WO2020262983A1 - 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 및 이의 저해제 - Google Patents

신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 및 이의 저해제 Download PDF

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WO2020262983A1
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김우현
남태식
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02006—NAD(P)+ nucleosidase (3.2.2.6)

Definitions

  • the present invention relates to a novel ADP-ribosyl cyclase that converts NAD + into cyclic ADP-ribose and an inhibitor thereof.
  • ADPRC is an enzyme that synthesizes cyclic ADP-ribose (cADPR) from NAD + and nicotinic acid adenine dinucletide phosphate (NAADP) from NADP +, from plants to mammals. It exists in a wide range. This ADPRC is known to regulate various functions of cells by releasing calcium from the intracellular calcium reservoir into the cytoplasm [Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529, 2003; Lee HC, Mol. Med. 12 317-323, 2006].
  • cADPR cyclic ADP-ribose
  • NAADP nicotinic acid adenine dinucletide phosphate
  • the intracellular calcium concentration is maintained at a baseline level below 10 -7 M.
  • the intracellular calcium concentration is increased to about 10 times the baseline value, and if the calcium concentration is kept high in the pathological state, many functions of the cell are affected. Function is lost.
  • Diabetes, obesity, dementia, ischemia, and cell proliferation with hypertension or hypertension also cause abnormalities in the regulation of intracellular calcium metabolism, and the intracellular calcium concentration is maintained higher than normal [Resnick LM. Am. J. Hypertens. 6:123S-134S, 1993].
  • This elevated blood pressure secondaryly causes proliferation and hypertrophy of vascular smooth muscle cells and fibrous tissue, and as a result, further increases peripheral vascular resistance and blood pressure, thereby inhibiting organ functions such as the cardiovascular system, brain, and kidneys, resulting in myocardial infarction.
  • Angina pectoris, stroke and chronic heart failure are known to lead to death [Cowley AW Jr. Physiol Rev. 72:231-300, 1992].
  • ADPRC is present in immune cells, cardiomyocytes, pancreatic beta cells, renal muscle cells, and nerve cells, and is associated with receptors of various hormones, thereby increasing intracellular calcium concentration and regulating various physiological activities, thereby causing abnormal regulation of the expression or activity of ADPRC. If this is present, it can cause abnormalities in the regulation of physiological phenomena (immunity, kidney function, insulin secretion, cardiovascular function).
  • This ADPRC is activated by several hormones, and this enzyme produces cADPR, a product from the substrate NAD + , which increases intracellular calcium in almost all organs.
  • abnormal increase of calcium due to ADPRC activity is caused by insulin secretion [Kim BJ, Park KH, Yim CY, Takasawa S, Okamoto H, Im MJ, Kim UH. Diabetes. 57: 868-878, 2008], hypertrophy [Gul R, Park JH, Kim SY, Jang KY, Chea JK, Ko JK, Kim UH. Cardiovasc Res.
  • ADPRC which has been best studied so far, is CD38, a T-cell surface antigen, which is widely expressed in various organs as well as immune cells.
  • tissue-specific ADPRC expression will be helpful in treating diseases caused by increased intracellular calcium.
  • the mechanism of activation of ADPRC is still unknown.
  • the present inventors discovered and confirmed the activity of a new type of ADPRC enzyme other than the existing ADPRC (CD38, CD157) known in mammals, and reached the completion of the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a novel ADP-ribosyl cyclase (ADPRC) or a naturally occurring variant thereof.
  • ADPRC ADP-ribosyl cyclase
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a vector containing the nucleic acid molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a host cell comprising the vector.
  • Another object of the present invention is the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof, a nucleic acid molecule encoding the same or a vector containing the nucleic acid molecule, NAD + cyclic ADP-ribo To provide a catalyst composition for converting to cyclic ADP-ribose (cADPR).
  • cADPR cyclic ADP-ribose
  • Another object of the present invention is a drug for the prevention or treatment of ADP-ribosyl cyclase-mediated diseases comprising an expression inhibitor or an activity inhibitor of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof as an active ingredient It is to provide a medical composition.
  • Another object of the present invention is a food for preventing or improving ADP-ribosyl cyclase-mediated diseases comprising an expression inhibitor or an activity inhibitor of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof as an active ingredient It is to provide a composition.
  • Another object of the present invention is to provide an animal model with a heterotype gene deletion of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information on diagnosis of ADP-ribosyl cyclase mediated disease.
  • Another object of the present invention is an ADP-ribosyl cyclase-mediated disease comprising an agent measuring the gene expression level of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof, or an agent measuring the protein level It is to provide a composition for diagnosis of.
  • Another object of the present invention is an ADP-ribosyl cyclase-mediated disease comprising an agent measuring the gene expression level of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof, or an agent measuring the protein level It is to provide a diagnostic kit of.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance for the prevention or treatment of the ADP-ribosyl cyclase-mediated disease.
  • the present invention relates to an ADP-ribosyl cyclase (ADPRC) or a naturally occurring variant thereof comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. to provide.
  • ADPRC ADP-ribosyl cyclase
  • the present inventors seek to discover a novel ADP-ribosyl cyclase in addition to the conventionally known ADP-ribosyl cyclase. As a result of earnest efforts, the present invention was completed.
  • ADP-ribosyl cyclase or “ADP-ribosyl cyclase (ADPRC)” refers to an enzyme that converts NAD + into cyclic ADP-ribose (cADPR).
  • the term “aDpi-ribosyl cyclase variant” refers to a variant in which some amino acid sequences of the ADP-ribosyl cyclase are naturally or artificially substituted, deleted, or added, and NAD + is cyclic ADP-ribose (cyclic ADP-ribose; cADPR) refers to a variant of ADP-ribosyl cyclase possessing the activity of a catalytic conversion.
  • naturally occurring variant of ADP-ribosyl cyclase refers to a naturally occurring variant of ADP-ribosyl cyclase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. As, it refers to a variant of ADP-ribosyl cyclase possessing the activity of a catalyst for converting NAD + to cyclic ADP-ribose (cADPR).
  • the naturally occurring variants of the ADP-ribosyl cyclase of the present invention are species variants, species homologs, isoforms, alleles. It is a naturally occurring variant selected from the group consisting of alllelic variants, conformation variants, splice variants, and point mutant variants.
  • the naturally occurring variant of the ADP-ribosyl cyclase of the present invention is preferably 50% or more homologous to the ADP-ribosyl cyclase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more preferably It has at least 60% homology, even more preferably at least 70% homology, even more preferably at least 80% homology, and most preferably at least 90% homology.
  • the naturally occurring variant of the ADP-ribosyl cyclase of the present invention is generated in an organism selected from the group consisting of mammals, birds, reptiles, amphibians and fish.
  • the naturally occurring variant of the ADP-ribosyl cyclase of the present invention is compared with the ADP-ribosyl cyclase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It was found to have a homology of 70% or more, birds, reptiles and amphibians, 60% or more, and 50% or more of fish.
  • the naturally occurring variant of the ADP-ribosyl cyclase of the present invention is compared with the ADP-ribosyl cyclase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, human And 96% for rats, 93% for champs, 91% for guinea pigs and horses, 90% for dogs, goats and sheep, 89% for rabbits, 88% for pigs, 78% for cattle, 70% for chickens, and 63 for frogs. %, turkey showed a high homology of 62%, it was confirmed that the proportion of conservative sequences between species is a very high enzyme (Fig. 4).
  • the naturally occurring variant of the ADP-ribosyl cyclase of the present invention comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 21 in Sequence Listing.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof, a vector containing the nucleic acid molecule, or a host cell containing the vector. to provide.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be isolated or recombinant, and includes DNA and RNA in the form of single-stranded and double-stranded as well as corresponding complementary sequences.
  • nucleic acids enzymatically or chemically synthesized from the template such as PCR products, cDNA molecules, or oligonucleotides
  • the nucleic acid resulting from such a procedure can be understood as an isolated nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule refers to a nucleic acid molecule in the form of a separate fragment or as a component of a larger nucleic acid construct.
  • Nucleic acids are "operably linked" when placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • the DNA of the presequence or secretion leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when expressed as a preprotein, which is a form before the polypeptide is secreted
  • the promoter or enhancer is a polypeptide sequence Is operably linked to the coding sequence when it affects the transcription of, or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • operably linked means that the DNA sequences to be linked are located contiguously, and in the case of a secretory leader, it means that they are contiguous and exist within the same reading frame. However, enhancers need not be located adjacent to each other. Linkage is achieved by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker is used according to a conventional method.
  • the nucleic acid molecule is cDNA.
  • the term "vector” refers to a delivery system capable of inserting a nucleic acid sequence into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence.
  • Nucleic acid sequences can be exogenous or heterologous.
  • the vector include, but are not limited to, plasmids, cosmids, and viruses (eg, bacteriophage).
  • viruses eg, bacteriophage.
  • Those skilled in the art can construct vectors by standard recombinant techniques (Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; and Ausubel et al., In: Current. Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994, etc.).
  • expression vector refers to a vector including a nucleic acid sequence encoding at least a portion of the gene product to be transcribed. In some cases, the RNA molecule is then translated into a protein, polypeptide, or peptide. Expression vectors may contain various regulatory sequences. Along with the regulatory sequences that control transcription and translation, vectors and expression vectors may contain nucleic acid sequences that also provide other functions.
  • the term "host cell” includes eukaryotes and prokaryotes, and refers to any transformable organism capable of replicating the vector or expressing a gene encoded by the vector.
  • the host cell may be transfected or transformed by the vector, which refers to a process in which exogenous nucleic acid molecules are transferred or introduced into the host cell.
  • the host cells of the present invention are preferably bacterial cells, yeast, animal or human cells (CHO cells, HeLa cells, HEK293 cells, MES13 cells, BHK-21 cells, COS7 cells, COP5 cells, A549 cells). , NIH3T3 cells, etc.), but are not limited thereto.
  • the present invention comprises the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, or a vector containing the nucleic acid molecule, cyclic NAD + It provides a catalyst composition for converting to ADP-ribose (cyclic ADP-ribose; cADPR).
  • the catalyst composition of the present invention efficiently catalyzes the conversion of NAD + to cADPR.
  • the present invention provides a composition comprising an inhibitor of the expression or activity of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating ADP-ribosyl cyclase mediated diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises (a) the expression inhibitor or activity inhibitor; And (b) may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition of the present invention is a food composition for preventing or improving ADP-ribosyl cyclase-mediated diseases.
  • the present invention provides a method for preventing or treating adipi-ribosyl cyclase mediated disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition.
  • the present invention provides an inhibitor of expression or activity of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof for use in therapy. .
  • the type of ADP-ribosyl cyclase-mediated disease to be prevented or treated by the present invention is not limited, preferably diabetes or kidney disease, more preferably renal failure, nephropathy, nephritis (nephritis), renal fibrosis (renal fibrosis) or nephrosclerosis (nephrosclerosis).
  • the renal failure is chronic renal failure (Chronic Renal Failure), acute renal failure (Acute Renal Failure), or mild renal failure before dialysis.
  • the nephropathy is Nephropathy Syndrome, Lipoid Nephropathy, Diabetic Nephropathy, Immunoglobin A Nephropathy (IgA Nephropathy), Analgesic Nephropathy, or It is Hypertensive Nephropathy.
  • the composition of the present invention is a candidate for the treatment of kidney diseases including chronic kidney failure or diabetic nephropathy through a significant decrease in kidney weight to body weight, a significant increase in creatine clearance, and a significant decrease in urine albumin amount.
  • kidney diseases including chronic kidney failure or diabetic nephropathy through a significant decrease in kidney weight to body weight, a significant increase in creatine clearance, and a significant decrease in urine albumin amount.
  • Fig. 6 the ADP-ribosyl cyclase activity and the concentration of cADPR were lowered to normal levels (Fig. 7); Lowering the expression levels of TGF- ⁇ 1, Fibronectin, and Collagen IV to normal levels (FIG.
  • expression inhibitor refers to a substance that inhibits the expression of the ADP-ribosyl cyclase, and a person skilled in the art can easily manufacture it from the structure and function of the ADP-ribosyl cyclase. .
  • the expression inhibitor of the present invention is not limited, but preferably, an antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA, which binds complementarily to the mRNA of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring mutant gene thereof, It is any one selected from the group consisting of miRNA, ribozyme, DNAzyme, and protein nucleic acid (PNA).
  • siRNA siRNA
  • shRNA which binds complementarily to the mRNA of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring mutant gene thereof.
  • PNA protein nucleic acid
  • the siRNA contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the term “activity inhibitor” refers to a substance that inhibits the activity of the expressed ADP-ribosyl cyclase protein, and preferably the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant protein thereof It is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, and antibodies that specifically bind to.
  • the compound is 4,4'-dihydroxyazobenzene, 2-(1,3-benzoxazol-2-ylamino)-1-methyl
  • the 4,4'-dihydroxyazobenzene of the present invention may preferably be represented by the following Formula 1:
  • 2-(1,3-benzoxazol-2-ylamino)-1-methylquinazolin-4(1H)-one of the present invention may preferably be represented by the following formula (2):
  • Dicaffeoylquinic acid (DCQA) of the present invention is the following formulas 3 to 8 (1,4-DCQA, 3,4-DCQA, 3,5-DCQA, 4,5-DCQA, 1,3-DCQA And 1,5-DCQA) may be represented by any one compound selected from the group consisting of:
  • the expression inhibitor or activity inhibitor for the novel ADPR-ribosyl cyclase according to the present invention contributes to inhibiting kidney disease through a mechanism that regulates the expression or activity of ADPRC. Became.
  • the expression inhibitor or activity inhibitor for the novel ADP-ribosyl cyclase of the present invention can be used as a clinically useful selective inhibitor for each cell, and further prevent, ameliorate and/or treat intrarenal diseases.
  • composition of the present invention may be used in combination with an active ingredient, a novel inhibitor of ADPRC expression or activity inhibitor, as well as a previously known therapeutic agent for ADPRC-related diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders and dizziness or similar reactions when administered to humans.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stea, stevia, glycerin, glycerin, glycerin, g
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and may be administered by, for example, intravenous injection, local injection, and intraperitoneal injection.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity of the patient, Usually, the skilled practitioner can readily determine and prescribe the dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be made by incorporating it into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • composition of the present invention when prepared as a food composition, it includes, as an active ingredient, an expression inhibitor or an activity inhibitor for the ADP-ribosyl cyclase, as well as ingredients that are commonly added during food production, for example, Includes proteins, carbohydrates, fats, nutrients, flavoring and flavoring agents.
  • examples of the aforementioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides, and the like; And polysaccharides, for example, common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agent natural flavoring agents (taumatin, stevia extract [for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.]) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food composition of the present invention when prepared as a drink, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, headworm extract, in addition to the expression inhibitor or activity inhibitor for ADP-ribosyl cyclase of the present invention, Jujube extract, licorice extract, and the like may be additionally included.
  • the food composition of the present invention controls various kidney-related pathological form-related factors (significant decrease in kidney weight versus body weight, significant increase in creatine clearance, significant decrease in urine albumin content; expression levels of TGF- ⁇ 1, Fibronectin, and Collagen IV) Is reduced to normal level; glomerular thickening, invasion of inflammatory cells, and recovery of the formation of heterogeneous epithelial cells to a normal level) have an excellent effect in improving kidney disease.
  • the present invention is an animal with a heterotype gene deletion of ADP-ribosyl cyclase (ADPRC) or a naturally occurring variant thereof. Provide a model.
  • ADPRC ADP-ribosyl cyclase
  • the animal is a mammal other than humans, birds, reptiles, amphibians or fish.
  • the present invention provides a method for determining whether an ADP-ribosyl cyclase mediated disease comprising the following steps: (a) the ADP-ribosyl cyclase or its natural Inducing a specific disease in the heterotype gene deletion animal model and the wild-type animal model of the mutant generated as a result; And (b) checking differences between the animal models.
  • a specific disease eg, diabetes, kidney disease, hypertension, obesity, etc.
  • a specific disease eg, diabetes, kidney disease, hypertension, obesity, etc.
  • ADP-ribosyl cyclase e.g., diabetes, kidney disease, hypertension, obesity, etc.
  • differences between the animal models eg, differences in body weight, kidney weight, blood pressure, creatine clearance, blood sugar, inflammation, glomerular thickening, etc.
  • the present invention provides a method for providing information on diagnosis of an ADP-ribosyl cyclase mediated disease comprising the following steps:
  • step 2) Comparing the expression or activity level of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof in step 1) with a normal control to determine an individual at risk of developing a cyclase-mediated disease.
  • diagnosis means to identify the presence or characteristics of a pathological condition.
  • diagnosis is to confirm the current onset or the likelihood of developing an ADP-ribosyl cyclase-related or mediated disease.
  • ADP-ribosyl cyclase is activated by several hormones, and this enzyme produces cADPR, a product from the substrate NAD + , which increases intracellular calcium in almost all organs.
  • cADPR a product from the substrate NAD +
  • an abnormal increase in calcium due to the activity of ADP-ribosyl cyclase is known to be a factor of various biopathology such as insulin secretion, hypertrophy, and cell proliferation. Accordingly, it is possible to provide useful information for diagnosis of an ADP-ribosyl cyclase mediated disease caused by an increase in intracellular calcium through measurement of the expression or activity level of the ADP-ribosyl cyclase.
  • the present invention provides an agent or protein level measuring the gene expression level of ADP-ribosyl cyclase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring variant thereof. It provides a composition for diagnosis of an ADP-ribosyl cyclase-mediated disease comprising an agent to be measured.
  • the agent for measuring the gene expression level of the present invention is a primer or probe that specifically binds to a gene encoding ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof. .
  • the agent for measuring the protein level of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof, when using this antibody or antigen-binding fragment thereof, ADP-ribosyl cyclase contained in the sample or its naturally occurring It is possible to accurately measure the amount of mutant.
  • the amount of ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof can be quantified by analyzing the antigen against the antibody through antigen-antibody binding reaction, and the antigen-antibody binding reaction Is a conventional ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), Sandwich assay, Western Blot on polyacrylamide gel, Immunoblot assay, and immunohistochemical staining method ( Immnohistochemical staining) is preferably selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the fixture for the antigen-antibody binding reaction is composed of a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a well plate synthesized of polyvinyl resin or polystyrene resin, and a slide glass made of glass. Those selected from the group may be used, but are not limited thereto.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a conventional color developing agent that performs a color development reaction, and HRP (Horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, colloid gold, and FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) , RITC (Rhodamine-B-isothiocyanate), or any one of a label selected from the group consisting of a fluorescent substance (Fluorescein) and a dye (Dye) may be used.
  • HRP Haseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • colloid gold and FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)
  • RITC Rhodamine-B-isothiocyanate
  • Substrates that induce color development are preferable to be used depending on the label that reacts to color development, and TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline) -6-sulfonic acid)] and OPD (ophenylenediamine) It is preferable to use any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention provides an agent or protein level measuring the gene expression level of ADP-ribosyl cyclase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring variant thereof. It provides a diagnostic kit for ADP-ribosyl cyclase-mediated disease comprising an agent to be measured.
  • the diagnostic kit of the present invention may further include a composition, solution, or device of one or more other components suitable for the analysis method or instructions for use thereof.
  • the present invention provides a method for screening a substance for preventing or treating ADP-ribosyl cyclase mediated disease comprising the following steps:
  • Measurement of the gene expression level of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof is not limited thereto, but preferably, immunoprecipitation, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, RT-PCR, Western blot (Western Blotting) and flow cytometry (FACS) is measured by one or more methods selected from the group consisting of.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • FACS flow cytometry
  • the measurement of the protein level of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof is not limited thereto, but preferably, SDS-PAGE, immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA), mass spectrometry and protein chip It is measured by one or more methods selected from the group consisting of.
  • the present invention is a novel ADP-ribosyl cyclase or a drug for the prevention or treatment of a disease mediated by ADP-ribosyl cyclase comprising as an active ingredient an inhibitor of expression or an activity inhibitor of a naturally occurring variant thereof Provide a pharmaceutical composition.
  • the present invention mediated ADP-ribosyl cyclase comprising an agent measuring the gene expression level of the ADP-ribosyl cyclase or a naturally occurring variant thereof or an agent measuring the protein level It provides a composition for diagnosis of disease.
  • composition of the present invention has the effect of inhibiting an increase in calcium in kidney cells due to an increase in the expression or activity of new ADP-ribosyl cyclase by angiotensin II, and thus ADP-ribosyl cyclase mediated diseases, particularly It can be usefully used as a therapeutic agent for kidney disease.
  • FIG. 1 is a diagram showing the measurement of the NED-glycohydrolase (NADase) activity of new ADPRCs in HEK293 cells and MES13 cells.
  • NADase NED-glycohydrolase
  • 2 is a view evaluating the cADPR synthesis ability of purified FLAG-ADPRC.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement of intracellular cADPR production by new ADPRC when MES13 cells are stimulated with angiotensin II.
  • Figure 5 is a diagram measuring the effect of a new inhibitor inhibiting the activity of a new ADPRC NAD glycohydrolase (NADase).
  • Figure 6 is a blood glucose (Figure 6a), kidney weight (kidney weight) and body weight (body weight) ratio ( Figure 6b), creatinine clearance (Figure 6c) and urine albumin amount (Figure 6d) of the diabetic kidney disease mouse model. It is a diagram measuring the effect of Dicaffeolylquinic acid (DCQA).
  • DCQA Dicaffeolylquinic acid
  • FIG. 7 is a view measuring the effect of DCQA on the activity of ADPRC (FIG. 7A) and cADPR concentration (FIG. 7B) in diabetic kidney disease mouse model kidney tissue.
  • FIG. 8 is a view measuring the effect of DCQA on the expression change of TGF- ⁇ 1, Fibronectin and Collagen IV in diabetic kidney disease mouse model kidney tissue.
  • H&E Hematoxylin and Eosin
  • Figure 10 is a measurement of blood sugar (Figure 10a), the ratio of kidney weight to body weight (Figure 10b) and creatinine clearance (Figure 10c) of diabetic kidney disease model of normal mice and ADPRC hetero (ADPRC (+/-)) mice It is a drawing.
  • FIG. 11 is a graph measuring the effect of DCQA on blood pressure (FIG. 11A) and creatinine clearance (FIG. 11B) of normal and hypertensive mouse models.
  • ADP-ribosyl cyclase of SEQ ID NO: 1
  • the cDNA sequence encoding the ADPRC was ligated to the FLAG-CMV-2 vector to create a FLAG-ADPRC plasmid, which was HEK293
  • New ADPRC overexpression was induced in cells or MES13 cells using a transfection reagent.
  • the new overexpressed ADPRC was dissolved in a lysis buffer. 45 ⁇ l of the dissolved sample was treated with 5 ⁇ l of 2 mM ⁇ -NAD (Nicotinamide 1,N6-ethenoadenine dinucleotide) and reacted at 37° C. for 1 hour.
  • the FLAG-ADPRC plasmid was overexpressed in HEK293 cells using a transfection reagent, and then lysed in a lysis buffer.
  • the dissolved sample was purified using a FLAG-agarose column to purify the overexpressed FLAG-ADPRC.
  • the purified sample was treated with 100 ⁇ M ⁇ -NAD and reacted at 37°C for 1 hour.
  • trichloroacetic acid was treated to a final concentration of 0.6 M to extract cADPR, and then, in 0.1 ml of extract and 0.1 ml of cADPR standard solution, ADPR cyclase (0.3 ⁇ g/ml) and nicotinamide (nicotinaminde, 30 mM) were added. ), sodium phosphate (sodium phosphate, 100 mM) mixed solution 50 ul was added, and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • ADPRC ADPRC protein kinase kinase
  • SEQ ID NO: 22 a new small interfering RNA
  • Cells that inhibited ADPRC expression were treated with 150 nM angiotensin II for 60 seconds, and then cADPR was extracted with 0.6 M trichloroacetic acid, and then, in 0.1 ml of extract and 0.1 ml of cADPR standard solution, ADPR cyclase ( 0.3 ⁇ g/ml), nicotinamide (nicotinaminde, 30 mM), sodium phosphate (100 mM) mixed solution 50 ⁇ l was added, and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • ADPR cyclase 0.3 ⁇ g/ml
  • nicotinamide nicotinaminde, 30 mM
  • sodium phosphate 100 mM
  • ADPRC novel ADP-ribosyl cyclase
  • Example 5 Effect of DCQA on blood glucose, kidney weight and weight ratio, creatine clearance, and urine albumin amount in a mouse model of kidney disease
  • mice with elevated blood sugar at 9 mg/ml in dimethyl sulfoxide, then diluted to 9 ⁇ g/ml in saline. 100 ⁇ l each was intraperitoneally injected daily for 6 weeks. On the last day of 6 weeks, the mice were placed in a metabolic cage and urine was obtained for 24 hours.
  • FIG. 6A After obtaining urine for 24 hours, the weight of the mouse was measured, and blood glucose was measured (FIG. 6A).
  • serum was obtained by sacrifice using an anesthetic and the kidney was removed.
  • Fig. 6b After measuring the ratio of kidney weight and body weight using the extracted kidney (Fig. 6b), some kidneys were fixed by putting them in 10% formalin for fluorescence staining and H&E staining, and the remaining kidneys Dividing into pieces, ADPR cyclase activity and cADPR concentration were measured. Creatinine in urine and serum was measured using a creatinine measurement kit (BioAssay System, USA) to calculate the creatinine clearance (FIG. 6c), and the amount of urine albumin was measured using an albumin measurement kit (BioAssay System, USA) (FIG. 6d). The results are shown in FIG. 6.
  • FIG. 6 in the case of the STZ+DCQA group in the diabetic mouse model caused by STZ, although the blood glucose did not decrease compared to the control group (STZ) (FIG. 6A ), a significant decrease in kidney weight compared to body weight (Fig. 6b), a significant increase in creatine clearance (Fig. 6c), and a significant decrease in the amount of urine albumin (Fig. 6d) confirmed the possibility as a candidate for renal disease treatment such as chronic renal failure or diabetic nephropathy.
  • ADPR cyclase (0.3 ⁇ g/ml)
  • 50 ul of a mixed solution of nicotinamide (nicotinaminde, 30 mM) and sodium phosphate (100 mM) was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the DCQA of the present invention lowered the ADP-ribosyl cyclase activity increased by STZ to below the control level, and as shown in Figure 7b, the DCQA of the present invention was increased cADPR by STZ.
  • the concentration of was lowered to the level of the control, it was confirmed that DCQA has the ability to lower the concentration of cADPR and the activity of ADPRC caused by abnormal kidney function or damage related to kidney disease.
  • Example 7 Effect of 1,4-DCQA on the expression change of TGF- ⁇ 1, Fibronectin and Collagen IV in kidney disease mouse model kidney tissue
  • Renal tissue fixed in 10% formalin was placed on a slide glass using a frozen tissue slicer, washed with TTBS (Tris-buffered saline (TBS) with 0.1% Tween 20) buffer, and then 1% bovine serum albumin ( BSA) was reacted with TTBS buffer for 1 hour.
  • TTBS Tris-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • 1% Bovine Serum Albumin (BSA) in TTBS buffer containing primary antibodies TGF- ⁇ 1 (Santa Cruz, USA), Fibronectin (Santa Cruz, USA), Collagen IV (Abcam, UK)
  • the secondary antibody with FITC attached thereto was diluted 1:200 in TTBS buffer and reacted at room temperature in a dark place for 1 hour. After the secondary antibody reaction, wash three times with TTBS buffer, and then attach a cover glass using a mounting solution. The stained kidney tissue was observed using a fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany) to observe green fluorescence. The results are shown in FIG. 8.
  • DCQA of the present invention lowered the expression levels of TGF- ⁇ 1, Fibronectin, and Collagen IV increased by STZ to a control level, and DCQA was found to have abnormal kidney function or The ability to lower the expression levels of TGF- ⁇ 1, Fibronectin, and Collagen IV caused by injury was confirmed.
  • DCQA of the present invention restored glomerular thickening, invasion of inflammatory cells, and formation of heteroepithelial cells increased by STZ to a level similar to that of the control group, DCQA related to kidney disease Thus, the ability to recover the pathologic changes in the kidney caused by abnormal kidney function or damage was confirmed.
  • mice wild type, WT
  • ADPRC hetero knockout mice ADPRC(+/-) mice produced by The Jackson Laboratory (USA) were treated with 50 mM citrate buffer (pH 4.8).
  • Zotosine Streptozotocin (STZ)
  • STZ Steptozotocin
  • mice with a blood glucose level of 300 mg/dL were used. After 6 weeks from the time the blood sugar rose, the mice were placed in a metabolic cage and urine was obtained for 24 hours.
  • FIG. 10A After obtaining urine for 24 hours, the weight of the mouse was measured, and blood glucose was measured (FIG. 10A). Serum was obtained by sacrifice using an anesthetic and the kidney was removed. Using the extracted kidney, the ratio of the kidney weight and body weight was measured (FIG. 10B ). Creatinine in urine and serum was measured using a creatinine measurement kit (BioAssay System, USA) to calculate the creatinine clearance (FIG. 10C). The results are shown in FIG. 10.
  • L-NAME N ⁇ -nitro-l-arginine-methyl-ester, Sigma-Aldrich, USA
  • DCQA N ⁇ -nitro-l-arginine-methyl-ester
  • Creatinine in urine and serum was measured using a creatinine measurement kit (BioAssay System, USA) to calculate the creatinine clearance (FIG. 11B). The results are shown in FIG. 11.
  • Resnick LM Ionic basis of hypertension, insulin resistance, vascular disease, and related disorders. The mechanism of “Syndrome X”. Am. J. Hypertens. 6:123S-134S, 1993.

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Abstract

본 발명은 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 안지오텐신 II에 의한 새로운 에이디피-라이보실 사이클라아제의 발현 또는 활성 증가로 인한 신장 세포 내 칼슘 증가를 억제하는 효과가 있어, 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환, 특히 신장질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 및 이의 저해제
본 발명은 NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스로 변환시키는 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 및 이의 저해제에 관한 것이다.
ADPRC는 NAD+로부터 사이클릭 에이디피 라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)를 합성하고, NADP+로부터 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (nicotinic acid adenine dinucletide phosphate; NAADP)를 합성하는 효소로써, 식물에서부터 포유동물에 이르기까지 광범위하게 존재한다. 이 ADPRC는 세포내 칼슘저장고로부터 세포질로 칼슘을 유리시킴으로써 세포의 다양한 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다 [Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529, 2003; Lee HC, Mol. Med. 12 317-323, 2006].
안정한 상태에서는 세포 내 칼슘농도는 10-7 M 이하로 기저치로 유지된다. 그러나 세포가 활성화된 상태에서는 세포 내 칼슘농도가 기저치의 10 배 정도까지 증가되며, 병적인 상태에서 칼슘농도가 지속적으로 높게 유지되는 경우에는 세포의 많은 기능이 영향을 받게 되며, 결과적으로 세포의 정상기능을 소실하게 된다.
고혈압 또는 고혈압을 동반한 당뇨병, 비만, 치매, 허열, 세포증식을 동반한 질환에서도 세포내의 칼슘대사조절에 이상이 생겨, 세포내의 칼슘농도가 정상보다 높게 유지된다 [Resnick LM. Am. J. Hypertens. 6:123S-134S, 1993].
일 예로 고혈압과 같은 만성질환자를 살펴보면, 여러 가지 유전적, 환경적 혹은 어떤 질병의 이차적인 원인에 의해서 혈관 평활근세포내의 칼슘농도가 지속적으로 정상치보다 높은 수치를 나타내며, 그 결과 혈관 평활근의 수축을 유발시켜 말초혈관의 저항이 증가되어, 이로 인해 혈압이 정상혈압보다 상승된 상태로 지속적으로 유지되어 고혈압이 초래된다.
이와 같이 상승된 혈압은 이차적으로 혈관평활근세포와 섬유조직의 증식과 비대를 초래하고, 그 결과, 말초 혈관 저항과 혈압을 더욱 증가시켜, 심혈관계, 뇌 및 신장 등의 장기 기능이 저해되어 심근경색, 협심증, 중풍 및 만성 심부전증 등으로 사망에 이르게 한다고 알려져 있다 [Cowley AW Jr. Physiol Rev. 72:231-300, 1992].
췌장으로부터 인슐린 분비에는 ADPRC의 일종인 CD38 활성에 의한, 즉 cADPR에 의한, 칼슘증가가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 당뇨병 유발은 안지오텐신의 생성을 증가시키는데 이 펩타이드 호르몬은 신장질환, 고혈압 및 심장병을 유발시킬 뿐만 아니라 ADPRC를 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다.
따라서 ADPRC는 면역세포, 심장근세포, 췌장 베타세포, 신장근세포 및 신경세포 등에 존재하면서 여러 호르몬의 수용체와 연관되어 세포내 칼슘농도의 증가 및 여러 생리활성을 조절함으로써 이 ADPRC의 발현 또는 활성 조절에 이상이 있으면 생리현상 (면역, 신장기능, 인슐린분비, 심혈관 기능) 조절에 이상을 일으킬 수 있다.
이 같은 ADPRC는 여러 호르몬에 의하여 활성화되며 이 효소는 기질 NAD+로부터 산물인 cADPR을 생성하는데 이 cADPR은 거의 모든 장기에서 세포내 칼슘을 증가시킨다. 또한 ADPRC의 활성에 의한 칼슘의 이상증가는 인슐린분비 (insulin secretion) [Kim BJ, Park KH, Yim CY, Takasawa S, Okamoto H, Im MJ, Kim UH. Diabetes. 57: 868-878, 2008], 세포비대 (hypertrophy) [Gul R, Park JH, Kim SY, Jang KY, Chea JK, Ko JK, Kim UH. Cardiovasc Res. 81: 582-591, 2009], 세포증식 (proliferation) [Kim SY, Gul R, Rah SY, Kim SH, Park SK, Im MJ, Kwon HJ, Kim UH. Am J Physiol Renal Physiol. 294: F989-F989, 2008] 등 다양한 생체병리에 요인으로 알려져 왔다.
현재까지 가장 잘 연구가 된 ADPRC는 T-세포 표면 항원인 CD38로서 이 분자는 면역세포 뿐만 아니라 여러 장기에 널리 발현되어 있다.
그러나 심장, 신장, 뇌에는 CD38과 다른 ADPRC가 발현된다고 밝혀졌다 [Partida-Sanchez S, Cockayne DA, Monard S, Jacobson EL, Oppenheimer N, Garvy B, Kusser K, Goodrich S, Howard M, Harmsen A, Randall TD, Lund FE. Nat Med 7:1209-16, 2001].
따라서 조직 특이적 ADPRC의 발현조절은 세포내 칼슘증가로 유발된 병을 치료하는데 도움이 될 것이다. 또한 ADPRC의 활성기전은 아직까지 잘 알려져 있지 않다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자는 포유동물에서 알려져 있는 기존의 ADPRC (CD38, CD157)가 아닌 새로운 종류의 ADPRC의 효소를 발견 및 이의 활성을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADP-ribosyl cyclase; ADPRC) 또는 이의 천연적으로 발생된(naturally occurred) 변이체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체, 이를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는, NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 촉매 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 헤테로 타입(hetero type) 유전자 결손된 동물 모델을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단에 대한 정보 제공방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADP-ribosyl cyclase; ADPRC) 또는 이의 천연적으로 발생된(naturally occurred) 변이체를 제공한다.
본 발명자는 NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 전환시키는 효소로서, 종래에 알려진 에이디피-라이보실 사이클라아제 외에 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제를 발굴하고자 예의 노력을 한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 용어 “에이디피-라이보실 사이클라아제” 또는 “ADP-ribosyl cyclase (ADPRC)”는 NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 효소를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “에이디피-라이보실 사이클라아제의 변이체”는 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 일부 아미노산 서열이 천연적 또는 인공적으로 치환, 결실, 첨가된 변이체를 의미하며, NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 촉매의 활성을 보유한 에이디피-라이보실 사이클라아제의 변이체를 의미한다.
명세서에서 용어 “에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 (naturally occurred) 변이체”는 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체로서, NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 촉매의 활성을 보유한 에이디피-라이보실 사이클라아제의 변이체를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 종간 변이체(species variants), 종의 상동체(species homologs), 아이소폼(isoforms), 대립유전자 변이체(allelic variants), 입체 배열에 의한 변이체(conformation variants), 스플라이스 변이체(splice variants) 및 점 돌연변이 변이체(point mutant variants)로 구성된 군으로부터 선택되는 천연적으로 발생된 변이체인 것이다.
본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제와 바람직하게는 50% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 60% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 70% 이상의 상동성, 보다 더욱 더 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 어류로 구성된 군으로부터 선택되는 생물에서 발생된 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제와 비교하여, 포유류의 경우 70% 이상, 조류, 파충류 및 양서류의 경우 60% 이상, 어류의 경우 50% 이상의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제와 비교하여, 인간 및 래트는 96%, 챔팬지는 93%, 기니피그 및 말은 91%, 개, 염소 및 양은 90%, 토끼는 89%, 돼지는 88%, 소는 78%, 닭은 70%, 개구리는 63%, 칠면조는 62%의 높은 상동성을 나타내어 종간 보존적 서열의 비중이 매우 높은 효소임을 확인하였다(도 4).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 서열목록 제2서열 내지 제21서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 핵산분자는 cDNA인 것이다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, 이스트(yeast), 동물 또는 인간 세포(CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, MES13 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체, 이를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는, NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 촉매 조성물을 제공한다.
본 발명의 촉매 조성물은 NAD+가 cADPR로 변환되는 과정을 효율적으로 촉매한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 발현 억제제 또는 활성 억제제; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 치료 용도로 사용하기 위한(for use in therapy), 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 제공한다.
본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 종류는 제한되지 않으며, 바람직하게는 당뇨병 또는 신장질환인 것이고, 보다 바람직하게는 신부전(renal failure), 신증(nephropathy), 신염(nephritis), 신장 섬유증(renal fibrosis) 또는 신장경화증 (nephrosclerosis)인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 신부전은 만성 신부전(Chronic Renal Failure), 급성 신부전(Acute Renal Failure), 또는 투석 전의 경도 신부전인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 신증은 신증 증후군(Nephropathy Syndrome), 리포이드 신증(Lipoid Nephropathy), 당뇨병성 신증(Diabetic Nephropathy), 면역글로빈A 신증(IgA Nephropathy), 진통제 신증(Analgesic Nephropathy) 또는 고혈압성 신증(Hypertensive Nephropathy)인 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 체중 대비 신장 무게의 유의미한 감소, 크레아틴 청소율의 유의미한 증가, 소변 알부민양의 유의미한 감소를 통해서 만성신부전이나 당뇨병성 신증을 포함하는 신장질환 치료제의 후보로서의 가능성을 확인하였으며(도 6); 추가적으로 ADP-ribosyl cyclase 활성 및 cADPR의 농도를 정상 수준으로 낮추고(도 7); TGF-β1, Fibronectin, Collagen IV의 발현량을 정상 수준으로 낮추며(도 8); 사구체 비후, 염증세포의 침윤, 이형상피세포의 형성을 정상 수준으로 회복시켜 신장의 병리조직학적 변화를 회복시키는 능력도 보유하며(도 9); 고혈압 모델에서도 크레아틴 청소율 유의미하게 증가하여 고혈압성 신증에의 적용 가능성도 확인한 바(도 11b), 신장 기능 이상 또는 손상에 의해 발생하는 다양한 종류의 신장질환 치료제로서의 가능성을 갖는다.
본 명세서에서 용어 “발현 억제제”는 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 발현을 억제하는 물질을 의미하며, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 구조 및 기능으로부터 통상의 기술자는 이를 용이하게 제작할 수 있다.
본 발명의 발현 억제제는 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열목록 제22서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 명세서에서 용어 “활성 억제제”는 상기 발현된 에이디피-라이보실 사이클라아제 단백질의 활성을 억제하는 물질을 의미하며, 바람직하게는 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화합물은 4,4'-디하이드록시아조벤젠(4,4'-dihydroxyazobenzene), 2-(1,3-벤조옥사졸-2-일아미노)-1-메틸퀴나졸린-4(1H)-온(2-(1,3-benzoxazol-2-ylamino)-1-methylquinazoline-4(1H)-one) 및 디카페올리퀴닉 산(Dicaffeoylquinic acid, DCQA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 4,4'-디하이드록시아조벤젠은 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
Figure PCTKR2020008283-appb-C000001
본 발명의 2-(1,3-벤조옥사졸-2-일아미노)-1-메틸퀴나졸린-4(1H)-온은 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:
Figure PCTKR2020008283-appb-C000002
본 발명의 디카페올리퀴닉 산(Dicaffeoylquinic acid, DCQA)은 하기 화학식 3 내지 8(1,4-DCQA, 3,4-DCQA, 3,5-DCQA, 4,5-DCQA, 1,3-DCQA 및 1,5-DCQA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물로 표시될 수 있다:
Figure PCTKR2020008283-appb-C000003
Figure PCTKR2020008283-appb-C000004
Figure PCTKR2020008283-appb-C000005
Figure PCTKR2020008283-appb-C000006
Figure PCTKR2020008283-appb-C000007
Figure PCTKR2020008283-appb-C000008
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 새로운 에이디피-라이보실 사이클라아제에 대한 발현 억제제 또는 활성 억제제는 ADPRC의 발현 또는 활성을 조절하는 기전을 경유하여 신장질환을 억제하는데 기여하는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 새로운 에이디피-라이보실 사이클라아제에 대한 발현 억제제 또는 활성 억제제는 임상적으로 유용한 각 세포별 선택적 억제제, 나아가 신장내 질병 예방, 개선 및/또는 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분인 새로운 ADPRC의 발현 억제제 또는 활성 억제제 뿐만 아니라 기존에 공지된 ADPRC 관련 질환의 치료제와 함께 사용될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약제학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 담체를 말한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제에 대한 발현 억제제 또는 활성 억제제 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 [예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제에 대한 발현 억제제 또는 활성 억제제 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 신장 관련 다양한 병리적 형태 관련 인자의 조절(체중 대비 신장 무게의 유의미한 감소, 크레아틴 청소율의 유의미한 증가, 소변 알부민양의 유의미한 감소; TGF-β1, Fibronectin, Collagen IV의 발현양을 정상 수준으로 감소; 사구체 비후, 염증세포의 침윤, 이형상피세포의 형성을 정상 수준으로 회복)을 통해 신장질환을 개선하는데 매우 우수한 작용을 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADP-ribosyl cyclase; ADPRC) 또는 이의 천연적으로 발생된(naturally occurred) 변이체의 헤테로 타입(hetero type) 유전자 결손된 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 동물은 인간을 제외한 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류인 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환 여부의 확인방법을 제공한다: (a) 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 헤테로 타입 유전자 결손 동물 모델과 야생형(wild-type) 동물 모델에 특정 질환을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 동물 모델 간 차이를 확인하는 단계.
상기 동물 모델을 이용하면 특정 질환(예를 들어, 당뇨병, 신장 질환, 고혈압, 비만 등)이 에이디피-라이보실 사이클라아제와 매개하여 발생된 것인지, 아니면 에이디피-라이보실 사이클라아제와 무관하게 발생된 것인지를, 상기 동물 모델 간 차이(예를 들어, 체중, 신장 무게, 혈압, 크레아틴 청소율, 혈당, 염증, 사구체의 비후 정도 등의 차이)를 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단에 대한 정보 제공방법을 제공한다:
1) 피검체로부터 분리된 시료 내 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군과 비교하여 사이클라아제 매개 질환에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단하는 단계.
본 명세서에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 에이디피-라이보실 사이클라아제 관련 또는 매개 질환이 현재 발병하였거나 또는 발병할 가능성을 확인하는 것이다.
에이디피-라이보실 사이클라아제는 여러 호르몬에 의하여 활성화되며 이 효소는 기질 NAD+로부터 산물인 cADPR을 생성하는데 이 cADPR은 거의 모든 장기에서 세포내 칼슘을 증가시킨다. 또한 에이디피-라이보실 사이클라아제의 활성에 의한 칼슘의 이상증가는 인슐린분비 (insulin secretion), 세포비대 (hypertrophy), 세포증식 등 다양한 생체병리의 요인으로 알려져 있다. 따라서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 발현 또는 활성 수준의 측정을 통하여 세포내 칼슘증가로 유발된 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단에 대한 유용한 정보의 제공이 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 수준을 측정하는 제제는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것이다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체에 특이적으로 결합하기 때문에 이를 이용하면 샘플 중에 포함된 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 양을 정확하게 측정 가능하다.
본 발명의 진단용 조성물을 이용하면 항원항체 결합반응을 통하여 상기 항체에 대한 항원을 분석함으로써 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 양을 정량할 수 있으며, 상기 항원항체 결합반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치나 이에 대한 사용설명서를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 후보물질의 처리에 의해 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 유전자 발현 수준 또는 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않는 대조군과 비교하여 감소한 경우 상기 후보물질을 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료 물질로 선별하는 단계.
상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 면역침강법 (immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 측정되는 것이다.
상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 단백질 수준의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법 (ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 측정되는 것이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(ii) 또한, 본 발명은 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
(iii) 본 발명의 조성물은 안지오텐신 II에 의한 새로운 에이디피-라이보실 사이클라아제의 발현 또는 활성 증가로 인한 신장 세포 내 칼슘 증가를 억제하는 효과가 있어, 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환, 특히 신장질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 HEK293 세포와 MES13 세포에서 새로운 ADPRC의 엔에디-글라이코하이드롤라아제 (NADase) 활성을 측정한 도면이다.
도 2는 정제된 FLAG-ADPRC의 cADPR 합성능을 평가한 도면이다.
도 3은 MES13 세포에서 안지오텐신 II로 자극을 했을 때 새로운 ADPRC에 의한 세포 내 cADPR 생성을 측정한 도면이다.
도 4는 본 발명의 에이디피-라이보실 사이클라아제의 종간 서열의 상동성을 얼라인먼트를 통하여 비교한 결과이다 (마우스를 기준으로 인간(96%), 래트(96%), 개(90%), 돼지(88%), 토끼(89%), 양(90%), 닭(70%), 소(78%), 침팬지(93%), 말(91%), 개구리(63%), 염소(90%), 칠면조(62%), 기니피그(91%), 에키노코쿠스 그라눌로수스(27%), 시스토조마 헤마토비움(22%), 트리키넬라 스피랄리스(22%), 초파리(19%), 제브라피쉬(56%)).
도 5는 새로운 ADPRC의 엔에이디 글라이코하이드롤라아제 (NADase) 활성을 억제하는 새로운 억제제의 효과를 측정한 도면이다.
도 6은 당뇨병성 신장질환 마우스 모델의 혈당(도 6a), 신장무게(kidney weight)와 체중(body weight)의 비율(도 6b), 크레아티닌 청소율(도 6c) 및 소변 알부민양(도 6d)에서 Dicaffeolylquinic acid (DCQA)의 효과를 측정한 도면이다.
도 7은 당뇨병성 신장질환 마우스 모델 신장조직에서 ADPRC의 활성(도 7a) 및 cADPR 농도(도 7b)에 대한 DCQA의 효과를 측정한 도면이다.
도 8은 당뇨병성 신장질환 마우스 모델 신장조직에서 TGF-β1, Fibronectin 및 Collagen IV의 발현변화에 대한 DCQA의 효과를 측정한 도면이다.
도 9는 당뇨병성 신장질환 마우스 모델 신장조직에서 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색을 통한 병리조직학적 변화를 관찰한 도면이다.
도 10은 정상 마우스와 ADPRC hetero (ADPRC (+/-)) 마우스의 당뇨병성 신장질환 모델의 혈당(도 10a), 신장무게와 체중의 비율(도 10b) 및 크레아티닌 청소율(도 10c)을 측정한 도면이다.
도 11은 정상 마우스와 고혈압 마우스 모델의 혈압(도 11a) 및 크레아티닌 청소율(도 11b)에서 DCQA의 효과를 측정한 도면이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 새로운 ADPRC의 엔에디-글라이코하이드롤라아제 (NADase) 효소 활성
서열목록 제1서열의 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADPRC)의 활성을 확인하기 위하여, 상기 ADPRC를 코딩하는 cDNA 서열을 FLAG-CMV-2 벡터에 라이게이션하여 FLAG-ADPRC 플라스미드를 만들고, 이를 HEK293 세포 또는 MES13 세포에 형질감염 시약 (transfection reagent)을 이용하여 새로운 ADPRC의 과발현을 유도하였다. 상기 과발현된 새로운 ADPRC를 용해 완충액 (lysis buffer)으로 용해하였다. 용해된 시료 45 μl에 2 mM ε-NAD (Nicotinamide 1,N6-ethenoadenine dinucleotide) 5 μl를 처리하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 10% 삼염화아세트산 (Trichloroacetic acid)을 50 μl 처리하여 효소-기질 반응이 멈추도록 하였다. 10분간 원심분리를 통해 상층액 80 μl를 720 μl의 0.1 M 인산나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer)에 넣은 후 excitation 297 nm, emission 410 nm에서 형광분석기로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 새로운 ADPRC의 cADPR 합성능 평가
상기 ADPRC의 cADPR 합성능 평가는 Graeff R et al [Graeff R, Lee HC. Biochem. J. 361:379-384, 2002]에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.
구체적으로는 HEK293 세포에 FLAG-ADPRC 플라스미드를 형질감염 시약을 이용하여 과발현 한 후, 용해 완충액으로 용해하였다. 용해된 시료를 FLAG-agarose 컬럼을 이용하여 과발현된 FLAG-ADPRC를 정제하였다. 정제된 시료에 100 μM β-NAD를 처리하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 삼염화아세트산 (Trichloroacetic acid)을 최종 농도 0.6 M이 되도록 처리하여 cADPR을 추출한 뒤, 0.1 ml의 추출물과 0.1 ml의 cADPR 표준용액에 ADPR cyclase (0.3 μg/ml), 니코틴아미드 (nicotinaminde, 30 mM), 인산나트륨 (sodium phosphate, 100 mM) 혼합용액 50 ul를 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다.
이 혼합액에 에탄올 (ethanol, 2%), 알코올디하이드로게나아제 (alcohol dehydrogenase, 100 μg/ml), 레자주린 (resazurin, 20 μM), 디아포라아제 (diaphorase, 10 μg/ml), FMN (10 μM), 니코틴아미드 (10 mM), 우혈청알부민 (BSA, 0.1 mg/ml), 인산나트륨 (100 mM)을 넣고, 2-4시간 동안 반응시켰다. 반응물은 544 nm와 590 nm 사이의 형광분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 3. MES13 세포에서 ADPRC에 의한 세포내 cADPR 농도의 변화
상기 ADPRC에 의한 세포내 cADPR 농도 변화는 Graeff R et al [Graeff R, Lee HC. Biochem. J. 361:379-384, 2002]에 의해 보고된 방법에 의해 제조하였다.
구체적으로는 MES13 세포에 새로운 ADPRC의 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, 서열목록 제22서열)를 형질감염 시약으로 ADPRC의 발현을 억제하였다. ADPRC의 발현을 억제한 세포에 150 nM의 안지오텐신 II를 60 초간 처리한 후 0.6 M 삼염화아세트산 (Trichloroacetic acid)을 이용하여 cADPR을 추출한 뒤, 0.1 ml의 추출물과 0.1 ml의 cADPR 표준용액에 ADPR cyclase (0.3 μg/ml), 니코틴아미드 (nicotinaminde, 30 mM), 인산나트륨 (sodium phosphate, 100 mM) 혼합용액 50 μl를 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다.
이 혼합액에 에탄올 (ethanol, 2 %), 알코올디하이드로게나아제 (alcohol dehydrogenase, 100 μg/ml), 레자주린 (resazurin, 20 μM), 디아포라아제 (diaphorase, 10 μg/ml), FMN (10 μM), 니코틴아미드 (10 mM), 우혈청알부민 (BSA, 0.1 mg/ml), 인산나트륨 (100 mM)을 넣고, 2-4시간 동안 반응시켰다. 반응물은 544 nm와 590 nm 사이의 형광분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 4. 새로운 ADPRC의 엔에이디 글라이코하이드롤라아제 (NADase) 활성을 억제하는 새로운 억제제의 효과
서열목록 제1서열의 새로운 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADPRC)의 활성을 억제하는 억제제를 찾기 위해, 4,4'-dihydroxyazobenzene (4-DHAB, TCI (일본)), 2,2'-dihydroxyazobenzene (2-DAB, Sigma-Aldrich (미국)), 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one (Quercetin, Sigma-Aldrich (미국)), San4825 (kannt A et al [Kannt A, Sicka K, Kroll K, Kadereit D, Gogelein H. Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. 385:717-727, 2012], 합성 (중국))와 화합물 스크리닝을 통해 새롭게 발견한 2-(1,3-benzoxazol-2-ylamino)-1-methylquinazoline-4(1H)-one (2-BMQ, 합성 (중국)), 1,4-Dicaffeoylquinic acid (1,4-DCQA, Biopurify (중국), 이하 DCQA)를 새로운 ADPRC 40 μl에 억제제 5 μl를 얼음물에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 후 2 mM ε-NAD (Nicotinamide 1,N6-ethenoadenine dinucleotide) 5 μl를 처리하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 10% 삼염화아세트산 (Trichloroacetic acid)을 50 μl 처리하여 효소-기질 반응이 멈추도록 하였다. 10분간 원심분리를 통해 상층액 80 μl를 720 μl의 0.1 M 인산나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer)에 넣은 후 excitation 297 nm, emission 410 nm에서 형광분석기로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, Control과 대비하여, 4-DHAB는 42.40%, 2-BMQ는 36.49%, 그리고 DCQA는 무려 79.64%의 비율로 엔에이디 글라이코하이드롤라아제 (NADase) 활성을 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 신장질환 마우스 모델의 혈당, 신장무게와 체중의 비율, 크레아틴 청소율 및 소변 알부민양에서 DCQA의 효과
신장질환 마우스 모델에서의 혈당, 신장과 체중의 비율, 크레아티닌 청소율 및 소변 알부민양 측정은 Kim SY et al [Kim SY, Park KH, Gul R, Jang KY, Kim UH. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296:F291-F297, 2009]에 의해 보고된 방법에 의해 제조되었다.
구체적으로는 C57BL/6J 마우스에 50 mM 시트레이트 완충액 (citrate buffer, pH 4.8)을 0.2 ml씩 복강 주사한 군 (Control군과 DCQA군)과 50 mM 시트레이트 완충액에 스트렙토조토신 (Streptozotocin (STZ, Sigma-Aldrich (미국)))을 5 mg/ml로 녹인 후 200 μl씩 복강 주사한 군 (STZ군과 STZ+DCQA군)으로 나누었다. STZ 주사 후 2일째부터 혈당을 측정하여 혈당 수치가 300 mg/dL인 마우스를 STZ군 및 STZ+DCQA군으로 분류한 후 사용하였다. 혈당이 올라간 마우스에 상기 실시예 5에서 신규한 ADPRC에 대한 억제효과가 가장 뛰어났던 DCQA를 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl Sulfoxide)에 9 mg/ml로 녹인 후, 식염수에 9 μg/ml로 희석시킨 후 100 μl씩 6주간 매일 복강주사 하였다. 6주 마지막 날에 마우스를 메타볼릭케이지에 넣고 24시간동안 소변을 얻었다.
24시간동안 소변을 얻은 후 마우스의 체중을 측정하고, 혈당을 측정하였다(도 6a). 또한 신장질환 치료제로서의 가능성을 확인하기 위해 마취제를 이용하여 희생시켜 혈청을 얻고 신장을 적출하였다. 적출한 신장을 이용하여 신장무게(kidney weight)와 체중(body weight)의 비율을 측정 후(도 6b), 일부 신장은 형광염색 및 H&E 염색을 위해 10% 포르말린에 넣어 고정하고, 나머지 신장은 여러 조각으로 나누어 에이디피알 사이클라아제 활성 및 cADPR 농도를 측정하였다. 소변과 혈청의 크레아티닌을 크레아티닌 측정 kit (BioAssay System, 미국)를 이용하여 측정하여 크레아티닌 청소율을 계산하고(도 6c), 소변 알부민양을 알부민 측정 kit (BioAssay System, 미국)를 이용하여 측정하였다(도 6d). 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, STZ에 의해 유발된 당뇨병 마우스 모델에서 STZ+DCQA 군의 경우 대조군(STZ) 대비 혈당은 감소하지 않았음에도 불구하고(도 6a), 체중 대비 신장 무게의 유의미한 감소(도 6b), 크레아틴 청소율의 유의미한 증가(도 6c), 소변 알부민양의 유의미한 감소(도 6d)를 통해서 만성신부전이나 당뇨병성 신증과 같은 신장질환 치료제의 후보로서의 가능성을 확인하였다.
실시예 6. 신장질환 마우스 모델 신장조직에서 ADPRC의 활성 및 cADPR 농도에 대한 DCQA의 효과
신장질환 마우스 모델의 신장조직에서의 ADPRC 활성과 cADPR 농도측정은 Kim SY et al [Kim SY, Park KH, Gul R, Jang KY, Kim UH. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296:F291-F297, 2009]에 의해 보고된 방법에 의해 제조되었다.
구체적으로는 C57BL/6J 마우스에 50 mM 시트레이트 완충액 (citrate buffer, pH 4.8)을 0.2 ml씩 복강 주사한 군 (Control군과 DCQA군)과 50 mM 시트레이트 완충액에 스트렙토조토신 (Streptozotocin (STZ, Sigma-Aldrich (미국)))을 5 mg/ml로 녹인 후 200 μl씩 복강 주사한 군 (STZ군과 STZ+DCQA군)으로 나누었다. STZ 주사 후 2일째부터 혈당을 측정하여 혈당 수치가 300 mg/dL인 마우스를 STZ군과 STZ+DCQA군으로 분류하여 사용하였다. 혈당이 올라간 마우스에 상기 실시예 5에서 신규한 ADPRC에 대한 억제효과가 가장 뛰어났던 DCQA를 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl Sulfoxide)에 9 mg/ml로 녹인 후, 식염수에 9 μg/ml로 희석시킨 후 100 μl씩 6주간 매일 복강주사 하였다. 신장질환 치료제로서의 가능성을 확인하기 위해 마취제를 이용하여 희생시켜 혈청을 얻고 신장을 적출하였다.
각 군의 적출한 신장조직의 일부를 용해 완충액 (lysis buffer)으로 용해한 후, 용해된 시료 45 μl에 2 mM NGD (Nicotinamide guanine dinucleotide) 5 μl를 처리하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 10% 삼염화아세트산 (Trichloroacetic acid)을 50 μl 처리하여 효소-기질 반응이 멈추도록 하였다. 10분간 원심분리를 통해 상층액 80 μl를 720 μl의 0.1 M 인산나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer)에 넣은 후 excitation 297 nm, emission 410 nm에서 형광분석기(Hitachi, 일본)로 흡광도를 측정하였다.
또한 각 군의 적출한 신장조직의 일부에 0.6 M 삼염화아세트산 (Trichloroacetic acid) 0.2 ml을 처리하여 cADPR을 추출한 뒤, 0.1 ml의 추출물과 0.1 ml의 cADPR 표준용액에 ADPR cyclase (0.3 μg/ml), 니코틴아미드 (nicotinaminde, 30 mM), 인산나트륨 (sodium phosphate, 100 mM) 혼합용액 50 ul를 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다. 이 혼합액에 에탄올 (ethanol, 2%), 알코올디하이드로게나아제 (alcohol dehydrogenase, 100 μg/ml), 레자주린 (resazurin, 20 μM), 디아포라아제 (diaphorase, 10 μg/ml), FMN (10 μM), 니코틴아미드 (10 mM), 우혈청알부민 (BSA, 0.1 mg/ml), 인산나트륨 (100 mM)을 넣고, 2-4시간 동안 반응시켰다. 반응물은 544 nm와 590 nm 사이의 형광분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 DCQA는 STZ에 의해 증가된 ADP-ribosyl cyclase 활성을 대조군(control) 수준 이하로 낮추었으며, 도 7b에 나타낸 바와 같이 본원발명의 DCQA는 STZ에 의해 증가된 cADPR의 농도를 대조군(control) 수준으로 낮추었는 바, DCQA가 신장질환과 관련하여 신장의 기능 이상 또는 손상에 의해 발생하는 ADPRC의 활성과 cADPR의 농도를 낮추는 능력을 확인하였다.
실시예 7. 신장질환 마우스 모델 신장조직에서 TGF-β1, Fibronectin 및 Collagen IV의 발현변화에 대한 1,4-DCQA의 효과
신장질환 마우스 모델에서의 신장조직에서의 TGF-β1, Fibronectin 및 Collagen IV의 발현변화는 Kim SY et al [Kim SY, Park KH, Gul R, Jang KY, Kim UH. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296:F291-F297, 2009]에 의해 보고된 방법에 의해 제조되었다.
구체적으로는 C57BL/6J 마우스에 50 mM 시트레이트 완충액 (citrate buffer, pH 4.8)을 0.2 ml씩 복강 주사한 군 (Control군과 DCQA군)과 50 mM 시트레이트 완충액에 스트렙토조토신 (Streptozotocin (STZ, Sigma-Aldrich (미국)))을 5 mg/ml로 녹인 후 200 μl씩 복강 주사한 군 (STZ군과 STZ+DCQA군)으로 나누었다. STZ 주사 후 2일째부터 혈당을 측정하여 혈당 수치가 300 mg/dL인 마우스를 STZ군과 STZ+DCQA군으로 사용하였다. 혈당이 올라간 마우스에 상기 실시예 5에서 신규한 ADPRC에 대한 억제효과가 가장 뛰어났던 DCQA를 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl Sulfoxide)에 9 mg/ml로 녹인 후, 식염수에 9 μg/ml로 희석시킨 후 100 μl씩 6주간 매일 복강주사 하였다. 신장질환 치료제로서의 가능성을 확인하기 위해 마취제를 이용하여 희생시켜 혈청을 얻고 신장을 적출하였다. 적출한 신장의 일부를 10% 포르말린에 넣어 고정하였다. 10% 포르말린에 고정된 신장조직을 동결조직절편기를 이용하여 슬라이드 글라스에 신장조직절편을 올리고 TTBS(Tris-buffered saline (TBS) with 0.1% Tween 20) 완충액로 씻어 준 후, 1% 우혈청알부민 (BSA)이 들어있는 TTBS 완충액으로 1시간동안 반응시킨다. 1% 우혈청알부민 (BSA)이 들어있는 TTBS 완충액에 1차항체 (TGF-β1 (Santa Cruz, 미국), Fibronectin (Santa Cruz, 미국), Collagen IV (Abcam, 영국))를 1:200으로 희석시켜 4℃에서 12시간 이상 반응시킨다. TTBS 완충액으로 1차항체를 반응시킨 조직을 3번 씻어준 후, FITC가 붙어있는 2차항체를 1:200으로 TTBS 완충액에 희석시켜 어두운 장소의 실온에서 1시간동안 반응시킨다. 2차항체 반응 후 TTBS 완충액으로 3번 씻어준 후, 마운팅용액을 이용하여 커버글러스를 붙인다. 염색된 신장 조직을 녹색형광을 관찰하는 형광현미경 (Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 DCQA는 STZ에 의해 증가된 TGF-β1, Fibronectin, Collagen IV의 발현양을 대조군(control) 수준으로 낮추었는 바, DCQA가 신장질환과 관련하여 신장의 기능 이상 또는 손상에 의해 발생하는 TGF-β1, Fibronectin, Collagen IV의 발현양을 낮추는 능력을 확인하였다.
실시예 8. 신장질환 마우스 모델 신장조직에서 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색을 통한 병리조직학적 변화
신장질환 마우스 모델에서의 신장조직에서의 병리조직학적 변화는 Shu B et al [Shu B, Feng Y, Gui Y, Lu Q, Wei W, Xue X, Sun X, He W, Yang J, Dai C. Cell. Signal. 42:249-258, 2018]에 의해 보고된 방법에 의해 제조되었다.
구체적으로는 C57BL/6J 마우스에 50 mM 시트레이트 완충액 (citrate buffer, pH 4.8)을 0.2 ml씩 복강 주사한 군 (Control군과 DCQA군)과 50 mM 시트레이트 완충액에 스트렙토조토신 (Streptozotocin (STZ, Sigma-Aldrich (미국)))을 5 mg/ml로 녹인 후 200 μl씩 복강 주사한 군 (STZ군과 STZ+DCQA군)으로 나누었다. STZ 주사 후 2일째부터 혈당을 측정하여 혈당 수치가 300 mg/dL인 마우스를 STZ군과 STZ+DCQA군으로 사용하였다. 혈당이 올라간 마우스에 상기 실시예 5에서 신규한 ADPRC에 대한 억제효과가 가장 뛰어났던 DCQA를 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl Sulfoxide)에 9 mg/ml로 녹인 후, 식염수에 9 μg/ml로 희석시킨 후 100 μl씩 6주간 매일 복강주사 하였다. 신장질환 치료제로서의 가능성을 확인하기 위해 마취제를 이용하여 희생시켜 혈청을 얻고 신장을 적출하였다. 적출한 신장의 일부를 10% 포르말린에 넣어 고정하였다. 10% 포르말린에 고정된 신장조직을 동결조직절편기를 이용하여 슬라이드 글라스에 신장조직절편을 올리고 흐르는 물에 5분간 씻고, Hematoxylin에 5분간 염색한다. 염색 후, 흐르는 물에 5분간 씻고, 157 mM 염산에 빠르게 2번 담궜다가 뺀 후, 흐르는 물에 5분간 씻는다. 0.25% 암모니아수에 1번 빠르게 담궜다가 뺀 후, 다시 흐르는 물에 5분간 씻고, Eosin에 약 30초간 염색한 후, 70% 에탄올 30초, 80% 에탄올 30초, 90% 에탄올 30초, 1차 100% 에탄올 30초, 2차 100% 에탄올 30초, 3차 100% 에탄올 30초동안 반응 시킨다. 마지막으로 1차 Xylene에 5분간 반응시킨 후 2차 Xylene에 5분이산 반응시킨 후 마운팅용액을 이용하여 커버글러스를 붙인다. 염색된 신장 조직을 광학현미경 (Lieca, 독일)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 DCQA는 STZ에 의해 증가된 사구체 비후, 염증세포의 침윤, 이형상피세포의 형성이 대조군(control)과 비슷한 수준으로 회복시킨된 바, DCQA가 신장질환과 관련하여 신장의 기능 이상 또는 손상에 의해 발생하는 신장의 병리조직학적 변화를 회복시키는 능력을 확인하였다.
실시예 9. 정상 마우스와 ADPRC hetero (ADPRC (+/-)) 마우스의 신장질환 모델의 혈당, 신장과 체중의 비율 및 크레아티닌 청소율의 비교
신장질환 마우스 모델에서의 혈당, 신장과 체중의 비율 및 크레아틴 청소율 측정은 Kim SY et al [Kim SY, Park KH, Gul R, Jang KY, Kim UH. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296:F291-F297, 2009]에 의해 보고된 방법에 의해 제조되었다.
구체적으로는 129S1/SvImJ 마우스 (wild type, WT)와 The Jackson Laboratory (미국)로부터 제작한 ADPRC hetero knockout (ADPRC(+/-)) 마우스에 50 mM 시트레이트 완충액 (citrate buffer, pH 4.8)에 스트렙토조토신 (Streptozotocin (STZ))을 5 mg/ml로 녹인 후 200 μl씩 복강 주사를 하였다. 주사 후 2일째부터 혈당을 측정하여 혈당 수치가 300 mg/dL인 마우스를 사용하였다. 혈당이 올라간 때부터 6주 후 마우스를 메타볼릭케이지에 넣고 24시간동안 소변을 얻었다.
24시간동안 소변을 얻은 후 마우스의 체중을 측정하고, 혈당을 측정하였다(도 10a). 마취제를 이용하여 희생시켜 혈청을 얻고 신장을 적출하였다. 적출한 신장을 이용하여 신장 무게(kidney weight) 및 체중(body weight)의 비율을 측정하였다(도 10b). 소변과 혈청의 크레아티닌을 크레나티닌 측정 kit (BioAssay System, 미국)를 이용하여 측정하여 크레아티닌 청소율을 계산하였다(도 10c). 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, STZ에 의해 유발된 당뇨병 마우스 모델에서 대조군 대비 (ADPRC(+/-)에서 혈당은 감소하지 않았으나(도 10a), 본원발명의 ADPRC(+/-)+STZ군의 체중 대비 신장 무게가 WT+STZ군 대비 유의미한 감소를 보였다(도 10b). 또한 STZ에 의한 크레아티닌 청소율의 감소가 ADPRC(+/-)+STZ군에서 감소하지 않은 바(도 10c), 만성신부전이나 당뇨병성신증과 같은 신장질환에 새로운 ADPRC의 중요성도 확인하였다.
실시예 10. 정상 마우스와 고혈압 마우스 모델의 혈압 및 크레아티닌 청소율에서 DCQA의 효과
고혈압 마우스 모델에서의 혈압 및 크레아티닌 청소율 측정은 Allagnat et al [Allagnat F, Haefliger JA, Lambelet M, Longchamp A, Berard X, Mazzolai L, Corpataux JM, Deglise S. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 51:733-742, 2016]과 Kim SY et al [Kim SY, Park KH, Gul R, Jang KY, Kim UH. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296:F291-F297, 2009]에 의해 보고된 방법에 의해 제조되었다.
구체적으로는 C57BL/6J 마우스에 8 mg L-NAME (Nω-nitro-l-arginine-methyl-ester, Sigma-Aldrich, 미국)을 1 ml 식염수에 녹인 후 0.2 ml씩 매일 경구투여 하였다. 경구투여 7일째와 14일째에 마우스의 혈압을 꼬리에서 측정하였고, 혈압이 높아진 것을 확인 후 상기 실시예 5에서 신규한 ADPRC에 대한 억제효과가 가장 뛰어났던 DCQA를 다이메틸 설폭사이드 (Dimethyl Sulfoxide)에 9 mg/ml로 녹인 후, 식염수에 9 μg/ml로 희석시킨 후 100 μl씩 7일간 DCQA를 매일 복강주사하고 L-NAME을 경구투여하였다. DCQA처리 6일 후 마우스를 메타볼릭케이지에 넣고 24시간동안 소변을 얻었다.
24시간동안 소변을 얻은 후 마우스의 혈압을 측정하였다(도 11a). 마취제를 이용하여 희생시켜 혈청을 얻었다.
소변과 혈청의 크레아티닌을 크레나티닌 측정 kit (BioAssay System, 미국)를 이용하여 측정하여 크레아티닌 청소율을 계산하였다(도 11b). 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11a에서 나타낸 바와 같이, DCQA은 고혈압 모델에서는 혈압을 낮추는 효과는 없는 것으로 확인되었다. 하지만 크레아티닌 청소율이 DCQA에 의해 증가한 바 고혈압성신증과 같은 신장질환에 치료제의 후보로서의 가능성도 확인하였다(도 11b).
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (25)

  1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADP-ribosyl cyclase; ADPRC) 또는 이의 천연적으로 발생된(naturally occurred) 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 종간 변이체(species variants), 종의 상동체(species homologs), 아이소폼(isoforms), 대립유전자 변이체(allelic variants), 입체 배열에 의한 변이체(conformation variants), 스플라이스 변이체(splice variants) 및 점 돌연변이 변이체(point mutant variants)로 구성된 군으로부터 선택되는 천연적으로 발생된 변이체인 것을 특징으로 하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 어류로 구성된 군으로부터 선택되는 생물에서 발생된 것을 특징으로 하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제의 천연적으로 발생된 변이체는 서열목록 제2서열 내지 제21서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 변이체는 NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 것을 특징으로 하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체.
  6. 제 1 항의 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체를 코딩하는 핵산분자.
  7. 제 6 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  8. 제 7 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  9. 제 1 항의 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체, 제 6 항의 핵산 분자 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는, NAD+를 사이클릭 ADP-라이보오스 (cyclic ADP-ribose; cADPR)로 변환시키는 촉매 조성물.
  10. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열목록 제22서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 활성 억제제는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 화합물은 4,4'-디하이드록시아조벤젠(4,4'-dihydroxyazobenzene), 2-(1,3-벤조옥사졸-2-일아미노)-1-메틸퀴나졸린-4(1H)-온(2-(1,3-benzoxazol-2-ylamino)-1-methylquinazoline-4(1H)-one) 및 디카페올리퀴닉 산(Dicaffeoylquinic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환은 신장질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 신장질환은 신부전(renal failure), 신증(nephropathy), 신염(nephritis), 신장 섬유증(renal fibrosis) 또는 신장경화증 (nephrosclerosis)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 신부전은 만성 신부전(Chronic Renal Failure), 급성 신부전(Acute Renal Failure), 또는 투석 전의 경도 신부전인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 신증은 신증 증후군(Nephropathy Syndrome), 리포이드 신증(Lipoid Nephropathy), 당뇨병성 신증(Diabetic Nephropathy), 면역글로빈A 신증(IgA Nephropathy), 진통제 신증(Analgesic Nephropathy) 또는 고혈압성 신증(Hypertensive Nephropathy)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  19. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  20. 제 1 항의 에이디피-라이보실 사이클라아제 (ADP-ribosyl cyclase; ADPRC) 또는 이의 천연적으로 발생된(naturally occurred) 변이체의 헤테로 타입(hetero type) 유전자 결손된 인간을 제외한 동물 모델.
  21. 하기의 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환 여부의 확인방법:
    (a) 제 20 항의 동물 모델과 야생형(wild-type) 동물 모델에 특정 질환을 유도하는 단계; 및
    (b) 상기 동물모델 간 차이를 확인하는 단계.
  22. 하기의 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단에 대한 정보 제공방법:
    1) 피검체로부터 분리된 시료 내 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군과 비교하여 사이클라아제 매개 질환에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단하는 단계.
  23. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단용 조성물.
  24. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 진단 키트.
  25. 하기의 단계를 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법:
    1) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    2) 상기 후보물질의 처리에 의해 상기 에이디피-라이보실 사이클라아제 또는 이의 천연적으로 발생된 변이체의 유전자 발현 수준 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 유전자 발현 수준 또는 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않는 대조군과 비교하여 감소한 경우 상기 후보물질을 에이디피-라이보실 사이클라아제 매개 질환의 예방 또는 치료 물질로 선별하는 단계.
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