WO2021006619A1 - B7-h3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

B7-h3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an anti-B7-H3 antibody that specifically binds to B7-H3 and its use, and more particularly, to an anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid encoding the same, and the nucleic acid.
  • T lymphocytes are the major cells that can remove tumor cells (Effector cells).
  • Immune checkpoints are co-signaling molecules that play a pivotal role in T lymphocyte activity and regulate to inhibit or stimulate TCR (T cell receptor) signals (Immunological reviews 2017, 276:52- 65).
  • tumor cells express the ligand protein of the immune checkpoint molecule responsible for inhibition on the cell surface, thereby inhibiting the function of T lymphocytes and preventing changes in the tumor micro-environment. Resulting in suppressing immunity.
  • CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte antigen-4
  • PD-1 programmed death-1
  • the corresponding antigen presenting cells and tumor cell ligands are the B7 family. It is a monoclonal antibody inhibitor (blockade) for the molecules B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) and B7-H1/PD-L1 (programmed death-ligand-1) (N Engl J Med. 2011, 364(26): 2517-2526; N Engl J Med., 2012, 366(26)2455-2465; and N Engl J Med. 2013, 369(2): 134-144).
  • B7-H3 (B7 Homologue 3, or CD276 (Cluster of Differentiation 276) is a member of the B7 family, B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD -L2), B7-H2 (ICOSL), B7-H4 (B7S1, B7x, Vtcn1), B7-H5 (VISTA, GI24, Dies1, PD-1H), B7-H6 (NCR3LG1) and B7-H7 (HHLA2) And 20-30% structural homology (Blood 2013, 121(5): 734-744; and Molecular Cancer Therapeutics 2017, 16(7): 1203-1211), and systematically preserved with various biological functions.
  • B7-H3 mRNA is found in various normal tissues, the protein is rarely expressed.
  • protein expression is induced in monocytes, macrophages, or dendritic cells, but is overexpressed in various solid carcinomas, prostate cancer, ovarian cancer, Breast cancer, colon cancer, renal cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, melanoma, Expression was observed in glioblastoma (glioblastoma), neuroblastoma, and other tumors (eg, small round blue cell tumors of childhood).
  • 4Ig-B7-H3 (IgV-IgC-IgV-IgC) is the main form, 2Ig-B7-H3 is slightly found, and in Murine it is the 2Ig-B7-H3 form.
  • both types show similar functions (Genome Biol. 2005, 6:233.1-233.7; PNAS 2008, 105(30):10277-10278).
  • 4Ig-B7-H3 can inhibit the anti-tumor activity of natural killer cells (PNAS 2004, 101(34): 12640-12645).
  • the B7-H3 inhibitory signal is presumed to be achieved through interaction with molecules (NF-kB, AP-1, NFAT, etc.) involved in TCR signaling, and in animal experiments, Th1 (helper T cell), Th2 or Th17 was observed to inhibit (J. Immunol. 2004, 173:2500-2506; Immunol. Rev. 2009, 229(1):145-151).
  • molecules NF-kB, AP-1, NFAT, etc.
  • B7-H3 protein expression is very limited in normal cells, but it is significantly increased in the tumor vasculature as well as in primary and metastatic tumors, differentiated tumor cells, and tumor initiating. Or it is found in a number of cell types, including cancer stem cells (Medicographia 2014, 36(2): 285-292; and Cancer cell 2017, 31:501-515), and its expression is in some tumor types. There is a strong correlation with a poor prognosis.
  • the present inventors have an anti-B7-H3 antibody that specifically binds to human B7-H3 as well as non-human (e.g., cynomolgus monkey, mouse, rat, etc.) B7-H3 with affinity. It was developed, and it was confirmed that this antibody can serve as a target immuno-cancer agent or a therapeutic agent for autoimmune or inflammatory diseases by binding to the cell surface B7-H3 and then entering the cells, and the present invention was completed.
  • non-human e.g., cynomolgus monkey, mouse, rat, etc.
  • An object of the present invention is to provide an anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to B7-H3.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof and a vector comprising the same.
  • Another object of the present invention is to provide a cell transformed with the vector and a method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof using the same.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, and a method of treating the disease using the same.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody-drug conjugate or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody-drug conjugate or multispecific antibody, and the disease using the same Is to provide a method of treatment.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease including the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody-drug conjugate or multispecific antibody, and a method for diagnosing the disease using the same. To provide.
  • the present invention is a heavy chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 7, 13 and 19, a heavy chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8, 14 and 20, SEQ ID NO: 3, Heavy chain CDR3 selected from the group consisting of 9, 15 and 21, light chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 33 and 35, SEQ ID NOs: 5, 11, Anti-B7-H3 comprising a light chain CDR2 selected from the group consisting of 17 and 31, and a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 23, 25, 27, 29, 32, 34 and 36 Antibodies or antigen-binding fragments thereof are provided.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, a recombinant expression vector comprising the nucleic acid, and a cell transformed with the recombinant expression vector.
  • the present invention also comprises the steps of (i) culturing the transformed cells and (ii) recovering the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof from the obtained cell culture medium, anti-B7-H3 antibody or It provides a method for producing an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides an antibody-drug conjugate (ADC) comprising the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof and a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the present invention also provides a multispecific antibody comprising the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also contains the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody-drug conjugate or the multispecific antibody and a pharmaceutically acceptable additive as an active ingredient, cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease, and a method of treating the disease using the same.
  • the present invention also provides a composition for diagnosis of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease comprising the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody-drug conjugate, or the multispecific antibody, and the disease using the same Provides a diagnostic method.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a B7-H3 expression vector.
  • Figures 6a to 6d are the results of measuring the binding force of the selected B7-H3 antibody to the cell surface B7-H3 by FACs
  • Figure 6a is the result of measuring the binding force of each cell line of the CD276-033E03 antibody
  • 6b is the cell line of the CD276-051H04 antibody
  • 6c represents the result of measuring the binding force of each cell line of the CD276-039C05 and CD276-040F10 antibodies
  • 6d represents the measurement result of each cell line of the six antibodies.
  • 7A to 7E are ELISA results of measuring the binding ability of the selected B7-H3 antibodies to various B7-H3 antigens.
  • FIG. 9A and 9B are results of measuring the intracellular influx of the complex of the selected B7-H3 antibody and the cell surface B7-H3 antigen
  • FIG. 9A is the result of confirming the intracellular influx of the selected B7-H3 antibody over time.
  • Figure 9b is a result of measuring the degree of intracellular influx of the antibody at 18 hours.
  • the B7-H3 protein acting as an antigen of the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is closely related to inhibition of the activity of immune cells, and is a membrane protein present on the surface of immune cells. Acts as a co-inhibitory receptor.
  • the B7-H3 may be derived from mammals such as humans, primates such as monkeys, and rodents such as mice and rats.
  • B7-H3 is a concept collectively referring to any variant, isotype and species homologue of B7-H3, which is naturally expressed by cells.
  • B7-H3 of human, but is not limited thereto, and may be a concept including B7-H3 of other mammalian animals.
  • the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to the amino acid sequence of the human B7-H3 protein represented by SEQ ID NO: 65 or a part thereof, but is not limited thereto. .
  • antibody refers to an anti-B7-H3 antibody that specifically binds to B7-H3.
  • the scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind to B7-H3, but also antigen-binding fragments of the antibody molecules.
  • a complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3), gamma4 ( ⁇ 4), alpha1 ( ⁇ 1) and alpha2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • Antigen-binding fragment or “antibody fragment” of an antibody refers to a fragment having an antigen-binding function, and may be in the form of Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
  • Fab is a structure having a light chain and a heavy chain variable region, a light chain constant region, and a heavy chain first constant region (CH1), and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab')2 antibodies are generated when cysteine residues in the hinge regions of two Fab's form disulfide bonds.
  • Fv refers to the smallest fragment of an antibody having only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the double-chain Fv (two-chain Fv) is a non-covalent bond between the heavy chain variable region and the light chain variable region
  • single-chain Fv (scFv) is generally a variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain through a peptide linker. Since the regions are linked by covalent bonds or directly linked at the C-terminus, a dimer-like structure such as double-chain Fv can be achieved.
  • antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields Fab, and digestion with pepsin yields F(ab')2 fragments), and gene It can also be produced through recombinant technology.
  • the antibody according to the invention is in the Fv form (eg scFv) or in the complete antibody form.
  • the heavy chain constant region may be any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3), or gamma 4 (IgG4).
  • the light chain constant region may be of kappa or lambda type.
  • Antibodies of the present invention include monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F(ab') fragments, disulfide-binding Fvs (sdFV) And an anti-idiotype (anti-Id) antibody, or an epitope-binding fragment of the antibodies, but is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention may be a human antibody sequence in which all amino acid sequences constituting the antibody are composed of human immunoglobulin sequences, and if necessary, humanized antibodies or chimeric antibodies according to methods well known in the art. It can be modified in various forms such as antibodies.
  • Antibody variable domain refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule comprising the amino acid sequence of the Complementarity Determining Region (CDR), and the Framework Region (FR).
  • CDR Complementarity Determining Region
  • FR Framework Region
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDR complementarity determining region
  • the present invention consists of a heavy chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 7, 13 and 19, a heavy chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8, 14 and 20, and SEQ ID NOs: 3, 9, 15 and 21
  • a heavy chain CDR3 selected from the group, SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 33 and 35
  • light chain CDR1 selected from the group consisting of, SEQ ID NOs: 5, 11, 17 and 31
  • Anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a selected light chain CDR2 and a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 23, 25, 27, 29, 32, 34 and 36 to provide.
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 6;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 9 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10
  • light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11 light chain CDR3 of SEQ ID NO: 12;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 14
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 15 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 17, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 18;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 22, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 23;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 24, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 25;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 26
  • light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11 light chain CDR3 of SEQ ID NO: 27;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 28, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 29;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 30, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 31, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 32;
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 33, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 34; or
  • Heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21 light chain CDR1 of SEQ ID NO: 35, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 11, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 36.
  • the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 37, 39, 41 or 43, or SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 light chain variable regions may be included.
  • FR “Skeletal regions” are variable domain residues other than CDR residues. Each variable domain typically has 4 FRs identified as FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the antibody is monovalent or bivalent, and includes single or double chains.
  • the binding affinity (K D ) of the antibody is in the range of 10 -8 M to 10 -12 M.
  • the binding affinity of the antibody is 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -10 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -11 M , 10 -9 M to 10 -11 M, 10 -10 M to 10 -11 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, or 10 -8 M to 10 -9 It is M.
  • “Phage display” is a technique for displaying a variant polypeptide as a fusion protein with at least a portion of an envelope protein on the surface of a phage, eg, fibrous phage particle.
  • the usefulness of phage display lies in the fact that it can quickly and efficiently classify sequences that bind to a target antigen with high affinity, targeting a large library of randomized protein variants. Displaying peptide and protein libraries on phage has been used to screen millions of polypeptides to identify polypeptides with specific binding properties.
  • Phage display technology has the advantage of being able to generate large antibody libraries with various sequences in a short time compared to conventional hybridoma and recombinant methods for producing antibodies with desired characteristics.
  • phage antibody libraries can generate antibodies even against toxic or low antigenic antigens.
  • Phage antibody libraries can also be used to generate and identify novel therapeutic antibodies.
  • a technique capable of identifying and isolating high affinity antibodies from phage display libraries is important for the separation of novel antibodies for treatment. Isolation of high affinity antibodies from a library can depend on the size of the library, the efficiency of production among bacterial cells and the diversity of the library.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof in which a part of the amino acid sequence is substituted through conservative substitution in the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is also included. Included.
  • “conservative substitution” refers to a modification of a polypeptide comprising the substitution of one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not cause loss of biological or biochemical function of the polypeptide.
  • “Conservative amino acid substitutions” are substitutions that replace amino acid residues with amino acid residues having similar side chains. Classes of amino acid residues with similar side chains are defined in the art and are well known. These classes are amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains (e.g.
  • glycine Asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • amino acids with non-polar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains Amino acids (eg threonine, valine, isoleucine) and amino acids having aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • Antibodies of the present invention may still retain activity even with conservative amino acid substitutions as described above.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding an anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • the nucleic acid used herein may exist in cells, cell lysates, or may exist in a partially purified or substantially pure form. Nucleic acids are prepared by standard techniques including alkali/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, agarose gel electrophoresis, and others well known in the art to obtain other cellular components or other contaminants, e.g. When purified from a nucleic acid or protein from another cell, it is “isolated” or “substantially pure”.
  • the nucleic acid of the present invention may be, for example, DNA or RNA, and may or may not contain an intron sequence.
  • a nucleotide which is a basic structural unit in a nucleic acid, includes not only natural nucleotides, but also analogs with modified sugar or base moieties.
  • the sequence of the nucleic acid encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention can be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the nucleic acid encoding the anti-B7-H3 antibody is the polynucleotide of SEQ ID NOs: 51, 53, 55, and 57 encoding the heavy chain variable region, and SEQ ID NOs: 52, 54 encoding the light chain variable region, It may include any one or more sequences selected from the group consisting of 56, and 58 to 64 polynucleotides.
  • the antibody of the present invention or a nucleic acid molecule encoding the same is interpreted to include a sequence exhibiting substantial identity with the sequence described in SEQ ID NO:
  • the above substantial identity is 90% or more homology when the sequence of the present invention and any other sequence are arranged to correspond as much as possible and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, Preferably, it means a sequence exhibiting 95% or more homology, more preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more homology.
  • sequence homology of the nucleic acid or protein of the present invention may be determined using a sequence comparison algorithm (eg, NCBI Basic Local Alignment Search Tool; BLAST), manual alignment, and visual inspection.
  • sequence comparison algorithm eg, NCBI Basic Local Alignment Search Tool; BLAST
  • the present invention relates to a recombinant expression vector comprising the nucleic acid.
  • DNA encoding the partial or full-length light and heavy chains is used in standard molecular biology techniques (e.g., PCR amplification or high CDNA cloning using bridoma), and DNA can be "operably linked" to transcription and translation control sequences and inserted into expression vectors.
  • Vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: signal sequence, origin of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and transcription termination sequences.
  • vector refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Cozmid vector; Viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors, and the like.
  • the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof is operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to the ligation of a gene encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof into a vector such that the transcriptional and translational control sequences in the vector have the intended function of regulating the transcription and translation of the antibody gene. It means to be.
  • the expression vector and expression control sequence are selected so as to be compatible with the cell for expression used.
  • the light and heavy chain genes of the antibody are inserted into separate vectors, or both genes are inserted into the same expression vector.
  • Antibody genes are inserted into the expression vector by standard methods (e.g., ligation of complementary restriction enzyme sites on antibody gene fragments and vectors, or blunt end ligation if no restriction enzyme sites are present).
  • the recombinant expression vector may contain a sequence encoding a signal peptide that facilitates secretion of the antibody chain from the transformed cell.
  • the antibody chain gene and signal peptide-encoding sequence can be cloned into a vector in frame so that the signal peptide is bound to the amino terminus of the antibody chain and expressed.
  • the signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal peptide derived from a protein other than an immunoglobulin).
  • the recombinant expression vector may include a regulatory sequence that controls the expression of the antibody chain gene in the transformed cell.
  • the “regulatory sequence” may include promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals) that control the transcription or translation of antibody chain genes.
  • promoters e.g., promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals) that control the transcription or translation of antibody chain genes.
  • expression control elements eg, polyadenylation signals
  • the design of the expression vector may vary by selecting different regulatory sequences according to factors such as selection of cells to be transformed and expression levels of proteins.
  • the vector of the invention may also contain other sequences to be fused to the antibody gene to facilitate purification of the antibody expressed from the vector.
  • This sequence may be, for example, a gene such as glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the vector includes an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, and such genes include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, and There are genes for resistance to tetracycline.
  • the present invention also provides a cell transformed with the recombinant expression vector.
  • Cells according to the present invention may be animal cells, plant cells, yeast, E. coli, insect cells, etc., but are not limited thereto.
  • the cells according to the present invention are E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis. ) Or it may be a prokaryotic cell such as Staphylococcus sp.
  • fungi such as Aspergillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp., and Neuro. It may be a lower eukaryotic cell such as Neurospora crassa, and a eukaryotic cell such as cells of higher eukaryotes (eg, insects).
  • the cells according to the present invention may be derived from plants or mammals.
  • COS-7 monkey kidney cells 7
  • BHK baby hamster kidney
  • CHO Choinese hamster ovary
  • CHOK1, DXB-11, DG-44 CHO/-DHFR
  • CV1, HEK293, BHK, TM4 VERO, HELA
  • MDCK BRL 3A
  • W138 Hep G2
  • SK-Hep MMT
  • TRI MRC 5, FS4, 3T3, RIN
  • HT1080 or the like may be used, but is not limited thereto.
  • COS7 cells Preferably, COS7 cells, NSO cells, SP2/0 cells, CHO cells, W138, BHK cells, MDCK, myeloma cell lines, HuT 78 cells and HEK293 cells, particularly preferably CHO cells can be used.
  • expression vectors suitable for eukaryotic cells include expression vectors derived from SV40, bovine papillomavirus, anenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus, and retrovirus, but are limited to these. It does not become.
  • Expression vectors that can be used in bacterial cells include E.
  • coli-derived bacterial plasmids such as pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof; Plasmids with a wider host range, such as RP4; phage DNA such as ⁇ gt10, ⁇ gt11, and various phage lambda derivatives such as NM989; And other DNA phages such as M13 and filamentous single-stranded DNA phage.
  • Expression vectors useful for yeast cells are the YEp plasmid and derivatives thereof.
  • a vector useful for insect cells is pVL941.
  • the vector is transfected or transfected into cells.
  • the present invention also includes (i) culturing the transformed cells; And (ii) recovering the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof from the obtained cell culture medium.
  • a recombinant expression vector capable of expressing the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof is introduced into a mammalian cell, a culture in which the cell is cultured for a period sufficient to allow the antibody to be expressed in the cell, or more preferably The antibody or antigen binding fragment thereof can be prepared by culturing the cells for a period sufficient to allow the antibody to be secreted into the medium.
  • the cells may be cultured in various media, and commercial media may be used without limitation as the culture media. All other essential supplements known to those skilled in the art may also be included in suitable concentrations. Suitable culture conditions, such as temperature, pH, etc., have already been used for protein expression in the selected host cells, which will be apparent to those skilled in the art.
  • the expressed antibody can be separated from the cell culture and purified uniformly. Isolation or purification of the antibody may be performed by a conventional protein separation and purification method, such as chromatography.
  • the chromatography may include, for example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or hydroxylapatite chromatography using a protein A column or a protein G column.
  • antibodies can be separated and purified by further combining filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like.
  • the present invention also provides an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof and a drug.
  • the antibody-drug conjugate requires that the anticancer drug is stably bound to the antibody before the anticancer drug is delivered to the target cancer cell.
  • the drug delivered to the target must be released from the antibody to induce the death of the target cell. For this, when the drug stably binds to the antibody and is released from the target cell, it must have sufficient cytotoxicity to induce the death of the target cell.
  • the drug may be bound to the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention as an agent exhibiting a pharmacological effect, and may be separated from the antibody or antigen-binding fragment thereof by acidic conditions, and exhibit a therapeutic effect on target cells.
  • the drug may be a cytotoxin, a radioactive isotope, an antiproliferative agent, a pro-apoptotic agent, a chemotherapeutic agent, and a therapeutic nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the antibody-drug conjugate can be internalized into cells and mediate antibody dependent cytotoxicity.
  • cytotoxic activity refers to a cell-killing, cell proliferation inhibitory or growth inhibitory effect of an antibody-drug conjugate or an intracellular metabolite of the antibody-drug conjugate. Cytotoxic activity can be expressed as an IC5O value, which is the concentration (molar or mass) per unit volume at which 1/2 of the cells survive.
  • cytotoxin generally refers to an agent that inhibits or prevents the function of cells and/or destroys cells.
  • Representative cytotoxins include antibiotics, inhibitors of tubulin polymerization, alkylating agents that bind to and destroy DNA, and agents that disrupt the function or protein synthesis of essential cellular proteins such as protein kinases, phosphatases, topoisomerases, enzymes and cyclins. do.
  • Examples of cytotoxins include taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, and etoposide.
  • the antibodies of the invention may contain high energy radioactive isotopes.
  • Such isotopes may be bound directly to the antibody, for example at cysteine residues present in the antibody, or chelates may be used to mediate the binding of the antibody to the radioactive isotope.
  • Radioactive isotopes suitable for radiotherapy include, but are not limited to, ⁇ -emitters, ⁇ -emitters and auger electrons.
  • Radioactive isotopes useful for diagnostic applications include positron emitters and ⁇ -emitters.
  • Antiproliferative and apoptosis promoters include PPAR-gamma (e.g., cyclopentenone prostaglandin (cyPGs)), retinoids, triterpinoids (e.g., cycloartan, lupan, uric acid, oleanane, priedelane, Dammaran, cucurbitacin and limonoid triterpenoid), inhibitors of EGF receptors (e.g., HER4), rapamycin, CALCITRIOL(1,25-dihydroxycholecalciferol (vitamin D)), Aromatase inhibitors (FEMARA (retrozone)), telomerase inhibitors, iron chelating agents (e.g.
  • PPAR-gamma e.g., cyclopentenone prostaglandin (cyPGs)
  • retinoids e.g., cycloartan, lupan, uric acid, oleanane
  • 3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone (triapine)), apoptin (viral protein 3) -VP3) from chicken anemia virus, inhibitors of Bcl-2 and Bcl-X(L), TNF-alpha, FAS ligand, TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/Apo2L), TNF-alpha/FAS ligand/TNF -Related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/Apo2L) activators of signaling, and inhibitors of PI3K-Akt survival pathway signaling (eg, UCN-01 and geldanamycin).
  • TRAIL/Apo2L TNF-alpha/FAS ligand/TNF -Related apoptosis-inducing ligand activators of signaling
  • inhibitors of PI3K-Akt survival pathway signaling eg, UCN-01 and
  • a “chemotherapeutic agent” is a chemical compound useful in the treatment of cancer, regardless of the mechanism of action.
  • Classes of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, alkylating agents, metabolic antagonists, spindle toxic plant alkaloids, cytotoxic/anti-tumor antibiotics, topoisomerase inhibitors, antibodies, photosensitizers, and kinase inhibitors.
  • Chemotherapeutic agents include compounds used in "targeted therapy” and traditional chemotherapy.
  • the conjugate can be prepared by a known method by combining a drug with an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Antibodies and drugs can be directly bonded through their own linking group or indirectly through linkers or other substances.
  • the main mechanisms by which drugs are cleaved from antibodies are hydrolysis of lysosomes (hydrazone, acetal and cis-aconitate-like amides) at acidic pH, peptide cleavage by lysosomal enzymes (cathepsin and other lysosomal enzymes) and disulfide. The reduction of is included.
  • the mechanisms for linking the drug to the antibody are very diverse and any suitable linker can be used.
  • Suitable linking groups for binding the antibody and drug are well known in the art, and include, for example, disulfide groups, thioether groups, acid degradable groups, photodegradable groups, peptidase degradable groups, and esterase degradable groups.
  • the linking group may include, for example, a disulfide bond using an SH group or a bond via maleimide.
  • the intramolecular disulfide bond of the antibody Fc region and the disulfide bond of the drug are reduced, and both are linked by a disulfide bond.
  • Antibodies and drugs can also be indirectly bound through other substances (linkers). It is preferable that the linker has one or two or more functional groups that react with antibodies, drugs, or both. Examples of the functional group include an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, a maleimide group, and a pyridinyl group.
  • the present invention also provides a multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Multispecific antibody refers to an antibody capable of binding to two or more different kinds of antigens (target proteins), and is a form produced by genetic engineering or any method.
  • Multi-specific antibodies include bi-specific antibodies, tri-specific antibodies or tetra-specific antibodies.
  • the multispecific antibody is preferably in a form in which the anti-B7-H3 antibody according to the present invention is bound to an antibody or fragment thereof having the ability to bind to an immunogenic cell-specific target molecule.
  • the immunogenic cell-specific target molecule is preferably selected from TCR/CD3, CD16 (Fc ⁇ RIIIa) CD44, CD56, CD69, CD64 (Fc ⁇ RI), CD89 and CD11b/CD18 (CR3), but is not limited thereto.
  • the multispecific antibody is preferably in a form in which the anti-B7-H3 antibody according to the present invention is bound to an antibody or fragment thereof having the ability to bind to cytokines that stimulate or inhibit immunity.
  • the cytokine that stimulates or inhibits immunity is preferably selected from, for example, IL-2, IL-6, IL-7, IFN ⁇ , GM-CSF, IL-10, and TGF- ⁇ , but is not limited thereto. .
  • Multispecific antibodies are targets for which the anti-B7-H3 antibody according to the present invention is used in cancer treatment, for example, PD-1, PD-L1, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF receptor, and other growth factor receptors. , CD20, CD40, CTLA-4, TIGIT, TIM-3, LAG-3, OX-40, 4-IBB, and preferably in a form combined with an antibody or fragment thereof having binding ability to ICOS, but limited thereto no.
  • Antibodies belonging to multispecific antibodies can be classified into scFv-based antibodies, Fab-based antibodies, and IgG-based antibodies.
  • a bispecific antibody since it can suppress or amplify two signals at the same time, it can be more effective than the case of suppressing/amplifying one signal. Compared with the case of treating each signal with each signal inhibitor, Low-dose dosing is possible and can suppress/amplify two signals at the same time and space.
  • bispecific antibodies are well known. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy/light chain pairs under conditions where the two heavy chains have different specificities.
  • a hybrid scFv can be prepared in a heterodimer form by combining VL and VH of different scFvs with each other to make a diabody, and different scFvs can be mixed with each other.
  • a tandem ScFv can be prepared by linking, and a heterodimeric miniantibody can be prepared by expressing the CH1 and CL of Fab at the ends of each scFv, and the homodimeric domain of Fc By substituting some amino acids of the CH3 domain into a heterodimeric structure in the form of a'knob into hole', the modified CH3 domains are expressed at different ends of each scFv to prepare a heterodimeric scFv type minibody can do.
  • Fab' against a specific antigen can be combined with each other using a disulfide bond or a mediator to form a heterodimeric Fab, and the end of the heavy or light chain of a specific Fab
  • scFvs for different antigens, it can be prepared to have two antigen-binding valencies or four antigen-binding valencies in a homodimeric form by placing a hinge region between the Fab and the scFv.
  • a dual target bibody having three antigen-binding values by fusing scFvs for different antigens to the light and heavy chain ends of the Fab, a dual target bibody having three antigen-binding values, and by fusing different scFvs to the light and heavy chain ends of the Fab, respectively. It can be prepared in the form of a triple target bibody having three binding values for each, and can be obtained by chemically conjugating three different Fabs.
  • an IgG-based bispecific antibody a method of producing a bispecific antibody by producing a hybrid hybridoma, aka quadromas, by re-crossing a mouse and rat hybridoma is known.
  • a bispecific antibody can be prepared in the form of a so-called'Holes and Knob' produced in a heterodimer form by modifying some amino acids of the CH3 homodimeric domain of Fc for different heavy chains while sharing the light chain portion. have. It is also possible to prepare homodimeric forms of (scFv)4-IgG by fusion-expressing two different scFvs to a constant domain instead of the variable domains of the light and heavy chains of IgG.
  • the present invention also includes the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, or the multispecific antibody or antibody-drug conjugate comprising the same as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable additive, cancer or tumor, autoimmune It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases or inflammatory diseases.
  • the cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease may be related to the expression or overexpression of B7-H3.
  • cancer and “tumor” are used substantially the same meaning, and typically refer to or mean a physiological condition of a mammal characterized by uncontrolled cell growth and proliferation.
  • Prevention refers to any action of inhibiting or delaying the progression of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease by administration of the composition according to the present invention
  • treatment refers to inhibiting the development of cancer or tumor, cancer or tumor It means alleviation or elimination of, suppression, alleviation or elimination of autoimmune diseases or inflammatory diseases.
  • Cancer or carcinoma that can be treated with the composition of the present invention is not particularly limited, and includes both solid cancer and blood cancer.
  • cancers include skin cancer such as melanoma, liver cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, pancreatic cancer, uterus.
  • Cervical cancer brain cancer, prostate cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, rectal cancer, head and neck cancer, cervical cancer, ureter cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma Sarcoma, astrocytoma, glioblastoma (glioblastoma), neuroblastoma (neuroblastoma), glioma, and may be selected from the group consisting of other tumors (eg, small round blue cell tumors of childhood), but is not limited thereto.
  • other tumors eg, small round blue cell tumors of childhood
  • the cancer or tumor is characterized in that the B7-H3 protein is expressed, and prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, melanoma, glioblastoma, nerve It may be characterized in that it is selected from the group consisting of blastoma and other tumors (eg, small round blue cell tumors of childhood).
  • the cancer may be a primary cancer or a metastatic cancer.
  • the autoimmune disease or inflammatory disease may be asthma, rheumatoid arthritis, or multiple sclerosis, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of an anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, together with a pharmaceutically acceptable additive.
  • pharmaceutically acceptable additives are substances that can be added to the active ingredient to help formulate or stabilize the pharmaceutical composition and do not cause significant toxic effects to the patient.
  • the additive refers to a carrier or diluent that does not irritate the patient and does not impair the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers for compositions formulated as liquid solutions are sterilized and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and A mixture of these may be used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like, pills, capsules, granules, or tablets.
  • compositions include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for preparing sterile injectable solutions or dispersions for immediate administration (extemporaneous).
  • the composition is preferably formulated for parenteral injection.
  • the composition may be formulated as a solution, microemulsion, liposome, or other customized formulation suitable for high drug concentration.
  • the carrier can be, for example, a solvent or dispersion medium containing water, ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof.
  • isotonic agents such as sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride, may be included in the composition.
  • Each formulation can be prepared using methods well known in the pharmaceutical field.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, but may be changed according to various factors including the patient's health status and weight, the severity of the disease, the type of drug, the route of administration, and the administration time.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention can be administered in a single or multiple doses per day into mammals, including humans, rats, mice, livestock, etc. through various routes, typically accepted oral or parenteral routes. Can be administered.
  • the oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intranasal, inhalation, intraocular, intrapulmonary or intradermal routes may be administered in a conventional manner, but are limited thereto. no.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to a patient as a bolus or by continuous infusion, if necessary.
  • the bolus administration of the antigen-binding fragment of the anti-B7-H3 antibody of the present invention represented by the Fab fragment is 0.0025 to 100 mg/kg body weight, 0.025 to 0.25 mg/kg, 0.010 to 0.10 mg/kg or 0.10 To 0.50 mg/kg.
  • the antigen-binding fragment of the anti-B7-H3 antibody of the present invention represented by the Fab fragment is 0.001 to 100 mg/kg body weight/min, 0.0125 to 1.25 mg/kg/min, 0.010 to 0.75 mg/kg/ Min, 0.010 to 1.0 mg/kg/min or 0.10 to 0.50 mg/kg/min for 1 hour to 24 hours, 1 hour to 12 hours, 2 hours to 12 hours, 6 hours to 12 hours, 2 hours to 8 hours, Or can be administered over a period of 1 to 2 hours.
  • the dosage is about 1 to 10 mg/kg body weight, 2 to 8 mg/kg, 3 to 7 mg/kg, or 4 to 6 mg May be /kg.
  • Full-length anti-B7-H3 antibodies are typically administered via infusion lasting a period of 30 to 35 minutes.
  • the frequency of administration depends on the severity of the condition. The frequency can range from 3 times per week to once every 1 or 2 weeks.
  • the present invention also provides a therapeutically effective amount of the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof or the multispecific antibody or antibody-drug conjugate in need of prevention or treatment of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease. It relates to a method of preventing or treating cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease, comprising administering to a patient.
  • the prevention or treatment method may further include the step of identifying a patient in need of prevention or treatment of the disease prior to the administration step.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof in combination with other conventional anticancer therapeutic agents, it is possible to effectively target tumor cells expressing B7-H3 and increase anti-tumor T cell activity to increase the immune response.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be used with other anti-neoplastic or immunogenic agents, such as weakened cancer cells, tumor antigens (including recombinant proteins, peptides and carbohydrate molecules), antigen-transferring cells (e.g.
  • the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention, and a pharmaceutical composition comprising the same may be administered simultaneously with or sequentially with an existing anticancer therapeutic agent.
  • the present invention also provides a composition for diagnosis of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease comprising the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody-drug conjugate, or the multispecific antibody, and the disease using the same Provides a diagnostic method of
  • the expression level of B7-H3 in a sample through the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody-drug conjugate, or the multispecific antibody according to the present invention cancer or tumor, autoimmune disease or Inflammatory diseases can be diagnosed.
  • the expression level can be measured according to a conventional immunoassay method, and radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), and capture using an antibody against B7-H3 -ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunoaffinity purification may be used to measure, but is not limited thereto.
  • a normal biological sample eg, normal gastric tissue, blood, plasma, or serum
  • the present invention also provides a diagnostic kit comprising the diagnostic composition.
  • the kit according to the present invention may include an anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention, or an antibody-drug conjugate or multispecific antibody comprising the same, and a label generating a detectable signal.
  • the label is a chemical substance (e.g., biotin) bound to an antibody, an enzyme (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase or cytochrome P450), a radioactive substance (e.g., C14, I125, P32 and S35), a fluorescent material (eg, fluorescein), a luminescent material, a chemiluminescent material, and a fluorescence resonance energy transfer (FRET), but are not limited thereto.
  • an enzyme alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase or cytochrome P450
  • a radioactive substance e.g., C14, I125, P32 and S35
  • a fluorescent material eg, fluorescein
  • luminescent material e.g, chemiluminescent material
  • FRET fluorescence resonance energy
  • the substrate for the enzyme is bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • naphthol-AS-B1-phosphate naphthol-
  • ECF enhanced chemifluorescence
  • horse radish peroxidase chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin ( Bis-N-methylacridinium nitrate), resorupine benzyl ether, luminol, Amplex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine),
  • Cancer or tumor autoimmune disease or inflammatory disease can be diagnosed by analyzing the intensity of a signal indicated by the reaction between the sample and the antibody. Measurement of the activity or signal of an enzyme used for diagnosis can be performed according to various methods known in the art, through which B7-H3 expression can be analyzed qualitatively or quantitatively.
  • Example 1-1 B7-H3 protein expression vector construction
  • Example 1-2 Expression and purification of B7-H3 antigen
  • Transfection was performed using PEI (polyethylenimine, 23966, Polysciences) under optimized conditions.
  • Human HEK293F cells were inoculated into a medium (#Freestyle 293 AGT type; AG100009P1, Thermo.) as much as 5 ⁇ 10 5 cells per ml, and cultured until 1 ⁇ 10 6 cells/ml.
  • a medium #Freestyle 293 AGT type; AG100009P1, Thermo.
  • Soytone #212488, DIFCO
  • the expressed B7-H3-Fc antigens were sequentially purified using protein A agarose and Superdex 200 (1.5 cm*100 cm) gel filtration chromatography. Each antigen-producing culture medium was centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes to remove cell debris, and filtered using a bottle top filter having a pore size of 0.22 ⁇ m. To perform purification, 3 ml of Ni-NTA resin (#30230, QIAGEN,) was added to an empty column, and then the resin was packed with 20 ml of binding buffer (10 mM imidazole). The culture solution filtered through the packed resin was flowed at a gravity-flow rate so as to bind to the resin at a rate of 0.2 ml per minute.
  • the obtained E. coli was cultured at 30°C for 16 hours.
  • the culture medium was centrifuged to concentrate the supernatant with polyethylene glycol (PEG), and then dissolved in a phosphate buffered saline (PBS) buffer to prepare human antibody library phage.
  • PEG polyethylene glycol
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 2-2 The library phage obtained in Example 2-2 was put in the immunosorbent tube prepared in Example 2-1, reacted for 2 hours at room temperature, washed with 1x PBST and 1x PBS, and then 100 mM TAE and Tris-HCl (pH7.5 ) The solutions were sequentially treated to elute only scFv-phages specifically bound to the antigen.
  • a pool of positive phage is obtained, and the number of times in the PBST (PBS + tween-20) washing step is increased with the phage amplified in the first round of panning.
  • round 2 and round 3 panning were performed in the same manner. As a result, as shown in Table 2, it was confirmed that the number of phages bound to the antigen was slightly increased in 3 rounds of panning.
  • Example 2-4 Polyphage ELISA
  • Poly phage ELISA was performed to examine the antigen specificity of the positive poly scFv-phage antibody pool obtained through panning of each round.
  • Immuno-plate coated with antigens B7-H3-His (Sino) and B7-H3-His (in house), respectively, and coated with ITGA6-Fc protein used as an indicator of nonspecific binding ELISA was performed simultaneously with the phage pool obtained in each round using the prepared immuno-plate.
  • As a negative control for ELISA #38, an M13 phage in which the antibody was not displayed, was used together.
  • Example 2-5 Positive phage selection
  • Example 2-6 Base sequence analysis of positive phage antibody
  • phagemid DNA was isolated using a DNA purification kit (Qiagen, Germany) and sequenced. As a result of analyzing the sequence of the CDR3 regions of the heavy and light chains, the clones as shown in Table 3 were identified.
  • amino acid sequences of the heavy and light chain CDRs and variable regions are as described in Tables 4 and 5.
  • sequences of the polynucleotides encoding the heavy and light chain variable regions are shown in Table 6 below.
  • Example 3-1 Conversion of scFv form to IgG form (conversion)
  • the base sequence of the heavy chain variable region was cloned into pNATVH (Y-Biologics) using the restriction enzyme SfiI/NheI site, and the N293F HC vector was Then, the base sequence of the light chain variable region was cloned into pNATVL (Y-Biologics) using the restriction enzyme SfiI/BglII site to prepare an N293F LC vector.
  • Example 3-2 Human antibody production and purification
  • the N293F HC and N293F LC vectors were co-transfected into HEK293F cells (co-transfection), and the culture solution was collected on the 7th day of culture, centrifugation and 0.22 ⁇ m Top-filter to remove cells and suspended matter, and then the supernatant was removed. Collected and purified by protein A beads (protein A bead). The purity of the anti-B7-H3 antibody was analyzed using SDS-PAGE (Fig. 4).
  • the culture medium was centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes to remove cell debris, and filtered using a bottle top filter (Sterritop-GP Filter Unit. #SCGPS01RE, Millipore) having a pore size of 0.22 ⁇ m. Meanwhile, 4 ml of Protein A Sepharose resin slurry (KANEKA KanCapATM, Cat. No. KKC20170403_01) was added to an empty column (#BR731-1550, Bio-rad), and then 100 ml of DPBS (#LB001-02) was used. Was packed and washed. The filtered medium was loaded on the packed resin and flowed at a rate of 1 ml per minute (#EP-1 Econo pump, Bio-Rad).
  • the gel was separated from the tank, soaked in a dyeing buffer, and dyed on a stirrer for 1 hr. Thereafter, the dyeing solution was discarded and decolorized while stirring with the decolorizing solution for about 1 hour, and the decolorizing solution was exchanged once more to decolorize again. After the gel after decolorization was washed with distilled water, the image was stored using an imaging equipment.
  • Example 4-1 Specific avidity to human B7-H3 expressed on the cell surface (FACs)
  • Each of the cells expressing human B7-H3 was prepared to be 0.5 ⁇ 10 6 cells per sample, and the antibodies were each diluted in a constant multiple, and then reacted with the prepared cells at 4° C. for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed three times with PBS (#LB001-02, welgene) containing 2% fetal bovine serum, and an anti-human IgG antibody (#LB001-02, welgene) conjugated with FITC (fluorescein isothiocyanate) fluorescent substance (# FI-3000, Vectorlabs) or PE-anti-hIgG antibody (#555787, BD) was used to react at 4° C. for 20 minutes, followed by washing as described above.
  • PBS #LB001-02, welgene
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE-anti-hIgG antibody #555787, BD
  • An Octet QK instrument (Fortebio Inc.) was used to measure the binding affinity of the antibody to the B7-H3 antigen based on the principle of biolayer interferometry (BLI).
  • the selected anti-B7-H3 antibody was immobilized on an AHC (Anti-Human IgG Fc Capture) biosensor (Fortebio Inc.), and affinity (KD) was obtained by binding to the human B7-H3 antigen prepared by concentration thereto. .
  • Kinetic buffer (Fortebio Inc.) was used for all buffers.
  • the biosensor was immersed in a buffer to stabilize, and the anti-B7-H3 antibody dissolved in the buffer at a concentration of 10 ⁇ g/ml was reacted for about 5 minutes, and then fixed to the AHC biosensor.
  • the biosensor was washed with a buffer for 3-5 minutes to remove unimmobilized antibodies, and a binding reaction was performed with the B7-H3 antigen prepared by concentration (30 nM ⁇ 0.24 nM) for 10 minutes, and then a dissociation reaction was performed for 10 minutes. I did. All experiments were performed at 30° C. and 1,000 rpm, and sensorgram data during binding and dissociation over time were collected.
  • KD Equilibrium dissociation constant
  • a TMB substrate solution (#T0440-1L, Sigma) was added and reacted at room temperature for at least 3 minutes while blocking the light to confirm color development, and a 1-normal sulfuric acid solution (#S1478, Samchun) was added to stop the reaction.
  • the absorbance was measured at 450 nm using a spectrophotometer (#GM3000, Promega or SpectraMaxM5, Molecular devices). It was confirmed that the selected single B7-H3 antibody has a concentration-related binding ability not only to the human B7-H3 antigen, but also to the mouse, rat, and cynomolgus monkey B7-H3 antigen (FIGS. 7A to 7E ).
  • Example 4-5 Adhesion by pH to FcRN (ELISA)
  • Calu-6 cell line 1ml growth medium (RPMI1640(#A10491-01, Gibco), 10% FBS(#26140-079, Gibco), 1X Antibiotic-Antimycotic(#15240-062, Gibco), 100x MEM NEAA(#11140) -050, Gibco)), diluted to 1, 2, or 4x10 5 , and then added 50 ⁇ l to each well of a 96-well plate (#3595, Corning) and incubated in a 37°C CO 2 incubator for 24 hours or longer.
  • A498 cell line 1ml growth medium (DMEM (#SH30243.01, HyclonTM), 10% FBS (#26140-079, Gibco), 1X Antibiotic-Antimycotic (#15240-062, Gibco), 100x MEM NEAA (#11140- 050, Gibco)) to 1, 2, or 4x10 4 , and then put 50 ⁇ l into each well of a 96-well plate (#3595, Corning) and incubated in a 37°C CO 2 incubator for 24 hours or longer.
  • DMEM DMEM
  • FBS fetal bovine serum
  • 1X Antibiotic-Antimycotic #15240-062, Gibco
  • 100x MEM NEAA #11140- 050, Gibco
  • the antibody to be tested and IncuCyte TM FabFluor Red (# 4722, essen bioscience) were mixed at a molar ratio of 1:3 and allowed to stand at 37°C for 15 minutes, and 50 ⁇ l was carefully added to the well containing the cells.
  • the plate was placed in a CO 2 incubator equipped with IncuCyte ZOOM (essen bioscience, USA) and internalization was observed.
  • the scanning conditions were measured at 100 or 200 times magnification for 24 hours at 30 minute intervals, but 4 images were scanned for each well by time.
  • the scanned image was edited in the IncuCyte ZOOM 2016B program, and analyzed using the One phase association function of the Non-linear fit of Graphpad PRISM (Fig.
  • Incucyte FabFlour Red reagent has a characteristic that it does not fluoresce at neutral pH and emits red fluorescence as acidic pH increases. After binding of the cell surface B7-H3 antigen and the antibody, it enters the cell through the endosome, and when it is fused to the lysosome, it is exposed to an acidic pH ( ⁇ 4.7) environment, thus emitting strong red fluorescence.
  • red cells increased with time inside the cells (Red object count/well or Total Red Object Area, um2/well). From this, it can be seen that B7-H3 on the cell surface is a target for influx of antibodies into cells, and influx of anti-B7-H3 antibodies into cells increases with time.
  • Example 4-7 Influx of B7-H3 antigen-antibody complex into cells (FabZAP)
  • the influx of the antibody into the cells was confirmed as a cytotoxic effect.
  • Saporin as a ribosome inhibitor, causes cytotoxicity when introduced into cells and released.
  • the FabZAP protein to which saporin is conjugated was diluted to 45 nM in a growth medium, and the antibody was diluted at a constant magnification with this solution, and then allowed to stand at room temperature for 15 minutes to react to conjugate Saporin.
  • Saporin to be used as a negative control was prepared by making a 10 uM solution and then serially diluted at a constant rate, and another negative control, Control-SAP, was prepared by preparing a 100 nM solution and then diluted at a constant rate.
  • the A498 renal cancer cell line was diluted with growth medium and plated on a 96-well culture plate at 1 ⁇ 10e3/well, and cultured in a 37°C CO 2 incubator for 16 hours or longer.
  • 50 ul of the XTT substrate solution prepared in PBS was added to each well and reacted in a CO2 incubator at 37° C.
  • the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof binds human and non-human B7-H3 with high affinity and can be introduced into cells after binding, so that the anti-B7-H3 antibody or antigen-binding fragment thereof Fragments, antibody-drug conjugates or multispecific antibodies comprising the same may be usefully used in the prevention or treatment of cancer or tumor, autoimmune disease or inflammatory disease, or diagnosis.

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Abstract

본 발명은 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항-B7-H3 항체 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (Antibody-drug conjugate) 또는 다중 특이적 항체, 이를 포함하는 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 및 비-인간 B7-H3에 높은 친화력으로 결합하며 결합 후 세포 내로 유입될 수 있으므로, 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료, 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

B7-H3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
본 발명은 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항-B7-H3 항체 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (Antibody-drug conjugate) 또는 다중 특이적 항체, 이를 포함하는 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
우리의 면역 시스템은 자가 항원(self-antigen)에 대한 내성을 유지하면서 침입 병원체(pathogen)를 효과적으로 제거할 수 있도록 미세 조율되고 있다. 이 중 T 림프구(T lymphocyte)는 종양세포를 제거할 수 있는 주요한 세포(Effector cell)이다.
면역관문분자(Immune checkpoint)들은 T 림프구 활성에 중추적인 역할을 하는 공동신호분자로서 TCR(T cell receptor) 신호를 억제(inhibitory)하거나 상승(stimulatory) 되도록 조절한다(Immunological reviews 2017, 276:52-65).
일부 종양 세포는 면역 감시(immune surveillance)를 회피하는 일환으로 억제를 담당하는 면역관문분자의 리간드 단백질을 세포표면에 발현하여 T 림프구의 기능을 저해하고 종양미세환경(tumor micro-environment)의 변화를 초래하여 면역을 억제시킨다. 성공적인 종양 면역 요법으로 대표적인 것이 억제면역관문분자인 CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4)와 PD-1(programmed death-1), 이에 상응하는 항원제시세포 및 종양세포 리간드로 B7 패밀리(family) 분자인 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86)와 B7-H1/PD-L1(programmed death-ligand-1)에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody) 저해제(blockade)이다(N Engl J Med. 2011, 364(26): 2517-2526; N Engl J Med., 2012, 366(26)2455-2465; 및 N Engl J Med. 2013, 369(2): 134-144).
B7-H3(B7 Homologue 3, 또는 CD276(Cluster of Differentiation 276))는 B7 패밀리 멤버로서 B7.1(CD80), B7.2(CD86), B7-H1(PD-L1), B7-DC(PD-L2), B7-H2(ICOSL), B7-H4(B7S1, B7x, Vtcn1), B7-H5(VISTA, GI24, Dies1, PD-1H), B7-H6(NCR3LG1) 및 B7-H7(HHLA2)와 20-30%의 구조적 상동성을 가지고 있으며(Blood 2013, 121(5): 734-744; 및 Molecular Cancer Therapeutics 2017, 16(7): 1203-1211), 다양한 생물학적 기능을 가진 계통적으로 보존된 단백질이다. 처음 발견되었던 2001년에는 공동자극분자 리간드로 소개되었으나(Nature Immunology 2001, 2(3): 269274), 최근까지 연구 결과들을 통해 재조명된 바는 활성화된 T 세포 혹은 NK 세포 상에서 발현되는 어떤 면역억제 수용체에 대한 리간드로 결합체가 형성되면 항원 수용체 시그날링을 부정적으로 조절할 수 있다는 것이며(Eur J Immunol. 2009, 39(7): 1754-1764 외 다수) 아직 결합파트너는 밝혀지지 않았다.
B7-H3 mRNA는 다양한 정상조직에서 발견되지만 단백질은 거의 발현되어 있지 않다. 면역 활성 신호가 주어지면 단구세포(monocyte), 대식세포(Macrophage)나 수지상 세포(Dendritic cell) 등에서 단백질 발현이 유도되지만 다양한 고형암종에서는 과발현 되어 있으며, 전립선(prostate)암, 난소(ovarian)암, 유방(breast)암, 결장(colon)암, 신장(renal)암, 비소세포폐(non-small cell lung)암, 췌장(pancreatic)암, 두경부(head and neck)암, 흑색종(melanoma), glioblastoma(아교모세포종), 및경 모세포종(neuroblastoma), 기타 종양(예, small round blue cell tumors of childhood) 등에서 발현이 관찰되었다. 인간 B7-H3는 4Ig-B7-H3(IgV-IgC-IgV-IgC)가 주요한 형태이고 2Ig-B7-H3가 약간 발견되며 Murine에서는 2Ig-B7-H3 형태이다. 그러나 두 형태 모두 유사한 기능을 보인다(Genome Biol. 2005, 6:233.1-233.7; PNAS 2008, 105(30):10277-10278). 4Ig-B7-H3는 자연살해세포(Natural killer cell)의 항종양작용을 억제할 수 있다(PNAS 2004, 101(34): 12640-12645). B7-H3 저해 신호는 TCR 신호전달에 관여하는 분자들(NF-kB, AP-1, NFAT 등)과의 상호작용을 통해서 이루어질 것으로 짐작되고, 동물실험에서 Th1(helper T cell), Th2 또는 Th17을 저해하는 것으로 관찰되었다(J. Immunol. 2004, 173:2500-2506; Immunol. Rev. 2009, 229(1):145-151).
B7-H3는 단백질 발현이 정상세포에서는 매우 제한적이나 원발성(primary) 및 전이성(metastatic) 종양뿐만 아니라 종양 혈관계(tumor vasculature)에서 현저히 증가되어 있고, 분화된(differentiated) 종양 세포, 종양 개시(initiating) 또는 암 줄기(cancer stem) 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서 발견되는데(Medicographia 2014, 36(2): 285-292; 및 Cancer cell 2017, 31:501-515), 그 발현은 일부 종양 유형에서 나쁜 예후와 깊은 상관성이 있다.
B7-H3에 대한 단클론 항체를 포함한 다양한 변형항체들의 개발 과정에서 유망한 치료적 효능이 얻어지고 있고 임상 개발이 진행되고 있다(Medicographia 2014, 36(2): 285-292).
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 인간 B7-H3 뿐만 아니라 비인간(Non-human)(예: cynomolgus 원숭이, mouse, rat 등) B7-H3에도 친화력을 가지고 특이적으로 결합하는 항-B7-H3 항체를 개발하였고, 이 항체가 세포 표면 B7-H3에 결합한 후 세포내로 유입됨으로써 목적하는 면역항암제 또는 자가면역질환이나 염증 질환의 치료제로서의 역할을 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 7, 13 및 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2, 8, 14 및 20으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 3, 9, 15 및 21로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3, 서열번호 4, 10, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 33 및 35로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5, 11, 17 및 31로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6, 12, 18, 23, 25, 27, 29, 32, 34 및 36으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계 및 (ii) 얻어진 세포 배양액으로부터 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 유효성분으로서 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체 또는 상기 다중특이적 항체 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 진단 방법을 제공한다.
도 1은 B7-H3 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 패닝 횟수에 따른 폴리 scFV-파지의 B7-H3 항원에 대한 결합능 측정 결과이다.
도 3은 모노 scFV-파지의 B7-H3-His 특이적 결합능을 확인한 ELISA 측정 결과이다.
도 4는 선별된 B7-H3 항체를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 5는 세포주별로 B7-H3 발현율을 측정한 FACs 결과이다.
도 6a 내지 6d는 선별된 B7-H3 항체의 세포표면 B7-H3에 대한 결합력을 FACs로 측정한 결과로서, 도 6a는 CD276-033E03 항체의 세포주별 결합력 측정 결과, 6b는 CD276-051H04 항체의 세포주별 결합력 측정 결과, 6c는 CD276-039C05 및 CD276-040F10 항체들의 세포주별 결합력 측정 결과, 6d는 6개 항체들의 세포주별 결합력 측정 결과를 각각 나타낸다.
도 7a 내지 7e는 선별된 B7-H3 항체의 여러 종의 B7-H3 항원과의 결합력을 측정한 ELISA 결과이다.
도 8은 선별된 B7-H3 항체들과 FcRn 복합체 단백질의 결합력을 측정한 ELISA 결과이다.
도 9a 및 9b는 선별된 B7-H3 항체와 세포표면 B7-H3 항원의 복합체의 세포내 유입을 측정한 결과로서, 도 9a는 선별된 B7-H3 항체의 시간에 따른 세포내 유입을 확인한 결과이고, 도 9b는 18시간째에 항체의 세포내 유입 정도를 측정한 결과이다.
도 10은 선별된 B7-H3 항체가 세포내로 유입되어 일으킨 세포독성 측정 결과이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 항원으로 작용하는 B7-H3 단백질은 면역 세포의 활성 억제와 밀접한 관련이 있으며, 면역 세포의 표면에 존재하는 막 단백질로서, 면역 세포의 보조 억제 수용체로서 작용한다. 상기 B7-H3은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 랫트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "B7-H3"는 세포에 의해 천연적으로 발현되는, B7-H3의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 총칭하는 개념이다. 바람직하게는 인간의 B7-H3를 의미하지만, 이에 한정되지 않고, 다른 포유류 동물의 B7-H3를 포함하는 개념일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 65로 표시되는 인간 B7-H3 protein의 아미노산 서열 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어, "항체(antibody)"는 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항-B7-H3 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 B7-H3에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 “항원 결합 단편” 또는 “항체 단편”이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등의 형태일 수 있다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로서 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 두 개의 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머(dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중 어느 하나의 이소타입일 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린 서열로 구성되어 있는 인간 항체 서열일 수 있으며, 필요에 따라, 당 분야에 잘 알려진 방법에 따라 인간화 항체, 키메라 항체 등의 다양한 형태로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (Complementarity Determining Region; CDR), 및 골격 영역 (Framework Region; FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역” (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명은 서열번호 1, 7, 13 및 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2, 8, 14 및 20으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 3, 9, 15 및 21로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3, 서열번호 4, 10, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 33 및 35로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5, 11, 17 및 31로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6, 12, 18, 23, 25, 27, 29, 32, 34 및 36으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3;
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3;
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 23의 경쇄 CDR3;
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 24의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3;
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 26의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 경쇄 CDR3;
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 29의 경쇄 CDR3;
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 30의 경쇄 CDR1, 서열번호 31의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 32의 경쇄 CDR3;
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 33의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 35의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 36의 경쇄 CDR3를 포함한다.
또한, 본 발명의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 37, 39, 41 또는 43의 중쇄 가변영역을 포함하거나, 서열번호 38, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 37의 중쇄 가변영역 및 서열번호 38의 경쇄 가변영역; 서열번호 39의 중쇄 가변영역 및 서열번호 40의 경쇄 가변영역; 서열번호 41의 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 44의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 45의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 47의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 48의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 49의 경쇄 가변영역; 또는 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 50의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR들을 가진다.
상기 항체는 1가 또는 2가이고, 단쇄 또는 이중쇄를 포함한다. 기능적으로, 상기 항체의 결합 친화도(KD)은 10-8M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화도는 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-10 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 또는 10-8 M 내지 10-9 M이다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수도 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다.
본 발명의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편에는 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서 보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 그의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 명세서에서 “보존적 치환”이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. “보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이다. 본 발명의 항체는 상기와 같은 보존적 아미노산 치환을 가지더라도 여전히 활성을 보유할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 해당 기술분야에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 “단리”되거나 “실질적으로 순수하게 된” 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-B7-H3 항체를 코딩하는 핵산은 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 51, 53, 55, 및 57의 폴리뉴클레오티드, 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 52, 54, 56, 및 58 내지 64의 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변형들을 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬(alignment)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(예: NCBI Basic Local Alignment Search Tool; BLAST), 수동 정렬, 육안 검사 등을 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어, PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 “작동되도록 연결”되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터 성분에는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “작동적으로 연결”은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 세포와 상용성이 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다.
경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 항체 사슬 유전자 및 신호 펩티드-코딩 서열은 신호 펩티드가 항체 사슬의 아미노 말단에 결합되어 발현되도록 프레임에 맞게 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 형질전환된 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절서열을 포함할 수 있다. “조절서열”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 형질전환시킬 세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 벡터로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 항체 유전자에 융합시킬 다른 서열을 포함할 수 있다. 이 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA), 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등의 유전자일 수 있다.
상기 벡터는 선택 표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 이러한 유전자로는 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명에 따른 세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는 본 발명에 따른 세포는 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등의 하등진핵 세포, 및 고등 진핵생물(예: 곤충)의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포는 식물이나 포유동물로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, COS-7(monkey kidney cells 7), BHK(baby hamster kidney), CHO(Chinese hamster ovary), CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS0, U20S, 또는 HT1080 등이 이용 가능하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 COS7 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, CHO 세포, W138, BHK 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 특히 바람직하게는 CHO 세포가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항-B7-H3 항체를 발현시키기 위해 다양한 세포/벡터 조합이 이용될 수 있다. 구체적으로, 진핵 세포에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 세균 세포에 사용할 수 있는 발현 벡터로는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같은 대장균(E. coli)-유래 세균성 플라스미드; RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드; λgt10, λgt11, 및 NM989와 같은 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체 등의 파지 DNA; 및 M13과 필라멘트성 단일가닥 DNA 파지와 같은 기타 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 YEp 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
상기 벡터는 세포에 형질주입 또는 트랜스펙션(transfection)된다. “형질주입” 또는 “트랜스펙션”을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 얻어진 세포 배양액에서 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다. 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 포유류 세포 내로 도입될 경우, 세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 세포를 배양함으로써 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조할 수 있다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있으며, 배양 배지로는 시판용 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 선별된 숙주세포에서 단백질 발현을 위해 적합한 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
경우에 따라서, 발현된 항체를 세포 배양액으로부터 분리하여 균일하게 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질 분리 및 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 히드록실아파타이트 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
항체-약물 접합체는 타겟 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 타겟으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 타겟 세포의 사멸을 유도해야 한다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 타겟 세포에서 유리될 때는 타겟 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.
상기 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 분리될 수 있으며, 표적 세포에 대한 치료 효과를 나타내는 화합물을 의미한다. 상기 약물은 세포독소(cytotoxin), 방사성 동위원소, 항증식제, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent), 화학요법제 및 치료용 핵산이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체-약물 접합체는 세포로 내재화될 수 있으며, 항체 의존성 세포독성을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포독성 활성"은 항체-약물 접합체 또는 항체-약물 접합체의 세포 내 대사물질의 세포-사멸, 세포증식 억제 또는 성장 억제 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 1/2의 세포가 생존하는 단위 부피당 농도(몰 또는 질량)인 IC5O 값으로서 표현될 수 있다.
용어 “세포독소”란 일반적으로 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포를 파괴하는 제제를 말한다. 대표적인 세포독소에는 항생제, 튜불린 중합 억제제, DNA에 결합하여 이를 파괴하는 알킬화제, 및 단백질 키나제, 포스파타제, 토포아이소머라제, 효소 및 사이클린과 같은 필수적인 세포 단백질의 기능 또는 단백질 합성을 파괴하는 제제가 포함된다. 세포독소의 예는 택솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시안트라신디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라노롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
방사선요법 적용을 위해, 본 발명의 항체는 고 에너지 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 당해 동위원소는 예를 들면, 항체 내에 존재하는 시스테인 잔기에서 항체에 직접적으로 결합될 수 있거나, 또는 킬레이트를 사용하여 항체와 방사성 동위원소의 결합을 매개할 수 있다. 방사선요법에 적합한 방사성 동위원소에는, α-방출기, β-방출기 및 오제 전자(auger electron)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 진단상 적용에 유용한 방사성 동위원소에는 양전자방출기 및 γ-방출기가 포함된다.
항증식제 및 아폽토시스 촉진제에는 PPAR-감마(예를 들면, 사이클로펜테논 프로스타글란딘(cyPGs)), 레티노이드, 트리테르피노이드(예를 들면, 사이클로아르탄, 루판, 우르산, 올레아난, 프리에델란, 담마란, 쿠쿠르비타신 및 리모노이드 트리테르페노이드), EGF 수용체의 억제제(예를 들면, HER4), 라파마이신, CALCITRIOL　(1,25-디하이드록시콜레칼시페롤(비타민 D)), 아로마타제 억제제(FEMARA　(레트로존)), 텔로머라제 억제제, 철킬레이트제(예를 들면, 3-아미노피리딘-2-카복스알데하이드 티오세미카르바존(트리아핀)), 아폽틴(바이러스 단백질 3-닭 빈혈 바이러스로부터의 VP3), Bcl-2 및 Bcl-X(L)의 억제제, TNF-알파, FAS 리간드, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L), TNF-알파/FAS 리간드/TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L) 신호전달의 활성화제, 및 PI3K-Akt 생존 경로 신호전달의 억제제(예를 들면, UCN-01 및 겔다나마이신)가 포함된다.
"화학요법제"는 작용의 메커니즘과는 관계없이, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 부류는 알킬화제, 대사길항물질, 방추체 독성 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 국소이성화효소 억제물질, 항체, 감광제, 그리고 키나아제 억제물질을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 화학요법제는 "표적화된 요법" 및 전통적인 화학요법에 이용되는 화합물을 포함한다.
상기 접합체는 약물을 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 결합시켜 공지된 방법으로 제작할 수 있다. 항체와 약물은 그들 자신이 가진 연결기 등을 통해 직접 결합할 수도 있고, 링커나 다른 물질을 통해 간접적으로 결합할 수도 있다. 약물이 항체로부터 절단되도록 하는 주요 기전에는 리소좀(히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드)의 산성 pH에서의 가수분해, 리소좀 효소(카텝신 및 기타 리소좀 효소)에 의한 펩타이드 절단 및 디설파이드의 환원이 포함된다. 이러한 다양한 절단 기전의 결과로서, 약물을 항체에 연결시키는 기전은 매우 다양하며 어떠한 적합한 링커라도 사용될 수 있다.
항체와 약물이 결합하기 위한 적절한 연결기는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이황화 기, 티오에테르 기, 산분해성 기, 광분해성 기, 펩티다제 분해성 기 및 에스테라아제 분해성 기를 포함한다.
약물이 직접 결합될 경우 연결기(linking group)는 예로서는, SH기를 이용한 이황화결합이나 말레이미드를 매개로 하는 결합을 들 수 있다. 예를 들면, 항체 Fc영역의 분자 내 이황화결합과 약물의 이황화결합을 환원하여, 양자를 이황화결합으로 연결한다. 또한, 말레이미드를 통하는 방법 및 항체 내에 시스테인을 유전공학적으로 도입하는 방법도 있다.
항체와 약물을 다른 물질(링커)을 통해 간접적으로 결합시킬 수도 있다. 링커로는 항체, 약물 또는 모두와 반응하는 작용기를 1 또는 2종류 이상 가지는 것이 바람직하다. 작용기의 예로는 아미노기, 카르복실기, 머캡토기, 말레이미드기, 피리디닐기 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체를 제공한다. 다중특이적 항체는 서로 다른 두 종류 이상의 항원 (표적 단백질)에 결합할 수 있는 항체를 의미하고, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태이다. 다중특이적(multi-specific) 항체는 이중특이적(bi-specific) 항체, 삼중특이적(tri-specific) 항체 또는 사중특이적(tetra-specific) 항체를 포함한다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체가 면역효능세포-특이적 표적분자에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하다. 면역효능세포-특이적 표적 분자는 TCR/CD3, CD16(FcγRIIIa) CD44, CD56, CD69, CD64(FcγRI), CD89 및 CD11b/CD18(CR3)에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체가 면역을 자극하거나 저해시키는 사이토킨에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하다. 면역을 자극하거나 저해시키는 사이토킨은 예를 들면, IL-2, IL-6, IL-7, IFNα, GM-CSF, IL-10, 및 TGF-β에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체가 암 치료에 사용되고 있는 타겟, 예를 들면, PD-1, PD-L1, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, TIGIT, TIM-3, LAG-3, OX-40, 4-IBB 및 ICOS에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 이종이량체(heterodimer) 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 탠덤(tendem) ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 이종이량체성 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 동종이량체성 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 이종이량체 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 이종이량체성 scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.
Fab를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 이종이량체성 Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 동종이량체 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody) 및 Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디 형채로 제조할 수 있고, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시켜도 수득할 수 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 마우스와 랫트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄 부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 동종이량체성 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 이종이량체 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수도 있다. 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 불변(constant) 도메인에 각각 융합 발현시켜 동종이량체 형태의 (scFv)4-IgG를 제조할 수도 있다.
본 발명은 또한 유효성분으로 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 상기 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 B7-H3의 발현 또는 과발현과 관련된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “암”과 “종양”은 실질적으로 동일한 의미로 사용되며, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장 및 증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 또는 종양의 발전 억제, 암 또는 종양의 경감 또는 제거, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 억제, 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 이러한 암의 예는 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 비소세포폐암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 아교모세포종(glioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 신경교종 및 기타 종양(예, small round blue cell tumors of childhood)으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 바람직하게, 상기 암 또는 종양은 B7-H3 단백질이 발현된 것을 특징으로 하며, 전립선암, 난소암, 유방암, 결장암, 신장암, 비소세포폐암, 췌장암, 두경부암, 흑색종, 아교모세포종, 신경모세포종 및 기타 종양(예, small round blue cell tumors of childhood)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자가면역 질환(autoimmune disease) 또는 염증성 질환(inflammatory disease)은 천식(asthma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 치료적 유효량의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 함께 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함한다. "약학적으로 허용되는 첨가제"는 약학적 조성물을 제제화하거나 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 첨가제는 환자를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제 등을 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 제형으로 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 각 제제는 약제학 분야에 잘 알려진 방법들을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 하루에 1회 또는 다회 용량으로 인간, 쥐(rat), 마우스(mouse), 가축, 등을 포함하는 포유동물 내로 전형적으로 허용된 경구 또는 비경구 경로의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 구강, 직장내, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비내, 흡입, 안구내, 폐내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 대표되는 본 발명의 항-B7-H3 항체의 항원 결합 단편의 볼루스 투여는 0.0025 내지 100 mg/kg 체중, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, Fab 단편으로 대표되는 본 발명의 항-B7-H3 항체의 항원 결합 단편은 0.001 내지 100 mg/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/분, 0.010 내지 0.75 mg/kg/분, 0.010 내지 1.0 mg/kg/분 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg/분으로 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 12시간, 6시간 내지 12시간, 2시간 내지 8시간, 또는 1시간 내지 2시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 본 발명의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 경우, 투여량은 약 1 내지 10 mg/kg 체중, 2 내지 8 mg/kg, 3 내지 7 mg/kg, 또는 4 내지 6 mg/kg일 수 있다. 전장 항-B7-H3 항체는 전형적으로 30분 내지 35분의 기간 동안 지속되는 주입을 통해 투여한다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주당 3회 내지 매 1주 또는 2주 마다 1회의 범위일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 상기 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체의 치료적 유효량을 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 예방 또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 종래의 다른 항암 치료제와 병용함으로써 B7-H3을 발현하는 종양 세포를 효과적으로 표적화하고, 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제, 예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포(예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포), 면역 자극 사이토킨(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토킨을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포; 표준 암 치료요법, 예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술; 또는 기타 항체, 예를 들면, PD-1, PD-L1, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS에 대한 항체와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 약학 조성물은 기존의 항암 치료제와 동시에 투여되거나, 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 상기 질환의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 상기 항체-약물 접합체, 또는 상기 다중특이적 항체를 통해 시료에서의 B7-H3 발현 수준을 측정함으로써 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 B7-H3에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 결과, 생물학적 시료에서의 B7-H3 단백질 발현이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 높게 나오는 경우에는 상기 질환들로 진단될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체 및 검출가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있다. 상기 레이블은 항체에 결합된 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent), 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널의 세기를 분석하여 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 진단할 수 있다. 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이를 통해 B7-H3 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: B7-H3 항원 발현 및 정제
실시예 1-1: B7-H3 단백질 발현 벡터 제작
B7-H3의 세포 외 도메인(extracellular domain)만을 클로닝하기 위해, Jurkat 세포 cDNA 라이브러리(Stratagene, 미국) 및 5'과 3'에 제한효소 SfiI 사이트가 포함된 B7-H3에 대한 프라이머 쌍(표 1)을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물과 N293F 벡터를 이용하여 B7-H3의 세포 외 도메인의 카복시-말단에 8x His, 인간 Fc, 또는 마우스 Fc가 융합된 단백질을 각각 발현하는 발현벡터들을 제작하였다(도 1).
Figure PCTKR2020008928-appb-T000001
실시예 1-2: B7-H3 항원의 발현 및 정제
형질감염(transfection)은 최적화된 조건에서 PEI(polyethylenimine, 23966, Polysciences)를 이용하여 수행하였다. 인간 HEK293F 세포를 ml당 5x105 세포만큼 배지(#Freestyle 293 AGT type; AG100009P1, Thermo.)에 접종하고 1x106 세포/ml이 될 때까지 배양하였다. 실시예 1-1에서 얻은 각 발현벡터와 PEI를 섞어 폴리플렉스(polyplex)를 형성하게 한 후, 상기 세포에 첨가하여 형질전환시킨 다음 소이톤(Soytone; #212488, DIFCO) 5 g/L를 첨가한 후 6일을 더 배양하였다. 발현된 B7-H3-Fc 항원들을 protein A agarose 및 Superdex 200(1.5 cm*100 cm) 젤 여과 크로마토그래피를 순차적으로 이용하여 정제하였다. 각 항원 생산 배양액을 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하고, 0.22 μm 공극 크기의 보틀 탑 필터를 이용하여 여과하였다. 정제를 수행하기 위해, 빈 칼럼에 3 ml의 Ni-NTA 레진(#30230, QIAGEN,)을 넣은 후 20 ml의 결합 버퍼(10 mM imidazole)로 레진을 패킹하였다. 패킹된 레진에 여과된 배양액을 분당 0.2 ml의 속도로 레진에 결합되도록 중력 유속(gravity-flow)으로 흘려주었다. 100 ml의 세척 버퍼(20 mM Imidazole)로 세척을 수행한 후 용출 버퍼(250 mM imidazole)로 용출하였다. 용출 버퍼로 얻은 용출액을 투석(dialysis)을 통하여 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 버퍼 교환하였다(1 L, 3회). 단백질의 농도는 나노-드롭(Nano-drop)으로 측정하였다. SDS-PAGE와 크기 배제 크로마토그래피(#TSK-GEL G-3000 SWXL Size-exclusion chromatography (SEC), Tosoh)를 이용하여 각 단백질을 정제하고 순도를 확인하였으며, 순도는 모두 95% 이상이었다.
실시예 2: B7-H3 인간 항체의 선별
실시예 2-1: 항원 준비
실시예 1에서 제조한 B7-H3-His와 Sino Biological Inc.에서 구입한 B7-H3-his(#11188-H08H) 및 B7-H3-Fc(#11188-H02H) 항원 각 50 μg을 면역흡착튜브(Immunosorb tube)에 코팅한 후 블로킹 (blocking)을 수행하였다.
실시예 2-2: 인간항체 라이브러리 파지 준비
2.7x1010의 다양성을 가진 인간 scFv 라이브러리 파지((주)와이바이오로직스)를 대장균에 감염시킨 후, 얻어진 대장균을 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층액을 PEG(polyethylene glycol)로 농축한 다음, 이를 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액에 녹여 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.
실시예 2-3: 바이오패닝
실시예 2-1에서 준비된 면역흡착튜브에 실시예 2-2에서 얻은 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 다음, 1x PBST와 1x PBS로 세척 후, 100 mM TAE와 Tris-HCl(pH7.5) 용액을 차례로 처리하여 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만을 용출시켰다. 용출된 파지를 다시 대장균에 감염시켜 증폭시키는 패닝과정을 통해 양성 파지의 풀(pool)을 얻고, 첫 번째 라운드의 패닝에서 증폭된 파지를 가지고 PBST(PBS + tween-20) 세척 단계에서 횟수만 늘리고, 나머지는 동일한 방법으로 2라운드와 3라운드 패닝을 수행하였다. 그 결과, 표 2와 같이 3라운드 패닝에서 항원에 결합한 파지 수가 다소 증가였음을 확인하였다.
Figure PCTKR2020008928-appb-T000002
실시예 2-4: 폴리 파지 ELISA
각 라운드의 패닝을 통해 얻어진 양성 poly scFv-파지 항체 pool의 항원 특이성을 알아보기 위해 폴리 파지 ELISA를 수행하였다. 항원인 B7-H3-His(Sino)와 B7-H3-His(in house)로 각각 코팅한 면역-플레이트(immuno-plate)와 비특이적 결합(nonspecific binding)의 지표로 사용된 ITGA6-Fc 단백질로 코팅된 면역-플레이트를 이용하여 각 라운드에서 얻어진 파지 pool로 동시에 ELISA를 수행하였다. ELISA의 음성 대조군(negative control)으로 항체가 디스플레이 되지 않은 M13 파지인 #38을 같이 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, B7-H3-His 항원에 대한 결합능이 2라운드 패닝의 양성 파지 pool에서부터 증가하므로, 항-B7-H3 파지 항체가 성공적으로 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 2-5: 양성 파지 선별
폴리 파지 ELISA에서 결합능이 큰 것으로 확인된 3라운드 패닝의 양성 파지 풀로부터 수천여 개의 모노 클론들을 선별하였고, 이들을 96-딥웰 플레이트(96-deep well plate)에서 헬퍼 파지를 감염하여 배양한 다음, 상층액에 존재하는 모노 scFv-파지를 B7-H3 항원이 코팅된 면역-플레이트에 옮겨 ELISA를 수행하였다. 이 때, B7-H3-His(Sino) 또는 B7-H3-His(in house)에 대한 모노 파지 ELISA와 비특이적 항원 대조군인 ITGA6-Fc 단백질에 대한 ELISA를 동시에 수행하여, 얻어진 양성 파지 클론이 B7-H3에 특이적인지를 확인하였다.
그 결과, 도 3에서와 같이 모노 scFv-파지 클론들은 B7-H3-His에만 결합능이 강함을 확인하였으며, 수십 종의 예비 항체 클론이 선별되었다. 한편, 특성분석으로 선별된 CD276-039C05 클론의 친화도 증가 패닝을 시도하여 우수한 항체 클론들을 추가로 확보하였다.
실시예 2-6: 양성 파지 항체의 염기서열 분석
선별된 단일 클론에 대해 DNA 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 파지미드(phagemid) DNA를 분리하고 염기서열을 분석하였다. 중쇄와 경쇄의 CDR3 부위 서열을 분석한 결과, 표 3과 같은 클론으로 확인되었다.
Figure PCTKR2020008928-appb-T000003
한편, 중쇄 및 경쇄의 CDR 및 가변영역의 아미노산 서열들은 표 4 및 5에 기재된 바와 같다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 하기 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2020008928-appb-T000004
Figure PCTKR2020008928-appb-I000001
Figure PCTKR2020008928-appb-T000005
Figure PCTKR2020008928-appb-I000002
Figure PCTKR2020008928-appb-T000006
실시예 3: B7-H3 인간 항체의 생산
실시예 3-1: scFv 형태를 IgG 형태로 전환 (conversion)
실시예 2에서 선별된 단일클론 파지 항체를 scFv 형태에서 IgG 형태로 전환하기 위해, 중쇄 가변 영역의 염기서열을 제한효소 SfiI/NheI 사이트를 이용하여 pNATVH(Y-Biologics)에 클로닝하여 N293F HC 벡터를 제조하였고, 경쇄 가변 영역의 염기서열을 제한 효소 SfiI/BglII 사이트를 이용하여 pNATVL(Y-Biologics)에 클로닝하여 N293F LC 벡터를 제조하였다.
실시예 3-2: 인간 항체 생산 및 정제
N293F HC와 N293F LC 벡터를 HEK293F 세포에 동시 형질감염(co-transfection)시키고, 배양 7일차에 배양액을 수거하여 원심분리 및 0.22 ㎛ Top-필터 여과를 통해 세포와 부유물질을 제거한 후, 상층액을 모아 단백질 A 비드 (protein A bead)로 정제하였다. 항-B7-H3 항체의 순도는 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다(도 4).
(1) 단백질 A 크로마토그래피
배양액을 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하고 0.22 μm 공극 크기의 보틀 탑 필터 (bottle top filter: Steritop-GP Filter Unit. #SCGPS01RE, Millipore)를 이용하여 여과하였다. 한편, 빈 칼럼(#BR731-1550, Bio-rad)에 4 ml의 단백질 A 세파로스 레진 슬러리 (KANEKA KanCapA™, Cat. No. KKC20170403_01)를 넣은 후 100 ml의 DPBS(#LB001-02)로 레진을 패킹 및 세척하였다. 패킹된 레진에 여과된 배지를 로딩하고 1분당 1 ml의 속도로 흘려 주었다(#EP-1 Econo pump, Bio-Rad). 150 ml의 DPBS로 세척한 후, 10 ml의 0.1 M 글라이신(glycine)-HCl (pH 3.3)로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl (pH 9.0)을 10% 첨가하여 pH를 중화시키고, Amicon Ultra-10(#UFC901096, Millipore)를 이용하여 DPBS로 버퍼를 바꾸어 주었다. 이 과정을 약 3회 실시한 후 1 ml 정도로 농축되었을 때 멈추고, Nano-drop으로 농도를 측정하였다.
(2) SDS-PAGE
정제가 끝난 단백질의 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 정제 단백질 샘플 3 μg을 환원 샘플 버퍼 및 비환원 샘플 버퍼 5μl와 각각 혼합하여 100℃에서 3 분 동안 보일링 (boiling)하였다. 러닝 탱크 (Running tank, #165-8027, Bio-Rad)에 12% 겔을 장착하고 1x 러닝 버퍼를 겔 안쪽에 가득 채우고, 바깥쪽은 1/3가량 채워 준비된 샘플을 피펫을 이용하여 버블이 들어가지 않게 웰에 로딩하였다. AccuBand Prestained Protein Marker 4 μl를 맨 왼쪽 웰에 로딩하였다. 겔 챔버의 윗 덮개를 장착하고 전원을 연결시켜 200V, 1 hr 조건으로 러닝하였다. 한 시간 후에 탱크에서 겔을 분리하여 염색 버퍼에 잠길 정도로 해서 1 hr 교반기 위에서 염색하였다. 이 후, 염색액을 버리고, 탈색액으로 1시간가량 교반하면서 탈색하고, 탈색액을 한 번 더 교환하여 다시 탈색을 시켰다. 탈색이 끝난 겔을 증류수로 세척한 후 이미지 장비를 이용하여 이미지를 저장하였다.
(3) Western Blotting
(2)에서와 같이 SDS-PAGE를 1 시간 동안 러닝시킨 후, 탱크에서 겔을 분리하여 NC 막을 겔 밑에 두고 카세트를 고정시켜 트랜스퍼 탱크(#165-8027, Bio-Rad)에 넣고, 그 안에 트랜스퍼 버퍼를 채운 다음 110V로 2시간 가량 러닝하였다. 트랜스퍼가 다되었다고 예상되면 트랜스퍼를 중지하고 NC 막을 꺼내어 블로킹 용액(1% Skim milk/PBS)으로 상온에서 1 시간동안 블로킹하였다. 그런 다음, 2차 항체인 항hFc-HRP(#31413, Thermo)와 항His-HRP(#A7058, Sigma)를 블로킹용액에 1:4000이 되도록 희석한 후 NC 막에 넣어주고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. NC 막을 1x PBST로 10 ml씩 5회 세척하였다. 그 후 NC 막에 ECL 용액(#16024, Intron)을 흩뿌린 다음, Chemi Doc(UVITEC, mini HD)을 감지하는데, 노출 시간을 1 초, 30 초, 1 분으로 하여 잘 나온 이미지를 선택하여 저장하였다.
실시예 4: B7-H3 단일 클론 항체의 특성
실시예 4-1: 세포 표면에 발현된 인간 B7-H3에 대한 특이적 결합력 (FACs)
인간 B7-H3를 발현하는 세포 각각을 시료당 0.5x106 세포가 되도록 준비하고, 항체를 각각 일정한 배수로 희석한 후 준비된 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 2% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 PBS(#LB001-02, welgene)로 3회 세척하고, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(#FI-3000, Vectorlabs) 또는 PE-anti-hIgG 항체(#555787, BD)를 사용하여 4℃에서 20분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 세포를 0.5 ml의 2% FBS(#26140-079, Thermo)가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences, 미국)을 사용하여 결합력을 분석하였다. 그 결과 B7-H3 항체가 농도 의존적으로 세포 표면에 발현된 B7-H3에 결합하였고 B7-H3가 발현되지 않는 Raji 세포, 거의 발현되지 않는 Jurkat 세포, 및 shRNA(GIPZ humanCD276 shRNA transfection starter kit, #V3LHS_306029, Thermo)를 통해 B7-H3를 Knock-down시킨 HEK293E/KD 세포주에는 결합하지 않았음을 Geometric mean 값을 통해 확인하였다(도 6a 내지 6d, 및 하기 표 7). 각 세포주들의 B7-H3의 발현 여부는 PE 형광물질이 결합된 항 인간 CD276 항체(#331606, Biolegend)를 사용하여 측정하였다(도 5).
Figure PCTKR2020008928-appb-T000007
실시예 4-2: 항 B7-H3 항체의 열안정성
시차 주사 형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry)을 이용하여 항체의 열안정성을 테스트하였다. 항체 단백질을 DPBS에 희석하여 3 μM, 45 μl를 만들고, 200x sypro orange dye(#S6650, Thermo) 5 μl와 섞어서 qPCR 튜브(#TLS0851-white, Bio-Rad)에 50 μl씩 분주하고 뚜껑(#TCS0803, Bio-Rad)을 닫았다. Biorad CFX96 실시간 PCR 기기를 사용하여 qPCR을 실시하였다. qPCR은 25℃에서 30초간 반응시킨 후, 99℃까지 0.5℃씩 증가시키되 각 온도에서 0.5분간 반응시키고, 마지막으로 25℃에서 10초간 반응시켜 마무리하였다. 항체 구조가 풀리는 속도 상수로는 Melt Tm(용융 온도)을 사용하였다. 그 결과는 아래 표 8과 같다.
Figure PCTKR2020008928-appb-T000008
실시예 4-3: B7-H3 항원에 대한 친화도 (OCTET)
Octet QK 기기(Fortebio Inc.)를 사용하여 BLI(biolayer interferometry) 원리를 바탕으로 하여 B7-H3 항원에 대한 항체의 결합친화도를 측정하였다. AHC(Anti-Human IgG Fc Capture) 바이오센서(Fortebio Inc.)에 선별된 항-B7-H3 항체를 고정시키고, 여기에 농도별로 준비한 인간 B7-H3 항원을 결합시켜서 친화도(KD)를 구하였다. 모든 완충액은 키네틱 버퍼(Kinetic Buffer; Fortebio Inc.)를 사용하였다. 먼저, 바이오센서를 완충액에 담가 안정시키고, 완충액에 10 μg/ml 농도로 녹인 항-B7-H3 항체를 5분 정도 반응시켜서 AHC 바이오센서에 고정하였다. 바이오센서를 완충액으로 3-5분 세척하여 고정되지 않은 항체를 제거하고, 농도별(30 nM ~ 0.24 nM)로 준비한 B7-H3 항원과 10분간 결합 반응을 수행한 다음, 10분간 해리 반응을 수행하였다. 모든 실험은 30℃, 1,000 rpm 조건에서 수행하였고, 시간에 따른 결합과 해리 과정 중의 센소그램(sensorgram) 데이터를 수집하였다. Octet 데이터 분석 소프트웨어 9.0에 따라 1:1 global binding fitting model을 적용해 평형 해리상수(KD)를 구하였다. 그 결과 KD 값은 0.04~2.0 nM로 B7-H3 항원에 대해 높은 친화도를 보였다. 그 결과는 아래 표 9와 같다.
Figure PCTKR2020008928-appb-T000009
실시예 4-4: B7-H3 항원에 대한 결합력 (ELISA)
His tag된 B7-H3를 PierceTM Nickel Coated Plates(#15142, pierce)의 well에 넣고 상온에서 1시간동안 코팅하거나 Fc tag된 B7-H3를 Immune plate(#439454, Thermo)의 well에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. Mouse B7-H3(#50973-M08H, Sino), rat B7-H3(#80380-R08H, Sino), cynomolgus B7-H3(#90806-C08H, Sino), 그리고 Human B7-H3(#S1435, Ybiologics)를 항원으로 사용하였다. 세척액(0.05% tween-20(#P9416, Sigma-Aldrich)이 들어있는 PBS)으로 3회 세척한 후, 조건에 따라 블로킹 용액인 4% skim milk(#232120, Becton, Dickinson and Company)/PBS 300 μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하여 비특이 결합을 차단하였다. 일정 희석 배수로 연속 희석된 항체를 넣어주고 상온에서 1시간 동안 Rocking하며 반응시켰다. 동일한 방법으로 세척하고 HRP가 결합되어 있는 항 인간 Kappa 항체(#A7164, Sigma)를 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 세척액으로 5회 세척한 후 TMB 기질 용액 (#T0440-1L, Sigma)을 넣고 차광하며 상온에서 3분 이상 반응시켜 발색을 확인하였고 1노르말 황산 용액(#S1478, Samchun)을 넣어 반응을 중단시켰다. 분광 광도계(#GM3000, Promega 또는 SpectraMaxM5, Molecular devices)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 선별된 단일 B7-H3 항체는 인간 B7-H3 항원뿐만 아니라 쥐, 랫트, 그리고 cynomolgus 원숭이 B7-H3 항원에 대해서도 농도 상관적인 결합력을 가지고 있음을 확인하였다(도 7a 내지 7e).
실시예 4-5: FcRN에 대한 pH별 결합력 (ELISA)
FCGRT & B2M Heterodimer 단백질(#CT009-H08H, Sino)에 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin(#15508, Thermo)을 사용하여 Biotin을 접합시킨 후 0.5 mg/mL 이 되도록 준비하고, Ovalbumin(#A5503, Sigma)로 blocking된 Pierce™ NeutrAvidin™ Coated High Capacity Plate의 각 Well에 100 ul씩 넣고 실온에서 2시간 rocking하면서 코팅하였다. 각 Well을 pH 6.0과 pH7.2가 되도록 적정된 Sodium phosphate 용액으로 3회 세척한 후, 각 용액에 일정 배수로 희석된 항체를 각 Well에 100 ul씩 넣고 실온에서 1시간동안 rocking하며 반응시켰다. 각 용액으로 3회 세척한 후, 1:5000으로 희석된 Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L)(#109-036-003, Jackson)을 Well당 100 ul씩 넣고 실온에서 1시간 rocking 하며 반응시켰다. pH 6.0 Sodium phosphate 용액으로 3회 세척하고 TMB 기질을 넣어 차광하며 반응시키다가 색변화가 관찰되면 0.5 M/L 황산 용액으로 반응을 중지시켰다. GlomaxTM Discover system(#GM3000, Promega)에서 450nm 흡광도를 측정하였다. 항-B7-H3 항체는 pH6.0에서만 농도 구배 의존적으로 FcRN-B2M 복합체에 결합하였고 pH7.2에서는 결합하지 않음을 확인하였다(도 8).
실시예 4-6: B7-H3 항원-항체 복합체의 세포 내로의 유입 (Incucyte)
Calu-6 세포주를 1ml 성장배지(RPMI1640(#A10491-01, Gibco), 10% FBS(#26140-079, Gibco), 1X Antibiotic-Antimycotic(#15240-062, Gibco), 100x MEM NEAA(#11140-050, Gibco))에 1, 2, 또는 4x105개가 되도록 희석한 후 96-well plate(#3595, Corning)의 각 well에 50 μl씩 넣어주고 24시간 이상 37℃ CO2배양기에서 배양하였다. A498 세포주는 1ml 성장배지(DMEM (#SH30243.01, Hyclon™), 10% FBS(#26140-079, Gibco), 1X Antibiotic-Antimycotic(#15240-062, Gibco), 100x MEM NEAA(#11140-050, Gibco))에 1,2, 또는 4x104개가 되도록 희석한 후 96-well plate(#3595, Corning)의 각 well에 50 μl씩 넣어주고 24시간 이상 37℃ CO2배양기에서 배양하였다. 한편, 테스트할 항체와 IncuCyteTM FabFluor Red(# 4722, essen bioscience)를 1:3 몰비가 되도록 섞고 37℃에서 15분간 방치한 후, 50 μl를 세포가 들어있는 well에 조심스럽게 첨가하였다. IncuCyte ZOOM(essen bioscience, USA)이 장착되어 있는 CO2 배양기에 plate를 넣고 Internalization을 관찰하였다. 스캔 조건으로 30분 간격으로 24시간 동안 100 또는 200배 배율에서 측정하되 시간 별로 각 well 당 4군데의 이미지를 스캔하였다. 스캔된 이미지는 IncuCyte ZOOM 2016B 프로그램에서 편집하였고 Graphpad PRISM의 Non-linear fit중 One phase association function을 사용하여 분석하였다(도 9a). 또는 24시간이상 배양한 후 GlomaxTM Discover system(#GM3000, Promega)에서 형광필터(Exitation-627nm, Emission-660~720nm)에서 적색 형광 세기를 측정하였다(도 9b). Incucyte FabFlour Red 시약은 중성 pH에서는 형광을 띠지 못하고 산성 pH가 될수록 적색 형광이 발산되는 특징이 있다. 세포 표면 B7-H3 항원과 항체가 결합한 후 엔도좀을 통해 세포 내로 유입되고 라이소좀에 융합되면 산성 pH(~4.7) 환경에 노출되기 때문에 강력한 적색 형광이 발산된다. 항-B7-H3 항체 처리 후 시간이 흐름에 따라 세포 안쪽에서 적색을 띠는 세포들이 늘어가는 것을 확인할 수 있었다(Red object count/well 혹은 Total Red Object Area, um2/well). 이로부터, 세포 표면의 B7-H3가 항체의 세포 내 유입을 위한 타겟임과 항-B7-H3 항체의 세포내 유입이 시간에 따라 증가함을 알 수 있다.
실시예 4-7: B7-H3 항원-항체 복합체의 세포 내로의 유입 (FabZAP)
Advanced Targeting System사의 FabZAP antibody internalization kit(#IT-51)를 사용하여 항체의 세포내 유입을 세포독성효능으로 확인하였다. Saporin은 라이보좀 저해제로서 세포로 유입되어 방출되면 세포독성을 일으킨다. Saporin이 접합되어 있는 FabZAP 단백질을 성장배지에 45 nM로 희석하고 이 용액으로 항체를 일정배율로 희석한 후 상온에서 15분간 방치하여 Saporin이 접합되도록 반응시켰다. 음성대조군으로 사용할 Saporin은 10 uM 용액으로 만든 후 일정배율로 연속 희석하여 준비하였고, 또 다른 음성대조군인 Control-SAP은 100 nM 용액으로 제조한 후 일정배율로 희석하여 준비하였다. 각 물질들을 처리하기 전날 A498 신장암 세포주를 성장배지로 희석하여 1x10e3/well 로 96-well culture plate에 plating 하여 16시간 이상 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 항체와 각 물질들을 처리하고 72시간 후에 PBS로 제조된 XTT 기질용액을 각 Well당 50 ul씩 넣고 37℃ CO2 배양기에서 2시간 반응시킨 후 GloMaxTM Discover System를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Saporin 물질은 세포막을 투과할 수 없기 때문에 세포독성이 나타나지 않았고, 특이적 항원결합이 없는 control-SAP 은 세포 생장에 아무런 영향을 주지 않았다. 이에 반해, FabZAP이 접합된 항-B7-H3 항체는 항체농도가 증가할수록 세포독성효과도 증가함을 확인하였다. 이는 A498 세포주 표면에 발현되어 있는 B7-H3에 결합한 항-B7-H3 항체가 세포 내로 들어갔고 라이소좀에서 방출된 Saporin에 의해 세포독성이 발생하였음을 보여준다(도 10).
본 발명에 따른 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 및 비-인간 B7-H3에 높은 친화력으로 결합하며 결합 후 세포 내로 유입될 수 있으므로, 상기 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 또는 다중특이적 항체는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료, 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (16)

  1. 서열번호 1, 7, 13 및 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄(heavy chain) CDR(Complementarity Determining Region)1,
    서열번호 2, 8, 14 및 20으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2,
    서열번호 3, 9, 15 및 21로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3,
    서열번호 4, 10, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 33 및 35로 구성된 군에서 선택되는 경쇄(light chain) CDR1,
    서열번호 5, 11, 17 및 31로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 6, 12, 18, 23, 25, 27, 29, 32, 34 및 36으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3;
    서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3;
    서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2, 서열번호 15의 중쇄 CDR3, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 23의 경쇄 CDR3;
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 24의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3;
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 26의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 27의 경쇄 CDR3;
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 28의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 29의 경쇄 CDR3;
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 30의 경쇄 CDR1, 서열번호 31의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 32의 경쇄 CDR3;
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 33의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3; 또는
    서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2, 서열번호 21의 중쇄 CDR3, 서열번호 35의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 36의 경쇄 CDR3를 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 37, 39, 41 또는 43의 중쇄 가변영역을 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 38, 40, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 경쇄 가변영역을 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  6. 제5항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  7. 제6항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  8. 제7항에 있어서, 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제7항에 있어서, COS-7(monkey kidney cells 7) 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, CHO(Chinese hamster ovary) 세포, W138, BHK(baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichiapastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  10. (i) 제7항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 얻어진 세포 배양액으로부터 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC).
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체.
  13. 유효성분으로서 제1항의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 제11항의 항체-약물 접합체 또는 제12항의 다중특이적 항체 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 전립선암, 난소암, 유방암, 결장암, 신장암, 비소세포폐암, 췌장암, 두경부암, 흑색종, 아교모세포종 및 신경모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 천식, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제1항의 항-B7-H3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 제11항의 항체-약물 접합체, 또는 제12항의 다중특이적 항체를 포함하는 암 또는 종양, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단용 조성물.
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