WO2020256286A1 - 무세포화 처리방법 - Google Patents

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세르게브나 체르노노소바베라
비타레브나 체레파노바안나
알레산드로비치 라스카조브게오르기
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    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a method for acellularization of tissues, and in particular, by treating relatively thin flat or tubular non-parenchymal tissues such as pericardium, small intestine, blood vessels, dermis, etc. to have acellular and non-immunogenic properties, and collagen and
  • the present invention relates to a method for filling with matrix proteins such as elastin and having high density, abrasion resistance, high stiffness, excellent bio-blood compatibility, and excellent resistance to mineralization and peeling, and a cell-free treated tissue.
  • Atherosclerosis is the most common disease in humans, leading to ischemic tissue lesions. To treat it, cardiovascular components such as arteries, veins, and heart valves need to be replaced. On the other hand, this is solved through the operation of replacing the valve with a mechanical or biological artificial valve.
  • Bio-prosthetic valves are generally composed of lobules and skirts when used for delivery via a vascular conduit, or via a catheter. Bio-artificial valves have many advantages over mechanical valves, including a low risk of complications due to thrombus formation, but loss of mechanical properties and calcification (mineralization) are often problematic.
  • Non-Patent Document 3 Theory and Practice of Histological Techniques, edited by Bancroft and Stephens, Churchill Livingstone, Edinburgh (1990)
  • the present invention further comprises, after step (ii), washing the tissue obtained in step (ii) with an isotonic solution containing DNAase or RNAase, preferably PBS, in order to further remove DNA and RNA from the tissue. can do.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • FIG. 2 shows the results of examining the effect of acellularization treatment on the surface structure of the porcine pericardium with an electron microscope.
  • Figure 2A is the pericardium 1 before treatment
  • Figure 2B is the opposite side of the pericardium 1 before treatment
  • Figure 2C is the pericardium 1 after treatment
  • Figure 2D is the opposite side of the pericardium 1 after treatment
  • Figure 2E is the pericardium 2 before treatment
  • Figure 2F is The opposite side of pericardium 2 before treatment
  • FIG. 2G shows the opposite side of pericardium 2 after treatment with Folch reagent
  • FIG. 2H shows the opposite side of pericardium 2 after treatment with Folch reagent.
  • human umbilical vein endothelial cells were cultured on the surface of the pericardium for the cytotoxicity test of the acellularized bovine and porcine pericardium.
  • the cells were inoculated at an amount of 10,000 cells/cm 2 , and cultured for 2 days in IM DMEM containing 10% fetal calf serum (FBS).
  • FBS fetal calf serum

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Abstract

본 발명은 심낭, 혈관 및 다른 막 유사 생체 조직 등을 무세포화 처리하여, 역학적 성질의 손실, 무기화 및 면역 반응성에 내성을 갖도록 하는, 인체 수술을 위한 이종 생체 조직의 무세제 무세포화 처리방법 및 무세포화 처리된 조직을 제공하고자 한다. 본 발명에 따라 무세포화 처리된 조직은 처리되지 않은 조직보다 생체 내에서 석회화가 감소하고, 혈액적합성 및 생체적합성이 향상되며, 조직의 두께가 감소하고, 인장 강도 및 꼬임 저항 등이 증가하는 우수한 효과가 있다.

Description

무세포화 처리방법
본 발명은 조직의 무세포화 처리방법에 관한 것으로, 특히 심낭, 소장, 혈관, 진피 등과 같은 비교적 얇은 편평 또는 관상의 비실질 조직을 처리하여, 무세포성 및 비면역원성의 성질을 갖게 하고, 콜라겐 및 엘라스틴 등 매트릭스 단백질로 채워지도록 하며, 고밀도, 내마모성, 고강성, 우수한 생체·혈액 적합성, 및 무기화·박리에 대한 우수한 저항성을 지니게 하는 방법 및 그 무세포화 처리된 조직에 관한 것이다.
죽상 동맥 경화증은 허혈성 조직 병변으로 이어지는, 사람에게 가장 흔한 질병으로, 이를 치료하기 위해서는 동맥, 정맥, 심장 판막 등과 같은 심혈관계 구성의 교체가 필요하다. 한편, 이는 판막을 기계 또는 생체 인공 판막으로 교체하는 작업을 통해 해결된다. 생체 인공 판막은 일반적으로 소엽 및 혈관 도관, 또는 카테터 경유 전달에 사용되는 경우 소엽 및 스커트로 구성된다. 생체 인공 판막은 혈전 형성으로 인한 합병증 위험이 낮다는 점을 포함하여 기계 판막보다 많은 장점이 있지만, 역학적 성질의 손실 및 석회화(무기화)가 문제되곤 한다. 석회화는 현재 사용되는 생체 인공 심장 판막의 예상 수명에 중요한 제한 요소로서, 소엽의 농축, 수축 및 이동을 감소시키고 협착 등을 유발할 수 있다. 기능적으로 손상된 생체 인공 판막에 대한 치료는 새로운 판막으로의 교체인 경우가 대부분이어서, 생체 인공 심장 판막의 짧은 유효 수명은 환자에게 심각한 의학적 문제이자 의료 시스템의 재정적 손실이 된다. 또한, 무세포화 처리된 인공 혈관의 기계 부하 손실로 인해 동맥류가 발생하는 경우도 있다. 이러한 특성은 교체 판막 및 혈관의 내구성을 상당히 제한하기 때문에, 이를 해결하는 것은 중요한 과제이다.
이에 대해, 특허문헌 1 에서는 생체 조직을 완충 용액에 노출시켜 무세포화 처리하는 방법이 제안된바 있다. 그러나 이와 같은 무세포화 처리방법에도 여전히 역학적 성질의 손실 및 석회화가 문제된다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 미국 공개특허공보 US 5,595,571
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Leesson-Dietrich et al, J. Heart Valve Disease 4:88 (1995)
(비특허문헌 2) Chernonosova V.S., 2018
(비특허문헌 3) Theory and Practice of Histological Techniques, edited by Bancroft and Stephens, Churchill Livingstone, Edinburgh (1990)
본 발명은 심낭, 혈관 또는 다른 막 유사 생체 조직 등을 무세포화 처리하는 방법, 및 무세포화 처리된 조직을 제공함으로써, 생체 조직의 역학적 성질의 손실 및 무기화를 방지하고, 생체 조직이 면역 반응성에 내성을 갖도록 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따라 무세포화 처리된 조직은 포유류, 특히 인간의 결함 조직의 대체물로 사용하는 것을 목적으로 한다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 심장 판막, 혈관 등을 교체하는 데에 사용할 수 있다.
본 발명은 결함이 있는 생체 조직을 교체하여 포유류를 치료하기 위한 물질의 제조 방법으로서, 결함이 있는 조직은 심장 판막, 동맥, 정맥, 횡격막, 심낭, 근막, 경막 또는 고막으로부터 선택되고, 상기 물질은 무세포화 처리되고 고정된 생체 조직을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 무세포화 처리된 조직의 제조방법 및 그로 인해 제조된 조직을 제공한다:
(i) 포유류로부터, 심장 판막, 동맥, 정맥, 횡격막, 심낭, 근막, 경막 또는 고막으로부터 선택된 조직을 수득하는 단계;
(ii) 상기 수득된 조직을 세척액으로 세척하는 단계;
(iii) 상기 세척된 조직을, 막관통 액체 유동 장치에 설치하는 단계;
(iv) A260 광학 밀도가 0.1 미만이 될 때까지, 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 완충 용액으로 조직을 세척하는 단계;
(v) A260 광학 밀도가 0.05 미만이 될 때까지, 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 물로 조직을 세척하는 단계;
(vi) 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 이관능성 화합물을 포함하는 용액으로 조직을 세척하는 단계;
(vii) 조직을 막관통 액체 유동장치에서 꺼낸 뒤, 2 내지 10 kg/cm2 압력 하에서 조직을 고정시키는 단계; 및
(viii) 조직을 세척하는 단계.
본 발명에 따라 무세포화 처리된 조직은 처리되지 않은 조직보다 생체 내에서 무기화작용(예: 석회화)이 감소한다. 또한 본 발명에 따른 무세포화 처리는 조직의 면역원성을 감소시키고, 혈액적합성 및 생체적합성을 향상시킨다. 또한 본 방법은 조직의 두께를 감소시키고, 인장 강도 및 꼬임 저항 등을 증가시킨다.
본 발명에 따라 무세포화 처리된 조직은, 세제를 사용하여 무세포화 처리된 조직보다 세포외기질의 손상 및 콜라겐, 엘라스틴 및 글리코사미노글리칸(GAG)의 소실이 감소한다.
도 1은 생체 조직의 막관통 액체 유동장치를 나타낸다. 구체적으로, 도 1의 1은 안전 밸브; 2는 추가 압력 입력장치; 3은 과압 하에서 액체 저장 용기; 4는 생체 조직을 설치하는 다공성 지지체; 5는 심낭을 통과 한 액체의 수집기; 6은 액체의 배출구를 나타낸다.
도 2는 무세포화 처리가 돼지 심낭의 표면 구조에 미치는 영향을 전자현미경으로 검사한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 2A는 처리 전 심낭 1; 도 2B는 처리 전 심낭 1의 반대편; 도 2C는 처리 후 심낭 1; 도 2D는 처리 후 심낭 1의 반대편; 도 2E는 처리 전 심낭 2; 도 2F는 처리 전 심낭 2의 반대편; 도 2G는 Folch 시약을 사용한 처리 후 심낭 2; 도 2H는 Folch 시약을 사용한 처리 후 심낭 2의 반대편을 나타낸다.
도 3은 무세포화 처리가 소 및 돼지 심낭의 바깥 및 안쪽 표면에 미치는 영향을 전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 3A는 처리 전 소 심낭, 도 3B는 처리 후 소 심낭, 도 3C는 처리 전 돼지 심낭, 도 3D는 처리 후 돼지 심낭을 나타낸다.
도 4는 무세포화 처리 전(A) 및 후(B)의 소 심낭을 조직학적으로 관찰한 결과를 나타낸다. 조직을 헤마톡실린으로 염색하고, 400배율로 관찰하였다.
도 5는 무세포화 처리된 소 및 돼지 심낭에서 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를 배양한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 무세포화 처리된 조직의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 포유류로부터, 심장 판막, 동맥, 정맥, 횡격막, 심낭, 근막, 경막 또는 고막으로부터 선택된 조직을 수득하는 단계;
(ii) 상기 수득된 조직을 세척액으로 세척하는 단계;
(iii) 상기 세척된 조직을, 막관통 액체 유동 장치에 설치하는 단계;
(iv) A260 광학 밀도가 0.1 미만이 될 때까지, 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 완충 용액으로 조직을 세척하는 단계;
(v) A260 광학 밀도가 0.05 미만이 될 때까지, 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 물로 조직을 세척하는 단계;
(vi) 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 이관능성 화합물을 포함하는 용액으로 조직을 세척하는 단계;
(vii) 조직을 막관통 액체 유동장치에서 꺼낸 뒤, 2 내지 10 kg/cm2 압력 하에서 조직을 고정시키는 단계; 및
(viii) 조직을 세척하는 단계.
본 발명에서 무세포화 처리는 생체 조직 내 세포를 제거하는 절차이다. 바람직하게는 조직이 본질적으로 무세포화 될 수 있고, 여기서 "본질적으로"는 자연 발생 생체 조직보다 적어도 95% 적은 세포를 갖는다는 것을 의미한다. 본질적 무세포화 판단시, 생체 조직에 고유한 세포만 계수한다. 적혈구 및 혈소판을 포함한 혈액 매개 세포는 물론 다른 생물체의 세포도 포함되지 않는다.
본 발명에서 조직은 인간 또는 동물에 이식하는데 적합한 생체 조직을 의미한다. 조직은 인체 또는 비인체(예: 소, 돼지 또는 기타)의 것일 수 있다. 바람직하게는, 조직은 소 또는 돼지의 것일 수 있다. 바람직하게는, 조직은 신선한 것이 선호된다. 조직은 냉동 보존될 수 있지만, 이 경우 신선한 조직에 비해 무세포화 처리된 후 역학적 성질이 다를 수 있다. 본 발명은 심낭을 예시로 들고 있지만, 무세포화 처리방법은 심장 판막, 근막, 동맥, 정맥, 횡격막, 탯줄, 장간막, 경막 또는 고막을 포함하는 다른 조직에도 적용 가능하다.
상기 단계 (i) 에서 조직의 수득은 당업자에게 공지된 공급원으로부터 이루어진다. 예를 들어, 적절한 품질의 생체 조직 제공을 보증하는 검사를 받는 도살장에서 습득한 동물에서 조직을 얻을 수 있다. 생체 조직은 반드시 무균 조건 하에서 수득할 필요는 없지만, 오염을 줄이기 위해 깨끗한 조건 하에서 수득하는 것이 바람직하다. 생체 조직을 수득한 후, 조직은 약 3 내지 10 ℃의 온도 범위를 갖는 완충 용액에 저장될 수 있다. 상기 용액의 pH 범위는 약 7.0 내지 7.8 일 수 있다. 상기 용액의 온도 및 pH는 생체 조직의 신선한 상태를 보존하도록 선택될 수 있다. 따라서, 특정 완충 용액 및 조건의 경우, pH 및 온도는 상기 범위를 벗어날 수 있다. 생체 조직은 수일에서 수주에 이르는 장시간 동안 저장될 수 있다. 바람직하게는, 생체 조직은 조직의 구조적 성분의 최대 보존을 위해 수확 된지 몇 시간 내에 다음 단계를 시작할 수 있다. 보다 바람직하게는, 조직은 수확 후 2 내지 10 시간 이내에 다음 단계를 시작할 수 있다.
상기 단계 (ii) 에서 세척은 생체 조직의 표면 부착 혈액성분을 제거하고 오염 물질의 양을 줄이며 조직이 신선한 상태를 유지하도록 세척액을 처리하는 과정이다. 본 발명에서 세척액은 당업자에게 공지된 다양한 세척 용액일 수 있고, 바람직하게는 세척액은 완충 용액이다. 보다 바람직하게는, 세척액은 PBS이다. 또한, 상기 세척액은 정균제를 포함할 수 있으며, 정균제는 당업자에게 공지된 것을 사용할 수 있다. 세척은 혈액 세포의 흔적이 완전히 제거될 때까지 약 0 내지 30 ℃의 온도에서 실행할 수 있다. 바람직하게는, 약 0 내지 20 ℃의 온도에서 실행한다. 세척은, 예를 들어, 정균제가 있는 무균 조건에서 PBS로 이루어질 수 있다. 세척 후 곧바로 또는 1일 내에 다음 단계를 시작할 수 있다.
본 발명은, 조직에서 DNA 및 RNA를 추가로 제거하기 위해, 단계 (ii) 후에, 단계 (ii) 에서 수득된 조직을 DNAase 또는 RNAase를 함유하는 등장액, 바람직하게는 PBS로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 (iii) 에서 막관통 액체 유동 장치는 무세포화 처리를 위한 막관통 액체 유동장치(device for transmembrane flow of liquid) 혹은 교차류 장치(device for cross flow)로서, 도 1 에 예시되어 있으며, 통상적으로 관통 구멍이 있는 지지체, O-링, 압력 하에서 작동할 수 있는 액체 저장조, 안전 밸브 및 부속품으로 구성되어 있다. 막관통 액체 유동 장치에, 다공성 지지체에 설치한 조직을 넣고, 교차류로 액체를 통과시키는 방식으로 상기 장치를 사용하며, 이로써 조직의 두께에 균일하게 액체가 도달하는 효과를 얻을 수 있고, 사용하는 액체를 적절히 선택하여 조직을 다당류, 단백질, 항응고제 등으로 채울 수 있다.
상기 단계 (iv) 에서 세척은 A260 광학 밀도가 0.1 미만이 될 때까지 완충 용액으로 조직을 세척함으로써 수용성 조직 및 아넥신, 알부민, 면역 글로불린 등의 혈청 단백질을 제거하고, 압력 스트레스에 의해 세포를 일부 용해시키는 절차이다. 완충 용액은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 완충 용액일 수 있다. 여기에는 다양한 인산염 및 비인산염 완충 용액이 포함될 수 있다. 바람직한 완충 용액은 인산 완충 용액, 예를 들어 소듐 포스페이트 일염기성 및 이염기성 완충 용액 및 포스페이트 시트레이트 완충 용액을 포함한다. 보다 바람직하게는, 완충 용액은 PBS이다. 완충 용액은 조직의 두께에 따라 조직의 10 cm2 당 5 내지 10 ml를 공급하고, 모든 완충 용액이 조직을 통과할 때까지 조직 두께 및 다공성/밀도에 따라 0.3 내지 2 MPa의 압력을 가할 수 있다. 상기 단계를 0 내지 37 ℃의 온도에서, 바람직하게는 2 내지 6 ℃의 온도에서, 및 질소 대기에서 통상 5 내지 24 시간 동안 수행할 수 있다. 단계 (iv) 가 끝난 후 압력을 완화한다.
상기 단계 (v) 에서 세척은 A260 광학 밀도가 0.05 미만이 될 때까지 물로 조직을 세척함으로써 저장성 처리를 통해 세포를 완전히 용해하고, 생체 고분자 및 세포기관을 제거하는 절차이다. 바람직하게는, 물은 발열원 제거수(pyrogen-free water)일 수 있다. 물은 조직의 두께에 따라 조직의 10 cm2 당 5 내지 10 ml를 공급하고, 모든 물이 조직을 통과할 때까지 조직 두께 및 다공성/밀도에 따라 0.3 내지 2 MPa의 압력을 가할 수 있다. 상기 단계를 0 내지 37 ℃의 온도에서, 바람직하게는 2 내지 6 ℃의 온도에서, 및 질소 대기에서 통상 5 내지 24 시간 동안 수행할 수 있다. 단계 (v) 가 끝난 후 압력을 완화한다.
상기 단계 (iv) 및 (v) 에서 이루어지는 A260 광학 밀도 또는 흡광도의 측정은 당업자에게 공지된 방식으로 공지된 자외선분광기를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명은, 조직의 지방 제거, 석회화 감소 및 알데히드/시프 그룹의 폐색/축소의 감소를 위해, 단계 (v) 후에, 클로로포름, 물 및 에탄올을 함유하는 용액으로 단계 (v) 에서 수득된 조직을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 용액은 20 내지 30 질량%의 클로로포름, 20 내지 30 질량%의 물, 및 45 내지 50 질량%의 에탄올을 함유한다. 보다 바람직하게는, 상기 용액은 25 질량%의 클로로포름, 25 질량%의 물, 및 50 질량%의 에탄올을 함유하는 Folch 용액이다.
상기 단계 (vi) 에서 세척은 이관능성 화합물을 포함하는 용액으로 조직을 세척함으로써 가교반응을 유도하는 절차이다. 이관능성 화합물은 가교제(cross-linking agent)의 역할을 하는 화합물로, 바람직하게는 비스 에폭시 화합물일 수 있고, 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜-디글리시딜에테르(PEG-DGE) 또는 글루타르알데히드(GA)일 수 있다. 이관능성 화합물을 포함하는 용액은 이관능성 화합물을 0.5 내지 2 질량% 포함할 수 있다. 또한, 단계 (vi) 에서 이관능성 화합물을 포함한 용액을 10 내지 200x의 부피비로 처리할 수 있으며, 예를 들어, 100x의 부피비로 처리할 수 있다. 이관능성 화합물을 포함한 용액은 조직의 두께에 따라 조직의 10 cm2 당 5 내지 10 ml를 공급하고, 모든 용액이 조직을 통과할 때까지 조직 두께 및 다공성/밀도에 따라 0.3 내지 2 MPa의 압력을 가할 수 있다. 상기 단계를 0 내지 37 ℃의 온도, 바람직하게는 2 내지 6 ℃의 온도, 및 질소 대기에서 통상 5 내지 24 시간 동안 수행할 수 있다. 단계 (vi) 가 끝난 후 압력을 완화한다.
상기 단계 (vii) 에서 고정은, 조직 분해 및 역학적 성질 손실의 기초가 되는 구멍을 제거하기 위해, 생체 조직을 매끄러운 두 표면, 예를 들어 유리 판 사이에 고정하고 압력을 가하는 절차이다. 바람직하게 압력은 2 내지 10 kg/cm2일 수 있다. 생체 조직은 사용된 이관능성 화합물 및 조직의 형태에 따라 4 시간 내지 4 일 동안 온도 4 내지 25 ℃에 보관할 수 있다.
본 발명은, 조직의 생체·혈액적합성을 향상시키고 석회화를 방지하기 위해, 상기 단계 (vii) 후에, 단계 (vii) 에서 수득된 조직을 이관능성 화합물을 포함하는 용액 및 단백질/다당류로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질/다당류는 인간 혈청 알부민, 인간 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 인간 성장 인자, 히루딘, 비발리루딘 또는 헤파린을 포함하는 용액이다.
본 발명은, 상기 단계 (vii) 후에, 단계 (vii) 에서 수득된 조직을 아미노산을 포함하는 용액으로 세척한 후, 환원제로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노산은 글리신이다. 바람직하게는, 환원제는 소듐 보로하이드라이드 또는 소듐 보로-시아노-하이드라이드이다.
상기 단계 (viii) 에서 세척은 세척액으로 생체 조직을 세척하는 절차이다. 예를 들어, 1000x 부피비 이상의 세척액을 2 내지 10 번 교환하거나, 막관통 액체 유동 장치에서 세척액으로 조직을 세척할 수 있다. 세척액은 상기 단계 (ii) 에 기재된 세척액을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 감광제의 존재 또는 부재하에, 감마 또는 전자 빔 조사, 에틸렌 옥사이드, b-프로피오락톤, 포비돈-요오드 또는 UV 조사를 통해 멸균할 수 있다.
본 발명에서, 혈액 적합성을 증가시키는 약제, 혈소판 조절제 및 항생제를 당업자에게 공지된 방법에 따라 추가로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1
용액 준비
인산완충식염수(PBS) (시그마, cat n. P4417-100TAB): 권장량대로 발열원 제거수(pyrogen-free water)에 1 정을 용해하였다.
1M CaCl2 : 탈이온수 20 ml에 CaCl2 2.22 g을 넣고 4 ℃에서 보관하였다.
1M MgCl2 : 탈이온수 10 ml에 MgCl2 2.033 g을 넣고 4 ℃에 보관하였다.
DNAse I 용액 : 4.9 ml의 멸균수에 10 mg DNAse I (시그마 D5025) (최종 농도 0.2 mg/ml), 50 ul 1 M MgCl2 (최종 농도 5 mM) 및 50 ul 1 M CaCl2 (최종 농도 5 mM)를 냉각 표기된 1.5 ml 미세 튜브에 1 ml 분주하여 -20 ℃에 냉장 보관하였다.
RNAse A 용액 : 10 ml의 멸균수에 100 mg의 RNAse A를 넣고 혼합하여 용해하고, 미리 냉각 된 1.5 ml 미세 튜브 20 개에 500 ml 씩 분주하고 -20 ℃에서 보관하였다.
Nuclease 용액 : PBS 98 ml, 1 M MgCl2 (최종 농도 3 mM), 96 ml 1 M CaCl2 (최종 농도 0.1 mM)에 2 mg/ml DNAse I 1 ml, 10 mg/ml RNAse A 1 ml를 첨가하고, 0.2 마이크론 필터로 필터 살균하였다.
폴리에틸렌글리콜-디글리시딜에테르(PEG-DGE) 2% 용액 : 0.2 g 폴리에틸렌글리콜-디글리시딜에테르)(시그마)를 발열원 제거수 9.8 ml 와 혼합하였다.
글루타르 알데히드(GA) 0.25 % : 25 % Ga 용액 (시그마) 1 ml를 발열원
제거수 9 ml와 혼합하였다.
단백질 용액 : 1 내지 10 mg/ml 농도로 준비하고 사용 직전에 이관능성 용액과 혼합하였다.
돼지 심낭의 무세포화
1 일째
돼지 심장은 시판되는 표준 체중 돼지(>120 kg)에서 수득하였다. 무균 PBS에서 헹군 후 심낭을 꺼내어 4 ℃의 무균 PBS 조건에서 운송하였다. 모든 심낭은 도축 6 시간 이내에 도착하였다. 심낭의 남아있는 혈전 및 혈액 세포를 제거하기 위해 PBS를 5 내지 6 번 교체하였다. 신선한 심낭(추출 후 4 내지 6 시간 이내)을 무세포화 처리를 위한 막관통 액체 유동 장치의 다공성 지지대에 놓고, 나머지 부분은 도려내었다. 그 후 심낭을 포함한 지지대를 장치에 설치하였다. 탱크는 조직의 두께에 따라 조직 10 cm2 당 5 내지 10 ml의 PBS로 채웠다. 그런 다음 모든 PBS가 조직을 통과 할 때까지 조직 두께와 다공성/밀도에 따라 0.3 내지 2 MPa의 압력을 가하였다. 이 과정은 A260 광학 밀도가 0.1 미만이 될 때까지 온도 4 ℃에서 실시하였다.
2 일째
압력을 완화한 후, PBS와 동일한 조건으로 발열원 제거수를 첨가하고, 물이 전부 통과할 때까지 다시 압력을 가하였다. 조직 두께 및 다공성/밀도에 따라 모든 PBS가 조직을 침투해 스며들 때까지 0.3 내지 2 MPa의 압력을 가하였다. 이 과정은 A260 광학 밀도가 0.05 미만이 될 때까지 온도 4 ℃에서 실시하였다.
3 일째
압력을 완화한 후, PBS와 동일한 조건으로 2 %의 PEG-DGE 용액을 첨가하고, 용액이 전부 통과할 때까지 다시 압력을 가하였다. 조직 두께 및 다공성/밀도에 따라 모든 PBS가 조직을 침투해 스며들 때까지 0.3 내지 2 MPa의 압력을 가하였다. 이 과정은 온도 4 ℃에서 밤새 실시하였다.
4-7 일째
편평한 유리 조각에 심낭을 곧게 펴고 두 번째 유리판으로 덮고
2 내지 10 kg/cm2로 눌렀다. 이를 100 % 습도 챔버에서 4 일 동안 온도 4 내지 6 ℃에서 보관하였다.
8-9 일째
과량의 시약을 제거하기 위해 심낭을 4 ℃에서 온화한 교반하에 4 번 교체한 과량의 PBS에 배양하였다.
제조예 2
용액 준비
제조예 1 과 동일한 용액에 하기의 용액을 추가로 사용하였다.
Folch 용액 : 25 질량%의 클로로포름, 25 질량%의 물, 및 50 질량%의 에탄올을 혼합하였다.
돼지 심낭의 무세포화
제조예 1 과 동일한 과정에 2일째 단계 이후 상기 Folch 용액으로 조직을 세척하는 단계를 추가하였다.
실시예 1
조직 샘플에서 칼슘 측정 방법
회수한 조직을 칼슘 및 마그네슘이 없는 무균 PBS로 각각 10 ml로 세 번 씻어 내었다. 칼슘은 떼어낸 판의 소엽(leaves) 및 스커트(skirt) 30 지점의 X-선 광전자분광법(XPS)를 통해 정량화하였다. XPS 분석은 PHOIBOS-150 MCD-9 반구형 분석기 및 비-단색성 MgK 소스가 장착 된 SPECS 전자 분광계(SPECS GmbH, Germany)로 수행하였다. 샘플의 열적 열화를 막기 위해 X-레이 건을 샘플 홀더로부터 30mm 떨어진 곳에 위치시키고 100 W에서만 작동하였다. 스펙트럼은 50 eV(조사 스캔) 및 10 eV(고해상도 스캔)로 설정된 통과 에너지(pass energy)로 기록하였다. 측정 전에 에너지 스케일을 금 및 구리 박막의 Au4f7/2(84.00 eV) 및 Cu2p3/2(932.67 eV) 피크를 사용하여 보정하였다. 스펙트럼 획득 중 잔류 가스 압력은 3Х10-7 Pa 미만이었다. 샘플을 3M® 전도성 구리 양면 접착 테이프를 사용하여 강철 샘플 홀더에 장착하였다. XPSPEAK 소프트웨어 4.1 버전 및 원자 감도 인자를 사용하여 데이터를 정량적으로 처리하였다. 초기 심낭와 무세포화 처리된 심낭을 비교하였으며 석회화 수준은 대조군을 고려하여 나타내었다.
생체 역학 테스트
사각형 모양의 심낭 샘플을 사용하여 강성 데이터를 획득하였다. 각 샘플의 두께는 컨덕턴스 회로와 디지털 캘리퍼에 부착된 저질량 핀을 사용하여 수행된 세 차례 측정의 평균으로부터 얻었다. 모든 테스트는 실온에서 젖은 샘플을 사용하여 수행하였다. 연속 하중 연신율 곡선(load-elongation curve)이 겹쳐 질 때까지(~20 사이클) 각 샘플을 150 g의 하중으로 사전 조정하였다. 그런 다음 조직 쇠퇴에 대한 단축 한계인장강도시험을 수행하였다. 각 조직 유형의 적어도 5 개의 표본을 검사하였다.
구체적으로, 비특허문헌 1 에 개시된 소엽 생체역학 연구를 반영하여, 최대 150 g의 하중을 10 mm/min의 신장 속도로 조직에 가하여 저하중 신율로 응력변형률 관계를 판단하였다.
SEM 및 조직 화학
평활근 액틴 및 조직 적합성 항원과 같은 세포 특이적 마커를 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 사용할 수 있으며, 이러한 마커가 없는 것이 무세포화의 추가 지표이다. 신선한 심낭 및 무세포화 처리된 심낭의 샘플을 4 ℃에서 2 % 포르말린으로 고정시켰다. 주사 전자 현미경 검사를 위해 에탄올 용액 시리즈(50 %, 70 % 및 96 % 에탄올)에서 심낭 조각들을 탈수시킨 후 헥사메틸디실라잔(Sigma, USA)으로 처리하였다. 이 파편들을 전도성 접착 테이프로 고정시키고, 10 nm 금 박막으로 스퍼터-코팅하고, 비특허문헌 2 에 개시된 대로 JSM-6460 LV(Jeol, Japan) 현미경을 사용하여 검사했다. 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 파라핀 슬라이드를 준비하고 처리하여 조직학적 평가에 사용하였다. 5 내지 10 mm 두께의 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하거나 von Kossa(비특허문헌 3 참조) 염색에 의해 칼슘을 특정하여 염색하였다.
통계
독립적인 t-테스트에 의해 생체역학적 파라미터 군 평균의 통계적 차이를 평가하였다. 유의차 값으로 0.05 의 p값을 선택하였다. 칼슘 데이터는 IBM-PC, SPSS-PC에 대한 통계 프로그램으로 수행 된 ANOVA 테스트에 따라 분석하였다.
결과
무세포화 처리과정에서 소실된 물질
DNA의 손실은 UV 분광학 및 형광 염료를 사용하는 생화학적 방법으로 추정할 수 있다. 심낭에 PBS를 처리하는 즉시 세포 파괴와 260 nm에서 흡광도의 증가로 이어졌다. 형광염료 Hoechst 33258를 통해 얻은 DNA 농도에 관한 데이터는 심낭 조직의 cm2당 약 6000 개의 세포가 있음을 입증한다. 그 결과를 하기 표 1 에 나타내었다.
심낭의 역학적 성질
무세포화 처리된 조직에서, 세포 용해 후에 남아있는 구멍은 조직을 더 비균질적으로 만들고, 조직 붕괴를 야기할 수도 있다. 이에, 심낭을 두 유리 사이에 2 내지 10 kg/cm2 압력으로 고정시킴으로써 구조를 보다 균일하게 만들고 두께를 보다 감소시켰다. 이는 심장 판막의 카테터 경유 전달 및 기타 응용에 매우 중요한 성질이다. 조직의 고정 절차는 심낭을 통과하는 교차류 액체와 함께 조직의 두께를 최대 1.7 배까지 감소시키는 역할을 하였다(표 1 참조). 무세포화 처리는 조직의 인장 강도 및 봉합사 유지율을 높이고 영률을 소량 감소시켰다. 참고로, 영률(Young's Modulus)은 탄성을 가진 어떤 물체가 변형력에 대해 상대적인 길이가 어떻게 변화하는지를 나타내는 계수를 의미한다.
조직 검사
무세포화 처리는 심낭 내 세포의 완전한 소실 및 구조의 압축을 이루었으나 조직 내 콜라겐 섬유는 유지되는 것으로 확인되었다.
구체적으로, 1 개월 차 무세포화 처리된 돼지 심낭은 조직 매트릭스 내에서 내인성 세포 및 침전물이 없는 것으로 확인되었다. 이 군에서 측정된 조직 칼슘은 60±14 mg/g이었으며, 일부 부분에서만 석회질 침전물이 발견되었다. von Kossa 염색을 사용하여 추가로 검사했을 때 해당 부분이 명확히 드러났다. 특히, 해당 부분에서 칼슘 침전물은 비특이적인 구조에서 나타났다. 대조적으로, 무세포화 처리되지 않고 글루타르알데히드로 고정된 조직의 초기 석회화는 항상 세포핵에서 나타났다.
이식 후 1, 2 및 4 개월이 지남에 따라 석회화되는 부분에 초엽 조직이 포함되는 정도가 점점 증가하는 양상이 확인되었다. 초엽의 중심부는 일찍 석회화되었고, 가장자리는 나중에 석회화되었다. 대동맥 또는 폐동맥 판막 혈관 성분 중 석회화 된 부위는 일반적으로 이식부위의 주변부에 남아 있었으며, 이식부위의 중심부 조직에서 광물화가 관찰되는 경우는 드물었다.
무세포화 처리 과정에서 DNA 및 단백질 손실 등에 대한 데이터 및 무세포화 처리의 영향을 보여주는 심낭의 두께 및 밀도 등을 하기의 표 1 에 나타내었다.
[표 1]
Figure PCTKR2020006514-appb-I000001
*초기 심낭의 날짜 기재
**PBS+ H2O 전체 부분의 UV 흡광도 기재
SEM
무세포화 처리가 돼지 심낭의 표면 구조에 미치는 영향을 전자현미경으로 검사한 결과를 도 2 에 나타내었다. 구체적으로, 도 2A는 처리 전 심낭 1, 도 2B는 처리 전 심낭 1의 반대편, 도 2C는 처리 후 심낭 1, 도 2D는 처리 후 심낭 1의 반대편, 도 2E는 처리 전 심낭 2, 도 2F는 처리 전 심낭 2의 반대편, 도 2G는 Folch 시약을 사용한 처리 후 심낭 2, 도 2H는 Folch 시약을 사용한 처리 후 심낭 2의 반대편을 나타낸다. 이를 통해, 무세포화 처리는 표면 구조에는 큰 영향을 미치지 않지만 조직 내면을 더 평평하게 만든다는 것을 확인하였다.
실시예 2
제조예 1 에 기재된 방법대로 무세포화 처리된 돼지 심낭 및 동일한 방법으로 무세포화 처리된 소 심낭을 제조하였다.
심낭의 역학적 성질 및 SEM
실시예 1 에 기재된 것과 동일한 방법으로 생체 역학 테스트와 SEM 및 조직 화학 검사를 수행하였다. 구체적으로, 무세포화 처리 전후의 소 및 돼지 심낭의 바깥 및 안쪽 표면을 전자현미경(SEM)으로 관찰하였다. 그 결과, 도 3 에 나타낸 바와 같이, 무세포화 처리된 소 및 돼지 심낭의 안쪽 표면은 처리 전에 비해 평평해졌고, 심낭의 바깥 표면은 거의 영향을 받지 않은 것으로 관찰되었다. 구체적으로, 도 3A는 처리 전 소 심낭, 도 3B는 처리 후 소 심낭, 도 3C는 처리 전 돼지 심낭, 도 3D는 처리 후 돼지 심낭을 나타낸다.
또한, 무세포화 처리 전후의 소 심낭을 헤마톡실린으로 염색하고 400배율에서 조직학적으로 관찰하였다. 그 결과, 도 4 에 나타낸 바와 같이, 무세포화 처리 전(A) 및 후(B)로 심낭 조직 내부에는 큰 변화가 없는 것으로 관찰되었다. 구체적으로, 조직의 부패 등 이식장기로 기능하는데 있어 장애가 될만한 변화는 관찰되지 않았다. 한편, 조직의 구조가 더 조밀해진 것이 관찰되었다. 또한, 무세포화 처리로 인해 조직의 인장강도가 증가하는 등 조직이 단단해졌음이 확인되었다.
세포 배양 실험
한편, 무세포화 처리된 소 및 돼지 심낭의 세포 독성 실험을 위해 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를 심낭의 표면에서 배양하였다. 10,000세포/cm2의 양으로 세포를 접종하고, 10%의 송아지 태아 혈청(FBS)을 함유한 IM DMEM에서 2일동안 배양하였다.
그 실험의 결과를 도 5 에 나타내었다. 심낭의 양 표면에 연속되는 단층의 세포층이 형성된 것으로 관찰되었고, 인간 탯줄 정맥 내피 세포들은 조직에 효율적으로 부착되어 빠르게 증식한 것으로 관찰되었다. 즉, 무세포화 처리된 조직은 독성이 없으므로 생체 내에서 이식 장기로 사용될 수 있음이 확인되었다.

Claims (17)

  1. 하기 단계를 포함하는 무세포화 처리된 조직의 제조 방법:
    (i) 포유류로부터, 심장 판막, 동맥, 정맥, 횡격막, 심낭, 근막, 경막 또는 고막으로부터 선택된 조직을 수득하는 단계;
    (ii) 상기 수득된 조직을 세척액으로 세척하는 단계;
    (iii) 상기 세척된 조직을, 막관통 액체 유동 장치에 설치하는 단계;
    (iv) A260 광학 밀도가 0.1 미만이 될 때까지, 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 완충 용액으로 조직을 세척하는 단계;
    (v) A260 광학 밀도가 0.05 미만이 될 때까지, 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 물로 조직을 세척하는 단계;
    (vi) 0.3 내지 2 MPa의 압력 하에서, 이관능성 화합물을 포함하는 용액으로 조직을 세척하는 단계;
    (vii) 조직을 막관통 액체 유동장치에서 꺼낸 뒤, 2 내지 10 kg/cm2 압력 하에서 조직을 고정시키는 단계; 및
    (viii) 조직을 세척하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (ii)의 세척액은 PBS인, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단계 (iv)의 완충 용액은 PBS인, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 단계 (ii) 후에, 단계 (ii)에서 수득된 조직을 DNAase 또는 RNAase를 함유하는 PBS로 세척하는 단계를 더 포함하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단계 (v) 후에, 25 질량% 의 클로로포름, 25 질량% 의 물, 및 50 질량% 의 에탄올을 함유하는 용액으로 단계 (v)에서 수득된 조직을 세척하는 단계를 더 포함하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 단계 (vii) 후에, 단계 (vii)에서 수득된 조직을 이관능성 화합물을 포함하는 용액; 및 인간 혈청 알부민, 인간 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 인간 성장 인자, 히루딘, 비발리루딘 또는 헤파린을 포함하는 용액;
    으로 세척하는 단계를 더 포함하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 단계 (vii) 후에, 단계 (vii)에서 수득된 조직을 아미노산을 포함하는 용액으로 세척을 한 후, 환원제로 세척하는 단계를 더 포함하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 단계 (iv) 내지 (vi)에서 각 단계에 사용되는
    액체는 10cm2 조직 당 5-10 ml인, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 단계 (iv) 내지 (vi)를 0 내지 37 ℃에서 수행하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 단계 (iv) 내지 (vi)를 2 내지 6 ℃에서 수행하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 단계 (iv) 내지 (vi) 를 질소 대기에서 수행하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 단계 (iv) 내지 (vi) 를 각각 5 내지 24 시간 동안 수행하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 이관능성 화합물은 비스 에폭시 화합물인, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 이관능성 화합물을 포함하는 용액은, 폴리에틸렌글리콜-디글리시딜에테르(PEG-DGE) 또는 글루타르알데히드(GA)를 0.5-2 질량% 포함하는 용액인, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 단계 (viii) 는 1000x 부피비 이상의 PBS를 2 내지 10 번 교환하거나, 막관통 액체 유동 장치에서 PBS 로 조직을 세척하는 단계인, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 멸균하는 단계를 추가로 포함하는, 무세포화 처리된 조직의 제조 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된, 무세포화 처리된 조직.
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