WO2021010264A1 - バイオサーファクタント産生組換え微生物 - Google Patents

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あずさ 雜賀
英明 小池
徳馬 福岡
北本　大
知宏 菅原
周平 山本
曽我部　敦
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Toyobo Co Ltd
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Toyobo Co Ltd
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    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries

Definitions

  • Lipase is an enzyme that breaks the ester bonds of triglycerides that make up fats and oils such as vegetable fats and oils and decomposes them into fatty acids and glycerin. Lipase is possessed by many organisms and is used not only for in vivo reactions but also for many industrial purposes.
  • Biosurfactant is a natural surfactant produced by microorganisms, has high biodegradability, low environmental load, and has various beneficial physiological functions. Therefore, when used in the food industry, cosmetics industry, pharmaceutical industry, chemical industry, environmental industry, etc., it is meaningful in realizing an environment-friendly society.
  • Biosurfactants are classified into five types: glycolipid type, acylpeptide type, phospholipid type, fatty acid type and polymer type. Of these, glycolipid-based surfactants have been the most studied. Examples of such glycolipid-based biosurfactants include mannoseyl erythritol (hereinafter, also referred to as ME) in which erythritol is glycosidic bonded to mannose, and mannosyl erythritol lipid (hereinafter, also referred to as MEL) in which fatty acid is ester-bonded. , Ramnolipid, ustyrazine acid, trehalose lipid, sophorose lipid and the like are known.
  • ME mannoseyl erythritol
  • MEL mannosyl erythritol lipid
  • Ramnolipid, ustyrazine acid, trehalose lipid, sophorose lipid and the like are known.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 35 g / L (production rate: 0.3 g / L / h, production rate: 0.3 g / L / h, from 5% by mass of soybean oil using Candida sp. B-7 strain in 5 days, It has been reported that it is possible to produce MEL (raw material yield: 70% by mass).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 describe 38 g / L (production rate: 0.2 g / L / h, raw material) from 8% by mass soybean oil using Candida antarctica T-34 strain in 8 days. It has been reported that it is possible to produce MEL (yield: 48% by mass).
  • Non-Patent Document 5 110 g / L (production rate: 0.2 g) from 25% by mass of peanut oil 24 days later by sequential infusion of Candida antarctica T-34 strain three times at 6-day intervals. It has been reported that it is possible to produce MEL (/ L / h, raw material yield: 44% by mass).
  • Non-Patent Document 6 50 g / L (production rate: 0.25 g / L / h, production rate: 0.25 g / L / h, of 10% by mass of vegetable oil and fat by batch culture method using Candida sp.
  • FIG. 1 shows the structural formulas of MEL in which hydrogen atoms, acetyl groups, and fatty acid residues having 3 to 18 carbon atoms are represented by R 1 to R 5 .
  • the structure in which R 1 and R 2 are fatty acid residues and R 3 and R 4 are acetyl groups is MEL-A, and the structure in which R 3 is a hydrogen atom and R 4 is an acetyl group is MEL-B.
  • a structure in which R 3 is an acetyl group and R 4 is a hydrogen atom is defined as MEL-C
  • a structure in which R 3 and R 4 are hydrogen atoms is defined as MEL-D.
  • the structure of the obtained ME differs as shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b) depending on whether the hydroxymethyl group of erythritol bonded to mannose is derived from the carbon at the 1-position or the carbon at the 4-position. ..
  • the Candida antarctica T-34 strain produces a compound having 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol as a sugar skeleton shown in FIG. 2 (a).
  • the obtained 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol Lipid is also referred to as 4-O- ⁇ -MEL.
  • Pseudozaima tsukubaensis 1E5 strain produces 70 g / L (production rate: 0.4 g / L / h, raw material yield: 35 mass%) of 1-O- ⁇ -MEL-B from 20 mass% olive oil in 7 days. It has been reported that this is possible (see Non-Patent Document 7), and it is sold as a cosmetic material.
  • Patent Document 1 discloses that a biosurfactant-producing microorganism is transformed with a lipase gene.
  • One challenge is to provide a means for further improvement of such means.
  • Item 1 A mannosylerythritol lipid-producing microorganism transformed with an expression vector having a gene encoding lipase under the control of the E5Pgap promoter or the E5Ptef promoter.
  • Item 2 Item 2.
  • Item 3 Item 2.
  • Item 4 Item 3.
  • Item 5 An expression vector having a gene encoding lipase under the control of the E5Pgap promoter or the E5Ptef promoter.
  • Item 6 Item 5.
  • the expression vector according to Item 5 wherein the gene encoding lipase is derived from a microorganism of the genus Pseudozyma.
  • Item 7 Item 5.
  • Item 8 Item 3.
  • Item 9 A method for producing mannosyl erythritol lipid production using the mannosyl erythritol lipid-producing microorganism according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 10 A method for producing mannosyl erythritol lipid production, which comprises culturing the mannosyl erythritol lipid-producing microorganism according to any one of Items 1 to 4 in a medium containing vegetable oil.
  • MEL The structure of MEL is shown.
  • the structures of 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol (a) and 1-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol (b) are shown.
  • the structure of the expression vector pUC T _neo :: PaLIPA is shown.
  • the results of detecting lipase in the culture supernatant by the SDS-PAGE method when the exogenous lipase-introduced strain and the control were cultured are shown.
  • the results of measuring the cell growth amount (a) and lipase activity (b) of the exogenous lipase-introduced strain and the control are shown.
  • the results of HPLC measurement of the cell growth amount (a) of the exogenous lipase-introduced strain and the control and the production of MEL are shown.
  • the results of measuring the consumption of raw material fats and oils by the exogenous lipase-introduced strain and the control by thin layer chromatography (a) and HPLC (b) are shown.
  • the nucleotide sequence of Pgap derived from Pseudozaima tsukubaensis is shown.
  • the nucleotide sequence of Ptef derived from Pseudozaima tsukubaensis is shown.
  • the nucleotide sequence of Pubq derived from Pseudozaima tsukubaensis is shown.
  • the mannosyl erythritol-producing microorganism is transformed with a gene encoding lipase under the control of a specific promoter.
  • the particular promoter is preferably a highly expressed promoter suitable for the host.
  • the specific promoter is preferably a promoter derived from a microorganism belonging to the genus Pseudozyma, more preferably a promoter derived from Pseudozyma tsukubaensis.
  • the particular promoter is the promoter of the glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase gene (Pgap), the promoter of the elongation factor EF-1 (Ptef), or the promoter of the ubiquitin gene (Pubq) of the Pseudozaima genus microorganism. Is preferable.
  • the particular promoter is preferably Pgap or Ptef, more preferably Ptef.
  • the nucleotide sequence of Pgap derived from Pseudozaima tsukubaensis is shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1).
  • the nucleotide sequence of Ptef derived from Pseudozaima tsukubaensis is shown in FIG. 9 (SEQ ID NO: 2).
  • the nucleotide sequence of Pubq derived from Pseudozaima tsukubaensis is shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 3).
  • Highly expressed promoters can be selected by analysis of expression frequency by RNA sequence.
  • the specific promoter preferably has a base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 or a base sequence having 80% or more identity with the base sequence.
  • the identity is preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • Such promoters can be obtained by any method. For example, it can be produced by using a genetic engineering method and a chemical synthesis method (for example, a liquid phase method and a solid phase method).
  • the promoter refers to substitutions, deletions, insertions, additions and / or inversions of one or several bases in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-3 (hereinafter collectively referred to as "mutations"). It may be a sequence having promoter activity.
  • “several” is not limited as long as the promoter activity is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of the total sequence, preferably a number corresponding to less than about 15%, and further. It is preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%.
  • 2 to 100 pieces preferably 2 to 80 pieces, more preferably 2 to 60 pieces, still more preferably 2 to 40 pieces, still more preferably 2 to 20 pieces, still more preferably. It is 2 to 15, more preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 5.
  • the lipase used for the recombination of the microorganism is not particularly limited as long as it is expressed in the microorganism and exhibits lipase activity (that is, functions), and can be arbitrarily selected. Therefore, the origin of lipase may be any of microorganisms, plants and animals.
  • the preferred lipase in one embodiment is of microbial origin.
  • the preferred microorganisms from which lipases are derived are the genera Pseudozyma, Ustilago, Sparisorium, MELanopsichium, Moesziomyces, and Kurtumanomyces.
  • Preferred Pseudozyma genus microorganisms are Pseudozyma antarctica (Moesziomyces antarcticus), Pseudozyma aphidis (Moesziomyces aphidis), Pseudozyma hubeiensis, and Pseudozyma tsukubaensis.
  • Preferred Ustilago microorganisms are Ustilago hordei and Ustilago maydis.
  • Preferred Sporisorium genus microorganisms are Sporisorium reilianum and Sporisorium scitamineum.
  • a preferred MELanopsichium genus microorganism is MELanopsichium pennsylvanicum.
  • a preferred microorganism of the genus Kurtzmanomyces is Kurtzmanomyces sp. I-11.
  • the lipase preferably has the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 13 or an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence.
  • the identity is preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • a lipase can be obtained by any method. For example, it can be produced by using a genetic engineering method and a chemical synthesis method (for example, a liquid phase method and a solid phase method).
  • the nucleic acid encoding lipase can also be obtained by using an arbitrary method (for example, a genetic engineering method and a chemical method).
  • SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of Lipase A derived from P. antarctica T-34.
  • SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of the lipase derived from Pseudozyma aphidis DSM70725.
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of lipase derived from Pseudozyma hubeiensis SY62.
  • SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of the lipase derived from Ustilago hordei.
  • SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of the lipase derived from Ustilago maydis 521.
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of the lipase derived from Sparisorium reilianum SRZ2.
  • SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of lipase derived from Sporisorium scitamineum.
  • SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of the lipase derived from Melanopsichium pennsylvanicum 4.
  • SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of the lipase derived from Kurtzmanomyces sp. I-11.
  • the preferred lipase in one embodiment is LIP-A from P. antarctica T-34.
  • the P. antarctica T-34 is also referred to as the "Moesziomyces antarcticus T-34".
  • P. aphidis is also called “Moesziomyces aphidis”.
  • Amino acid sequence and base sequence identity can be calculated using commercially available analysis tools available on the Internet or using software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, etc.
  • FASTA Altschul et al.
  • BLAST Altschul et al.
  • PSI-BLAST PSI-BLAST
  • SSEARCH SSEARCH
  • the main initial conditions commonly used for BLAST searches are as follows. That is, in Advanced BLAST 2.1, blastp is used for the program, Expect value is 10, Filter is all OFF, BLOSUM62 is used for Matrix, and Gap presence cost, Per default gap cost, and Lambda ratio are 11, 1, 0.85, respectively.
  • the value (%) of the identity of the amino acid sequence or the base sequence can be calculated by setting (default value) and setting various other parameters to the default value and performing a search.
  • the lipase is a substitution, deletion, insertion, addition and / or inversion of one or several amino acids in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 to 13 (hereinafter collectively referred to as "these are collectively referred to as”. It may be a polypeptide having a lipase activity, consisting of an amino acid sequence that has been “mutated”.
  • “several” is not limited as long as the lipase activity is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 15%, and further.
  • amino acid substitution is not particularly limited, but conservative amino acid substitution is preferable from the viewpoint of not significantly affecting lipase.
  • Constant amino acid substitution means substituting an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having similar properties.
  • Amino acid residues depending on their side chain, are basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg aspartic acid, glutamate), uncharged polar side chains (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine).
  • Cysteine non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, It is classified into several families, such as tryptophan (histidine).
  • Conservative amino acid substitutions are preferably substitutions between amino acid residues within the same family.
  • One or several mutations can be treated with restriction enzymes, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., and known methods such as position-specific mutation introduction method (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Can be introduced using.
  • the variant can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • Variants also include naturally occurring variants (eg, single nucleotide polymorphisms), such as when based on individual differences in lipase-bearing microorganisms, species or genus differences.
  • the mutation is preferably present at a site that does not affect the active site or substrate binding site of FGDH.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is shown in SEQ ID NO: 17.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is shown in SEQ ID NO: 19.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • composition of the expression vector is arbitrary as long as it has a gene encoding lipase under the control of a specific promoter as described above.
  • an expression vector may have multiple genes encoding lipase under the control of a particular promoter.
  • the plurality of genes encoding lipase may be homologous or heterologous to each other.
  • the expression vector may contain multiple cassettes consisting of genes encoding lipases under the control of a particular promoter.
  • the plurality of genes encoding lipase contained in the expression vector may be the same or different from each other.
  • the specific promoters contained in each cassette may be the same or different from each other.
  • the mannosyl erythritol lipid-producing microorganism is transformed with an expression vector having a gene encoding the above lipase under the above promoter.
  • the host microorganism to be transformed is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing mannosylerythritol lipid (MEL-producing microorganism), and can be arbitrarily selected and used.
  • MEL-producing microorganism microorganism capable of producing mannosylerythritol lipid
  • Examples of microorganisms capable of producing mannosyl erythritol lipid include microorganisms belonging to the genus Pseudozyma.
  • microorganisms capable of producing the preferred mannosyl erythritol lipids include Pseudozyma tsukubaensis, Pseudozaima antarctica, Pseudozaima lugurosa, Pseudozaima aphidis, Pseudozaima paraantarctica, Pseudozaima hubayensis. It is a microorganism to which it belongs.
  • Preferred MEL-producing strains contained in the Tsukubaensis species include NBRC1940 strain, KM-160 strain, 1D9 strain, 1D10 strain, 1D11 strain, 1E5 strain, and JCM16987 strain.
  • 1-O- ⁇ -MEL-B produced by Pseudozaima tsukubaensis has higher hydration than 4-O- ⁇ -MEL-B and is useful in water-based applications.
  • the means for introducing the nucleic acid encoding lipase into the host cell is arbitrary and is not particularly limited.
  • the nucleic acid can be incorporated into a vector suitable for the host and introduced into the host cell by any method.
  • a vector is a nucleic acid molecule (carrier) capable of transporting a nucleic acid molecule incorporated therein into a cell.
  • the transformation may be transient or stable transformation. In one embodiment, the transformation is preferably a stable transformation.
  • the type and structure of the vector are not particularly limited as long as they can be replicated and expressed in the host cell.
  • the type of vector can be appropriately selected depending on the type of host cell.
  • Specific examples of the vector include a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, a virus vector (adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpesvirus vector, etc.) and the like.
  • the preferred vector in one embodiment is a plasmid vector.
  • Examples of plasmid vectors for the genus Pseudozaima include pUXV1 ATCC 77463, pUXV2 ATCC 77464, pUXV5 ATCC 77468, pUXV6 ATCC 77469, pUXV7 ATCC 77470, pUXV8 ATCC 77471, pUXV3 ATCC 77465, pU2X1 ATCC 77466, pU2X1 , PUXV1-neo, pPAX1-neo, pPAA1-neo, pUC_neo, pUC T _neo and the like can be exemplified.
  • the preferred vectors are pUXV1-neo, pPAX1-neo, pPAA1-neo, pUC_neo and pUC T _neo.
  • an expression vector containing a selectable marker can also be used. Insertion of nucleic acid into vector, insertion of selectable marker gene, insertion of promoter, etc. are performed using standard recombinant DNA technology (see, for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). be able to.
  • the method of introducing the vector into the host cell is arbitrary, and can be appropriately selected depending on the type of the host cell and the vector.
  • the vector introduction method can be carried out by, for example, electroporation, calcium phosphate co-precipitation method, lipofection, microinjection, lithium acetate method and the like.
  • the method for introducing the vector into the host cell is preferably to unify the plasmid vector by restriction enzyme treatment before introducing the vector. As a result, stable transformation can be achieved by incorporating the introduced gene into the genomic gene.
  • Whether or not a recombinant microorganism was obtained by introducing nucleic acid can be confirmed by any method. For example, it can be confirmed that a desired recombinant microorganism has been obtained by confirming the presence or absence of lipase activity imparted by the introduction of an exogenous nucleic acid. Confirmation of lipase activity can be performed by any method.
  • Recombinant microorganisms can produce mannosyl erythritol lipids more efficiently by having lipase activity and mannosyl erythritol lipid production ability.
  • the type of mannosyl erythritol lipid produced by the recombinant microorganism is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the preferred MELs are 1-O- ⁇ -MEL-B and 4-O- ⁇ -MEL-B, more preferably 1-O- ⁇ -MEL-B.
  • 4-O- ⁇ -MEL-B may be any of MEL-A, MEL-B, MEL-C, and MEL-D.
  • MEL production using recombinant microorganisms can be performed by any method. For example, it can be carried out by culturing the recombinant microorganism in a medium suitable for the production of MEL.
  • vegetable oil when producing MEL using recombinant microorganisms, it is preferable to add vegetable oil to the medium.
  • the type of vegetable oil is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of target MEL and the like.
  • soybean oil, olive oil, rapeseed oil, safflower oil, sesame oil, palm oil, sunflower oil, coconut oil, cocoa butter, castor oil and the like can be mentioned.
  • the preferred fat and oil in one embodiment is olive oil.
  • the culture conditions for recombinant microorganisms are not particularly limited.
  • the recombinant microorganism belongs to the genus Pseudozaima, it can be cultured for 3 to 7 days under the conditions of pH 5 to 8, preferably pH 6, temperature 20 to 35 ° C., preferably 22 to 28 ° C.
  • MEL can be recovered from the culture medium according to a conventional method.
  • MEL production medium Prepared by dissolving 5 g of yeast extract, 3 g of sodium nitrate, 0.3 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.3 g of magnesium sulfate / heptahydrate, and 20 g of glycerol in 1 L of deionized water.
  • RNA sequence analysis 2-1 Strain culture The above Pseudozyma tsukubaensis 1E5 strain was inoculated into 30 mL of a medium containing 4% olive oil added to MEL medium, and cultured at 25 ° C. for 2 days with shaking.
  • RNA was purified with the Oligotex-dT30 ⁇ super> mRNA purification kit (Takara) to obtain mRNA. The purity and amount of the obtained mRNA were confirmed with a spectrophotometer.
  • RNA library The extracted mRNA was processed using the NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs) and NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England BioLabs) according to the manual attached to the kit to create a library. ..
  • SEQ ID NO: 5 is a nucleotide sequence encoding lipase A of the Pseudozyma antarctica T-34 strain.
  • SEQ ID NO: 23 a forward primer in which a sequence homologous sequence with the vector of 15 bp is added upstream of the start codon
  • SEQ ID NO: 23 a reverse primer in which the sequence homologous sequence with the vector is added downstream of the stop codon
  • the gene was amplified using the genomic DNA of the Pseudozyma antarctica T-34 strain obtained in the above as a template.
  • the amplified gene contains the expression vector pUC T _neo (Ustilago maydis-derived replication initiation site (UARS)), the G418 resistance gene, and the gap terminator derived from the Pseudozyma antarctica T-34 strain, which was cleaved at the SmaI site. ) was linked using an in-fusion cloning kit (Takara).
  • a gap promoter (T34Pgap or E5Pgap, SEQ ID NOs: 4 and 1) was added to the upstream of the sequence.
  • Amplification was performed using a forward primer (SEQ ID NOs: 25 and 26) and a reverse primer (SEQ ID NOs: 27 and 28) in which the XbaI site was added downstream of the sequence.
  • the tef promoter (E5Ptef, SEQ ID NO: 2) and the ubq promoter (E5Pubq, SEQ ID NO: 3) are forwarded by adding a sequence homologous to the vector 15 bp upstream of the sequence.
  • Amplification was performed using a primer (SEQ ID NOs: 29 and 30) and a reverse primer (SEQ ID NOs: 31 and 32) in which a sequence homologous to the vector of 15 bp was added downstream of the sequence.
  • transformant 3-2 The gene expression vector pUC T _neo :: PaLIPA, which expresses the lipase A gene under the control of any of the T34Pgap, E5Pgap, E5Ptef, and E5Pubq promoters obtained in the above, was linearized by restriction enzyme SsPI treatment and electroporated. Pseudozyma tsukubaensis 1E5 strain was transformed by the poration method.
  • the insert-free vector pUC T _neo was linearized by the restriction enzyme SspI treatment and then introduced into the Pseudozyma tsukubaensis 1E5 strain by the electroporation method. G418 was used for selection of transformants.
  • T34P gap is a pUC T _neo :: PaLIPA (T34Pgap) -introduced strain
  • E5P gap is a pUC T _neo :: PaLIPA (E5Pgap) -introduced strain
  • E5 Ptef is a pUC T _neo: : PaLIPA (E5Ptef) -introduced strain
  • E5Pubq indicates pUC T _neo :: PaLIPA (E5Pubq) -introduced strain, respectively.
  • the strain into which the expression vector using the three promoters E5Pgap, E5Ptef, and E5Pubq derived from Pseudozyma tsukubaensis 1E5 strain was introduced is a control or T34Pgap derived from Pseudozyma antarctica T-34 strain.
  • the band derived from lipase A was detected more densely than the strain into which the expression vector was introduced, and it was confirmed that the expression level of lipase in the culture supernatant was improved.
  • the lipase activity in the culture supernatant of each transformant was measured using Lipase Activity Assay Kit (Cayman Chemical).
  • the amount of enzyme required to consume 1 nmol of substrate per minute was set to 1 Unit (Fig. 5 (b)).
  • the strain into which the expression vector using the three promoters E5Pgap, E5Ptef, and E5Pubq derived from Pseudozyma tsukubaensis 1E5 strain was introduced is a control or T34Pgap derived from Pseudozyma antarctica T-34 strain. It was confirmed that the lipase activity was significantly improved as compared with the strain into which the expression vector using the above was introduced.
  • the wild-type 1E5 strain and the transformants (Nega and E5Ptef) prepared in 4 above were cultured in 100 mL of glycerol-added YM medium at 25 ° C. for 1 day with shaking to obtain a preculture solution. Then, 60 mL of the preculture solution was inoculated into 6 L / 10 L of the medium containing 15% olive oil added to the MEL medium, and cultured at 25 ° C. for 3 days. An equal amount of ethyl acetate was added to the obtained culture solution, and the mixture was sufficiently stirred, and then the ethyl acetate layer was separated. The MEL contained in the ethyl acetate layer was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC). In addition, the area area ratio obtained by HPLC was also measured for changes in the amounts of residual olive oil and fatty acids.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the strain into which the expression vector using the E5Ptef promoter was introduced showed high MEL productivity as compared with the wild strain and the Nega strain. From the proportion of olive oil remaining in the culture broth shown in FIG. 12, it was found that the E5Ptef-introduced strain had a much faster decomposition rate of olive oil than the wild strain and Nega. Further, as shown in FIG. 13, the fatty acid production rate is high in the E5 Ptef-introduced strain so as to be linked with the residual olive oil in FIG. These results indicate that the E5Ptef-introduced strain promotes the decomposition of olive oil, rapidly produces fatty acids that serve as substrates for MEL, and proceeds to MEL synthesis.

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Abstract

MELの生産効率を高める手段を提供すること。　E5Pgapプロモーター又はE5Ptefプロモーターの制御下にリパーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターで形質転換されている、マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。

Description

バイオサーファクタント産生組換え微生物
　微生物を用いたバイオサーファクタントの製造に関する技術が開示される。
　リパーゼは、植物油脂等の油脂類を構成するトリグリセリドのエステル結合を切断し、脂肪酸とグリセリンに分解する酵素である。リパーゼは多くの生物が保有し、生体内の反応のみならず、多くの工業用途に使用されている。
　バイオサーファクタントは微生物が生産する天然の界面活性剤であり、生分解性が高く、環境低負荷であり、種々の有益な生理機能を有する。よって、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境工業分野等で使用すれば、環境調和型の社会を実現する上で有意義である。
　バイオサーファクタントは、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系および高分子系の5つに分類される。これらの中でも、糖脂質系の界面活性剤が最もよく研究されている。このような糖脂質系のバイオサーファクタントとしては、マンノースにエリスリトールがグリコシド結合したマンノシルエリスリトール（以下、MEとも称す。）に、更に脂肪酸がエステル結合したマンノシルエリスリトールリピッド（以下、MELとも称す。）、並びに、ラムノリピッド、ユスチラジン酸、トレハロースリピッド、及びソホロースリピッド等が知られている。
　MELについては、植物油脂等の油脂類を原料に製造された例が多く報告されている。例えば、非特許文献１及び２には、カンジダ・エスピー（Candida sp.） B-7株を用いて5質量%の大豆油から5日間で35g／L（生産速度：0.3g／L／h、原料収率：70質量％）のMELの生産が可能であることが報告されている。非特許文献３及び４には、カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）T-34株を用いて8質量％の大豆油から8日間で38g／L（生産速度：0.2g／L／h、原料収率：48質量%）のMELの生産が可能であることが報告されている。
　非特許文献５には、カンジダ・アンタークティカT-34株を用いて6日間隔で計3回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から110g／L（生産速度：0.2g／L／h、原料収率：44質量%）のMELの生産が可能であることが報告されている。非特許文献６には、カンジダ・エスピー（Candida sp.）SY-16株を用いて10質量%の植物油脂から回分培養法により200時間で50g／L（生産速度：0.25g／L／h、原料収率：50質量%）のMELの生産が可能であると共に、流加培養法により20質量%の植物油から200時間で120g／L（生産速度：0.6g／L／h、原料収率：50質量%）のMELの生産が可能であることが報告されている。
　MELには結合する脂肪酸残基並びにアセチル基の位置及び数等が相違する種々の構造が存在する。図１に、水素原子、アセチル基、及び炭素数3～18の脂肪酸残基をR1～R5で示したMELの構造式を示す。R1およびR2が脂肪酸残基であり、かつR3およびR4がアセチル基である構造物はMEL－A、R3が水素原子でありR4がアセチル基である構造物はMEL－B、R3がアセチル基でR4が水素原子である構造物はMEL－C、R3およびR4が水素原子である構造物はMEL－Dと定義される。マンノースと結合するエリスリトールのヒドロキシメチル基が1位の炭素に由来するか、4位の炭素に由来するかによって、得られるMEの構造は図２（ａ）、（ｂ）に示すように相違する。前記カンジダ・アンタークティカ T-34株は図２（ａ）に示される4－O－β－D－mannopyranosyl－erythritolを糖骨格とする化合物を生成する。得られる4－O－β－D－mannopyranosyl－erythritol Lipidを4－O－β－MELとも称する。
　多くの種類の微生物が上記の4－O－β－MELを生成するのに対して、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）はオリーブ油を原料に、図２（ｂ）に示される1－O－β－D－mannopyranosyl－erythritolを糖骨格とする1－O－β－D－mannopyranosyl－erythritol Lipid－B（以下、1－O－β－MEL－Bとも称す。）を生成する。1－O－β－MEL－Bは、4－O－β－MEL－Bと比べて水和性が向上し、ベシクル形成能も高いという特徴を持ち、スキンケア剤などとして有望なバイオ素材である。シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株は20質量%のオリーブ油から7日間で70g／L（生産速度：0.4g／L／h、原料収率：35質量%）の1－O－β－MEL－Bの生産が可能であることが報告されており（非特許文献７参照）、化粧品素材として販売されている。
WO2017/208791
T．Nakahara，H．Kawasaki，T．Sugisawa，Y．Takamori　and　T．Tabuchi：J．Ferment．Technol．，61，19（1983） H．Kawasaki，T．Nakahara，M．Oogaki　and T．Tabuchi：J．Ferment．Technol．，61,143（1983） D．Kitamoto，S．Akiba，C．Hioki and T．Tabuchi：Agric．Biol．Chem．，54，31（1990） D．Kitamoto，K．Haneishi，T．Nakahara and T．Tabuchi：Agric．Biol．Chem．，54，37（1990） D．Kitamoto，K．Fijishiro，H．Yanagishita，T．Nakane and T．Nakahara：Biotechnol．Lett．，14,305（1992） 金，伊炳大，桂樹徹，谷吉樹：平成10年日本生物工学会大会要旨，p195 T．Morita，M．Takashima，T．Fukuoka，M．Konishi，T．Imura，D．Kitamoto：Appl．Microbiol．Biotechnol．，　88,679（2010）
　MELを食品工業、医薬品工業、及び化学工業などで広く普及させるためには、MELの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが望ましい。そのようなMELの生産効率を高める手段として、特許文献１には、バイオサーファクタント産生微生物をリパーゼ遺伝子で形質転換することが開示されている。斯かる手段の更なる改良手段を提供することが一つの課題である。
　斯かる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、リパーゼ遺伝子を特定のプロモーターで制御することにより、バイオサーファクタントの生産効率が飛躍的に高まることが見出された。これらの知見に基づき、更なる研究と検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。
項１
E5Pgapプロモーター又はE5Ptefプロモーターの制御下にリパーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターで形質転換されている、マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。
項２
マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物がシュードザイマ属微生物である、項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。
項３
リパーゼをコードする遺伝子がシュードザイマ属微生物由来である、項１又は２に記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。
項４
マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物がシュードザイマ・ツクバエンシスである、項１～３のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。
項５
E5Pgapプロモーター又はE5Ptefプロモーターの制御下にリパーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクター。
項６
リパーゼをコードする遺伝子がシュードザイマ属微生物由来である、項５に記載の発現ベクター。
項７
マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を形質転換するための発現ベクターである、項５又は６に記載の発現ベクター。
項８
項５～７のいずれかに記載の発現ベクターでマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を形質転換することを含む、項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を製造する方法。
項９
項１～４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を用いて、マンノシルエリスリトールリピッド産生を製造する方法。
項１０
項１～４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を植物油脂を含む培地で培養することを含む、マンノシルエリスリトールリピッド産生を製造する方法。
　効率的にバイオサーファクタントを製造することが可能である。
MELの構造を示す。 4－O－β－D－mannopyranosyl－erythritol（ａ）及び1－O－β－D－mannopyranosyl－erythritol（ｂ）の構造を示す。 発現ベクターpUCT_neo::PaLIPAの構造を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールを培養した際の、培養上清中のリパーゼをSDS－PAGE法で検出した結果を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールの菌体増殖量（ａ）及びリパーゼ活性（ｂ）を測定した結果を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールの菌体増殖量（ａ）及びMELの生産をHPLCで測定した結果を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールによる原料油脂の消費量を薄層クロマトグラフィー（ａ）及びHPLC（ｂ）で測定した結果を示す。 シュードザイマ・ツクバエンシス由来のPgapの塩基配列を示す。 シュードザイマ・ツクバエンシス由来のPtefの塩基配列を示す。 シュードザイマ・ツクバエンシス由来のPubqの塩基配列を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールのMEL生産をHPLCで測定した結果を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールのオリーブ油消費をHPLCで測定した結果を示す。 外因性リパーゼ導入株及びコントロールの脂肪酸生産をHPLCで測定した結果を示す。
　マンノシルエリスリトール産生微生物は、特定のプロモーターの制御下にあるリパーゼをコードする遺伝子で形質転換されていることが好ましい。一実施形態において特定のプロモーターは、宿主に適した高発現プロモーターであることが好ましい。一実施形態において特定のプロモーターは、シュードザイマ属微生物に由来するプロモーターであることが好ましく、シュードザイマ・ツクバエンシス由来のプロモーターがより好ましい。一実施形態において、特定のプロモーターは、シュードザイマ属微生物のグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Pgap）、伸長因子EF-1のプロモーター（Ptef）、又はユビキチン遺伝子のプロモーター（Pubq）であることが好ましい。一実施形態において、特定のプロモーターは、Pgap又はPtefであることが好ましく、Ptefであることがより好ましい。シュードザイマ・ツクバエンシス由来のPgapの塩基配列を図８（配列番号１）に示す。シュードザイマ・ツクバエンシス由来のPtefの塩基配列を図９（配列番号２）に示す。シュードザイマ・ツクバエンシス由来のPubqの塩基配列を図１０（配列番号３）に示す。高発現プロモーターは、RNAシーケンスによる発現頻度の解析により選抜することが出来る。
　好ましい一実施形態において、特定のプロモーターは、配列番号１～３のいずれかの塩基配列又はそれと80%以上の同一性を有する塩基配列を有することが好ましい。同一性は、好ましくは85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上である。このようなプロモーターは、任意の手法で得ることができる。例えば、遺伝子工学的な手法及び化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することが可能である。
　他の実施形態において、プロモーターは、配列番号１～３の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）した配列からなり、プロモーター活性を有する配列であってもよい。ここで「数個」とは、プロモーター活性が維持される限り制限されないが、例えば、全配列の約20%未満に相当する数であり、好ましくは約15%未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10%未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5%未満に相当する数であり、最も好ましくは約1%未満に相当する数である。より具体的には、例えば、2～100個、好ましくは2～80個、より好ましくは2～60個、更に好ましくは2～40個であり、より更に好ましくは2～20個、一層好ましくは2～15個、より一層好ましくは2～10個、特に好ましくは2～5個である。
　微生物の組換えに使用するリパーゼは、微生物において発現され、リパーゼ活性を発揮する（即ち、機能する）限り特に制限されず、任意に選択することができる。よって、リパーゼの由来は、微生物、植物及び動物のいずれでもよい。一実施形態において好ましいリパーゼは微生物由来である。一実施形態において、リパーゼの由来として好ましい微生物は、シュードザイマ属、ウスチラゴ属、Sporisorium属、MELanopsichium属、Moesziomyces属、及びクルツマノマイセス属である。好ましいシュードザイマ属微生物は、Pseudozyma antarctica（Moesziomyces antarcticus）、Pseudozyma aphidis（Moesziomyces aphidis）、Pseudozyma hubeiensis、及びPseudozyma tsukubaensisである。好ましいウスチラゴ属微生物は、Ustilago hordei及びUstilago maydisである。好ましいSporisorium属微生物は、Sporisorium reilianum及びSporisorium scitamineumである。好ましいMELanopsichium属微生物は、MELanopsichium pennsylvanicumである。好ましいクルツマノマイセス属微生物は、Kurtzmanomyces sp. I-11である。
　好ましい一実施形態において、リパーゼは、配列番号５～１３のいずれかのアミノ酸配列又はそれと80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。同一性は、好ましくは85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上である。このようなリパーゼは、任意の手法で得ることができる。例えば、遺伝子工学的な手法及び化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することが可能である。また、リパーゼをコードする核酸についても任意の手法（例えば、遺伝子工学的手法及び化学方性法）を用いて得ることができる。
　配列番号５は、P.antarctica T-34由来のLipase Aのアミノ酸配列である。配列番号６は、Pseudozyma aphidis DSM70725由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号７は、Pseudozyma hubeiensis SY62由来のリパーゼのアミノ酸配列である。配列番号８は、Ustilago hordei由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号９は、Ustilago maydis 521由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号１０は、Sporisorium reilianum SRZ2由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号１１は、Sporisorium scitamineum由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号１２は、Melanopsichium pennsylvanicum 4由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号１３は、Kurtzmanomyces sp. I-11由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。一実施形態において好ましいリパーゼは、P.antarctica T-34由来のLIP-Aである。尚、P.antarctica T-34は、「Moesziomyces antarcticus T-34」とも称される。P. aphidisは、「Moesziomyces aphidis」とも称される。
　アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列又は塩基配列の同一性の値（%）を算出することができる。
　他の実施形態において、リパーゼは、配列番号５～１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）したアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。ここで「数個」とは、リパーゼ活性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約20%未満に相当する数であり、好ましくは約15%未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10%未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5%未満に相当する数であり、最も好ましくは約1%未満に相当する数である。より具体的には、例えば、2～100個、好ましくは2～80個、より好ましくは2～60個、更に好ましくは2～40個であり、より更に好ましくは2～20個、一層好ましくは2～15個、より一層好ましくは2～10個、特に好ましくは2～5個である。
　アミノ酸の置換の種類は、特に制限されないが、リパーゼに顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular　Cloning，　Third　Edition，　Chapter　13　，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press，　New　York）など公知の手法を利用して導入することができる。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントを得ることができる。バリアントには、リパーゼを有する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。一実施形態において、変異は、ＦＧＤＨの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位に存在することが好ましい。
　配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１４に示す。配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１５に示す。配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１６に示す。配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号９のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１８に示す。配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１９に示す。配列番号１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２０に示す。配列番号１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２１に示す。配列番号１３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２２に示す。
　発現ベクターは、上述のとおり特定のプロモーターの制御下にあるリパーゼをコードする遺伝子を有する限り、その構成は任意である。例えば、発現ベクターは、特定のプロモーターの制御下にリパーゼをコードする遺伝子を複数有していてもよい。この場合、リパーゼをコードする複数の遺伝子は互いに同種であってもよく、異種であってもよい。発現ベクターは、特定のプロモーターの制御下にあるリパーゼをコードする遺伝子からなるカセットを複数含んでいてもよい。この場合も発現ベクターに含まれるリパーゼをコードする複数の遺伝子は互いに同種でも異種でもよい。また、各カセットに含まれる特定のプロモーターも互いに同種でも異種でもよい。
　マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物は、上記プロモーター下に上記リパーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターで形質転換されていることが好ましい。形質転換される宿主微生物は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物（MEL生産微生物）であれば特に制限されず、任意に選択して使用することができる。マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物として、例えば、シュードザイマ属に属する微生物が挙げられる。一実施形態において、好ましいマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物は、シュードザイマ・ツクバエンシス、シュードザイマ・アンタークティカ、シュードザイマ・ルギュローサ、シュードザイマ・アフィディス、シュードザイマ・パラアンタークティカ、シュードザイマ・ヒュベイエンシスに属する微生物である。ツクバエンシス種に含まれる好ましいMEL生産株としては、NBRC1940株、KM－160株、1D9株、1D10株、1D11株、1E5株、及びJCM16987株が挙げられる。シュードザイマ・ツクバエンシスの生産する1－O－β－MEL－Bは水和性が4－O－β－MEL－Bよりも高く、水系用途において有用である。
　宿主細胞へのリパーゼをコードする核酸の導入手段は任意であり、特に制限されない。例えば、核酸を宿主に適したベクターに組み込み、それを任意の方法で宿主細胞に導入することができる。ベクターとは、それに組み込まれた核酸分子を細胞内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）である。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。一実施形態において、形質転換は安定的な形質転換であることが好ましい。
　ベクターの種類は、宿主細胞内で複製及び発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。ベクターの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択できる。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。一実施形態において好ましいベクターは、プラスミドベクターである。
　シュードザイマ属を宿主とする場合のプラスミドベクターとしては、例えば、pUXV1　ATCC　77463、pUXV2　ATCC　77464、pUXV5　ATCC　77468、pUXV6　ATCC　77469、pUXV7　ATCC　77470、pUXV8　ATCC　77471、pUXV3　ATCC　77465、pU2X1　ATCC　77466、pU2X2　ATCC　77467、pUXV1-neo、pPAX1-neo、pPAA1-neo、pUC_neo、及びpUCT_neo等を例示することができる。一実施形態において、好ましいベクターは、pUXV1-neo、pPAX1-neo、pPAA1-neo、pUC_neo及びpUCT_neoである。
　発現ベクターとして、選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入、プロモーターの挿入等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular　Cloning，　Third　Edition，　1.84，　Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press，　New　York参照）を用いて行うことができる。
　宿主細胞へのベクターの導入方法は任意であり、宿主細胞及びベクターの種類等に応じて適宜選択できる。ベクターの導入方法は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクション、マイクロインジェクション、及び酢酸リチウム法等によって実施することができる。一実施形態において、宿主細胞へのベクターの導入方法は、プラスミドベクターを制限酵素処理によって一本化してから導入することが好ましい。これにより、導入した遺伝子をゲノム遺伝子に組み込むことで安定的な形質転換ができる。
　核酸の導入によって組換え微生物が得られたか否かは、任意の方法で確認することができる。例えば、外因性核酸の導入によって付与したリパーゼ活性の有無を確認することによって所望の組換え微生物が得られたことを確認できる。リパーゼ活性の確認は任意の方法で実施できる。
　組換え微生物は、リパーゼ活性とマンノシルエリスリトールリピッド産生能力を備えることにより、より効率的にマンノシルエリスリトールリピッドを産生することができる。組換え微生物が産生するマンノシルエリスリトールリピッドの種類は特に制限されず目的に応じて適宜選択できる。一実施形態において、好ましいMELは、1－O－β－MEL－B及び4－O－β－MEL－Bであり、より好ましくは1－O－β－MEL－Bである。また、4－O－β－MEL－Bは、MEL－A、MEL－B、MEL－C、及びMEL－Dのいずれであってもよい。
　組換え微生物を用いたMELの生産は任意の方法で行うことができる。例えば、MELの生産に適した培地で組換え微生物を培養することによって実施できる。一実施形態において、組換え微生物を用いたMELを生産する場合、培地に植物油脂を添加することが好ましい。植物油脂の種類は特に制限されず、目的とするMELの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、大豆油、オリーブ油、ナタネ油、紅花油、ゴマ油、パームオイル、ひまわり油、ココナッツ油、カカオバター、及びひまし油等を挙げることができる。一実施形態において好ましい油脂はオリーブ油である。
　組換え微生物の培養条件は特に制限されない。例えば、組換え微生物が、シュードザイマ属の場合には、pH5～8、好ましくはpH6、温度20～35℃、好ましくは22～28℃の条件で3～7日間培養することができる。MELは、定法にしたがって培養液中から回収することができる。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
１．材料
・使用菌体
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）1E5株（寄託番号JCM16987）
・mRNA
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）1E5株・ゲノムDNA
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）1E5株シュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）T-34株（寄託番号KM-34）・プラスミド
発現ベクターpUCT_neo
・培地　
グリセロール添加YM培地：脱イオン水1Lに、酵母エキス3g、麦芽エキス3g、ペプトン5g、グルコース10g、グリセロール50gを溶かして調製した。
MEL生産培地：脱イオン水1Lに、酵母エキス5g、硝酸ナトリウム3g、リン酸二水素カリウム0.3g、硫酸マグネシウム・七水和物0.3g、グリセロール20gを溶かして調製した。
２．RNAシーケンス解析
２－１．菌株の培養
　上記シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株をMEL培地に4％オリーブ油を添加した培地30mLに接種し、25℃で2日間振とう培養した。
２－２．Total RNAの抽出
　上記菌体培養液に含まれる菌体を回収し、液体窒素で凍結し、ISOGEN（NIPPON GENE）で処理した後、Total RNAを含む水層を回収した。回収した水層をフェノール及びクロロホルムで処理し、Total RNAを抽出した。得られたTotal RNAの純度と量は分光光度計で確認した。
２－３．mRNAの精製
　抽出したTotal RNAをOligotex-dT30〈super〉mRNA purification kit（Takara）で精製し、mRNAを得た。得られたmRNAの純度と量は分光光度計で確認した。
２－４．RNAライブラリの作成
　抽出したmRNAをNEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina（New England BioLabs）、及びNEBNext Multiplex Oligos for Illumina（New England BioLabs）を用いてキットに添付のマニュアル通りに処理し、ライブラリを作成した。
２－５．シーケンス解析
　作成したライブラリをMiSeq Reagent Kits v2（Illumina）を用いてシーケンス解析に供した。シーケンサーにはMiSeq（Illumina）を使用した。
２－６．データ解析
　シーケンス解析で得られたデータを、該微生物のタンパク質をコードする遺伝子配列にbowtie2を用いてマッピングした。約15%程度のシーケンス解析データを、タンパク質遺伝子配列に帰属させることができた。この結果を、マッピングデータの変換ツールであるBEDtoolsや、プログラム言語Perlを用いたテキスト処理を実施することにより、各タンパク質遺伝子についてマッピングされた数を集計し、それぞれの遺伝子の発現量の元データとした。また、各タンパク質遺伝子では塩基数が異なるため、長い遺伝子ほど多くのマッピング数が得られるので、遺伝子間で比較する際には、マッピング数が発現の違いを反映しない。この影響をなくすためにマッピング数を遺伝子長で補正し、1 kbp当たりのマッピング数に計算処理した。解析の結果、gapプロモーター、tefプロモーターおよびubqプロモーターを高発現プロモーターとして選抜した。
３．高発現プロモーターを用いたリパーゼ発現ベクターの構築
３－１．ゲノムDNAの抽出
　上記シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株及びシュードザイマ・アンタークティカT-34株の菌体培養液に含まれる菌体を回収し、液体窒素で凍結し、フェノールおよびクロロホルムで処理しゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAの純度と量は分光光度計で確認した。
３－２．発現ベクター構築
　配列番号５に示す遺伝子を発現する発現ベクターを次の手順で構築した。配列番号５は、シュードザイマ・アンタークティカT-34株のリパーゼAをコードする塩基配列である。まず、配列番号５を参照して、開始コドンの上流にベクターとの相同配列15bpを付加したフォワードプライマー（配列番号２３）、および終止コドンの下流にベクターとの相同配列15bpを付加したリバースプライマー（配列番号２４）を調製した。これらを用いて、上記３－１．で得られたシュードザイマ・アンタークティカT-34株のゲノムDNAをテンプレートに遺伝子の増幅を行った。増幅した遺伝子を、SmaIサイトで切断した発現ベクターpUCT_neo（糸状菌（Ustilago maydis）由来の複製開始点（UARS）、G418耐性遺伝子、シュードザイマ・アンタークティカT-34株由来のgapターミネーターを含む）に、In-fusion cloning kit（Takara）を用いて連結した。次に、シュードザイマ・アンタークティカT-34株、またはシュードザイマ・ツクバエンシス1E5株のゲノムDNAをテンプレートとし、gapプロモーター（T34PgapまたはE5Pgap、配列番号４及び１）を配列の上流にSalIサイトを付加したフォワードプライマー（配列番号２５及び２６）、および配列の下流にXbaIサイトを付加したリバースプライマー（配列番号２７及び２８）を用いて増幅した。同様に、シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株のゲノムDNAをテンプレートとし、tefプロモーター（E5Ptef、配列番号２）及びubqプロモーター（E5Pubq、配列番号３）を配列の上流にベクターとの相同配列15bpを付加したフォワードプライマー（配列番号２９及び３０）、及び配列の下流にベクターとの相同配列15bpを付加したリバースプライマー（配列番号３１及び３２）を用いて増幅した。増幅したプロモーターを、SalIサイト及びXbaIサイトで切断したリパーゼAを導入したpUCT_neoに、Ligation High ver.2（Toyobo、T34Pgap及びE5Pgap）またはIn-fusion cloning kit（Takara、E5Ptef及びE5Pubq）を用いて連結し、T34Pgap、E5Pgap、E5Ptef、E5Pubqのいずれのプロモーターの制御下でリパーゼA遺伝子が発現される遺伝子発現ベクターpUCT_neo::PaLIPAを構築した。発現ベクターの構造を図３に示す。
Fwd:（リパーゼA増幅用、配列番号２３）CTCTAGAGGATCCCCATGCGAGTGTCCTTGCGCRvs:（リパーゼA増幅用、配列番号２４）GTAGGGAGCGTACCCCTAAGGCGGTGTGATGGGFwd:（T-34Pgap増幅用、配列番号２５）GTAGTCGACGTCGCCTCGGAAAGATCFwd:（E5Pgap増幅用、配列番号２６）CAGGTCGACATCCGCTCTCTCTTCRvs:（T-34Pgap増幅用、配列番号２７）CTGTCTAGAGATGATGGATGGGGAGTGTGRvs:（E5Pgap増幅用、配列番号２８）TCCTCTAGATAATTTTTGGGATGAGFwd:（E5Ptef増幅用、配列番号２９）ATGCCTGCAGGTCGACGAAATAACTCAGCACATCGCCCTTGFwd:（E5Pubq増幅用、配列番号３０）
ATGCCTGCAGGTCGACTTGTTGGAAGATGGGATG
Rvs:（E5Ptef増幅用、配列番号３１）
ATGGGGATCCTCTAGATGATGTTTTTGATGTATGATATGRvs:（E5Pubq増幅用、配列番号３２）
ATGGGGATCCTCTAGATCACGATTTTGCTAACCAG
４．形質転換体の調製
　上記３－２．で得られたT34Pgap、E5Pgap、E5Ptef、E5Pubqのいずれのプロモーターの制御下でリパーゼA遺伝子が発現される遺伝子発現ベクターpUCT_neo::PaLIPAを制限酵素SsPI処理で直線化したものを用いて、エレクトロポレーション法にてシュードザイマ・ツクバエンシス1E5株を形質転換した。また、コントロールとしてインサートを含まないベクターpUCT_neoも同様に、制限酵素SspI処理で直線化した後、エレクトロポレーション法にてシュードザイマ・ツクバエンシス1E5株に導入した。形質転換体の選別には、G418を使用した。
５．SDS-PAGE法による培養上清中のリパーゼの検出
　各形質転換体をグリセロール添加YM培地2mLで25℃、2日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液1mLをMEL培地に1%オリーブ油を添加した培地20mLに接種し、25℃で3日間振とう培養した。得られた菌体培養液を遠心し、培養上清を得た。培養上清をAny kDTMMini-PROTEAN(商標) TGXTMPrecast Protein Gels（BioRad）とMini-PROTEAN(商標) Tetra Vertical Electrophoresis Cell（BioRad）を用いて泳動した後、SimplyBlueTMSafeStain（Invitrogen）でタンパク質を染色し、リパーゼを検出した（図４）。
　図４中、Nega.はpUCT_neo導入株（コントロール）、T34PgapはpUCT_neo::PaLIPA（T34Pgap）導入株、E5PgapはpUCT_neo::PaLIPA（E5Pgap）導入株、E5PtefはpUCT_neo::PaLIPA（E5Ptef）導入株、E5PubqはpUCT_neo::PaLIPA（E5Pubq）導入株をそれぞれ示す。図４に示されるとおり、シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株由来のE5Pgap、E5Ptef、E5Pubqの3種のプロモーターを使用した発現ベクターを導入した株は、コントロールあるいはシュードザイマ・アンタークティカT-34株由来のT34Pgapを使用した発現ベクターを導入した株よりも、リパーゼAに由来するバンドが濃く検出され、培養上清中のリパーゼの発現量が向上していることが確認された。
６．酵素活性測定
　各形質転換体をグリセロール添加YM培地2mLで25℃、2日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液1mLをMEL培地に1%オリーブ油を添加した培地20mLに接種し、25℃で3日間振とう培養した。得られた菌体培養液を遠心し、培養上清を得た。遠心後に菌体を回収し、乾燥させた後に重量を測定し、増殖を評価したところ、形質転換体間で増殖量に有意な差は見られなかった（図５（a））。
　各形質転換体の培養上清中のリパーゼ活性は、Lipase Activity Assay Kit（Cayman Chemical）を用いて測定した。1分間に1nmolの基質を消費するのに必要な酵素量を1Unitとした（図５（b））。
　図５に示される通り、シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株由来のE5Pgap、E5Ptef、E5Pubqの3種のプロモーターを使用した発現ベクターを導入した株は、コントロールあるいはシュードザイマ・アンタークティカT-34株由来のT34Pgapを使用した発現ベクターを導入した株よりも、有意にリパーゼ活性が向上することが確認された。特にE5Pgap及びE5Ptefを使用した発現ベクターを導入した株では、活性がシュードザイマ・アンタークティカT-34株由来のT34Pgapを使用した発現ベクターを導入した株の2倍以上に向上することが確認された。
７．形質転換体のMEL生産能の評価
　各形質転換体をグリセロール添加YM培地2mLで25℃、2日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液1mLをMEL培地に6%オリーブ油を添加した培地20mLに接種し、25℃で7日間振とう培養した。培養3日目及び5日目に6%オリーブ油を追加した（添加油脂量合計18%）。得られた菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。残った水層にメタノールを加えた後遠心し、沈殿した菌体を回収して乾燥させた後に重量を測定したところ、形質転換体間で増殖量に有意な差は見られなかった（図６（a））。酢酸エチル層に含まれるMELは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定量した（図６（b））。
　図６に示される通り、シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株由来のE5Pgap、E5Ptef、E5Pubqの3種のプロモーターを使用した発現ベクターを導入した株は、コントロールよりも、MELの生産量が向上することが確認された。特にE5Ptefを使用した発現ベクターを導入した株では、生産量がコントロールの1.8倍、シュードザイマ・アンタークティカT-34株由来のT34Pgapを使用した発現ベクターを導入した株の1.5倍に向上することが確認された。
８．形質転換体の原料油脂の消費能力の評価
　各形質転換体をグリセロール添加YM培地2mLで25℃、2日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液1mLをMEL培地に6%オリーブ油を添加した培地20mLに接種し、25℃で7日間振とう培養した。培養2日目に6%オリーブ油を、3、4、5、6日目に3%オリーブ油を追加した（添加油脂量合計24%）。得られた菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれる残存油脂は薄層クロマトグラフィー（TLC）及び高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定量した（図７（ａ、ｂ））。
　図７に示される通り、シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株由来のE5Ptefを使用した発現ベクターを導入した株は、コントロールよりも原料油脂の消費量が向上することが確認された。コントロールでは7日間で168g/Lの油脂を分解したのに対し、E5Ptefを使用した発現ベクターを導入した株では7日間で224g/Lと、油脂の消費量が1.3倍に向上することが確認された。
　野生型1E5株と上記４で作成した形質転換体(NegaおよびE5Ptef)をグリセロール添加YM培地100mLで25℃、1日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液60mLをMEL培地に15%オリーブ油を添加した培地6L/10L容量に接種し、25℃で3日間培養した。得られた培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるMELは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定量した。また、残存のオリーブ油と脂肪酸の量の変化についてもHPLCで得られるエリア面積比を測定した。
　図１１に示される通りE5Ptefのプロモーターを使用した発現ベクターを導入した株は、野生株やNega株と比較して高いＭＥＬ生産性を示した。図１２に示される、培養液中に残存するオリーブ油の割合から、E5Ptef導入株は野生株やNegaと比較してオリーブ油の分解速度が非常に速いことが分かった。また、図１３に示すように図１２のオリーブ油の残存と連動するようにE5Ptef導入株で脂肪酸の生産速度が速い。これらの結果は、E5Ptef導入株ではオリーブ油の分解が促進され、MELの基質となる脂肪酸が速やかに産生されMEL合成へ進んでいることを示す。

Claims (10)

  1. E5Pgapプロモーター又はE5Ptefプロモーターの制御下にリパーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターで形質転換されている、マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。
  2. マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物がシュードザイマ属微生物である、請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物。
  3. リパーゼをコードする遺伝子がシュードザイマ属微生物由来である、請求項１又は２に記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物
  4. マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物がシュードザイマ・ツクバエンシスである、請求項１～３のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物
  5. E5Pgapプロモーター又はE5Ptefプロモーターの制御下にリパーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクター。
  6. リパーゼをコードする遺伝子がシュードザイマ属微生物由来である、請求項５に記載の発現ベクター。
  7. マンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を形質転換するための発現ベクターである、請求項５又は６に記載の発現ベクター。
  8. 請求項５～７のいずれかに記載の発現ベクターでマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を形質転換することを含む、請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を製造する方法。
  9. 請求項１～４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を用いて、マンノシルエリスリトールリピッド産生を製造する方法。
  10. 請求項１～４のいずれかに記載のマンノシルエリスリトールリピッド産生微生物を植物油脂を含む培地で培養することを含む、マンノシルエリスリトールリピッド産生を製造する方法。
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