WO2021002435A1 - 改質したえんどう豆たん白質の製造方法 - Google Patents
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Definitions
- the protein deamide enzyme is added to the aqueous dispersion obtained in the step (B1) or the solution obtained by removing the solid substance from the aqueous dispersion obtained in the step (B1) to carry out an enzymatic reaction. Get the liquid.
- the method for removing the solid substance from the aqueous dispersion obtained in the step (B1) include centrifugation and filtration. Centrifugation can be performed by a known method, for example, centrifugation (6000 g ⁇ 30 minutes) at 20 ° C. Filtration can be performed by a known method, and for example, filtration may be performed with a paper filter (for example, Whatman, 520B 1/2 FF) or the like.
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Abstract
本発明は、改質したえんどう豆たん白質（溶解性が向上したえんどう豆たん白質）の製造方法；該方法で得られる改質したえんどう豆たん白質；えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法の提供を課題とする。 えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、改質したえんどう豆たん白質の製造方法、及び該方法で得られる改質したえんどう豆たん白質。上記工程（Ｉ）、（ＩＩ）をこの順又は反対の順に行うことを含む、改質したえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法。
Description
本発明は、製造の特定の工程でたん白質脱アミド酵素を添加することを特徴とする、改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）の製造方法；該製造方法で得られる改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）；及び、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法に関する。
えんどう豆たん白質は低ｐＨ条件において溶解性が低く、酸性食品・飲料に配合した場合に沈殿が生じて、食感や外観などの品質に悪影響を及ぼしやすいため、使用範囲が限られる。従って、低ｐＨ条件における溶解性が向上したえんどう豆たん白質の開発が求められている。
特許文献１は、市販のえんどう豆たん白質（Ｐｉｓａｎｅ Ｃ９（商品名）、Ｃｏｓｕｃｒａ製）の水分散液にプロテイングルタミナーゼを添加して酵素反応を行い、ｐＨ６．５における溶解性が向上したことを開示する。しかし、特許文献１は、本発明における特定の工程でプロテイングルタミナーゼを添加することは記載していない。
本発明は、改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）の製造方法；該製造方法で得られる改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）；及び、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行ったところ、製造の特定の工程でたん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼ）を添加することにより、低ｐＨ条件において溶解性が向上したえんどう豆たん白質が製造できることを見出した。本発明者らは、該知見に基づき、さらに検討を行って本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記を提供する。
［１］えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、改質したえんどう豆たん白質の製造方法。
［２］（Ａ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程、
を含む、上記［１］記載の製造方法。
［３］（Ｂ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程、及び
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、
を含む、上記［１］記載の製造方法。
［４］たん白質脱アミド酵素の添加量が、たん白質１ｇあたり、０．１～１０００ユニットである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］上記［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法で得られる、改質したえんどう豆たん白質。
［６］えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法。
［７］（Ａ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程、
を含む、上記［６］記載の方法。
［８］（Ｂ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程、及び
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、
を含む、上記［６］記載の方法。
［９］たん白質脱アミド酵素の添加量が、たん白質１ｇあたり、０．１～１０００ユニットである、上記［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１］えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、改質したえんどう豆たん白質の製造方法。
［２］（Ａ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程、
を含む、上記［１］記載の製造方法。
［３］（Ｂ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程、及び
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、
を含む、上記［１］記載の製造方法。
［４］たん白質脱アミド酵素の添加量が、たん白質１ｇあたり、０．１～１０００ユニットである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］上記［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法で得られる、改質したえんどう豆たん白質。
［６］えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法。
［７］（Ａ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程、
を含む、上記［６］記載の方法。
［８］（Ｂ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程、及び
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、
を含む、上記［６］記載の方法。
［９］たん白質脱アミド酵素の添加量が、たん白質１ｇあたり、０．１～１０００ユニットである、上記［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）の製造方法；該製造方法で得られる改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）；及び、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法を提供することができる。
本発明の製造方法で得られる改質したえんどう豆たん白質は、低ｐＨ条件において溶解性が向上しているので、酸性食品・飲料への配合が可能となる点で有利である。
本発明の製造方法で得られる改質したえんどう豆たん白質は、低ｐＨ条件において溶解性が向上しているので、酸性食品・飲料への配合が可能となる点で有利である。
えんどう豆から抽出して得られた分離えんどう豆たん白質粉末が市販されている（例えば、Ｐｉｓａｎｅ Ｃ９（商品名）、Ｃｏｓｕｃｒａ製)。かかる従来の分離えんどう豆たん白質粉末を食品や飲料に添加して最終製品を製造する工程において、たん白質の溶解性を向上させるために酵素を添加すると、酵素の添加・反応工程や管理項目の追加等の煩雑な作業が必要になる。
本発明の製造方法で得られる溶解性が向上したえんどう豆たん白質を食品や飲料に添加して最終製品を製造する場合は、最終製品製造時の酵素添加が不要で、最終製品の製造が簡便となる点で有利である。
本発明の製造方法で得られる溶解性が向上したえんどう豆たん白質を食品や飲料に添加して最終製品を製造する場合は、最終製品製造時の酵素添加が不要で、最終製品の製造が簡便となる点で有利である。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明において、たん白質脱アミド酵素としては、例えば、プロテイングルタミナーゼ、プロテインアスパラギナーゼ等が挙げられる。
本発明において用いられるプロテイングルタミナーゼは、たん白質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びたん白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する。当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。プロテイングルタミナーゼは、プロテイングルタミナーゼを産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。プロテイングルタミナーゼの調製に用いられる微生物は特に限定されないが、クリセオバクテリウム属、フラボバクテリウム属、エンペドバクター属の微生物が例示される。例えば、クリセオバクテリウム属細菌としてはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Chryseobacterium proteolyticum）等、フラボバクテリウム属細菌としてはフラボバクテリウム・アクアティレ（Flavobacterium aquatile）等、エンペドバクター属細菌としてはエンペドバクター・ブレビス（Empedobacter brevis)等が挙げられる。
微生物の培養液からのプロテイングルタミナーゼの調製方法については、公知のたん白質分離、精製方法（遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
本発明において用いられるプロテイングルタミナーゼは市販品であってもよく、具体例としては、天野エンザイム（株）より「Ａｍａｎｏ５００Ｋプロテイン－グルタミナーゼ」という商品名で市販されているプロテイングルタミナーゼ等を用いることができる。
本発明において、たん白質脱アミド酵素としては、例えば、プロテイングルタミナーゼ、プロテインアスパラギナーゼ等が挙げられる。
本発明において用いられるプロテイングルタミナーゼは、たん白質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びたん白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する。当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。プロテイングルタミナーゼは、プロテイングルタミナーゼを産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。プロテイングルタミナーゼの調製に用いられる微生物は特に限定されないが、クリセオバクテリウム属、フラボバクテリウム属、エンペドバクター属の微生物が例示される。例えば、クリセオバクテリウム属細菌としてはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Chryseobacterium proteolyticum）等、フラボバクテリウム属細菌としてはフラボバクテリウム・アクアティレ（Flavobacterium aquatile）等、エンペドバクター属細菌としてはエンペドバクター・ブレビス（Empedobacter brevis)等が挙げられる。
微生物の培養液からのプロテイングルタミナーゼの調製方法については、公知のたん白質分離、精製方法（遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
本発明において用いられるプロテイングルタミナーゼは市販品であってもよく、具体例としては、天野エンザイム（株）より「Ａｍａｎｏ５００Ｋプロテイン－グルタミナーゼ」という商品名で市販されているプロテイングルタミナーゼ等を用いることができる。
本明細書において使用するプロテイングルタミナーゼの活性単位は、次のようにして測定され、かつ定義される。
（１）３０ｍＭ Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む１７６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１００μｌにプロテイングルタミナーゼを含む水溶液１０μｌを添加して、３７℃、１０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。このとき、酵素濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で適宜希釈する。
（２）遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ－ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。その方法は以下の通りである。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ－ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いて３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。Ｆ－ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）たん白質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いる。
（５）プロテイングルタミナーゼの活性を以下の式により求める。
（１）３０ｍＭ Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む１７６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１００μｌにプロテイングルタミナーゼを含む水溶液１０μｌを添加して、３７℃、１０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。このとき、酵素濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で適宜希釈する。
（２）遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ－ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。その方法は以下の通りである。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ－ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いて３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。Ｆ－ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）たん白質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いる。
（５）プロテイングルタミナーゼの活性を以下の式により求める。
本発明において用いられるプロテインアスパラギナーゼは、たん白質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びたん白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する。当該作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。プロテインアスパラギナーゼは、プロテインアスパラギナーゼを産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。プロテインアスパラギナーゼの調製に用いられる微生物は特に限定されないが、ルテイミクロビウム属、アグロマイセス属、ミクロバクテリウム属、レイフソニア属の微生物が例示される。例えば、ルテイミクロビウム属細菌としてはルテイミクロビウム・アルバム（Luteimicrobium album）等、アグロマイセス属細菌としてはアグロマイセス属の１種（AJ111073（NITE BP-01782））等、ミクロバクテリウム属細菌としてはミクロバクテリウム・テスタセウム（Microbacterium testaceum）等、レイフソニア属細菌としては、レイフソニア・キシリー（Leifsonia xyli）やレイフソニア・アクアティカ（Leifsonia aquatica）等が挙げられる。
本発明において用いられるプロテインアスパラギナーゼは、例えば、ＷＯ２０１５／１３３５９０に記載の方法により製造することができる。
本発明において用いられるプロテインアスパラギナーゼは、例えば、ＷＯ２０１５／１３３５９０に記載の方法により製造することができる。
本明細書において使用するプロテインアスパラギナーゼの活性単位は、次のようにして測定され、かつ定義される。
（１）３０ｍＭ Ｃｂｚ－Ａｓｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１２５μｌにプロテインアスパラギナーゼを含む水溶液２５μｌを添加して、３７℃、６０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１５０μｌを加えて反応を停止させる。
（２）遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ－ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。その方法は以下の通りである。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ－ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いて３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。Ｆ－ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）たん白質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いる。
（５）プロテインアスパラギナーゼの活性を以下の式により求める。
（１）３０ｍＭ Ｃｂｚ－Ａｓｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１２５μｌにプロテインアスパラギナーゼを含む水溶液２５μｌを添加して、３７℃、６０分間インキュベートした後、１２％ＴＣＡ溶液１５０μｌを加えて反応を停止させる。
（２）遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、上清についてＦ－ｋｉｔアンモニア（Ｒｏｃｈｅ製）によるＮＨ３の定量を行う。その方法は以下の通りである。
（３）試薬ＩＩ液（Ｆ－ｋｉｔ付属品）１００μｌに上清１０μｌと０．１Ｍトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０）１９０μｌを加え、室温で５分間放置後１００μｌを用いて３４０ｎｍの吸光度（Ｅ１）を測定する。残りの２００μｌに、１．０μｌの試薬ＩＩＩ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に２０分間室温に放置した後に残り２００μｌの３４０ｎｍの吸光度（Ｅ２）を測定する。Ｆ－ｋｉｔに付属のアンモニア標準液を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（３４０ｎｍ）の変化量の関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求める。
（４）たん白質濃度の測定は、プロテインアッセイＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）溶液（ナカライテスク）を用い、検出波長５９５ｎｍで測定する。Ｓｔａｎｄａｒｄとして、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いる。
（５）プロテインアスパラギナーゼの活性を以下の式により求める。
本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法は、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順（工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順）又は反対の順（工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順）に行うことを含む。
以下、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順に行うことを含む製造方法を、「本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法（Ａ）」と記載し、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順に行うことを含む製造方法を、「本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法（Ｂ）」と記載する。
以下、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順に行うことを含む製造方法を、「本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法（Ａ）」と記載し、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順に行うことを含む製造方法を、「本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法（Ｂ）」と記載する。
本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法（Ａ）としては、以下の工程（Ａ１）－（Ａ３）を含む方法が好ましい。
工程（Ａ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ａ２）：工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ａ３）：工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程
工程（Ａ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ａ２）：工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ａ３）：工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程
工程（Ａ１）
工程（Ａ１）では、えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る。
本発明において使用するえんどう豆は、黄色えんどう豆、赤えんどう豆等が挙げられ、マメ科エンドウ属の完熟種子であれば種類は問わない。
乾式粉砕は、公知の方法で行うことができるが、例えば、衝撃式粉砕機、ピンミル、ジェットミル、ボールミル等が挙げられる。
乾式粉砕して得られたえんどう豆粉砕物（えんどう豆粉末）に水を添加し、攪拌してえんどう豆粉砕物の水分散液を得ることができる。添加する水の量は、例えば、えんどう豆粉砕物１５重量部に対して、６０～１０００重量部である。攪拌は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で１時間攪拌する。
また、湿式粉砕により、えんどう豆粉砕物の水分散液を得ることができる。
湿式粉砕は、公知の方法で行うことができるが、例えば、ボールミル等が挙げられる。使用する水の量は、適宜選択することができる。必要に応じて、湿式粉砕で得られた水分散液にさらに水を添加して、例えば、えんどう豆粉砕物１５重量部に対して、水を６０～１０００重量部の割合で含むえんどう豆粉砕物の水分散液を得ることができる。
本発明において、えんどう豆粉砕物は、例えば粒度分布曲線において、小粒径側から体積累計９５％の粒径を表わすＤ９５が２００μｍ以下のものを用いることができる。粒径は、例えばレーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定できる。
工程（Ａ１）では、えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る。
本発明において使用するえんどう豆は、黄色えんどう豆、赤えんどう豆等が挙げられ、マメ科エンドウ属の完熟種子であれば種類は問わない。
乾式粉砕は、公知の方法で行うことができるが、例えば、衝撃式粉砕機、ピンミル、ジェットミル、ボールミル等が挙げられる。
乾式粉砕して得られたえんどう豆粉砕物（えんどう豆粉末）に水を添加し、攪拌してえんどう豆粉砕物の水分散液を得ることができる。添加する水の量は、例えば、えんどう豆粉砕物１５重量部に対して、６０～１０００重量部である。攪拌は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で１時間攪拌する。
また、湿式粉砕により、えんどう豆粉砕物の水分散液を得ることができる。
湿式粉砕は、公知の方法で行うことができるが、例えば、ボールミル等が挙げられる。使用する水の量は、適宜選択することができる。必要に応じて、湿式粉砕で得られた水分散液にさらに水を添加して、例えば、えんどう豆粉砕物１５重量部に対して、水を６０～１０００重量部の割合で含むえんどう豆粉砕物の水分散液を得ることができる。
本発明において、えんどう豆粉砕物は、例えば粒度分布曲線において、小粒径側から体積累計９５％の粒径を表わすＤ９５が２００μｍ以下のものを用いることができる。粒径は、例えばレーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定できる。
工程（Ａ２）
工程（Ａ２）では、工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を回収する。
工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去する方法として、例えば、遠心分離、ろ過が挙げられる。遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過を組合せて行ってもよい。固体物質を除去した溶液（遠心分離で回収した上清、又はろ過で回収したろ液）に酸を添加する。
酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。酸を添加して、ｐＨ３．０～ｐＨ６．０（好ましくはｐＨ４．５）に調整し、沈殿物が生じる。
沈殿物を回収する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーションが挙げられる。
遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過とデカンテーションを組合せて行ってもよい。
工程（Ａ２）では、工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を回収する。
工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去する方法として、例えば、遠心分離、ろ過が挙げられる。遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過を組合せて行ってもよい。固体物質を除去した溶液（遠心分離で回収した上清、又はろ過で回収したろ液）に酸を添加する。
酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。酸を添加して、ｐＨ３．０～ｐＨ６．０（好ましくはｐＨ４．５）に調整し、沈殿物が生じる。
沈殿物を回収する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーションが挙げられる。
遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過とデカンテーションを組合せて行ってもよい。
工程（Ａ３）
工程（Ａ３）では、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行うことで、本発明の改質したえんどう豆たん白質を得る。
本発明においては、沈殿物（ペースト状、半固形）にたん白質脱アミド酵素の粉末または溶液を練りこみ、半固形の状態でも、酵素反応を進めることができる。すなわち、沈殿物に水を加えて溶解し、必要に応じてアルカリを添加してｐＨを調整し、たん白質脱アミド酵素を加えて溶解して酵素反応を行ってもよく、又は、沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加（必要に応じてアルカリを添加してｐＨを調整）して、練りこんで酵素反応を行ってもよい。
反応効率・ハンドリングの面からは、沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、攪拌して酵素反応を行うことが好ましい。沈殿物を溶解するために使用する水の量は、沈殿物が溶解・分散し、後述するアルカリが均一に混合できるようになる量であれば特に限定はない。
沈殿物又は沈殿物の溶液のｐＨ調整（中和）は、たん白質脱アミド酵素の添加前、又は添加後に行ってもよい。ｐＨ調整のために使用するアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
本発明においては、たん白質脱アミド酵素を添加する前に、工程（Ａ２）で得られた沈殿物又は沈殿物の溶液を乾燥させる工程を行わないことが好ましい。沈殿物をいったん乾燥させると、反応効率が低くなったり、得られるたん白質の質が異なる可能性がある。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）の添加量は、対象物質（工程（Ａ２）で得られた沈殿物又は沈殿物の溶液）中の、たん白質１ｇあたり、好ましくは０．１～１０００ユニット、より好ましくは１～１００ユニット、特に好ましくは５～５０ユニットである。本明細書において、「たん白質１ｇあたり」の「たん白質」とは、対象物質に含まれる窒素量に対して窒素換算係数５．７をかけた値とする。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）添加後の酵素反応時間、すなわち酵素添加から酸添加までの時間は１０分～２４時間（好ましくは１時間）である。酵素反応温度は各酵素の温度安定性や至適温度によって異なるが、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は０～８０℃（好ましくは５０℃）であり、プロテインアスパラギナーゼの場合は０～６０℃（好ましくは３５℃）である。反応時間について、１０分未満だと酵素添加効果が十分に得られず、２４時間を超えると工場においてタンクを占有してしまうなどの生産性の低下が生じる。反応温度について、０℃未満だと溶液が凍り酵素反応が進行せず、プロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超えると、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超えると酵素が失活する。酵素反応時には攪拌することがより好ましく、攪拌は公知の方法で行うことができる。
工程（Ａ３）では、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行うことで、本発明の改質したえんどう豆たん白質を得る。
本発明においては、沈殿物（ペースト状、半固形）にたん白質脱アミド酵素の粉末または溶液を練りこみ、半固形の状態でも、酵素反応を進めることができる。すなわち、沈殿物に水を加えて溶解し、必要に応じてアルカリを添加してｐＨを調整し、たん白質脱アミド酵素を加えて溶解して酵素反応を行ってもよく、又は、沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加（必要に応じてアルカリを添加してｐＨを調整）して、練りこんで酵素反応を行ってもよい。
反応効率・ハンドリングの面からは、沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、攪拌して酵素反応を行うことが好ましい。沈殿物を溶解するために使用する水の量は、沈殿物が溶解・分散し、後述するアルカリが均一に混合できるようになる量であれば特に限定はない。
沈殿物又は沈殿物の溶液のｐＨ調整（中和）は、たん白質脱アミド酵素の添加前、又は添加後に行ってもよい。ｐＨ調整のために使用するアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
本発明においては、たん白質脱アミド酵素を添加する前に、工程（Ａ２）で得られた沈殿物又は沈殿物の溶液を乾燥させる工程を行わないことが好ましい。沈殿物をいったん乾燥させると、反応効率が低くなったり、得られるたん白質の質が異なる可能性がある。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）の添加量は、対象物質（工程（Ａ２）で得られた沈殿物又は沈殿物の溶液）中の、たん白質１ｇあたり、好ましくは０．１～１０００ユニット、より好ましくは１～１００ユニット、特に好ましくは５～５０ユニットである。本明細書において、「たん白質１ｇあたり」の「たん白質」とは、対象物質に含まれる窒素量に対して窒素換算係数５．７をかけた値とする。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）添加後の酵素反応時間、すなわち酵素添加から酸添加までの時間は１０分～２４時間（好ましくは１時間）である。酵素反応温度は各酵素の温度安定性や至適温度によって異なるが、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は０～８０℃（好ましくは５０℃）であり、プロテインアスパラギナーゼの場合は０～６０℃（好ましくは３５℃）である。反応時間について、１０分未満だと酵素添加効果が十分に得られず、２４時間を超えると工場においてタンクを占有してしまうなどの生産性の低下が生じる。反応温度について、０℃未満だと溶液が凍り酵素反応が進行せず、プロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超えると、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超えると酵素が失活する。酵素反応時には攪拌することがより好ましく、攪拌は公知の方法で行うことができる。
工程（Ａ３）において、たん白質脱アミド酵素を添加する前に、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を加熱する工程を含むことが好ましい。
該加熱工程は、たん白質脱アミド酵素の添加前であれば、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）に水を加えて溶解した後に行ってもよい。該加熱工程は、たん白質脱アミド酵素の添加前であれば、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）の、ｐＨ調整前又はｐＨ調整後のいずれに行ってもよいが、ｐＨ調整後に行うことが好ましい。
たん白質脱アミド酵素を添加する前に、工程（Ａ２）で得られた沈殿物を加熱する工程を含むことで、低ｐＨ条件においてさらに溶解性が向上したえんどう豆たん白質を製造することができる（後述の試験例３（実施例６）参照）。
該加熱工程における、加熱温度は、５５～９５℃、好ましくは６０～８０℃である。加熱時間は、１～１２０分間、好ましくは５～６０分間である。
該加熱工程は、たん白質脱アミド酵素の添加前であれば、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）に水を加えて溶解した後に行ってもよい。該加熱工程は、たん白質脱アミド酵素の添加前であれば、工程（Ａ２）で得られた沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）の、ｐＨ調整前又はｐＨ調整後のいずれに行ってもよいが、ｐＨ調整後に行うことが好ましい。
たん白質脱アミド酵素を添加する前に、工程（Ａ２）で得られた沈殿物を加熱する工程を含むことで、低ｐＨ条件においてさらに溶解性が向上したえんどう豆たん白質を製造することができる（後述の試験例３（実施例６）参照）。
該加熱工程における、加熱温度は、５５～９５℃、好ましくは６０～８０℃である。加熱時間は、１～１２０分間、好ましくは５～６０分間である。
本発明の製造方法において、工程（Ａ３）で得られた本発明の改質したえんどう豆たん白質（液、ペースト状、又は半固形）を、乾燥して、本発明の改質したえんどう豆たん白質（乾燥物）を得ることもできる。
乾燥方法は、例えば、凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等が挙げられる。凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等の乾燥は、公知の方法で行うことができる。
上記の乾燥工程の前において加熱をすることにより、酵素（たん白質脱アミド酵素）を失活させることができる。加熱温度について、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超える温度、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超える温度であればよい。
乾燥方法は、例えば、凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等が挙げられる。凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等の乾燥は、公知の方法で行うことができる。
上記の乾燥工程の前において加熱をすることにより、酵素（たん白質脱アミド酵素）を失活させることができる。加熱温度について、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超える温度、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超える温度であればよい。
本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法（Ｂ）としては、以下の工程（Ｂ１）～（Ｂ３）を含む方法が好ましい。
工程（Ｂ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ｂ２）：工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程
工程（Ｂ３）：工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ｂ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ｂ２）：工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程
工程（Ｂ３）：工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ｂ１）
工程（Ｂ１）では、えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る。
工程（Ｂ１）は、前述の工程（Ａ１）と同じ方法で行うことができる。
工程（Ｂ１）では、えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る。
工程（Ｂ１）は、前述の工程（Ａ１）と同じ方法で行うことができる。
工程（Ｂ２）
工程（Ｂ２）では、工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る。
工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去する方法として、例えば、遠心分離、ろ過が挙げられる。遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過を組合せて行ってもよい。固体物質を除去した溶液（遠心分離で回収した上清、又はろ過で回収したろ液）にたん白質脱アミド酵素を添加する。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）の添加量は、対象物質（工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液）中の、たん白質１ｇあたり、好ましくは０．１～１０００ユニット、より好ましくは１～１００ユニット、特に好ましくは５～５０ユニットである。本明細書において、「たん白質１ｇあたり」の「たん白質」とは、対象物質に含まれる窒素量に対して窒素換算係数５．７をかけた値とする。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）添加後の酵素反応時間、すなわち酵素添加から酸添加までの時間は１０分～２４時間（好ましくは１時間）である。酵素反応温度は各酵素の温度安定性や至適温度によって異なるが、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は０～８０℃（好ましくは５０℃）であり、プロテインアスパラギナーゼの場合は０～６０℃（好ましくは３５℃）である。反応時間について、１０分未満だと酵素添加効果が十分に得られず、２４時間を超えると工場においてタンクを占有してしまうなどの生産性の低下が生じる。反応温度について、０℃未満だと溶液が凍り酵素反応が進行せず、プロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超えると、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超えると酵素が失活する。酵素反応時には攪拌することがより好ましく、攪拌は公知の方法で行うことができる。
本発明においては、たん白質脱アミド酵素を添加する前に、えんどう豆粉砕物を乾燥させる工程を行わないことが好ましい。いったん乾燥させると、反応効率が低くなったり、得られるたん白質の質が異なる可能性がある。
工程（Ｂ２）では、工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る。
工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去する方法として、例えば、遠心分離、ろ過が挙げられる。遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過を組合せて行ってもよい。固体物質を除去した溶液（遠心分離で回収した上清、又はろ過で回収したろ液）にたん白質脱アミド酵素を添加する。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）の添加量は、対象物質（工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液）中の、たん白質１ｇあたり、好ましくは０．１～１０００ユニット、より好ましくは１～１００ユニット、特に好ましくは５～５０ユニットである。本明細書において、「たん白質１ｇあたり」の「たん白質」とは、対象物質に含まれる窒素量に対して窒素換算係数５．７をかけた値とする。
たん白質脱アミド酵素（例えば、プロテイングルタミナーゼやプロテインアスパラギナーゼ）添加後の酵素反応時間、すなわち酵素添加から酸添加までの時間は１０分～２４時間（好ましくは１時間）である。酵素反応温度は各酵素の温度安定性や至適温度によって異なるが、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は０～８０℃（好ましくは５０℃）であり、プロテインアスパラギナーゼの場合は０～６０℃（好ましくは３５℃）である。反応時間について、１０分未満だと酵素添加効果が十分に得られず、２４時間を超えると工場においてタンクを占有してしまうなどの生産性の低下が生じる。反応温度について、０℃未満だと溶液が凍り酵素反応が進行せず、プロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超えると、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超えると酵素が失活する。酵素反応時には攪拌することがより好ましく、攪拌は公知の方法で行うことができる。
本発明においては、たん白質脱アミド酵素を添加する前に、えんどう豆粉砕物を乾燥させる工程を行わないことが好ましい。いったん乾燥させると、反応効率が低くなったり、得られるたん白質の質が異なる可能性がある。
工程（Ｂ３）
工程（Ｂ３）では、工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を回収する。
酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。酸を添加して、ｐＨ３．０～ｐＨ６．０（好ましくはｐＨ４．５）に調整し、沈殿物が生じる。
沈殿物を回収する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーションが挙げられる。
遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過とデカンテーションを組合せて行ってもよい。
沈殿物の中和は、ハンドリングの面からは、沈殿物を溶解後に行うことが好ましい。沈殿物を溶解するために使用する水の量は、沈殿物が溶解・分散し、下記のアルカリが均一に混合できるようになる量であれば特に限定はない。
沈殿物又は沈殿物の溶液のｐＨ調整（中和）のために使用するアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
工程（Ｂ３）では、工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物（分離えんどう豆たん白質カード）を回収する。
酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。酸を添加して、ｐＨ３．０～ｐＨ６．０（好ましくはｐＨ４．５）に調整し、沈殿物が生じる。
沈殿物を回収する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過、デカンテーションが挙げられる。
遠心分離は公知の方法で行うことができ、例えば、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）を行う。ろ過は公知の方法で行うことができ、例えば、ペーパーフィルター等にてろ過してもよい。遠心分離とろ過とデカンテーションを組合せて行ってもよい。
沈殿物の中和は、ハンドリングの面からは、沈殿物を溶解後に行うことが好ましい。沈殿物を溶解するために使用する水の量は、沈殿物が溶解・分散し、下記のアルカリが均一に混合できるようになる量であれば特に限定はない。
沈殿物又は沈殿物の溶液のｐＨ調整（中和）のために使用するアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
本発明の製造方法において、工程（Ｂ３）で得られた本発明の改質したえんどう豆たん白質（液、ペースト状、又は半固形）を、乾燥して、本発明の改質したえんどう豆たん白質（乾燥物）を得ることもできる。
乾燥方法は、例えば、凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等が挙げられる。凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等の乾燥は、公知の方法で行うことができる。
上記の乾燥工程の前において加熱をすることにより、酵素（たん白質脱アミド酵素）を失活させることができる。加熱温度について、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超える温度、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超える温度であればよい。
乾燥方法は、例えば、凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等が挙げられる。凍結乾燥、スプレードライ、ドラムドライ等の乾燥は、公知の方法で行うことができる。
上記の乾燥工程の前において加熱をすることにより、酵素（たん白質脱アミド酵素）を失活させることができる。加熱温度について、例えばプロテイングルタミナーゼの場合は８０℃を超える温度、プロテインアスパラギナーゼの場合は６０℃を超える温度であればよい。
従来の分離えんどう豆たん白質粉末を食品や飲料に添加して最終製品を製造する工程において、たん白質の溶解性を向上させるために酵素を添加すると、酵素を添加した後に加熱等の失活工程を経ずに製造された最終製品には、その原材料表示に酵素表示が義務付けられるため、包材の変更、流通や消費者からの受容性の低下等のデメリットが発生する。
本発明の製造方法において、上記の乾燥工程を経て得られる溶解性が向上したえんどう豆たん白質は、酵素添加工程から乾燥工程の間で酵素を失活できるような十分な加熱をすることができれば、最終製品製造時にさらなる加熱等の失活工程や最終製品表示への酵素記載が不要である点で有利である。
本発明の製造方法において、上記の乾燥工程を経て得られる溶解性が向上したえんどう豆たん白質は、酵素添加工程から乾燥工程の間で酵素を失活できるような十分な加熱をすることができれば、最終製品製造時にさらなる加熱等の失活工程や最終製品表示への酵素記載が不要である点で有利である。
上記した本発明の製造方法により、本発明の改質したえんどう豆たん白質を得ることができる。「改質した」とは、酵素反応によりえんどう豆たん白質の溶解性等の性質が変化したものであることを意味する。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、低ｐＨ条件における溶解性が向上している。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、ｐＨ７以下（好ましくはｐＨ６．４以下、特に好ましくはｐＨ６．１以下）における溶解性が向上している。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、特に、ｐＨ５．２～ｐＨ７．０の範囲（好ましくはｐＨ５．２～ｐＨ６．４の範囲、特に好ましくはｐＨ５．５～ｐＨ６．１の範囲）で溶解性が向上している。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、低ｐＨ条件における溶解性が向上している。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、ｐＨ７以下（好ましくはｐＨ６．４以下、特に好ましくはｐＨ６．１以下）における溶解性が向上している。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、特に、ｐＨ５．２～ｐＨ７．０の範囲（好ましくはｐＨ５．２～ｐＨ６．４の範囲、特に好ましくはｐＨ５．５～ｐＨ６．１の範囲）で溶解性が向上している。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、そのまま、又は食品（飼料）に添加して、ヒト、ヒト以外の動物（例えば、家畜、家禽、実験動物などの、哺乳動物、鳥類）が安全に摂取することができる。
本発明の改質したえんどう豆たん白質の摂取量は特に限定されず、一般食品（飼料）のたん白質摂取量に準じて適宜選択すればよい。
本明細書において、食品とは、経口摂取し得るもの（医薬品を除く）を広く包含する概念であり、いわゆる「食べ物」のみならず飲料、健康補助食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品）、サプリメントなどを含む。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、酸性食品・飲料に配合した場合に、従来のえんどう豆たん白質に比べて沈殿ができにくい点で、有利である。
本発明の改質したえんどう豆たん白質の摂取量は特に限定されず、一般食品（飼料）のたん白質摂取量に準じて適宜選択すればよい。
本明細書において、食品とは、経口摂取し得るもの（医薬品を除く）を広く包含する概念であり、いわゆる「食べ物」のみならず飲料、健康補助食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品）、サプリメントなどを含む。
本発明の改質したえんどう豆たん白質は、酸性食品・飲料に配合した場合に、従来のえんどう豆たん白質に比べて沈殿ができにくい点で、有利である。
本発明はまた、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法に関する。
本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法は、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順（工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順）又は反対の順（工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順）に行うことを含む。
以下、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順に行うことを含む方法を、「本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法（Ａ）」と記載し、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順に行うことを含む方法を、「本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法（Ｂ）」と記載する。
本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法は、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順（工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順）又は反対の順（工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順）に行うことを含む。
以下、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）の順に行うことを含む方法を、「本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法（Ａ）」と記載し、えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、工程（ＩＩ）、工程（Ｉ）の順に行うことを含む方法を、「本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法（Ｂ）」と記載する。
本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法（Ａ）としては、以下の工程（Ａ１）－（Ａ３）を含む方法が好ましい。
工程（Ａ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ａ２）：工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ａ３）：工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程
工程（Ａ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ａ２）：工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ａ３）：工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程
本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法（Ｂ）としては、以下の工程（Ｂ１）－（Ｂ３）を含む方法が好ましい。
工程（Ｂ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ｂ２）：工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程
工程（Ｂ３）：工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
工程（Ｂ１）：えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程
工程（Ｂ２）：工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程
工程（Ｂ３）：工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程
本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法における工程（Ａ１）－（Ａ３）、（Ｂ１）－（Ｂ３）は、前述の本発明の改質したえんどう豆たん白質の製造方法における工程（Ａ１）－（Ａ３）、（Ｂ１）－（Ｂ３）と同様に行うことができる。また、本発明のえんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法は、該製造方法について説明した乾燥工程を含んでいてもよい。
本発明の方法により、低ｐＨ条件におけるえんどう豆たん白質の溶解性が向上する。
本発明の方法により、ｐＨ７以下（好ましくはｐＨ６．４以下、特に好ましくはｐＨ６．１以下）におけるえんどう豆たん白質の溶解性が向上する。
本発明の方法により、特に、ｐＨ５．２～ｐＨ７．０の範囲（好ましくはｐＨ５．２～ｐＨ６．４の範囲、さらに好ましくはｐＨ５．５～ｐＨ６．１の範囲）でえんどう豆たん白質の溶解性が向上する。
本発明において、溶解度は、例えば、後述の試験例１に記載の方法により、測定することができる。
本発明の方法により、低ｐＨ条件におけるえんどう豆たん白質の溶解性が向上する。
本発明の方法により、ｐＨ７以下（好ましくはｐＨ６．４以下、特に好ましくはｐＨ６．１以下）におけるえんどう豆たん白質の溶解性が向上する。
本発明の方法により、特に、ｐＨ５．２～ｐＨ７．０の範囲（好ましくはｐＨ５．２～ｐＨ６．４の範囲、さらに好ましくはｐＨ５．５～ｐＨ６．１の範囲）でえんどう豆たん白質の溶解性が向上する。
本発明において、溶解度は、例えば、後述の試験例１に記載の方法により、測定することができる。
以下、実施例、比較例、試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例において、プロテイングルタミナーゼとして、Ａｍａｎｏ５００Ｋプロテイン－グルタミナーゼ（商品名）（天野エンザイム（株））を使用した。
以下の実施例において、プロテイングルタミナーゼとして、Ａｍａｎｏ５００Ｋプロテイン－グルタミナーゼ（商品名）（天野エンザイム（株））を使用した。
［実施例１］
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径の規格が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が１４９μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例１の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径の規格が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が１４９μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例１の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例１］
実施例１における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例１と同じ方法で、比較例１の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例１における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例１と同じ方法で、比較例１の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［試験例１］
実施例１及び比較例１で得た分離えんどう豆たん白質乾燥物のそれぞれ２重量部に９８重量部の水を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを加えてｐＨを５．５及び７．０に調整して２０℃で２時間攪拌し、ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を得た。
得られたｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を２０℃で遠心分離（２００００ｇ×１０分）して上清（各ｐＨ調整溶液）を回収し、その窒素濃度をケルダール法により測定して、下式によりたん白質の溶解度を求めた。結果を表１に示す。
たん白質の溶解度（％）＝上清に含まれる窒素量／ｐＨ調整分散液サンプル全体に含まれる窒素量
実施例１及び比較例１で得た分離えんどう豆たん白質乾燥物のそれぞれ２重量部に９８重量部の水を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを加えてｐＨを５．５及び７．０に調整して２０℃で２時間攪拌し、ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を得た。
得られたｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を２０℃で遠心分離（２００００ｇ×１０分）して上清（各ｐＨ調整溶液）を回収し、その窒素濃度をケルダール法により測定して、下式によりたん白質の溶解度を求めた。結果を表１に示す。
たん白質の溶解度（％）＝上清に含まれる窒素量／ｐＨ調整分散液サンプル全体に含まれる窒素量
［実施例２］
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径の規格が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が１４９μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液をスプレードライすることにより、実施例２の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径の規格が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が１４９μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液をスプレードライすることにより、実施例２の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例２］
実施例２における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例２と同じ方法で、比較例２の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例２における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２０ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例２と同じ方法で、比較例２の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［試験例２］
実施例２及び比較例２で得た分離えんどう豆たん白質乾燥物のそれぞれ２重量部に９８重量部の水を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを加えてｐＨを５．２、５．５、５．８及び７．０に調整して２０℃で２時間攪拌し、ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を得た。
ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を２０℃で遠心分離（２００００ｇ×１０分）して上清（各ｐＨ調整溶液）を回収し、その窒素濃度をケルダール法により測定して、上記の式によりたん白質の溶解度を求めた。結果を表２に示す。
実施例２及び比較例２で得た分離えんどう豆たん白質乾燥物のそれぞれ２重量部に９８重量部の水を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを加えてｐＨを５．２、５．５、５．８及び７．０に調整して２０℃で２時間攪拌し、ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を得た。
ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を２０℃で遠心分離（２００００ｇ×１０分）して上清（各ｐＨ調整溶液）を回収し、その窒素濃度をケルダール法により測定して、上記の式によりたん白質の溶解度を求めた。結果を表２に示す。
［実施例３］
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２１ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例３の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２１ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例３の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例３］
実施例３における「黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２１ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例３と同じ方法で、比較例３の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例３における「黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２１ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例３と同じ方法で、比較例３の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［実施例４］
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液にプロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２４ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例４の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液にプロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２４ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例４の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例４］
実施例４における「得られたえんどう豆溶液にプロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２４ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られたえんどう豆溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例４と同じ方法で、比較例４の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例４における「得られたえんどう豆溶液にプロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり２４ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られたえんどう豆溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例４と同じ方法で、比較例４の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［実施例５］
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例５の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
黄色えんどう豆を乾式粉砕して得られた黄色えんどう豆粉末（粒径が、レーザー回折・散乱式 粒子径分布測定装置で測定したＤ９５が５０μｍ以下の粉末）１５重量部に８５重量部の水を加え、２０℃で１時間攪拌し、２０℃で遠心分離を行い（６０００ｇ×３０分）、上清を回収してペーパーフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，５２０Ｂ １／２ ＦＦ）にてろ過し、えんどう豆溶液を得た。得られたえんどう豆溶液に塩酸を加えてｐＨ４．５に調整し、２０℃で３０分攪拌し、２０℃で遠心分離（６０００ｇ×３０分）して沈殿物を回収し、分離えんどう豆たん白質カードを得た。得られたカード１重量部に３重量部の水を加えてカードを分散させ、水酸化ナトリウムを加えて溶液ｐＨを７．０に調整し、カードを溶解して、分離えんどう豆たん白質溶液を得た。得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例５の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例５］
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例５の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例５の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［実施例６］
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を７５℃で１５分間攪拌し、氷水で５０℃まで冷却後、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、実施例６の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を７５℃で１５分間攪拌し、氷水で５０℃まで冷却後、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、実施例６の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例６］
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を７５℃で１５分間攪拌し、氷水で冷却した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例６の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を７５℃で１５分間攪拌し、氷水で冷却した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例６の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例７］
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を７５℃で１５分間攪拌し、氷水で５０℃まで冷却後、（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例７の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を７５℃で１５分間攪拌し、氷水で５０℃まで冷却後、（プロテイングルタミナーゼを添加せずに）５０℃で１時間攪拌した」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例７の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［比較例８］
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例５の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例８の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例８の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
実施例５における「得られた分離えんどう豆たん白質溶液に、プロテイングルタミナーゼをたん白質１ｇあたり１７ユニット添加し、５０℃で１時間攪拌した。その溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例５の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。」を、「得られた分離えんどう豆たん白質溶液を凍結し、凍結乾燥することにより、実施例８の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。」に変更した以外は、実施例５と同じ方法で、比較例８の分離えんどう豆たん白質乾燥物を得た。
［試験例３］
実施例３～６及び比較例３～８で得た分離えんどう豆たん白質乾燥物のそれぞれ２重量部に９８重量部の水を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを加えてｐＨを５．２、５．５、５．８、６．１、６．４、６．７及び７．０に調整して２０℃で２時間攪拌し、ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を得た。
ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を２０℃で遠心分離（１５０００ｇ×１０分）して上清（各ｐＨ調整溶液）を回収し、その窒素濃度をケルダール法により測定して、上記の式によりたん白質の溶解度を求めた。
結果を、図１～４に示す。
実施例３～６及び比較例３～８で得た分離えんどう豆たん白質乾燥物のそれぞれ２重量部に９８重量部の水を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを加えてｐＨを５．２、５．５、５．８、６．１、６．４、６．７及び７．０に調整して２０℃で２時間攪拌し、ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を得た。
ｐＨを調整した各分離えんどう豆たん白質分散液を２０℃で遠心分離（１５０００ｇ×１０分）して上清（各ｐＨ調整溶液）を回収し、その窒素濃度をケルダール法により測定して、上記の式によりたん白質の溶解度を求めた。
結果を、図１～４に示す。
本発明によれば、改質したえんどう豆たん白質（特に、溶解性が向上したえんどう豆たん白質）の製造方法等を提供することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１９－１２４８３６及び特願２０２０－０５４９１５を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
Claims (9)
- えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、改質したえんどう豆たん白質の製造方法。
- （Ａ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程、
を含む、請求項１記載の製造方法。 - （Ｂ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程、及び
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、
を含む、請求項１記載の製造方法。 - たん白質脱アミド酵素の添加量が、たん白質１ｇあたり、０．１～１０００ユニットである、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法で得られる、改質したえんどう豆たん白質。
- えんどう豆粉砕物の水分散液を原料として、（Ｉ）酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び（ＩＩ）たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応を行う工程を、この順又は反対の順に行うことを含む、えんどう豆たん白質の溶解性を向上させる方法。
- （Ａ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた水分散液、又は工程（Ａ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、及び
（Ａ３）工程（Ａ２）で得られた沈殿物にたん白質脱アミド酵素を添加するか、又は工程（Ａ２）で得られた沈殿物を溶解後にたん白質脱アミド酵素を添加して、酵素反応を行う工程、
を含む、請求項６記載の方法。 - （Ｂ１）えんどう豆を乾式粉砕して水と混合するか、又はえんどう豆を水中で湿式粉砕して、えんどう豆粉砕物の水分散液を得る工程、
（Ｂ２）工程（Ｂ１）で得られた水分散液、又は工程（Ｂ１）で得られた水分散液から固体物質を除去した溶液に、たん白質脱アミド酵素を添加して酵素反応液を得る工程、及び
（Ｂ３）工程（Ｂ２）で得られた酵素反応液に、酸を添加して沈殿物を回収する工程、
を含む、請求項６記載の方法。 - たん白質脱アミド酵素の添加量が、たん白質１ｇあたり、０．１～１０００ユニットである、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
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