WO2021002571A1 - 식물 엑소좀의 대량 생산 방법 - Google Patents

식물 엑소좀의 대량 생산 방법 Download PDF

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centrifugation
exosome
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조용우
최지숙
최영찬
김민강
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Exostemtech Co Ltd
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting exosomes from raw plants, including plants having hard pulp or skin. More specifically, the present invention relates to a method for mass-producing high-purity plant exosomes from raw plants so that they can be usefully used in related industries such as pharmaceuticals and commercialized products.
  • exosomes are nano-sized microvesicles secreted from various cells, contain proteins, lipids, mRNA, and miRNA, and act as an important mediator of intercellular communication by acting on the endocrine system. This role is attracting attention as a new treatment that can overcome the problems of existing stem cell treatments such as engraftment and immunogenicity.
  • exosomes isolated from edible plants have no toxicity or immunogenicity compared to exosomes secreted from mammalian cells, and thus have very high stability and biocompatibility in the body.
  • exosomes isolated from mammalian cells contain about 20% cholesterol, but edible plant exosomes do not contain cholesterol.
  • the source plant compared to animal tissue or cell culture solution, the source plant has the advantage of being able to obtain a large amount.
  • a mass production process using centrifugation and TFF is proposed as a method for extracting high-purity plant exosomes.
  • the purification and productivity of high-purity plant exosomes were effectively improved.
  • Another object of the present invention is to provide a method for extracting high-purity exosomes from a source plant with uniform particle size and distribution.
  • Another object of the present invention is a method for extracting plant exosomes without limitation of raw plants, including marine flora such as hard shells, stems, seeds and seaweed, and seaweed, unlike methods limited to soft flesh or juice in the prior art To provide.
  • Another object of the present invention is to provide an extraction method that is suitable for GMP production of plant-derived exosomes for medical and commercialized products, and facilitates process scale-up.
  • One aspect of the present invention is to perform centrifugation; And it is to provide a plant exosome extraction method comprising the step of performing tangential-flow filtration (TFF) as ultrafiltration.
  • TFF tangential-flow filtration
  • plant exosomes used in the present invention collectively refers to exosomes or exosome-like extracellular vesicles having a size of about 50 to 200 nm extracted from plants.
  • Plant-derived exosomes are known to have low toxicity and immunogenicity compared to exosomes secreted from mammalian cells, and have very low cholesterol content and thus have high stability and biocompatibility in the body.
  • plant-derived exosomes are known to be effective in wound healing and skin regeneration due to plant-derived antioxidant components or protein components.
  • Plant-derived exosomes have a uniform size distribution of 30 to 500 nm, and preferably may have a uniform size distribution of 50 to 200 nm.
  • the centrifugal separation method used in the present invention refers to a method of accelerating sedimentation of a solid using a centrifugal force as a separation method using a density difference between a solid and a liquid surrounding the solid. Centrifugation has the advantage that the process can be repeated continuously, a large amount can be processed within a short time, and operation in a sterile state is easy.
  • the centrifugal separation method of the present invention may be differential centrifugation, density gradient centrifugation, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the centrifugation method used in the present invention may be selected from low-speed centrifugation, high-speed centrifugation, ultracentrifugation, and combinations thereof, preferably It may be to include centrifugation (ultracentrifugation).
  • Low-speed centrifugation can achieve a speed of less than 6,000 rpm (6,000 xg) and is mainly used for centrifugation of easily precipitated samples such as cells or nuclei
  • high-speed centrifugation has a maximum speed of about 20,000-25,000 rpm (60,000 xg).
  • ultracentrifugation refers to a centrifugal separation method with a maximum speed of about 40,000-80,000 rpm (600,000 xg).
  • ultracentrifugation has a low yield and is known to damage exosomes during the separation process, so it cannot be used for mass extraction of exosomes, and only laboratory-level separation is known.
  • the inventors of the present invention surprisingly found that, unlike animal exosomes, plant exosomes can effectively improve productivity without damaging exosomes through ultracentrifugation, and can be applied to mass production processes of exosomes.
  • the centrifugation of the present invention is (a) a process of obtaining a supernatant after centrifugation for 10 to 30 minutes in a centrifugation condition at a rate of 1,000 to 3,000 ⁇ g, (b) a second at a rate of 10,000 to 50,000 ⁇ g The process of ultracentrifuging for 60 minutes to 2 hours under centrifugation conditions to remove vacuoles, and (c) ultracentrifuging for 60 minutes to 2 hours under ultracentrifugation conditions at a speed of 100,000 to 150,000 ⁇ g to contain exosomes. It may be performed including the process of obtaining a pellet.
  • the method of the present invention is characterized in that it includes the step of performing tangential-flow filtration (TFF).
  • the tangential-flow filtration (TFF) used in the present invention is a filtration method in which a solution flows in a direction perpendicular to the filtration membrane, filters out impurities of a small size present in the solution, and separates exosomes of a large size. It is possible to minimize the adsorption of exosomes or clogging of the membrane pores in the pores of the filtration filter compared to the conventional filtration method, and accordingly, it is easy to apply a process scale-up and GMP process.
  • the rapid flow of the feed solution acts to reduce the concentration polarization (product concentration at the pore surface) while'sweeping out' the membrane or hollow fiber surface.
  • the TFF method prevents an increase in contaminants that can clog pores. This rapid cross flow drops the pressure, which can force some of the dissolved molecules and feed solutions smaller than the pores of the membrane or hollow fiber to pass through the filter.
  • the solution that has passed through the pores is called a filtrate or permeate, and molecules or particles larger than the pores remain in the feed solution and are effectively concentrated.
  • the TFF of the present invention is an ultrafiltration system, and as a result of performing the TFF method as described above, the centrifuged extract can be efficiently concentrated to a volume of 1/10 to 1/100.
  • Ultrafiltration is located in the middle of microfiltration and reverse osmosis, and is a method of separating specific substances by the size difference between membrane pores and solutes.
  • the ultrafiltration membrane may exhibit its separation performance as a molecular weight cutoff (MWCO) defined as the minimum molecular weight of a solute that exhibits 90% or more exclusion by the membrane.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the tangential flow filtration used in the present invention may be one or more selected from the group consisting of a hollow fiber TFF and a membrane TFF capable of performing ultrafiltration, and preferably, a molecular weight cutoff. ; MWCO) may be to use a TFF filter of 100,000 Da to 500,000 Da.
  • the method of the present invention may further include the step of crushing the source plant before the centrifugation and TFF steps.
  • the raw material plant used in the method of the present invention may include one or more selected from the group consisting of pulp, shell, seed, stem, leaf, root, and flower.
  • the process of crushing the raw material plant may include a process of mechanically grinding a mixture of the raw material plant and the buffer solution in a weight ratio of 1:1 to 1:10, and the buffer solution is Phosphate-buffered saline (PBS) , tris-buffered saline (TBS), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-buffered saline (HBS) physiological saline, distilled water, culture medium, water for injection, etc. can be used. It is not limited thereto.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • TBS tris-buffered saline
  • HBS 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
  • HBS 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
  • HBS 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulf
  • the process of pulverizing the raw plant may be performed by mechanically pulverizing the plant mixture with a blade rotating at a speed of 10 to 1,000 rpm.
  • the extract obtained by the method of the present invention may contain plant exosomes at a concentration of 10 7 to 10 12 particles per unit volume of 1 mL.
  • the method of the present invention as described above is suitable for large-scale production of plant exosomes, and is 1 mL or more, 10 mL or more, 100 mL or more, 1 L or more, 10 L or more, or 100 L per hour. There is an advantage that the above mass processing is possible.
  • the method of the present invention provides a method for uniformly obtaining high purity exosomes from which vacuoles have been removed.
  • high-purity plant exosomes can be extracted from a large number of raw plants by using centrifugation and TFF that can treat a large amount of plant raw materials at once. This improves the conventional plant exosome extraction process staying at the laboratory level and suggests an easy process for mass production.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a process for a method of extracting a plant-derived exosome according to an embodiment of the present invention.
  • TEM 2 is a morphological analysis (TEM) result of exosomes derived from aloe shell according to Example 1.
  • NTA characterization
  • FIG. 4 is a TEM image comparing the result obtained when the UC process is omitted and only TFF is performed, and the result obtained when UC and TFF are combined.
  • Figure 5 is a result of characterization (DLS) of exosomes derived from aloe shell according to Example 1.
  • Example 6 is a morphological analysis (TEM) result of garlic-derived exosomes according to Example 2.
  • NTA characteristic analysis
  • TEM 8 is a morphological analysis (TEM) result of exosomes derived from seaweed shells according to Example 3.
  • NTA characteristic analysis
  • the exosomes derived from aloe shell were extracted using UC and TFF. Specifically, the aloe skin was thoroughly ground after putting it in a blender with phosphate-buffered saline (PBS) and 1:2 (w/w). Then, the supernatant obtained after centrifugation at 1,000xg for 10 minutes was centrifuged at 2000xg for 20 minutes, and then the supernatant was collected again. The supernatant was centrifuged at 3,000xg for 30 minutes and then centrifuged at 10,000xg for 60 minutes. The supernatant after 10,000xg was ultracentrifuged for 70 minutes at 100,000xg at 4°C using UC.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the remaining pellets after UC were suspended and exosomes were extracted from the suspension through a tangential-flow filtration (TFF) system. Specifically, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed to the surface of a multi-filter having a cut-off value of 100 to 500 kDa in the TFF system, and a solution containing exosomes derived from aloe shell was concentrated. The exosomes extracted in this way were stored frozen at -70°C or less until use in the experiment.
  • TFF tangential-flow filtration
  • the exosomes derived from aloe shell were extracted using microfiltration and TFF. Specifically, the aloe skin was thoroughly ground after putting it in a blender with phosphate-buffered saline (PBS) and 1:2 (w/w). Thereafter, 2% by weight of trehalose was added to obtain exosomes having a uniform particle size distribution and high purity. After trehalose was added, it was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste products, and large particles.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • trehalose 2% by weight of trehalose was added to obtain exosomes having a uniform particle size distribution and high purity. After trehalose was added, it was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste products, and large particles.
  • exosomes were extracted through a tangential-flow filtration (TFF) system as ultrafiltration. Specifically, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed to the surface of a multi-filter having a cut-off value of 100 to 500 kDa in the TFF system, and a solution containing exosomes derived from aloe shell was concentrated. The exosomes extracted in this way were stored frozen at -70°C or less until use in the experiment.
  • TFF tangential-flow filtration
  • exosomes derived from aloe shell were evaluated for exosome characteristics through the following method.
  • TEM scanning electron microscope
  • DLS dynamic light scattering photometer
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Example 1 the supernatant after centrifugation at 10,000xg in Example 1 was microfiltered (pore size 0.1 to 1.0 ⁇ m) to filter out a solid substance having a relatively large particle size, and a mixture of exosomes and vacuoles was obtained. , It was confirmed that exosomes and vacuoles were mixed in the supernatant after centrifugation at 10,000xg. In Example 1, it was confirmed that the pellets collected after performing 100,000xg ultracentrifugation were mixed with a large amount of impurities such as proteins and nucleic acids, as well as exosomes.
  • vacuoles similar to exosomes were mixed in the extract derived from the aloe bark extracted by the method of Comparative Example 1, and it was confirmed that it was difficult to remove the vacuoles contained in the plant extract by the MF and TFF methods. Became.
  • UC ultracentrifugation
  • TFF TFF
  • Garlic-derived exosomes were extracted using UC and TFF. Specifically, the peeled garlic was mixed with Phosphate-buffered saline (PBS) and 1:2 (w/w) in a blender and then sufficiently ground. Then, the supernatant obtained after centrifugation at 1,000xg for 10 minutes was centrifuged at 2,000xg for 20 minutes, and then the supernatant was collected again. The supernatant was centrifuged at 3,000xg for 30 minutes and then centrifuged at 10,000xg for 60 minutes. The supernatant after 10,000xg was ultracentrifuged for 70 minutes at 100,000xg at 4°C using UC.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • w/w w/w
  • the remaining pellets after UC were suspended and exosomes were extracted through an ultrafiltration (tangential-flow filtration, TFF) system. Specifically, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed to the surface of a multi-filter having a cut-off value of 100 to 500 kDa in the TFF system, and a solution containing garlic-derived exosomes was concentrated. The exosomes extracted in this way were stored frozen at -70°C or less until use in the experiment.
  • TFF tangential-flow filtration
  • Garlic-derived exosomes were extracted using UC and Sucrose-Density Gradient Ultracentrifugation. Specifically, the peeled garlic was mixed with Phosphate-buffered saline (PBS) and 1:2 (w/w) in a blender and then sufficiently ground. Then, the supernatant obtained after centrifugation at 1,000xg for 10 minutes was centrifuged at 2,000xg for 20 minutes, and then the supernatant was collected again. The supernatant was centrifuged at 3,000xg for 30 minutes and then centrifuged at 10,000xg for 60 minutes. The supernatant after 10,000xg was ultracentrifuged for 70 minutes at 100,000xg at 4°C using UC.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • sucrose-Density Gradient Ultracentrifugation was additionally performed by suspending the remaining pellet after UC. Specifically, a sucrose solution having a density gradient was put in a centrifuge tube for ultracentrifugation. These sucrose solutions are prepared in 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, and 30% solutions, respectively, sterilized at 124°C for 15 minutes, and then carefully placed in a tube for ultracentrifugation of 90% to 30%. To have a layer. After carefully adding the suspension containing the exosomes to the top of the prepared sucrose gradient tube for ultracentrifugation, using a centrifuge for ultracentrifugation at 4°C and 200,000xg for 4 hours Ultracentrifuged. Thereafter, a fraction of 1 ml was obtained from the top of the tube, and the density was measured to obtain a fraction corresponding to an exosome, and washed to separate sucrose.
  • the garlic-derived exosomes extracted in Example 2 had a spherical microstructure of 200 nm or less through a scanning electron microscope (TEM) (FIG. 6), and extracted through nanoparticle tracking analysis (NTA).
  • TEM scanning electron microscope
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Seaweed-derived exosomes were extracted using UC and TFF. Specifically, the dried seaweed was mixed with phosphate-buffered saline (PBS) and 1:2 (w/w) in a blender and then sufficiently ground. Then, the supernatant obtained after centrifugation at 1,000xg for 10 minutes was centrifuged at 2,000xg for 20 minutes, and then the supernatant was collected again. The supernatant was centrifuged at 3,000xg for 30 minutes and then centrifuged at 10,000xg for 60 minutes. The supernatant after 10,000xg was ultracentrifuged for 70 minutes at 100,000xg at 4°C using UC.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • w/w phosphate-buffered saline
  • the remaining pellet was suspended and exosomes were extracted from the suspension through an ultrafiltration (tangential-flow filtration, TFF) system. Specifically, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed to the surface of the multi-filter having a cut-off value of 100 to 500 kDa in the TFF system, and the solution containing the seaweed-derived exosomes was concentrated.
  • TFF tangential-flow filtration
  • Size Exclusion Chromatography is known as a useful method for separating exosomes without damaging exosomes or changing properties.
  • seaweed-derived exosomes were extracted using SEC and TFF.
  • the separation of exosomes by SEC was performed by the method described in Boing et al (Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography, J Extracell Vesicles , 2014:1-11).
  • Sepharose CL-2B Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 12 mL was stacked in a 20 mL syringe (BD PlasticpakcTM, San Jose, CA), washed with PBS, and allowed to equilibrate. 2 mL of sample was loaded onto the column, and fractions were collected using PBS as an elution buffer.
  • Exosomes were extracted from the collected fractions through an ultrafiltration (tangential-flow filtration, TFF) system. Specifically, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed to the surface of the multi-filter having a cut-off value of 100 to 500 kDa in the TFF system, and the solution containing the seaweed-derived exosomes was concentrated. The exosomes extracted in this way were stored frozen at -70°C or less until use in the experiment.
  • TFF tangential-flow filtration
  • the seaweed-derived exosomes extracted in Example 3 were confirmed to have a spherical microstructure of 200 nm or less through a scanning electron microscope (TEM) (Fig. 8), and the exosomes extracted through nanoparticle tracking analysis (NTA) As a result of checking the number of particles per unit volume, it was confirmed to have a concentration of 1 x 10 9 to 11 exosomes per unit volume of 1 mL (FIG. 9).
  • TEM scanning electron microscope
  • NTA nanoparticle tracking analysis

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Abstract

본 발명은 식물 엑소좀의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 대량의 식물 원료를 한꺼번에 처리할 수 있는 원심분리와 TFF을 이용하여, 대량의 원료 식물로부터 고순도의 식물 엑소좀을 추출할 수 있다. 이는 실험실 수준에 머문 종래의 식물 엑소좀 추출 공정을 개선하여, 대량 생산에 용이한 공정을 제시한다.　

Description

식물 엑소좀의 대량 생산 방법
본 출원은 2019년 07월 02일 출원된 대한민국출원 제 10-2019-0079490호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 단단한 과육 혹은 껍질을 갖는 식물을 포함한 원료 식물로부터 엑소좀을 추출하는 방법에 관한 것이다.　더 상세하게는 본 발명은 의약품 및 상용화 제품 등 관련 산업에 유용하게 사용할 수 있도록 원료 식물로부터 고순도 식물 엑소좀을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
엑소좀은 다양한 세포에서 분비되는 나노사이즈의 미세 소포체로서 단백질, 지질, mRNA 및 miRNA를 함유하고 내분비 계에 작용하여 세포 간 커뮤니케이션의 중요한 매개체 역할을 한다고 보고되었다. 이러한 역할은 기존 줄기세포 치료제의 문제점인 생착률 및 면역원성을 극복할 수 있는 새로운 치료제로 주목 받고 있다.
최근 연구에 따르면, 식용 식물에서 분리된 엑소좀은 포유류 세포에서 분비되는 엑소좀에 비해 독성이나 면역원성이 없어, 체내 안정성 및 생체적합성이 매우 높다고 알려져 있다. 또한 포유류 세포에서 분리된 엑소좀은 20% 정도의 콜레스테롤을 함유하고 있지만 식용 식물 엑소좀은 콜레스테롤이 없는 것으로 보고되었다. 특히 동물 조직 혹은 세포 배양액과 비교하여, 원료 식물은 다량으로 얻을 수 있는 장점이 있다.
유래 식물에 따라 엑소좀 내부에 다양한 단백질이 포함되어 있으나, 현재까지 식물 엑소좀에 관한 단백질은 알려진 바가 거의 없고 포유류 세포 엑소좀에 비해 특성을 확정하는데 제한점이 존재한다. 대부분의 연구에서 식물 엑소좀의 특성은 엑소좀의 크기나 형태로 확인하고 있으며, 식물 엑소좀을 추출하기 위해서는 적절한 크기를 선별해서 엑소좀만을 추출하는 방법이 필요하다.
종래 기술의 경우, sucrose gradient를 이용한 밀도 구배 초원심분리 방법을 통해 식물 엑소좀을 추출하려 시도된 바 있으나, 이러한 방식은 엑소좀의 상용화를 위한 생산공정에 활용하기에는 어려움이 있다. 또한, 분리된 세포 외 소포체를 여과하여 여과필터의 기공보다 작은 크기의 물질을 얻는 방식이 있는데, 이는 많은 양의 식물 착즙물로부터 엑소좀을 추출 시에, 필터 기공에 불순물 혹은 엑소좀이 흡착 및 축적되어 여과 효율이 급격히 낮아지며 장기간 엑소좀 추출에 매우 불리하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명에서는 고순도의 식물 엑소좀을 추출하기 위한 방법으로 원심분리법과 TFF를 사용한 대량생산 공정을 제시한다. 본 발명을 통해, 고순도 식물 엑소좀의 정제와 생산성을 효과적으로 향상시켰다.
따라서, 본 발명의 목적은 기존의 추출법을 보완하여 효과적으로 고순도의 식물 엑소좀을 대량 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 원료 식물로부터 고순도의 엑소좀을 입자 크기 및 분포가 균일하게 대량 추출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 종래 기술에서 연한 과육 혹은 착즙물에 국한된 방법과 달리, 단단한 껍질, 줄기, 씨앗 및 미역, 김 등 해양 식물군을 포함하여 원료 식물의 제한 없이 식물 엑소좀을 추출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 유래 엑소좀을 의료용 및 상용화 제품의 GMP 생산에 적합하며, 공정 스케일업(scale-up)이 용이한 추출 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 원심분리를 수행하는 단계; 및 한외여과로서 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계를 포함하는, 식물 엑소좀 추출 방법 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "식물 엑소좀"이란 식물에서 추출된 50 ~ 200 nm 정도의 크기를 갖는 엑소좀 혹은 엑소좀 유사 세포외 소포체를 통칭한다.
식물 유래 엑소좀은 포유류 세포에서 분비되는 엑소좀에 비해 낮은 독성과 면역원성을 가지며, 콜레스테롤의 함량이 매우 적어 체내 안정성 및 생체적합성이 매우 높다고 알려져 있다. 뿐만 아니라 식물에서 유래한 항산화 성분 혹은 단백질 성분에 의해 식물 유래 엑소좀은 상처 치료 및 피부 재생 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
그 동안 생물체로부터 엑소좀을 분리하기 위한 다양한 방법으로서 원심 분리, 초원심분리, 밀도구배원심분리, 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 접선흐름여과, 폴리머 기반 침전, 총 엑소좀 추출 키트 및 면역친화성 분리법 등이 개발되어 왔다. 그러나 이러한 종래 기술의 경우, 엑소좀 추출 방법은 동물, 한정적으로 포유류 유래 세포 혹은 생물학적 용액(우유 등)에서 엑소좀을 추출하는 방법에 한정되어 있다. 동물 유래 세포와 달리 식물 유래 세포에는 엑소좀과 유사한 액포가 발견되기 때문에 이를 제거하기 위한 방법들이 소개되고 있으나, 대부분 실험실 수준의 용량에 국한되어 있다.
본 발명에서는 종래 알려진 엑소좀 분리 방법들 중에서 특히 초원심분리 및 한외여과로서의 접선흐름여과를 조합하는 것에 의하여, 액포 등 불순물에 의한 오염 및 순도 저하를 방지하고, 고순도의 식물 엑소좀을 대량으로 얻을 수 있는 식물 유래 엑소좀의 추출 방법을 제공한다. 종래 알려진 엑소좀 분리 방법들 중 상기 조합이 아닌 다른 임의의 2개 방법의 조합으로는 액포가 제거된 식물 엑소좀을 수득하기 어렵고, 특히 고순도의 식물 엑소좀을 균일하게 대량으로 얻는 것은 불가능하다.
식물 유래 엑소좀은 30 내지 500 nm의 균일한 크기 분포를 가지며, 바람직하게는 50 내지 200 nm의 균일한 크기 분포를 가질 수 있다.
다른 측면에서, 식물 엑소좀의 소량 생산에 국한된 종래의 밀도구배 원심분리 방법을 대체하기 위해 원심분리와 TFF 방법을 이용한 식물 엑소좀의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 사용되는 원심분리법은 고체와 고체를 둘러싼 액체 간의 밀도차를 이용하는 분리 방법으로서 고체가 침전(sedimentation)되는 것을 원심력을 이용하여 가속하는 방법을 의미한다. 원심분리는 공정을 계속적으로 반복할 수 있고, 많은 양을 짧은 시간 안에 처리할 수 있으며, 멸균상태에서 조업이 용이한 장점이 있다. 본 발명의 원심 분리 방법은 편차원심분리(differential centrifugation), 밀도기울기원심분리 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 상기 원심분리 방법은 저속 원심분리(low-speed centrifugation), 고속 원심분리(high-speed centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있는데, 바람직하게는 초원심분리(ultracentrifugation)를 포함하는 것일 수 있다. 저속 원심분리는 6,000 rpm (6,000 xg) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심 분리에 이용되고, 고속 원심분리는 최고속도가 20,000-25,000 rpm (60,000 xg) 정도이며, 초원심분리는 최고속도가 40,000-80,000 rpm (600,000 xg) 정도인 원심분리법을 의미한다.
기존에 초원심분리는 수율이 낮고 분리과정에서 엑소좀에 손상을 주는 것으로 알려져 있어 엑소좀의 대량 추출에는 사용할 수 없었고 실험실 수준의 분리만이 가능한 것으로 알려져 있었다. 그러나, 본원발명자들은 놀랍게도 식물 엑소좀은 동물 엑소좀과는 달리 초원심분리를 통해 엑소좀 손상 없이 생산성을 효과적으로 향상시킬 수 있고, 엑소좀 대량 생산 공정에 적용이 가능함을 밝혀내었다. 일 구현예에서, 본 발명의 원심분리는 (a) 1,000 내지 3,000 ×g 속도의 원심분리 조건에서 10 내지 30 분 동안 원심분리 후 상층액을 얻는 과정, (b) 10,000 내지 50,000 ×g 속도의 초원심분리 조건에서 60분 내지 2시간 동안 초원심분리하여 액포를 제거하는 과정 및 (c) 100,000 내지 150,000 ×g 속도의 초원심분리 조건에서 60분 내지 2시간동안 초원심분리하여 엑소좀이 포함된 펠렛을 얻는 과정을 포함하여 수행되는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 사용되는 접선흐름여과법(tangential-flow filtration, TFF)은 용액이 여과 막의 직각 방향으로 흘러가며, 용액 내에 존재하는 작은 크기의 불순물을 걸러내고 큰 크기의 엑소좀을 분리하는 여과 방식이다. 종래 여과 방식보다 여과필터의 기공에 엑소좀의 흡착 혹은 막 기공의 막힘을 최소화할 수 있으며, 이에 따른 공정 스케일업(process scale-up) 및 GMP 공정 응용에 용이하다.
TFF에서 feed 용액의 빠른 유동은 막 또는 중공사 표면을 '쓸어내면서' 농도 분극(공극 표면의 제품 농도)을 감소시키는 작용을 한다. 또한 TFF법은 공극을 막을 수 있는 오염 물질의 증가를 방지한다. 이 신속한 cross flow는 압력을 떨어뜨리는데 이 때문에 멤브레인 또는 중공사의 공극보다 작은 피드 용액과 용해 분자 중 일부가 필터를 통과하도록 힘을 받을 수 있다. 공극을 통과한 용액을 여과액 또는 투과액이라고 하는데, 공극보다 큰 분자 또는 입자는 피드 용액에 남게 되어 효과적으로 농축된다. 바람직한 구현예에서 본 발명의 TFF는 한외여과 시스템이며, 상기와 같이 TFF 방법을 수행한 결과 원심분리된 추출액이 1/10 내지 1/100의 부피까지 효율적으로 농축될 수 있게 된다. 한외여과란 미세여과(microfiltration) 및 역삼투의 중간 영역에 위치하는 것으로서 막세공과 용질간의 크기 차에 의해 특정 물질을 분리하는 방법이다. 한외여과막은 막에 의해 90% 이상의 배제도를 나타내는 용질의 최소 분자량으로 정의되는 분획분자량(molecular weight cutoff, MWCO)으로서 그 분리 성능을 나타낼 수 있다.
본 발명에 사용되는 상기 접선흐름여과는 한외여과를 수행할 수 있는 중공 섬유(Hollow fiber) TFF 및 막(membrane) TFF로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있으며, 바람직하게는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 100,000 Da 내지 500,000 Da인 TFF 필터를 사용하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 원심분리 및 TFF 단계 이전에 원료 식물을 파쇄하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 이 경우 기계물리적인 분쇄 과정을 통해서, 연한 과육에 국한되었던 원료 식물의 범위를 껍질 등을 포함한 단단한 식물로 범위를 확장시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 방법에 사용되는 원료 식물은 과육, 껍질, 씨앗, 줄기, 잎, 뿌리 및 꽃으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 원료 식물을 파쇄하는 과정은 원료 식물과 버퍼 용액을 무게비로 1:1 내지 1:10 범위로 섞은 혼합물을 기계적 분쇄하는 과정을 포함하는 것일 수 있으며, 버퍼 용액으로는 Phosphate-buffered saline (PBS), tris-buffered saline (TBS), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)-buffered saline (HBS) 생리식염수, 증류수, 배양배지, 주사용수 등을 1종 이상 포함한 것을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 원료 식물을 분쇄하는 과정은 10 내지 1,000 rpm의 속도로 회전하는 칼날에 의해 기계적으로 식물 혼합물을 분쇄하는 것에 의하여 수행될 수 있다.
이러한 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 추출물은 1 mL의 단위부피당 10 7 내지 10 12 개의 입자 수의 농도로 식물 엑소좀을 포함하는 것일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 방법은 식물 엑소좀의 대량생산(large-scale production)에 적합하며, 시간당 원료식물 1 mL 이상, 10 mL 이상, 100 mL 이상, 1 L 이상, 10 L 이상 또는 100 L 이상의 대량 처리가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 방법은 액포가 제거된 고순도의 엑소좀을 균일하게 얻을 수 있는 방법을 제공한다. 특히, 대량의 식물 원료를 한꺼번에 처리할 수 있는 원심분리와 TFF을 이용하여, 대량의 원료 식물로부터 고순도의 식물 엑소좀을 추출할 수 있다. 이는 실험실 수준에 머문 종래의 식물 엑소좀 추출 공정을 개선하여, 대량 생산에 용이한 공정을 제시한다.
도면 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 식물 유래 엑소좀의 추출 방법에 대한 공정 모식도이다.
도면 2는 실시예 1에 따른 알로에 껍질 유래 엑소좀의 형태분석(TEM) 결과이다.
도면 3은 실시예 1에 따른 알로에 껍질 유래 엑소좀의 특성분석(NTA) 결과이다.
도면 4는 UC 과정을 생략하고 TFF만을 수행하는 경우 얻어진 결과물과 UC 및 TFF를 조합한 경우 얻어진 결과물을 비교한 TEM 사진이다.
도면 5는 실시예 1에 따른 알로에 껍질 유래 엑소좀의 특성분석(DLS) 결과이다.
도면 6은 실시예 2에 따른 마늘 유래 엑소좀의 형태분석(TEM) 결과이다.
도면 7은 실시예 2에 따른 마늘 유래 엑소좀의 특성분석(NTA) 결과이다.
도면 8 은 실시예 3에 따른 미역 껍질 유래 엑소좀의 형태분석(TEM) 결과이다.
도면 9는 실시예 3에 따른 미역 껍질 유래 엑소좀의 특성분석(NTA) 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 알로에 껍질 유래 엑소좀
(1) 추출방법
- 실시예 1 ( UC + TFF )
알로에 껍질 유래 엑소좀을 UC와 TFF를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 알로에 껍질을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)를 맞추어 믹서기에 넣은 후 충분히 갈아주었다. 그 후 1,000xg로 10분간 원심분리 후 생긴 상층액을 2000xg로 20분간 원심 분리 후 다시 상층액을 모아주었다. 상층액을 3,000xg로 30분간 원심분리 후 10,000xg로 60분간 원심분리하였다. 10,000xg 후의 상층액을 UC를 이용하여 4℃에서 100,000xg로 70분간 초원심분리하였다.
UC후 남은 pellet을 현탁시켜 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 현탁액에서 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa 의 컷 오프 값을 가지는 다중필터의 표면으로 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고, 알로에 껍질 유래 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다. 이렇게 추출된 엑소좀은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 이하 냉동보관 하였다.
- 비교예 1 (MF + TFF )
알로에 껍질 유래 엑소좀을 미세여과(microfiltration)와 TFF를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 알로에 껍질을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)를 맞추어 믹서기에 넣은 후 충분히 갈아주었다. 그후 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 이를 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다.
상기 여과과정을 거친 후 한외여과로서 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa 의 컷 오프 값을 가지는 다중필터의 표면으로 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고, 알로에 껍질 유래 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다. 이렇게 추출된 엑소좀은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 이하 냉동보관 하였다.
(2) 엑소좀의 특성 평가
알로에 껍질 유래 엑소좀은 다음의 방법을 통하여 엑소좀 특성 평가를 진행하였다. 엑소좀의 모양을 확인하기 위하여, 주사전자현미경(TEM)을 사용하였고, 정확한 미세입자 크기를 확인하기 위해 동적광산란광도계(DLS)를 사용하였다. 추출한 엑소좀의 단위 부피당 입자수는 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 확인하였다.
실험결과, 상기 실시예 1에서 10,000xg 원심분리 후의 상층액을 미세여과(기공 사이즈 0.1~1.0 ㎛)하여 비교적 입자크기가 큰 고형물질을 걸러낸 후에는 엑소좀과 액포가 혼재된 혼합물이 얻어지어, 10,000xg 원심분리 후의 상층액에는 엑소좀과 액포가 혼합되어 있음이 확인되었다. 상기 실시예 1에서 100,000xg 초원심분리까지 수행한 후 수집한 펠렛에는 엑소좀뿐만 아니라 단백질, 핵산과 같은 불순물이 다량으로 혼합되어 있는 것으로 확인되었다. 상기 실시예 1에서 한외여과인 TFF까지 수행하여 엑소좀을 추출한 결과, 1 mL의 단위부피당 1 x 10 9~ 11 개의 고순도의 엑소좀이 추출되었다. 추출된 알로에 껍질 유래 엑소좀은 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것이 확인되었고(도 2), 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 1 mL의 단위부피당 1 x 10 9~ 11 개의 엑소좀 농도가 확인되었다(도 3).
반면에 비교예 1의 방법에 의하여 추출한 알로에 껍질 유래 추출물 중에는 엑소좀과 유사한 액포(vacuole)가 혼입되어 있는 것이 관찰되어, MF 및 TFF 방법에 의해서는 식물 추출물에 함유된 액포 제거가 힘들다는 것이 확인되었다. 즉, 알로에 껍질로부터 엑소좀을 추출하는 과정에서 초고속원심분리(Ultracentrifugation, UC) 과정을 생략하고 TFF만을 수행하는 경우, 엑소좀 이외의 액포를 포함한 불순물(빨간색 화살표)이 포함되어 있음이 명확히 확인되며, 이러한 불순물은 식물 엑소좀의 효능을 떨어트리는 원인이 된다(도 4 참조).
2. 마늘 유래 엑소좀의 추출
(1) 추출방법
- 실시예 2 ( UC + TFF ):
마늘 유래 엑소좀을 UC와 TFF를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 껍질을 제거한 마늘을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)를 맞추어 믹서기에 넣은 후 충분히 갈아주었다. 그 후 1,000xg로 10분간 원심분리 후 생긴 상층액을 2,000xg로 20분간 원심 분리 후 다시 상층액을 모아주었다. 상층액을 3,000xg로 30분간 원심분리 후 10,000xg로 60분간 원심분리하였다. 10,000xg 후의 상층액을 UC를 이용하여 4℃에서 100,000xg로 70분간 초원심분리하였다. UC후 남은 pellet을 현탁시켜 한외여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa 의 컷 오프 값을 가지는 다중필터의 표면으로 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고, 마늘 유래 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다. 이렇게 추출된 엑소좀은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 이하 냉동보관 하였다.
- 비교예 2 ( UC + S- DGUC )
마늘 유래 엑소좀을 UC와 수크로스 밀도 구배 초원심분리(Sucrose-Density Gradient Ultracentrifugation)를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 껍질을 제거한 마늘을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)를 맞추어 믹서기에 넣은 후 충분히 갈아주었다. 그 후 1,000xg로 10분간 원심분리 후 생긴 상층액을 2,000xg로 20분간 원심 분리 후 다시 상층액을 모아주었다. 상층액을 3,000xg로 30분간 원심분리 후 10,000xg로 60분간 원심분리하였다. 10,000xg 후의 상층액을 UC를 이용하여 4℃에서 100,000xg로 70분간 초원심분리하였다.
UC후 남은 pellet을 현탁시켜 수크로스 밀도 구배 초원심분리(Sucrose-Density Gradient Ultracentrifugation)를 추가적으로 수행하였다. 구체적으로, 초원심분리용 원심분리 튜브에 밀도 구배를 가지는 수크로스(sucrose) 용액을 넣었다. 이들 수크로스 용액은 각각 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 용액을 만들어서 124℃에서 15분간 멸균 후 초원심분리용 튜브에 조심스럽게 90%~30%의 층을 가지게 하였다. 이와 같이 준비된 초원심분리용 슈크로스 밀도구배(sucrose gradient) 튜브의 최상단에 상기 엑소좀을 포함하는 현탁액을 조심스럽게 첨가한 후 초원심분리용 원심분리기를 이용하여 4℃, 200,000xg로 4시간 동안 초원심분리하였다. 이후, 튜브 상단에서부터 1 ml씩 fraction을 얻고 밀도를 측정하여 엑소좀에 해당하는 분획을 수득하고 수크로스를 분리하기 위하여 세척하였다.
(2) 엑소좀의 특성 평가
실험결과, 상기 실시예 2에서 추출된 마늘 유래 엑소좀은 주사전자현미경(TEM)을 통해 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것이 확인되었고(도 6), 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 추출한 엑소좀의 단위 부피당 입자수를 확인한 결과 1 mL의 단위부피당 1 x 10 10~ 12 개의 엑소좀 농도가 확인되었다(도 7).
비교예 2의 방법에 의하여 추출한 마늘 유래 엑소좀 또한 주사전자현미경(TEM)을 통해 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것이 관찰되었다. 하지만 고순도 엑소좀을 추출하기 위해서는 수크로스를 분리하기 위한 추가의 세척과정을 거쳐야 했으며 시간당 엑소좀 생산량이 실시예 2 생산량의 100분의 1에도 미치지 못하였다. 따라서 비교예 2의 방법은 엑소좀의 상용화를 위한 대량 생산공정에 활용하기에는 어려움이 있는 것으로 확인되었다.
3. 미역 유래 엑소좀의 추출
(1) 추출방법
- 실시예 3 ( UC + TFF ):
미역 유래 엑소좀을 UC와 TFF를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 물기를 제거한 미역을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)를 맞추어 믹서기에 넣은 후 충분히 갈아주었다. 그 후 1,000xg로 10분간 원심분리 후 생긴 상층액을 2,000xg로 20분간 원심 분리 후 다시 상층액을 모아주었다. 상층액을 3,000xg로 30분간 원심분리 후 10,000xg로 60분간 원심분리하였다. 10,000xg 후의 상층액을 UC를 이용하여 4℃에서 100,000xg로 70분간 초원심분리하였다.
UC후 남은 pellet을 현탁시켜 한외여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 현탁액에서 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa 의 컷 오프 값을 가지는 다중필터의 표면으로 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고, 미역 유래 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다. 이렇게 추출된 엑소좀은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 이하 냉동보관 하였다.
- 비교예 3 (SEC + TFF ):
사이즈 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)는 엑소좀 손상 내지 특성 변화 없이 엑소좀을 분리할 수 있는 유용한 방법으로 알려져 있다. 이에 미역 유래 엑소좀을 SEC와 TFF를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, SEC에 의한 엑소좀의 분리는 Boing et al (Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography, J Extracell Vesicles, 2014:1-11)에 기재된 방법에 의해 수행되었다. 20 mL 시린지(BD PlasticpakcTM, San Jose, CA)에 Sepharose CL-2B (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 12 mL를 쌓고 PBS로 세척 및 평형을 이루게 하였다. 2 mL의 시료를 컬럼에 로딩하고, 용출 완충액으로서 PBS를 사용하여 분획을 수집하였다.
수집한 분획을 한외여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 이로부터 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa 의 컷 오프 값을 가지는 다중필터의 표면으로 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고, 미역 유래 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다. 이렇게 추출된 엑소좀은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 이하 냉동보관 하였다.
(2) 엑소좀의 특성 평가
상기 실시예 3에서 추출된 미역 유래 엑소좀은 주사전자현미경(TEM)을 통해 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것으로 확인되었으며(도 8), 나노입자추적분석(NTA)을 통해 추출한 엑소좀의 단위 부피당 입자수를 확인한 결과 1 mL의 단위부피당 1 x 10 9~ 11 개의 엑소좀 농도를 갖는 것으로 확인되었다(도 9).
반면에 비교예 3의 방법에 의하여 추출한 미역 유래 추출물 중에는 엑소좀과 유사한 액포(vacuole)가 혼입되어 있는 것이 관찰되어, SEC 및 TFF 방법에 의해서는 식물 추출물에 함유된 액포 제거가 힘들다는 것이 확인되었다.

Claims (10)

  1. 원심분리를 수행하는 단계; 및
    접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계
    를 포함하는, 식물 엑소좀 추출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 원심분리는 초원심분리(ultracentrifugation)를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  3. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 접선흐름여과는 중공 섬유(Hollow fiber) TFF 및 막(membrane) TFF로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  4. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 접선흐름여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 100,000 Da 내지 500,000 Da인 TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 상기 원심분리 단계 이전에 원료 식물을 파쇄하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  6. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 원료 식물은 과육, 껍질, 씨앗, 줄기, 잎, 뿌리 및 꽃으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 식물 엑소좀은 50 내지 200 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  8. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법에 의하여 추출물 1 mL의 단위부피당 10 7 내지 10 12 개의 입자 수의 농도로 식물 엑소좀을 포함하는 고순도 및 고수율의 식물 엑소좀 추출물이 얻어지는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  9. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법에 의하여 액포가 제거된 고순도 식물 엑소좀 추출물이 얻어지는 것을 특징으로 하는 식물 엑소좀 추출 방법.
  10. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 식물 엑소좀의 대량생산(large-scale production)을 위한 것인 식물 엑소좀 추출 방법.
PCT/KR2020/004906 2019-07-02 2020-04-10 식물 엑소좀의 대량 생산 방법 Ceased WO2021002571A1 (ko)

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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306409A (zh) * 2021-08-27 2022-04-12 徐州医科大学 玛咖外泌体的提取方法及由其提取的玛咖外泌体和应用
EP4190155A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-07 Hansabiomed Life Sciences Oü Process to obtain extracellular-like nanoparticles from plants and uses thereof
JP2023107326A (ja) * 2022-01-24 2023-08-03 一丸ファルコス株式会社 スプラウト由来の細胞外膜小胞
WO2023242605A1 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Támogatott Kutatócsoportok Irodája Extracellular vesicles for use in therapy
EP4309664A4 (de) * 2021-02-04 2025-03-12 Gordeychuk, Vladimir Evgenevich Verfahren zur isolierung von mikrovesikeln aus pflanzen der amaranthaceae-familie

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116209426B (zh) * 2020-08-07 2025-09-09 胞外体干细胞株式会社 包含青花菜外排体作为活性成分的抗老化和抗氧化化妆品组合物和包含其的功能性化妆品
KR102430604B1 (ko) * 2020-09-08 2022-08-09 주식회사 바이오솔루션 유산균 유래 세포 외 소포체를 포함하는 항노화용 조성물
KR102253418B1 (ko) 2020-10-08 2021-05-18 (주)지에프씨생명과학 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법
KR102324068B1 (ko) 2020-11-12 2021-11-10 (주)지에프씨생명과학 자가 포식으로 유도된 인체 지방 유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법
CN112451488A (zh) * 2020-12-15 2021-03-09 南京中医药大学 一种植物来源类外泌体制品的制备方法和应用
KR102265811B1 (ko) 2021-04-09 2021-06-16 주식회사 에이바이오머티리얼즈 분산성 및 안정성이 우수한 병풀 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물
KR102329247B1 (ko) 2021-07-02 2021-11-22 주식회사 에이바이오머티리얼즈 분산성 및 안정성이 우수한 쇠비름 유래 엑소좀의 정제방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물
KR102348510B1 (ko) 2021-08-27 2022-01-07 주식회사 에이바이오머티리얼즈 붓꽃 구근 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102683369B1 (ko) * 2021-11-02 2024-07-10 주식회사 케이제이엠바이오 알로에 껍질 캘러스 유래 나노 엑소좀의 제조방법 및 이에 따라 제조된 알로에 껍질 캘러스 유래 나노 엑소좀을 포함하는 피부개선용 조성물
KR102391645B1 (ko) 2021-11-11 2022-04-28 주식회사 에이바이오머티리얼즈 무화과 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물
KR102391636B1 (ko) 2021-12-02 2022-04-28 주식회사 에이바이오머티리얼즈 황금, 약모밀 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 및 모발 상태개선용 화장료 조성물
KR102413200B1 (ko) 2021-12-06 2022-06-24 주식회사 에이바이오머티리얼즈 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102432749B1 (ko) 2021-12-17 2022-08-16 주식회사 에이바이오머티리얼즈 고사리 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102433271B1 (ko) 2021-12-20 2022-08-18 주식회사 에이바이오머티리얼즈 티트리, 하수오 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102450862B1 (ko) 2022-01-04 2022-10-06 주식회사 에이바이오머티리얼즈 천궁, 작약 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102674407B1 (ko) 2022-02-25 2024-06-12 ㈜클리니크후즈후 혈소판 및 혈액유래 줄기세포를 포함한 혈액유래 엑소좀 제조방법과 이를 통해 제조된 엑소좀
KR102450893B1 (ko) * 2022-03-16 2022-10-06 (주)지에프씨생명과학 수국 잎 유래 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법
KR102413205B1 (ko) 2022-04-11 2022-06-24 주식회사 에이바이오머티리얼즈 자소엽, 유칼립투스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 보습, 피부진정, 항염, 세포재생 및 주름개선용 화장료 조성물
KR20230161719A (ko) 2022-05-19 2023-11-28 전남대학교산학협력단 고순도의 식물 유래 엑소좀 추출 방법
KR102527607B1 (ko) * 2022-06-30 2023-05-03 (주)모아캠 식물 유래 세포외소포체, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법
KR102727248B1 (ko) * 2022-06-30 2024-11-08 주식회사 코스메카코리아 발효된 에델바이스 캘러스 배양 추출물 및 석류 유래 엑소좀 혼합물을 함유한 화장료 조성물
KR102940987B1 (ko) 2022-07-12 2026-03-18 주식회사 제이투케이바이오 엑소좀의 대량 분리 방법
KR20240023949A (ko) 2022-08-16 2024-02-23 주식회사에이치엔비랩스 초고압 나노균질기를 이용하여 수율이 향상된 엑소좀의 제조방법
KR102502664B1 (ko) 2022-09-23 2023-02-23 주식회사 에이바이오머티리얼즈 토마토, 브로콜리 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 및 모발 상태개선용 화장료 조성물
KR102523528B1 (ko) 2022-10-04 2023-04-19 주식회사 에이바이오머티리얼즈 자몽, 동백꽃 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR102861005B1 (ko) * 2022-10-21 2025-09-18 주식회사 엑티브온 식물 유래 엑소좀의 추출 방법, 이에 따라 분리된 엑소좀, 및 이의 화장학적 용도
KR102528139B1 (ko) 2022-11-03 2023-05-03 주식회사 에이바이오머티리얼즈 녹차, 귀리 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
KR20240065617A (ko) 2022-11-04 2024-05-14 주식회사 엑티브온 식물 유래 엑소좀 분리 방법, 이에 따라 분리된 엑소좀, 및 이의 화장학적 용도
KR102523523B1 (ko) 2022-11-14 2023-04-19 주식회사 에이바이오머티리얼즈 개박하, 시금치 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 및 모발 상태개선용 화장료 조성물
CN118207149A (zh) * 2022-12-16 2024-06-18 浙江养生堂天然药物研究所有限公司 来源于桦树原料的外泌体及其制备方法
CN116672458B (zh) * 2023-01-18 2026-05-01 中国农业科学院油料作物研究所 一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其制备方法和在活性成分递送中的应用
JP2024122807A (ja) * 2023-02-28 2024-09-09 国立大学法人 東京大学 医薬組成物および医薬品、食品組成物および食品、並びに化粧品組成物および化粧品
KR102873007B1 (ko) 2023-03-28 2025-10-17 주식회사 필코코스팜 해조류 엑소좀을 함유하는 발모 및 탈모 예방용 조성물
CN120919220A (zh) * 2023-05-31 2025-11-11 苏州大学 大蒜来源纳米颗粒在制备改善肠道免疫紊乱产品中的应用
KR102692188B1 (ko) * 2023-06-02 2024-08-06 주식회사 더클라세움 대마 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 세포 재생, 항염 및 미백용 화장료 조성물
CN116814390A (zh) * 2023-06-21 2023-09-29 珈泌生物科技(武汉)有限责任公司 一种大规模细胞外囊泡的分离系统及分离方法
KR102671639B1 (ko) 2023-11-14 2024-06-03 주식회사 에이바이오머티리얼즈 울릉국화, 은행잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
TWI862300B (zh) * 2023-11-23 2024-11-11 郭晶耀 具分散穩定性之荷葉外泌體及其緩解發炎反應及傷口癒合之用途
KR20260000140A (ko) 2024-06-25 2026-01-02 주식회사 에이바이오머티리얼즈 붓꽃 구근 유래 엑소좀, 아스파라거스 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발용 화장료 조성물
KR102769766B1 (ko) 2024-06-28 2025-02-19 인코스(주) 멸균 공정을 포함하는 발효 세포외소포체의 제조방법
WO2026009961A1 (ja) * 2024-07-04 2026-01-08 イビデン株式会社 組成物、組成物の製造方法、原料体、海藻由来の細胞外小胞（ＥＶｓ）の使用、安定性向上剤、安定性向上方法、環状アデノシン一リン酸の増加剤、環状アデノシン一リン酸の増加剤の製造方法、浸透性組成物及び浸透促進剤

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120093957A (ko) * 2009-10-15 2012-08-23 크루셀 홀란드 비.브이. 고밀도 세포 배양액에서 아데노바이러스의 정제 방법
KR20170037380A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 (주)프로스테믹스 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
KR101895916B1 (ko) * 2017-08-11 2018-09-07 주식회사 엑소코바이오 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법
KR20190050286A (ko) * 2017-11-02 2019-05-10 주식회사 엑소코바이오 안정화된 엑소좀의 필러 조성물
KR20190052644A (ko) * 2017-11-08 2019-05-16 학교법인 한문화학원 황칠나무 유래의 세포 외 베지클을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물
KR20190079490A (ko) 2017-12-27 2019-07-05 도요타 지도샤（주） 차량

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9280206B2 (en) * 2012-08-20 2016-03-08 Samsung Electronics Co., Ltd. System and method for perceiving images with multimodal feedback
WO2016033695A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Exerkine Corporation Exosome isolation
WO2019035057A2 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Cellex Life Sciences, Incorporated EXOSOMES FOR TARGET-SPECIFIC DELIVERY AND METHODS OF PREPARATION AND ADMINISTRATION THEREOF
KR20170003780A (ko) * 2015-06-30 2017-01-10 이수천 자동차의 흡배기관 및 연소실 클리닝용 집진장치
KR102598793B1 (ko) 2015-09-23 2023-11-07 (주)아모레퍼시픽 인삼 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 미백용 조성물
KR102475127B1 (ko) * 2015-09-30 2022-12-07 (주)아모레퍼시픽 인삼 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물
GB201609216D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Evox Therapeutics And Isis Innovation Ltd Exosomes comprising therapeutic polypeptides
CN106083863A (zh) 2016-06-03 2016-11-09 庄爱华 一种新的吲哚生物碱类化合物及其制备方法和医药用途
EP3494977A4 (en) 2016-08-05 2020-03-18 Exostemtech Co., Ltd. COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF LUNG FIBROSE WITH FAT TISSUE EXOSOM OBTAINED FROM STEM CELLS AS AN ACTIVE SUBSTANCE
CA3002520A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Ilias Biologics Inc. Compositions containing protein loaded exosome and methods for preparing and delivering the same
KR20190003316A (ko) 2017-06-30 2019-01-09 주식회사 엑소코바이오 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도
WO2019004738A2 (ko) 2017-06-30 2019-01-03 주식회사 엑소코바이오 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도
US20220023347A9 (en) 2017-08-15 2022-01-27 Children's Medical Center Corporation Purified mesenchymal stem cell exosomes and uses thereof
JP7525396B2 (ja) 2017-09-22 2024-07-30 ユニバーシティ オブ マイアミ 表皮水疱症を処置するための方法及び組成物
SG11202101777VA (en) 2018-08-24 2021-03-30 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Methods and compositions for the modification of plants

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120093957A (ko) * 2009-10-15 2012-08-23 크루셀 홀란드 비.브이. 고밀도 세포 배양액에서 아데노바이러스의 정제 방법
KR20170037380A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 (주)프로스테믹스 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
KR101895916B1 (ko) * 2017-08-11 2018-09-07 주식회사 엑소코바이오 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법
KR20190050286A (ko) * 2017-11-02 2019-05-10 주식회사 엑소코바이오 안정화된 엑소좀의 필러 조성물
KR20190052644A (ko) * 2017-11-08 2019-05-16 학교법인 한문화학원 황칠나무 유래의 세포 외 베지클을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물
KR20190079490A (ko) 2017-12-27 2019-07-05 도요타 지도샤（주） 차량

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3995568A4

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4309664A4 (de) * 2021-02-04 2025-03-12 Gordeychuk, Vladimir Evgenevich Verfahren zur isolierung von mikrovesikeln aus pflanzen der amaranthaceae-familie
US12514891B2 (en) 2021-02-04 2026-01-06 Vladimir Gordeychuk Method for isolating microvesicules from plants of the Amaranthaceae family
CN114306409A (zh) * 2021-08-27 2022-04-12 徐州医科大学 玛咖外泌体的提取方法及由其提取的玛咖外泌体和应用
EP4190155A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-07 Hansabiomed Life Sciences Oü Process to obtain extracellular-like nanoparticles from plants and uses thereof
WO2023099735A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Hansabiomed Life Sciences Oü Process to obtain extracellular-like nanoparticles from plants and uses thereof
JP2023107326A (ja) * 2022-01-24 2023-08-03 一丸ファルコス株式会社 スプラウト由来の細胞外膜小胞
WO2023242605A1 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Támogatott Kutatócsoportok Irodája Extracellular vesicles for use in therapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP3995568A4 (en) 2023-07-19
US12116590B2 (en) 2024-10-15
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KR102125567B1 (ko) 2020-06-22
CN114040965B (zh) 2025-01-14
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EP3995568A1 (en) 2022-05-11
JP7274712B2 (ja) 2023-05-17

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