WO2020262540A1 - トランスフェクション方法 - Google Patents

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WO2020262540A1
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ultrafine
ultrafine bubble
nucleic acid
aqueous solution
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直之 村田
サーヤン チュアノイ
薫雄 柳井
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention comprises a delivery system of a target substance into an immune cell, which comprises a combination of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles and an ultrasonic generator, and the ultrafine bubble water or aqueous solution.
  • the present invention relates to a preparation for delivering nucleic acid or protein into immune cells, and a method for delivering nucleic acid or protein into the cells by contacting the immune cells with the preparation and treating with ultrasonic waves.
  • Ultrasound has been mainly used as an ultrasonic contrast device in the medical field.
  • Microbubbles which are ultrasonic contrast agents, have brought about breakthroughs in ultrasonic diagnosis.
  • ultrasonic waves have become available for purposes other than diagnosis.
  • non-invasive cancer hyperthermia by focusing ultrasonic energy on the affected area and heating only the affected area has been used for uterine fibroids and prostate gland. It is clinically applied.
  • DDS drug delivery system
  • bubble liposomes in which perfluoropropane is encapsulated in polyethylene glycol (PEG) -modified liposomes have been reported as a gene delivery system to skeletal muscle that combines bubble liposomes and ultrasonic technology (Non-Patent Document 1). ..
  • PEG-modified bubble liposome bubble lipopolyplex having an average particle diameter of 50 to 500 nm, in which a specific morpholino oligomer is bound to the surface and perfluorohydrocarbon is encapsulated inside, the muscle tissue or blood vessel is administered.
  • Non-Patent Document 1 A therapeutic agent for Duchenne muscular dystrophy, which introduces the morpholino oligomer into muscle cells with high efficiency by irradiating muscle tissue with ultrasonic waves from outside the body, has also been reported (Patent Document 1). Furthermore, it has been reported that gas-filled microbubbles and ultrasonic waves can be used for drug and gene delivery to the brain (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 It has been reported that by using perfluoropropane gas as the encapsulating gas, bubble liposomes having a size smaller than that using perfluorobutane gas or nitrogen gas can be obtained (Non-Patent Document 3).
  • bubble lipopolyplex which is a combination of nanobubbles and plasmid
  • the plasmid was introduced into the vascular endothelium or the external position of the blood vessel, and the efficiency of gas encapsulation was increased. It has been reported that the introduction site is different (Non-Patent Document 4).
  • bubble liposomes may cause problems with lipid antigenicity.
  • an output intensity such as 1.5 to 2.5 W / cm 2 , which has a concern about safety, is used for ultrasonic irradiation, which poses a problem in terms of practicality.
  • nanobubble water containing nanobubbles containing no phospholipid and having 2.0 ⁇ 10 8 cells / mL or more has an excellent antibacterial effect (Patent Document 2).
  • the target substance such as nucleic acid or protein was introduced into cells by combining the nanobubble water and ultrasonic waves.
  • CAR-T cells or TCR-T cells into which a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR) derived from a cancer antigen-specific killer T cell has been introduced has been studied. It is progressing rapidly.
  • the current CAR-T cell therapy is ex-vivo CAR-T cells collected from patients using a viral vector such as a lentiviral vector, such as Kymriah (trade name) and Yescarta (trade name) approved in the United States.
  • a general method is to introduce a gene to produce CAR-T cells and administer the CAR-T cells to a patient.
  • this method has a problem that the manufacturing cost is high due to the cost of cell culture and preparation of viral vector and the like. If CAR and exogenous TCR can be selectively introduced into immune cells such as T cells in vivo, preparation in ex vivo becomes unnecessary, and CAR- or TCR-immune cell therapy with low manufacturing cost can be provided. Become. Also, in ex-vivo, if CAR and exogenous TCR can be selectively introduced into immune cells such as T cells without using a viral vector having a high manufacturing cost, the cost for virus survival test and the like becomes unnecessary. It is possible to provide CAR- or TCR-immune cell therapy with low manufacturing cost.
  • An object of the present invention is to provide a novel means for safely and efficiently introducing a target substance such as nucleic acid or protein into an immune cell such as T cell.
  • the present inventors have previously developed nanobubble water having an excellent antibacterial action (see Patent Document 2 above; the International Organization for Standardization (ISO) is 1 ⁇ m (1000 nm). ) Is defined as “ultra fine bubble” (ISO 20480-1), so in this specification, it is referred to as “ultra fine bubble” instead of “nano bubble”). I focused on not including it.
  • the ultrafine bubbles contained in this ultrafine bubble water have an average diameter of 200 nm or less, which is even smaller than the conventional one.
  • the present invention [1] Delivery of a target substance into immune cells, which comprises a combination of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less and an ultrasonic generator. system; [2]
  • the ultrafine bubble aqueous solution is one or more kinds of surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, hydrophilic resins, and the like.
  • a nucleic acid or protein comprising a combination of an ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing an ultrafine bubble containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less is introduced into an immune cell.
  • a preparation for delivery characterized in that an effective amount of the nucleic acid or protein is delivered into immune cells in combination with ultrasonic irradiation;
  • a method for delivering a nucleic acid or protein into the cells which comprises contacting the immune cells with the preparation according to [15] and treating them with ultrasound; Etc.
  • T cells can non-invasively deliver target substances such as nucleic acids and proteins by irradiating ultrasonic waves with an output intensity that does not adversely affect the living body. Since it can be selectively introduced into immune cells such as, a highly safe introduction system can be provided. Since it is not necessary to use liposomes in the system, it is not necessary to add a special additive such as phospholipid, it can be produced at low cost, and there is no problem of antigenicity due to phospholipid. Further, conventionally, ultrafine bubbles are considered to be unsuitable for cell transfection because the cell membrane is severely damaged when crushed as compared with microbubbles.
  • ultrafine bubbles are considered to be unsuitable.
  • the efficiency of introducing the target substance into the cell can be significantly increased as compared with the case of using the microbubbles.
  • the ultrafine bubbles having an average diameter of 200 nm or less are stable for a long period of time in ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution.
  • the system of the present invention comprises an ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less, and an ultrasonic generator in combination into an immune cell.
  • a delivery system for the target substance hereinafter, also referred to as “system of the present invention”.
  • delivery of the target substance into the cell means a substance that is originally difficult to pass through the cell membrane (for example, a compound that is water-soluble and difficult to passively diffuse, a compound having a large molecular weight, a selective transporter, or the like. It means that a compound without a receptor) passes through the cell membrane and translocates into the cell. Therefore, the system of the present invention may deliver the target substance into the cell by any mechanism, and includes, but is not limited to, temporarily forming a hole in the cell membrane.
  • the term "immune cell” means a cell involved in an immune response, such as lymphocytes such as T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and natural killer T (NKT) cells.
  • Granulocytes such as neutrophils, eutrophils, eutrophils, monocytes, macrophages, dendritic cells, etc., or unipotent or pluripotent stem cells or precursor cells capable of final differentiation into them (however, embryos) And other pluripotent or pluripotent stem cells).
  • An “immune cell” is a heterogeneous cell population containing any of the above cells, even if it is a specific isolated immune cell, including a plurality of types of immune cells such as lymphocytes.
  • the lymphocytes can be produced by collecting from, for example, peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood of human or non-human mammals, or by inducing differentiation from stem cells such as iPS cells by a method known per se.
  • an isolated immune cell eg, T cell
  • the lymphocyte can be a lymphocyte present in an individual animal.
  • the "immune cell” is an isolated and purified T cell.
  • the immune cell can be a cell population containing T cells, such as T cells present in an individual animal.
  • T cell is a type of leukocyte found in lymphatic organs or peripheral blood, and means a classification of lymphocytes characterized in that they differentiate and mature mainly in the thymus and express TCR. ..
  • T cells that can be used in various embodiments of the present invention include cytotoxic T cells (CTL) that are CD8 positive cells, helper T cells that are CD4 positive cells, control T cells, and effector T cells. Etc., but cytotoxic T cells are preferable.
  • the target substance delivered into the immune cell using the system of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can impart preferable physiological activity to the immune cell by being delivered into the immune cell, for example.
  • High molecular weight compounds eg, nucleic acids, eg, small RNAs / DNAs such as siRNA (eg, FAM-siRNA, manufactured by Nippon Gene), ssRNA, shRNA, miRNA, S-modified oligo DNA (phosphorothioate, etc.), genes (eg, plasmid DNA, etc.) Proteins (including peptides) (eg, antibodies (eg, IgG (eg, Alexa-IgG, manufactured by Invitrogen)), etc.), polysaccharides (eg, dextran, fluorescein isothiocyanate dextran, etc.), etc.], Low molecular weight compounds (eg, fluorescein, sodium fluorescein, etc.) and the like can be mentioned, but are not
  • the term "ultrafine bubble” may include a gas having a normal atmospheric pressure or a higher pressure, or the inside of the ultrafine bubble may be a vacuum.
  • vacuum means a state of a space filled with a gas having a pressure lower than the normal atmospheric pressure.
  • the "phospholipid-free ultrafine bubble” is an ultrafine bubble in which the shell of the bubble does not form a phospholipid bilayer structure.
  • ultra fine bubble water refers to water containing ultra fine bubbles.
  • the “ultra-fine bubble aqueous solution” refers to an aqueous solution containing ultra-fine bubbles.
  • the aqueous solution constituting the ultrafine bubble aqueous solution is, for example, 1) One or more surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, It contains one or more substances selected from 2) hydrophilic resin and 3) buffer solution as components.
  • the "anionic surfactant” in the present invention examples include sodium lauryl sulfate and the like.
  • the "nonionic surfactant” includes, for example, glycerin fatty acid ester (eg, glycerin monostearate, etc.), sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester (eg, sorbitan monostearate, sorbitan monolaurate, etc.).
  • Polyglycerin fatty acid ester polyoxyethylene (hardened) castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (eg, polyoxyethylene sorbitan laurate (eg, polysorbate 20, etc.), polyoxyethylene sorbitan oleic acid ester (eg, polysorbate) 80 etc.), polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether (eg polyoxyethylene lauryl ether etc.), polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether (eg polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether etc.), poly Examples thereof include oxyethylene alkyl phenyl ether (eg, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, etc.), macrogol, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol (eg, porox summer 407, porox summer 235, porox summer 188, poroxamine, etc.).
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol eg, porox summer 407, porox summer 235,
  • polyoxyethylene sorbitan lauric acid ester eg, polysorbate 20 and the like
  • polyoxyethylene sorbitan oleic acid ester eg, polysorbate 80 and the like
  • polysorbate 20 or polysorbate 80 Particularly preferred is polysorbate 80.
  • the "cationic surfactant” in the present invention include benzalkonium chloride, benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, hexadecyltrimethylammonium bromide, decalinium chloride and the like.
  • the "amphoteric surfactant” in the present invention include cocamidopropyl betaine and cocamidopropyl hydroxysultaine. The above-mentioned surfactant may be used alone or in combination of two or more.
  • the "hydrophilic resin” includes, for example, an acrylic resin (eg, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethylmethacrylate), a vinyl resin (eg, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylethyl ether). ); Polysaccharides (eg, tragant gum, karaya gum, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hyaluronic acid, agarose, curdran, etc.) can be mentioned. Of these, polyvinyl alcohol and hydroxypropyl cellulose are preferable. More preferably, polyvinyl alcohol can be mentioned.
  • the hydrophilic resin may be used alone or in combination of two or more.
  • the "buffer” includes, for example, an acidic buffer (for example, acetate buffer, citrate buffer, diluted Mclivine buffer) or a neutral buffer (for example, 4- (2-hydroxyethyl)).
  • an acidic buffer for example, acetate buffer, citrate buffer, diluted Mclivine buffer
  • a neutral buffer for example, 4- (2-hydroxyethyl)
  • -1-Piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) buffer Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline (PBS)
  • Tris hydroxymethyl aminomethane
  • PBS phosphate buffer
  • a diluted Mclivine buffer solution is preferable.
  • the aqueous solution constituting the "ultrafine bubble aqueous solution” in the present invention is preferably 1 or 2 selected from 1) anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • examples thereof include an aqueous solution composed of more than one type of surfactant and / or 2) a hydrophilic resin.
  • an aqueous solution composed of a nonionic surfactant and / or a hydrophilic resin is preferable.
  • an aqueous solution composed of a nonionic surfactant or the like is also preferable.
  • an aqueous solution composed of 1 or 2 selected from polysorbate 80 and polysorbate 20 and / or 2) polyvinyl alcohol and the like can be mentioned. More preferably, an aqueous solution composed of polysorbate 80 and / or polyvinyl alcohol and the like can be mentioned. In particular, an aqueous solution composed of polysorbate 80 is preferable.
  • examples of the aqueous solution constituting the "ultrafine bubble aqueous solution" include an aqueous solution composed of an ionic (anionic or cationic) surfactant and / or a hydrophilic resin.
  • the "gas" constituting the ultra-fine bubbles in the present invention for example, perfluoro hydrocarbons (e.g., perfluoropropane (C 3 F 8), perfluorobutane, etc.), air, nitrogen, ozone, oxygen, argon, Examples thereof include, but are not limited to, one kind or a mixture of two or more kinds selected from carbon dioxide, helium and the like. Of these, perfluorohydrocarbons (eg, perfluoropropane, perfluorobutane, etc.), air, nitrogen, ozone, oxygen, and argon are preferable.
  • perfluoro hydrocarbons e.g., perfluoropropane (C 3 F 8), perfluorobutane, etc.
  • air, nitrogen, ozone, oxygen, and argon are preferable.
  • it is a perfluorohydrocarbon (eg, perfluoropropane, perfluorobutane, etc.), air.
  • perfluorohydrocarbon eg, perfluoropropane, perfluorobutane, etc.
  • air is used, ultrafine bubbles can be easily produced at low cost. More preferably, air is used.
  • the "ultrafine bubble aqueous solution” in the present invention is preferably one selected from (A) an aqueous solution composed of a nonionic surfactant and / or a hydrophilic resin, and (B) perfluorohydrocarbon, air and the like.
  • an ultrafine bubble aqueous solution composed of ultrafine bubbles composed of two or more kinds of gases can be mentioned. More preferably, (A) an aqueous solution consisting of 1 or 2 selected from polysorbate 80 and polysorbate 20 and / or 2) polyvinyl alcohol, and (B) one selected from perfluorohydrocarbon and air or An ultrafine bubble aqueous solution composed of an ultrafine bubble composed of two kinds of gases can be mentioned.
  • an ultrafine bubble aqueous solution composed of (A) an aqueous solution composed of polysorbate 80 and / or polyvinyl alcohol and (B) an ultrafine bubble composed of perfluorohydrocarbon and / or air
  • A an aqueous solution composed of polysorbate 80 and / or polyvinyl alcohol
  • B an ultrafine bubble composed of perfluorohydrocarbon and / or air
  • an ultrafine bubble aqueous solution composed of an aqueous solution composed of polysorbate 80 and an ultrafine bubble composed of air is preferable.
  • the "ultrafine bubble" in the present invention does not contain amphipathic phospholipids such as liposomes, it is possible to provide a safer preparation without exhibiting antigenicity.
  • the average diameter of the "ultra fine bubble” is about 200 nm or less.
  • the average diameter is preferably, for example, 10 nm to 200 nm, more preferably 50 nm to 200 nm, and more preferably 100 nm to 180 nm.
  • the "mean diameter” means the particle diameter (mode diameter) corresponding to the mode value (maximum value of the number%) of the distribution.
  • the "ultra fine bubble water” or “ultra fine bubble aqueous solution” means water or an aqueous solution in which gas particles (ultra fine bubbles) having a diameter of 1000 nm or less are stably present.
  • the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution in the present invention (hereinafter, also referred to as “ultrafine bubble water or the like in the present invention”) is characterized by containing ultrafine bubbles having an average diameter of about 200 nm or less.
  • the size of the ultrafine bubble is uniform.
  • the "d90 / d10 ratio" when the ultrafine bubble diameters corresponding to cumulative 10% and cumulative 90% from the small diameter side of the ultrafine bubble number reference distribution are d10 and d90, respectively, is preferably 5 or less. , More preferably 4.5 or less.
  • the number of ultrafine bubbles contained in ultrafine bubble water or the like means the number of ultrafine bubbles present in 1 mL of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution, and in the present specification, “ultra fine bubbles”. It is also called “fine bubble density”.
  • the number of ultrafine bubbles contained in the ultrafine bubble water or the like in the present invention is not particularly limited.
  • the lower limit of the “ultra fine bubble density” is, for example, 1.0 ⁇ 10 8 pieces / mL or more, preferably 2.0 ⁇ 10 8 pieces / mL or more, and more preferably 2.5 ⁇ 10 8 pieces / mL or more. ..
  • the upper limit of the "ultra fine bubble density” is, for example, 2.0 ⁇ 10 9 pieces / mL or less, preferably 1.0 ⁇ 10 9 pieces / mL or less.
  • the "ultrafine bubble density" in the present invention is, for example, 1.0 ⁇ 10 8 to 2.0 ⁇ 10 9 pieces / mL, preferably 2.0 ⁇ 10 8 to 1.0 ⁇ 10 9 pieces / mL. more preferably 2.5 ⁇ 10 8 ⁇ 1.0 ⁇ 10 9 cells / mL.
  • Ultrafine bubble diameter (including ultrafine bubble mean diameter; same below), ultrafine bubble number reference distribution (including d90 / d10 ratio; same below), and ultrafine bubble number are scattering of laser light based on Brown motion.
  • Nanosite, LM20, LM10, etc. method based on changes in electrical resistance (eg, Beckman Coulter, Multisizer4, etc.), method based on laser diffraction and scattering method (eg, Shimadzu, SALD-) It can be measured by using a method using Mie scattering (eg, Nippon Denshoku Kogyo, NP-500T, etc.), etc. (7100H, etc.).
  • the ultrafine bubble diameter and the ultrafine bubble number reference distribution in the present invention were measured by using a tracking method (tracking method) using laser light scattering using nanosite (device name LM10) manufactured by Nanosite. Alternatively, the one measured according to it is used.
  • the values of the ultrafine bubble diameter, the number reference distribution of ultrafine bubbles, and the number of ultrafine bubbles are usually measured immediately after the production of ultrafine bubble water or the like, or may be measured after long-term storage.
  • the ultrafine bubble water The value may be a value obtained by measuring the ultrafine bubble diameter, the ultrafine bubble number reference distribution, and the number of ultrafine bubbles immediately before use after sealed storage for a certain period of time after production.
  • the "water” containing ultrapure water (and the “water” used for the “water solution” containing ultrapure water) is not particularly limited, and for example, tap water, deionized water, distilled water, and sterilization. Distilled water, purified water for injection, ultrapure water and the like can be used, but when used as an injection, sterilized distilled water, purified water for injection and the like are preferable.
  • the "aqueous solution" containing ultrafine bubbles is one or more selected from the above-mentioned anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • water further containing any additive commonly used in the pharmaceutical formulation field.
  • additive include electrolytes, excipients, lubricants, binders, disintegrants, solubilizers, suspending agents, dispersants, isotonic agents, soothing agents, preservatives, and the like.
  • antioxidants examples thereof include antioxidants, colorants, sweeteners, pH adjusters, stabilizers, acidulants, flavors, fluidizers and the like.
  • Preferred are pharmacologically acceptable additives, and more preferably one or more additives selected from suspending agents, stabilizers, dispersants, isotonic agents and the like are used. Be done.
  • the above-mentioned additives may be used by mixing two or more kinds in an appropriate ratio.
  • additives one or more surfactants, hydrophilic resins, and buffers selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants
  • Including can be prepared as an aqueous solution of ultrafine bubbles by dissolving it in water in advance as long as it does not affect the formation and stability of ultrafine bubbles, or ultrafine bubbles in water containing no additives. After producing ultrafine bubble water, the additive may be dissolved to prepare an ultrafine bubble aqueous solution.
  • any of uncharged ultrafine bubble aqueous solution, positively charged ultrafine bubble aqueous solution and negatively charged ultrafine bubble aqueous solution can be used, and the type of target immune cells, the surrounding microenvironment, and the type of target substance can be used. Etc., it can be appropriately selected.
  • the ultrafine bubble aqueous solution is used. In some cases, a negatively charged ultrafine bubble aqueous solution is preferable.
  • the ultrafine bubble aqueous solution in another aspect, in the method of the present invention in which the target substance is delivered into the immune cells using the ultrafine bubble aqueous solution and ultrasonic waves, when the target substance is a polymer compound, the ultrafine bubble aqueous solution can be used.
  • a positively charged ultrafine bubble aqueous solution may be preferred.
  • the charge of the ultrafine bubble aqueous solution can be appropriately adjusted by, for example, the pH of the buffer solution used.
  • the pH of the ultrafine bubble aqueous solution is preferably 1 to 4, for example.
  • the pH of the ultrafine bubble aqueous solution is preferably 7 to 14, for example.
  • the microbubbles As a method for producing ultrafine bubble water, after microbubbles (gas particles having a diameter of about 1 to 60 ⁇ m) and ultrafine bubbles are simultaneously generated in water, the microbubbles are levitated and separated to produce only ultrafine bubbles. It is roughly divided into a method of leaving it and a method of directly generating ultrafine bubbles, but at present, the former is the mainstream.
  • the former method is a high-speed swirling liquid flow method in which a gas is crushed by high-speed swirling to generate a large number of microbubbles, and the microbubbles are floated and separated to leave ultrafine bubbles in water.
  • the gas is pressurized and dissolved by supersaturation.
  • a pressure dissolution type is preferably used as a method for producing ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution in the present invention.
  • steps 1) to 3) can be mentioned; 1) in a pressurized container pressurized to about 0.2 to 0.5 MPa by a pressurizing pump, (i) anionic surfactant, non-anionic surfactant.
  • Examples of the ultrafine bubble generator used for producing the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution in the present invention include a pressure dissolution type apparatus (eg, nanoGALF TM manufactured by IDEC, OM4-MD5-045 manufactured by Aura Tech). , Nikuni's micro-bubble generator, etc.), high-speed swirling liquid flow type device (eg, B-Clean's YJ, Aqua Air's micro-bubble generator, Royal Electric's micro blade, etc.) and the like.
  • the ultrafine bubble generator is preferably a pressure melting type device (eg, nanoGALF TM manufactured by IDEC Corporation).
  • one or more interfaces selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants for the production of ultrafine bubble water or ultrafine bubble aqueous solution.
  • an activator a hydrophilic resin and / or a buffer solution, the number of ultrafine bubbles in the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution can be increased.
  • One or more surfactants, hydrophilic resins and / or buffers selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants used in the present invention are used in the present invention.
  • the content of water in water is not particularly limited.
  • the upper limit is preferably 50% (W / V) or less, more preferably 20% (W / V) or less, and further preferably 10% (W / V) or less.
  • the lower limit is preferably 0.01% (W / V) or more, more preferably 0.05% (W / V) or more, and further preferably 0.1% (W / V) or more.
  • (W / V) is assumed to mean g / mL.
  • the ultrafine bubble water, etc. in the present invention produced as described above is sealed and stored in a vial or ampoule. Storage is preferably performed under light-shielded conditions.
  • the storage temperature is preferably room temperature or lower, more preferably 10 ° C. or lower.
  • the ultrafine bubble water or ultrafine bubble aqueous solution in the present invention preferably has one or more interfaces selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants. Since it is produced in the presence of an activator, a hydrophilic resin and / or a buffer solution, the action and effect of ultrafine bubble water or the like in the present invention (for example, immune cells when ultrafine bubble water or the like and ultrasonic treatment are used in combination).
  • the period required to maintain the perforation effect of the cell membrane, the effect of increasing the deliverability of the target substance into immune cells using ultrafine bubble water or the like and ultrasonic waves (for example, passing through the cell membrane) When used as a base for a target substance that is desired to be delivered, its effective period (for example, 3 months or more, more preferably 6 months or more, further preferably 1 year or more), ultrafine bubble water, etc.
  • the number of ultrafine bubbles can be maintained at 1.0 ⁇ 10 8 cells / mL or more.
  • Ultra-fine bubble water or the like in the present invention can perform heat sterilization, after heat sterilization even number ultra-fine bubbles can be maintained above 1.0 ⁇ 10 8 cells / mL.
  • the ultrafine bubble water or the like in the present invention When the ultrafine bubble water or the like in the present invention has an ultrafine bubble number of 1.0 ⁇ 10 8 cells / mL or more, it exhibits an excellent antibacterial action and a storage effect due to the excellent antibacterial action.
  • Multiple doses of liquid pharmaceutical preparations such as injections (eg, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, infusions, intracerebral injections, intracranial spinal fluid) It is also useful as a base for administered injections, intramuscular injections, etc.).
  • the ultrafine bubble water or the like in the present invention is preferably one or more surfactants (preferably) selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • surfactants preferably selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • anionic surfactants preferably nonionic surfactants
  • nonionic surfactants cationic surfactants
  • amphoteric surfactants preferably one or more surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • the average diameter of the ultrafine bubbles is smaller and the size is more uniform. (Ie, the d90 / d10 ratio is small), in the system of the present invention, a safer effect of delivering the target substance into immune cells can be obtained.
  • the "ultrasonic generator” used in the system of the present invention is an ultrasonic wave under conditions sufficient to deliver the target substance into immune cells when used in combination with the ultrafine bubble water or the like in the present invention. Anything can be used as long as it can generate.
  • any device conventionally used for ultrasonic diagnosis in the medical field a commercially available ultrasonic gene transfer device (eg, Sonitron GTS (manufactured by Neppagene), etc.) can be appropriately used.
  • the output intensity of ultrasonic waves is 10 mW or more, preferably. It is mentioned that it is 30 mW or more, more preferably 50 mW or more.
  • the upper limit of output intensity is not particularly limited, but does not adversely affect animals (eg, cytotoxicity), especially when the system of the present invention is intended for in vivo transfection into immune cells in mammals including humans. The upper limit is preferably the range.
  • the upper limit of the ultrasonic output intensity in the system of the present invention is preferably 720 mW / cm 2 .
  • the output intensity of the ultrasonic wave 50 ⁇ 720mW / cm 2, more preferably from 50 ⁇ 500mW / cm 2.
  • the output intensity of the ultrasound used for conventional gene transfer significantly exceeds the above criteria for ultrasound diagnostic applications (eg, 1.5-2.5 W / cm 2 ) and is a safety risk.
  • the target substance can be efficiently delivered into the immune cells with a small output intensity (preferably 50 to 500 mW / cm 2 ) regardless of the molecular weight of the target substance, which is extremely safe. Delivery system.
  • the condition of the "ultrasonic wave generator" in the present invention is not particularly limited to the frequency of the ultrasonic wave, and can be appropriately selected within the range of, for example, 0.5 to 10 MHz.
  • the frequency widely adopted at present is about 1 MHz, but since it is considered that the higher frequency has less adverse effect on the living body, it is preferably selected within the range of 1 to 5 MHz, more preferably 1 to 3 MHz. Can be done.
  • the ultrasonic irradiation time is not particularly limited as long as it is sufficient to deliver the target substance into the immune cells, and the output intensity of the ultrasonic waves is adjusted. Although it may vary depending on the response, for example, even if the output intensity is 50 mW / cm 2 , the target substance can be delivered into the immune cells with an irradiation time of 10 seconds.
  • the ultrasonic irradiation time may be, for example, 1 to 60 seconds, preferably 1 to 30 seconds, and more preferably 1 to 20 seconds.
  • the conditions for using the "ultrasonic wave generator” in the present invention include, for example, (i) the output intensity of ultrasonic waves is 50 to 720 mW / cm 2 (preferably 50 to 500 mW / cm 2 ), and (ii) ultrasonic waves. Examples thereof include a combination of a frequency of 0.5 to 10 MHz and (iii) an ultrasonic irradiation time of 1 to 60 seconds. Of these, the combination of (i) ultrasonic output intensity of 50 to 500 mW / cm 2 , (ii) ultrasonic frequency of 1 to 5 MHz, and (iii) ultrasonic irradiation time of 1 to 60 seconds is preferable. Be done.
  • the system of the present invention When the system of the present invention is used for transfection of immune cells isolated from animals or immune cells induced to differentiate from stem cells such as iPS cells by a method known per se, the immune cells are subjected to the transfection treatment. May include the step of culturing. Therefore, the system of the present invention may further include means for culturing immune cells (eg, culture vessel (eg, dish, flask, etc.), medium, culturing device (eg, CO 2 incubator, etc.)). Since immune cells proliferate in a suspended state, the culture vessel is preferably coated with a non-adhesive or low-adhesive substrate. The above-mentioned culturing step also includes a subculture step. When cells are subcultured by the system of the present invention, the expression intensity of the target substance introduced into the cells can be maintained.
  • culturing immune cells eg, culture vessel (eg, dish, flask, etc.), medium, culturing device (eg,
  • the present invention also uses an ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing an ultrafine bubble containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less, and an ultrasonic wave to produce a nucleic acid or protein.
  • a method for increasing the intracellular deliverability of an immune cell hereinafter, also referred to as “the method for increasing the deliverability of the present invention”.
  • the method comprises administering the ultrafine bubble water or the like of the present invention to a subject to deliver it in the vicinity of immune cells, and irradiating the immune cells with ultrasonic waves, whereby the nucleic acid or protein is transferred to the immune cells. Delivered within.
  • immune cell is synonymous with that defined in the system of the present invention.
  • the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution used in the "method for increasing the deliverability of the present invention the above-mentioned ultrafine bubble water or the like in the present invention can be used. Further, the ultrasonic irradiation in the "method for increasing the deliverability of the present invention” can be carried out under the same conditions as the use of the ultrasonic wave generator in the system of the present invention described above.
  • the nucleic acid or protein whose deliverability is enhanced into the immune cell by the method for increasing the deliverability of the present invention is not particularly limited, but for example, it can impart preferable physiological activity to the immune cell by being delivered into the immune cell.
  • Small RNAs / DNAs such as siRNA (eg, FAM-siRNA, manufactured by Nippon Gene), ssRNA, shRNA, miRNA, S-modified oligo DNA (phosphorothioate, etc.), genes (eg, plasmid DNA, etc.), which can be substances, for example, as nucleic acids. mRNA, etc.) and the like.
  • examples of the protein include, but are not limited to, antibodies (eg, IgG (eg, Alexa-IgG, manufactured by Invitrogen), etc.), peptides, and the like.
  • the nucleic acid includes a nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or an exogenous T cell receptor (TCR), and examples of the protein include an antibody.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • TCR exogenous T cell receptor
  • the number of nucleotides of the nucleic acid and the molecular weight of the protein are not particularly limited.
  • the nucleic acid when the nucleic acid is a small RNA / DNA such as siRNA or antisense oligonucleic acid, the nucleic acid encodes 10 mer to 30 mer, preferably 15 mer to 25 mer, CAR or TCR.
  • (Plasmid DNA) 1 to 10 kb, preferably 2 to 8 kb can be mentioned.
  • 25 kDa to 900 kDa preferably 25 kDa to 320 kDa can be mentioned.
  • the nucleic acid is a nucleic acid encoding CAR or exogenous TCR.
  • the nucleic acids encoding CAR or exogenous TCR will be described in detail below.
  • Nucleic acid encoding CAR CAR is an artificially constructed hybrid protein containing an antigen-binding domain (eg, scFv) of an antibody linked to a T cell signaling domain.
  • an antigen-binding domain eg, scFv
  • a feature of CAR is the ability to utilize the antigen-binding properties of monoclonal antibodies to convert T cell specificity and reactivity to selected targets in a non-MHC-binding manner.
  • Non-MHC-binding antigen recognition gives T cells expressing CAR the ability to recognize antigens independently of antigen processing, thereby bypassing the major mechanism of tumor escape.
  • CAR advantageously does not dimerize with the endogenous TCR ⁇ and ⁇ chains.
  • the CAR used in the present invention is a surface antigen (eg, cancer antigen peptide, cancer) to be recognized by target immune cells (eg, T cells, NK cells, NKT cells, monospheres, macrophages, dendritic cells, etc.). It includes an antigen-binding domain, an extracellular hinge domain, a transmembrane domain, and an intracellular T cell signal transduction domain of an antibody capable of specifically recognizing a surface receptor whose expression is upregulated in a cell.
  • target immune cells eg, T cells, NK cells, NKT cells, monospheres, macrophages, dendritic cells, etc.
  • Antigens specifically recognized by the antigen-binding domain include, for example, various cancers (eg, acute lymphocytic cancer, follicular rhombic myoma, bladder cancer, bone cancer, brain cancer (eg, pulp blast) Tumor), cancer, cancer of the anus, anal canal or anal rectal, cancer of the eye, cancer of the intrahepatic bile duct, cancer of the joint, cancer of the neck, bile sac or pleura, cancer of the nose, nasal cavity or middle ear, cancer of the oral cavity , Cancer of the genital area, chronic myeloid cancer, colon cancer, esophageal cancer, cervical cancer, fibrosarcoma, gastrointestinal cartinoid tumor, head and neck cancer (eg, squamous epithelial cancer of the head and neck), hypopharyngeal cancer, kidney cancer, laryngeal Cancer, leukemia (eg, acute lymphoblastic leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic le
  • the antigen-binding domain used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody fragment capable of specifically recognizing a target antigen, but considering the ease of CAR production, a light chain variable region and a heavy chain It is desirable that it is a single chain antibody (scFv) in which a variable region is linked via a linker peptide.
  • the arrangement of the light chain variable region and the heavy chain variable region in the single chain antibody is not particularly limited as long as both can reconstitute the functional antigen-binding domain, but usually from the N-terminal side to the light chain variable region-linker peptide-weight. It can be designed in the order of the chain variable regions.
  • linker peptide a known linker peptide that is usually used for producing a single chain antibody can be used.
  • the DNA encoding the light chain variable region and the DNA encoding the heavy chain variable region are prepared, for example, by cloning the light chain gene and the heavy chain gene from antibody-producing cells and performing PCR using them as templates. Or, it can be chemically synthesized from the sequence information of an existing antibody.
  • a DNA encoding a single-chain antibody can be obtained by ligating each of the obtained DNA fragments and the DNA encoding the linker peptide by an appropriate method. It is preferable that a leader sequence is further added to the N-terminal side of the antigen-binding domain in order to present CAR on the surface of immune cells.
  • a domain derived from a T cell surface molecule usually used in the art can be appropriately used, and examples thereof include domains derived from CD8 ⁇ and CD28. Not limited.
  • intracellular signal transduction domain examples include those having a CD3 ⁇ chain, and further co-stimulation transmission motifs such as CD28, CD134, CD137, Lck, DAP10, ICOS, and 4-1BB between the transmembrane domain and the CD3 ⁇ chain.
  • co-stimulation transmission motifs such as CD28, CD134, CD137, Lck, DAP10, ICOS, and 4-1BB between the transmembrane domain and the CD3 ⁇ chain.
  • co-stimulation transmission motifs examples include those having two or more co-stimulation transmission motifs, but are not limited thereto, and any domain usually used in the art can be used in combination.
  • Nucleic acid sequence information encoding an extracellular hinge domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain is well known in the art, and a person skilled in the art can easily obtain each domain from a T cell based on the information.
  • a DNA fragment encoding the above can be obtained.
  • the DNA encoding the CAR is obtained by ligating the DNA fragments thus encoding the antigen-binding domain, the extracellular hinge domain, the transmembrane domain, and the intracellular signal transduction domain, respectively, by a conventional method. be able to.
  • the obtained DNA encoding CAR should be inserted into an expression vector containing a functional promoter in T cells, preferably a plasmid vector, as it is or after adding an appropriate linker and / or nuclear localization signal.
  • Functional promoters in T cells include SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, and MoMuLV (Molony mouse leukemia virus) LTR, which are composed of mammalian cells.
  • HSV-TK Simple Herpesvirus thymidine kinase
  • gene promoters such as CD3, CD4, and CD8 that are specifically expressed in T cells can also be used.
  • RNA encoding CAR preferably mRNA
  • the RNA encoding CAR can be prepared by transcribing into mRNA using an expression vector containing the DNA encoding CAR as a template, using an in vitro transcription system known per se.
  • TCR T cell receptor
  • ⁇ chain, ⁇ chain TCR chain
  • MHC leukocyte antigen
  • TCR chain is composed of a variable region and a constant region, and the variable regions have three complementarity determining regions (CDR1, CDR2, CDR3).
  • the TCR used in the present invention includes not only those in which the ⁇ and ⁇ chains of the TCR form a heterodimer, but also those in which a homodimer is formed. Further, the TCR includes those in which a part or all of the constant region is deleted, those in which the amino acid sequence is recombined, those in which the soluble TCR (soluble TCR) is obtained, and the like.
  • exogenous TCR means that it is exogenous to T cells which are target cells in the present invention. The amino acid sequence of the exogenous TCR may be the same as or different from the endogenous TCR expressed by the T cells that are the target cells in the present invention.
  • the nucleic acid encoding the TCR used in the present invention is a nucleic acid encoding the ⁇ chain and ⁇ chain of the TCR capable of specifically recognizing a surface antigen (eg, cancer antigen peptide, etc.) to be recognized by the target T cell. is there.
  • the nucleic acid can be prepared by a method known per se.
  • a DNA strand or an RNA strand is chemically synthesized based on the sequence, or a partially overlapping oligo DNA short strand is synthesized.
  • the DNA encoding the full length or a part of the TCR of the present invention can be constructed by connecting using the PCR method or the Gibson Assembly method.
  • the target T cell can be isolated from a cell population containing the T cell expressing the target TCR, and a nucleic acid encoding the TCR can be obtained from this T cell.
  • a cell population containing T cells eg PBMC
  • a living body eg, human
  • the cells expressing the cell surface antigen are specified from this cell population by a known method using the specificity for the cell expressing the cell surface antigen and the cell surface antigen such as CD8 and CD4 as indicators.
  • T cells to be recognized can be selected.
  • the specificity of T cells for cells expressing the surface antigen can be measured using, for example, a dextromer assay, an ELISPOT assay, a cytotoxic assay, or the like.
  • the cell population containing the T cells is, for example, a living body having many cells expressing a cell surface antigen recognized by the target TCR (eg, a patient with a disease such as cancer, or an epitope of the antigen or a pulse at the epitope. It is preferable to collect from a T cell-containing population in contact with the dendritic cells.
  • the nucleic acid of the present invention can be obtained by extracting DNA from the isolated T cells by a conventional method, amplifying and cloning the TCR gene based on the nucleic acid sequence of the constant region of TCR using the DNA as a template.
  • RNA is extracted from cells by a conventional method to synthesize cDNA, and using this as a template, 5'-RACE (5'-RACE) using an antisense primer complementary to the nucleic acid encoding the constant region of the TCR ⁇ chain and ⁇ chain, respectively. It can also be prepared by performing Rapid amplification of cDNA ends).
  • 5'-RACE may be carried out by a known method, for example, using a commercially available kit such as SMART PCR cDNA Synthesis Kit (manufactured by Clontech).
  • the DNA encoding the ⁇ -chain and ⁇ -chain of the obtained TCR can be inserted into an appropriate expression vector in the same manner as the DNA encoding the CAR.
  • the DNA encoding the ⁇ chain and the DNA encoding the ⁇ chain may be inserted into the same vector or may be inserted into separate vectors. When inserted into the same vector, the expression vector may express both strands polycistronically or monocistronically.
  • RNA encoding each strand of TCR preferably mRNA
  • RNA encoding the CAR can be prepared, for example, using the expression vector as a template in the same manner as RNA encoding the CAR.
  • the present invention also comprises a combination of a nucleic acid or protein with ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing phospholipid-free ultrafine bubbles having an average diameter of 200 nm or less.
  • a preparation for delivering a protein into immune cells in which an effective amount (amount at which the immune cell exerts a desired effect) of the nucleic acid or the protein is delivered into the immune cell in combination with ultrasonic irradiation.
  • a preparation hereinafter, also referred to as “the preparation of the present invention”
  • immuno cell is synonymous with that defined in the system of the present invention.
  • the nucleic acid or protein may be the nucleic acid or protein exemplified in the above-mentioned "method for increasing serviceability of the present invention". Further, as the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution in the preparation of the present invention, the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution described in the above-mentioned "system of the present invention" is used.
  • the nucleic acid or protein may be mixed with the ultrafine bubble water or the like in the present invention and administered to the subject as a single preparation, or both may coexist in the vicinity of immune cells at the same time. As long as each is formulated separately, they may be administered by the same or different routes at the same time or at different times.
  • the nucleic acid or protein and the ultrafine bubble water or the like in the present invention can be blended with a pharmaceutically acceptable carrier in an amount acceptable to humans or other mammals.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include pH adjusters such as monosodium phosphate, dipotassium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, sodium hydroxide, and hydrochloric acid; canamycin sulfate, erythromycin lactobionate, penicillin G potassium, etc.
  • Antibiotics stabilizers such as lactose, potassium glutamate, D-sorbitol, aminoacetic acid, human serum albumin; colorants such as phenol red; isotonic agents such as sodium chloride and potassium chloride.
  • the content of nucleic acids or proteins in the preparation of the present invention is particularly large as long as it can impart preferable physical properties such as desired physiological activity to the immune cells when they are delivered into the immune cells by ultrasonic irradiation.
  • the preparation of the present invention contains a nucleic acid encoding CAR or exogenous TCR as a nucleic acid and is administered to mammals including humans, CAR or extrinsic TCR per kg of body weight at a time.
  • the amount of nucleic acid encoding the above is in the range of 0.001 mg to 10 mg.
  • it is administered in the range of 0.001 to 50 mg to a patient weighing 60 kg.
  • the above dose is an example, and the dose can be appropriately selected depending on the type of nucleic acid used, the route of administration, the age, body weight, symptom, etc. of the administration target or patient.
  • the amount of ultrafine bubble water or the like is not particularly limited as long as it is sufficient to deliver nucleic acid or protein into immune cells by ultrasonic irradiation.
  • ultrafine bubbles in the vicinity of immune cells The amount may be such that the ultrafine bubbles can be delivered so that the density is 1 ⁇ 10 8 to 10 ⁇ 10 8 pieces / mL, preferably 2 ⁇ 10 8 to 5 ⁇ 10 8 pieces / mL.
  • the present invention also provides a method of delivering a nucleic acid or protein into the cell, comprising contacting the immune cell with the formulation of the invention and treating with ultrasound.
  • immune cell is synonymous with that defined in the system of the present invention.
  • the target to which the "method for increasing deliverability of the present invention” and the “method for delivering the present invention” can be applied is an immune cell (also referred to as "ex vivo immune cell” in the present specification) collected from a living body or a tissue containing the same.
  • Immune cells in the animal body also referred to as “in vivo immune cells” in the present specification
  • the means for administering the ultrafine bubble water or the like in the present invention to the subject is not particularly limited as long as it is an administration route capable of delivering the ultrafine bubble to the vicinity of immune cells.
  • a nucleic acid encoding CAR or an exogenous TCR is delivered as a nucleic acid will be described separately as ex vivo immune cells and in vivo immune cells, as specific examples.
  • CAR or exogenous TCR can be combined with ultrafine bubble water or the like in the present invention and ultrasonic waves.
  • ex vivo immune cells expressing the CAR or exogenous TCR can be produced. Therefore, the present invention also provides ex vivo immune cells obtained by this method.
  • immune cell here, among those defined in the system of the present invention, cells having the ability to damage target cells (pathogenic cells) such as cancer cells by some mechanism of action (so-called immunity).
  • T cells responsible for cell-mediated immunity NK cells responsible for natural immunity, monospheres, macrophages, dendritic cells, etc., and NK cells among acquired immunity.
  • examples thereof include NKT cells, which are T cells having.
  • the immune cell can be a T cell. T cells collected from a living body are also referred to as "ex vivo T cells" in the present specification.
  • the immune cell can be a cell responsible for innate immunity such as NK cells, macrophages, dendritic cells and the like.
  • the above-mentioned effector immune cell or a stem cell having totipotency or pluripotency capable of final differentiation into them, or a precursor thereof.
  • the cell population contains cells (excluding embryos and other totipotent or pluripotent stem cells), specific immune cells isolated and purified (eg, T cells, NK cells, monospheres, macrophages, etc.) It may be an NKT cell such as a dendritic cell or a stem / progenitor cell thereof) or an heterogeneous cell population containing multiple types of immune cells such as lymphocytes.
  • the isolated and purified T cells include cytotoxic T cells (CTL) which are CD8 positive cells, helper T cells which are CD4 positive cells, control T cells, effector T cells, and the like. Are cytotoxic T cells.
  • the lymphocytes can be collected from, for example, peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood of human or non-human mammals, or can be produced from stem cells such as iPS cells.
  • ex-vivo immune cells eg, ex-vivo T cells
  • the cell population is the target of treatment. It is preferably taken from itself or from a donor that matches the MHC type to be treated.
  • unipotent or pluripotent stem cells or progenitor cells capable of final differentiation into immune cells include hematopoietic stem cells, myerophosphorid common progenitor cells (MLP), myeloid progenitor cells (MP), and granulocytes.
  • MLP myerophosphorid common progenitor cells
  • MP myeloid progenitor cells
  • GFP nuclear progenitor cells
  • MDP macrophages-dendritic cell progenitor cells
  • DCP dendritic cell progenitor cells
  • These stem / progenitor cells can be differentiated into various immune cells, for example T cells, by a method known per se.
  • the method for contacting the preparation of the present invention with ex vivo immune cells is not particularly limited, but for example, the preparation of the present invention may be added to a medium of ordinary immune cells. Since immune cells proliferate in a floating state without adhering to a culture vessel, preculture of ex vivo immune cells and contact with the preparation of the present invention are performed in a culture coated with a non-adhesive or low-adhesive substrate. It is preferably performed in a container. Ultrasound irradiation can be performed on ex vivo immune cells using the ultrasonic generator and irradiation conditions described in the system of the present invention.
  • the T cells are originally derived from the viewpoint of increasing the expression of the exogenous TCR, suppressing the appearance of mispair TCR, or suppressing the autoreactivity.
  • Expression of the expressed endogenous TCR ⁇ and TCR ⁇ chains may be suppressed by siRNA.
  • siRNA that suppresses the expression of the endogenous TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain acts on the base sequence of the nucleic acid encoding the TCR.
  • the nucleotide sequence can be prepared by introducing a silent mutation into a nucleic acid encoding TCR obtained from nature, or by chemically synthesizing an artificially designed nucleic acid. Alternatively, part or all of the constant region of the nucleic acid encoding the exogenous TCR may be replaced with a constant region derived from a non-human animal, such as a mouse, to avoid mispairing with the endogenous TCR strand.
  • the formulations of the invention can be delivered to mammals (humans or other mammals (eg, mice, rats). , Hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys), preferably humans), and tissues / organs containing immune cells (eg, spleen, thymus, etc.) are irradiated with ultrasonic waves.
  • the nucleic acid can be introduced into immune cells in an animal, such as T cells (also referred to herein as "in vivo T cells”), to induce the expression of CAR or exogenous TCR.
  • T cells also referred to herein as "in vivo T cells”
  • the in vivo immune cells exert a preventive or therapeutic effect on the disease by specifically recognizing cancer cells expressing a surface antigen targeted by CAR or exogenous TCR and killing the diseased cells. Can be done.
  • the preparation of the present invention is, for example, in the form of an injection, in vivo immune cells by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, infusion, intracerebral injection, cerebrospinal fluid injection, intraocular injection, etc.
  • the nucleic acid, ultrafine bubble water, etc. can be delivered in the vicinity.
  • the operation conventionally used for ultrasonic diagnosis may be performed by replacing the target site with a tissue / organ containing in vivo immune cells.
  • Method for increasing deliverability of the present invention and “method for delivering the present invention” are induced to differentiate from exvivo immune cells, that is, immune cells isolated from animals, or stem cells such as iPS cells by a method known per se.
  • exvivo immune cells that is, immune cells isolated from animals, or stem cells such as iPS cells by a method known per se.
  • the step of culturing the immune cells after the transfection treatment may be included.
  • maintenance culture of finally differentiated immune cells and more undifferentiated stem / precursor cells are performed using a culture vessel (eg, dish, flask, etc.) and a culture device (eg, CO 2 incubator, etc.) known per se. It can be carried out in a medium usually used for inducing differentiation into finally differentiated immune cells.
  • the above-mentioned culturing step also includes a subculture step.
  • the expression intensity of the target substance introduced into the cells can be maintained.
  • the exvivo immune cell into which the target substance has been introduced can be produced by the action of the target substance.
  • it can be used as is or as known pharmaceutically acceptable carriers (excipients, diluents, bulking agents, binders, lubricants). , Flow aids, disintegrants, surfactants, etc.) and conventional additives can be mixed to prepare a pharmaceutical composition.
  • Excipients are well known to those of skill in the art, and auxiliary agents such as wetting agents or emulsifiers, and pH buffering agents can also be used. Further, formulation aids such as suspending agents, preservatives, stabilizers and dispersants may be used.
  • the pharmaceutical composition may be in a dry form for reconstitution with a suitable sterile liquid before use.
  • the pharmaceutical composition is prepared in the form of preparation (tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, emulsions, suspensions and other oral administrations; injections, infusions, external preparations, suppositories and the like. Oral administration or parenteral administration can be performed systemically or locally depending on the parenteral administration agent) and the like.
  • intravenous administration In the case of parenteral administration, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration and the like are possible.
  • an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like When used in the injection form, an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like can be added.
  • the ex vivo immune cells into which the target substance has been introduced are cells expressing a surface antigen specifically recognized by the CAR or exogenous TCR. It can be specifically recognized and killed (eg, induce apoptosis). Therefore, as a surface antigen, a nucleic acid encoding CAR or exogenous TCR that recognizes a surface molecule that is specifically expressed in a diseased cell such as a cancer cell or whose expression is upregulated is contained as an active ingredient.
  • Exvivo immune cells into which the nucleic acid has been introduced and express the CAR or exogenous TCR can be used for the prevention or treatment of diseases such as cancer, humans or other mammals (eg, mice, rats). , Hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys), preferably humans.
  • the medicament containing ex vivo immune cells into which the target substance has been introduced according to the present invention can be a preventive or therapeutic agent for cancer.
  • the cancer to which the drug is applied is not particularly limited, and for example, acute lymphocytic cancer, follicular rhombic myoma, bladder cancer, bone cancer, brain cancer (eg, medullary cell tumor), breast cancer, etc.
  • the dose of the drug containing ex vivo immune cells into which the target substance has been introduced according to the present invention is, for example, in the range of 0.001 mg to 10 mg as the amount of nucleic acid encoding CAR or exogenous TCR per 1 kg of body weight at one time. Is administered at. For example, when administered to a human patient, it is administered in the range of 0.001 to 50 mg to a patient weighing 60 kg.
  • the above dose is an example, and the dose can be appropriately selected depending on the type of nucleic acid used, the route of administration, the age, body weight, symptom, etc. of the administration target or patient.
  • the drug containing ex vivo immune cells into which the target substance has been introduced according to the present invention is preferably administered parenterally to a subject for use.
  • Parenteral administration methods include intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, and subcutaneous administration.
  • the dose is appropriately selected according to the condition, body weight, age, etc. of the subject, but the number of cells is usually 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 per administration for a subject having a body weight of 60 kg.
  • it is preferably administered so as to be 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 and more preferably 5 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 8 . Further, it may be administered once or may be administered multiple times.
  • Example 1 Gene transfer into T cells Jurkat E6.1 (3 ⁇ 10 4 cells, 0.5 mL) in RPMI1640 medium containing 10% FBS was seeded at 48 wells. After removing the medium, 0.5 mL of Ultrafine Bubble / RPMI medium containing 5 ⁇ g of pGFP was added. As the ultrafine bubble / RPMI medium, 1 L of the ultrafine bubble aqueous solution prepared in Reference Example 1 was added to the RPMI medium powder, and 2 g / L NaHCO 3 and 10% FBS were added, which was used as the transfection medium.
  • the medium was irradiated with ultrasonic waves at a frequency of 1 MHz and an output intensity of 0.5 W / cm 2 for 10 sec using an ultrasonic generator (NEPAGENE), and then cultured for 2 hours, and then the transfection medium was removed.
  • the cells were cultured in RPMI medium (culture medium) for 48 hours. Then, the cells were collected and completely dissolved in 0.15 mL of cell lysate, and then the amount of fluorescence of GFP was measured with a spectrofluorometer. The number of viable cells was also measured, converted into the amount of fluorescence per viable cell, and compared. The results are shown in FIG.
  • Example 2 Protein introduction into T cells Jurkat E6.1 (3 ⁇ 10 4 cells, 0.5 mL) in RPMI 1640 medium containing 10% FBS was seeded at 48 wells. After removing the medium, 0.5 mL of ultrafine bubble / RPMI medium containing IgG-FITC (4 mL of ultrafine bubble / RPMI medium was added to 40 ⁇ L of IgG-FITC) was added. As the ultrafine bubble / RPMI medium, 1 L of the ultrafine bubble aqueous solution prepared in Reference Example 1 was added to the RPMI medium powder, and 2 g / L NaHCO 3 and 10% FBS were added, which was used as the transfection medium.
  • the system of the present invention can efficiently deliver a target substance such as nucleic acid or protein into immune cells by irradiating ultrasonic waves with low output intensity, so that the drug can be delivered into immune cells with high safety.
  • the system can be provided.
  • the efficiency of introducing the target substance into the cell can be significantly increased by using the ultrafine bubble as compared with the case of using the conventional microbubble.
  • liposomes since it is not necessary to use liposomes, it can be manufactured at low cost and is highly safe. From the above, the system of the present invention is extremely useful as a novel DDS into immune cells.

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Abstract

本発明は、核酸やタンパク質等の目的物質を、安全かつ効率的にＴ細胞等の免疫細胞内に導入する新規な手段を提供するために、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、免疫細胞内への目的物質の送達システム。該ウルトラファインバブル水等と、超音波とを用いて、核酸またはタンパク質の免疫細胞内送達性を増大させる方法等を提供する。

Description

トランスフェクション方法
　本発明は、ウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、免疫細胞内への目的物質の送達システム、該ウルトラファインバブル水もしくは水溶液と、超音波とを用いて、核酸またはタンパク質の免疫細胞内送達性を増大させる方法、核酸またはタンパク質と、該ウルトラファインバブル水もしくは水溶液とを組み合わせてなる、超音波照射との併用により該核酸またはタンパク質を免疫細胞内に送達させるための製剤、並びに、免疫細胞を該製剤と接触させ、超音波で処理することによる該細胞内への核酸またはタンパク質の送達方法等に関する。
（発明の背景）
　超音波は、医療現場において主に超音波造影装置として利用されてきた。超音波造影剤であるマイクロバブルが超音波診断に画期的な進歩をもたらしている。一方、最近では、超音波を診断以外にも利用できるようになり、例えば、超音波エネルギーを患部に集束させて患部のみを加熱することによる非侵襲的がん温熱療法が、子宮筋腫や前立腺がんで臨床応用されている。また、非侵襲性と空間的・時間的制御が容易であることに着目して、超音波照射を、遺伝子や薬物を目的細胞に送達させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の手段として利用する研究（ソノポレーション）も進められている。
　これまでに、バブルリポソームと超音波技術を融合した骨格筋への遺伝子デリバリーシステムとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リポソームに、パーフルオロプロパンを封入したバブルリポソームが報告されている（非特許文献１）。また、特定のモルフォリノオリゴマーを表面に結合させ、内部にパーフルオロ炭化水素を封入した、平均粒子径５０～５００ｎｍのＰＥＧ修飾バブルリポソーム（バブルリポポリプレックス）を筋組織内または血管内に投与後、体外から筋組織に超音波照射することにより、筋細胞に該モルフォリノオリゴマーを高効率で導入させるデュシェンヌ型筋ジストロフィー治療薬も報告されている（特許文献１）。さらに、脳への薬物や遺伝子送達のために、ガス封入マイクロバブルおよび超音波が利用されうることも報告されている（非特許文献２）。
　封入ガスとしてパーフルオロプロパンガスを用いることで、パーフルオロブタンガスまたは窒素ガスを用いたものよりも小さいサイズのバブルリポソームが得られるとの報告がある（非特許文献３）。また、ｄｄＹマウスに、ナノバブルとプラスミドを組み合わせたバブルリポポリプレックスを投与し、脳組織に対して超音波照射を行ったところ、血管内皮または血管外部位にプラスミドが導入され、ガスの封入効率により導入部位が異なることが報告されている（非特許文献４）。
　しかしながら、バブルリポソームの使用は、脂質による抗原性の問題を引き起こす懸念がある。また、超音波照射に１．５～２．５Ｗ／ｃｍ２といった超音波診断用として安全性に懸念がある出力強度が使用されており、実用性の面で問題がある。
　本発明者らは、２．０×１０８個／ｍＬ以上の、リン脂質を含まないナノバブルを含有するナノバブル水が、優れた抗菌作用を有することを明らかにしている（特許文献２）。しかしながら、該ナノバブル水と超音波とを組み合わせて、細胞に核酸やタンパク質等の目的物質を導入したとの報告は皆無である。
　ところで、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はがん抗原特異的キラーＴ細胞由来のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を遺伝子導入したＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ－Ｔ細胞によるがん免疫療法の研究・開発が急速に進展している。現在のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、米国で承認されたＫｙｍｒｉａｈ（商品名）やＹｅｓｃａｒｔａ（商品名）のように、患者から採取したＴ細胞にレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを用いてｅｘ　ｖｉｖｏでＣＡＲ遺伝子を導入してＣＡＲ－Ｔ細胞を製造し、当該ＣＡＲ－Ｔ細胞を患者に投与するという方法が一般的である。しかし、この方法では、細胞培養やウイルスベクター等の調製にかかるコストにより製造原価が高くなるという課題がある。ｉｎ　ｖｉｖｏでＴ細胞等の免疫細胞選択的にＣＡＲや外因性ＴＣＲを導入することができれば、ｅｘ　ｖｉｖｏでの調製が不要となり、製造原価の低いＣＡＲ－もしくはＴＣＲ－免疫細胞療法の提供が可能となる。またｅｘ　ｖｉｖｏでも、製造原価の高いウイルスベクターを用いずにＴ細胞等の免疫細胞選択的にＣＡＲや外因性ＴＣＲを導入することができれば、ウイルス残存試験等にかかるコストが不要になることにより、製造原価の低いＣＡＲ－もしくはＴＣＲ－免疫細胞療法の提供が可能となる。
　しかしながら、Ｔ細胞等の免疫細胞は細胞分裂数が少なく、かつ浮遊性の細胞であるため、他の細胞と比較してトランスフェクション効率が悪いことが知られており、より効率的な免疫細胞への核酸等の導入法が求められている。これまでに、ＣＡＲや外因性ＴＣＲをコードする核酸（例、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）を、ソノポレーションを用いてＴ細胞等の免疫細胞に選択的に導入したとの報告はない。
ＷＯ２０１２／１５３６３５ ＷＯ２０１５／１８２６４７
YAKUGAKU ZASSHI 130(11) 1489-1496 (2010) NATURE REVIEWS 12 161-174 (2016) Drug Delivery 24(1) 320-327 (2017) 「超音波応答性ナノバブルによる脳指向ＤＤＳにおける脳内への薬物動態の評価」、渕上由貴ら、長崎大学、日本薬学会第137年会発表要旨(2017年3月)
　本発明の目的は、核酸やタンパク質等の目的物質を、安全かつ効率的にＴ細胞等の免疫細胞内に導入する新規な手段を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、本発明者らが以前に開発した抗菌作用に優れたナノバブル水（上記特許文献２を参照；尚、国際標準化機構（ＩＳＯ）は１μｍ（１０００ｎｍ）未満のバブルを「ウルトラファインバブル」と定義している（ISO 20480-1）ため、本明細書では以下、「ナノバブル」でなく、「ウルトラファインバブル」と表記する。）が、リン脂質を含んでいないことに着目した。このウルトラファインバブル水に含まれるウルトラファインバブルは平均径が２００ｎｍ以下と、従来よりもさらに小さな平均径を有している。従来、ウルトラファインバブルは圧壊した際にマイクロバブルと比較して細胞膜の損傷が激しいと考えられていたが、本発明者らは敢えてこのウルトラファインバブル水と超音波照射とを組み合わせて、Ｔ細胞内への核酸及びタンパク質の導入について検討した。その結果、意外にも、該ウルトラファインバブル水は、ソノポレーションによる核酸の導入効率を飛躍的に増大させ得ること、タンパク質導入においても、該ウルトラファインバブル水と超音波との組み合わせは、いずれかの単独処理よりも顕著に導入効率を増大させ得ることが示された。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、免疫細胞内への目的物質の送達システム；
［２］ウルトラファインバブル水溶液が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝液から選ばれる１または２以上の成分を含む、［１］に記載のシステム；
［３］ウルトラファインバブル水溶液が、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、［１］または［２］に記載のシステム；
［３－１］ウルトラファインバブル水溶液が、イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、［１］または［２］に記載のシステム；
［４］ウルトラファインバブルが、パーフルオロ炭化水素または空気で構成される、［１］～［３］のいずれかに記載のシステム；
［５］ウルトラファインバブルの平均径が、５０ｎｍ～２００ｎｍである、［１］～［４］のいずれかに記載のシステム；
［６］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が５以下である、［１］～［５］のいずれかに記載のシステム；
［７］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８個／ｍＬ以上である、［１］～［６］のいずれかに記載のシステム；
［８］超音波発生装置において超音波の出力強度が、７２０ｍＷ／ｃｍ２以下である、［１］～［７］のいずれかに記載のシステム；
［９］超音波発生装置において超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２および超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚである、［１］～［８］のいずれかに記載のシステム；
［１０］目的物質が核酸又はタンパク質である、［１］～［９］のいずれかに記載のシステム；
［１１］核酸がキメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体をコードする、［１０］に記載のシステム；
［１２］免疫細胞がＴ細胞である、［１］～［１１］のいずれかに記載のシステム；
［１３］免疫細胞内へ核酸を送達するための、［１１］または［１２］に記載のシステム；
［１４］平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波とを用いて、核酸またはタンパク質の免疫細胞内送達性を増大させる方法；
［１５］核酸又はタンパク質と、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液とを組み合わせてなる、該核酸又は該タンパク質を免疫細胞内に送達させるための製剤であって、超音波照射との併用により有効量の該核酸又は該タンパク質が免疫細胞内に送達されることを特徴とする、製剤；
［１６］免疫細胞を、［１５］に記載の製剤と接触させ、超音波で処理することを含む、該細胞内への核酸又はタンパク質の送達方法；
等に関する。
　本発明の免疫細胞内への目的物質の送達システムによれば、生体に悪影響を及ぼさない程度の出力強度の超音波を照射することで、非侵襲的に核酸やタンパク質等の目的物質をＴ細胞等の免疫細胞内に選択的に導入することができるので、安全性の高い導入系が提供され得る。該システムでは、リポソームを用いる必要がないため、リン脂質のような特殊な添加剤を配合する必要がなく、安価に製造可能であり、かつ、リン脂質による抗原性の問題が生じない。
　また、従来ウルトラファインバブルは圧壊した際にマイクロバブルと比較して細胞膜の損傷が激しく、細胞のトランスフェクションには不向きと考えられていたが、意外にも、本発明によれば、ウルトラファインバブルを使用することにより、マイクロバブルを使用した場合と比較し、細胞内への目的物質の導入効率を顕著に増大させることができる。
　さらに、該平均径２００ｎｍ以下のウルトラファインバブルはウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液内で長期間安定である。
ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを組み合わせることにより、Ｔ細胞へのプラスミドの導入効率が改善したことを示す図である。縦軸は生存細胞あたりのＧＦＰの蛍光強度を示す。ＵＳ（超音波照射）：－（なし）、＋（あり）；Ｂｕｂｂｌｅ（ウルトラファインバブル）：Ｃａｔ（プラスチャージ）、Ａｎ（マイナスチャージ）、－（なし） ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを組み合わせることにより、Ｔ細胞へのタンパク質の導入効率が改善したことを示す図である。縦軸は生存細胞あたりのＧＦＰの蛍光強度を示す。ＵＳ（超音波照射）：－（なし）、＋（あり）；Ｂｕｂｂｌｅ（ウルトラファインバブル）：Ｃａｔ（プラスチャージ）、Ａｎ（マイナスチャージ）、－（なし）
（発明の詳細な説明）
Ｉ．本発明のシステム
　本発明は、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、免疫細胞内への目的物質の送達システム（以下、「本発明のシステム」ともいう）を提供する。
　本明細書において「細胞内への目的物質の送達」とは、本来細胞膜を通過することが困難な物質（例えば、水溶性で受動拡散しにくい化合物、分子量が大きい化合物、選択的なトランスポーターや受容体を持たない化合物）が、細胞膜を通過して細胞内に移行することを意味する。従って、本発明のシステムは、いかなるメカニズムによって目的物質を細胞内に送達させるものであってもよく、例えば、細胞膜に一時的に孔を開けること等が挙げられるが、それに限定されない。
　本明細書において、「免疫細胞」とは、免疫反応に関与する細胞を意味し、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞等のリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等の顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞等、あるいは、それらに最終分化し得る単能性もしくは多分化能を有する幹細胞または前駆細胞（但し、胚および他の全能性または多能性幹細胞を除く。）が挙げられる。「免疫細胞」は、上記のいずれかの細胞を含む細胞集団であれば、単離された特定の免疫細胞であっても、例えば、リンパ球のような複数種の免疫細胞を含む不均質な細胞集団であってもよい。
　前記リンパ球は、ヒト又は非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄及び臍帯血より採取したり、ｉＰＳ細胞などの幹細胞から自体公知の方法を用いて分化誘導することにより製造することができる。本発明を適用して目的物質が導入された、単離された免疫細胞（例、Ｔ細胞）を、癌などの疾患の治療に用いる場合には、当該細胞は治療対象自身、又は治療対象のＭＨＣタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。あるいは、リンパ球は、動物個体中に存在するリンパ球であり得る。
　好ましい一実施態様において、「免疫細胞」は、単離精製されたＴ細胞である。また、別の好ましい実施態様において、免疫細胞はＴ細胞を含む細胞集団、例えば、動物個体中に存在するＴ細胞等であり得る。
　本明細書において、「Ｔ細胞」とは、リンパ器官あるいは末梢血中等に認められる白血球の一種で、主に胸腺で分化成熟しＴＣＲを発現することを特徴とするリンパ球の一分類を意味する。本発明の種々の実施形態に用いることができるＴ細胞としては、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞などが挙げられるが、好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞である。
　本発明のシステムを用いて免疫細胞内に送達される目的物質は、免疫細胞内に送達されることによって、該免疫細胞に好ましい生理活性を付与し得る物質であれば特に制限はなく、例えば、高分子化合物〔例えば、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ（例、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ、ニッポンジーン製）、ｓｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｓ化オリゴＤＮＡ（ホスホロチオエート等）などの小ＲＮＡ／ＤＮＡ、遺伝子（例、プラスミドＤＮＡ，ｍＲＮＡ等）など、タンパク質（ペプチドも含む）（例、抗体（例、ＩｇＧ（例、Ａｌｅｘａ－ＩｇＧ、インビトロジェン製））等）、多糖類（例、デキストラン、フルオレセインイソチオシアナートデキストラン等）等〕、低分子化合物（例、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム等）等を挙げることができるが、それらに限定されない。中でも好ましくは高分子化合物および低分子化合物が挙げられる。さらに好ましくは高分子化合物が挙げられる。さらに好ましくは核酸およびタンパク質が挙げられる。特に好ましくは核酸および抗体が挙げられる。
　本明細書において「ウルトラファインバブル」とは、通常の大気圧又はより高圧の気体を含んでいてもよいし、ウルトラファインバブル内が真空であってもよい。ここで、「真空」とは通常の大気圧より低い圧力の気体で満たされた空間の状態を意味する。
　本発明において「リン脂質を含まないウルトラファインバブル」とは、バブルの殻（shell）がリン脂質二重層の構造を形成していないウルトラファインバブルである。
　本発明において「ウルトラファインバブル水」とは、ウルトラファインバブルを含有する水のことをいう。
　本発明において「ウルトラファインバブル水溶液」とは、ウルトラファインバブルを含有する水溶液のことをいう。ウルトラファインバブル水溶液を構成する水溶液は、例えば、
１）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、
２）親水性樹脂および
３）緩衝液
から選ばれる１種または２種以上の物質を成分として含む。
　本発明において「アニオン性界面活性剤」としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
　本発明において「非イオン性界面活性剤」としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸グリセリン等）、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル（例、ポリソルベート２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル（例、ポリソルベート８０等）等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等）、マクロゴール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例、ポロクサマー４０７、ポロクサマー２３５、ポロクサマー１８８、ポロキサミン等）等が挙げられる。中でも好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル（例、ポリソルベート２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル（例、ポリソルベート８０等）である。さらに好ましくはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。特に好ましくはポリソルベート８０である。
　本発明において「カチオン性界面活性剤」としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化デカリニウム等が挙げられる。
　本発明において「両性界面活性剤」としては、例えば、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン等が挙げられる。
　上記界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明において「親水性樹脂」としては、例えば、アクリル系樹脂（例、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸メチル）、ビニル系樹脂（例、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエチルエーテル）；多糖類（例、トラガントガム、カラヤガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸、アガロース、カードラン等）が挙げられる。中でも好ましくはポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。より好ましくはポリビニルアルコールが挙げられる。
　上記親水性樹脂は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明において「緩衝液」としては、例えば、酸性緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液）や、中性緩衝液（例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））が挙げられる。緩衝液としては、薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液が好ましい。
　本発明における「ウルトラファインバブル水溶液」を構成する水溶液として、好ましくは、１）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、および／または２）親水性樹脂とからなる水溶液等が挙げられる。中でも好ましくは、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる水溶液等が挙げられる。または、非イオン性界面活性剤からなる水溶液等も好ましい。さらに好ましくは、１）ポリソルベート８０およびポリソルベート２０から選ばれる１種または２種および／または２）ポリビニルアルコールとからなる水溶液等が挙げられる。さらに好ましくは、ポリソルベート８０および／またはポリビニルアルコールとからなる水溶液等が挙げられる。とりわけ、ポリソルベート８０からなる水溶液が好ましい。
　別の好ましい実施態様において、「ウルトラファインバブル水溶液」を構成する水溶液として、イオン性（アニオン性もしくはカチオン性）界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる水溶液等が挙げられる。
　本発明においてウルトラファインバブルを構成する「気体」としては、例えば、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）、パーフルオロブタン等）、空気、窒素、オゾン、酸素、アルゴン、二酸化炭素およびヘリウム等から選ばれる１種または２種以上の混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも好ましくは、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン等）、空気、窒素、オゾン、酸素、アルゴンが挙げられる。より好ましくは、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン等）、空気である。空気を用いる場合、安価で、かつ、容易にウルトラファインバブルを製造することができる。さらに好ましくは空気が挙げられる。
　本発明における「ウルトラファインバブル水溶液」として、好ましくは、（Ａ）非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる水溶液と、（Ｂ）パーフルオロ炭化水素、空気等から選ばれる１種または２種以上の気体で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が挙げられる。さらに好ましくは、（Ａ）１）ポリソルベート８０およびポリソルベート２０から選ばれる１種または２種および／または２）ポリビニルアルコールとからなる水溶液と、（Ｂ）パーフルオロ炭化水素および空気から選ばれる１種または２種の気体で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が挙げられる。さらに好ましくは、（Ａ）ポリソルベート８０および／またはポリビニルアルコールとからなる水溶液と、（Ｂ）パーフルオロ炭化水素および／または空気で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が挙げられる。とりわけ、ポリソルベート８０からなる水溶液と、空気で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が好ましい。
　本発明における「ウルトラファインバブル」は、リポソーム等の両親媒性リン脂質を含まないため、抗原性を示すことなく、より安全な製剤を提供し得る。
　本発明において「ウルトラファインバブル」の平均径は約２００ｎｍ以下である。好ましい平均径としては、例えば１０ｎｍ～２００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ～２００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ～１８０ｎｍである。
　本明細書において「平均径」とは、分布の最頻値（個数％の極大値）に対応する粒子径（モード径）を意味する。
　本明細書において「ウルトラファインバブル水」もしくは「ウルトラファインバブル水溶液」とは、１０００ｎｍ以下の直径を有する気体粒子（ウルトラファインバブル）が安定に存在する水もしくは水溶液を意味する。本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液（以下、「本発明におけるウルトラファインバブル水等」ともいう）は、平均径が約２００ｎｍ以下であるウルトラファインバブルを含むことを特徴とする。
　本発明において、ウルトラファインバブルのサイズは均一であることが望ましい。例えば、ウルトラファインバブル個数基準分布の小径側から累積１０％および累積９０％に相当するウルトラファインバブル径をそれぞれｄ１０およびｄ９０としたときの「ｄ９０／ｄ１０比」は、５以下であることが好ましく、さらに好ましくは４．５以下である。
　本発明において、ウルトラファインバブル水等に含有されるウルトラファインバブル数とは、ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液１ｍＬ中に存在するウルトラファインバブルの数を意味し、本明細書においては「ウルトラファインバブル密度」と称することもある。本発明におけるウルトラファインバブル水等に含まれるウルトラファインバブル数は特に制限されない。「ウルトラファインバブル密度」の下限として例えば、１．０×１０８個／ｍＬ以上、好ましくは２．０×１０８個／ｍＬ以上、より好ましくは２．５×１０８個／ｍＬ以上である。「ウルトラファインバブル密度」の上限として例えば、２．０×１０９個／ｍＬ以下、好ましくは１．０×１０９個／ｍＬ以下である。本発明における「ウルトラファインバブル密度」としては、例えば、１．０×１０８～２．０×１０９個／ｍＬ、好ましくは２．０×１０８～１．０×１０９個／ｍＬ、さらに好ましくは２．５×１０８～１．０×１０９個／ｍＬである。
　ウルトラファインバブル径（ウルトラファインバブル平均径を含む。以下同じ）、ウルトラファインバブル個数基準分布（ｄ９０／ｄ１０比を含む。以下同じ）、およびウルトラファインバブル数は、ブラウン運動に基づくレーザー光の散乱を利用した方法（例、ナノサイト社、ＬＭ２０やＬＭ１０等）、電気抵抗変化に基づく方法（例、ベックマン・コールター社、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４等）、レーザー回折散乱法に基づく方法（例、島津製作所、ＳＡＬＤ－７１００Ｈ等）、ミー散乱を利用した方法（例、日本電色工業、ＮＰ－５００Ｔ等）等を用いて測定することができる。本発明におけるウルトラファインバブル径およびウルトラファインバブル個数基準分布は、ナノサイト社製ナノサイト（機器名ＬＭ１０）を用いたレーザー光散乱を利用したトラッキング法（追尾法）を用いて測定されたもの、あるいはそれに準じて測定されたものが使用される。
　ウルトラファインバブル径、ウルトラファインバブル個数基準分布およびウルトラファインバブル数の値は、通常、ウルトラファインバブル水等の製造直後に測定されてもよく、長期保管後に測定されてもよい。本発明におけるウルトラファインバブル水等のウルトラファインバブル径、ウルトラファインバブル個数基準分布およびウルトラファインバブル数は極めて長期間（例えば、６ヶ月～２年程度）安定に維持されるため、ウルトラファインバブル水を製造後に一定期間密閉保管後、使用直前にウルトラファインバブル径、ウルトラファインバブル個数基準分布およびウルトラファインバブル数を測定した値であってもよい。
　本明細書における、ウルトラファインバブルを含む「水」（およびウルトラファインバブルを含む「水溶液」に用いられる「水」）としては、特に制限はなく、例えば水道水、脱イオン水、蒸留水、滅菌蒸留水、注射用精製水、超純水等を用いることができるが、注射剤に使用する場合は、滅菌蒸留水、注射用精製水等が好ましい。
　本明細書における、ウルトラファインバブルを含む「水溶液」としては、前記したアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝剤から選ばれる１または２以上の成分に加え、例えば、医薬製剤分野で通常使用され得る任意の添加剤をさらに含有する水が挙げられる。該「添加剤」としては、例えば、電解質、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、分散剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、酸味料、香料、流動化剤等が挙げられる。好ましくは薬理学的に許容し得る添加剤が挙げられ、より好ましくは、懸濁化剤、安定化剤、分散剤、等張化剤等から選ばれる１種または２種以上の添加剤が用いられる。
　上記した添加剤は、２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
　これらの添加剤（アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝剤を含む）は、ウルトラファインバブルの生成および安定性等に影響を与えない限り、予め水に溶解して直接ウルトラファインバブル水溶液として調製することもでき、あるいは、添加剤を含まない水中にウルトラファインバブルを生成させウルトラファインバブル水とした後、用時添加剤を溶解しウルトラファインバブル水溶液としてもよい。
　水溶液としては、非荷電のウルトラファインバブル水溶液、プラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液およびマイナスに帯電したウルトラファインバブル水溶液のいずれも使用でき、標的免疫細胞の種類や周辺の微小環境、目的物質の種類等に応じて、適宜選択することができる。本発明の、ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを用いて目的物質を免疫細胞内に送達させる方法において、例えば目的物質が高分子化合物（例、核酸、タンパク質等）の場合、ウルトラファインバブル水溶液としては、マイナスに帯電したウルトラファインバブル水溶液が好ましい場合がある。また、別の態様においては、本発明の、ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを用いて目的物質を免疫細胞内に送達させる方法において、目的物質が高分子化合物の場合、ウルトラファインバブル水溶液としては、プラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液が好ましい場合がある。
　また、ウルトラファインバブル水溶液の電荷は、例えば、用いる緩衝液のｐＨにより適宜調整することができる。例えばプラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液とする場合、ウルトラファインバブル水溶液のｐＨとしては、例えば１～４が好ましい。一方、マイナスに帯電したウルトラファインバブル水溶液とする場合、ウルトラファインバブル水溶液のｐＨとしては、例えば７～１４が好ましい。
　ウルトラファインバブル水の製造方法としては、マイクロバブル（１～６０μｍ程度の直径を有する気体粒子）とウルトラファインバブルとを水中に同時発生させた後、マイクロバブルを浮上分離させてウルトラファインバブルのみを残留させる方法と、ウルトラファインバブルを直接生成させる方法とに大別されるが、現状では前者が主流である。前者の方法としては、気体を高速旋回で破砕してマイクロバブルを多数発生させ、マイクロバブルを浮上分離してウルトラファインバブルを水中に残留させる高速旋回液流式、気体を加圧して過飽和で溶解させた液を急速減圧してマイクロバブルとウルトラファインバブルを発生させ、マイクロバブルを浮上分離してウルトラファインバブルを水中に残留させる加圧溶解式等がある。ウルトラファインバブル水溶液の製造方法も上記と同様である。
　本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液の製造方法として好ましくは、加圧溶解式が用いられる。例えば、以下の１）～３）の工程が挙げられる；１）加圧ポンプにより０．２～０．５ＭＰａ程度に加圧された加圧容器内で、（i）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、（ii）親水性樹脂および／または（iii）緩衝液が溶解している液に強制的に気体を溶解させ；２）ノズルを通して水中にフラッシュ操作し、減圧され過飽和となった気体を排水中にマイクロバブルまたはウルトラファインバブルとして放出させ、マイクロバブル水およびウルトラファインバブル水の混合物を生成する；３）通気を停止して静置し、マイクロバブルを自然浮上離脱させる。これより、ウルトラファインバブルのみが残留した澄明なウルトラファインバブル水が生成される。
　本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液の製造に用いられるウルトラファインバブル発生装置としては、例えば、加圧溶解式装置（例、ＩＤＥＣ社製ｎａｎｏＧＡＬＦＴＭ、オーラテック社製ＯＭ４－ＭＤ５－０４５、ニクニ社製マイクロバブルジェネレータ等）、高速旋回液流式装置（例、バイ・クリーン社製ＹＪ、アクアエアー社製マイクロバブル発生装置、ローヤル電機社製マイクロブレード等）等が挙げられる。ウルトラファインバブル発生装置として好ましくは、加圧溶解式装置（例、ＩＤＥＣ社製ｎａｎｏＧＡＬＦＴＭ）である。
　本発明において、ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液の製造にアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂および／または緩衝液を用いることにより、上記ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液中のウルトラファインバブル数を増大させることができる。
　本発明で用いられるアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂および／または緩衝剤の水への含有量は特に限定されるものではない。上限としては、好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）以下、より好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下、さらに好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以下である。下限としては、好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上、より好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）以上、さらに好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）以上である。ここで、（Ｗ／Ｖ）は、ｇ／ｍＬを意味するものとする。
　該界面活性剤、親水性樹脂および緩衝剤を２種以上組み合わせて用いる場合は、その合計量を水への含有量とする。
　上記のようにして製造された本発明におけるウルトラファインバブル水等は、バイアルまたはアンプルに密封して保存する。保存は遮光条件下で行うのが好ましい。保存温度は室温以下が好ましく、１０℃以下がより好ましい。
　本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液は、好ましくはアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂および／または緩衝液の存在下製造されるため、本発明におけるウルトラファインバブル水等の作用効果（例えば、ウルトラファインバブル水等と超音波処理とを併用した場合の免疫細胞の細胞膜穿孔効果、ウルトラファインバブル水等と超音波とを用いて目的物質の免疫細胞内への送達性を増大させる効果等）が維持されることが要求される期間（例えば、細胞膜を通過して送達されることが望まれる目的物質の基剤として使用した場合には、その有効期間（例えば３ヶ月以上、より好ましくは６ヶ月以上、さらに好ましくは１年以上））、ウルトラファインバブル水等のウルトラファインバブル数を１．０×１０８個／ｍＬ以上に維持することができる。
　本発明におけるウルトラファインバブル水等は加熱滅菌を行うことができ、加熱滅菌後もウルトラファインバブル数を１．０×１０８個／ｍＬ以上に維持することができる。
　本発明におけるウルトラファインバブル水等が１．０×１０８個／ｍＬ以上のウルトラファインバブル数を有する場合、優れた抗菌作用とそれによる保存効力を示すので、一定期間、同一容器から繰り返して使用される複数回投与型の液体医薬製剤、例えば、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、点滴剤、脳内投与注射剤、脳脊髄液内投与注射剤、眼内投与注射剤等）の基剤としても有用である。
　本発明におけるウルトラファインバブル水等は、好ましくはアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤（好ましくはポリソルベート８０および／またはポリソルベート２０、さらに好ましくはポリソルベート８０）の存在下で製造され、製造されたウルトラファインバブル水等では、ウルトラファインバブルの平均径がより小さく、また、そのサイズがより均一である（すなわちｄ９０／ｄ１０比が小さい）ため、本発明のシステムにおいて、より安全な免疫細胞内への目的物質の送達効果が得られる。
　本発明のシステムに使用される「超音波発生装置」としては、本発明におけるウルトラファインバブル水等と組み合わせて用いた場合に、免疫細胞内へ目的物質を送達させるのに十分な条件の超音波を発生させ得る限り、いかなるものでも使用することができる。例えば、従来より医療現場で超音波診断用に使用されている任意の装置や、市販の超音波遺伝子導入装置（例、Sonitron GTS（ネッパジーン社製）等）等を適宜用いることができる。
　本発明における「超音波発生装置」の条件としては、例えば、超音波の出力強度（音波の進行方向に垂直な単位面積（ｃｍ２）を単位時間に通過する音響エネルギー）が１０ｍＷ以上、好ましくは３０ｍＷ以上、より好ましくは５０ｍＷ以上であることが挙げられる。出力強度の上限に特に制限はないが、特に本発明のシステムがヒトを含む哺乳動物内の免疫細胞へのｉｎ　ｖｉｖｏトランスフェクションを目的とする場合、動物に悪影響（例、細胞毒性）を及ぼさない範囲を上限とすることが好ましい。例えば、改正薬事法の第３者認証基準（２００５）において「７２０ｍＷ／ｃｍ２を超えない」（米国ＦＤＡのＴｒａｃｋ ３の上限値と同じ）との要求事項が追加され、日本国内の超音波診断装置はこの上限を超えないよう制御されていることから、好ましくは、本発明のシステムにおける超音波の出力強度の上限は７２０ｍＷ／ｃｍ２である。超音波の出力強度として好ましくは、５０～７２０ｍＷ／ｃｍ２、さらに好ましくは５０～５００ｍＷ／ｃｍ２である。従来の遺伝子導入のために使用されている超音波の出力強度は、超音波診断用途での上記基準を大幅に上回っており（例えば、１．５～２．５Ｗ／ｃｍ２）安全性に対するリスクが大きいが、本発明のシステムにおいては、小さな出力強度（好ましくは５０～５００ｍＷ／ｃｍ２）で目的物質の分子量に関係なく、目的物質を効率よく免疫細胞内へ送達させることができ、極めて安全な送達システムである。
　本発明における「超音波発生装置」の条件としては、超音波の周波数は特に制限されず、例えば、０．５～１０ＭＨｚの範囲内で適宜選択することができる。現在広く採用されている周波数は約１ＭＨｚであるが、高周波数の方が生体への悪影響がより少ないと考えられることから、好ましくは１～５ＭＨｚ、より好ましくは１～３ＭＨｚの範囲内で適宜選択され得る。
　本発明における「超音波発生装置」を用いる条件としては、超音波の照射時間は、目的物質を免疫細胞内へ送達させるのに十分な時間であれば特に制限されず、超音波の出力強度に応じても変動し得るが、例えば、出力強度５０ｍＷ／ｃｍ２であっても、１０秒の照射時間で目的物質を免疫細胞内へ送達させることができる。超音波の照射時間としては、例えば１～６０秒、好ましくは１～３０秒、より好ましくは１～２０秒を挙げることができる。
　本発明における「超音波発生装置」を用いる場合の条件としては、例えば、（i）超音波の出力強度が５０～７２０ｍＷ／ｃｍ２（好ましくは５０～５００ｍＷ／ｃｍ２）、（ii）超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚおよび（iii）超音波の照射時間が１～６０秒の組み合わせが挙げられる。中でも好ましくは、（i）超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２、（ii）超音波の周波数が１～５ＭＨｚおよび（iii）超音波の照射時間が１～６０秒の組み合わせ等が挙げられる。
　本発明のシステムが動物から単離された免疫細胞、またはｉＰＳ細胞などの幹細胞から自体公知の方法を用いて分化誘導された免疫細胞のトランスフェクションに使用される場合、トランスフェクション処理後に該免疫細胞を培養する工程を含んでいてもよい。従って、本発明のシステムは、さらに免疫細胞の培養手段（例えば、培養容器（例、ディッシュ、フラスコ等）、培地、培養装置（例、ＣＯ２インキュベーター等））をさらに含み得る。免疫細胞は浮遊した状態で増殖するので、該培養容器は非接着性または低接着性の基質でコーティングされたものが好ましい。上記の培養工程には、継代培養工程も含まれる。本発明のシステムにより細胞が継代培養された場合、細胞内に導入された目的物質の発現強度が維持され得る。
ＩＩ．本発明の送達性増大方法
　本発明はまた、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波とを用いて、核酸またはタンパク質の免疫細胞内送達性を増大させる方法（以下、「本発明の送達性増大方法」ともいう）も提供する。当該方法は、本発明におけるウルトラファインバブル水等を対象に投与して免疫細胞の近傍に送達させること、および免疫細胞に対して超音波照射を行うことを含み、それにより核酸またはタンパク質が免疫細胞内に送達される。ここで「免疫細胞」とは、上記本発明のシステムにおいて定義されたものと同義である。
　「本発明の送達性増大方法」において使用されるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液としては、上記の本発明におけるウルトラファインバブル水等を用いることができる。また、「本発明の送達性増大方法」における超音波照射は、上記の本発明のシステムにおける超音波発生装置の使用と同様の条件にて実施することができる。
　本発明の送達性増大方法により免疫細胞内への送達性が増大する核酸またはタンパク質は特に制限されないが、例えば、免疫細胞内に送達されることによって、該免疫細胞に好ましい生理活性を付与し得る物質であり得る、例えば、核酸として、ｓｉＲＮＡ（例、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ、ニッポンジーン製）、ｓｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｓ化オリゴＤＮＡ（ホスホロチオエート等）などの小ＲＮＡ／ＤＮＡ、遺伝子（例、プラスミドＤＮＡ，ｍＲＮＡ等）などが挙げられる。また、タンパク質として、例えば、抗体（例、ＩｇＧ（例、Ａｌｅｘａ－ＩｇＧ、インビトロジェン製）等）、ペプチド等を挙げることができるが、それらに限定されない。中でも好ましくは、核酸として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸等、また、タンパク質として抗体等が挙げられる。
　核酸のヌクレオチド数やタンパク質の分子量は特に制限されないが、例えば、核酸がｓｉＲＮＡやアンチセンスオリゴ核酸等の小ＲＮＡ／ＤＮＡの場合、１０ｍｅｒ～３０ｍｅｒ、好ましくは１５ｍｅｒ～２５ｍｅｒ、ＣＡＲやＴＣＲをコードする核酸（Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ）の場合、１～１０ｋｂ、好ましくは２～８ｋｂを挙げることができる。一方、タンパク質の場合、２５ｋＤａ～９００ｋＤａ、好ましくは２５ｋＤａ～３２０ｋＤａを挙げることができる。
　好ましい一実施態様において、核酸はＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸である。以下、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸について詳述する。
（ａ）ＣＡＲをコードする核酸
　ＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（例、ｓｃＦｖ）を含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質である。ＣＡＲの特徴には、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、非ＭＨＣ拘束的様式でＴ細胞の特異性及び反応性を、選択された標的に対して転換する能力が挙げられる。非ＭＨＣ拘束的抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、それにより、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現されると、ＣＡＲは、有利なことに、内在性ＴＣＲ α鎖及びβ鎖と二量体化しない。
　本発明に使用されるＣＡＲは、標的免疫細胞（例、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等）が認識すべき表面抗原（例、がん抗原ペプチド、がん細胞で発現が亢進している表面受容体等）を特異的に認識し得る抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
　抗原結合ドメインが特異的に認識する表面抗原としては、例えば、各種がん（例、急性リンパ球性癌、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌（例、髄芽細胞腫）、乳癌、肛門、肛門管若しくは肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢若しくは胸膜の癌、鼻、鼻腔若しくは中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例、頭頸部扁平上皮癌）、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病（例、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病）、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌（例、非小細胞肺癌）、リンパ腫（例、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌；腹膜、網及び腸間膜の癌；咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌など）で発現が亢進している表面受容体、例えば、ＣＤ１９、ＥＧＦ受容体、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１、ＭＵＣ１６、ＣＤ２０、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、Ｂ－ｃｅｌｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｔｅｎ（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ３、ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３３、ＭＵＣ－１、ＣＤ１３８、ＣＤ２２、ＧＤ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＥＡ、ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ－４、ＩＬ－１３受容体α鎖、ＩｇＧκ軽鎖等や、がん抗原ペプチド（例、ＷＴ１、ＧＰＣ３、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ４等由来のペプチド）等が挙げられるが、それらに限定されない。
　本発明において使用される抗原結合ドメインとしては、標的抗原を特異的に認識し得る抗体フラグメントであれば、特に制限はないが、ＣＡＲ作製の容易さを考慮すれば、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とをリンカーペプチドを介して連結した一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であることが望ましい。一本鎖抗体における軽鎖可変領域と重鎖可変領域の配置は、両者が機能的な抗原結合ドメインを再構成できる限り特に限定されないが、通常Ｎ末端側から軽鎖可変領域－リンカーペプチド－重鎖可変領域の順序で設計され得る。リンカーペプチドとしては、一本鎖抗体の作製に通常使用されている自体公知のリンカーペプチドを用いることができる。軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、重鎖可変領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれ抗体産生細胞から軽鎖遺伝子、重鎖遺伝子をクローニングし、それらを鋳型としてＰＣＲを行う等して調製するか、あるいは既存の抗体の配列情報から化学的に合成することができる。得られた各ＤＮＡ断片とリンカーペプチドをコードするＤＮＡとを、適当な方法によりライゲーションすることにより一本鎖抗体をコードするＤＮＡを取得することができる。抗原結合ドメインのＮ末端側には、ＣＡＲを免疫細胞表面に提示させるために、リーダー配列がさらに付加されていることが好ましい。
　細胞外ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインとしては、当該技術分野で通常使用されるＴ細胞表面分子由来のドメインを適宜使用することができ、例えば、ＣＤ８αやＣＤ２８由来の各ドメインが挙げられるが、それらに限定されない。
　細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３ζ鎖を有するもの、膜貫通ドメインとＣＤ３ζ鎖との間に、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、Ｌｃｋ、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢなどの共刺激伝達モチーフをさらに有するもの、２つ以上の共刺激伝達モチーフを有するもの等が挙げられるが、それらに限定されず、当該技術分野で通常使用される任意のドメインを組み合わせて使用することができる。
　細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列情報は、当該技術分野で周知であり、当業者であれば、それらの情報に基づいて、Ｔ細胞から容易に各ドメインをコードするＤＮＡ断片を取得することができる。
　そのようにして得られた、抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをそれぞれコードするＤＮＡ断片を、常法により連結することにより、ＣＡＲをコードするＤＮＡを取得することができる。
　得られたＣＡＲをコードするＤＮＡは、そのまま、あるいは、適当なリンカー及び／又は核移行シグナル等を付加した後に、Ｔ細胞内で機能的なプロモーターを含む発現ベクター、好ましくはプラスミドベクターに挿入することができる。Ｔ細胞で機能的なプロモーターとしては、哺乳動物細胞で構成的なＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどを用いることができるが、それらに限定されない。また、Ｔ細胞特異的に発現するＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８等の遺伝子プロモーターを用いることもできる。
　ＣＡＲをコードするＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、前記ＣＡＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてｍＲＮＡに転写することにより調製することができる。
（ｂ）外因性ＴＣＲをコードする核酸
　本明細書において、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」とは、ＴＣＲ鎖（α鎖、β鎖）のダイマーから構成され、抗原又は該抗原-ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）（ＭＨＣ；主要組織適合遺伝子複合体）複合体を認識してＴ細胞へ刺激シグナルを伝達する受容体を意味する。それぞれのＴＣＲ鎖は可変領域と定常領域から構成され、可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が存在する。また、本発明で使用されるＴＣＲには、ＴＣＲのα鎖とβ鎖がヘテロダイマーを構成しているものだけでなく、ホモダイマーを構成しているものも包含される。さらに、該ＴＣＲには、定常領域の一部若しくは全部を欠損したものや、アミノ酸配列を組み換えたもの、可溶性ＴＣＲ（ｓｏｌｕｂｌｅ　ＴＣＲ）としたものなども包含される。
　尚、「外因性ＴＣＲ」とは、本発明における標的細胞であるＴ細胞にとって外因性であることを意味する。外因性ＴＣＲのアミノ酸配列は、本発明における標的細胞であるＴ細胞が発現する内因性ＴＣＲと同一であっても、異なっていてもよい。
　本発明に使用されるＴＣＲをコードする核酸は、標的Ｔ細胞が認識すべき表面抗原（例、がん抗原ペプチド等）を特異的に認識し得るＴＣＲのα鎖及びβ鎖をコードする核酸である。
　該核酸は自体公知の方法により調製することができる。目的のＴＣＲのアミノ酸配列または核酸配列が公知である場合には、該配列に基づき、例えば、化学的にＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法やＧｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法を利用して接続することにより、本発明のＴＣＲの全長又は一部をコードするＤＮＡを構築することが可能である。
　目的のＴＣＲの配列が公知でない場合には、例えば、目的のＴＣＲを発現するＴ細胞を含む細胞集団から目的のＴ細胞を単離し、このＴ細胞からＴＣＲをコードする核酸を得ることができる。具体的には、生体（例：ヒト）からＴ細胞を含有する細胞集団（例：ＰＢＭＣ）を採取して、目的のＴＣＲが認識する細胞表面抗原のエピトープの存在下でこれらの細胞集団を刺激しながら培養し、この細胞集団から、該細胞表面抗原を発現する細胞に対する特異性と、ＣＤ８やＣＤ４等の細胞表面抗原とを指標として、公知の方法で該細胞表面抗原を発現する細胞を特異的に認識するＴ細胞を選択することができる。Ｔ細胞の該表面抗原を発現する細胞に対する特異性は、例えば、デキストロマーアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ又は細胞障害性アッセイなどを利用して測定することができる。前記Ｔ細胞を含有する細胞集団は、例えば、目的のＴＣＲが認識する細胞表面抗原を発現する細胞を多く有する生体（例：がんなどの疾患患者、あるいは、該抗原のエピトープ又は該エピトープでパルスした樹状細胞と接触させたＴ細胞含有集団）から採取することが好ましい。
　前記単離したＴ細胞から常法によりＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として、ＴＣＲの定常領域の核酸配列を基にＴＣＲ遺伝子を増幅し、クローニングすることで、本発明の核酸が得られる。また、常法により細胞からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域をそれぞれコードする核酸に相補的なアンチセンスプライマーを用いて、５’－ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）を行うことにより調製することもできる。５’－ＲＡＣＥは公知の方法により行えばよく、例えば、ＳＭＡＲＴ　ＰＣＲ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）のような市販のキットを用いて行うことができる。得られたＴＣＲのα鎖及びβ鎖をそれぞれコードするＤＮＡは、前記ＣＡＲをコードするＤＮＡと同様に、適当な発現ベクターに挿入することができる。α鎖をコードするＤＮＡとβ鎖をコードするＤＮＡとは、同一のベクターに挿入してもよいし、別個のベクターに挿入してもよい。同一のベクターに挿入する場合、該発現ベクターは両鎖をポリシストロニックに発現してもよいし、モノシストロニックに発現してもよい。前者の場合、両鎖をコードするＤＮＡの間にＩＲＥＳやＦＭＶ　２Ａのようなポリシストロニックな発現を許容する介在配列を挿入する。
　また、ＴＣＲの各鎖をコードするＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡは、例えば、該発現ベクターを鋳型として、前記ＣＡＲをコードするＲＮＡと同様にして、調製することができる。
ＩＩＩ．本発明の製剤
　本発明はまた、核酸又はタンパク質と、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液とを組み合わせてなる、該核酸又は該タンパク質を免疫細胞内に送達させるための製剤であって、超音波照射との併用により有効量（免疫細胞が所望の効果を発揮する量）の該核酸又は該タンパク質が免疫細胞内に送達されることを特徴とする、製剤（以下、「本発明の製剤」ともいう。）を提供する。ここで「免疫細胞」とは、上記本発明のシステムにおいて定義されたものと同義である。
　本発明の製剤において、核酸又はタンパク質は、上記「本発明の送達性増大方法」において例示された核酸やタンパク質であり得る。また、本発明の製剤におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液としては、上記「本発明のシステム」において記載されたウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液が用いられる。
　本発明の製剤において、核酸又はタンパク質は、本発明におけるウルトラファインバブル水等と混合して単一の製剤として対象に投与してもよいし、あるいは、両者が同時に免疫細胞の近傍に共存し得る限り、それぞれを別個に製剤化して、同時または時間差をおいて、同一または異なる経路で投与してもよい。
　核酸又はタンパク質と、本発明におけるウルトラファインバブル水等とを別個に製剤化する場合、該核酸又はタンパク質には、医薬上許容できる担体をヒトまたは他の哺乳動物が許容できる量配合することができる。
　医薬上許容できる担体としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、水酸化ナトリウム、塩酸等のｐＨ調節剤；硫酸カナマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、ペニシリンＧカリウム等の抗生物質；乳糖、グルタミン酸カリウム、Ｄ－ソルビトール、アミノ酢酸、ヒト血清アルブミン等の安定剤；フェノールレッド等の着色剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム等の等張化剤等が挙げられる。
　本発明の製剤における核酸またはタンパク質の含有量としては、超音波照射によりそれらが免疫細胞内に送達された場合に該免疫細胞に所望の生理活性等の好ましい物性を付与し得る量であれば特に制限はないが、例えば、本発明の製剤が、核酸としてＣＡＲ又は外因性ＴＣＲをコードする核酸を含み、ヒトを含む哺乳動物に投与される場合、１回につき体重１ｋｇあたり、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲをコードする核酸量として、０．００１ｍｇ～１０ｍｇの範囲で投与される。例えば、ヒト患者に投与する場合、体重６０ｋｇの患者に対し０．００１～５０ｍｇの範囲で投与される。上記の投与量は例示であり、用いる核酸の種類や投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状などにより、投与量を適宜選択することができる。一方、ウルトラファインバブル水等の量としては、超音波照射により核酸またはタンパク質を免疫細胞内に送達させるのに十分な量であれば特に制限はないが、例えば、免疫細胞近傍でのウルトラファインバブル密度が１×１０８～１０×１０８個／ｍＬ、好ましくは２×１０８～５×１０８個／ｍＬとなるように、ウルトラファインバブルを送達させ得る量であればよい。
ＩＶ．本発明の送達方法
　本発明はまた、免疫細胞を、上記本発明の製剤と接触させ、超音波で処理することを含む、該細胞内への核酸又はタンパク質の送達方法を提供する。ここで「免疫細胞」とは、上記本発明のシステムにおいて定義されたものと同義である。
　「本発明の送達性増大方法」、「本発明の送達方法」を適用し得る対象としては、生体から採取した免疫細胞（本明細書において「ｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞」ともいう）もしくはそれを含む組織、動物体内の免疫細胞（本明細書において「ｉｎ　ｖｉｖｏ免疫細胞」ともいう）であれば特に制限はなく、例えば、ヒトおよびその他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）またはそれらに由来する免疫細胞もしくはそれを含む組織などを挙げることができる。対象に本発明におけるウルトラファインバブル水等を投与する手段としては、ウルトラファインバブルを免疫細胞の近傍に送達させることができる投与経路であれば特に制限はない。以下、核酸としてＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸を送達させる場合を具体例として、ｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞とｉｎ　ｖｉｖｏ免疫細胞として分けて説明する。
（ａ）ｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞へのＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸の送達
　本発明の送達方法によれば、本発明におけるウルトラファインバブル水等と超音波とを組み合わせて、ＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸をｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞に送達させることにより、該ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲを発現するｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を製造することができる。従って、本発明はまた、該方法により得られるｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を提供する。ここでの「免疫細胞」としては、上記本発明のシステムにおいて定義されたもののうち、がん細胞等の標的細胞（病原細胞）を、何らかの作用機序により障害し得る能力を有する細胞（いわゆる免疫エフェクター細胞）であれば特に制限はないが、例えば、獲得免疫のうち細胞性免疫を担うＴ細胞や、自然免疫を担うＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等、並びにＮＫ細胞の性質を有するＴ細胞であるＮＫＴ細胞などが挙げられる。好ましい一実施態様においては、免疫細胞はＴ細胞であり得る。生体から採取したＴ細胞を、本明細書において「ｅｘ　ｖｉｖｏ　Ｔ細胞」ともいう。一方、別の好ましい実施態様においては、免疫細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の自然免疫を担う細胞であり得る。Ｔ細胞はＭＨＣタイプが一致する場合でも、同種異系（アロ）移植によりＧＶＨＤを引き起こすリスクが相当程度あるのに対し、アロＮＫ細胞等はＧＶＨＤを引き起こさないと考えられている。従って、種々のＭＨＣタイプのアロｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を準備しておけば、ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆでの使用が可能となる。ＣＡＲ－ＮＫ細胞については、例えば、ＵＳ２０１６／００９６８９２、Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ．　２５（８）：　１７６９－１７８１　（２０１７）等に、ＣＡＲ－樹状細胞、ＣＡＲ－マクロファージ等については、例えば、ＷＯ２０１７／０１９８４８、ｅＬＩＦＥ．　２０１８　ｅ３６６８８等に記載されている。
　本発明の製剤によりＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸を導入するｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞としては、上記のエフェクター免疫細胞、あるいはそれらに最終分化し得る単能性もしくは多分化能を有する幹細胞又はその前駆細胞（但し、胚および他の全能性または多能性幹細胞を除く。）を含む細胞集団であれば、単離精製された特定の免疫細胞（例、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等、ＮＫＴ細胞又はそれらの幹／前駆細胞）であっても、例えば、リンパ球のような複数種の免疫細胞を含む不均質な細胞集団であってもよい。単離精製されたＴ細胞としては、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞などが挙げられるが、好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞である。
　前記リンパ球は、ヒト又は非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄及び臍帯血より採取したり、ｉＰＳ細胞などの幹細胞から製造することができる。本発明の製剤によりＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞（例、ｅｘ　ｖｉｖｏ　Ｔ細胞）を、癌などの疾患の治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象自身、又は治療対象のＭＨＣタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。
　免疫細胞に最終分化し得る単能性もしくは多分化能を有する幹細胞又は前駆細胞としては、例えば、造血幹細胞、ミエローリンフォイド共通前駆細胞（ＭＬＰ）、ミエロイド系前駆細胞（ＭＰ）、顆粒球単核前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ－樹状細胞前駆細胞（ＭＤＰ）、樹状細胞前駆細胞（ＤＣＰ）などが挙げられる。これらの幹／前駆細胞は、自体公知の方法により各種免疫細胞、例えばＴ細胞に分化させることができる。
　本発明の製剤をｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞に接触させる方法に特に限定はないが、例えば、通常の免疫細胞の培地に本発明の製剤を添加すればよい。免疫細胞は、培養容器に接着せずに浮遊した状態で増殖するので、ｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞の前培養および本発明の製剤との接触は、非接着性または低接着性の基質でコーティングされた培養容器内で行うことが好ましい。超音波照射は、上記本発明のシステムにおいて記載した超音波発生装置と照射条件を用いて、ｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞に対して実施することができる。
　本発明の製剤が、特に外因性ＴＣＲをコードする核酸を活性成分として含む場合、外因性ＴＣＲの発現上昇、ミスペアＴＣＲの出現の抑制、又は自己反応性の抑制の観点から、該Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現をｓｉＲＮＡによって抑制してもよい。前記の核酸を当該方法に適用する場合には、外因性ＴＣＲに対するｓｉＲＮＡの効果を避けるため、該ＴＣＲをコードする核酸の塩基配列を、内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現を抑えるｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡに対応する塩基配列とは異なる配列（コドン変換型配列）とすることが好ましい。これらの方法は、例えば国際公開第２００８／１５３０２９号に記載されている。前記の塩基配列は、天然から取得されたＴＣＲをコードする核酸へのサイレント変異の導入や、人為的に設計した核酸を化学的に合成することで作製することができる。あるいは、内在性のＴＣＲ鎖とのミスペアを避けるため、外因性ＴＣＲをコードする核酸の定常領域の一部又は全部を、ヒト以外の動物、例えばマウス由来の定常領域に置換してもよい。
（ｂ）ｉｎ　ｖｉｖｏ免疫細胞へのＣＡＲまたは外因性ＴＣＲをコードする核酸の送達
　本発明の送達方法によれば、本発明の製剤を、哺乳動物（ヒト又は他の哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル）、好ましくは、ヒト）に投与し、免疫細胞を含む組織・臓器（例、脾臓、胸腺等）に超音波照射を行うことにより、該動物体内の免疫細胞、例えばＴ細胞（本明細書において「ｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｔ細胞」ともいう）内に該核酸が導入され、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲの発現を誘導することができる。該ｉｎ　ｖｉｖｏ　免疫細胞が、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲが標的とする表面抗原を発現するがん細胞等を特異的に認識して当該疾患細胞を殺傷することにより、当該疾患に対する予防又は治療効果を発揮し得る。
　本発明の製剤は、例えば注射剤の形態で、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、脳内注射、脳脊髄液内注射、眼内注射等によりｉｎ　ｖｉｖｏ免疫細胞の近傍に該核酸及びウルトラファインバブル水等を送達させることができる。また、超音波照射は、従来より超音波診断に用いられている操作を、標的部位をｉｎ　ｖｉｖｏ免疫細胞を含む組織・臓器に代えて実施すればよい。
　「本発明の送達性増大方法」、「本発明の送達方法」をｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞、即ち、動物から単離された免疫細胞、またはｉＰＳ細胞などの幹細胞から自体公知の方法を用いて分化誘導された免疫細胞に適用する場合、トランスフェクション処理後に該免疫細胞を培養する工程を含んでいてもよい。当該培養工程は、自体公知の培養容器（例、ディッシュ、フラスコ等）や培養装置（例、ＣＯ２インキュベーター等）を用い、最終分化した免疫細胞の維持培養や、より未分化な幹／前駆細胞から最終分化した免疫細胞への分化誘導に通常使用される培地中で行うことができる。免疫細胞は、培養容器に接着せずに浮遊した状態で増殖するので、ｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞の培養は、非接着性または低接着性の基質でコーティングされた培養容器内で行うことが好ましい。また、上記の培養工程には、継代培養工程も含まれる。「本発明の送達性増大方法」、「本発明の送達方法」により細胞が継代培養された場合、細胞内に導入された目的物質の発現強度が維持され得る。
Ｖ．本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を含む医薬
　本発明システムを用いて、また、本発明の送達方法により、目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞は、該目的物質の作用により所望の効果が奏される（例えば、新たな生理活性を獲得する）ので、そのまま、あるいは、公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。賦形剤は、当業者にはよく知られており、また、湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も使用することができる。さらに、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び分散剤などの製剤補助剤などを用いてもよい。また、上記医薬組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的に又は局所的に、経口投与又は非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
　例えば、目的物質がＣＡＲ又は外因性ＴＣＲをコードする核酸である場合、該目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞は、該ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲが特異的に認識する表面抗原を発現する細胞を特異的に認識し、これを殺傷（例、アポトーシスを誘導）することができる。従って、表面抗原として、がん細胞等の疾患細胞で特異的に発現するか、発現が亢進している表面分子を認識するＣＡＲ又は外因性ＴＣＲをコードする核酸を活性成分として含有させることにより、該核酸が導入され、該ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲを発現したｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞は、がん等の疾患の予防又は治療のために用いることができ、ヒト又は他の哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル）、好ましくはヒトに安全に投与することができる。
　好ましい実施態様において、本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を含む医薬は、がんの予防又は治療薬であり得る。当該医薬の適用対象となるがんは特に制限されず、例えば、急性リンパ球性癌、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌（例、髄芽細胞腫）、乳癌、肛門、肛門管若しくは肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢若しくは胸膜の癌、鼻、鼻腔若しくは中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例、頭頸部扁平上皮癌）、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病（例、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病）、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌（例、非小細胞肺癌）、リンパ腫（例、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌；腹膜、網及び腸間膜の癌；咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌などが挙げられるが、それらに限定されない。
　本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を含む医薬の投与量としては、例えば、１回につき体重１ｋｇあたり、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲをコードする核酸量として、０．００１ｍｇ～１０ｍｇの範囲で投与される。例えば、ヒト患者に投与する場合、体重６０ｋｇの患者に対し０．００１～５０ｍｇの範囲で投与される。上記の投与量は例示であり、用いる核酸の種類や投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状などにより、投与量を適宜選択することができる。
　本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ免疫細胞を含む医薬は、非経口的に対象に投与して用いることが好ましい。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下投与などの方法が挙げられる。投与量は、対象の状態、体重、年齢等応じて適宜選択されるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、通常１×１０６～１×１０１０個となるように、好ましくは１×１０７～１×１０９個となるように、より好ましくは５×１０７～５×１０８個となるように投与される。また、１回で投与してもよく、複数回にわたって投与してもよい。
　以下、参考例および実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
　以下の参考例および実施例において、「％」は特記しない限り、重量／容量％を示す。
参考例１：ウルトラファインバブル水の調製
　注射用水２Ｌまたは薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３．０）２Ｌにポリソルベート８０を２ｇ溶解させ（０．１％　ポリソルベート８０）、ＩＤＥＣ社製ウルトラファインバブル発生装置（ｎａｎｏＧＡＬＦＴＭＦＺ１Ｎ－０２）を用いて、以下の設定によりウルトラファインバブル水溶液を調製した。酸性緩衝液（薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液：ｐＨ３．０）を用いるとプラスチャージのウルトラファインバブルを、注射用水を用いるとマイナスチャージのウルトラファインバブルを製造できる。
　・調製に用いたガス：空気
　・気泡水流量：約４．０Ｌ／分
　・溶解圧力：３００ＫＰａ±５％（ｓ．ｄ．）
　調製されたウルトラファインバブル水溶液は、適宜、オートクレーブを用いて１２１～１２４℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。滅菌後にナノサイト
社、ＬＭ１０を用いたレーザー光散乱を利用したトラッキング法（追尾法）を用いてウルトラファインバブル平均径、ウルトラファインバブル密度およびｄ９０／ｄ１０比を測定した。
　結果を以下に示す。
　ウルトラファインバブル平均径：１２０ｎｍ±１６ｎｍ
　ウルトラファインバブル密度：４×１０８個／ｍＬ
　ｄ９０／ｄ１０比：３．３
実施例１　Ｔ細胞への遺伝子導入
　１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中のＪｕｒｋａｔ　Ｅ６．１（３×１０４　ｃｅｌｌ，０．５ｍＬ）を４８ｗｅｌｌに播種した。培地を除去した後にｐＧＦＰ　５μｇ含有したウルトラファインバブル／ＲＰＭＩ培地を０．５ｍＬ加えた。ウルトラファインバブル／ＲＰＭＩ培地は、ＲＰＭＩ培地用粉末に参考例１で調製したウルトラファインバブル水溶液を１Ｌ加え、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３及び１０％　ＦＢＳを添加したものを、トランスフェクション用培地として用いた。
　ｐＧＦＰ含有培地を添加した後、超音波発生装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いて周波数１ＭＨｚ、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２で１０ｓｅｃ超音波照射した後、２ｈｒ培養し、その後トランスフェクション用培地を除去し、ＲＰＭＩ培地（培養用培地）で４８時間培養した。その後、細胞を回収し、細胞溶解液０．１５ｍＬで完全に溶解させた後に、ＧＦＰの蛍光量を分光蛍光光度計で測定した。生存細胞数も測定し、生存細胞あたりの蛍光量に換算して、比較を行った。
　結果を図１に示す。
実施例２　Ｔ細胞へのタンパク質導入
　１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中のＪｕｒｋａｔ　Ｅ６．１（３×１０４　ｃｅｌｌ，０．５ｍＬ）を４８ｗｅｌｌに播種した。培地を除去した後にＩｇＧ－ＦＩＴＣを含有したウルトラファインバブル／ＲＰＭＩ培地（ＩｇＧ－ＦＩＴＣ　４０μＬに対しウルトラファインバブル／ＲＰＭＩ培地を４ｍＬ添加した）を０．５ｍＬ加えた。ウルトラファインバブル／ＲＰＭＩ培地は、ＲＰＭＩ培地用粉末に参考例１で調製したウルトラファインバブル水溶液を１Ｌ加え、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３及び１０％　ＦＢＳを添加したものを、トランスフェクション用培地として用いた。
　ＩｇＧ－ＦＩＴＣ含有培地を添加した後、超音波発生装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いて周波数１ＭＨｚ、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２で１０ｓｅｃ超音波照射した後、２ｈｒ培養し、その後トランスフェクション用培地を除去し、ＲＰＭＩ培地（培養用培地）で４８時間培養した。その後、ＩｇＧ－ＦＩＴＣの蛍光量を分光蛍光光度計で測定した。生存細胞数も測定し、生存細胞あたりの蛍光量に換算して、比較を行った。
　結果を図２に示す。
　本発明のシステムは、低い出力強度の超音波を照射することで、効率よく免疫細胞内へ核酸やタンパク質等の目的物質を送達させることができるので、安全性の高い免疫細胞内への薬物送達システムを提供することができる。また、従来のマイクロバブルを使用した場合と比較し、ウルトラファインバブルを使用することにより、細胞内への目的物質の導入効率を顕著に増大させることができる。さらに、リポソームを用いる必要がないので、安価に製造可能でかつ安全性も高い。以上より、本発明のシステムは、免疫細胞内への新規なＤＤＳとして、きわめて有用である。
　本出願は日本で出願された特許出願である特願２０１９－１１９１６４（出願日:２０１９年６月２６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (16)

  1. 　平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、免疫細胞内への目的物質の送達システム。
  2. 　ウルトラファインバブル水溶液が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝液から選ばれる１または２以上の成分を含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 　ウルトラファインバブル水溶液が、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、請求項１に記載のシステム。
  4. 　ウルトラファインバブルが、パーフルオロ炭化水素または空気で構成される、請求項１に記載のシステム。
  5. 　ウルトラファインバブルの平均径が、５０ｎｍ～２００ｎｍである、請求項１に記載のシステム。
  6. 　ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が５以下である、請求項１に記載のシステム。
  7. 　ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８個／ｍＬ以上である、請求項１に記載のシステム。
  8. 　超音波発生装置において超音波の出力強度が、７２０ｍＷ／ｃｍ２以下である、請求項１に記載のシステム。
  9. 　超音波発生装置において超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２および超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚである、請求項１に記載のシステム。
  10. 　目的物質が核酸又はタンパク質である、請求項１に記載のシステム。
  11. 　核酸がキメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体をコードする、請求項１０に記載のシステム。
  12. 　免疫細胞がＴ細胞である、請求項１に記載のシステム。
  13. 　免疫細胞内へ核酸を送達するための、請求項１１に記載のシステム。
  14. 　平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波とを用いて、核酸またはタンパク質の免疫細胞内送達性を増大させる方法。
  15. 　核酸又はタンパク質と、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液とを組み合わせてなる、該核酸又は該タンパク質を免疫細胞内に送達させるための製剤であって、超音波照射との併用により有効量の該核酸又は該タンパク質が免疫細胞内に送達されることを特徴とする、製剤。
  16. 　免疫細胞を、請求項１５に記載の製剤と接触させ、超音波で処理することを含む、該細胞内への核酸又はタンパク質の送達方法。
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