WO2021006202A1 - 改変ノイラミニダーゼ - Google Patents

改変ノイラミニダーゼ Download PDF

Info

Publication number
WO2021006202A1
WO2021006202A1 PCT/JP2020/026174 JP2020026174W WO2021006202A1 WO 2021006202 A1 WO2021006202 A1 WO 2021006202A1 JP 2020026174 W JP2020026174 W JP 2020026174W WO 2021006202 A1 WO2021006202 A1 WO 2021006202A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
neuraminidase
modified
neu1
cells
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2020/026174
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
伊藤　孝司
準 月本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokushima NUC
Original Assignee
University of Tokushima NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokushima NUC filed Critical University of Tokushima NUC
Priority to US17/623,302 priority Critical patent/US12577570B2/en
Priority to JP2021530672A priority patent/JP7537762B2/ja
Priority to EP20836020.6A priority patent/EP4000637A4/en
Priority to CA3145622A priority patent/CA3145622A1/en
Priority to CN202080062553.3A priority patent/CN114555800A/zh
Publication of WO2021006202A1 publication Critical patent/WO2021006202A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/16—Serine-type carboxypeptidases (3.4.16)
    • C12Y304/16005—Carboxypeptidase C (3.4.16.5), i.e. carboxypeptidase Y
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Definitions

  • the present invention relates to a modified neuraminidase, a gene encoding a modified neuraminidase.
  • the present invention also relates to a combination of modified neuraminidase and cathepsin A, a combination of a gene encoding modified neuraminidase and a gene encoding cathepsin A.
  • the present invention also relates to vectors containing these genes.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing these.
  • Neuraminidase also called N-acetyl- ⁇ -neuraminidase, lysosomal sialidase
  • NEU1 neuraminidase 1
  • Patent Document 1 discloses that NEU1 deficiency is also associated with amyloidosis
  • Non-Patent Document 1 discloses that NEU1 is also associated with cancer metastasis / infiltration.
  • Lysosomal storage disease also called lysosomal storage disease or lysosomal storage disease
  • lysosomal storage disease encodes an acidic hydrolyzing enzyme (lysosomal enzyme) or cofactor contained in lysosomes, which are organelles that decompose and metabolize biomolecules inside and outside the cell.
  • lysosomal enzyme lysosomal enzyme
  • cofactor contained in lysosomes which are organelles that decompose and metabolize biomolecules inside and outside the cell.
  • a group of inborn errors of metabolism based on mutations in the gene. It used to be an incurable disease, but since 1990, recombinant enzyme preparations secreted and purified from normal human lysosomal enzyme gene-introduced strains into cultured animal or plant cells have been regularly administered intravenously (1-2) to patients.
  • Enzyme replacement therapy which is continuously administered at weekly intervals
  • ERT Enzyme replacement therapy
  • Non-Patent Document 2 Enzyme replacement therapy has a problem that applicable diseases are limited. Therefore, further treatment methods for lysosomal storage diseases are required.
  • the present inventor examined gene therapy using human neuraminidase 1 and found that overexpression of human neuraminidase 1 resulted in intracellular crystals and cell rupture. Therefore, it has been found that the application of human neuraminidase 1 to gene therapy causes damage to cells and is dangerous.
  • One of the objects of the present invention is to provide a modified neuraminidase that does not crystallize intracellularly and can be used for gene therapy.
  • one of a further object of the present invention is to provide a means for co-localizing neuraminidase 1 to lysosomes.
  • neuraminidase 1 does not crystallize even if it is overexpressed in the cell.
  • neuraminidase 1 co-localizes with lysosomes by overexpressing cathepsin A (CTSA).
  • CTSA cathepsin A
  • the present invention (1) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Includes (i) W173N and K175S mutations, or (ii) K358N mutations.
  • a modified neuraminidase comprising a sequence having 80% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the vector of (4) which is an AAV vector
  • a pharmaceutical composition comprising the modified neuraminidase of (1) or (2) or the vector of any of (4)-(6).
  • the pharmaceutical composition of (7) for the treatment of diseases associated with deletion or attenuation of neuraminidase 1 activity, Regarding.
  • neuraminidase 1 that does not crystallize even when overexpressed or has very little crystallization.
  • neuraminidase 1 can be co-localized with lysosomes when used in combination with cathepsin A.
  • NEU1, B: lysosome, C: A and B are superimposed.
  • the nucleus was stained with Hoechst 33258, NEU1 was stained with anti-NEU1, and lysosome was stained with Lysotracker.
  • A: NEU1, B: lysosome, C: A and B are superimposed.
  • the nucleus was stained with Hoechst 33258, NEU1 was stained with anti-NEU1, and lysosome was stained with Lysotracker.
  • CTSA + NEU1 modified co-expression plasmid It is a figure which shows an example of CTSA + NEU1 modified co-expression plasmid. It is a figure which shows the plasmid expressing EGFP used as a negative control. It is a figure which shows the neuraminidase activity when each plasmid is introduced into NEU1 knockout HEK293 cells. It is a figure which shows the carboxypeptidase activity when each plasmid is introduced into NEU1 knockout HEK293 cells. It is a figure which shows the neuraminidase activity when each plasmid is introduced into CTSA knockout HEK293 cells.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the carboxypeptidase activity when the EGFP expression vector (negative control) and CTSA + NEU1 modified co-expression AAV vector are administered to various HEK293 cells.
  • the figure shows the neuraminidase activity of healthy skin fibroblasts and the neuraminidase activity when an EGFP expression vector (negative control) or a CTSA + NEU1 modified co-expressing AAV vector is administered to skin fibroblasts derived from galactosialidosis patients. is there.
  • the present invention provides, in certain embodiments, a modified neuraminidase.
  • the present invention in a further aspect, provides a nucleic acid encoding a modified neuraminidase.
  • the modified neuraminidase of this embodiment includes a sequence in which W and 175 K of amino acid position 173 of wild-type neuraminidase 1 shown in SEQ ID NO: 1 are mutated, or a sequence in which K of amino acid position 358 is mutated. More specifically, it includes W173N and K175S mutations, or K358N mutations. In certain embodiments, the modified neuraminidase of this embodiment has the above mutation and is about 75% or more, eg, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the modified neuraminidase of this embodiment has the above mutations and further comprises one or more, eg, 1 to about 40, 1 to about 30 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the modified neuraminidase of this embodiment comprises or consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • nucleic acid encoding the modified neuraminidase of this embodiment examples include the nucleic acid encoding the above-mentioned modified neuraminidase.
  • the nucleic acid encoding wild-type neuraminidase 1 set forth in SEQ ID NO: 4 has a mutation at positions 517 to 319 and a mutation at two or more of positions 523 to 525, or at position 1074.
  • Nucleic acids containing mutations can be mentioned. More specifically, nucleic acids containing mutations where positions 517-519 are AAT or AAC, positions 523-525 are TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC, or positions 1074 are T or C. Be done.
  • the nucleic acid encoding the modified neuraminidase of this embodiment has the above mutation and is about 75% or more, eg, about 80% or more, about 85% or more, about 90 with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. % Or more, about 91% or more, about 92% or more, about 93% or more, about 94% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 98% or more, about 99% or more sequence identical Containing or consisting of a sequence having sex.
  • the nucleic acid encoding the modified neuraminidase of this embodiment has the above mutation and further has one or more, for example, 1 to about 40, 1 to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. Approximately 30 pieces, 1 piece to about 20 pieces, 1 piece to about 10 pieces, 1 piece to about 5 pieces, for example, 1 piece, 2 pieces, 3 pieces, 4 pieces or 5 pieces, or 1 piece to 4 pieces, for example 1 Containing or consisting of a nucleic acid sequence in which 1, 2, 3, or 4 amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added.
  • the nucleic acid encoding the modified neuraminidase of this embodiment comprises or comprises the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • the identity of the base sequence or amino acid sequence can be determined by using a homology search site using the Internet (for example, on the website of European Bioinformatics Institute (EBI), FASTA, BLAST, PSI-BLAST, and Homology searches such as SSEARCH are available: http: //www.ebi.ac.uk/Tools/sss/).
  • a search using BLAST can be performed in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (for example, the BLAST page on the NCBI website; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi; Altschul, SF et al., J. Mol.
  • nucleic acid is a molecule in which nucleotides are polymerized, and includes oligonucleotides, polynucleotides, and the like. It also contains single-stranded or double-stranded DNA and the like. Furthermore, it also includes those formed only of natural nucleotides, those containing a part of unnatural bases, nucleotides and nucleosides, or synthetic nucleic acids. Typically, the nucleic acid is DNA.
  • the modified neuraminidase of this embodiment may be a protein to which various modifications such as physiological modification such as sugar chain, labeling such as fluorescence or radioactive substance, or fusion with other proteins have been added.
  • various modifications such as physiological modification such as sugar chain, labeling such as fluorescence or radioactive substance, or fusion with other proteins have been added.
  • the method for producing the modified neuraminidase of this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include recombinant expression (mammalian cells, yeast, Escherichia coli, insect cells, etc.), synthesis using a cell-free system, and the like.
  • the cells used for these are not particularly limited, and examples thereof include HEK293 cells.
  • the obtained modified neuraminidase can be isolated intracellularly or extracellularly (medium, etc.) and purified as a substantially pure and uniform protein.
  • the separation and purification of the protein may be performed by using the separation and purification method used in the usual purification of the protein, and is not limited in any way. For example, a chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected. Proteins can be separated and purified by / or combination.
  • the present invention provides, in other embodiments, a vector containing a nucleic acid encoding a modified neuraminidase.
  • the vector include, but are not limited to, a plasmid vector, a retrovirus vector, a lentiviral vector, an adenovirus vector, an adenoassociate virus vector, a Sendai virus vector, a Sendai virus envelope vector, a papillomavirus vector, and the like. Absent.
  • Preferred examples include retroviral vectors, lentiviral vectors, and adeno-associated virus (AAV) vectors.
  • the vector is an AAV vector.
  • AAV includes AAV1, AAV2, AAV3 (including 3A and 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, tri-AAV, bovine. Includes, but is not limited to, AAV, dog AAV, horse AAV and sheep AAV, as well as any other AAV that is unknown or later discovered.
  • the AAV vector is type AAV2.
  • the vector may contain a promoter DNA sequence that effectively induces gene expression, a factor that controls gene expression, and a molecule necessary for maintaining the stability of DNA.
  • the vector of this embodiment further comprises a nucleic acid encoding cathepsin A. Specifically, about 75% or more, for example, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 91% or more, about 92% or more, about 93% or more with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13. , About 94% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 98% or more, about 99% or more, a nucleic acid, a sequence encoding a sequence comprising or consisting of a sequence having sequence identity. Number: 1 or more in the amino acid sequence represented by 13, for example, 1 to about 40, 1 to about 30, 1 to about 20, 1 to about 10, 1 to about 5.
  • nucleotide containing or encoding an amino acid sequence nucleic acid containing or encoding an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, about 75% or more of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. For example, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 91% or more, about 92% or more, about 93% or more, about 94% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more.
  • nucleic acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 for example, 1 to about 40, 1 to about 30, 1 Approximately 20 pcs, 1 pcs to approximately 10 pcs, 1 pcs to approximately 5 pcs, for example 1, 2, 3, 4 pcs or 5 pcs, or 1 to 4 pcs, for example 1 pcs, 2 pcs.
  • examples thereof include a nucleic acid containing or consisting of a sequence in which 3 or 4 nucleic acids are substituted, inserted, deleted and / or added, and a nucleic acid containing or consisting of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the present invention provides, in a further embodiment, cells that secrete modified neuraminidase.
  • cells that secrete modified neuraminidase also secrete cathepsin A.
  • the cell secreting the modified neuraminidase of this embodiment is, for example, a cell having the above nucleic acid sequence.
  • the cell secreting the modified neuraminidase of this embodiment can be prepared, for example, by introducing the above vector.
  • the present invention also, in a further embodiment, the above-mentioned modified neuraminidase, a combination of modified neuraminidase and catepsin A, a nucleic acid encoding a modified neuraminidase, a combination of a nucleic acid encoding a modified neuraminidase and a nucleic acid encoding catepsin A, a nucleic acid encoding a modified neuraminidase.
  • a pharmaceutical composition comprising a vector containing, or a cell secreting a modified neuraminidase.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be formulated according to a conventional method (see, for example, Remington's Pharmaceutical Science, late edition, Mark Publishing Company, Easton, USA) and is a pharmaceutically acceptable carrier. And additives may be included together. For example, surfactants, excipients, colorants, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents.
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • Examples of the method for administering the pharmaceutical composition of this embodiment include oral administration and parenteral administration, and specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • Examples of injection administration include systemic or local (eg, subcutaneous, intradermal, skin surface, eyeball or eyelid) of the pharmaceutical composition of this embodiment by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like. It can be administered to the conjunctival, nasal mucosa, oral and gastrointestinal mucosa, vaginal / intrauterine mucosa, intraperitoneal, intrathecal (eg, intratubal or lumbar intramedullary), or ventricular.
  • intrathecal eg, intratubal or lumbar intramedullary
  • the administration method can be appropriately selected depending on the patient's age, symptoms, etc.
  • the dose can be selected in the range of about 0.000000001 mg to about 1000 mg per kg of body weight per administration.
  • the dose can be selected in the range of about 0.00001 to about 100,000 mg / body per patient.
  • a gene therapy vector in which a cell secreting modified neuraminidase or a DNA encoding modified neuraminidase is inserted is administered, it can be administered so that the amount of modified neuraminidase is within the above range in the target tissue. ..
  • the composition is not limited to these doses.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be used for the treatment of diseases caused by deletion or attenuation of neuraminidase 1 activity.
  • diseases include lysosomal storage diseases, amyloidosis, cancer and the like.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be used for the treatment of galactosialidosis or sialidosis.
  • the term "patient” or “subject” includes humans or non-human animals, including, for example, humans, mice, rats, monkeys, pigs, dogs, rabbits, hamsters, guinea pigs and the like. However, it is not limited to these.
  • treatment refers to, for example, any of alleviation, amelioration, and / or elimination, alleviation and / or stabilization of symptoms (eg, not progressing to more advanced stages). ..
  • Necessary targets include the above-mentioned modified neuraminidase, a combination of modified neuraminidase and catepsin A, a nucleic acid encoding modified neuraminidase, a combination of a nucleic acid encoding modified neuraminidase and a nucleic acid encoding catepsin A, and a nucleic acid encoding modified neuraminidase.
  • Necessary targets include the above-mentioned modified neuraminidase, a combination of modified neuraminidase and catepsin A, a nucleic acid encoding modified neuraminidase, a combination of a nucleic acid encoding modified neuraminidase and a nucleic acid encoding catepsin A, and a nucleic acid encoding modified neuraminidase.
  • a method for treating lysosome storage disease, amyloidosis or cancer, preferably lysosome storage disease, more preferably galactosialidosis or sialidosis which comprises administering a vector containing a vector containing, or a composition containing cells secreting a modified neuraminidase; (3) The above-mentioned modified neuraminidase, combination of modified neuraminidase and catepsin A, nucleic acid encoding modified neuraminidase for the treatment of lysosome storage disease, amyloidosis or cancer, preferably lysosome storage disease, more preferably galactosialidosis or sialidosis.
  • nucleic acid encoding a modified neuraminidase a combination of a nucleic acid encoding a modified neuraminidase and a nucleic acid encoding catepsin A, a vector containing a nucleic acid encoding a modified neuraminidase, or a cell secreting a modified neuraminidase.
  • modified neuraminidase nucleic acid encoding modified neuraminidase
  • vector containing nucleic acid encoding modified neuraminidase cells secreting modified neuraminidase, their morphology, formulation, method of administration, and dosage in these embodiments.
  • the embodiment is as described above.
  • either simultaneous administration or sequential administration may be performed, or both may be used as one preparation.
  • the cell disruption solution is centrifuged at 12000 ⁇ g at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant is collected to obtain a cell extract.
  • the protein is quantified by Bio-Rad DC Protein assay reagent.
  • ⁇ Immune fluorescent staining> 1.8 Passage to well chamber slides F-10 Ham (Sigma Aldrich) with fetal bovine serum (Biosera) and PBS are warmed to a final concentration of 10%. Transfection is performed for 24 hours, and the medium of CHO 24 hours after the medium exchange is aspirated with an ejector and washed with 1 mL of 1 ⁇ PBS. Add 1 mL of 0.05% trypsin-1 mM EDTA / PBS and incubate at 37 ° C. for 2 minutes. Add 1 mL of F-10 Ham, exfoliate cells and collect the entire volume in a 15 mL tube.
  • Lysottracker Red DND-99 (Thermo) is diluted with F-10 Ham to a final concentration of 1 ⁇ M, replaced with a medium containing Lysottracker, and cultured for 1 hour. After removing the medium, wash once with 500 ⁇ M / well of PBS, add 200 ⁇ L of 4% PFA / PBS, and fix at room temperature for 30 minutes. Wash 3 times at 500 ⁇ L / well. Add 200 ⁇ L / well of 5% goat serum (Cedarlane) and 1% BSA (Sigma Aldrich) / PBS and block at room temperature for 1 hour.
  • ⁇ SDS-PAGE> 1 Preparation of separation gel 30% acrylamide: 3.125 mL, 4 ⁇ lower layer buffer (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8): 1.875 mL, MilliQ water: 2.425 mL, 10% SDS: 75 ⁇ L, 10% APS : 25 ⁇ L and TEMED: 5 ⁇ L are mixed and poured into a gel plate, water-saturated butanol is laminated on the gel plate, and the mixture is solidified at room temperature to prepare a separation gel (12.5%).
  • Sample preparation 6 Sample buffer (0.3M Tris-HCl, pH 6.8, 36% glycerol, 24% SDS, 1.2% 2-mercaptoethanol, 0.012% bromophenol blue) was added to 20 ⁇ L of cells. Add 4 ⁇ L to 40 ⁇ g of the crushed solution and boil for 3 minutes. Add 4 ⁇ L of 6 ⁇ sample buffer to 5 ⁇ L of biotinylated marker or prestained marker, and scalpel up to 24 ⁇ L with Milli-Q water. Soak the sample in a hot water bath at 100 ° C for 3 minutes.
  • Sample buffer 0.3M Tris-HCl, pH 6.8, 36% glycerol, 24% SDS, 1.2% 2-mercaptoethanol, 0.012% bromophenol blue
  • the electrophoresis tank is filled with the electrophoresis buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS), the gel plate is set, and the electrophoresis buffer is also put on the cathode side. Remove the comb, trim the wells and apply the entire sample. Perform SDS-PAGE with a constant current of 20 mA.
  • the electrophoresis buffer 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS
  • ⁇ Western blotting> The gel for concentration is cut out from the gel after electrophoresis and immersed in a blotting buffer (48 mM Tris, 39 mM glycine, 20% methanol) for about 15 minutes. Immerse the PVDF membrane in methanol and then in blotting buffer for 15 minutes. Soak filter paper (6 sheets) in blotting buffer for 15 minutes. Moisten the trans blotter with a transfer buffer, set the filter paper (3 sheets), PVDF film, gel, and filter paper (3 sheets) in this order, and start the transfer. Perform at 15V for about 1 hour. The transferred PVDF membrane is taken out, 50% Blocking ONE / TBS is added, and blocking is performed for 1 hour. Apply the primary antibody solution and react at 4 ° C.
  • Example 1 Preparation of modified neuraminidase and confirmation of activity 1.
  • Amplification of the gene encoding wild-type human neuraminidase 1 The gene encoding human neuraminidase 1 (SEQ ID NO: 4) is the following primer Forward primer: TTTTTCTAGACACCATGACTGGGGAGCGAC (SEQ ID NO: 7).
  • the PCR reaction solution was: forward primer: 1 ⁇ L (50 pmol), reverse primer: 1 ⁇ L (50 pmol), template plasmid (pcDNA3.1 Hygro (-) NEU1): 1 ⁇ L (10 ng), 10 ⁇ KOD buffer: 5 ⁇ L, 25 mM sulfonyl 4 : 2 ⁇ L, 2 mM dNTPs: 5 ⁇ L, KOD plus (Toyobo): 1 ⁇ L were prepared by priming up to 50 ⁇ L with Milli-Q water.
  • DNA sample buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 33% glycerol, 0.3% bromophenol blue). The whole amount was run on a 1% agarose gel. The main band was excised with a Gel Execution kit (Qiagen), and the DNA was purified. The obtained DNA fragments were mixed in this molar amount.
  • E. coli transformation ligation product was added to 100 ⁇ L of DH5 ⁇ competent cells (Nippon Gene) and placed on ice for 30 minutes. Heat shock was applied at 42 ° C. for 60 seconds. 300 ⁇ L of SOC medium was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The entire amount was applied to LB (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin). Incubated at 37 ° C. for 14 hours.
  • the supernatant was taken, 450 ⁇ L of 2-propanol was added, and the mixture was mixed well. Centrifugated at 18000 xg for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed, and 1 mL of 75% ethanol was added. Centrifugation was performed at 18,000 ⁇ g at 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed and the pellet was air dried. The pellet was dissolved in 10 ⁇ L of TE buffer (pH 8.0).
  • DMEM 4500 mg / mL glucose
  • PBS containing fetal bovine serum Biosera
  • the medium of HEK293 cultured in a 10 cm dish was aspirated with an ejector and washed with 4 mL of 1 ⁇ PBS.
  • 1 mL of 0.05% trypsin-1 mM EDTA / PBS was added, and the cells were cultured at 37 ° C. for 2 minutes.
  • 1 mL of DMEM was added, cells were peeled off, and the whole amount was collected in a 15 mL tube.
  • NEU1 activity The neuraminidase activity of wild-type NEU1 and NEU1 modified types 1 and 2 was measured according to the method described in ⁇ Measurement of neuraminidase activity> above. The value obtained by subtracting the measured value of neuraminidase activity of NEU1 unintroduced cells from the obtained measured value was defined as neuraminidase activity. The results are shown in the table below and FIG. Both modified types 1 and 2 showed relatively high activity, although they were lower than wild type NEU1.
  • Example 2 Confirmation of crystallization of modified neuraminidase 1.
  • Transfection into CHO cells Transfect CHO cells with a plasmid incorporating a gene encoding the above wild-type NEU1 and NEU1 modified type 1 (hereinafter, unless otherwise specified, NEU1 modified type 1 is also simply referred to as NEU1 modified type). did. Specifically, the procedure was as follows. F-10 Ham (Sigma Aldrich) and PBS containing fetal bovine serum (Biosera) were warmed to a final concentration of 10%. The medium of CHO cultured in a 10 cm dish (Greener) was sucked with an ejector and washed with 5 mL of 1 ⁇ PBS.
  • Opti-MEM (Thermo) was dispensed at 150 ⁇ L ⁇ 2 ⁇ number of plasmids. To one side, 2.5 ⁇ g of each plasmid and 5 ⁇ L of P3000 (Thermo) were added. To the other, 7.5 ⁇ L of Lipofectamine 3000 (Thermo) was added. Both solutions were mixed and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The mixture was applied to the cells and cultured for 24 hours. The medium was replaced with 2 mL of fresh F-10 Ham.
  • Example 3 Co-localization of NEU1 with lysosomes in cathepsin A overexpressing cells Transformation was performed according to a known method to obtain a pCXN 2 plasmid (referred to as pCXN 2 CTSA) having the full length of human cathepsin A (CTSA) cDNA (SEQ ID NO: 14). Created (Fig. 5).
  • CHO cells were transfected with pCXN 2 CTSA according to the method described above. After 24 hours of medium replacement, the medium was replaced with 2 mL of new medium. 400 ⁇ g / mL G418 (Invivogen) was added as a selective drug, and the cells were cultured for 3 days.
  • the medium was changed, the selected drug was added again, and the cells were cultured for another week.
  • the cells were increased by changing to a medium without a selective drug.
  • the above-mentioned NEU1 modified form 1 was introduced into the obtained CTSA overexpressing cells according to the above-mentioned method, and immunostaining was performed. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the NEU1 modified form co-localized with lysosomes in CTSA overexpressing cells. This indicates that NEU1 is transported to lysosomes if CTSA is sufficient.
  • Example 4 Preparation of a vector that co-expresses two genes (CTSA and NEU1 modified form) 1.
  • Reverse primer: AAAAAGATCTTCAGAGTGTCCCATAGACAC (SEQ ID NO: 16), was prepared in the same procedure as in Example 1.1 above.
  • CTSA cDNA Amplification The gene encoding CTSA cDNA (SEQ ID NO: 14) is loaded with the following primers: TTTTAGATCTCACCATGATCCGAGCCGCGCC (SEQ ID NO: 17). Reverse primer: AAAAGCGGCCGCTCAGTATGGCTGCTTGTTC (SEQ ID NO: 18), Using pCXN 2 CTSA as a template plasmid, treatment was performed in the same procedure as in Example 1.1.
  • Example 5 Enzyme activity in cells into which various plasmids have been introduced
  • each plasmid of EGFP negative control, FIG. 8
  • CTSA CTSA
  • FEU1 mod NEU1
  • FIGS. 9-12 The results are shown in FIGS. 9-12.
  • a plasmid into which only mod NEU1 has been introduced shows the same level of NEU1 activity as usual, and is considered to be more effective than wild-type NEU1 in consideration of not crystallizing.
  • a vector that co-expresses CTSA and NEU1 is highly likely to be effective for gene therapy of lysosomal storage diseases, particularly galactosialidosis and sialidosis.
  • Example 6 Preparation of CTSA + mod NEU1 co-expressing AAV2 1.
  • Preparation of pBI-CMV1 CTSA + mod NEU1 NV for template Prepare the restriction enzyme reaction solution as shown in the table below, change the Milli-Q water used to dissolve the air-dried pellets from 10 ⁇ L to 8 ⁇ L, and use EcoRV 0.5 ⁇ L as the restriction enzyme. The treatment was carried out in the same procedure as in Examples 1.3 to 6 except that 0.5 ⁇ L of Xho I (Takara) was used. The one with one band was used as pBI-CMV1 CTSA + mod NEU1 NV as a template for producing a vector for AAV production (FIG. 13).
  • CTSA mod NEU1 co-expression unit and EGFP cDNA amplification
  • pBI-CMV1 CTSA + mod NEU1 NV and pEGFP-N1 (Takara) as template plasmids
  • treatment was performed in the same procedure as in Example 1.1.
  • Restriction enzyme treatment The procedure was the same as in Example 1.3, except that the restriction enzyme reaction solution was prepared as shown in the table below.
  • Example 7 Transfection of CTSA + mod NEU1 co-expressing AAV2 into HEK293 cells 1.
  • DMEM 4500 mg / mL glucose
  • PBS containing fetal bovine serum Biosera
  • the medium of HEK293 cultured in a 10 cm dish was aspirated with an ejector and washed with 4 mL of 1 ⁇ PBS.
  • 1 mL of 0.05% trypsin-1 mM EDTA / PBS was added, and the cells were cultured at 37 ° C. for 2 minutes.
  • DMEM 1 mL of DMEM was added, cells were peeled off, and the whole amount was collected in a 15 mL tube. Centrifuge at 200 xg at room temperature for 5 minutes, remove the supernatant, suspend in 3 mL of DMEM, take 30 ⁇ L and add to a 1.5 mL tube. 30 ⁇ L of 0.3% trypan blue was added and mixed to stain the cells. A cell count was performed using a complete blood count plate. 4 ⁇ 10 6 cells were sprinkled on a 10 cm dish (Greener). DMEM was added to the final 10 mL. Incubate at 5% CO 2 , 37 ° C. for 24 hours.
  • the contents were transferred to a 1.5 mL tube and centrifuged at 10000 ⁇ g, 4 ° C. for 10 minutes. Again, vortex-centrifugation was performed for 15 seconds. The supernatant was transferred to a new 1.5 mL tube, 50 ⁇ L of AAV Extraction Solution B (Takara) was added and mixed. 100 ⁇ L each was dispensed and stored at ⁇ 80 ° C.
  • AAV Quantitative AAV solution 5 ⁇ L, water: 12 ⁇ L, 10 ⁇ DNase buffer: 2 ⁇ L, DNase I (Takara): 1 ⁇ L are gently mixed by pipetting to prepare a DNase reaction solution, 7 ° C., 30 minutes ⁇ 95 ° C., It was allowed to react for 10 minutes.
  • Forward primer 5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (SEQ ID NO: 23)
  • Reverse primer 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA (SEQ ID NO: 24)
  • Use iQ CYBR Green supermix (2x) Bio-Rad: 10 ⁇ L, 100 ⁇ M forward primer: 0.1 ⁇ L, 100 ⁇ M reverse primer: 0.1 ⁇ L, Nuclease free water: 4.8 ⁇ L, and mix in total.
  • a master mix of 15 ⁇ L / sample was prepared.
  • pAAV-CMV was diluted to 2 ⁇ 10 9 moles / ⁇ L.
  • the plasmid was serially diluted as shown in the table below. The sample was diluted as follows.
  • Example 7 CTSA + mod NEU1 co-expressed AAV2 infection Extract containing virus was added to galactosialidosis (GS) or sialidosis (SD) patient-derived skin fibroblasts at 2 ⁇ 10 5 vg / cell or 1 ⁇ 10 5 vg / cell. It was cultured for 1 week. Skin fibroblasts F598 derived from galactosialidosis patients, skin fibroblasts F643 derived from patients with sialidosis, and skin fibroblasts F258 derived from healthy subjects were used as positive controls. Cells were lysed with a detergent and neuraminidase activity was measured with 4-MU-NANA. The results are shown in FIGS. 18 and 19. Addition of AAV2 CTSA + mod NEU1 increased neuraminidase activity in both GS and SD patient-derived skin fibroblasts.
  • Example 8 The NEU1 modified form is secreted into the CHO cell supernatant.
  • the CHO cells transfected in the same procedure as in Example 2.1 are cultured in a serum-free medium, the culture supernatant is collected, and purified CTSA is added to the above. Neuraminidase activity was measured according to the method. The results are shown in FIG. 1.18 mg of NEU1 modified form 1 was secreted per 1 L of medium.
  • Example 9 Purification of CTSA + mod NEU1 co-expressing AAV2 vector Zolotukin et. al. Gene Ther. , 6, 973-985 (1999), purify the vector according to the discontinuous gradient method.
  • PBS PBS-MK
  • DNase I and RNase A are added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • Centrifuge at 10000 xg, 10 ° C. for 5 minutes and filter the supernatant with a 0.45 ⁇ m filter.
  • PBS-MK is passed through the filter to push out the liquid remaining in the filter.
  • Example 10 In vivo In vivo Administration Protocol CTSA mutant Anesthetize mice and cut open the scalp. Insert a two-step needle 1 mm to the right of the bregma and 0.5 mm to the tail and administer 25 ⁇ L of AAV solution. Place the mouse on the body warmer and maintain body temperature until waking up from anesthesia. After 1 week, dissect and divide into cerebrum and cerebellum, and measure enzyme activity.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

改変型ノイラミニダーゼ、改変型ノイラミニダーゼをコードする遺伝子、改変型ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変型ノイラミニダーゼをコードする遺伝子およびカテプシンＡをコードする遺伝子の組み合わせ、これらの遺伝子を含むベクター、ならびにこれらを含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、リソソーム蓄積症治療のために用いられ得る。

Description

改変ノイラミニダーゼ
　関連出願
　この出願は、令和１年７月５日に日本国特許庁に出願された出願番号２０１９－１２６３７６号の優先権の利益を主張する。優先権基礎出願はその全体について、出典明示により本明細書の一部とする。
　本発明は、改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼをコードする遺伝子に関する。本発明はまた、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡとの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする遺伝子とカテプシンＡをコードする遺伝子の組み合わせに関する。本発明はまた、これらの遺伝子を含むベクターにも関する。本発明はさらに、これらを含む医薬組成物にも関する。
　ノイラミニダーゼ（Ｎ－アセチル－α－ノイラミニダーゼ、リソソームシアリダーゼともいう）は、糖鎖の末端シアル酸残基を加水分解により除去するグリコシダーゼの一種である。４種類のノイラミニダーゼがヒトの細胞内に存在することが知られている。なかでも、ノイラミニダーゼ１（以下、ＮＥＵ１とも称する）は、２つの臨床的に類似する神経変性的リソソーム蓄積症：シアリドーシスおよびガラクトシアリドーシスの標的酵素として精力的に研究されている。また、特許文献１には、ＮＥＵ１欠損がアミロイドーシスにも関連すること、非特許文献１には、ＮＥＵ１ががんの転移・浸潤にも関連すること、が開示されている。
　リソソーム蓄積症（リソソーム病、ライソゾーム病ともいう）は、細胞内外の生体分子の分解代謝を行う細胞内小器官（オルガネラ）であるリソソームに含まれる酸性加水分解酵素（リソソーム酵素）または補助因子をコードする遺伝子の変異に基づく、一群の先天性代謝異常症である。かつては治らない病であったが、１９９０年以降、動物又は植物培養細胞への正常ヒトリソソーム酵素遺伝子導入株から分泌・精製される組換え酵素製剤を患者の静脈内に定期的（１－２週間隔）に継続投与する、酵素補充療法（ｅｎｚｙｍｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｔｈｅｒａｐｙ；ＥＲＴ）が実用化され、主に末梢症状を伴う９種の疾患に対して臨床応用されている（非特許文献２）。しかしながら、酵素補充療法は適用できる疾患が限られているといった問題がある。このため、リソソーム蓄積症のさらなる治療法が求められている。
特表２０１４－５２６９０４号公報
生化学、第８０巻、第１号、１３－２３、２００８ 薬学雑誌、Ｖｏｌ．１３８，Ｎｏ．７（２０１８）
　本発明者は、ヒトノイラミニダーゼ１を用いた遺伝子治療を検討したところ、ヒトノイラミニダーゼ１を過剰発現させると細胞内結晶を生じ、細胞が破れることを見出した。このため、ヒトノイラミニダーゼ１を遺伝子治療に応用することは、細胞を損傷することとなり、危険を伴うことを見出した。本発明の目的の一つは、細胞内で結晶化せず、遺伝子治療に用いることが可能な改変型ノイラミニダーゼを提供することである。また、本発明のさらなる目的の一つは、ノイラミニダーゼ１をリソソームに共局在させる手段を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ある種の改変ノイラミニダーゼ１が、細胞内で過剰発現させても結晶化しないことを見出した。また、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）を過剰発現させることにより、ノイラミニダーゼ１がリソソームと共局在することを見出した。本発明は、上記知見により完成されたものである。
　すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において：
（ｉ）Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、または
（ｉｉ）Ｋ３５８Ｎ変異、を含み、
配列番号：１に示されるアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有する配列を含む、改変ノイラミニダーゼ、
（２）配列番号：２または配列番号：３に示される配列を有する、改変ノイラミニダーゼ、
（３）（１）または（２）の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、
（４）（３）の核酸を含む、ベクター、
（５）ＡＡＶベクターである、（４）のベクター、
（６）さらに、カテプシンＡをコードする核酸を含む、（４）または（５）のベクター、
（７）（１）または（２）の改変ノイラミニダーゼ、または（４）～（６）のいずれかのベクターを含む、医薬組成物、
（８）ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱に関連する疾患の治療のための、（７）の医薬組成物、
に関する。
　本発明により、過剰発現させても結晶化しない、または結晶化がごくわずかである改変ノイラミニダーゼ１を提供することができる。また、カテプシンＡとの併用により、ノイラミニダーゼ１をリソソームと共局在させることができる。
ＮＥＵ１改変型を発現するプラスミドの一例を示す図である。 野生型ＮＥＵ１と比較した、ＮＥＵ１改変型１、２のノイラミニダーゼ活性を示す図である。 野生型ＮＥＵ１を過剰発現させたときの免疫染色結果を示す図である。Ａ：ＮＥＵ１、Ｂ：リソソーム、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた図である。核はＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８、ＮＥＵ１は抗ＮＥＵ１、リソソームはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを用いて染色した。 ＮＥＵ１改変型１を過剰発現させたときの免疫染色結果を示す図である。Ａ：ＮＥＵ１、Ｂ：リソソーム、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた図である。核はＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８、ＮＥＵ１は抗ＮＥＵ１、リソソームはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを用いて染色した。 ＣＴＳＡ過剰発現細胞を作製する際に使用したプラスミドを示す図である。 ＣＴＳＡ過剰発現細胞においてＮＥＵ１改変型１を過剰発現させたときの免疫染色結果を示す図である。Ａ：ＮＥＵ１、Ｂ：リソソーム、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた図である。核はＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８、ＮＥＵ１は抗ＮＥＵ１、リソソームはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを用いて染色した。 ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現プラスミドの一例を示す図である。 ネガティブコントロールとして使用したＥＧＦＰを発現するプラスミドを示す図である。 各プラスミドをＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。 各プラスミドをＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のカルボキシペプチダーゼ活性を示す図である。 各プラスミドをＣＴＳＡノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。 各プラスミドをＣＴＳＡノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のカルボキシペプチダーゼ活性を示す図である。 ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクター作製の手順を示す図である。 ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクター作製の手順を示す図である。 ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクター増幅の際に使用したベクターを示す図である。 ＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを各種ＨＥＫ２９３細胞に投与した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。 ＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを各種ＨＥＫ２９３細胞に投与した際のカルボキシペプチダーゼ活性を示す図である。 健常者の皮膚繊維芽細胞のノイラミニダーゼ活性、およびガラクトシアリドーシス患者由来の皮膚繊維芽細胞にＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、またはＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを投与した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。 健常者の皮膚繊維芽細胞のノイラミニダーゼ活性、およびシアリドーシス患者由来の皮膚繊維芽細胞にＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、またはＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを投与した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。 ＮＥＵ１改変型導入ＣＨＯ細胞の培養上清のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
　本発明は、ある態様において、改変ノイラミニダーゼを提供する。本発明は、さらなる態様において、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を提供する。
　本態様の改変ノイラミニダーゼは、配列番号：１で示される野生型ノイラミニダーゼ１のアミノ酸位置１７３のＷおよび１７５のＫが変異した配列、またはアミノ酸位置３５８のＫが変異した配列を含む。より具体的には、Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、またはＫ３５８Ｎ変異を含む。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼは、上記変異を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、またはからなる。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼは、上記変異を有し、さらに配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含む、またはからなる。さらなる実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼは、配列番号：２または配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる。
　本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸として、上記の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸が挙げられる。より具体的な例として、配列番号：４で示される野生型ノイラミニダーゼ１をコードする核酸の、位置５１７～５１９の変異および位置５２３～５２５のうち２つ以上の位置での変異、または位置１０７４の変異を含む核酸が挙げられる。さらに具体的には、位置５１７～５１９がＡＡＴまたはＡＡＣ、位置５２３～５２５がＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣであるか、または位置１０７４がＴまたはＣである変異を含む核酸が挙げられる。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸は、上記変異を有し、配列番号：４で示される核酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、またはからなる。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸は、上記変異を有し、さらに配列番号：４で示される核酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加した核酸配列を含む、またはからなる。さらなる実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸は、配列番号：５または配列番号：６に示される核酸配列を含む、またはからなる。
　塩基配列やアミノ酸配列の同一性の決定は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）のウェブサイトにおいて、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／）。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトにおけるＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９９０，　２１５（３）：４０３－１０；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　＆　Ｇｉｓｈ，　Ｗ．，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９９６，　２６６：４６０－４８０；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１９９７，　２５：３３８９－３４０２）。
　本明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチドが重合した分子であり、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等を含む。また、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ等を含む。さらに、天然のヌクレオチドのみで形成されたもの、および非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むもの、あるいは合成核酸も含む。典型的には、核酸はＤＮＡである。
　本態様の改変ノイラミニダーゼは、糖鎖等の生理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質であってもよい。また、製造および精製時におけるタンパク質の性質および構造の安定化や、分子間ジスルフィド結合の抑制等を目的として、システイン残基における－ＳＨ基の酸化（例えばスルホ基への変換）、グルタチオン化、ニトロシル化、アルキル化、マレイミドとの結合等を行ったものでもよい。これらのいずれも、機能的に同等である限り、本態様の改変ノイラミニダーゼとして使用できる。
　本態様の改変ノイラミニダーゼの作製方法は特に限定されず、組換え発現（哺乳類細胞、酵母、大腸菌、昆虫細胞等）、無細胞系を用いた合成などが例示できる。例えば、宿主に応じたシグナル配列をコードする核酸配列および本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を有する核酸を宿主細胞に導入し、組換え発現後の培養上清から回収する方法や、宿主細胞に改変ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を有する核酸を導入し、組換え発現後に細胞を破砕して回収する方法、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を有する核酸を鋳型として無細胞系で合成するなどの方法が挙げられる。これらに使用される細胞は特に限定されず、例えばＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
　得られた改変ノイラミニダーゼは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択および／または組み合わせることによりタンパク質を分離、精製することができる。
　本発明は、他の態様において、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエートウイルスベクター、センダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター、などが例示できるが、これらに限定されるものではない。好ましい例として、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノアソシエートウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。より具体的な実施形態において、該ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶには、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶならびにヒツジＡＡＶ、ならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２型である。該ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターＤＮＡ配列や、遺伝子発現を制御する因子、ＤＮＡの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。
　ある実施形態において、本態様のベクターは、カテプシンＡをコードする核酸をさらに含む。具体的には、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、またはからなる配列をコードする核酸、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含む、またはからなる配列をコードする核酸、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる配列をコードする核酸、配列番号：１４で示される核酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する核酸、配列番号：１４で示される核酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個の核酸が置換、挿入、欠失および／または付加した配列を含む、またはからなる核酸、配列番号：１４で示される核酸配列を含む、またはからなる核酸、が挙げられる。
　本発明は、さらなる態様において、改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を提供する。ある実施形態において、改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞は、さらにカテプシンＡも分泌する。本態様の改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞は、例えば上記核酸配列を有する細胞である。本態様の改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞は、例えば上記ベクターを導入することにより作製できる。
　本発明はまた、さらなる態様において、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を含む、医薬組成物を提供する。
　本態様の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｌａｔｅｓｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｅａｓｔｏｎ，　Ｕ．Ｓ．Ａ参照）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
　本態様の医薬組成物の投与方法として、経口投与または非経口投与が挙げられ、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本態様の医薬組成物を全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、腹腔内、髄腔内（例えば大槽内または腰髄内）、または脳室内など）に投与できる。
　また、患者の年齢、症状等により適宜投与方法を選択することができる。改変ノイラミニダーゼを投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約０．００００００１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり約０．００００１から約１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量が選択できる。改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞や改変ノイラミニダーゼをコードするＤＮＡが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、対象となる組織において、改変ノイラミニダーゼの量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本態様の医薬組成物は、ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱による疾患の治療に使用できる。疾患の例として、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、がん等が挙げられる。より具体的な例として、本態様の医薬組成物はガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療に使用できる。
　本明細書において使用される用語、「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに制限されない。
　本明細書で使用される用語、「治療」は、例えば、症状の緩和、改善、および／または除去、軽減および／または安定化（例えばより進んだ段階へと進行しないこと）のいずれかを指す。
　本発明は、さらに以下の態様も提供する：
（１）必要とする対象に、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を投与することを含む、リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療方法；
（２）必要とする対象に、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を含む組成物を投与することを含む、リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療方法；
（３）リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療のための、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞の使用；
（４）リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療のための医薬の製造における、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞の使用、も提供する。
　これらの態様における、改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞、それらの形態、製剤化、投与方法、および投与量についての説明や他の実施形態は上記のとおりである。
　また、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせの場合、同時投与、逐次投与のいずれでもよく、また両者を一つの製剤としてもよい。
　本明細書において引用された先行技術文献は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と引用文献の記載に不一致がある場合、本明細書の記載により調整される。また、本明細書において、「約」なる用語は、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％の範囲を意味する。また、その範囲の境界値となる数値は、本明細書に記載されているものとみなされる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例は必ずしも本発明の範囲を限定するものではない。
（各種測定方法）
＜ノイラミニダーゼ活性測定＞
１．細胞破砕液の作製
　培地を除去した後、ＰＢＳで細胞を剥がし、１．５ｍＬチューブに回収する。これを５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去して１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去し、２５０μの溶解バッファー（１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ／５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）／１μＭペプスタチンＡ（ペプチド研究所）／２ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加え、ピペッティングにより細胞破砕液を得る。
２．細胞破砕液のタンパク質定量
　溶解バッファーで希釈した細胞破砕液を９６ウェルプレートに５μＬずつ分注する。下表の濃度の検量線を９６ウェルプレート内に作製する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＤＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＡ液とＳ液を５０：１で混合し、各ウェルに２５μＬずつ加えた後、Ｂ液を２００μＬずつ加え、１５分間、室温で反応させる。７５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定し、タンパク質定量を行う。
３．ノイラミニダーゼ活性測定
　細胞破砕液を２０μＬずつ分注し、２０μＬの基質溶液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）：８μＬ、Ｍｉｌｉ－Ｑ水：５μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）：２μＬ、２ｍＭ　４－ＭＵ－ＮＡＮＡ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）：５μＬ）を加え、３７℃で３０分間反応させる。その後、０．２Ｍグリシン－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．７）を３７０μＬ加え、反応を停止させる。下表の濃度の検量線を作製する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定し、比活性を算出する。
＜カルボキシペプチダーゼ活性測定＞
　上記細胞破砕液を１２０００×ｇ、４℃、５分間遠心し、上清を回収して細胞抽出液とする。Ｂｉｏ－Ｒａｄ　ＤＣ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔでタンパク定量を行っておく。
１．１次反応
　１．５ｍＬチューブ３本に細胞抽出液２５μＬを加える。基質ＭＩＸとして、０．２Ｍ　ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．６）：１２．５μＬ、３ｍＭ　Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）：１２．５μＬを混合したものをチューブ２本に加え、３ｍＭ　Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕの代わりに水を１２．５μＬ混合したものを基質（－）としてチューブ１本に加える。３０分間、２５℃で反応させた後、１００℃の沸騰水に３分間浸し、反応を停止させる。
２．２次反応
　下表のとおり、検量線のスタンダードを調製する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　チューブ１本あたり、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）：５００μＬ、０．２Ｍ　Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）：１．２５μＬ、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（Ｃｏｒｏｔａｌｕｓ　ａｔｒｏｘ由来、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）／２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）：１μＬ、ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）：０．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ　ｏ－Ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液：１５μＬを混合した２次反応液を調製し、各サンプル、スタンダードに加え、３７℃、４０分間インキュベートする。４０分後、６Ｍ　ＨＣｌを５００μＬずつ各サンプル、スタンダードに加え、反応を停止させる。各サンプルおよびスタンダードを９６ウェルプレートに２００μＬずつ加え、５４０ｎｍの吸光度を測定する。
＜免疫蛍光染色＞
１．８ウェルチャンバースライドへの継代
　最終濃度１０％になるようウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＦ－１０　Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＢＳを温めておく。トランスフェクションを２４時間行い、培地交換後さらに２４時間後のＣＨＯの培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ　１ｍＬで洗浄する。０．０５％トリプシン－１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　１ｍＬを加え、３７℃、２分間培養する。Ｆ－１０　Ｈａｍ　１ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収する。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＦ－１０　Ｈａｍ　１ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加える。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色する。血球計数版を用いて、セルカウントを行う。８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ）に１×１０４細胞／ウェル加え、Ｆ－１０　Ｈａｍで３００μＬにメスアップする。
２．免疫蛍光染色
　Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで染色する場合は、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＤＮＤ－９９（Ｔｈｅｒｍｏ）を最終濃度１μＭになるようにＦ－１０　Ｈａｍで希釈し、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ入りの培地に交換して１時間培養する。培地を除き、ＰＢＳ　５００μＭ／ウェルで１回洗浄後に４％ＰＦＡ／ＰＢＳを２００μＬ加え、室温で３０分間固定する。５００μＬ／ウェルで３回洗浄する。５％ヤギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、室温、１時間ブロッキングする。１次抗体（抗ＮＥＵ１　Ｆ－８（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、１００倍希釈）、または抗ＬＡＭＰ１（ａｂｃａｍ、３００倍希釈））で処理（１５０μＬ／ウェル）し、４℃、１６時間置く。１次抗体液を除き、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ　５００μＬで洗浄する（×５回）。ＰＢＳ　５００μＬで洗浄する（×１回）。２次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｆ（ａｂ’）２（ＣＳＴ、１０００倍希釈）またはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｆ（ａｂ’）２（ＣＳＴ、１０００倍希釈））およびＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８での処理（１５０μＬ／ウェル）を、室温、１時間行う。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ　５００μＬ／ウェルで洗浄する（×５回）。ＰＢＳ　５００μＬ／ウェルで洗浄する（×２回）。５０％グリセロール／ＰＢＳで封入し、共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察する。
＜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＞
１．分離用ゲルの作成
　３０％アクリルアミド：３．１２５ｍＬ、４×下層バッファー（１．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８）：１．８７５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水：２．４２５ｍＬ、１０％ＳＤＳ：７５μＬ、１０％ＡＰＳ：２５μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬを混合し、ゲル板に流し込んで、上に水飽和ブタノールを積層し、室温で固めて分離用ゲル（１２．５％）を作製する。
２．濃縮用ゲルの作成
　３０％アクリルアミド：０．６５ｍＬ、４×上層バッファー（０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８）：１．２５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水：３．０２ｍＬ、１０％ＳＤＳ：５０μＬ、１０％ＡＰＳ：２５μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬを混合し、ゲル板に流し込んで、コームを差し込み、室温で固めて濃縮用ゲルを作製する。
３．サンプル調製
　６×サンプルバッファー（０．３Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３６％グリセロール、２４％ＳＤＳ、１．２％２－メルカプトエタノール、０．０１２％ブロモフェノールブルー）を２０μＬにメスアップした細胞破砕液４０μｇ分に４μＬ加え、３分間煮沸する。ビオチン化マーカー、またはプレステインドマーカー５μＬに６×サンプルバッファーを４μＬ加え、２４μＬにＭｉｌｌｉ－Ｑ水でメスアップする。サンプルを１００℃の湯浴に３分間浸ける。
４．泳動
　泳動槽を泳動バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）で満たし、ゲル板をセットしてカソード側にも泳動バッファーを入れる。コームを抜き、ウェルを整えてサンプルを全量アプライする。２０ｍＡ定電流でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。
＜ウェスタンブロッティング＞
　泳動後のゲルから濃縮用ゲルを切り取り、ブロッティングバッファー（４８ｍＭ　Ｔｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、２０％メタノール）に１５分程浸す。ＰＶＤＦ膜をメタノールに浸し、さらにブロッティングバッファーに１５分間浸す。ろ紙（６枚）をブロッティングバッファーに１５分間浸す。トランスブロッターを転写バッファーで湿らせ、ろ紙（３枚）、ＰＶＤＦ膜、ゲル、ろ紙（３枚）の順にセットし、転写を開始する。１５Ｖ、約１時間行う。転写が終わったＰＶＤＦ膜を取り出し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ＯＮＥ／ＴＢＳを加えて１時間、ブロッキングする。１次抗体溶液をアプライし、４℃で一晩反応させる。ＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分×３回）、その後、ＰＢＳで２回洗浄する。二次抗体溶液をＰＶＤＦ膜に付ける。ＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分×３回）、ＰＢＳで１回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄する。その後、ＨＲＰ標識の場合はＷｅｓｔｅｒｎ　ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｕｌｔｒａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に浸し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｃｈｅｍｉ　Ｄｏｃ　ＲＸＳ＋で検出する。ＡＰ標識の場合は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｗａｋｏ）／５０ｍＭ　ＭｇＳＯ４／ＴＢＳに浸し、検出する。
実施例１．改変ノイラミニダーゼの作製および活性確認
１．野生型ヒトノイラミニダーゼ１をコードする遺伝子の増幅
　ヒトノイラミニダーゼ１をコードする遺伝子（配列番号：４）を、以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTTCTAGACACCATGACTGGGGAGCGAC（配列番号：７）
リバースプライマー：ATATAAGCTTTCAGAGTGTCCCATAGA（配列番号：８）、
を用いて９４℃２分間を１回、９４℃３０秒間、５７℃３０秒間、６８℃６０秒間のサイクルを３５サイクル行うＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応液は、フォワードプライマー：１μＬ（５０ｐｍｏｌ）、リバースプライマー：１μＬ（５０ｐｍｏｌ）、テンプレートプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ　（－）　ＮＥＵ１）：１μＬ（１０ｎｇ）、１０×ＫＯＤバッファー：５μＬ、２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４：２μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ：５μＬ、ＫＯＤ　ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）：１μＬを、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で５０μＬにメスアップして調製した。
２．改変型１および２の作製および増幅
　上述のプライマーに加えて、改変型１の作製のため、以下のプライマー、
フォワードプライマー：CTACCATGTTGGTAAACAGCAGCGATGATGGTGTTTC（配列番号：９）
リバースプライマー：GAAACACCATCATCGCTGCTGTTTACCAACATGGTAG（配列番号：１０）、
および改変型２の作製のため、以下のプライマー、
フォワードプライマー：CTCATGGCGGAACGAGACAGTCC（配列番号：１１）
リバースプライマー：GGACTGTCTCGTTCCGCCATGAG（配列番号：１２）、
を使用した。
　上記１．と同様にＰＣＲ増幅した後、エタノール１２５μＬ、２Ｍ　ＮａＣｌ　５μＬを加え、１８０００×ｇ、４℃、３０分間遠心した。上清を除き、ＤＮＡサンプルバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、３３％グリセロール、０．３％ブロモフェノールブルー）で溶解した。全量を１％アガロースゲルで泳動した。Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で主要バンドを切り出し、ＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡフラグメントを当モル混合した。２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４　２μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　５μＬ、ＫＯＤ　ｐｌｕｓバッファー５μＬ、ＫＯＤ　ｐｌｕｓ　１μＬを加え、水で５０μＬにメスアップした。これを、９４℃２分間を１回、９４℃３０秒間、５７℃３０秒間、６８℃８０秒間のサイクルを３５サイクル行うＰＣＲ反応により増幅した。
３．制限酵素処理
　ＰＣＲ後の反応液にＴＥ飽和フェノールとＣＩＡ（クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１で混合したもの）を２５μＬずつ加え、よく振った。４℃、２００００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、ＣＩＡを５０μＬ加えた。４℃、２００００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、エタノール１２５μＬと２Ｍ　ＮａＣｌを５μＬ加えた。２００００×ｇ、４℃、２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを風乾した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を１０μＬ加え、ペレットを溶解した。下表のとおり制限酵素反応液を調製し、３７℃、１６時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
４．ライゲーション
　制限酵素反応液を全量、１％アガロースゲルで泳動した。主要バンドを切り出し、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔでＤＮＡを精製した。プラスミド２５ｆｍｏｌ、インサート１２５ｆｍｏｌを混合し、同体積のＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｍｉｇｈｔｙ　ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃、１６時間反応させた。
５．大腸菌の形質転換
　ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテントセル（ニッポンジーン）１００μＬに加え、３０分間氷上に置いた。６０秒間、４２℃でヒートショックを加えた。ＳＯＣ培地を３００μＬ加え、３７℃、１時間インキュベートした。ＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に全量塗った。３７℃、１４時間インキュベートした。
６．ミニプレップ
　ＬＢ培地２ｍＬに１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを２μＬ加えた。コロニーを爪楊枝で拾って培地に入れ、３７℃、１６時間振とうした。菌液１ｍＬをとり、室温、１０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を除き、氷冷したＳｏｌＩ（５０ｍＭスクロース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を１００μＬ加え、再懸濁した。ＳｏｌＩＩ（０．２Ｍ　ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を２００μＬ加え、転倒混和して氷上で５分間放置した。氷冷したＳｏｌＩＩＩ（３Ｍ酢酸カリウム、２Ｍ酢酸）を１５０μＬ加え、転倒混和した。１２０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を取り、１０ｍｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅ　Ａ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を１μＬ入れ、３７℃、１時間インキュベートした。ＴＥ飽和フェノールとＣＩＡを２５５μＬずつ加え、よく振り混ぜた。１２０００×ｇ、５分間、４℃遠心分離した。上清を回収し、ＣＩＡ　４５０μＬを加え、よく振り混ぜた。１２０００×ｇ、５分間、４℃遠心分離した。上清を取り、２－プロパノールを４５０μＬ加え、よく混ぜた。１８０００×ｇ、２０分間、４℃遠心分離した。上清を除き、７５％エタノールを１ｍＬ加えた。１８０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を除き、ペレットを風乾した。ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）１０μＬでペレットを溶かした。各ＤＮＡ溶液１μＬ、１０×Ｍバッファー２μＬ、０．１％ＢＳＡ　２μＬ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水１４μＬ、Ｘｂａ　Ｉ　０．５μＬ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　０．５μＬをそれぞれ混合し、３７℃、１時間、インキュベートした。６×ＤＮＡサンプルバッファーを４μＬ加え、１％アガロースゲルで泳動した。
７．ミディプレップ
　ミニプレップで、インサートが正確に挿入されているプラスミドを持つコロニーを１ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に入れ、１２時間、３７℃で培養した。２００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に移し、３７℃で１６時間培養した。Ｈｉｐｕｒｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｉｄｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、ＤＮＡを抽出・精製した。得られたプラスミドに目的の変異が入っているか、配列を確認した（ＮＥＵ１改変型導入プラスミドについて、図１）。
８．ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
　最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）で培養したＨＥＫ２９３の培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ　４ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　１ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。ＤＭＥＭ　１ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＤＭＥＭ　１ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。３５ｍｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）に細胞を１×１０６個撒いた。最終１．５ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を１５０μＬ×２×プラスミド数分注した。一方に各プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を５μＬ加えた。もう一方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を７．５μＬ加えた。両液を混ぜて１５分間、室温に置いた。混合液を細胞にかけ、２４時間、培養した。培地を新しいＤＭＥＭ　２ｍＬに交換した。
９．ＮＥＵ１の活性確認
　上記＜ノイラミニダーゼ活性測定＞に記載の方法に従って、野生型ＮＥＵ１、ＮＥＵ１改変型１、２のノイラミニダーゼ活性を測定した。得られた測定値から、ＮＥＵ１未導入細胞のノイラミニダーゼ活性の測定値を差し引いた値をノイラミニダーゼ活性とした。結果を下表、および図２に示す。改変型１、２とも、野生型ＮＥＵ１よりは低いものの、比較的高い活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例２．改変ノイラミニダーゼの結晶化の有無の確認
１．ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション
　上記野生型ＮＥＵ１およびＮＥＵ１改変型１（以下、特に断らない場合はＮＥＵ１改変型１を単にＮＥＵ１改変型とも称する）をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドで、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。具体的には、以下の手順で実施した。最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＦ－１０　Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で培養したＣＨＯの培地をアスピレーターで吸い、１×ＰＢＳ　５ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　１ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。Ｆ－１０　Ｈａｍ　１ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を除いてＦ－１０　Ｈａｍ　１ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。３５ｍｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に細胞を１×１０６個撒いた。最終１．５ｍＬになるようにＦ－１０　Ｈａｍを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を１５０μＬ×２×プラスミド数分注した。一方に各プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を５μＬ加えた。もう一方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を７．５μＬ加えた。両液を混ぜて１５分間、室温に置いた。混合液を細胞にかけ、２４時間培養した。培地を新しいＦ－１０　Ｈａｍ　２ｍＬに交換した。
２．細胞内結晶化確認
　上記＜免疫蛍光染色＞に記載の方法に従って、遺伝子導入して４日後に、ＮＥＵ１については抗ＮＥＵ１抗体、リソソームについては抗ＬＡＭＰ１を用いて免疫染色を行った。
　野生型での結果を図３、改変型１での結果を図４に示す。図３に示すとおり、野生型ではＮＥＵ１の結晶化が観察された。図４に示すとおり、改変型１ではＮＥＵ１の結晶化は観察されなかった。なお、改変型２については、若干の結晶化が確認されたものの、野生型に比べてごくわずかであった。また、図に示すとおり、ＮＥＵ１はリソソームとはほとんど共局在が見られなかった。
実施例３．カテプシンＡ過剰発現細胞におけるＮＥＵ１のリソソームとの共局在
　公知の方法に従って形質転換を行い、ヒトカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）ｃＤＮＡ（配列番号：１４）の全長を有するｐＣＸＮ２プラスミド（ｐＣＸＮ２　ＣＴＳＡという）を作成した（図５）。上記の方法に従い、ＣＨＯ細胞をｐＣＸＮ２　ＣＴＳＡでトランスフェクトした。培地交換２４時間後、新しい培地２ｍＬに交換した。選択薬剤として４００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加え、３日間培養した。培地交換し、再度選択薬剤を加え、さらに１週間培養した。選択薬剤無しの培地に交換し、細胞を増やした。得られたＣＴＳＡ過剰発現細胞に、上記のＮＥＵ１改変型１を上記の方法に従い導入、免疫染色を行った。結果を図６に示す。図に示されるとおり、ＣＴＳＡ過剰発現細胞において、ＮＥＵ１改変型はリソソームと共局在した。このことは、ＣＴＳＡが十分にあれば、ＮＥＵ１がリソソームへ輸送されることを示す。
実施例４．２つの遺伝子（ＣＴＳＡおよびＮＥＵ１改変型）を同時発現するベクターの作製
１．ＮＥＵ１改変型１（ｍｏｄ　ＮＥＵ１）のｃＤＮＡ増幅、ベクターへの組み込み
　以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTGAATTCCACCATGACTGGGGAGCGACC（配列番号：１５）
リバースプライマー：AAAAAGATCTTCAGAGTGTCCCATAGACAC（配列番号：１６）、
を用いて、上記実施例１．１と同様の手順で調製した。
２．制限酵素処理
　下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
３．ライゲーション、４．大腸菌の形質転換、５．ミニプレップ
　制限酵素としてＥｃｏＲ　Ｉ　０．５μＬ、Ｂｇｌ　ＩＩ　０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているプラスミドをｐＢＩ－ＣＭＶ１　ｍｏｄ　ＮＥＵ１とし、次のＣＴＳＡ　ｃＤＮＡ組み込みに用いた。
６．ＣＴＳＡ　ｃＤＮＡ増幅
　ＣＴＳＡ　ｃＤＮＡをコードする遺伝子（配列番号：１４）を、以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTAGATCTCACCATGATCCGAGCCGCGCC（配列番号：１７）
リバースプライマー：AAAAGCGGCCGCTCAGTATGGCTGCTTGTTC（配列番号：１８）、
テンプレートプラスミドとしてｐＣＸＮ２　ＣＴＳＡを用いて、実施例１．１と同様の手順で処理した。
７．制限酵素処理
　下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
８．ライゲーション、９．大腸菌の形質転換、１０．ミニプレップ
　制限酵素としてＢｇｌ　ＩＩ　０．５μＬ、Ｎｏｔ　Ｉ　０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているプラスミドをｐＢＩ－ＣＭＶ１　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１（図７）とし、以降の実験に用いた。
１１．ミディプレップ
　実施例１．７と同様の手順で処理した。
実施例５．各種プラスミドを導入した細胞における酵素活性
　上記のＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１に加え、ＥＧＦＰ（ネガティブコントロール、図８）、ＣＴＳＡ（図５）、ｍｏｄ　ＮＥＵ１（図１）の各プラスミドを、上述の方法に従い、それぞれＣＴＳＡノックアウト（ＫＯ）またはＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した。導入後、界面活性剤で細胞を溶解し、上記の方法に従い、ノイラミニダーゼ活性およびカルボキシペプチダーゼ活性をそれぞれ測定した。結果を図９～１２に示す。両酵素を同時に発現するプラスミドを導入した細胞は、ＣＴＳＡ　ＫＯ、ＮＥＵ１　ＫＯ細胞の両方で、ノイラミニダーゼ活性とカルボキシペプチダーゼ活性が上昇した。また、ノイラミニダーゼのみを発現するプラスミドを導入した細胞は、ＮＥＵ１　ＫＯ細胞では通常のＨＥＫ２９３細胞と同程度のノイラミニダーゼ活性を示したが、ＣＴＳＡ　ＫＯ細胞では通常のＨＥＫ２９３細胞よりも低いノイラミニダーゼ活性を示した。これにより、ノイラミニダーゼ活性には、ＣＴＳＡ活性が重要であることが明らかとなった。ｍｏｄ　ＮＥＵ１のみを導入したプラスミドであっても、通常と同程度のＮＥＵ１活性を示しており、結晶化しないことを考慮すれば、野生型ＮＥＵ１よりも有効であると考えられる。また、ＣＴＳＡとＮＥＵ１を同時発現するベクターは、リソソーム蓄積症、特にガラクトシアリドーシス、シアリドーシスの遺伝子治療に有効である可能性が高いことが示された。
実施例６．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２の作製
１．テンプレート用ｐＢＩ－ＣＭＶ１　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１　ＮＶ　作成
　下表のとおり制限酵素反応液を調製し、風乾したペレットの溶解に使用するＭｉｌｌｉ－Ｑ水を１０μＬから８μＬに変更し、制限酵素としてＥｃｏＲ　Ｖ　０．５μＬ、Ｘｈｏ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬを使用する以外は、実施例１．３～６と同様の手順で処理した。バンドが１本のものを、ｐＢＩ－ＣＭＶ１　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１　ＮＶとして、ＡＡＶ製造用ベクター作製用テンプレートとして用いた（図１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
２．ＣＴＳＡ、ｍｏｄ　ＮＥＵ１同時発現ユニットおよびＥＧＦＰ　ｃＤＮＡ増幅
　以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTAAGCTTGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC（配列番号：１９）、
　　　　　　　　　　　TTTTGAATTCCACCATGGTGAGCAAGGG（配列番号：２０）、
リバースプライマー：TTTTTCTAGATCAGAGTGTCCCATAGACACTG（配列番号：２１）、
　　　　　　　　　　AAAAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC（配列番号：２２）、
テンプレートプラスミドとしてｐＢＩ－ＣＭＶ１　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１　ＮＶ、およびｐＥＧＦＰ－Ｎ１（Ｔａｋａｒａ）を用いて、実施例１．１と同様の手順で処理した。
３．制限酵素処理
　下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
４．ライゲーション、５．大腸菌の形質転換、６．ミニプレップ
　制限酵素としてＢｇｌ　ＩＩ　０．５μＬ、Ｎｏｔ　Ｉ　０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているベクターをｐＡＡＶ－ＣＭＶ　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１（図１４）あるいはｐＡＡＶ－ＣＭＶ　ＥＧＦＰとし、以降の実験に用いた。
７．ミディプレップ
　実施例１．７と同様の手順で処理した。
実施例７．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２のＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
１．ＨＥＫ２９３ＦＴ播種
　最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）で培養したＨＥＫ２９３の培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ　４ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　１ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。ＤＭＥＭ　１ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＤＭＥＭ　３ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。１０ｃｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に細胞を４×１０６個撒いた。最終１０ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。
２．トランスフェクション
　ＣａｌＰｈｏｓ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを滅菌水で６倍希釈した。希釈したＣａｌｃｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１０００μＬにプラスミド３種類（ｐＡＡＶ－ＣＭＶ　ＥＧＦＰまたはｐＡＡＶ　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１；ｐＲＣ２－ｍｉ３４２；ｐＨｅｌｐｅｒ、各ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）中１μｇ／μＬ、図１５）を６μＬずつ加えた。２×ＨＢＳを１０１８μＬ加え、１５回激しく振って混合した。室温で３分間静置し、細胞に全量加えた。１２時間後、ＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清）８ｍＬに全量培地交換した。
３．ＡＡＶの抽出
　細胞に０．５Ｍ　ＥＤＴＡ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）を１００μＬ加え、１０分間、室温に置いた。細胞をはがし、１５ｍＬチューブに回収した。ディッシュを２ｍＬのＤＭＥＭ＋２５μＬの０．５Ｍ　ＥＤＡＴ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）で洗いこみ、上記のチューブに回収した。１７００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。可能な限り上清を除き、ボルテックスで細胞をほぐした。５００μＬのＡＡＶ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ（Ｔａｋａｒａ）を加えた。１５秒間ボルテックスした。１．５ｍＬチューブに中身を移し、１００００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。再度、１５秒間のボルテックス～遠心分離を行った。上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し、ＡＡＶ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂ（Ｔａｋａｒａ）を５０μＬ加え、混合した。１００μＬずつ分注し、－８０℃で保存した。
４．ＡＡＶ定量
　ＡＡＶ溶液：５μＬ、水：１２μＬ、１０×ＤＮａｓｅバッファー：２μＬ、ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ）：１μＬを、ピペッティングで穏やかに混ぜてＤＮａｓｅ反応液を調製し、７℃、３０分間→９５℃、１０分間反応させた。以下のプライマー、
フォワードプライマー：5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号：２３）
リバースプライマー：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号：２４）、
を使用して、ｉＱ　ＣＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２×）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：１０μＬ、１００μＭフォワードプライマー：０．１μＬ、１００μＭリバースプライマー：０．１μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ：４．８μＬを混合し、全量で１５μＬ／サンプルのマスターミックスを調製した。ｐＡＡＶ－ＣＭＶを２×１０９　ｍｏｌｅｓ／μＬに希釈した。
下表のようにプラスミドを段階希釈した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
次のようにサンプルを希釈した。
　１：２０希釈：サンプル５μＬ＋水９５μＬ、
　１：１００希釈：１：２０希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
　１：５００希釈：１：１００希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
　１：２５００希釈：１：５００希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
各サンプルとスタンダードを５μＬずつ９６ウェルプレートにアプライし、マスターミックスを１５μＬずつ加え、ピペッティングして混ぜた。９５℃３分間／９５℃１５秒間／６０℃６０秒間／ｒｅａｄ　ｐｌａｔｅ／ステップ３から４０サイクル／融解曲線５５℃→９５℃の条件でＰＣＲを行った。解析にはＢｉｏ－Ｒａｄ　ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ解析システムを用いた。
５．ノイラミニダーゼ活性およびカルボキシペプチダーゼ活性の測定
　ウイルスを含む抽出液を１×１０５ｖｇ／細胞でＮＥＵ１ノックアウト（ＫＯ）あるいはＣＴＳＡ　ＫＯ　ＨＥＫ２９３に添加し、１週間培養した。界面活性剤で細胞を溶解し、４－ＭＵ－ＮＡＮＡでノイラミニダーゼ活性を、Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨでカルボキシペプチダーゼ活性を測定した。結果を図１６、１７に示す。図に示すとおり、ＣＴＳＡ　ＫＯ、ＮＥＵ１　ＫＯ　ＨＥＫ２９３の両方で、ＡＡＶ２　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１を添加するとノイラミニダーゼ活性、およびカルボキシペプチダーゼ活性が上昇した
実施例７．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２の感染
　ウイルスを含む抽出液を２×１０５ｖｇ／細胞あるいは１×１０５ｖｇ／細胞でガラクトシアリドーシス（ＧＳ）、またはシアリドーシス（ＳＤ）患者由来皮膚繊維芽細胞に添加し、１週間培養した。ガラクトシアリドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞F598、シアリドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞F643、およびポジティブコントロールとして健常者由来皮膚繊維芽細胞F258、を使用した。界面活性剤で細胞を溶解し、４－ＭＵ－ＮＡＮＡでノイラミニダーゼ活性を測定した。結果を図１８、１９に示す。ＧＳ患者由来、ＳＤ患者由来皮膚繊維芽細胞の両方で、ＡＡＶ２　ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１を添加するとノイラミニダーゼ活性が上昇した。
実施例８．ＮＥＵ１改変型はＣＨＯ細胞上清に分泌される
　実施例２．１と同様の手順でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、無血清培地で培養し、培養上清を回収し、精製ＣＴＳＡを加えて上記の方法に従い、ノイラミニダーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。培地１Ｌあたり、１．１８ｍｇのＮＥＵ１改変型１が分泌されていた。
実施例９．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ　ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２ベクターの精製
　Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ　ｅｔ．　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　６，　９７３－９８５　（１９９９）に記載される非連続グラジエント法に基づいてベクターを精製する。凍結保存していた細胞に１ｍＭ塩化マグネシウム入りＰＢＳ（ＰＢＳ－ＭＫ）を加え、融解する。ＤＮａｓｅ　Ｉ、およびＲＮａｓｅ　Ａを加え、３７℃、１時間反応させる。１００００×ｇ、１０℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターでフィルトレーションする。また、ＰＢＳ－ＭＫをフィルターに通し、フィルター内に残った液を押し出す。超遠心チューブにサンプルを加え、長い針を付けたシリンジで、１５％イオジキサノール／１ＭＮａＣｌ／ＰＢＳ－ＭＫをサンプルの下にアプライする。次いで、２５％イオジキサノール／フェノールレッド／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。また、４０％イオジキサノール／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。さらに、５４％イオジキサノール／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。５００００ｒｐｍ（使用ローターは７０．１　Ｔｉ、２０００００×ｇ）、１８℃、２時間遠心する。遠心終了後、４０％イオジキサノール層を回収する。１００ｋＤａ　ｃｕｔ　Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　でＰＢＳにバッファー交換する。
実施例１０．ｉｎ　ｖｉｖｏ脳室内投与プロトコール
　ＣＴＳＡ　ｍｕｔａｎｔマウスを麻酔し、頭皮を切り開く。ブレグマから右に１ｍｍ、尾の方に０．５ｍｍの位置に二段針を差し込み、ＡＡＶ溶液を２５μＬ投与する。カイロの上にマウスを置き、麻酔から覚めるまで体温を維持する。１週間後、解剖して大脳と小脳に分け、酵素活性を測定する。

Claims (8)

  1. 　配列番号：１に示されるアミノ酸配列において：
    （ｉ）Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、または
    （ｉｉ）Ｋ３５８Ｎ変異、を含み、
    配列番号：１に示されるアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有する配列を含む、改変ノイラミニダーゼ。
  2. 　配列番号：２または配列番号：３に示される配列を有する、改変ノイラミニダーゼ。
  3. 　請求項１または２に記載の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸。
  4. 　請求項３に記載の核酸を含む、ベクター。
  5. 　ＡＡＶベクターである、請求項４に記載のベクター。
  6. 　さらに、カテプシンＡをコードする核酸を含む、請求項４または５に記載のベクター。
  7. 　請求項１または２に記載の改変ノイラミニダーゼ、または請求項４～６のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  8. 　ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱に関連する疾患の治療のための、請求項７に記載の医薬組成物。
PCT/JP2020/026174 2019-07-05 2020-07-03 改変ノイラミニダーゼ Ceased WO2021006202A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/623,302 US12577570B2 (en) 2019-07-05 2020-07-03 Modified neuraminidase
JP2021530672A JP7537762B2 (ja) 2019-07-05 2020-07-03 改変ノイラミニダーゼ
EP20836020.6A EP4000637A4 (en) 2019-07-05 2020-07-03 Modified neuraminidase
CA3145622A CA3145622A1 (en) 2019-07-05 2020-07-03 Modified neuraminidase
CN202080062553.3A CN114555800A (zh) 2019-07-05 2020-07-03 经修饰的神经氨酸酶

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-126376 2019-07-05
JP2019126376 2019-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021006202A1 true WO2021006202A1 (ja) 2021-01-14

Family

ID=74114213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/026174 Ceased WO2021006202A1 (ja) 2019-07-05 2020-07-03 改変ノイラミニダーゼ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US12577570B2 (ja)
EP (1) EP4000637A4 (ja)
JP (1) JP7537762B2 (ja)
CN (1) CN114555800A (ja)
CA (1) CA3145622A1 (ja)
WO (1) WO2021006202A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024131237A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Hwu Wuh Liang Recombinant viral vector, recombinant adeno-associated virus comprising the same, and uses thereof in treating sialidosis

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014526904A (ja) 2011-08-31 2014-10-09 セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法
JP2019126376A (ja) 2018-01-19 2019-08-01 株式会社大一商会 遊技機

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5546898A (en) * 1997-01-14 1998-08-07 Hopital Sainte-Justine Human lysosomal sialidase and therapeutic uses thereof
KR101785910B1 (ko) 2015-04-16 2017-10-16 한국생명공학연구원 뮤코지질증 인간 세포 모델 및 이의 용도
MX2018005352A (es) * 2015-10-30 2018-08-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de amiloidosis.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014526904A (ja) 2011-08-31 2014-10-09 セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル リソソームエキソサイトーシス活性のレベルを検出する方法及び組成物並びに使用方法
JP2019126376A (ja) 2018-01-19 2019-08-01 株式会社大一商会 遊技機

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHUL, S.F.GISH, W., METH. ENZYMOL., vol. 266, 1996, pages 460 - 480
ALTSCHUL, SF ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, no. 3, 1990, pages 403 - 10
ALTSCHUL, SF ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 80, no. 1, 2008, pages 13 - 23
JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 138, no. 7, 2018
See also references of EP4000637A4
TSUKIMOTO, JUN ET AL.: "1P-0039 Control of intracellular crystallization of human neuraminidase 1 and its therapeutic application", 42ND ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN; FUKUOKA; DECEMBER 3-6, 2019, JAPAN, vol. 42, 19 November 2019 (2019-11-19) - 6 December 2019 (2019-12-06), Japan, pages 1 - 3, XP009533463 *
TSUKIMOTO, JUN ET AL.: "3T17e-03 Suppression of intracellular crystallization of human neuraminidase 1 and its application to the treatment of lysosomal storage diseases", THE 92ND ANNUAL MEETING OF THE JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 92, 4 September 2019 (2019-09-04), Japan, pages 384/693, XP009533465 *
TSUKIMOTO, JUN: "3P-0079 Suppression and medical application of intracellular crystallization of human neuraminidase 1 (NEU1) by amino acid substitution", 41ST ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN; NOV. 28 - 30, 2018, vol. 41, 30 November 2017 (2017-11-30) - 30 November 2018 (2018-11-30), pages 1 - 2, XP009533464 *
ZOLOTUKHIN, GENE THER., vol. 6, 1999, pages 973 - 985

Also Published As

Publication number Publication date
EP4000637A1 (en) 2022-05-25
US12577570B2 (en) 2026-03-17
CA3145622A1 (en) 2021-01-14
CN114555800A (zh) 2022-05-27
US20220364101A1 (en) 2022-11-17
EP4000637A4 (en) 2023-07-26
JP7537762B2 (ja) 2024-08-21
JPWO2021006202A1 (ja) 2021-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2769316C2 (ru) Полинуклеотиды, кодирующие интерлейкин-12 (il12), и их применения
JP7019639B2 (ja) 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法
JP5856059B2 (ja) 虚血組織を治療するためのｓｄｆ−１送達
JP2020058344A (ja) 組織再生を誘導するためのペプチドとその利用
JP2020512815A (ja) フェニルケトン尿症を処置するための組成物および方法
CN113316639A (zh) 用于治疗庞贝氏病的治疗性腺相关病毒
JP2022520232A (ja) ダノン病の治療のための遺伝子療法ベクター
BR112021011771A2 (pt) Rna que codifica uma proteína
KR20220102617A (ko) HPV mRNA 를 봉입한 핵산 지질 입자 백신
WO2021042944A1 (zh) 肌肉靶向的微环dna基因治疗
JP2023521090A (ja) ＡＡＶ遺伝子治療のためのＣｐＧフリーＩＴＲ
JP7537762B2 (ja) 改変ノイラミニダーゼ
WO2020146381A2 (en) A method of treating cystic fibrosis
US7074399B2 (en) Treatment of inflammation with p20
CN120035671A (zh) 工程化的肝脏特异性核心启动子及其应用
HK40067896A (en) Modified neuraminidase
TW202235618A (zh) 治療眼內壓相關疾患
AU2021215254A1 (en) Connexin 45 Inhibition for Therapy
JP7016125B2 (ja) 脳梗塞の治療薬
WO2021115141A1 (zh) 一种抑制HTT基因表达的siRNA及其前体和应用
JP2022507693A (ja) 心不全の治療及び予防における使用のためのリラキシン受容体１
US12312584B2 (en) cGMP exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease
WO2021000640A1 (zh) Dkk1抑制剂在预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病中的应用
JP4542732B2 (ja) 慢性関節リウマチの判定法
WO2026087567A1 (en) Transcriptional regulatory elements for cardiac-specific gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20836020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021530672

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3145622

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020836020

Country of ref document: EP

Effective date: 20220207

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2020836020

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 17623302

Country of ref document: US