well plate so as to be 3.0 ⁇ 10 3 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine. 2000 (Invitrogen) was used to transfect miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2). At 24, 48, and 72 hours after transfection, cell viability was measured with the GloMax-Multi + Detection System (Promega) using a cell counting kit-8 (Dojin Chemical Laboratory).
  • Test Example 7 Infiltration assay Using miR-4711-5p, an infiltration assay for colorectal cancer cell lines was performed. Specifically, first, two colorectal cancer cell lines of DLD-1 and HCT116 were seeded in each well of a 6-well plate so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine. 2000 (Invitrogen) was used to transfect miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2). Twenty-four hours after transfection, cells were seeded in BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD biosciences) and cultured for 48 hours. Next, nuclear staining was performed with henatoxylin, and the number of infiltrated cells was counted.
  • BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers BD biosciences
  • Test Example 8 Evaluation of migration ability Using miR-4711-5p, the migration ability of colorectal cancer cell lines was evaluated by a wound healing assay. Specifically, first, an insert (ibidi Culture Insert 2 Well (ibidi)) is set in a 24-well plate, and two colon cancer cell lines, DLD-1 and HCT116, are placed in each well, 3.5 ⁇ 10 5 to 4.0 ⁇ , respectively. The seeds were sown at 10 5 cells / well and cultured for 24 hours. The inserts were then removed to create a wound and continued culturing, and the wound area was measured 24, 48 and 72 hours after the insert was removed.
  • an insert ibidi Culture Insert 2 Well (ibidi)
  • two colon cancer cell lines DLD-1 and HCT116
  • Test Example 9 Apoptosis Assay Using miR-4711-5p, an apoptosis assay for colorectal cancer cell lines was performed. Specifically, first, two colorectal cancer cell lines of DLD-1 and HCT116 were seeded in each well of a 6-well plate so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine. 2000 (Invitrogen) was used to transfect miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2).
  • NC negative control miRNA
  • FIG. 8 The results of measuring the proportion of cells stained with Annexin V (that is, cells undergoing apoptosis) are shown in FIG. 8, and the results of measuring the expression levels of p53, survivin, cPARP, cCaspase3, and ACBT are shown in FIG. Shown. As a result, it was found that in the colon cancer cell line transfected with miR-4711-5p, the number of cells stained with Annexin V increased, and apoptosis was strongly induced.
  • transfection with miR-4711-5p enhances the expression of p53, decreases the expression level of the anti-apoptotic protein survivalin, and cPARP, which is an apoptotic protein. And the expression level of cCaspase3 was increased.
  • DLD-1 which has a mutant p53
  • transfection with miR-4711-5p reduced the expression of survival and increased the expression level of cCaspase3. That is, from these results, it was clarified that transfection of miR-4711-5p induces apoptosis of colorectal cancer cell lines.
  • Test Example 10 Analysis of Stem Cell Marker Expression Level The effect of miR-4711-5p on the stem cell marker expression level of colorectal cancer cell lines was analyzed. Specifically, first, two colorectal cancer cell lines of DLD-1 and HCT116 were seeded in each well of a 6-well plate so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine. 2000 (Invitrogen) was used to transfect miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 10 shows the results of measuring the mRNA amounts of KLF5, CD44v9, LGR5, BMI1, and LRIG1
  • FIG. 11 shows the results of measuring the amount of CD44v9 on the surface of DLD-1 by FACS.
  • transfection of miR-4711-5p suppressed the expression of the stem cell markers CD44v9, LGR5, and BMI1 in DLD-1, and in HCT116, the stem cell markers CD44v9 and BMI1. The expression was suppressed.
  • transfection of miR-4711-5p reduced CD44v9 present on the cell surface of DLD-1. From the above results, the expression of stem cell markers is suppressed in colorectal cancer cell lines transfected with miR-4711-5p, and miR-4711-5p has the effect of reducing the stem cell nature of cancer stem cells. Became clear.
  • Test Example 11 Measurement of reactive oxygen species activity
  • DLD-1 was seeded on a 6-well plate so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and after culturing overnight, miR-4711-5p or miR-4711-5p or using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used.
  • Negative control miRNAs were transfected. Cells were harvested 24 hours after transfection, stained with CellROX Deep Red (thermos fisher scientific), and ROS activity was measured by FACS.
  • the results are shown in FIG.
  • the ROS activity shown in the right figure of FIG. 12 is the ratio of cells judged to have high ROS activity.
  • the high and low cut-off values were determined using cells not exposed to the Cell ROX reagent. As a result, it was confirmed that in the colorectal cancer cell lines transfected with miR-4711-5p, the proportion of cells with high ROS activity increased, and that miR-4711-5p decreased stem cell properties. ..
  • Test Example 12 Analysis of sphere-forming ability The effect of miR-4711-5p on the sphere-forming ability of colorectal cancer cell lines was analyzed. Specifically, first, two colorectal cancer cell lines of DLD-1 and HCT116 were seeded in each well of a 6-well plate so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine. 2000 (Invitrogen) was used to transfect miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2). Twenty-four hours after transfection, cells were harvested and seeded in 96-well ultra-low attachment plates (Corning Inc., USA) at 1 ⁇ 10 3 cells / well with the cells not agglutinating.
  • NC negative control miRNA
  • the cells were cultured for 1 week.
  • serum-free DMEM / F-12 medium containing EGF 20 ng / ml, bFGF 10 ng / ml, and penicillin G 100 ⁇ g / ml was used for the culture.
  • Test Example 13 IPA analysis Ingenuity Pathways Analysis (IPA) was performed on colorectal cancer cell lines transfected with miR-4711-5p using the results of next-generation sequencing. Specifically, first, DLD-1 was seeded in each well of a 6-well plate so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and after culturing overnight, miR-4711 was used using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). -5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2) was transfected. Cells were harvested 36 hours after transfection and total RNA was extracted with the miRNeasy Kit (Applied Biosystems). Next, a library was prepared using the obtained total RNA, and then the next-generation sequence analysis of the library was performed. Then, using the results of the next-generation sequence, Ingenuity Pathways Analysis was performed.
  • IPA Ingenuity Pathways Analysis
  • Test Example 14 Cell Cycle Assay The results of Test Example 13 suggest that miR-4711-5p suppresses the transition from G1 to S in the cell cycle, so miR-4711-5p is a colon cancer.
  • the effect of cell lines on the cell cycle was analyzed in detail. Specifically, first, DLD-1 was seeded in each well of a 6-well plate so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured overnight using D-MEM medium containing 10% FBS. The medium was then replaced with FBS-free D-MEM medium and cultured for 24 hours, followed by transfection of miR-4711-5p or negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). I was excited. Twenty-four hours after transfection, the medium was replaced with D-MEM medium containing 10% FBS. After culturing for 8 hours, cells were collected and subjected to cell cycle assay. The methods for cell recovery and cell cycle assay are as follows.
  • the cells in the well were washed with PBS and treated with Trypsin-EDTA to release the cells. Then, the cells were suspended and collected in D-MEM medium containing 10% FBS, placed in a 15 ml tube, centrifuged, and the supernatant was removed. Then, PBS was added and centrifugation was performed again. Then, the supernatant was removed, and 200 ⁇ l of a cold 70% ethanol aqueous solution was added dropwise little by little with stirring. Then, the stirring was stopped, 300 ⁇ l of a cold 70% ethanol aqueous solution was added along the wall surface of the container, and the mixture was ice-cooled for 30 minutes.
  • the cells were washed with PBS and centrifuged again. After centrifugation, the supernatant was removed, 500 ⁇ l of 0.1 mg / ml RNase was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 20 minutes. After incubation, centrifugation was performed to remove the supernatant, and then 200 ⁇ l of 25 ⁇ g / ml propidium iodide was added and incubated for 20 minutes. Next, 300 ⁇ l of FACSflow sheath solution was added, passed through a cell strainer, and analyzed by FACS.
  • Test Example 15 Measurement of protein expression level involved in G1 / S phase control checkpoint miR-4711-5p was analyzed for its effect on protein expression level involved in G1 phase / S phase control point control. Specifically, two colorectal cancer cell lines, DLD-1 and HCT116, were seeded in each well of a 6-well plate so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and after overnight culture, Lipofectamine 2000 ( Invitrogen) was used for transfection with miR-4711-5p or a negative control microRNA (NC, SEQ ID NO: 2).
  • N negative control microRNA
  • Test Example 16 Confirmation of binding of miR-4711-5p and TFDP1 Target Scan suggested that TFDP1 has a binding region of miR-4711-5p. Therefore, in order to confirm whether miR-4711-5p binds to TFDP1 in colorectal cancer cell lines transfected with miR-4711-5p, pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega) was used. Analysis was carried out. First, target scan was used to identify binding sites (TFDP1 3'UTR position 191-213, 5'-UUUGAUACCAGUGUGCUGAUGCA-3'(SEQ ID NO: 6)) that were predicted to bind by miR-4711-5p. A DNA molecule (insert) containing the binding site was created, and the insert was inserted into the multi-cloning site of pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector.
  • DLD-1 was seeded in each well of the 96-well plate so as to be 3.0 ⁇ 10 3 cells / well, cultured in D-MEM medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) for 12 hours, and then the medium was prepared. The medium was replaced with serum-free Opti-MEM medium, and Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used to co-transfect miR-4711-5p or a plasmid in which a negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2) and an insert were inserted. Eight hours after transfection, the medium was replaced with D-MEM medium containing 10% FBS, and after further culturing for 24 hours, luciferase activity was measured according to the product protocol.
  • FBS fetal bovine serum
  • Test Example 17 Confirmation of binding between miR-4711-5p and MDM2 Target Scan suggested that MDM2 has a binding region of miR-4711-5p. Therefore, in order to confirm whether miR-4711-5p binds to MDM2 in colorectal cancer cell lines transfected with miR-4711-5p, pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega) was used. Analysis was carried out. First, target scan was used to identify binding sites (MDM2 3'UTR position 2315-2337, 5'-UAUGGAAUAAAACUACUGAUGCA-3'(SEQ ID NO: 7)) that were predicted to bind by miR-4711-5p. A DNA molecule (insert) containing the binding site was created, and the insert was inserted into the multi-cloning site of pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector.
  • DLD-1 was seeded in each well of the 96-well plate so as to be 3.0 ⁇ 10 3 cells / well, cultured in D-MEM medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) for 12 hours, and then the medium was prepared. The medium was replaced with serum-free Opti-MEM medium, and Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used to co-transfect miR-4711-5p or a plasmid in which a negative control miRNA (NC, SEQ ID NO: 2) and an insert were inserted. Eight hours after transfection, the medium was replaced with D-MEM medium containing 10% FBS, and after further culturing for 24 hours, luciferase activity was measured according to the product protocol.
  • FBS fetal bovine serum
  • Test Example 18 Evaluation of antitumor effect and safety of miR-4711-5p in a mouse subcutaneous solid tumor model 1.
  • the pH was adjusted to 7.5 with 1N HCl. This was filtered through a filter having a diameter of 0.2 ⁇ m. 2 ⁇ g of miRNA and 4 ⁇ l of CaCl 2 (1M) were mixed per 1 ml of the obtained buffer and incubated in a water bath at 37 ° C.
  • the obtained dispersion was subjected to ultrasonic vibration treatment for 10 minutes.
  • a water bath having an ultrasonic vibration function is used, and the dispersion liquid contained in a plastic container is floated in water set at 20 ° C. under the conditions of a high frequency output of 55 W and an oscillation frequency of 38 kHz. I went for a minute.
  • the resulting formulation was immediately used in the tests described below.
  • the dispersion liquid of the ultrasonic vibration treatment contains composite particles composed of carbonate apatite nanoparticles containing miRNA, and the composite particles contain about 20 ⁇ g of miRNA per 1 mg of carbonate apatite. Has been confirmed.
  • mice were randomly assigned to 5 miR-4711-5p (miR-4711-5p), 5 negative control, and untreated mice. (Parent) Divided into 3 groups of 4 animals.
  • the time when the tumor reached a size of about 20 mm 3 was defined as the 0th day, and the 0th day, the 2nd day, the 4th day, the 7th day, the 9th day, and the 11th day.
  • carbonate apatite nanoparticles containing iR-4711-5p were intravenously injected from the tail vein so that the amount of miR-4711-5p was 40 ⁇ g / dose.
  • carbonate apatite nanoparticles containing the control miRNA (SEQ ID NO: 2) were intravenously injected from the tail vein at the same schedule and dose as in the miR-4711-5p administration group.
  • the result of measuring the tumor size over time is shown in FIG. 19, and the result of observing the tumor removed from the mouse on the 14th day is shown in FIG. As a result, the tumor size was significantly smaller in the miR-4711-5p-administered group than in the negative control group and the untreated group.
  • FIG. 21 shows the results of measuring the body weight of the mouse over time. As a result, it was confirmed that there was no significant difference in body weight among the three groups and that there were no side effects due to miR-4711-5p.
  • mice were removed from the mice and stained with hematoxylin and eosin, and the results are shown in FIG. From the results of hematoxylin and eosin staining of each tissue, no side effects due to miR-4711-5p were observed.
  • Test Example 19 Evaluation of antitumor effect of miR-4711-5p DLD-1 becomes 2.5 ⁇ 10 6 cells / tumor on the left and right sides of the back of 8-week-old BALB / cA nude mice (female, manufactured by Japan Marie). A model mouse having a solid tumor was prepared by subcutaneous injection. Mice were randomly divided into two groups, three in the miR-4711-5p administration group (miR-4711-5p) and three in the negative control group (Negative control). In the miR-4711-5p administration group, the time of subcutaneous injection of DLD-1 is taken as the 0th day, and on the 7th, 8th and 9th days, the amount of miR-4711-5p is 40 ⁇ g / dose.
  • Carbonated apatite nanoparticles containing iR-4711-5p (prepared under the same conditions as in Test Example 18) were intravenously injected from the tail vein.
  • carbonate apatite nanoparticles containing the control miRNA (SEQ ID NO: 2) were intravenously injected from the tail vein at the same schedule and dose as in the miR-4711-5p administration group. The tumor was removed from the mouse on the 10th day.
  • the amount of miR-4711-5p in the resected tumor was measured by PCR.
  • the mRNA levels of KLF5, TFDP1 and MDM2 in the resected tumor were measured by PCR.
  • all proteins were extracted from the excised tumor, and the expression levels of KLF5, TFDP1, MDM2, cPARP (cleavedPARP), cCaspase3 (cleavedCaspase3), and ACTB ( ⁇ -actin) at the protein level were measured by Western blotting. did.
  • the resected tumor was stained with fragmented DNA generated by apoptosis by the TUNEL assay and the nucleus was stained with Hoechst.
  • Figure 23 shows the results of measuring the amount of miR-4711-5p in the tumor. As a result, the amount of miR-4711-5p in the tumor was significantly increased in the miR-4711-5p administration group as compared with the negative control group.
  • the results of the TUNEL assay are shown in FIGS. 26 and 27, and the results of measuring the expression of cPARP, cCaspase3, and ACTB at the protein level are shown in FIG. 28.
  • the number of cells in which apoptosis was induced was significantly increased, and the expression levels of the apoptotic proteins cPARP and cCaspase3 were increased. It turned out that there was.
  • Test Example 20 Cell proliferation test (comparison with other miRNAs) Four miRNAs (miR-21-5p, miR-152-5p, miR-) that have been reported to suppress the expression of miR-4711-5p and KLF5 using colon cancer cell lines (DLD-1 and HCT116) Cell proliferation tests were performed on 153-3p and miR-448-3p), and miR-34a, which has been reported to have antitumor effects. Specifically, first, two colorectal cancer cell lines of DLD-1 and HCT116 were seeded in each well of a 96-well plate so as to be 3.0 ⁇ 10 3 cells / well, and cultured overnight, and then Lipofectamine.
  • FIG. 29 The results are shown in Fig. 29.
  • the vertical axis of FIG. 29 is the absorbance at 450 nm. As a result, the highest growth inhibitory effect was observed when transfection of miR-4711-5p was performed.
  • Test Example 21 Cell proliferation test (verification using colon cancer cells collected from patients) A cell proliferation test was performed using colon cancer cells collected from 5 stage II and III patients (Pt.28, Pt.36, Pt.40, Pt.41, and Pt.45). This study was conducted with the permission of the Ethics Committee of Osaka University Hospital, and with the permission, using colorectal cancer cells collected from 5 colorectal cancer patients who gave informed consent. Colorectal cancer cell spheroids collected from each patient were dissociated into a single colorectal cancer cell by incubation with trypLE express (Invitrogen) at 37 ° C. for 30 minutes.
  • trypLE express Invitrogen
  • the single colon cancer cells obtained were seeded in each well of a 96-well plate at 4.0 ⁇ 10 3 cells / well, cultured overnight, and then miR-4711- using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 5p, miR-34a, and negative control miRNAs (NC, SEQ ID NO: 2) were transfected. 72 hours after transfection, the cell status was observed, and the cell viability was measured by the GloMax-Multi + Detection System (Promega) using the cell counting kit-8 (Dojin Chemical Laboratory).
  • miR-4711-5p has an antitumor effect.
  • miR-4711-5p can effectively reduce the survival rate of cancer cells and suppress the expression of KLF5 in cancer cells.
  • miR-4711-5p binds to the 3'UTR of KLF5.
  • miR-4711-5p can suppress the growth, infiltration, and migration of cancer cells.
  • miR-4711-5p can induce apoptosis of cancer cells.
  • miR-4711-5p reduces the stem cell property of cancer cells.
  • miR-4711-5p can suppress the expression of stem cell markers in cancer stem cells.
  • miR-4711-5p increases the proportion of cancer cells with high ROS activity.
  • miR-4711-5p can suppress the formation of spheres in cancer cells.
  • miR-4711-5p can suppress the transition from G1 stage to S stage in the cell cycle of cancer cells.
  • miR-4711-5p increases the proportion of cancer cells in G0 / G1 phase.
  • One of the mechanisms by which miR-4711-5p suppresses the transition from G1 to S is the down-regulation of TFDP1 that miR-4711-5p directly targets.
  • One of the mechanisms by which miR-4711-5p suppresses the transition from G1 to S is the down-regulation of MDM2, which is directly targeted by miR-4711-5p.
  • miR-4711-5p has a superior antitumor effect to miR-34a, which has been reported to have an antitumor effect, and is effective against colorectal cancer cells removed from colorectal cancer patients. It was confirmed that it actually has an excellent antitumor effect.

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Abstract

本発明の目的は、癌の効果的な治療を可能にする癌治療用の核酸医薬を提供することである。　miR-4711-5pは、KLF5、TFDP1及びMDM2の発現を抑制でき、その結果、効果的に癌細胞の増殖、浸潤、及び遊走を抑制し、アポトーシスとG1 arrestを誘導、さらに幹細胞性を低下させる。

Description

癌治療剤
　本発明は、癌治療剤に関する。より具体的には、本発明は、優れた抗腫瘍効果を奏し、しかも癌幹細胞の幹細胞性を低下させることもできる癌治療剤に関する。
　miRNAは、18～24ヌクレオチドからなる小さなRNAで真核生物に広く存在しており、ヒトでは数千のmiRNAの存在が明らかになっている。miRNAは、1993年に初めて報告された内在性に発現する短いRNAである。DNAからpri-miRNAと呼ばれるループ構造を持つRNAが転写される。ループが酵素によって切断され、pre-miRNAを作る。このpre-miRNAが核外に輸送され、Dicerにより20～25塩基程度のmiRNA配列が切り出される。これがRNA-induced silencing complex(RISC)と呼ばれるリボ核酸とArgonoute(アルゴノート)蛋白の複合体に取りこまれることでmiRNA-RISC複合体を形成し、mRNAの3'UTRと結合して遺伝子発現を抑制する。miRNAとmRNAの結合は不完全であるため標的遺伝子は１つとは限らず、複数の遺伝子を標的として制御することが可能である点が重要な特徴である。また、miRNAは、生体内の遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしており、miRNAの制御システムの異常は、多くの疾患の原因や進展に関与していることも明らかにされている。特に、癌の発症や進展に関連性を示すmiRNAについて種々解明されており、癌治療用の核酸医薬の担い手として注目されている。
　一方、癌細胞には、自己増殖能があり、周辺組織への浸潤や離れた組織への転移が可能であるという特性がある。しかしながら、癌組織を形成している癌細胞の全てにおいて、これらの特性を備わっているのではなく、癌を発症させたり、癌を進行させたりする癌細胞は、癌細胞の中でもごく僅かにしか存在しない癌幹細胞であることが分かっている。癌幹細胞は、正常幹細胞と同様に未分化な表面形質を示し、自己複製能と多分化能を有し、癌組織を構成する多様な分化段階にあるあらゆる癌細胞を生みだす特性を有している。即ち、癌幹細胞は、癌組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しつつ、分化によって大多数の癌細胞を生み出すもとになっていると考えられている。そのため、癌幹細胞自体を治療対象とすることが癌の根治につながると考えられている。
　また、KLF5は、ジンクフィンガー転写因子であるKLFファミリーの１つである。KLF5は、正常腸管では陰窩において強く発現しているが、癌部では広く発現してWnt/Catnbシグナル伝達を増強することにより癌細胞の増殖を促進することが明らかになっている（非特許文献１）。また、Lgr5陽性細胞やマウスにおいてKlf5を欠損させと腫瘍が形成されないことも報告されている（非特許文献１）。
Takeo Nakaya et al., Cancer Res; 74(10) May 15, 2014
　前述の通り、KLF5は癌化に必要な要素であり、癌幹細胞との関連が示唆されているが、従来、KLF5に結合でき癌の治療に有効なmiRNAは見出されていない。また、試験例２に示しているように、KLF5に結合できるmiRNAであっても、癌細胞に対する増殖抑制効果を示さないものは多数存在している。このような状況の下、本発明の目的は、癌の効果的な治療を可能にする癌治療用の核酸医薬を提供することである。
　本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、miR-4711-5pは、癌化に関与するKLF5のmRNAに結合するだけでなく、細胞周期がG1期からS期に移行する上で重要なTFDP1のmRNAにも結合する特性があることが判明した。更に、miR-4711-5pは、細胞のアポトーシスや細胞周期の制御に重要なp53を抑制するMDM2の発現を抑えることも確認できた。miR-4711-5pは、KLF5、TFDP1、及びMEM2の発現を抑制でき、その結果、効果的に癌細胞の増殖、浸潤、及び遊走を抑制し、細胞をG1期に留め、更に癌細胞のアポトーシスを誘導できることを見出した。また、miR-4711-5pには、癌幹細胞の幹細胞性を低下させる作用があり、癌幹細胞の増殖抑制に有効であることをも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　miR-4711-5pを有効成分として含む、癌治療剤。
項２．　miR-4711-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項１に記載の癌治療剤。
項３．　miR-4711-5pが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項１又は２に記載の癌治療剤。
項４．　miR-4711-5pを有効成分として含む、癌幹細胞の増殖抑制剤。
項５．　miR-4711-5pの癌治療剤の製造のための使用。
項６．　癌の治療のための処置に使用される、miR-4711-5p。
項７．　miR-4711-5pを癌患者に治療有効量投与する、癌の治療方法。
項８．　miR-4711-5pの癌幹細胞の増殖抑制剤の製造のための使用。
項９．　癌幹細胞の増殖を抑制するための処置に使用される、miR-4711-5p。
項１０．　miR-4711-5pを癌患者に治療有効量投与し、癌幹細胞の増殖を抑制させる、癌幹細胞の増殖抑制方法。
　本発明の癌治療剤は、癌幹細胞に関与するKLF5のmRNAだけでなく、細胞周期がG1期からS期に移行させるのに必要なTFDP1や、p53の抑制を行うMDM2のmRNAにも結合して、優れた抗腫瘍効果を奏し、癌細胞の増殖、浸潤、及び遊走を抑制し、更に癌細胞のアポトーシスを効果的に誘導することができる。また、本発明の癌治療剤は、癌幹細胞の幹細胞性を低下させることもできるので、癌幹細胞の増殖抑制が可能であり、癌治療用の核酸医薬として臨床上の有用性が極めて高い。
41種類の候補miRNAをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、HCT116、及びHT29）の増殖試験を行った結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）におけるKLF5 mRNA発現量を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）におけるKLF5（タンパク質）発現量を測定した結果を示す図である。 デュアルルシフェラーゼアッセイによりmiR-4711-5pとKLF5の結合を確認した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）の細胞増殖試験を行った結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）の浸潤アッセイを行った結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）の細胞遊走能を評価した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）におけるAnnexin Vで染色される細胞、即ちアポトーシスを起こしている細胞の割合を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）におけるp53、サバイビン、cPARP、及びcCaspase3の発現量を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）におけるKLF5、CD44v9、LGR5、BMI1、及びLRIG1のmRNA量を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1）におけるCD44v9陽性細胞の割合を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1）における活性酸素種活性を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）におけるスフェアー形成能を評価した結果を示す図である。 miR-4711-5pまたはnegative controlをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1）の次世代シークエンスの結果を用いてIngenuity Pathways Analysisを行った結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）について細胞周期アッセイを行った結果を示す図である。 miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）における、G1期/S期チェックポイントの制御に関わるタンパク質（TFDP1、E2F1、Rb、CCNE、CDK2、p53、p21、p27、CCND1、CDK2、CDK6、及びMDM2）とβ-アクチン（ACTB）のタンパク質レベルでの発現量を測定した結果を示す図である。 デュアルルシフェラーゼアッセイによりmiR-4711-5pとTFDP1の結合を確認した結果を示す図である。 デュアルルシフェラーゼアッセイによりmiR-4711-5pとMDM2の結合を確認した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍サイズを経時的に測定した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、１４日目にマウスから摘出した腫瘍を観察した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、マウスの体重を経時的に測定した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、１４日目にマウスから摘出した各組織をヘマトキシリン・エオジン染色して観察した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍におけるmiR-4711-5p量を測定した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍におけるKLF5、TFDP1、MDM2、及びACTBのmRNA量を測定した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍におけるKLF5、TFDP1、MDM2、及びACTBのタンパク質レベルでの発現量を測定した結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍組織をTUNELアッセイした結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍組織をTUNELアッセイした結果を示す図である。 マウス皮下固形腫瘍モデル（大腸癌細胞株DLD-1）において、腫瘍におけるcPARP、cCaspase3、及びACTBの蛋白量を測定した結果を示す図である。 miR-4711-5p、miR-21-5p、miR-152-5p、miR-153-3p、miR-448-3p、及びmiR-34aをトランスフェクションした大腸癌細胞株（DLD-1、及びHCT116）の細胞増殖試験を行った結果を示す図である。縦軸は、450nmの吸光度を示す。 大腸癌患者から得られた大腸癌細胞にmiR-4711-5p及びmiR-34aをトランスフェクションし、72時間後に細胞の状態を観察した結果を示す図である。 大腸癌患者から得られた大腸癌細胞にmiR-4711-5p及びmiR-34aをトランスフェクションし、細胞増殖試験を行った結果を示す図である。
１．癌治療剤
　本発明の癌治療剤は、有効成分としてmiR-4711-5pを含むことを特徴とする。以下、本発明の癌治療剤について詳述する。
［有効成分］
　本発明の癌治療剤では、有効成分としてmiR-4711-5pを使用する。miR-4711-5pは、ヒト由来のmiRNAであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、5'-UGCAUCAGGCCAGAAGACAUGAG-3'（配列番号１）である。
　本発明の癌治療剤において、有効成分として使用されるmiR-4711-5pは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、前記各miRNAは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体miRNAやpre-miRNAの塩基配列については、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
　有効成分として使用されるmiRNAは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
［適用対象］
　本発明の癌幹細胞の癌治療剤の適用対象となる癌種については、特に制限されないが、例えば、大腸癌、食道癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、脳腫瘍、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの癌種の中でも、好ましくは固形癌、更に好ましくは大腸癌が挙げられる。
　また、本発明の癌治療剤は、癌幹細胞の増殖を抑制することもできるので、化学療法が効かなかった癌に対しても有効な治療効果が認められ得るので、本発明の癌幹細胞の癌治療剤の適用対象の一態様として、化学療法が効かなかった癌が挙げられる。
［投与方法］
　本発明の癌治療剤の投与方法としては、miR-4711-5pを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
　本発明の癌治療剤の投与量については、適用対象となる癌幹細胞の種類、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、miR-4711-5pの成熟型miRNA量換算で１日当たり1～100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
［製剤化］
　本発明の癌治療剤は、miR-4711-5pが癌幹細胞内に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、本発明の癌治療剤はmiR-4711-5pが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、例えば、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内へのmiR-4711-5pの移行を効率的に行うことができるので、本発明の癌治療剤の好適な一態様としては、miR-4711-5pが炭酸アパタイト粒子との混合状態、又はmiR-4711-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化（内包）されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。
　以下、miR-4711-5pの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子について説明する。
（炭酸アパタイト粒子）
　炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）の水酸基の一部をCO3で置換した構造を有し、一般式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYnで表される化合物である。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換し得る元素であり、例えば、Sr、Mn、希土類元素等が挙げられる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる基又は元素であり、OH、F、Cl等が挙げられる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
　本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径については、生体内に投与されて、細胞内へ移行できる程度の大きさである限り、特に制限されない。具体的には、本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径として、通常30nm超、好ましくは30～3000nm、更に好ましくは30～2000nm、特に好ましくは30～1500nmが挙げられる。
　なお、前記の炭酸アパタイトの平均粒子径は、動的光散乱法粒子計測（DLS）により測定される値である。DLSを用いた測定に適さない巨大な粒子（例えば、粒径5μｍ以上）が存在する場合は、それらは測定対象範囲から除去される。また、本明細書において、粒径とは、走査型プローブ顕微鏡で測定した際に、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を意味する。よって、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。
　炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることができる。例えば、水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを共存させることによって調製することにより得ることができる。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
　水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常0.1～1000mM、好ましくは0.5～100mM、更に好ましくは1～10mMが挙げられる。
　水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常0.1～1000mM、好ましくは0.5～100mM、更に好ましくは1～10mMが挙げられる。
　水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常1.0～10000mM、好ましくは5～1000mM、更に好ましくは10～100mMが挙げられる。
　カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源としては、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの水溶性塩が挙げられる。具体的には、カルシウムイオン源としてCaCl2を用いることができ、リン酸イオン源としてNaH2PO4・2H2Oを用いることができ、炭酸イオン源としてNaHCO3を用いることができる。
　炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Sr、Mn等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるCa又はCO3を部分的に置換してもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Sr、Mnの添加量は、形成される複合体粒子のpH溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、基剤として水を使用すればよいが、細胞培養用の各種培地やバッファー等を使用してもよい。
　本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の調製において、水溶液中への各イオン供給源及び他の物質の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び他の物質を含有する第１の溶液を調製すると共に、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液を調製し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して水溶液を調製することができる。
　炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のpHを6.0～9.0の範囲に調整し、一定時間放置（インキュベート）することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のpHとしては、例えば6.5～9.0、好ましくは6.7～8.8、更に好ましくは6.7～8.6、より更に好ましくは6.8～8.5、特に好ましくは7.0～8.5、最も好ましくは7.1～8.0が挙げられる。
　炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常0℃以上であり、例えば4℃以上、或いは37℃が挙げられる。
　炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液のインキュベート時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常1分～24時間、好ましくは5分～1時間が挙げられる。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
　また、炭酸アパタイト粒子の平均粒径を前記範囲に制御する方法としては、特に制限されないが、例えば、炭酸アパタイト粒子の製造過程又は炭酸アパタイト粒子の製造後に分散剤を加える方法が挙げられる。分散剤の種類については、炭酸アパタイト粒子を分散可能であることを限度として特に制限されず、一般に医薬品に添加される分散剤であればよいが、一例としてアルブミンが挙げられる。分散剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。炭酸アパタイト粒子を含む水溶液中での分散剤の濃度としては、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、0.1～500mg/ml、好ましくは1～100mg/ml、更に好ましくは1～10mg/ml程度；或は0.001～10重量％程度が挙げられる。また、粒子径の制御法の別の例として、前記の水溶液中で形成した炭酸アパタイト粒子を超音波振動処理する方法が挙げられる。超音波振動処理としては、具体的には、超音波破砕機等の超音波振動子を直接試料に接触させて超音波をかける処理；超音波振動子及び水槽（洗浄槽）を備えた超音波洗浄器を用いて、当該水槽に液体（例えば、水）を入れ、そこに炭酸アパタイト粒子を収容した容器（例えば、プラスチック製のチューブ）を浮かべ、液体を介して炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に超音波をかける処理等が挙げられる。このような超音波振動処理によって、簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子の粒径を前記範囲に微細化することができる。
　上記の超音波振動処理の条件は、粒子径を所定範囲に制御可能である限り特に制限されない。例えば、超音波振動子及び水槽（洗浄槽）を備えた超音波洗浄器を用いて行う場合であれば、以下の条件が例示される。
水槽の温度：例えば5～45℃、好ましくは10～35℃、更に好ましくは20～30℃。
高周波出力：例えば10～500Ｗ、好ましくは20～400Ｗ、更に好ましくは30～300Ｗ、より好ましくは40～100Ｗ。
発振周波数：例えば10～60Ｈｚ、好ましくは20～50Ｈｚ、更に好ましくは30～40Ｈｚ。
処理時間：例えば、30秒～30分、好ましくは1～20分、更に好ましくは3～10分。
　超音波振動処理を行う際に用いる、炭酸アパタイト粒子を包含する容器の種類は、粒子を所定の粒子径範囲に微細化することが可能である限り制限されず、水溶液の容量や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、1～1000ml容量のプラスチック製チューブを用いることができる。
　また、超音波振動処理は、分散剤の存在下（即ち、分散剤を、炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に添加した状態）で行うことが好ましい。これは、分散剤と炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有する炭酸アパタイトナノ粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。
（miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子）
　本発明の癌治療剤の好適な一態様では、miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子が複合化した複合粒子が使用される。このようにmiR-4711-5pを炭酸アパタイト粒子に複合化させることによって、炭酸アパタイトの作用によって生体内の癌細胞にmiR-4711-5pを集積させて、癌細胞内にmiR-4711-5pを効率的に導入させることが可能になる。また、細胞内に導入された後に、細胞内でmiR-4711-5pが炭酸アパタイト粒子から遊離できるので、miR-4711-5pによる抗腫瘍効果を効率的に発揮させることも可能になる。
　本発明において、miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子とは、miR-4711-5pが炭酸アパタイト粒子に対してイオン結合、水素結合等によって吸着して担持された状態を指す。miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成方法については、特に制限されないが、例えば、miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子を水溶液中で共存させることにより形成する方法；炭酸アパタイト粒子を調製する水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンと共に、miR-4711-5pを共存させることにより、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う方法等が挙げられる。
　miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成を、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う場合、炭酸アパタイトの調製に使用される水溶液中にmiR-4711-5pを、例えば0.1～1000nM、好ましくは0.5～500nM、更に好ましくは1～200nMとなるように添加すればよい。
　miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子において、miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の比率については特に制限されず、miR-4711-5pの投与量等に応じて適宜設定すればよい。例えば、2mgのmiR-4711-5pを炭酸アパタイト粒子に複合化させる場合、前述する炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液2.5Lに、5mgのmiR-4711-5pを添加して、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行えばよい。
　また、本発明において、炭酸アパタイト粒子と複合化させたmiR-4711-5pを使用する場合、生体への投与に適した溶媒中に分散した状態で使用される。前述するように、炭酸アパタイト粒子は、各種のイオン供給源となる物質を水、培地、又はバッファー等の溶媒に溶解させることによって得られるが、そのようにして得られる炭酸アパタイト粒子分散溶液は、浸透圧、緩衝能、無菌性等の観点から必ずしも生体への投与（血管内投与）に適していない。よって、炭酸アパタイト粒子が分散した溶媒を生体への投与に適した溶媒（例えば、生理食塩水等）に置換するためには、通常、遠沈によって炭酸アパタイト粒子を溶媒から分離し、回収して溶媒を置き換える操作が必要である。しかしながら、このような操作を行うと炭酸アパタイト粒子同士が凝集し、粒子が巨大化するため、却って生体への投与には適さない状態へと変化してしまう。そこで、凝集した炭酸アパタイト粒子を生体への投与に適した溶媒に添加した上で、前述する超音波振動処理を行うことにより、miR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子が、生体への投与に適した溶媒中で適度な粒子径（前述する範囲の平均粒子径）で分散させることができる。
　また、本発明の癌治療剤において、炭酸アパタイト粒子と複合化させたmiR-4711-5pを使用する場合、本発明の癌治療剤の投与はmiR-4711-5pと炭酸アパタイト粒子の複合粒子を超音波振動処理によって微小な粒子の状態で分散させた後に、当該粒子が凝集する前に速やかに行うことが望ましい。例えば、超音波振動処理後１分以内、好ましくは３０秒以内の投与が好適である。但し、前述するように、アルブミンを添加することによって炭酸アパタイト粒子の凝集を抑制する場合は、超音波振動処理後、数分～数十分経過後に投与することも可能である。
２．癌幹細胞の増殖抑制剤
　miR-4711-5pは、癌幹細胞の幹細胞性を低下させて癌幹細胞の増殖を抑制することもできるので、本発明は、更に、miR-4711-5pを有効成分として含む癌幹細胞の増殖抑制剤を提供する。
　本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、癌幹細胞の増殖を抑制するために使用される核酸医薬であり、使用する有効成分、適用対象となる癌種、投与方法、製剤化等については、前記「１．癌治療剤」の場合と同様である。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。
試験例１：候補miRNAの抽出
　miRBaseとTarget Scanの２つのデータベースを使用して、KLF5に結合する可能性のあるmiRNAを抽出した。抽出したmiRNAの内、Wnt/β-カテニンシグナル、Wnt/Ca+シグナル、及びNotchシグナルのいずれかに関係するものを抽出した。その結果、miRBaseからは29種類のmiRNA、Target Scanからは31種のmiRNAが抽出された。miRBaseで抽出されたmiRNAとTarget Scan抽出されたmiRNAで重複しているものは16種類あったので、合計44種類のmiRNAが抽出された。44種類のmiRNAの内、3種類のmiRNAについては既に機能解析が進められていたので、それらを除外して41種類のmiRNAを候補として選択した。
試験例２：miRNAのスクリーニング
　前記で抽出した41種類の候補miRNAを用いて、大腸癌細胞株の増殖試験を行った。具体的には、先ず、９６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1、HCT116、及びHT29の３つの大腸癌細胞株をそれぞれ5000 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて候補miRNA又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、5'-AUCCGCGCGAUAGUACGUA-3'、配列番号２）でトランスフェクションした。トランスフェクションから72時間後にcell counting kit-8(同仁化学研究所)を用いて、GloMax-Multi+Detection System(Promega)で細胞生存率（cell viability、％）を測定した。
　結果を図１に示す。図１中、No.20の候補miRNAがmiR-4711-5pである。図１から明らかなように、miR-4711-5pは、大腸癌細胞株の増殖抑制効果が優れていることが確認された。
試験例３：miR-4711-5pがKLF5のmRNAレベルでの発現量に及ぼす影響の分析
　大腸癌細胞株に対する増殖抑制効果が優れていたmiR-4711-5pについて、KLF5 mRNA発現量に及ぼす影響を分析した。具体的には、6ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）でトランスフェクションした。トランスフェクションを行った24時間後に細胞を回収し、miRNeasy Kit (Applied Biosystems)で全RNAを抽出し、PCRによってKLF5 mRNA量の測定を行った。
　結果を図２に示す。この結果、miR-4711-5pには、大腸癌細胞株においてKLF5の発現をmRNAレベルで抑制する作用があることが確認された。
試験例４：miR-4711-5pがKLF5のタンパク質レベルでの発現量に及ぼす影響の分析
　miR-4711-5pについて、KLF5のタンパク質レベルでの発現量に及ぼす影響を分析した。具体的には、６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）でトランスフェクションした。トランスフェクションを行った48時間後に細胞を回収し、細胞内の全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングによりKLF5のタンパク質レベルでの発現量を測定した。
　結果を図３に示す。この結果、miR-4711-5pをトランスフェクトした大腸癌細胞株は、KLF5の発現がタンパク質レベルでも抑制されていることが確認された。
試験例５：miR-4711-5pとKLF5の結合の確認
　miR-4711-5pをトランスフェクトした大腸癌細胞株においてmiR-4711-5pがKLF5に結合しているか否かを確認するために、pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)を用いて分析を行った。先ず、target scanを用いて、miR-4711-5pによる強い結合が予測されるbinding site 1（KLF5の3'UTRの position 1186-1208、5'-AAUAGUAAUGUGAUGCUGAUGCU-3'（配列番号３））とmiR-4711-5pによる弱い結合が予測されるbinding site 2（KLF5の3'UTRの position 917-939、5'-GACAAUGUUGCAUUUAUGAUGC-3'（配列番号４）、とKLF5の3'UTRの position 951-973、5'-CAAAACGUUGAAUUGAUGAUGCA-5'（配列番号５）の２つの領域）を同定した。binding site 1を含むDNA分子（インサート１）、及びbinding site 2（２つの領域）を含むDNA分子（インサート２）を作成し、インサート１及び２をそれぞれpmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vectorのマルチクローニングサイトに挿入した。
　９６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×104 cells/wellとなるように播種し、10％FBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM培地で12時間培養を行った後に、培地を血清非含有のOpti-MEM培地に交換して、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）とインサート１又は２を挿入したプラスミドをコトランスフェクションした。トランスフェクションを行った8時間後に培地を10％FBS含有D-MEM培地に交換し、更に24時間培養を行った後に、製品のプロトコールに従って、ルシフェラーゼ蛋白発現量を測定した。
　結果を図４に示す。この結果、miR-4711-5pによりルシフェラーゼの発現が抑えられており、binding site 1及び２の双方にmiR-4711-5pが結合していることが確認された。
試験例６：細胞増殖試験
　miR-4711-5pを用いて、大腸癌細胞株の細胞増殖試験を行った。具体的には、先ず、９６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ3.0×103 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24、48、及び72時間後に、cell counting kit-8(同仁化学研究所)を用いて、GloMax-Multi+Detection System(Promega)で細胞生存数を測定した。
　結果を図５に示す。この結果、miR-4711-5pのトランスフェクションを行った場合には、ネガティブコントロールに比べて、48及び72時間後には、DLD-1及びHCT116の細胞増殖を有意に抑制できることが確認された。
試験例７：浸潤アッセイ
　miR-4711-5pを用いて、大腸癌細胞株の浸潤アッセイを行った。具体的には、先ず、６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に、細胞をBD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD biosciences)に播種して48時間培養を行った。次いで、ヘナトキシリンで核染色を行い、浸潤した細胞数を計測した。
　結果を図６に示す。この結果、miR-4711-5pのトランスフェクションを行った場合には、ネガティブコントロールに比べて、浸潤能細胞数が有意に低下することが確認された。
試験例８：遊走能の評価
　miR-4711-5pを用いて、創傷治癒アッセイによる大腸癌細胞株の遊走能の評価を行った。具体的には、先ず、２４ウェルプレートにインサート（ibidi Culture Insert 2 Well (ibidi)）をセットし、各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ3.5×105～4.0×105 cells/wellとなるように播種し、24時間培養を行った。次いで、インサートを除去してwoundを作成して引き続き培養を行い、インサート除去から24、48及び72時間後に、wound面積を測定した。
　結果を図７に示す。この結果、miR-4711-5pのトランスフェクションを行った場合には、ネガティブコントロールに比べて、wound面積が有意に広くなっており、細胞の遊走能が低下することが確認された。
試験例９：アポトーシスアッセイ
　miR-4711-5pを用いて、大腸癌細胞株のアポトーシスアッセイを行った。具体的には、先ず、6ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後に、細胞をAlexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (Thermo Fisher Scientific)で処理し、SH800ZCell Sorter (Sony Biotechnology Inc.)を用いて、Annexin Vので染色される割合を求めた。また、トランスフェクションから48時間後に細胞を回収し、細胞内の全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングによりp53、サバイビン、cPARP（cleaved PARP）、cCaspase3（cleaved Caspase3）、及びACTB（β-アクチン）の発現量を測定した。
　Annexin Vで染色される細胞（即ち、アポトーシスを起こしている細胞）の割合を測定した結果を図８に示し、p53、サバイビン、cPARP、cCaspase3、及びACBTの発現量を測定した結果を図９に示す。この結果、miR-4711-5pをトランスフェクトした大腸癌細胞株では、Annexin Vで染色される細胞が増加しており、アポトーシスが強く誘導されていることが分かった。また、野生型のp53を有するHCT116では、miR-4711-5pをトランスフェクションすることにより、p53の発現が亢進し、抗アポトーシス性タンパク質であるsurvivinの発現量が減少し、アポトーシス性タンパク質であるcPARP及びcCaspase3の発現量が増大していた。また、変異型のp53を有するDLD-1では、miR-4711-5pをトランスフェクトすることにより、survivinの発現が低下、cCaspase3の発現量が増大していた。即ち、これらの結果から、miR-4711-5pのトランスフェクションによって、大腸癌細胞株のアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。
試験例１０：幹細胞マーカーの発現量の分析
　miR-4711-5pが大腸癌細胞株の幹細胞マーカーの発現量に及ぼす影響について分析した。具体的には、先ず、6ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に細胞を回収し、miRNeasy Kit (Applied Biosystems)で全RNAを抽出し、PCRによってKLF5、CD44v9、LGR5、BMI1、及びLRIG1のmRNA量を測定した。また、トランスフェクションから48時間後のDLD-1については、FACSにより細胞表面のCD44v9量の測定を行った。
　KLF5、CD44v9、LGR5、BMI1、及びLRIG1のmRNA量を測定した結果を図１０に示し、FACSによりDLD-1表面のCD44v9量を測定した結果を図１１に示す。図１０から分かるように、miR-4711-5pのトランスフェクションによって、DLD-1では、幹細胞マーカーであるCD44v9、LGR5、及びBMI1の発現が抑制され、HCT116では、幹細胞マーカーであるCD44v9、及びBMI1の発現が抑制されていた。また、図１１から分かるように、miR-4711-5pのトランスフェクションによってDLD-1の細胞表面に存在するCD44v9が減少していた。以上の結果から、miR-4711-5pがトランスフェクションされた大腸癌細胞株では、幹細胞マーカーの発現が抑制されており、miR-4711-5pには癌幹細胞の幹細胞性を低減させる作用があることが明らかとなった。
試験例１１：活性酸素種活性の測定
　幹細胞性の高い細胞は活性酸素種（Reactive oxidant species, ROS)活性を低く保つ性質がある。そこで、miR-4711-5pが大腸癌細胞株のROS活性に及ぼす影響について分析した。具体的には、先ず、6ウェルプレートにDLD-1を1.0×105cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に細胞を回収し、CellROX Deep Red (thermos fisher scientific)で染色してFACSによりROS活性を測定した。
　結果を図１２に示す。なお、図１２の右図に示すROS activityは、ROS活性がhighと判定された細胞の割合である。Highとlowのcut off値はCell ROX試薬を暴露していない細胞を用いて決定した。この結果、miR-4711-5pがトランスフェクションされた大腸癌細胞株では、ROS活性が高い細胞の割合が増大しており、miR-4711-5pが幹細胞性を低下させていることが確認された。
試験例１２：スフェアー形成能の分析
　miR-4711-5pが大腸癌細胞株のスフェアー形成能に及ぼす影響について分析した。具体的には、先ず、6ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に細胞を回収し、細胞同士が凝集していない状態にして96-well ultra-low attachment plates (Corning Inc., USA)に1×103 cells/wellとなるように播種して１週間培養を行った。なお、当該培養には、EGF 20 ng/ml、bFGF 10 ng/ml、及びペニシリンG 100 μg/mlを含む無血清DMEM/F-12培地を用いた。１週間後に40μm以上のスフェロイドの数を計測した（n=10)。
　結果を図１３に示す。この結果、miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株のスフェロイド数が低下することが確認され、miR-4711-5pには大腸癌細胞株のスフェアー形成能を低減させる作用があることが明らかとなった。
試験例１３：IPA解析
　miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株について、次世代シークエンスを行った結果を用いてIngenuity Pathways Analysis（IPA）を行った。具体的には、先ず、6ウェルプレートの各ウェルにDLD-1を1.0×105cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから36時間後に細胞を回収し、miRNeasy Kit (Applied Biosystems)で全RNAを抽出した。次いで、得られた全RNAを用いてライブラリー調製を行った後、当該ライブラリーの次世代シーケンス解析を行った。そして、次世代シークエンスを行った結果を用いて、Ingenuity Pathways Analysisを実施した。
　結果を図１４に示す。この結果、miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株では、細胞周期におけるG1期からS期への移行が抑制されていることが示唆された。
試験例１４：細胞周期アッセイ
　前記試験例１３の結果から、miR-4711-5pは細胞周期におけるG1期からS期への移行を抑制することが示唆されたので、miR-4711-5pが大腸癌細胞株の細胞周期に及ぼす影響について詳細分析した。具体的には、先ず、６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1を1.0×105cells/wellとなるように播種し、10％FBS含有D-MEM培地を用いて終夜培養を行った。次いで、培地をFBS非含有D-MEM培地に交換して24時間培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に培地を10％FBS含有D-MEM培地に交換した。引き続き8時間培養を行った後に、細胞を回収して細胞周期アッセイを行った。細胞の回収及び細胞周期アッセイの手法は以下の通りである。
　ウェル中の細胞をPBSで洗浄し、Trypsin-EDTAで処理して細胞を遊離させた。次いで、10％FBS含有D-MEM培地中に細胞を懸濁して回収し、15mlチューブに入れて遠心分離及び上清除去を行った。その後、PBSを添加して遠心分離を再度行った。次いで、上清を除去し、撹拌しながら、冷70％エタノール水溶液200μlを少しずつ滴下した。その後、撹拌を停止して、冷70％エタノール水溶液300μlを容器の壁面を伝わせながら添加して、30分間氷冷した。次いで、遠心分離及び上清除去を行った後に、PBSで洗浄し、遠心分離を再度行った。遠心分離後に上清を除去し、0.1mg/mlのRNaseを500μl入れて、37℃で20分間インキュベートした。インキュベート後に遠心分離を行って上清を除去した後に、25μg/mlのプロピジウムイオダイドを200μl入れ、20分間インキュベートした。次いで、FACS flowシース液を300μl添加し、セルストレーナーに通してFACSにて解析を行った。
　結果を図１５に示す。この結果、miR-4711-5pをトランスフェクションした大腸癌細胞株では、G1期の細胞の割合が増加しており、G1からS期への移行が抑制されていることが確認された。
試験例１５：G1期/S期チェックポイントの制御に関わるタンパク質の発現量の測定
　miR-4711-5pについて、G1期/S期チェックポイントの制御に関わるタンパク質の発現量に及ぼす影響を分析した。具体的には、６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ1.0×105 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmicroRNA（NC、配列番号２）でトランスフェクションした。トランスフェクションを行った48時間後に細胞を回収し、細胞内の全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングにより、G1期/S期チェックポイントの制御に関わるタンパク質（TFDP1、E2F1、Rb、CCNE、CDK2、p21、p27、CCND1、CDK2、CDK6、及びMDM2）とβ-アクチン（ACTB）のタンパク質レベルでの発現量を測定した。
　結果を図１６に示す。この結果、miR-4711-5pをトランスフェクトした大腸癌細胞株では、細胞周期を止めるp21やp27の発現亢進と共に、TFDP1及びMDM2の発現低下も認められた。p53野生株のHCT116ではp53の発現が亢進し、その下流のp21の発現が亢進していた。
試験例１６：miR-4711-5pとTFDP1の結合の確認
　Target Scanにおいて、TFDP1はmiR-4711-5pの結合領域を持つことが示唆された。そこで、miR-4711-5pをトランスフェクトした大腸癌細胞株においてmiR-4711-5pがTFDP1に結合しているか否かを確認するために、pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)を用いて分析を行った。先ず、target scanを用いて、miR-4711-5pによる結合が予測されるbinding site （TFDP1の3'UTRの position 191-213、5'-UUUGAUACCAGUGUGCUGAUGCA-3'（配列番号６））を同定した。当該binding siteを含むDNA分子（インサート）を作成し、インサートをpmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vectorのマルチクローニングサイトに挿入した。
　９６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1を3.0×103 cells/wellとなるように播種し、10％FBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM培地で12時間培養を行った後に、培地を血清非含有のOpti-MEM培地に交換して、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）とインサートを挿入したプラスミドをコトランスフェクションした。トランスフェクションを行った8時間後に培地を10％FBS含有D-MEM培地に交換し、更に24時間培養を行った後に、製品のプロトコールに従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図１７に示す。この結果、miR-4711-5pによりルシフェラーゼの発現が抑えられており、TFDP1の3'UTRのposition 191-213にmiR-4711-5pが結合していることが確認された。
試験例１７：miR-4711-5pとMDM2の結合の確認
　Target Scanにおいて、MDM2はmiR-4711-5pの結合領域を持つことが示唆された。そこで、miR-4711-5pをトランスフェクトした大腸癌細胞株においてmiR-4711-5pがMDM2に結合しているか否かを確認するために、pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)を用いて分析を行った。先ず、target scanを用いて、miR-4711-5pによる結合が予測されるbinding site （MDM2の3'UTRの position 2315-2337、5'-UAUGGAAUAAAACUACUGAUGCA-3'（配列番号７））を同定した。当該binding siteを含むDNA分子（インサート）を作成し、インサートをpmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vectorのマルチクローニングサイトに挿入した。
　９６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1を3.0×103 cells/wellとなるように播種し、10％FBS（ウシ胎児血清）を含むD-MEM培地で12時間培養を行った後に、培地を血清非含有のOpti-MEM培地に交換して、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p又はネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）とインサートを挿入したプラスミドをコトランスフェクションした。トランスフェクションを行った8時間後に培地を10％FBS含有D-MEM培地に交換し、更に24時間培養を行った後に、製品のプロトコールに従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図１８に示す。この結果、miR-4711-5pによりルシフェラーゼの発現が抑えられており、MDM2の3'UTRのposition 2315-2337にmiR-4711-5pが結合していることが確認された。
試験例１８：マウス皮下固形腫瘍モデルにおけるmiR-4711-5pの抗腫瘍効果及び安全性の評価
１．miRNAと炭酸アパタイトの複合粒子の製造
　100mlの蒸留水に、0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O（1M）、及び180μlのCaCl2（1M）をこの順に添加して溶解させ、1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。得られたバッファー1ml当たりに2μgのmiRNA、4μlのCaCl2（1M）を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。その後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを生理食塩水（0.5重量％アルブミン含有）に分散させ、miRNAを炭酸アパタイト粒子に内包させた複合粒子の分散液を得た。試験に供する直前に、得られた分散液を10分間超音波振動処理にかけた。なお、超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容した前記分散液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。斯して得られた製剤は、直ちに、後述する試験に使用した。
　なお、超音波振動処理の分散液には、miRNAを包含した炭酸アパタイトナノ粒子からなる複合粒子が生成しており、当該複合粒子には炭酸アパタイト1mg当たり約20μg程度のmiRNAが含まれていることが確認できている。
２．マウス皮下固形腫瘍モデル試験
　6～8週齢のＢＡＬＢ／ｃＡヌードマウス（雌、日本クレア社製）の背部左右に、DLD-1を5×105 cells/腫瘍となるように皮下注射し、固形腫瘍を有するモデルマウスを作製した。腫瘍が約20 mm3の大きさに達した時点でマウスをランダムに、miR-4711-5p投与群（miR-4711-5p）5匹、ネガティブコントロール群（Negative control）5匹、及び未処置群（Parent）4匹の３群に分けた。miR-4711-5p投与群では、腫瘍が約20 mm3の大きさに達した時点を０日目として、０日目、２日目、４日目、７日目、９日目及び１１日目に、miR-4711-5p量換算で40μg/回となるようにiR-4711-5pを包含した炭酸アパタイトナノ粒子を尾静脈より静脈注射した。ネガティブコントロール群では、miR-4711-5p投与群と同様のスケジュール及び用量で、コントロールmiRNA（配列番号２）を包含した炭酸アパタイトナノ粒子を尾静脈より静脈注射した。未処置群では、薬剤の投与を行わなかった。試験期間中、マウス背部の腫瘍サイズ（長径×短径×短径×1/2）及びマウスの体重を経時的に測定した。また、１４日目にマウスから腫瘍を摘出して大きさを観察した。更に、１４日目にマウスから、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び結腸を摘出してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織観察を行った。
　腫瘍サイズを経時的に測定した結果を図１９に示し、１４日目にマウスから摘出した腫瘍を観察した結果を図２０に示す。この結果、miR-4711-5p投与群では、ネガティブコントロール群及び未処置群に比べて、腫瘍サイズが有意に小さかった。
　また、マウスの体重を経時的に測定した結果を図２１に示す。この結果、３群間で体重に有意な差はなく、miR-4711-5pによる副作用がないことが確認された。
　また、１４日目にマウスから、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、及び結腸を摘出してヘマトキシリン・エオジン染色を行った結果を図２２に示す。各組織のヘマトキシリン・エオジン染色の結果からも、miR-4711-5pによる副作用は認められなかった。
試験例１９： miR-4711-5pの抗腫瘍効果の評価
　8週齢のＢＡＬＢ／ｃＡヌードマウス（雌、日本クレア社製）の背部左右に、DLD-1を2.5×106 cells/腫瘍となるように皮下注射し、固形腫瘍を有するモデルマウスを作製した。マウスをランダムに、miR-4711-5p投与群（miR-4711-5p）3匹、及びネガティブコントロール群（Negative control）3匹の２群に分けた。miR-4711-5p投与群では、DLD-1を皮下注射した時点を０日目として、７日目、８日目及び９日目に、miR-4711-5p量換算で40μg/回となるようにiR-4711-5pを包含した炭酸アパタイトナノ粒子（前記試験例１８と同条件で調製したもの）を尾静脈より静脈注射した。ネガティブコントロール群では、miR-4711-5p投与群と同様のスケジュール及び用量で、コントロールmiRNA（配列番号２）を包含した炭酸アパタイトナノ粒子を尾静脈より静脈注射した。１０日目にマウスから腫瘍を摘出した。
　摘出した腫瘍におけるmiR-4711-5p量をPCRによって測定した。また、摘出した腫瘍におけるKLF5、TFDP1、及びMDM2のmRNA量をPCRによって測定した。更に、摘出した腫瘍から全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングにより、KLF5、TFDP1、MDM2、cPARP（cleaved PARP）、cCaspase3（cleaved Caspase3）、及びACTB（β-アクチン）のタンパク質レベルでの発現量を測定した。更に、摘出した腫瘍について、TUNELアッセイによってアポトーシスにより生じる断片化DNAを染色し、また、核をHoechstによって染色した。
　腫瘍におけるmiR-4711-5p量を測定した結果を図２３に示す。この結果、miR-4711-5p投与群では、ネガティブコントロール群に比べて、腫瘍におけるmiR-4711-5p量が有意に増加していた。
　また、腫瘍におけるKLF5、TFDP1、MDM2、及びACTBのmRNA量を測定した結果を図２４に示し、腫瘍におけるKLF5、TFDP1、MDM2、及びACTBのタンパク質量を測定した結果を図２５に示す。この結果、miR-4711-5p投与群では、ネガティブコントロール群に比べて、KLF5、TFDP1、及びMDM2の発現量は、mRNA及びタンパク質の双方で低減していることが確認された。
　TUNELアッセイを行った結果を図２６及び２７に示し、cPARP、cCaspase3、及びACTBの蛋白レベルでの発現を測定した結果を図２８に示す。この結果、miR-4711-5p投与群では、アポトーシスが誘導された細胞が有意に増加しており、アポトーシス性タンパク質であるcPARP及びcCaspase3の発現量が増大していることが分かった。
いることが分かった。
試験例２０：細胞増殖試験（他のmiRNAとの比較）
　大腸癌細胞株（DLD-1及びHCT116）を用いて、miR-4711-5p、KLF5の発現抑制作用が報告されている4種のmiRNA（miR-21-5p、miR-152-5p、miR-153-3p、及びmiR-448-3p）、及び抗腫瘍効果が報告されているmiR-34aについて細胞増殖試験を行った。具体的には、先ず、９６ウェルプレートの各ウェルにDLD-1及びHCT116の２つの大腸癌細胞株をそれぞれ3.0×103 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p、miR-21-5p、miR-152-5p、miR-153-3p、miR-448-3p、miR-34a、及びネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから24、48、及び72時間後に、cell counting kit-8(同仁化学研究所)を用いて、GloMax-Multi+Detection System(Promega)で細胞生存数を測定した。
　結果を図２９に示す。なお、図２９の縦軸は450nmの吸光度である。この結果、miR-4711-5pのトランスフェクションを行った場合に最も高い増殖抑制効果が認められた。
試験例２１：細胞増殖試験（患者から採取した大腸癌細胞を用いた検証）
　ステージII及びIIIの患者５名（Pt.28、Pt.36、Pt.40、Pt.41、及びPt.45）から採取した大腸癌細胞を用いて、細胞増殖試験を行った。本試験は、大阪大学病院の倫理委員会の許可を得た上で、その許可の下で、インフォームドコンセントが得られた大腸癌患者５名から採取した大腸癌細胞を用いて行った。各患者から採取された大腸癌細胞のスフェロイドをtrypLE express(Invitrogen)と共に37℃で30分間インキュベートすることにより、単一の大腸癌細胞に解離させた。得られた単一の大腸癌細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに4.0×103 cells/wellとなるように播種し、終夜培養を行った後に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてmiR-4711-5p、miR-34a、及びネガティブコントロールのmiRNA（NC、配列番号２）をトランスフェクションした。トランスフェクションから72時間後に、細胞の状態を観察すると共に、cell counting kit-8(同仁化学研究所)を用いて、GloMax-Multi+Detection System(Promega)で細胞生存数を測定した。
　細胞の状態を観察した結果を図３０に示し、細胞生存数を測定した結果を図３１に示す。この結果、miR-4711-5pは、大腸癌患者から得られた大腸癌細胞に対する増殖抑制効果が、miR-34a及びネガティブコントロールに比べて有意に高い（p<0.01ｐ）ことが確認された。
＜総合考察＞
　前記試験例１～９の結果から、以下の点が明らかになり、miR-4711-5pには抗腫瘍効果があることが確認された。
(1) KLF5に対するmiRNAの中でもmiR-4711-5pは、癌細胞の生存率を効果的に低下させ、癌細胞中のKLF5の発現を抑制できる。
(2) miR-4711-5pは、KLF5の3'UTRに結合する。
(3) miR-4711-5pは、癌細胞の増殖、浸潤、及び遊走を抑制できる。
(4) miR-4711-5pは、癌細胞のアポトーシスを誘導できる。
　また、前記試験例１０～１２の結果から、以下の点が明らかになり、miR-4711-5pには癌細胞の幹細胞性を低下させることが確認された。
(5) miR-4711-5pは、癌幹細胞の幹細胞マーカーの発現を抑制できる。
(6) miR-4711-5pは、ROS活性が高い癌細胞の割合を増大させる。
(7) miR-4711-5pは、癌細胞のスフェアーの形成を抑制できる。
　また、前記試験例１３～１７の結果から、以下の点が明らかになり、miR-4711-5pには癌細胞の細胞周期におけるG1期からS期への移行を抑制できることが確認された。
(8) miR-4711-5pは、G0/G1期の癌細胞の割合を増加させる。
(9) miR-4711-5pによってG1期からS期への移行が抑制されるメカニズムの１つは、miR-4711-5pが直接的に標的とするTFDP1のダウンレギュレーションである。
(10)　miR-4711-5pによってG1期からS期への移行が抑制されるメカニズムの１つは、miR-4711-5pが直接的に標的とするMDM2のダウンレギュレーションである。
　試験例１８及び１９の結果から、miR-4711-5pは、in vivoでも抗腫瘍効果を奏し、正常組織に対する副作用は認められないことは確認された。
　試験例２０及び２１の結果から、miR-4711-5pは、抗腫瘍効果が報告されているmiR-34aよりも優れた抗腫瘍効果があり、大腸癌患者から摘出された大腸癌細胞に対しても実際に優れた抗腫瘍効果を奏することが確認された。

Claims (10)

  1. 　miR-4711-5pを有効成分として含む、癌治療剤。
  2. 　miR-4711-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、請求項１に記載の癌治療剤。
  3. 　miR-4711-5pが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
  4. 　miR-4711-5pを有効成分として含む、癌幹細胞の増殖抑制剤。
  5. 　miR-4711-5pの癌治療剤の製造のための使用。
  6. 　癌の治療のための処置に使用される、miR-4711-5p。
  7. 　miR-4711-5pを癌患者に治療有効量投与する、癌の治療方法。
  8. 　miR-4711-5pの癌幹細胞の増殖抑制剤の製造のための使用。
  9. 　癌幹細胞の増殖を抑制するための処置に使用される、miR-4711-5p。
  10. 　miR-4711-5pを癌患者に治療有効量投与し、癌幹細胞の増殖を抑制させる、癌幹細胞の増殖抑制方法。
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