WO2021009990A1 - オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用 - Google Patents

オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用 Download PDF

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    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Definitions

  • the present invention relates to a kit of the auxin degron system and its use. Specifically, the present invention relates to a kit of an auxin degron system, a method for degrading a target protein, a target proteolysis inducer, and a cell.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-131464 filed in Japan on July 16, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • TIR1 which constitutes an auxin-responsive ubiquitin ligase
  • TIR1 is introduced into cells derived from eukaryotes such as yeast and animal cells, and the presence or absence and timing of addition of auxin are adjusted to cause a degradation tag (plant-derived aux).
  • IAA family protein or a partial protein thereof; also referred to as degron controls the degradation of the target protein.
  • the method for controlling the degradation of target proteins (also referred to as the auxin degron method) developed by the present inventors has already been widely used in cell biology research, and is a model organism such as yeast, nematode, Drosophila, and zebrafish. It is also being used for.
  • auxin makes it possible to rapidly degrade the target protein to which a degradation tag (degron) has been added.
  • degron a degradation tag
  • it is difficult to strictly control the expression because the target protein is weakly decomposed even when auxin is not added.
  • a relatively high concentration of auxin of 100 ⁇ M or more is used for inducing degradation, and there has been concern about the toxic effect of auxin itself, especially in multicellular animals.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a kit of an auxin degron system capable of strictly and freely controlling protein degradation, a target protein degradation method, a target proteolysis inducer, cells, and a compound. I will provide a.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a kit of the auxin degron system that controls the degradation of target proteins in non-plant-derived eukaryotic cells, and the first nucleic acid encoding a mutant TIR1 family protein having a mutation in the auxin binding site.
  • a degradation tag comprising an auxin analog having an affinity for the mutant TIR1 family protein and at least a portion of the Aux / IAA family protein and having an affinity for the mutant TIR1 family protein-the auxin analog complex.
  • a kit comprising two nucleic acids.
  • the kit according to [1] further comprising a third nucleic acid encoding a target protein linked upstream or downstream of the second nucleic acid.
  • the mutant TIR1 family protein is a rice-derived protein.
  • the mutant TIR1 family protein is a protein in which the 74th F of OsTIR1 is mutated to A, G, or S. ..
  • the auxin analog is a compound represented by the following general formula (I) or an ester thereof.
  • R 10 may have a substituent, or a cyclic aliphatic hydrocarbon group in which a part of the carbon atom constituting the ring may be substituted with a hetero atom, or , It is an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent and may have a part of carbon atoms constituting the ring substituted with a heteroatom.
  • a fourth encoding a linker for controlling a plurality of genes linked between the first nucleic acid and the second nucleic acid and the third nucleic acid with one promoter.
  • the kit according to any one of [2] to [5], which comprises the nucleic acid of.
  • a target proteolysis inducer used in the auxin degron system that controls the degradation of target proteins in non-plant-derived eukaryotic cells is a compound represented by the following general formula (I) or an ester thereof.
  • a target proteolytic inducer containing the body is a compound represented by the following general formula (I) or an ester thereof.
  • R 10 may have a substituent, or a cyclic aliphatic hydrocarbon group in which a part of the carbon atom constituting the ring may be substituted with a hetero atom, or , It is an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent and may have a part of carbon atoms constituting the ring substituted with a heteroatom.
  • mutant TIR1 family protein is a rice-derived protein.
  • mutant TIR1 family protein is a protein in which the 74th F of OsTIR1 is mutated to A, G, or S.
  • R 30 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom
  • R 31 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 30 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 31 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • auxin degron system kit of the present invention protein degradation control can be performed strictly and freely.
  • Example 3 This is the result of examining the degradation of the target protein in OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS expressing cells in Example 1. This is the result of examining the degradation of the target protein in OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells by adding a plurality of kinds of auxin analogs in Example 2. It is the result of the colony forming test in Example 3.
  • A is a microscopic image of OsTIR1 (F74G) / DHC1-mAID-Clover expressing cells supplemented with 5-Ph-IAA.
  • B 5-Ph-IAA-dependent degradation of DHC1 was confirmed by Western blotting.
  • FIG. 1 It is a conceptual diagram of a target proteolytic system.
  • A 5-Ph-IAA-dependent degradation of CENPH was confirmed by Western blotting.
  • B 5-Ph-IAA-dependent degradation of POLD1 was confirmed by Western blotting.
  • A It is a result of examining the degradation of the target protein in OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS expressing cells and OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS expressing cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of inducing mAID-EGFP-NLS reporter degradation in OsTIR1 (WT) and OsTIR1 (F74G) using different doses of IAA (auxin) and 5-Ph-IAA, respectively.
  • B It is a graph which shows the result of having induced the reporter decomposition with time in OsTIR1 (WT) and OsTIR1 (F74G). This is the result of examining the recovery of mAID-EGFP-NLS reporter expression after removal of 5-Ph-IAA in OsTIR1 (F74G).
  • (A) It is a figure which shows the outline of the experiment in Example 5.
  • (B) It is a photograph which showed the degree of colony formation on a plate in each yeast strain.
  • (A) It is a photograph which investigated the degradation of the reporter containing RAD21 in the RAD21-mAID-Clover (RAD21-mAC) cell expressing OsTIR1 (WT) or OsTIR1 (F74G).
  • (B) It is a graph which shows the result of inducing the degradation of the RAD21 reporter with time in the RAD21-mAID-Clover (RAD21-mAC) cell expressing OsTIR1 (WT) or OsTIR1 (F74G).
  • FIG. 1 It is a photograph showing the presence or absence of colonization in OsTIR1 (WT or F74G) or AtAFB2-expressing cells for which genome editing was attempted using mini-IAA7 (mIAA7).
  • C This is the result of FACS analysis of the degradation of the reporter when the degradation of mIAA7 or mAID-tagged DHC1 was induced in the cells expressing AtAFB2 or OsTIR1 (F74G). It is a result of examining the degradation of SMC2, CTCF, and POLR2A to which mAID was added by addition of 5-Ph-IAA in HCT116 which constitutively expresses OsTIR1 (F74G).
  • the kit of the present invention is a kit of the auxin degron system that controls the degradation of target proteins in non-plant-derived eukaryotic cells, and is the first kit encoding a mutant TIR1 family protein having a mutation in the auxin binding site.
  • the "auxin degron system” is a protein degradation control technology developed by the present inventors, and the plant-specific proteolytic system introduced by the plant hormone auxin is applied to non-plant-derived eukaryotic cells. It is a system (see, for example, Patent Documents 1 to 3). Specifically, this system consists of a plant-derived TIR1 family protein as an F-box protein, which is a subunit of the E3 ubiquitinating enzyme complex (SCF complex), and a plant-derived Aux / IAA family protein or a partial sequence thereof.
  • SCF complex E3 ubiquitinating enzyme complex
  • the TIR1 family protein which is an auxin receptor, produces a peptide consisting of the Aux / IAA family protein or a subunit thereof in an auxin-dependent manner. It is a system that recognizes and degrades target proteins using the ubiquitin / proteasome degradation system in non-plant-derived eukaryotic cells.
  • the present inventors have found a problem that the target protein is degraded in an auxin-independent manner in such a system.
  • the present inventors have a mutant TIR1 family protein having a mutation in the auxin binding site, an auxin analog having an affinity for the mutant TIR1 family protein, and at least a part of the Aux / IAA family proteins.
  • the present inventors have found that a low concentration of auxin analog can induce degradation of a target protein. According to the present invention, it is possible to provide an auxin degron system in which the degradation of the target protein hardly occurs when auxin is not added, and the degradation efficiency of the target protein is very high when auxin is added.
  • the first nucleic acid encodes a mutant TIR1 family protein having a mutation in the auxin binding site.
  • the TIR1 family protein is an F-box protein which is one of the subunits forming an E3 ubiquitinating enzyme complex (SCF complex) in ubiquitin / proteasome system proteolysis, and is a plant-specific protein. It is known that the TIR1 family protein is a receptor for the growth hormone auxin, and by accepting auxin, it recognizes the auxin signal transduction system inhibitor Aux / IAA family protein and degrades the target protein. Has been done.
  • the type of the gene encoding the TIR1 family protein is not limited as long as it is a gene encoding a plant-derived TIR1 family protein.
  • the type of plant from which it is derived is not limited, and examples thereof include Arabidopsis thaliana, rice, zinnia, pine, fern, and Physcomitrella patens.
  • Specific examples of the gene encoding the TIR1 family protein include TIR1 gene, AFB1 gene, AFB2 gene, AFB3 gene, FBX14 gene, AFB5 gene and the like. Of these, the OsTIR1 gene, which is a TIR1 gene derived from rice, is preferable.
  • Examples of the gene include the genes of accession numbers NM_001059194 (GeneID: 4335966) and Os04g0395600 or accession numbers EAY9333 and OsI_15707 registered in NCBI, and more specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Examples include genes consisting of. Further, a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 whose codon is optimized for human cells is preferable.
  • the mutant TIR1 family protein has a mutation in the auxin binding site.
  • the mutant protein is not particularly limited as long as it has an affinity for the auxin analog described later, but it is preferable that the 74th F of OsTIR1 is mutated to A, G, or S, and the mutated protein is mutated to G. What is more preferable.
  • the mutant TIR1 family protein consists of a sequence containing any one of the following amino acid sequences (a) to (c), and binds to a degradation tag via a complex with an auxin analog. Proteins that lead to degradation of the target protein are particularly preferred.
  • A An amino acid sequence in which the amino acid number 74 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is glycine
  • B An amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, inserted, substituted or added at a site other than the 74th amino acid number in (a) above.
  • C An amino acid sequence having 80% or more identity at a site other than the 74th amino acid number in (a) above.
  • the number of amino acids deleted, inserted, substituted or added in (b) is preferably 1 to 120, more preferably 1 to 60, further preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 10. Most preferably, 1 to 5 pieces.
  • it has 80% or more identity. As for the identity, 85% or more is more preferable, 90% or more is further preferable, 95% or more is particularly preferable, and 99% or more is most preferable.
  • Examples of the OsTIR1 F74A protein include those consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and examples of the gene encoding the OsTIR1 F74A protein include a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • Examples of the OsTIR1 F74G protein include those consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and examples of the gene encoding the OsTIR1 F74G protein include a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the first nucleic acid encoding the mutant TIR1 family protein may be a DNA containing an exon and an intron, or a cDNA composed of an exon.
  • the first nucleic acid encoding the mutant TIR1 family protein may be, for example, a full-length sequence in genomic DNA or a full-length sequence in cDNA.
  • the first nucleic acid encoding the mutant TIR1 family protein may be a partial sequence in genomic DNA or a partial sequence in cDNA as long as the expressed protein functions as TIR1.
  • TIR1 family protein means, for example, recognizing a degradation tag (full-length or partial protein of Aux / IAA family protein) in the presence of an auxin analog. This is because if the TIR1 family protein can recognize the degradation tag, the target protein labeled with the degradation tag can be degraded.
  • a promoter sequence that controls transcription of the first nucleic acid is operably linked to the 5'end of the first nucleic acid encoding the TIR1 family protein.
  • the TIR1 family protein can be expressed more reliably.
  • operably linked means between a gene expression control sequence (eg, a promoter or a series of transcription factor binding sites) and a gene to be expressed (the first nucleic acid encoding a TIR1 family protein).
  • a gene expression control sequence eg, a promoter or a series of transcription factor binding sites
  • the expression control sequence means a sequence that directs the transcription of the gene to be expressed (the first nucleic acid encoding the TIR1 family protein).
  • the promoter is not particularly limited and can be appropriately determined depending on, for example, the type of cell. Specific examples of the promoter include CMV promoter, SV40 promoter, EF1a promoter, RSV promoter and the like.
  • the first nucleic acid encoding the TIR1 family protein and the promoter sequence operably linked upstream may be in the form inserted into a vector.
  • the vector is preferably an expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited, and an expression vector suitable for the host cell can be used.
  • the vector may have a polyadenylation signal, NLS, a marker gene for a fluorescent protein, or the like operably linked to the 5'end or 3'end of the first nucleic acid encoding the TIR1 family protein.
  • the kit of the present invention may include non-plant-derived eukaryotic cells having the first nucleic acid on the chromosome. Such cells preferably have the first nucleic acid in the safe harbor locus.
  • the "safe harbor locus” is a gene region that is constitutively and stably expressed, and sustains life even when the gene originally encoded in the region is deleted or modified. Means the area where When inserting foreign DNA (in this embodiment, the gene encoding TIR1) into the safe harbor locus using the CRISPR system, it is preferable to have a PAM sequence in the vicinity.
  • the safe harbor locus include GTP-binding protein 10 locus, Rosa26 locus, beta-actin locus, AAVS1 (the AAV integration site 1) locus and the like. Above all, in the case of human-derived cells, it is preferable to insert foreign DNA into the AAVS1 locus.
  • the cell is not particularly limited as long as it is a non-plant-derived eukaryotic cell, and examples thereof include cells of animals, fungi, prokaryotes, and the like.
  • animals include mammals such as humans, mice, rats and rabbits, fish and amphibians such as zebrafish and Xenopus laevis, and invertebrates such as C. elegans and Drosophila.
  • eukaryotic-derived cells, ES cells, and iPS cells that have been established can also be mentioned.
  • eukaryotic cells for example, strained human-derived cells, strained mouse-derived cells, strained chicken-derived cells, human ES cells, mouse ES cells, human iPS cells, mouse iPS cells.
  • fungi include budding yeast, fission yeast and the like.
  • the auxin analog is not particularly limited as long as it has an affinity for the mutant TIR1 family protein, and is preferably a compound represented by the following general formula (I) or an ester thereof.
  • R 10 may have a substituent, or a cyclic aliphatic hydrocarbon group in which a part of the carbon atom constituting the ring may be substituted with a hetero atom, or , It is an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent and may have a part of carbon atoms constituting the ring substituted with a heteroatom.
  • the cyclic aliphatic hydrocarbon group in R 10 may be a monocyclic group or a polycyclic group.
  • Examples of the monocyclic aliphatic hydrocarbon include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a methylcyclohexyl group, a dimethylcyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, a cyclononyl group and a cyclodecyl group.
  • Examples of the polycyclic alicyclic hydrocarbon group include a decahydronaphthyl group, an adamantyl group, a 2-alkyladamantan-2-yl group, a 1- (adamantan-1-yl) alkane-1-yl group, and a norbornyl group. Examples thereof include a methylnorbornyl group and an isobornyl group.
  • a part of carbon atoms constituting the ring may be replaced with a hetero atom.
  • the hetero atom include an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom and the like.
  • heterocycles include pyrrolidine, tetrahydrofuran, tetrahydrothiophene, piperidine, tetrahydropyran, tetrahydrothiopyran, dioxane, dioxolane and the like.
  • substituents examples include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, and an aryl group having 6 to 30 carbon atoms.
  • alkyl group examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a cyclopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, a cyclobutyl group, and an n-pentyl group.
  • examples thereof include a group, a cyclohexyl group, a 2-methylpentyl group, a 3-methylpentyl group, a 1,1,2-trimethylpropyl group, a 3,3-dimethylbutyl group and the like.
  • alkoxy group examples include those in which the R portion of ⁇ OR is the same as the above-mentioned alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Among them, the carbon number alkoxy group is preferably a methoxy group or an ethoxy group.
  • the halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom and the like. Among them, as the halogen atom, a fluorine atom or a chlorine atom is preferable.
  • aryl group examples include a phenyl group, a naphthyl group, a benzyl group, a phenethyl group, a biphenyl group, a pentarenyl group, an indenyl group, an anthranyl group, a tetrasenyl group, a pentasenyl group, a pyrenyl group, a perylenel group, a fluorenyl group and a phenanthryl group.
  • Examples of the aromatic hydrocarbon group in R 10 include the above-mentioned aryl group having 6 to 30 carbon atoms. In the aromatic hydrocarbon group, a part of the carbon atom constituting the ring may be substituted with a hetero atom.
  • Examples of the hetero atom include an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom and the like. Examples of such heterocycles include pyrrole, furan, thiophene, pyridine, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole, pyridazine, pyrimidine, indol, benzimidazole, quinoline, isoquinoline, chromene, isochromene and the like.
  • substituents examples include those similar to those listed in [Cyclic aliphatic hydrocarbon group].
  • the ester of the compound represented by the general formula (I) is one in which the hydrogen atom in -COOH of the general formula (I) is substituted with a hydrocarbon group, and the ester compound is preferably substituted with an alkyl group.
  • the alkyl group an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a cyclopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, and a tert- Butyl group, cyclobutyl group, n-pentyl group, isopentyl group, sec-pentyl group, neopentyl group, tert-pentyl group, cyclopentyl group, 2,3-dimethylpropyl group, 1-ethylpropyl group, 1-methylbutyl group, 2
  • R 10 is an aromatic hydrocarbon group.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or an aryl group having 6 to 30 carbon atoms.
  • N is 0. it is an integer of 1-5, and when n is an integer of 2 to 5, n pieces of R 1 may be the same or different from each other.
  • halogen atom of R 1 examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom and the like. Among them, as the halogen atom, a fluorine atom or a chlorine atom is preferable.
  • alkyl group of R 1 examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, cyclobutyl group and n.
  • -Pentyl group isopentyl group, sec-pentyl group, neopentyl group, tert-pentyl group, cyclopentyl group, 2,3-dimethylpropyl group, 1-ethylpropyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, n-hexyl
  • examples thereof include a group, an isohexyl group, a cyclohexyl group, a 2-methylpentyl group, a 3-methylpentyl group, a 1,1,2-trimethylpropyl group and a 3,3-dimethylbutyl group.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably a methyl group or an ethyl group.
  • Examples of the alkoxy group of R 1 include those in which the R portion of ⁇ OR is the same as the above-mentioned alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Among them, the carbon number alkoxy group is preferably a methoxy group or an ethoxy group.
  • Examples of the aryl group of R 1 include a phenyl group, a naphthyl group, a benzyl group, a phenethyl group, a biphenyl group, a pentarenyl group, an indenyl group, an anthranyl group, a tetrasenyl group, a pentasenyl group, a pyrenyl group, a perylenel group, a fluorenyl group and a phenanthryl group. Can be mentioned.
  • N of R 1 is an integer of 0 to 5, preferably 0 to 3.
  • the compound represented by the general formula (I-1) has a plurality of R 1 , the following compounds or esters thereof can be mentioned.
  • R 1 to R 3 are independently alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms and alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, respectively. It is a halogen atom or an aryl group having 6 to 30 carbon atoms.
  • R 1 ⁇ R 3 are the same as R 1 in the general formula (I-1).
  • a compound represented by the following formula (I-1-4) also referred to as 5- (3-MeOPh) -IAA).
  • a compound represented by the following formula (I-1-5) also referred to as 5-Ph-IAA).
  • a compound represented by the following formula (I-1-6) also referred to as 5- (3,4-diMePh) -IAA).
  • a compound represented by the following formula (I-1-7) also referred to as 5- (3-MePh) -IAA).
  • a compound represented by the following formula (I-1-8) also referred to as 5- (3-ClPh) -IAA).
  • R 10 is an aromatic hydrocarbon group
  • compounds represented by the following formulas (I-2) to (I-5) or esters thereof are also preferable.
  • R 10 is a cyclic aliphatic hydrocarbon group, a compound represented by the following general formula (I-6), or an ester thereof.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom, or an aryl group having 6 to 30 carbon atoms.
  • M is 0. is an integer from to 11, when m is an integer of 2 to 11, m pieces of R 1 may be the same or different from each other.
  • R 1 is the same as that given in the general formula (I-1). m is preferably 0 to 6, more preferably 0 to 3.
  • R 10 is a cyclic aliphatic hydrocarbon group
  • a compound represented by the following formula (I-7) or an ester thereof is also preferable.
  • the second nucleic acid comprises at least a portion of the Aux / IAA family protein and encodes a degradation tag having an affinity for the mutant TIR1 family protein-the auxin analog complex.
  • the gene encoding the Aux / IAA family protein is not particularly limited as long as it is a plant-derived Aux / IAA family gene.
  • genes encoding the Aux / IAA family proteins include, for example, IAA1 gene, IAA2 gene, IAA3 gene, IAA4 gene, IAA5 gene, IAA6 gene, IAA7 gene, IAA8 gene, IAA9 gene, IAA10 gene, IAA11 gene, IAA12 gene, IAA13 gene, IAA14 gene, IAA15 gene, IAA16 gene, IAA17 gene, IAA18 gene, IAA19 gene, IAA20 gene, IAA26 gene, IAA27 gene, IAA28 gene, IAA29 gene, IAA30 gene, IAA31 gene, IAA32 gene , IAA34 gene and the like.
  • the kit of the present invention may have a full-length or partial sequence of a gene encoding any one of the Aux / IAA family proteins, or may have two or more of them.
  • the sequence of the Aux / IAA family gene derived from Arabidopsis thaliana is registered in TAIR (the Arabidopsis Information Resource), and the accession number of each gene is as follows.
  • IAA1 gene (AT4G14560), IAA2 gene (AT3G23030), IAA3 gene (AT1G04240), IAA4 gene (AT5G43700), IAA5 gene (AT1G15580), IAA6 gene (AT1G52830), IAA7 gene (AT3G23050), IAA7 gene (AT3G23050) (AT5G65670), IAA10 gene (AT1G04100), IAA11 gene (AT4G28640), IAA12 gene (AT1G04550), IAA13 gene (AT2G33310), IAA14 gene (AT4G14550), IAA15 gene (AT1G80390), IAA16 gene (AT1G80390), IAA16 gene ), IAA18 gene (AT1G51950), IAA19 gene (AT3G15540), IAA20 gene (AT2G46990), IAA26 gene (AT3G16500), IAA27 gene (AT4G29080), IAA28 gene (AT5G25890), IAA29 gene (
  • the degradation tag is not particularly limited as long as it binds to the mutant TIR1 family protein-auxin analog complex and leads to degradation of the target protein, and is an Aux / IAA family protein containing the full-length or partial protein of mAID. Is preferable.
  • MAID is an abbreviation for "Mini-auxin-inducible degron” and is a protein consisting of a partial sequence of Arabidopsis thaliana IAA17, which is one of the Aux / IAA family proteins. This partial sequence is a sequence consisting of a region containing at least two Lys residues on the N-terminal side and the C-terminal side of the domain II region of the Aux / IAA family protein, or a sequence in which two or more of the sequences are linked. Is an array.
  • This mAID can be a degradation tag that labels the target protein.
  • the amino acid sequence of mAID is represented by SEQ ID NO: 8.
  • a third nucleic acid encoding the target protein linked upstream or downstream of the second nucleic acid may be provided.
  • the second nucleic acid may be placed adjacent to either the 5'side or the 3'side of the third nucleic acid.
  • the fusion nucleic acid composed of the second nucleic acid and the third nucleic acid preferably has a promoter sequence operably linked, and may be integrated into an expression vector.
  • first nucleic acid and the second nucleic acid, or the fusion nucleic acid consisting of the second nucleic acid and the third nucleic acid may be incorporated into the expression vector, respectively, but the kit of the present invention is , Equipped with a fourth nucleic acid encoding a linker for controlling multiple genes with one promoter, linked between a first nucleic acid and a fusion nucleic acid consisting of a second nucleic acid and a third nucleic acid. It may be.
  • the fourth nucleic acid include nucleic acids encoding read-through linkers and nucleic acids encoding non-read-through linkers.
  • nucleic acid encoding the read-through linker examples include a nucleic acid encoding a cleavage sequence by an endogenous enzyme, which encodes a nucleic acid encoding a T2A peptide, a nucleic acid encoding a P2A peptide, a nucleic acid encoding an F2A peptide, and an E2A peptide. Nucleic acid can be mentioned. Nucleic acids encoding non-read-through linkers include IRES.
  • the kit of the present invention may include a transposon vector containing a first nucleic acid and / or a fusion nucleic acid consisting of a second nucleic acid and the third nucleic acid.
  • the kit of the present invention comprises a vector having transposon elements at both ends of a first nucleic acid and / or a fusion nucleic acid to which a promoter sequence is operably linked, and a nucleic acid encoding transposase. It is preferable to include a vector.
  • the first nucleic acid and the fusion nucleic acid may be contained in individual vectors, but when they are contained in one vector, the vector preferably contains the fourth nucleic acid.
  • Transposons require an enzyme that catalyzes the transposition reaction (transposes) and DNA that is recognized and transferred by the transposes (transposons element).
  • the kit of the present invention preferably contains these.
  • the transposon DNA when introduced into the cell, self-transposes. It can be expressed and transferred.
  • Such autonomous transposons can migrate from one location to another. Therefore, in order to more stably introduce the target gene into the chromosome, it is preferable that the kit of the present invention incorporates the DNA encoding the transposase and the transposon element into separate expression systems.
  • the transposon is not particularly limited, and examples thereof include Sleeping Beauty, piggyBac, and Tol2.
  • the kit of the invention preferably comprises a target genomic DNA cleaving enzyme encoding an endogenous target protein or a fifth nucleic acid encoding said enzyme.
  • the system used for double-strand breakage of the target genomic DNA include a CRISPR-Cas9 system, a Transcriction activator-like effector nucleoase (TALEN) system, and a Zn finger nuclease system.
  • the method for introducing these systems into cells is not particularly limited, and the target genomic DNA cleaving enzyme itself may be introduced into cells, and a target genomic DNA cleaving enzyme expression vector containing a fifth nucleic acid is introduced into cells.
  • You may.
  • a method of introducing a Cas9 expression vector and an expression vector encoding a guide RNA that induces Cas9 at a site to be cleaved into cells, a recombinant Cas9 protein whose expression has been purified, and a guide RNA. can be mentioned.
  • the guide RNA may be divided into two, tracrRNA and crRNA, or may be sgRNA connected to one.
  • the method for degrading the target protein of the present invention is the method using the above-mentioned kit of the present invention.
  • the above-mentioned kit in the auxin degron system it is possible to strictly and freely control the degradation of the target protein.
  • the target protein labeled with the degradation tag and the TIR1 family protein are expressed in the cell. It is preferable that the target protein labeled with the degradation tag and the TIR1 family protein are constantly expressed.
  • the concentration of the auxin analog contained in the medium is not limited, and is preferably 1 ⁇ M or more and less than 0.1 mM, and preferably 10 nM or more and 50 ⁇ M or less.
  • the combination of the compound represented by the general formula (I) and OsTIR1 (F74G) can sufficiently induce the decomposition of the target protein at a concentration of 50 nM.
  • Addition of a predetermined concentration of auxin analog forms a mutant TIR1 family protein-auxin analog complex, which recognizes the target protein labeled by the degradation tag and induces degradation of the target protein.
  • degradation of a target protein can be induced specifically for an auxin analog.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following general formula (II).
  • R 30 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom
  • R 31 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 30 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 31 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • halogen atom of R 30 examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom and the like. Among them, as the halogen atom, a fluorine atom or a chlorine atom is preferable.
  • alkyl groups of R 30 and R 31 include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group and tert, respectively.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably a methyl group or an ethyl group.
  • the cells of the present invention are non-plant-derived eukaryotic cells used in the auxin degron system that controls the degradation of target proteins, and are the first nucleic acids encoding mutant TIR1 family proteins having mutations in the auxin binding site. Has a chromosome containing.
  • the cells of the invention preferably have the first nucleic acid in the safe harbor locus.
  • the cells are the same as those described in ⁇ Auxin Deglon System Kit >>.
  • the eukaryotic cells derived from non-plants are not particularly limited, and examples thereof include cells of animals, fungi, prokaryotes and the like.
  • the OsTIR1 protein which is the same as that described in ⁇ Kit of auxin degron system >> and is a TIR1 protein derived from rice, is preferable.
  • the mutant TIR1 family protein is the same as that described in ⁇ Kit of auxin degron system >>, and it is preferable that the 74th F of OsTIR1 is mutated to A, G, or S, and it is mutated to G. What is more preferable.
  • the mutant TIR1 family protein is the same as that described in ⁇ Kit of auxin degron system >>, and consists of a sequence containing any one of the amino acid sequences (a) to (c) described above.
  • a protein that binds to a degradation tag via a complex with an auxin analog and leads to degradation of a target protein is particularly preferable.
  • the cells of the present invention further include a second nucleic acid comprising at least some Aux / IAA family proteins and encoding a degradation tag having an affinity for the mutant TIR1 family protein-auxin analog complex, and the second nucleic acid described above. It preferably has a chromosome containing a third nucleic acid encoding a target protein linked upstream or downstream of the nucleic acid.
  • the method for introducing the first nucleic acid, the second nucleic acid, and the third nucleic acid into the chromosome is not particularly limited, and as described in ⁇ Kit of auxindegron system >>, genome editing technology such as CRISPR system is used. It may be introduced using a transposon vector.
  • HCT116 cells human colon adenocarcinoma-derived cells
  • OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells or "OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells”
  • WT human colon adenocarcinoma-derived cells
  • F74G mAID-EGFP-NLS-expressing cells
  • OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells were prepared (hereinafter referred to as "OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells”). See FIG. 1).
  • auxin analog concentration in medium: 0,200 ⁇ M
  • OsTIR1 F74G
  • mAID-EGFP-NLS expressing cells culture for 24 hours.
  • auxin analog concentration in medium: 0,200 ⁇ M
  • WT OsTIR1
  • mAID-EGFP-NLS expressing cells were also prepared.
  • OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells 100 ⁇ M auxin was added to OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells, and 1 ⁇ M5-Ph-IAA was added to OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells for 4 hours. The cells were later collected and FACS analysis was performed. The results are shown in FIG. 7 (A). Comparing OsTIR1 (WT) and OsTIR1 (F74G) against a homogeneous genetic background, OsTIR1 (WT) had a low mAID-EGFP-NLS reporter level and a wide signal peak in the absence of auxin. It showed that there was basal decomposition.
  • OsTIR1 (F74A) / mAID-EGFP-NLS expressing cells were also used and similar experiments were performed with three clones. The results are shown in FIG. 7 (B). As shown in FIG. 7 (B), the three cell lines expressing OsTIR1 (WT) showed broader peaks at low expression levels, suggesting that there was basal degradation without auxin. On the other hand, clones expressing OsTIR1 (F74G) and OsTIR1 (F74A) showed stronger expression levels of the reporter in the absence of 5-Ph-IAA, suggesting that basal degradation was suppressed.
  • clones expressing OsTIR1 showed sharper degradation of the mAID-EGFP-NLS reporter compared to clones expressing OsTIR1 (F74A) by 5-Ph-IAA treatment. In all cases, the signal peak shifted to the left after 5-Ph-IAA treatment, indicating that degradation was induced.
  • 5-Phenyl-indole 3-acetic acid methyl ester (124 mg, 0.47 mmol) was placed in a 10 mL round bottom flask, and 1 mL of methanol and 1 mL of tetrahydrofuran were added. An aqueous solution of lithium hydroxide (23 mg, 0.96 mmol dissolved in 1 mL of water) was added dropwise thereto. The reaction was hydrolyzed by stirring at room temperature for 2 hours. 5 mL of 1 M dilute hydrochloric acid and 5 mL of ethyl acetate were added to the reaction mixture, and the product was extracted from the ethyl acetate layer.
  • HCT116 cells in which a plasmid containing the OsTIR1 (WT) gene or OsTIR1 (F74G) gene has been introduced and the mAID-EGFP (green fluorescent protein) -NLS (nuclear translocation signal) gene has been inserted on the chromosome ( Human colon adenocarcinoma-derived cells) (hereinafter referred to as "OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells" or "OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells”) were prepared (see FIG. 1). ).
  • auxin analog concentration in medium: 0, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 ⁇ M was added and cultured for 24 hours.
  • auxin analog concentration in medium: 0, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 ⁇ M was added and cultured for 24 hours.
  • WT OsTIR1
  • mAID-EGFP-NLS expressing cells were also prepared.
  • auxin-supplemented OsTIR1 F74G
  • mAID-EGFP-NLS-expressing cells degraded GFP at a lower concentration than auxin-supplemented OsTIR1 (WT) / mAID-EGFP-NLS-expressing cells.
  • OsTIR1 (F74G) / mAID-EGFP-NLS expressing cells were treated with low concentrations of each auxin analog.
  • the results are shown in FIG.
  • 5-Ph-IAA showed a stronger effect of inducing degradation of the mAID-EGFP-NLS reporter at 1 nM and 10 nM than other compounds.
  • Example 3 1. Cell preparation In HCT116 cells, the OsTIR1 (WT) gene or OsTIR1 (F74G) gene is introduced into the AAVS1 locus at the safe harbor locus using the CRISPR / Cas system, and OsTIR1 (WT) -expressing HCT116 cells or OsTIR1 (F74G) expressed HCT116 cells were constructed.
  • WT OsTIR1
  • F74G OsTIR1
  • OsTIR1 (F74G) -expressing HCT116 cells hereinafter referred to as "OsTIR1 (F74G) / DHC1-mAID-Clover expressing cells" that had undergone homologous recombination in 2 above.
  • the test was conducted.
  • a compound represented by the formula (I-2) also referred to as 5-Ph-IAA was added to OsTIR1 (F74G) / DHC1-mAID-Clover expressing cells, and the state of the cells after 24 hours was observed (FIG. 4 (A)).
  • FIG. 4 (A) the addition of 5-Ph-IAA resulted in the degradation of the DHC1-mAID-Clover fusion protein, and the accumulation of cells during mitosis was observed. Furthermore, the decomposition of DHC1 was confirmed by Western blotting (FIG. 4 (B)). As shown in FIG. 4B, degradation of DHC1 and mAID was confirmed in all of clones # 1 to 3 prepared by homologous recombination in a 5-Ph-IAA-dependent manner.
  • Example 4 There are three drawbacks to constructing an intrinsic target proteolytic system. (1) Since many cultured cells are polyploid, there are two or more copies of allele of the target gene. Therefore, it is difficult to construct this degradation system in various cultured cell lines. (2) It is necessary to create a parent strain into which OsTIR1 (F74G) has been introduced in advance. (3) It takes time and effort to construct a large number of decomposition systems and create a library.
  • a new target proteolytic system shown in FIG. 5 was constructed.
  • (1) the OsTIR1 (F74G) gene and the mAID-target gene are linked to a transposon vector with a P2A linker gene, and (2) to knock out an endogenous target gene including a gRNA and a Cas9 gene.
  • the transposon vector integrates the OsTIR1 (F74G) gene and the mAID-target gene into the genome, while the CRISPR-KO vector knocks out the endogenous target gene.
  • the OsTIR1 (F74G) gene and the mAID-EGFP-CENPH or mAID-EGFP-POLD1 target gene are linked to create a transposon vector linked by the P2A linker gene, and this vector is used as a target for the endogenous CENPH or POLD1 gene. It was introduced into HeLa cells together with the vector. 5-Ph-IAA was added to the cells, and the degradation of the target protein was confirmed by Western blotting (Fig. 6).
  • FIG. 6A shows the results of Western blotting using an anti-CENPH antibody. It was confirmed that the endogenous CENPH gene was knocked out, and that mAID-EGFP-CENPH was degraded in a 5-Ph-IAA-dependent manner.
  • FIG. 6B shows the results of Western blotting using the anti-POLD1 antibody.
  • clones # 1 to 3 it was confirmed that the endogenous POLD1 gene was knocked out, and that mAID-EGFP-POLD1 was degraded in a 5-Ph-IAA-dependent manner.
  • OsTIR1 WT, F74G, or F74A
  • MCM10 essential replication initiators
  • SLD3, or CDC45 essential replication initiators
  • yeast strains expressing OsTIR1 show slow growth and higher basal degradation in yeast, as shown in OsTIR1 ON, no ligand, cdc45-mAID, etc. in FIG. 12 (B). Suggested that there is.
  • OsTIR1 WT and F74A showed growth inhibition of these mAID-introduced strains at 500 ⁇ MIAA, suggesting that OsTIR1 (F74A) remains reactive to IAA.
  • strains expressing OsTIR1 F74G or F74A showed strong growth inhibition on plates containing 5 ⁇ M5-Ph-IAA.
  • OsTIR1 F74G or F74A
  • the growth of the mcm10-mAID strain and the sld3-mAID strain is strongly inhibited, so that the AID2 system can produce a mutant having a higher degradation ability and a strong phenotype. Is shown.
  • Example 6 Using human HCT116 cells that constitutively express OsTIR1 (F74G) as a material, RAD21-mAID-Clover (RAD21-mAC) cells were prepared by genome editing, and the effect of adding 5-Ph-IAA was confirmed. As shown in FIGS. 13 (A) and 13 (B), the expression level of RAD21-mAC expressed OsTIR1 (F74G) more than the cells expressing OsTIR1 (WT) at 0 minutes before addition. The cells are higher, indicating basal degradation in the conventional AID system. RAD21-mAC disappeared rapidly after addition of the ligand in both OsTIR1 (WT) and OsTIR1 (F74G).
  • T1 / 2 was 26.5 minutes and 11.7 minutes for OsTIR1 (WT) and OsTIR1 (F74G), respectively, indicating that RAD21-mAC was degraded faster by the AID2 system.
  • WT OsTIR1
  • F74G OsTIR1
  • Example 7 In view of the fact that OsTIR1 (F74G) showed less basal degradation, it was examined whether DHC1-mAID-Clover (DHC1-mAC) could be produced in HCT116 cells that constitutively express OsTIR1 (F74G).
  • a parental cell line constitutively expressing OsTIR1 WT or F74G was transfected with a CRISPR plasmid for adding the degron tag and two donors with neomycin or hygromycin resistance markers, respectively (see Figure 14).
  • OsTIR1 (F74G) -expressing cells colonies were formed in the presence of G418 and hygromycin, and the DHC1 gene in both alleles was tagged (see FIG.
  • FIG. 16B colonization was confirmed under all conditions. However, the number of colonies was smaller in the cells expressing OsTIR1 (WT) and AtAFB2 than in the cells expressing OsTIR1 (F74G). In cells expressing AtAFB2 or OsTIR1 (F74G), degradation of mIAA7 or mAID-tagged DHC1 was induced (see FIG. 16C). In FIG. 16C, it was confirmed that the combination of OsTIR1 (F74G) and the mAID tag was the most efficient. This is because, as shown in FIG.
  • the length of mIAA7 is short and / or the number of lysine residues required for ubiquitination of mIAA7 is small, so that the efficiency of formation of the three-component complex by IAA is reduced. It is thought that this is the reason.
  • Example 8 It was difficult to generate an AID cell line using HCT116 cells that constitutively express OsTIR1 (WT). Condensin complex subunit SMC2, insulator protein CTCF, and RNA polymerase 2 largest subunit. Regarding (POLR2A), it was examined whether a cell line could be prepared from cells constitutively expressing OsTIR1 (F74G). As shown in FIG. 17, it was confirmed that tags can be added to both alleles of endogenous SMC2, CTCF, and POLR2A in HCT116 that constitutively express OsTIR1 (F74G). In these cell lines, the addition of 1 ⁇ M5-Ph-IAA rapidly degraded the mAID fusion target. From these results, it was confirmed that the AID2 system using cells constitutively expressing OsTIR1 (F74G) can be produced even for genes for which it is impossible to generate a cell line using the original AID system. Was done.
  • auxin-independent degradation of the target protein can be inhibited, so that the degradation of the target protein can be strictly and freely controlled.

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Abstract

非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える、キット。

Description

オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用
　本発明は、オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用に関する。具体的には、本発明は、オーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、及び細胞に関する。
　本願は、２０１９年７月１６日に、日本に出願された特願２０１９－１３１４６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　本発明者らはこれまでに、オーキシンデグロンシステムと呼ばれるタンパク質の分解制御技術の開発を行ってきた（例えば、特許文献１～３参照）。このシステムでは、オーキシン応答性ユビキチンリガーゼを構成するＴＩＲ１を、酵母や動物細胞等の真核生物由来の細胞に導入し、オーキシンの添加の有無やタイミングを調整することで、分解タグ（植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分タンパク質；デグロンともいう。）を付加した標的タンパク質の分解を制御する。
　本発明者らが開発した標的タンパク質の分解を制御方法（オーキシンデグロン法ともいう。）は、すでに細胞生物学研究で広く使用されており、酵母、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどのモデル生物への利用も進んでいる。
特開２００８－１８７９５８号公報 国際公開第２０１０／１２５６２０号 国際公開第２０１３／０７３６５３号
　従来のオーキシンデグロン法を利用すると、オーキシンの添加により、分解タグ（デグロン）を付加した標的タンパク質を迅速に分解することが可能になる。しかしながら、従来のオーキシンデグロン法では、オーキシン非添加時にも標的タンパク質の弱い分解が起きるため、厳密な発現制御に困難があった。また、分解誘導に１００μＭ以上の比較的高濃度のオーキシンが使用されており、特に多細胞動物においてオーキシン自体の毒性影響が懸念されていた。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能なオーキシンデグロンシステムのキット、標的タンパク質の分解方法、標的タンパク質分解誘導剤、細胞、及び化合物を提供する。
　本発明は、以下の態様を含む。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］非植物由来の真核細胞中の目的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える、キット。
［２］更に、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備える、［１］に記載のキット。
［３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、［１］又は［２］に記載のキット。
［４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１］～［３］のいずれか一つに記載のキット。
［５］前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体である、［１］～［４］のいずれか一つに記載のキット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
［６］更に、前記第一の核酸と、前記第二の核酸及び前記第三の核酸との間に、連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備える、［２］～［５］のいずれか一つに記載のキット。
［７］更に、前記第一の核酸、並びに／又は、前記第二の核酸及び前記第三の核酸を含むトランスポゾンベクターを備える、［２］～［６］のいずれか一つに記載のキット。
［８］更に、内在性の目的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含有する、［１］～［７］のいずれか一つに記載のキット。
［９］更に、前記第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞を備える、請求項［１］～［８］のいずれか一つに記載のキット。
［１０］［１］～［９］のいずれか一つに記載のキットを用いる、標的タンパク質の分解方法。
［１１］非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる標的タンパク質分解誘導剤であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体を含有する、標的タンパク質分解誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
［１２］標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する、細胞。
［１３］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、［１２］に記載の細胞。
［１４］前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、［１２］又は［１３］に記載の細胞。
［１５］下記一般式（ＩＩ）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ３０は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ３１は、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３０が、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基である場合、Ｒ３１は、炭素数１～６のアルキル基である。）
　本発明のオーキシンデグロンシステムのキットによれば、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能である。
実施例１において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解を調べた結果である。 実施例２において、複数種類のオーキシンアナログを添加による、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解を調べた結果である。 実施例３における、コロニー形成試験の結果である。 （Ａ）５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加した、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞の顕微鏡像である。（Ｂ）５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的なＤＨＣ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した結果である。 標的タンパク質分解系の概念図である。 （Ａ）５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的なＣＥＮＰＨの分解をウエスタンブロッティングにより確認した結果である。（Ｂ）５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的なＰＯＬＤ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した結果である。 （Ａ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞、及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解を調べた結果である。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞、及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解をＦＡＣＳ解析した結果である。 複数種類のオーキシンアナログ添加による、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞での標的タンパク質の分解をＦＡＣＳ解析した結果である。 （Ａ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理したＨＣＴ１１６細胞の細胞周期への影響を調べた結果である。（Ｂ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理したＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成効率への影響を調べた結果である。 （Ａ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）において、異なる用量のＩＡＡ（オーキシン）と５－Ｐｈ－ＩＡＡをそれぞれ使用してｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーター分解を誘導した結果を示すグラフである。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）において、レポーター分解を経時的に誘導した結果を示すグラフである。 ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）において、５－Ｐｈ－ＩＡＡ除去後のｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーター発現の回復を調べた結果である。 （Ａ）実施例５における実験の概要を示す図である。（Ｂ）各酵母株におけるプレート上でのコロニーの形成の程度を示した写真である。 （Ａ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１を含むレポーターの分解を調べた写真である。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１レポーターの分解を経時的に誘導した結果を示すグラフである。（Ｃ）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１の分解による細胞周期への影響を調べた結果である。（Ｄ）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞における、ＲＡＤ２１の分解による姉妹染色分体の凝集への影響を調べた写真である。 実施例７における実験の概要を示す図である。 （Ａ）ゲノム編集を試みたＯｓＴＩＲ１（ＷＴ若しくはＦ７４Ｇ）、又はＡｔＡＦＢ２発現細胞における、コロニー形成の有無を示す写真である。（Ｂ）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞における、１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によるＤＨＣ１－ｍＡＣの分解を調べた結果である。（Ｃ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によりＤＨＣ１－ｍＡＣを分解したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞における、Ｍ期の細胞の割合を示したグラフである。（Ｄ）１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によりＤＨＣ１－ｍＡＣを分解したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞における、分裂期の状態を示す染色像である。 （Ａ）ｍＡＩＤ及びｍｉｎｉ－ＩＡＡ７（ｍＩＡＡ７）のアミノ酸配列のアライメントである。（Ｂ）ｍｉｎｉ－ＩＡＡ７（ｍＩＡＡ７）を用いて、ゲノム編集を試みたＯｓＴＩＲ１（ＷＴ若しくはＦ７４Ｇ）、又はＡｔＡＦＢ２発現細胞における、コロニー形成の有無を示す写真である。（Ｃ）ＡｔＡＦＢ２又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞で、ｍＩＡＡ７又はｍＡＩＤタグ付きＤＨＣ１の分解を誘導した際のレポーターの分解をＦＡＣＳ解析した結果である。 ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現しているＨＣＴ１１６における、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加によるｍＡＩＤを付加したＳＭＣ２、ＣＴＣＦ、及びＰＯＬＲ２Ａの分解を調べた結果である。
≪オーキシンデグロンシステムのキット≫
　本発明のキットは、非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、を備える。
　「オーキシンデグロンシステム」とは、本発明者らが開発したタンパク質の分解制御技術であり、植物ホルモンオーキシンによって導入される植物特異的なタンパク質分解系を、非植物由来の真核細胞に応用したシステムである（例えば、特許文献１～３参照）。
　具体的に、このシステムは、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）のサブユニットであるＦ－ｂｏｘタンパク質としての植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドで標識された標的タンパク質とを非植物由来の真核細胞に導入することにより、オーキシン受容体であるＴＩＲ１ファミリータンパク質が、オーキシン依存的に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドを認識し、非植物由来の真核細胞におけるユビキチン／プロテアソーム分解系を利用して、標的タンパク質を分解するシステムである。
　本発明者らは、係るシステムにおいて、オーキシン非依存的に標的タンパク質が分解されるという問題を見出した。係る問題に対して、本発明者らは、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグの組み合わせを見出した。
　また、本発明者らは、低濃度のオーキシンアナログで、標的タンパク質を分解誘導できることを見出した。
　本発明によれば、オーキシン非添加時には、標的タンパク質の分解はほとんど起こらず、オーキシン添加時には、標的タンパク質の分解効率が非常に高いオーキシンデグロンシステムを提供できる。
＜第一の核酸＞
　本発明において、第一の核酸は、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする。
　ＴＩＲ１ファミリータンパク質とは、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ－ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、標的タンパク質を分解することが知られている。
　ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子等が挙げられる。
　中でも、イネ由来のＴＩＲ１遺伝子である、ＯｓＴＩＲ１遺伝子が好ましい。係る遺伝子としては、ＮＣＢＩに登録されているアクセッション番号ＮＭ_００１０５９１９４（ＧｅｎｅＩＤ：４３３５６９６）、Ｏｓ０４ｇ０３９５６００又はアクセッション番号ＥＡＹ９３９３３、ＯｓＩ_１５７０７の遺伝子が挙げられ、より具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。更に、ヒト細胞用にコドンを最適化した配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子が好ましい。
　本発明において、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、オーキシン結合部位に変異を有するものである。係る変異タンパク質は、後述するオーキシンアナログとの親和性を有するものであれば特に限定されないが、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているものが好ましく、Ｇに変異しているものがより好ましい。
　具体的には、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質が特に好ましい。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７４位がグリシンであるアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸番号７４位以外の部位において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸番号７４位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　（ｂ）において欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１ ～１２０個が好ましく、１～６０個がより好ましく、１～２０個が更に好ましく、１～１０個が特に好ましく、１～５個が最も好ましい。
　（ａ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
　ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ａタンパク質としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられ、ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ａタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号５で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ｇタンパク質としては、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられ、ＯｓＴＩＲ１のＦ７４Ｇタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号７で表される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
　変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、エキソンとイントロンとを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。
　本明細書において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシンアナログの存在下で、分解タグ（Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質）を認識することを意味する。ＴＩＲ１ファミリータンパク質が分解タグを認識できれば、分解タグで標識化された標的タンパク質を分解できるからである。
　本発明のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端に、該第一の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。
　本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）の転写を指向するものを意味する。
　前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＲＳＶプロモーター等が挙げられる。
　本発明のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。
　ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、宿主細胞に応じた発現ベクターを用いることができる。
　ベクターは、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端又は３’末端に、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
　本発明のキットは、第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞を備えてもよい。係る細胞は、第一の核酸をセーフハーバー座位に有することが好ましい。
　「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、ＴＩＲ１をコードする遺伝子）をセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。セーフハーバー座位としては、例えば、ＧＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１０遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ遺伝子座、ＡＡＶＳ１（ｔｈｅ　ＡＡＶ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　１）遺伝子座等が挙げられる。中でも、ヒト由来細胞の場合は外来ＤＮＡをＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することが好ましい。
　細胞としては、非植物由来の真核細胞であれば特に限定されず、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等の魚類や両生類、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓやショウジョウバエ等の無脊椎動物が挙げられる。
　また、株化された真核動物由来細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞も挙げられる。真核細胞として具体的には、例えば、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞等が挙げられる。具体的には、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞、ニワトリＤＴ４０細胞等が挙げられる。
　また、菌類としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母等が挙げられる。
＜オーキシンアナログ＞
　本発明において、オーキシンアナログは、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するものであれば特に限定されず、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
［環状の脂肪族炭化水素基］
　Ｒ１０における環状の脂肪族炭化水素基としては、単環式基でも多環式基でもよい。
　単環式の脂肪族炭化水素としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、ジメチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基が挙げられる。
　多環式の脂環式炭化水素基としては、デカヒドロナフチル基、アダマンチル基、２－アルキルアダマンタン－２－イル基、１－（アダマンタン－１－イル）アルカン－１－イル基、ノルボルニル基、メチルノルボルニル基、イソボルニル基等が挙げられる。
　環状の脂肪族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、ジオキサン、ジオキソラン等が挙げられる。
　置換基としては、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
　アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
　アルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、上述した炭素数１～６のアルキル基と同様のものが挙げられる。中でも、炭素数アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
　ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
　アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。
［芳香族炭化水素基］
　Ｒ１０における芳香族炭化水素基としては、上述した炭素数６～３０のアリール基が挙げられる。
　芳香族炭化水素基は、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子等が挙げられる。係る複素環としては、ピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジン、インドール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、クロメン、イソクロメン等が挙げられる。
　置換基としては、［環状の脂肪族炭化水素基］で挙げたものと同様のものが挙げられる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物のエステル体は、一般式（Ｉ）の－ＣＯＯＨにおける水素原子が、炭化水素基に置換されたものであり、アルキル基に置換されたものが好ましい。
係るアルキル基としては、炭素数１～６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ１０が芳香族炭化水素基であるものとして、下記一般式（Ｉ－１）で表される化合物、又はそのエステル体が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（一般式（Ｉ－１）中、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。ｎは０～５の整数であり、ｎが２～５の整数である場合、ｎ個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよい。）
　Ｒ１のハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
　Ｒ１のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。中でも、炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
　Ｒ１のアルコキシ基としては、－ＯＲのＲの部分が、上述した炭素数１～６のアルキル基と同様のものが挙げられる。中でも、炭素数アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
　Ｒ１のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基が挙げられる。
　Ｒ１のｎは０～５の整数であり、０～３が好ましい。一般式（Ｉ－１）で表される化合物が複数のＲ１を有する場合、以下の化合物、又はそのエステル体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（一般式（Ｉ－１－１）～（Ｉ－１－３）中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。）
　一般式（Ｉ－１－１）～（Ｉ－１－３）における、Ｒ１～Ｒ３は、一般式（Ｉ－１）におけるＲ１と同様である。
　また、一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、以下に示す化合物、又はそのエステル体が好ましい。
　下記式（Ｉ－１－４）で示される化合物（５－（３－ＭｅＯＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
　下記式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）。
　下記式（Ｉ－１－６）で示される化合物（５－（３，４－ｄｉＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
　下記式（Ｉ－１－７）で示される化合物（５－（３－ＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
　下記式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　また、下記式（Ｉ－１－９）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　また、Ｒ１０が芳香族炭化水素基であるものとして、下記式（Ｉ－２）～（Ｉ－５）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　また、Ｒ１０が環状の脂肪族炭化水素基であるものとして、下記一般式（Ｉ－６）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（一般式（Ｉ－６）中、Ｒ１は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、ハロゲン原子、又は炭素数６～３０のアリール基である。ｍは０～１１の整数であり、ｍが２～１１の整数である場合、ｍ個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよい。）
　Ｒ１は、一般式（Ｉ－１）で挙げられてものと同様である。ｍは０～６が好ましく、０～３がより好ましい。
　また、Ｒ１０が環状の脂肪族炭化水素基であるものとして、下記式（Ｉ－７）で示される化合物、又はそのエステル体も好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
＜第二の核酸＞
　本発明において、第二の核酸は、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする。
　Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類について特別な限定はない。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子、ＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。
　本発明のキットは、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の全長又は部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
　ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）、ＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
　これらの中でも、シロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。
　分解タグは、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体と結合し、標的タンパク質を分解に導くものであれば特に限定されず、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のうち、ｍＡＩＤの全長又は部分タンパク質を含むものが好ましい。
　「ｍＡＩＤ」とは、「Ｍｉｎｉ－ａｕｘｉｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｄｅｇｒｏｎ」の略称であり、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の一つであるシロイヌナズナＩＡＡ１７の部分配列からなるタンパク質である。この部分配列とは、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は、該配列を２個以上連結してなる配列である。このｍＡＩＤは標的タンパク質を標識する分解タグとなり得る。例えば、ｍＡＩＤのアミノ酸配列は、配列番号８で表される。
＜第三の核酸＞
　本発明のキットにおいて、標的タンパク質が定まっている場合には、第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備えていてもよい。第二の核酸は、第三の核酸の５’側又は３’側のどちらに隣接されて配置されてもよい。
　第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、第一の核酸と同様に、プロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましく、発現ベクターに組み込まれたものであってもよい。
＜第四の核酸＞
　上記、第一の核酸、及び、第二の核酸、又は第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、それぞれ発現ベクターに組み込まれたものであってもよいが、本発明のキットは、第一の核酸と、第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸との間に連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備えていてもよい。
　第四の核酸としては、リードスルーリンカーをコードする核酸、非リードスルーリンカーをコードする核酸が挙げられる。
　リードスルーリンカーをコードする核酸としては、内在性酵素による切断配列をコードする核酸が挙げられ、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸、Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸が挙げられる。
　非リードスルーリンカーをコードする核酸としては、ＩＲＥＳが挙げられる。
＜トランスポゾンベクター＞
　本発明のキットは、第一の核酸、並びに／又は、第二の核酸及び前記第三の核酸からなる融合核酸を含むトランスポゾンベクターを備えていてもよい。
　具体的には、本発明のキットは、プロモーター配列が作動可能に連結された、第一の核酸、及び／又は、融合核酸の両端にトランスポゾンエレメントを備えたベクターと、トランスポゼースをコードする核酸を備えたベクターを含むことが好ましい。
　第一の核酸及び融合核酸は、それぞれ個別のベクターに含まれていてもよいが、一つのベクターに含まれる場合には、係るベクターは、上記第四の核酸を含むことが好ましい。
　トランスポゾンの転移には、トランスポジション反応を触媒する酵素（トランスポゼース）と、このトランスポゼースにより認識されて転移するＤＮＡ（トランスポゾンエレメント）が必要である。本発明のキットは、これらを含むことが好ましい。
　本発明のキットにおいて、トランスポゼースをコードするＤＮＡ及びトランスポゾンエレメントが、トランスポゾンＤＮＡとして、連結して一つの発現系に組み込まれている場合には、トランスポゾンＤＮＡは、一度細胞内に導入すると、自らトランスポゼースを発現して転移し得る。
　このような自律性トランスポゾンは、転移した位置から別の位置へ転移する可能性がある。そのため、より安定して染色体内に目的遺伝子を導入するためには、本発明のキットは、トランスポゼースをコードするＤＮＡ及びトランスポゾンエレメントが、それぞれ別個の発現系に組み込まれていることが好ましい。　　
　トランスポゾンとしては、特に限定されず、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２等が挙げられる。
＜第五の核酸＞
　第二の核酸と第三の核酸からなる融合核酸は、相同組換えにより内在性の第三の核酸と入れ替えられてもよいが、係る融合核酸がトランスポゾン等により、任意の染色体に組み込まれている場合には、本発明のキットは、内在性の標的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含むことが好ましい。標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムとしては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びＺｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられる。これらのシステムの細胞への導入方法としては、特に限定されず、標的ゲノムＤＮＡ切断酵素自体を細胞に導入してもよく、第五の核酸を含む標的ゲノムＤＮＡ切断酵素発現ベクターを細胞に導入してもよい。
　例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいては、Ｃａｓ９発現ベクターと、切断したい箇所にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクターと、を細胞に導入する方法や、発現精製した組み換えＣａｓ９タンパク質と、ガイドＲＮＡと、を細胞に導入する方法等が挙げられる。ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの２つに分かれていてもよく、１本につながっているｓｇＲＮＡであってもよい。
≪標的タンパク質分解方法≫
　本発明の標的タンパク質の分解方法は、上述した本発明のキットを用いる方法である。オーキシンデグロンシステムにおいて、上述のキットを用いることで、厳密かつ自在に標的タンパク質の分解制御が可能である。
　例えば、上述のキットを用いて標的タンパク質の分解制御を行う方法としては、以下の方法等が挙げられる。
　まず、細胞内において、分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現させる。分解タグで標識された標的タンパク質、及びＴＩＲ１ファミリータンパク質は、定常的に発現していることが好ましい。
　次いで、オーキシンアナログを培地に添加する。培地に含まれるオーキシンアナログの濃度は、限定されず、例えば、１μＭ以上０．１ｍＭ未満であり、１０ｎＭ以上５０μＭ以下であることが好ましい。実施例で後述するように、一般式（Ｉ）で表される化合物とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）の組み合わせでは、５０ｎＭの濃度で、十分に標的タンパク質の分解を誘導できる。所定濃度のオーキシンアナログの添加により、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体が形成され、この複合体が分解タグによって標識された標的タンパク質を認識し、標的タンパク質の分解が誘導される。
　本発明の分解方法によれば、オーキシンアナログ特異的に標的タンパク質の分解を誘導できる。
≪化合物≫
　本発明の化合物は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ３０は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ３１は、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３０が、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基である場合、Ｒ３１は、炭素数１～６のアルキル基である。）
　Ｒ３０のハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。
　Ｒ３０及びＲ３１のアルキル基としては、例えば、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、シクロペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、３，３－ジメチルブチル基等が挙げられる。中でも、炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
　一般式（ＩＩ）で表される化合物のうち、下記式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－４）で表される化合物が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
≪細胞≫
　本発明の細胞は、標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する。
　本発明の細胞は、第一の核酸をセーフハーバー座位に有することが好ましい。
　細胞としては、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、
非植物由来の真核細胞であれば特に限定されず、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。
　ＴＩＲ１ファミリータンパク質としては、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、イネ由来のＴＩＲ１タンパク質である、ＯｓＴＩＲ１タンパク質が好ましい。
　変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているものが好ましく、Ｇに変異しているものがより好ましい。
　具体的には、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたものと同様であり、上述した（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、オーキシンアナログとの複合体を介して、分解タグと結合して標的タンパク質を分解に導くタンパク質が特に好ましい。
　本発明の細胞は、更に、少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸と、を含む染色体を有することが好ましい。
　第一の核酸、第二の核酸、及び第三の核酸の染色体への導入方法としては、特に限定されず、≪オーキシンデグロンシステムのキット≫で述べたように、ＣＲＩＳＰＲシステム等ゲノム編集技術を用いて導入してもよく、トランスポゾンベクターを用いて導入してもよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１．オーキシンアナログの合成
　式（Ｉ－２）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を合成した。
２．細胞の準備
　ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）－ＮＬＳ（核移行シグナル）遺伝子がＰ２Ａ配列を介してコードされるＤＮＡがトランスポゾンにより染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」又は「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」と称する）を準備した（図１参照。）。
３．オーキシンアナログの添加
　ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンアナログ（培地中の濃度：０、２００μＭ）を添加して、２４時間培養した。また、対照として、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンを添加した細胞も準備した。
３．ＦＡＣＳ解析
　オーキシンアナログの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図１に示す。
　図１から、オーキシンアナログを添加したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞では、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞と比較して、分解誘導前の発現が高く均一である。さらに、オーキシンアナログを添加したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞では、オーキシンを添加したＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞と比較して、よりシャープにＧＦＰの分解が観察された。
　更に同様の実験を、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞に１００μＭオーキシンを添加し、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞に、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加し、４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図７（Ａ）に示す。
　同質遺伝的背景で、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を比較したところ、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）においては、オーキシン未添加の状態で、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターレベルが低く、そのシグナルピークが広く、基底分解があることを示していた。ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）に１００μＭオーキシンを添加することにより、シグナルピークが左にシフトし、レポーターが分解したことを示した。 
　対照的に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞では、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの発現レベルが高く、そのシグナルピークがよりシャープであり、これらの細胞では基底分解が、低いことが示された。更に、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを４時間添加すると、レポーターはＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞で効率的に分解された。
　更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞も用い、３つのクローンで同様の実験を行った。結果を図７（Ｂ）に示す。
　図７（Ｂ）に示す様に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現する３つの細胞株は、低発現レベルでより広いピークを示し、オーキシン無しでも基底分解があることを示唆した。
　一方、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）を発現するクローンは、５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加しない状態で、レポーターのより強い発現レベルを示し、基底分解が抑制されたことを示唆している。 
　更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するクローンは、５－Ｐｈ－ＩＡＡ処理によりＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）を発現するクローンと比較して、よりシャープなｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解を示した。 すべての場合において、シグナルピークは、５－Ｐｈ－ＩＡＡ処理後に左にシフトし、分解が誘発されたことを示した。
　ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）をより詳細に比較するために、異なる用量のＩＡＡ（オーキシン）と５－Ｐｈ－ＩＡＡをそれぞれ使用してｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーター分解を誘導した（図１０（Ａ）参照）。図１０（Ａ）に示す様に、 ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞の分解に必要なリガンド濃度は有意に低かった。 ＤＣ５０値（５０％分解の濃度）は、それぞれＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）で、３００±３０ｎＭ及び０．４５±０．０１ｎＭであり、５－Ｐｈ－ＩＡＡを使用したシステムが、従来のオーキシンデグロンシステムと比較して、約６７０倍の低濃度で機能することが確認された。
　標的タンパク質除去による、経時的動態を調べるために、時間経過後のサンプルを取り、レポーターの発現レベルを観察した（図１０（Ｂ）参照。）。本発明に係る分解システム（ＡＩＤ２システムともいう。）は、半減期が６２．３±２．０分で、従来のシステムと比べて、遥かにシャープに機能することが確認された。 
　一方、従来のシステムは、半減期１４７．１±１２．５分で効率が低下していた。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を使用したＡＩＤ２システムは、標的タンパク質の基底分解が少なく、新しい活性化リガンドである５－Ｐｈ－ＩＡＡの濃度が大幅に低くて済み、ターゲットの分解速度が速くなることが確認された。
　ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）と５－Ｐｈ－ＩＡＡのペアを使用したＡＩＤ２システムの可逆性を確認するために、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解を誘発した後に、５－Ｐｈ－ＩＡＡを含まない培地に交換し、レポーターの発現を調べた。結果を図１１に示す。図１１に示す様に、レポーター発現は３時間後に完全に回復し、ＡＩＤ２システムの可逆性が示された。
［実施例２］
１．オーキシンアナログの合成
　式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－６）で示される化合物（５－（３，４－ｄｉＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－７）で示される化合物（５－（３－ＭｅＰｈ）－ＩＡＡともいう。）、式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。）を合成した。式（Ｉ－１－４）で示される化合物（５－（３－ＭｅＯＰｈ）－ＩＡＡともいう。）は、東京化成工業株式会社から購入した。
　以下に、合成した化合物の合成方法を示す。
［5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステルの合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　5-ブロモインドール3-酢酸  (500 mg, 1.97 mmol) のメタノール 溶液（25 mL）を100 mL 丸底フラスコ入れて、撹拌しながら塩化アセチル 1 mL を滴下した。室温で3時間反応させた。反応液を水 100 mL に注ぎ、これを50 mL の酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水 100 mLで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮して茶褐色オイルの5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル（26 mg, 1.96 mmol, 収率99 %) を得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (s, 1H), 7.73 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 7.6, 5.7 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 13.5, 4.8 Hz, 1H), 7.16-7.10 (m, 1H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.71 (s, 3H)，13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.33, 134.80, 129.06, 125.21, 124.42, 121.59, 113.12, 112.730, 108.24, 52.18, 30.98.
［5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステルの合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (540 mg, 2.01 mmol) 、フェニルボロン酸 (467 mg,  3.83 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド[PdCl2(PPhe3)2 ：67 mg, 0.095 mmol]を 、ジメチルホルムアミド 5 mL 、エタノール 5 mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 2 mL を入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステルを橙色オイルとして得た(134 mg, 0.50 mmol,収率25.1 %) 。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.69-7.61 (m, 2H), 7.43 (t, J = 7.8 Hz, 3H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.34-7.28 (m, 1H), 7.16 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.17 (qd, J = 7.1, 4.0 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H),13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.19, 142.64, 135.74, 133.37, 128.74, 127.52, 126.44, 123.88, 122.18, 117.53, 111.52, 109.04, 60.95, 31.50.
［5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステル（式（Ｉ－１－５）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。））の合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステル (124 mg, 0.47 mmol) を10 mL 丸底フラスコにとり、メタノール 1 mL とテトラヒドロフラン1 mLを加えた。これに水酸化リチウム水溶液(23 mg, 0.96 mmolを水1 mL に溶解)を滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌して加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 5 mLと 酢酸エチル 5 mL を加えて酢酸エチル層に生成物を抽出した。さらに酢酸エチル 5 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 10 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-フェニルインドール3-酢酸を淡褐色粉末(98 mg, 0.39 mmol, 収率 83.4 %)として得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, acetone-d6) δ10.61 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.68-7.65 (m, 2H), 7.48-7.46 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 3H), 7.34 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.26 (tt, J = 7.3, 1.4 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6) δ 173.20, 143.65, 137.15, 133.06, 129.51, 129.15, 127.86, 126.96, 125.39, 121.85, 118.07, 112.54, 109.65, 31.39
［5-フェニル-インドール3-酢酸メチルエステルの合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　5-ブロモインドール3-酢酸  (508 mg、2.00 mmol) のエタノール溶液（25 mL）を100 mL 丸底フラスコに入れて、これに撹拌しながら塩化アセチル 1 mL を滴下した。この反応液を室温で3時間撹拌した。反応液を水 100 mL に注ぎ、これを50 mL の酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水 100 mLで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、茶褐色オイルの5-ブロモインドール3-酢酸エチルエステル(556 mg, 1.97 mmol, 収率99 %) を得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.23 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.24 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 2H), 1.28 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172.07, 134.82, 129.05, 125.08, 124.49, 121.64, 112.99, 112.77, 108.21, 61.11, 31.31, 14.32.
［5-(3-メチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルの合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (112 mg, 0.40 mmol) 、3-メチルフェニルボロン酸 (107 mg,  0.79 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（PdCl2(PPhe3)2 ：15 mg, 0.02 mmol)を 、ジメチルホルムアミド １ mL、エタノール １mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 0.5　mLを入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-(3-メチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルを黄色オイル(17 mg, 0.058 mmol, 収率14.6 %)として得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J=7.8, 1H), 7.19 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.16-7.11 (m, 1H), 4.18 (q, J=7.6, 2H), 3.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H),  1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 172.12, 142.59, 138.23, 135.68, 133.51, 128.62, 128.32, 127.84, 127.19, 124.61, 123.74, 122.24, 117.51, 111.39, 109.13, 60.91, 31.49, 21.67, 14.34.
［5-（3-メチルフェニル）-インドール3-酢酸の合成］　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　5-(3-メチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステル (４０mg, 0.14 mmol) を5 mLガラスバイアルにとり、メタノール0.25 mL とテトラヒドロフラン0.25 mL  を加えた。これに、10　%（W/V）水酸化カリウム水溶液0.25　ｍLを滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌し加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 １ mLと 酢酸エチル 2 mL を加えて抽出した。さらに酢酸エチル 2 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 1 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-（3-メチルフェニル）-インドール3-酢酸を淡褐色粉末(29 mg, 0.11 mmol, 収率 80.2 %)として得た。得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (s, 1H), 7.77 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.48-7.40 (m, 3H), 7.36 (d, J=8.7Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.3Hz,1H), 7.16-7.09 (m, 2H), 3.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.84, 142.51, 138.29, 135.63, 133.70, 128.67, 128.36, 127.69, 127.27, 124.68, 124.04, 122.41, 117.34, 111.53, 108.22, 31.07, 21.68.
［5-(3,4-ジメチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルの合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (11３ mg, 0.40 mmol) 、3,4-ジメチルフェニルボロン酸 (120 mg,  0.80 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（PdCl2(PPhe3)2 ：15 mg, 0.02 mmol)を 、ジメチルホルムアミド １ mL、エタノール １mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 0.5　mLを入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-(3,4-ジメチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルを黄色オイル(36 mg, 0.12 mmol, 収率29.2 %)として得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.79 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.22-7.14 (m, 2H), 4.17 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.80 (s, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.31 (s,3H), 1.25 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz CDCl3) δC 172.17, 140.24, 136.80, 135.55, 134.75, 133.44, 130.30, 128.80, 127.83, 124.85, 123.70, 122.15, 117.23, 111.37, 109.04, 60.89, 31.49, 20.04, 19.46, 14.35
［5-(3,4-ジメチルフェニル）-インドール3-酢酸の合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　5-(3,4-ジメチルフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステル (30 mg, 0.098 mmol) を5 mLガラスバイアルにとり、メタノール0.25 mL とテトラヒドロフラン0.25 mL  を加えた。これに10　%（W/V）水酸化カリウム水溶液0.25　ｍLを滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌し加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 １ mLと 酢酸エチル 2 mL を加えて抽出した。さらに酢酸エチル 2 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 1 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-（3,4-ジメチルフェニル）-インドール3-酢酸を淡褐色粉末(20 mg, 0.0716 mmol, 収率 73.4 %)として得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.46-7.40 (m, 2H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.22-7.14 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.30 (s, 3H),13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.32, 140.13, 136.83, 135.50, 134.83, 133.67, 130.05, 128.83, 127.69, 124.89, 123.91, 122.34, 117.10, 111.45, 108.23, 30.99, 20.03, 19.46.
［5-(3-クロロフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルの合成］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　5-ブロモインドール3-酢酸メチルエステル (11３ mg, 0.40 mmol) 、3-クロロフェニルボロン酸 (128 mg,  0.82 mmol)、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド（PdCl2(PPhe3)2 ：15 mg, 0.02 mmol)を 、ジメチルホルムアミド １ mL、エタノール １mL 、3 M 炭酸カリウム水溶液 0.5　mLを入れた50 mL の丸底フラスコに加えた。容器内を窒素置換し、120 ℃ で5時間加熱還流した。反応液に酢酸エチル10 mL と水20 mL を加え、酢酸エチル15 mL で3回抽出した。有機層を飽和食塩水20 mLで洗浄し、続いて無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー ( 溶出溶媒、ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1 ) で精製し、5-(3-クロロフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステルを黄色オイル(25 mg, 0.79 mmol, 収率19.5 %)として得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H),7.80 (s, 1H), 7.63 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.53 (dt, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30-7.24 (m, 1H), 7.23 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.81 (s, 2H), 1.27 (t, 7.2 Hz, 3H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 171.99, 144.48, 135.96, 134.54, 131.96, 129.90, 127.98, 127.52, 126.38, 125.59, 123.99, 121.98, 117.68, 111.61, 109.29, 60.95, 31.45, 14.34.
［5-（3-クロロフェニル）-インドール3-酢酸（式（Ｉ－１－８）で示される化合物（５－（３－ＣｌＰｈ）－ＩＡＡともいう。））の合成]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　5-(3-クロロフェニル)-インドール3-酢酸エチルエステル (38 mg, 0.12 mmol) を5 mLガラスバイアルにとり、メタノール0.25 mL とテトラヒドロフラン0.25 mL  を加えた。これに10　%（W/V）水酸化カリウム水溶液0.25　mLを滴下した。この反応液を室温で2時間攪拌し加水分解した。反応液に 1 M 希塩酸 １ mLと 酢酸エチル 2 mL を加えて抽出した。さらに酢酸エチル 2 mL で3回抽出した。この有機層を飽和食塩水 1 mL で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム :アセトン = 95: 5)で精製し、5-（3-クロロフェニル）-インドール3-酢酸を淡褐色粉末(31 mg, 0.11 mmol, 収率 89.6 %)として得た。
　得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲによる分析結果を以下に示す。
　1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.61 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (dt, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.40 (s, 2H), 7.34 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.26-7.28 (m, 1H), 7.20 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 13C-NMR (100MHz, CDCl3) δC 177.42, 144.36, 135.92, 134.54, 132.15, 129.94, 127.74, 127.54, 126.45, 125.66, 124.26, 122.15, 117.51, 111.73, 108.39, 30.98.
２．細胞の準備
　ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）－ＮＬＳ（核移行シグナル）遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」又は「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞」と称する）を準備した（図１参照。）。
３．オーキシンアナログの添加
　ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンアナログ（培地中の濃度：０、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）を添加して、２４時間培養した。また、対照として、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞にオーキシンを添加した細胞も準備した。
４．ＦＡＣＳ解析
　各オーキシンアナログの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図２に示す。図２において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、オーキシンアナログ溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した細胞を示す。
　図２から、オーキシンアナログを添加したＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞では、オーキシンを添加したＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞と比較して、低濃度でＧＦＰの分解が観察された。
　更に、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳ発現細胞に、低濃度の各オーキシンアナログを処理した。結果を図８に示す。用いたオーキシンアナログの中で、
５－Ｐｈ－ＩＡＡは、１ｎＭおよび１０ｎＭで他の化合物よりより強いｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＮＬＳレポーターの分解誘導の効果を示した。
　ＨＣＴ１１６細胞を、１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡで処理した影響を調べた、図９（Ａ）に示す様に、細胞周期への影響を示さなかった。図９（Ｂ）に示す様に、コロニー形成効率の変化を示さなかった。５－Ｐｈ－ＩＡＡは、効果的なリガンドであり、１μＭでは毒性が無いことが確認された。
［実施例３］
１．細胞の準備
　ＨＣＴ１１６細胞において、セーフハーバー座位であるＡＡＶＳ１遺伝子座に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）遺伝子又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子を導入し、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞を構築した。
２．コロニー形成試験
　ｍＡＩＤとＣｌｏｖｅｒとネオマイシン耐性遺伝子を有し、ｍＡＩＤとネオマイシン耐性遺伝子とを挟むように、ＤＨＣ１遺伝子に対して相同な配列を有するプラスミドベクターを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞、又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞に導入し、内在性のＤＨＣ１遺伝子と相同組換えを行った。次いで、Ｇ４１８によるセレクションの後、形成されたコロニーを、クリスタルバイオレットを用いて染色した。尚、「ＤＨＣ１」とはｄｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ１の略称であり、ダイニン重鎖１を意味する。結果を図３に示す。
　図３から、ＣＲＩＳＰＲ無しでは、耐性遺伝子が働いていないためコロニーの形成は確認されなかった。ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）発現ＨＣＴ１１６細胞では、相同組換えを行った細胞においても、オーキシン非依存的な分解誘導がなされているためか、コロニーの形成は確認されなかった。一方、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞では、相同組換えを行った細胞において、コロニーの形成は確認された。
３．分解誘導試験
　上記２にて相同組換えを行った、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）発現ＨＣＴ１１６細胞（以下、「ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する。）を用いて、ＤＨＣ１の分解誘導試験を行った。
　ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）／ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ発現細胞に、式（Ｉ－２）で示される化合物（５－Ｐｈ－ＩＡＡともいう。）を添加し、２４時間後の細胞の様子を観察した（図４（Ａ））。
　図４（Ａ）に示すように、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加により、ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質が分解されることで、分裂期の細胞の蓄積が観察された。
　更に、ＤＨＣ１の分解をウエスタンブロッティングにより確認した（図４（Ｂ））。図４（Ｂ）に示すように、相同組換えを行って作製したクローン＃１～３の全てにおいて、５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的に、ＤＨＣ１及びｍＡＩＤの分解が確認された。
［実施例４］
　内在性の標的タンパク質分解系を構築するには、以下３点の難点がある。（１）多くの培養細胞は多倍体化しているため、標的遺伝子のアリルが２コピー以上ある。そのため、様々な培養細胞株でこの分解系を構築することが難しい。（２）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）があらかじめ導入された親株を作成する必要がある。（３）多数の分解系を構築してライブラリー化するには手間がかかる。
　係る問題点を解決するために、図５に示す、新たな標的タンパク質分解系を構築した。この分解系では、（１）ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－標的遺伝子が、Ｐ２Ａリンカー遺伝子で繋がれたトランスポゾンベクターと、（２）ｇＲＮＡとＣａｓ９遺伝子を含む、内在性の標的遺伝子をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターを含む。
　この分解系では、トランスポゾンベクターにより、ゲノム中にＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－標的遺伝子をインテグレートさせる一方で、ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターにより、内在性の標的遺伝子をノックアウトする。
　ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）遺伝子とｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＣＥＮＰＨ又はｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＰＯＬＤ１標的遺伝子が、Ｐ２Ａリンカー遺伝子で繋がれたトランスポゾンベクターを作製し、このベクターを内在性ＣＥＮＰＨ又はＰＯＬＤ１遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－ＫＯベクターとともにＨｅＬａ細胞へ導入した。係る細胞へ５－Ｐｈ－ＩＡＡを添加し、標的タンパク質の分解をウエスタンブロッティングにより確認した（図６）。
　図６（Ａ）に抗ＣＥＮＰＨ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。内在性のＣＥＮＰＨ遺伝子がノックアウトされていることが確認され、かつ５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的にｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＣＥＮＰＨの分解が確認された。
　図６（Ｂ）に抗ＰＯＬＤ１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。クローン＃１～３において、内在性のＰＯＬＤ１遺伝子がノックアウトされていることが確認され、かつ５－Ｐｈ－ＩＡＡ依存的にｍＡＩＤ－ＥＧＦＰ－ＰＯＬＤ１の分解が確認された。
［実施例５］
　ＡＩＤ２システムが酵母でも機能することを確認するために、ＧＡＬ１－１０プロモーターの制御下で、ＵＲＡ３遺伝子座に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ、Ｆ７４Ｇ、又はＦ７４Ａ）を導入した（図１２（Ａ）参照。）。その後、必須の複製イニシエーターである、ＭＣＭ１０、ＳＬＤ３、又はＣＤＣ４５をコードする遺伝子にｍＡＩＤタグを付けた。
　例えば、図１２（Ｂ）のＯｓＴＩＲ１ ＯＮ、リガンドなし、ｃｄｃ４５－ｍＡＩＤ等に示されるように、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ又はＦ７４Ａ）を発現している酵母株は、遅い増殖を示し、酵母でより高い基底分解があることを示唆した。
　更に、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ及びＦ７４Ａ）は、５００μＭＩＡＡでこれらｍＡＩＤ導入株の増殖抑制がみられたこのことは、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ａ）がＩＡＡに対する反応性を残していることを示唆している。
　すべての場合において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ又はＦ７４Ａ）を発現する株は、５μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡを含むプレート上で、強い増殖阻害を示した。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ又はＦ７４Ａ）が発現された場合、ｍｃｍ１０－ｍＡＩＤ株及びｓｌｄ３－ｍＡＩＤ株の増殖が強く阻害されることから、ＡＩＤ２システムがより分解能力が高く、強い表現型を示す変異体を製造できることを示している。
［実施例６］
　ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を恒常的に発現するヒトＨＣＴ１１６細胞を材料に、ゲノム編集によりＲＡＤ２１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＲＡＤ２１－ｍＡＣ）細胞を作製し、５－Ｐｈ－ＩＡＡ添加による効果を確認した。図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、 ＲＡＤ２１－ｍＡＣの発現レベルは、添加前の０分でＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現している細胞よりも、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞の方が高く、従来のＡＩＤシステムのにおける基底分解を示している。 
　ＲＡＤ２１－ｍＡＣは、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）両方の場合に、リガンドの添加後に急速に消失した。但し、Ｔ１／２は、ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）とＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）でそれぞれ２６．５分と１１．７分であり、ＲＡＤ２１－ｍＡＣがＡＩＤ２システムによってより速く分解されたことを示している。これらの結果は、ＡＩＤ２システムが、従来のＡＩＤシステムよりもＲＡＤ２１－ｍＡＣをより迅速に制御できることを示している。
　ＡＩＤ２システムによる急速なＲＡＤ２１－ｍＡＣ分解の表現型を見るために、細胞周期を調べたところ、ＲＡＤ２１－ｍＡＣ分解細胞の大部分がＧ２／Ｍ期で停止していることが確認された（図１３（Ｃ）参照。）。ＲＡＤ２１－ｍＡＣ分解細胞は、ＲＡＤ２１の本質的な役割と一致して、姉妹染色分体の対合に重大な欠陥を示した（図１３（Ｄ）参照。）。
［実施例７］
　ＯｓＴＩＲ1（Ｆ７４Ｇ）がより少ない基底分解を示したことに鑑みて、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を恒常的に発現するＨＣＴ１１６細胞で、ＤＨＣ１－ｍＡＩＤ－Ｃｌｏｖｅｒ（ＤＨＣ１－ｍＡＣ）を作製できるかどうか検討した。 ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ又はＦ７４Ｇ）を構成的に発現する親細胞株に、デグロンタグを付加するためのＣＲＩＳＰＲプラスミドと、それぞれネオマイシンまたはハイグロマイシン耐性マーカーを持つ二つのドナーをトランスフェクトした（図１４参照。）。ＯｓＴＩＲ1（Ｆ７４Ｇ）発現細胞において、Ｇ４１８及びハイグロマイシンの存在下で、コロニーは形成され、両アリルでのＤＨＣ１遺伝子にタグが付加された（図１５（Ａ）参照。）。 ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を発現する細胞では、コロニーは形成されなかった。ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現するクローンでは、ＤＨＣ１－ｍＡＣは１μＭ ５－Ｐｈ－ＩＡＡの添加により効率的に分解した（図１５（Ｂ）参照。）。 これらの細胞は有糸分裂で停止し（図１５Ｃ参照。）、有糸分裂紡錘体形成に強い欠陥を示した（図１５（Ｄ）参照。）。これは、ＤＨＣ１が有糸分裂時に形成される紡錘体形成に必須であることと一致している。
　更に、シロイヌナズナのＴＩＲ１パラログであるＡｔＡＦＢ２を用いて、ＤＨＣ１－ｍＡＣ変異体が作製できるかどうか検討した。図１５（Ａ）に示されるように、コロニーを得ることができたが、得られたコロニー数は、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）と比較して少なかった。 
　更に、ｍＡＩＤの代わりに、もう1つのデグロンタグであるｍｉｎｉ－ＩＡＡ７（ｍＩＡＡ７）を用いて同様の実験を行った（図１６参照）。図１６（Ｂ）に示す様に、すべての条件において、コロニー形成が確認された。ただし、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現する細胞と比較して、コロニー数はＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）及びＡｔＡＦＢ２を発現する細胞の方が少なかった。
 ＡｔＡＦＢ２又はＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を発現している細胞で、ｍＩＡＡ７又はｍＡＩＤタグ付きＤＨＣ１の分解を誘導した（図１６（Ｃ）参照）。図１６（Ｃ）において、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）とｍＡＩＤタグの組み合わせが、最も効率的であることが確認された。これは、図１６（Ａ）に示す様に、ｍＩＡＡ７の長さが短いため、及び／又はｍＩＡＡ７のユビキチン化に必要なリジン残基が少ないために、ＩＡＡによる３成分複合体の形成効率が落ちるためと考えられる。
［実施例８］
　ＯｓＴＩＲ１（ＷＴ）を恒常的に発現するＨＣＴ１１６細胞を使用しては、ＡＩＤ細胞株を作製することが困難であった、コンデンシン複合体のサブユニットＳＭＣ２、インシュレータータンパク質ＣＴＣＦ、及びＲＮＡ ポリメラーゼ ２ 最大サブユニット（ＰＯＬＲ２Ａ）について、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現する細胞で、細胞株を作製できるか検討した。図１７に示すように、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現しているＨＣＴ１１６内の内因性ＳＭＣ２、ＣＴＣＦ、及びＰＯＬＲ２Ａの両アリルにタグを付加できることが確認された。これらの細胞株では、１μＭ５－Ｐｈ－ＩＡＡの添加によりｍＡＩＤ融合ターゲットが急速に分解された。これらの結果により、ＯｓＴＩＲ１（Ｆ７４Ｇ）を構成的に発現する細胞を使用するＡＩＤ２システムが、元のＡＩＤシステムを使用して細胞株を作製することが不可能な遺伝子に対しても作製できることが確認された。
　本発明のオーキシンデグロンシステムによれば、オーキシン非依存的な標的タンパク質の分解を阻害することができるため、厳密かつ自在に標的タンパク質の分解制御が可能である。

Claims (15)

  1. 　非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムのキットであって、
    　オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
    　前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質に親和性を有するオーキシンアナログと、
    　少なくとも一部のＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を含み、前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質－前記オーキシンアナログ複合体に親和性を有する分解タグをコードする第二の核酸と、
    を備える、キット。
  2. 　更に、前記第二の核酸の上流又は下流に連結された標的タンパク質をコードする第三の核酸を備える、請求項１に記載のキット。
  3. 　前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 　前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
  5. 　前記オーキシンアナログは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体である、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
  6. 　更に、前記第一の核酸と、前記第二の核酸及び前記第三の核酸との間に、連結された、複数の遺伝子を１つのプロモーターで制御するためのリンカーをコードする第四の核酸を備える、請求項２～５のいずれか一項に記載のキット。
  7. 　更に、前記第一の核酸、並びに／又は、前記第二の核酸及び前記第三の核酸を含むトランスポゾンベクターを備える、請求項２～６のいずれか一項に記載のキット。
  8. 　更に、内在性の標的タンパク質をコードする標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードする第五の核酸を含有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のキット。
  9. 　更に、前記第一の核酸を染色体上に有する非植物由来の真核細胞を備える、請求項１～８のいずれか一項に記載のキット。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のキットを用いる、標的タンパク質の分解方法。
  11. 　非植物由来の真核細胞中の標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる標的タンパク質分解誘導剤であって、
    　下記一般式（Ｉ）で表される化合物、又はそのエステル体を含有する、標的タンパク質分解誘導剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式（Ｉ）中、Ｒ１０は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい環状の脂肪族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよく、環を構成する炭素原子の一部がヘテロ原子で置換されていてもよい芳香族炭化水素基である。）
  12. 　標的タンパク質の分解を制御するオーキシンデグロンシステムに用いられる非植物由来の真核細胞であって、
    　オーキシン結合部位に変異を有する変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸を含む染色体を有する、細胞。
  13. 　前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、イネ由来タンパク質である、請求項１２に記載の細胞。
  14. 　前記変異型ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、ＯｓＴＩＲ１の７４番目のＦが、Ａ、Ｇ、又はＳに変異しているタンパク質である、請求項１２又は１３に記載の細胞。
  15. 　下記式（ＩＩ）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （一般式（ＩＩ）中、Ｒ３０は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ３１は、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基を表す。但し、Ｒ３０が、水素原子、又は炭素数１～６のアルキル基である場合、Ｒ３１は、炭素数１～６のアルキル基である。）
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