WO2021010731A1 - 벤조퓨란계 n-아실히드라존 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents
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- QGNRFESRJDOPFD-UHFFFAOYSA-N CCOCC[n]1c(Cl)c(C=O)c2cc(Cl)ccc12 Chemical compound CCOCC[n]1c(Cl)c(C=O)c2cc(Cl)ccc12 QGNRFESRJDOPFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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- C07D307/85—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 2
Definitions
- the present invention relates to a benzofuran-based N-acylhydrazone derivative and a pharmaceutical composition comprising the same. More specifically, the present invention relates to a novel benzofuran-based N-acylhydrazone derivative that can be used for the prevention or treatment of cell proliferative diseases and a pharmaceutical composition comprising the same.
- Microtubules perform numerous cellular functions, such as cell migration, cell division, maintenance of the cytoskeleton, and intracellular transport.
- the major protein component of microtubules is tubulin.
- the rapid growth of cancer cells relies heavily on tubulin polymerization/depolymerization, and tubulin has become an excellent target for anticancer drug development.
- Intervention of microtubule conjugates by inhibiting tubulin polymerization or blocking microtubule degradation increases the number of cells captured in the metaphase, resulting in cell death.
- Inhibiting the function of microtubules using a drug targeting tubulin is an approved approach to anticancer treatment (see Korean Patent Publication No. 2014-0128238).
- Microtubule stabilizers include taxane, paclitaxel, docetaxel, and the like, and they inhibit depolymerization of microtubules and enhance microtubule polymerization. Most microtubule stabilizers bind to the taxane binding site or the overlapping site of ⁇ -tubulin.
- the second group, microtubule destabilizing agents include colchicine and vinca alkaloid, which inhibit microtubule polymerization and mostly bind to the colchicine binding site or the vinca binding site.
- the two types of drugs targeting microtubules act at lower concentrations than drugs that affect microtubule polymers.
- tubulin inhibitors show drug resistance, which is a major obstacle to prolonged response or to increase the survival of cancer patients.
- neurotoxicity as well as resistance problems are one of the main side effects of tubulin inhibitors derived from complex natural products, which affects the quality of life of cancer patients.
- the low oral bioavailability is limiting for comfortable oral administration. Accordingly, in recent years, there is a need for an early development of a new tubulin inhibitor with low side effects, excellent oral bioavailability, and low resistance.
- the present invention provides a compound represented by Formula 1 below, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in one aspect:
- R 1 is H, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxycarbonylC 1-3 alkyl, or C 1-6 alkoxyC 1-3 alkyl;
- R 2 is halogen, C 1-6 alkyl or haloC 1-6 alkyl
- R 3 is H, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, or haloC 1-6 alkoxy;
- R 4 and R 5 are each independently H, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, or C 1-6 alkylcarbonylamino, but R 4 and R 5 are not H at the same time.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cell proliferative diseases, comprising the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
- the benzofuran-based N-acylhydrazone derivative represented by Formula 1 of the present invention, its stereoisomer, or its pharmaceutically acceptable salt inhibits the polymerization of tubulin in the microtubules, causing apoptosis, and showing multidrug resistance. It also works effectively and has excellent cancer metastasis inhibitory activity.
- the compounds of the present invention exhibit high stability and solubility in the body, they are excellent in bioavailability. Therefore, the pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention can be usefully used in the prevention or treatment of cell proliferative diseases including various cancers.
- 1 is a photograph confirming the effect on the spindle and chromosomes of cells undergoing mitosis according to the concentration of the example compound according to the present invention by immunostaining.
- FIGS. 2A to 2E show the results of an anticancer effect test in a human-derived cervical cancer cell (HeLa CCL2) transplantation model of the Example compound according to the present invention.
- 3A to 3E are results of a stability test in plasma of an example compound according to the present invention.
- 4A to 4E are results of metabolic stability tests in liver microtubules of an example compound according to the present invention.
- 5A to 5C are pharmacokinetics (PK) test results of the example compounds according to the present invention.
- 6A and 6B are results of a wound healing assay of an Example compound according to the present invention.
- 7A and 7B are the results of an in vitro invasion assay of an example compound according to the present invention.
- FIG. 8A to 8F show the toxicity test and open field behavior test of the compound of Example 4, FIG. 8A shows the schedule of the toxicity test of the compound of Example 4 and the appearance after the final injection, and FIG. 8B is during compound treatment.
- the weight of the mouse was measured, and FIG. 8C shows the HIT map result of analyzing the mouse movement for 5 minutes in the open field experiment, FIG. 8D is time consumption in the central zone, FIG. 8E is speed, and FIG. 8F is the total distance moved. Is the result of measuring.
- halogen means F, Cl, Br or I unless otherwise stated.
- alkyl unless otherwise specified, means a linear or branched saturated hydrocarbon moiety.
- C 1-6 alkyl means an alkyl skeleton composed of 1 to 6 carbons. Specifically, C 1-6 alkyl is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl, n-pentyl, i-pentyl, t-pentyl, sec-pentyl, neopentyl , Hexyl, etc. may be included.
- alkoxy means a linear or branched alkyl-oxy moiety.
- C 1-6 alkoxy means an alkyl-oxy skeleton composed of 1 to 6 carbons. Specifically, C 1-6 alkoxy is methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, t-butoxy, n-pentoxy, i-pentoxy, t -Pentoxy, sec-pentoxy, neopentoxy, hexyloxy, etc. may be included.
- substitution refers to the replacement of a hydrogen atom in a molecular structure with a substituent so as to be a chemically stable compound from such substitution without exceeding the valence on the designated atom.
- group A is substituted with a substituent B means that a hydrogen atom bonded to an atom such as carbon constituting the skeleton of group A is replaced with a substituent B, so that the group A and the substituent B form a covalent bond. can do.
- the present invention provides a compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
- R 1 is H, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxycarbonylC 1-3 alkyl, or C 1-6 alkoxyC 1-3 alkyl;
- R 2 is halogen, C 1-6 alkyl or haloC 1-6 alkyl
- R 3 is H, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, or haloC 1-6 alkoxy;
- R 4 and R 5 are each independently H, halogen, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, or C 1-6 alkylcarbonylamino, but R 4 and R 5 are not H at the same time.
- the C 1-6 alkyl may include C 1-3 alkyl, C 3-6 alkyl, C 2-4 alkyl, C 2-6 alkyl, and the like.
- the C 1-6 alkoxy may include C 1-3 alkoxy, C 3-6 alkoxy, C 2-4 alkoxy, C 2-6 alkoxy, and the like.
- haloC 1-6 alkyl and haloC 1-6 alkoxy may each have 1 to 10, or 1 to 3 of the same or different halogens.
- R 1 is H, -CH 3 , -CH 2 CO 2 CH 2 CH 3 , -CH 2 OCH 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 OCH 2 CH 3 or -CH 2 CH 2 OCH 3
- R 2 is Cl, Br, -CH 3 , or -CF 3 .
- R 3 is H, F, Cl, -CH 3, -OCH 3, or -OCF 3.
- R 4 and R 5 are not each independently H, Cl, -CH 3, -OCH 3, or -NHCOCH 3 provided that, R 4 and R 5 are simultaneously H.
- R 1 is H, -CH 3 , -CH 2 CO 2 CH 2 CH 3 , -CH 2 OCH 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 OCH 2 CH 3 or- CH 2 CH 2 OCH 3 ;
- R 2 is Cl, Br, -CH 3 or -CF 3 ;
- R 3 is H, F, Cl, -CH 3 , -OCH 3, or -OCF 3, and
- R 4 and R 5 are not each independently H, Cl, -CH 3, -OCH 3, or -NHCOCH 3 provided that, R 4 and R 5 are simultaneously H.
- the present invention includes a pharmaceutically acceptable salt of the compound of Formula 1.
- the pharmaceutically acceptable salt should have low toxicity to humans and should not adversely affect the biological activity and physicochemical properties of the parent compound.
- the pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt formed with a pharmaceutically acceptable free acid.
- an inorganic acid or an organic acid may be used, wherein the inorganic acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, perchloric acid, bromic acid, and the like, and the organic acid may be acetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfur It may be phonic acid, fumaric acid, maleic acid, malonic acid, phthalic acid, succinic acid, lactic acid, citric acid, gluconic acid, tartaric acid, salicylic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, embonic acid, aspartic acid, glutamic acid, and the like.
- the inorganic acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, perchloric acid, bromic acid, and the like
- the organic acid may be acetic acid, methanesulfonic acid, ethan
- the acid addition salt is prepared by dissolving the compound of Formula 1 in an excess amount of acid aqueous solution by a conventional method, for example, and precipitating this salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Can be.
- the pharmaceutically acceptable salt may be an alkali metal salt (such as sodium salt) or an alkaline earth metal salt (such as potassium salt).
- the alkali metal salt or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate. .
- the compounds of the present invention may have a chiral carbon center, and thus can exist in the form of R or S isomers, racemic compounds, individual enantiomers or mixtures, individual diastereomers or mixtures, and all such stereoisomers And mixtures thereof may fall within the scope of the present invention.
- the compound of the present invention may include hydrates and solvates of the compound of Formula 1 above.
- the hydrates and solvates can be prepared using known methods, and are preferably non-toxic and water-soluble.
- the hydrate and the solvate may be one to which 1 to 5 molecules of water and alcoholic solvents (especially, ethanol, etc.) are bonded, respectively.
- the compound of the present invention that is, the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, inhibits the polymerization of tubulin in microtubules to induce apoptosis and acts effectively on cancer cells showing multidrug resistance, It is also excellent in inhibiting cancer metastasis.
- the compounds of the present invention exhibit high stability and solubility in the body, they are excellent in bioavailability.
- the compound of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same can be used for the prevention or treatment of cell proliferative diseases.
- the compounds of the present invention can be used to depolymerize microtubules.
- the compound of the present invention can be used to inhibit tubulin, more specifically inhibit polymerization of tubulin.
- the compounds of the present invention may act on the colchicine binding site of tubulin, and may cause apoptosis by stopping the cell cycle in the G2 or M phase.
- the compounds of the present invention can act on cancer cells exhibiting multidrug resistance.
- the compound of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same may be used as a tubulin inhibitor or an anticancer agent.
- the present invention provides a use of the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the prevention or treatment of cell proliferative diseases.
- the present invention provides a use of the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for inhibiting polymerization of tubulin.
- the present invention provides a use of the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a medicament for preventing or treating cell proliferative diseases.
- the present invention provides a use of the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a pharmaceutical agent for inhibiting tubulin polymerization.
- the present invention provides a method for inhibiting polymerization of tubulin, comprising administering the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
- the present invention provides a method for preventing or treating a cell proliferative disease, comprising administering the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need.
- prevention refers to any action that inhibits or delays the occurrence, spread, and recurrence of the disease by administration of the compound
- treatment refers to all the symptoms of the disease that are improved or beneficially changed by the administration of the compound. Means action.
- the term "object in need” refers to monkeys, cattle, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, mice, including humans (patients) who have or may develop the cell proliferative disease, It means all animals such as rabbits and guinea pigs, and may specifically mean mammals. In addition, the required object may mean a biological sample.
- administration means providing a predetermined substance to a subject in need thereof by any suitable method, and the route of administration of the compound of the present invention is to be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. I can.
- the present invention provides a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting tubulin polymerization, comprising the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cell proliferative diseases, comprising the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
- the cell proliferative disease may be cancer.
- cancer refers to the abnormal growth of cells that tend to proliferate or metastasize in an uncontrolled manner.
- the cancer may be solid cancer, blood cancer, or metastatic cancer. More specifically, the cancer may be rectal cancer, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, liver cancer, leukemia, glioma, skin cancer, cervical cancer, or metastases derived therefrom.
- the pharmaceutical composition containing the compound of the present invention can be used as a therapeutic agent for various cancers or as an inhibitor of cancer metastasis as illustrated above.
- the present invention provides a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable additive.
- the pharmaceutical composition of the present invention contains the compound of Formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient, from 0.1% to 90% by weight, specifically from 0.1% by weight, based on the total weight of the composition. It may contain 75% by weight, more specifically 1% by weight to 50% by weight.
- the pharmaceutical composition of the present invention may contain conventional and non-toxic pharmaceutically acceptable additives according to a conventional method.
- the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.
- additives used in the composition of the present invention may include sweeteners, binders, solvents, dissolution aids, wetting agents, emulsifiers, isotonic agents, absorbents, disintegrants, antioxidants, preservatives, lubricants, fillers, flavoring agents, and the like.
- the additives are lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, glycine, silica, talc, stearic acid, stearin, magnesium stearate, magnesium aluminosilicate, starch, gelatin, gum tragacanth, Alginic acid, sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, agar, water, ethanol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, sodium chloride, calcium chloride, orange essence, strawberry essence, vanilla flavor, and the like.
- composition of the present invention may be formulated in various formulations for oral administration (eg, tablets, pills, powders, capsules, syrups or emulsions) or parenteral administration (eg, intramuscular, intravenous or subcutaneous injection).
- oral administration eg, tablets, pills, powders, capsules, syrups or emulsions
- parenteral administration eg, intramuscular, intravenous or subcutaneous injection.
- the composition of the present invention may be formulated as a formulation for oral administration, and additives used at this time include cellulose, calcium silicate, corn starch, lactose, sucrose, dextrose, calcium phosphate, stearic acid, magnesium stearate, Calcium stearate, gelatin, talc, surfactants, suspending agents, emulsifying agents, diluents, and the like may be included.
- solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid formulations include at least one excipient in the composition, for example starch, calcium carbonate, sucrose, lactose. , Gelatin, and the like may be mixed and formulated. Further, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used.
- suspensions, emulsions, syrups, etc. may be exemplified as liquid preparations for oral administration, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. Can be included.
- preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
- non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
- the base for suppositories is Withepsol, Macrogol, and Tween61. Cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
- the injection may include conventional additives such as solubilizing agents, isotonic agents, suspending agents, emulsifying agents, stabilizing agents, and preservatives.
- the compound or composition of the present invention may be administered to a patient in a therapeutically effective amount or in a pharmaceutically effective amount.
- terapéuticaally effective amount or “pharmaceutically effective amount” is an amount of a compound or composition effective to prevent or treat a target disease, which is sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and It means an amount that does not cause side effects.
- the level of the effective amount is the health condition of the patient, the type of disease, the severity, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the method of administration, the time of administration, the route of administration and the rate of excretion, the duration of treatment, factors including the drugs used in combination or concurrently, and Other factors well known in the medical field can be determined.
- the compound or composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
- the effective amount of the compound in the composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient, and in general, 0.1 mg to 100 mg, or 0.5 mg to 10 mg per 1 kg of body weight is administered daily or every other day, or It can be administered twice or three times a day. However, since it may increase or decrease according to the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., the scope of the present invention is not limited thereto.
- the compound or composition of the present invention is administered for tumor therapy in combination with chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy, hormone therapy, bone marrow transplantation, stem cell replacement therapy, other biological therapy, surgical intervention, or a combination thereof.
- chemotherapy radiation therapy, immunotherapy, hormone therapy, bone marrow transplantation, stem cell replacement therapy, other biological therapy, surgical intervention, or a combination thereof.
- the compounds or compositions of the present invention can be used as an adjuvant therapy in conjunction with other long-running treatment strategies, or can be used to maintain the patient's condition after tumor regression or chemoprophylactic therapy in severely ill patients.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more active ingredients, and the additional active ingredients are anti-proliferative compounds, such as aromatase inhibitors, anti-estrogens, topoisomerase I Inhibitors, topoisomerase II inhibitors, microtubule active compounds, alkylation compounds, histone deacetylase inhibitors, compounds that induce cell differentiation processes, cyclooxygenase inhibitors, MMP inhibitors, mTOR inhibitors, anti-neoplastic anti-metabolite Substances, platin compounds, compounds targeting/reducing protein or lipid kinase activity, anti-angiogenic compounds, compounds targeting, reducing or inhibiting the activity of protein or lipid phosphatase, gonadorelin agonists, anti-androgens, Methionine aminopeptidase inhibitor, bisphosphonate, biological response modifier, anti-proliferative antibody, heparanase inhibitor, inhibitor of Ras tumorigenic isotype, telomerase inhibitor, proteasome
- PrOH propanol
- DMSO dimethylsulfoxide
- the title compound (yield 75%, pale yellow solid) was obtained by the synthesis method disclosed in Korean Patent Application Publication No. 2014-0128238.
- HeLa cells (ATCC, USA), which is a human cervical cancer cell line, were sprinkled on a 96-well plate at 3 x 10 3 cells/well, and the cells were treated with an Example or Comparative Example compound according to the present invention and grown for 2 days. Then, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) reagent was added at 10 ⁇ L/well. After 2 hours, absorbance was measured at "OD 450" and statistical values were obtained using the Prism TM 6 program. The data shown in the table below is the average value of the results obtained by repeating the analysis twice.
- the compounds of Examples according to the present invention have excellent antiproliferative activity in HeLa cell lines (cervical cancer cell lines).
- the example compounds according to the present invention have excellent antiproliferative activity even in various cancer cell lines.
- K562 and MCF7 Bio Evaluation Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea
- cell lines K562/ADR and MCF7/ADR Bio Evaluation Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea
- Cytotoxicity was tested by MTT analysis in the same manner as in Experimental Example 1-1, and IC 50 was obtained by a log-dose response curve (unit: nM).
- the data shown in the table below are the average values of the results obtained by repeating the analysis three times.
- Resistance factors (resistance factor) of a cell line exhibit multidrug resistance means the ratio of the IC 50 of the multi-drug-resistant cell line to the IC 50 of the primary (parent) cells with no resistance.
- the multidrug-resistant cell line exhibited high resistance to existing anticancer drugs, with resistance factors reaching tens to hundreds of times.
- resistance factors were shown to be 0.40 to 0.57, and it was found that the example compounds according to the present invention exhibited stronger cytotoxic effects on cancer cell lines showing multidrug resistance compared to conventional anticancer agents. I can.
- HeLa CCL2 cell line was cultured in a 12-well plate (3x10 4 cells/well), treated with DMSO or the compound of Example 4 for 17 hours, and then propidium iodine dye was added to stain cellular DNA and FACS It was measured using. In the table below, the concentration at which cells gather during the division and the number of cells are shown in percent.
- the compound of Example 4 exhibits an IC 50 at 0.2 ⁇ M for HeLa CCL2, a representative cancer cell line, and in particular, more than 80% of the cells are stopped in the mitotic phase after 16 hours after treatment with the cells. By observing this, it was expected to suppress the polymerization reaction of tubulin, and this was confirmed in Experimental Example 3.
- HeLa cells were treated with DMSO or the compound of Example 4 (50 nM, 100 nM, 200 nM) for 16 hours.
- the cells were stained with anti-tubulin antibody and Alexa Fluor TM 488, and the nuclei of the cells were immunostained using Hoechst 33342 to test ⁇ -tubulin and DNA.
- concentration was increased when treated with the Example compound according to the present invention compared to the DMSO control, the shape of the tubulin became sloppy and short.
- form of DNA deviating from the central arrangement also increased.
- the example compound according to the present invention is an agent for depolymerizing microtubules.
- Cell culture was performed after thawing the human skin cancer cell line HeLa CCL2, which was being stored frozen in liquid nitrogen.
- the culture of the cells was performed in a CO 2 incubator (Forma, USA) at a temperature of 37° C. and a CO 2 concentration of 5% for an appropriate period.
- the example compound according to the present invention was used as a test substance, and a solvent (carrier) was used as a negative control substance.
- the compounds were dissolved in a mixture of DMAC (dimethylacetamide) 20% + Tween 80 5% + 20% HPbCD (2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin) 75% at an appropriate concentration and used.
- the prepared substances were administered intraperitoneally at 0.2 mL (10 mL/kg) per 20 g of mice in the following administration schedule.
- the tumor size of each animal was measured 11 times in 3 directions using a vernier caliper, and then length x width x height / 2 It was calculated by the formula of
- Example compound In order to test the degree of toxicity upon repeated intraperitoneal administration of the Example compound to HeLa CCL2 cancer cell transplanted nude mice, general symptoms and body weight changes of the animals were observed during the administration period.
- tumor weight reductions of 57.1%, 40.5%, and 26.2% were observed in the administration groups of the compounds of Examples 4, 8 and 15, respectively (see FIGS. 2D and 2E).
- the compounds of Examples 2, 3, 4, 8 and 15 were administered intravenously and plasma concentrations were observed over time. Also, Procaine was used as a positive control. Plasma stability was measured three times by administering the test compound to human, rat or mouse plasma (90 ⁇ L) at 37° C. at a concentration of 5 mM. The results are shown in the following table and FIGS. 3A to 3E.
- test compound was administered at a concentration of 1 mM in the presence or absence of NADPH (1 mM) in the liver microtubules (0.5 mg protein/mL) of human, rat and mouse, and metabolic stability was tested at 37° C. for 30 minutes.
- Buspirone Buspirone
- Solvent B Cremophor EL, SigmaAldrich
- Solvent C 20% HPbCD ((2-Hydroxypropyl)- ⁇ -cyclodextrin, SigmaAldrich) in deionized water
- PK pharmacokinetics
- PK Pharmacokinetic
- HeLa CCL2 was incubated at 100% in 6 wells, wounded with a yellow tip, and the compound of Example 4 was treated with 50 nM and 100 nM.
- the state of the cells before treatment was recorded as a photograph, and the degree of cell migration was compared with the state of the cells at 24, 36, and 48 hours after the drug treatment.
- the concentration of the compound of Example 4 treated on the cells was determined by performing MTT.
- the concentration of the compound of Example 4 did not significantly affect the growth of cells up to 100 nM.
- a trans well chamber for a 24-well plate was prepared, 5 X 10 4 of HeLa CCL2 was added to the upper chamber, and the compound of Example 4 was treated with 10 nM, 50 nM, 100 nM, and 250 nM. After cultivation, after 16 hours, cells were stained to identify the migrated cells, and the number of cells was measured.
- mice were supplied from Daehan Biolink (Korea). All mice were kept in sterile animal quarantine facilities. All in vivo experiments used mice aged 6-8 weeks.
- the acute toxicity test of the compound of Example 4 was performed at the Laboratory Animal Resource Center of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. ICR mice (6-8 weeks old) were acclimated for up to 10 days before the experiment, and then the drug was injected into 3 mice. Example compounds were mixed with a solvent and intraperitoneally injected. After drug treatment, clinical symptoms within 24 hours were observed twice, and additional drug treatment was performed up to 10 times as scheduled. The weight of the mouse was measured 5 times as scheduled.
- the experimental device was constructed similarly to that used in the paper of Reyes-Mendez et al. (2016), and consisted of a black acrylic fence (a floor area of 30 ⁇ 30 cm and a wall height of 40 cm). The floor surface was divided into 25 squares of 10 x 10 cm. For testing, mice were placed in the center of the floor and spontaneous activity was recorded for 7 minutes on the top. After the experiment, the experimental apparatus was thoroughly washed with 30% ethanol. Three observers, who were not aware of drug treatment, analyzed the recorded image for the first 5 minutes, counted the number of squares that the mouse passed, and counted the number of times the mouse stayed unmoved and the number of times the body was refurbished or shaken. Based on this analysis, the time spent in the central zone, speed, and total travel distance were calculated. When the two-tailed probability value was less than 0.05 (p ⁇ 0.05), it was considered statistically significant.
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Abstract
본 발명에 따른 벤조퓨란계 N-아실히드라존 유도체는 우수한 항암 효과를 가지면서 독성이 낮고 용해도가 우수하므로, 이를 포함하는 약학적 조성물은 다양한 암을 비롯한 세포증식성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 벤조퓨란계 N-아실히드라존 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포증식성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 신규한 벤조퓨란계 N-아실히드라존 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
미세소관(microtubule)은 세포의 이동, 세포 분열, 세포 골격 유지 및 세포내 수송 등 수많은 세포 기능을 수행한다. 미세소관의 주요 단백질 성분은 튜불린(tubulin)이다. 암세포의 빠른 성장은 튜불린 중합/탈중합에 크게 의존하며, 이에 따라 튜불린은 항암제 개발의 훌륭한 타겟이 되고 있다. 튜불린 중합을 저해하거나 미세소관 분해를 차단하는 것에 의한 미세소관 결합체에 대한 개입은, 중기(metaphase)에 포획된 세포 수를 증가시키고, 결국 세포 사멸을 일으킨다. 튜불린을 타겟으로 하는 약물을 사용하여 미세소관의 기능을 억제하는 것이 항암 치료에 인증된 접근법이다(한국 공개특허공보 제2014-0128238호 참조).
미세소관을 타겟으로 하는 약물들은 작용기전에 따라 미세소관 안정화제와 불안정화제의 두 그룹으로 나뉜다. 미세소관 안정화제로는 탁산(taxane), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 등이 있으며, 이들은 미세소관의 탈중합을 억제하고 미세소관 중합을 강화시키는 작용을 한다. 대부분의 미세소관 안정화제들은 탁산 결합 부위 또는 β-튜불린의 중복 부위(overlapping site)에 결합한다. 두 번째 그룹인 미세소관 불안정화제로는 콜히친(colchicine), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 등이 있으며, 이들은 미세소관 중합을 억제하며 대부분 콜히친 결합 부위 또는 빈카 결합 부위에 결합한다. 또한, 미세소관을 타겟으로 하는 두 가지 종류의 약물들은 미세소관 중합체에 영향을 주는 약물보다 더 낮은 농도에서 작용한다.
그러나, 대부분의 튜불린 저해제는 약물 내성을 보이는데, 이는 장기간의 반응이나 암 환자의 생존을 높이는데 큰 장애가 되고 있다. 또한, 내성 문제 뿐만 아니라 신경독성 문제가 복합 천연산물 유래의 튜불린 저해제의 주요 부작용 중 하나이며, 이는 암환자의 삶의 질에 영향을 미친다. 나아가, 낮은 경구 생체이용률은 편안한 경구 투여에 제약이 되고 있다. 따라서, 최근에는 부작용이 낮고 경구 생체이용률이 우수하며, 내성 발생이 적은 새로운 튜불린 저해제에 대한 조속한 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 신규한 튜불린 저해제를 연구하던 중, 벤조퓨란과 인돌 그룹의 N-아실히드라존 결합을 통해 합성된 신규한 벤조퓨란계 N-아실히드라존 유도체가 튜불린의 중합을 저해하여 세포자살을 유발하고 다중약물 내성을 보이는 암세포에도 효과적이며 체내에서 높은 안정성 및 용해도를 가짐을 발견하였다.
따라서 본 발명의 목적은 우수한 항암 효과를 가지면서 독성이 낮고 용해도가 우수한 신규의 튜불린 저해제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 튜불린 저해제를 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 일 측면에서 아래 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
상기 식에서,
R
1은 H, C
1-6알킬, C
1-6알콕시카보닐C
1-3알킬, 또는 C
1-6알콕시C
1-3알킬이고;
R
2는 할로겐, C
1-6알킬 또는 할로C
1-6알킬이고;
R
3은 H, 할로겐, C
1-6알킬, C
1-6알콕시, 또는 할로C
1-6알콕시이고;
R
4 및 R
5는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C
1-6알킬, C
1-6알콕시, 또는 C
1-6알킬카보닐아미노이되, R
4 및 R
5가 동시에 H는 아니다.
본 발명은 다른 측면에서 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 벤조퓨란계 N-아실히드라존 유도체, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 미세소관의 튜불린 중합을 저해하여 세포자살을 유발하고 다중약물 내성을 보이는 암세포에도 효과적으로 작용하며, 암 전이 억제 활성도 우수하다. 또한 본 발명의 화합물은 높은 체내 안정성 및 용해도를 나타내므로 생체이용률이 우수하다. 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 다양한 암을 비롯한 세포증식성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 화합물의 농도에 따라 유사분열 중인 세포의 방추사와 염색체에 미치는 영향을 면역 염색으로 확인한 사진이다.
도 2a 내지 2e는 본 발명에 따른 실시예 화합물의 인체 유래 자궁경부암 세포(HeLa CCL2) 이식 모델에서의 항암 효과 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3e은 본 발명에 따른 실시예 화합물의 혈장 내 안정성 시험 결과이다.
도 4a 내지 4e는 본 발명에 따른 실시예 화합물의 간 미세소관 내 대사안정성 시험 결과이다.
도 5a 내지 5c는 본 발명에 따른 실시예 화합물의 약물동태(PK) 시험 결과이다.
도 6a 및 6b는 본 발명에 따른 실시예 화합물의 상처회복시험(wound healing assay) 결과이다.
도 7a 및 7b는 본 발명에 따른 실시예 화합물의 침투시험(in vitro invasion assay) 결과이다.
도 8a 내지 8f는 실시예 4의 화합물의 독성 시험 및 오픈 필드 행동 시험을 나타낸 것으로서, 도 8a는 실시예 4의 화합물의 독성 시험의 일정 및 최종 주입 이후의 외관을 나타내고, 도 8b는 화합물 처리 중에 마우스의 체중을 측정한 것이고, 도 8c는 오픈 필드 실험에서 마우스 움직임을 5분간 분석한 HIT 맵 결과를 나타내고, 도 8d는 중앙 존에서의 시간 소비, 도 8e는 속도, 도 8f는 총 움직인 거리를 측정한 결과이다.
본 명세서에 있어서, 용어 "할로겐"은 다른 언급이 없으면 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 선형 또는 분지형의 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C
1-6알킬"은 1 내지 6개 탄소로 골격이 이루어진 알킬을 의미한다. 구체적으로 C
1-6알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸, t-펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, 헥실 등을 포함할 수 있다.
용어 "알콕시"는, 달리 명시되지 않는 한, 선형 또는 분지형의 알킬-옥시 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C
1-6알콕시"는 1 내지 6개 탄소로 골격이 이루어진 알킬-옥시를 의미한다. 구체적으로 C
1-6알콕시는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, i-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, i-펜톡시, t-펜톡시, sec-펜톡시, 네오펜톡시, 헥실옥시 등을 포함할 수 있다.
용어 "할로알킬" 또는 "할로알콕시"는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알킬 또는 알콕시를 의미한다. 구체적으로, 할로알킬 또는 할로알콕시는 동종 또는 이종의 할로겐이 1개 이상 치환된 알킬 또는 알콕시일 수 있다.
용어 "치환"은, 지정된 원자 상의 원자가(valence)를 초과하지 않으면서 이러한 치환으로부터 화학적으로 안정한 화합물이 되도록, 분자 구조체 내의 수소 원자를 치환기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어 "그룹 A가 치환기 B로 치환"된다는 것은, 그룹 A의 골격을 구성하는 탄소 등의 원자에 결합된 수소 원자가 치환기 B로 대체되어, 그룹 A와 치환기 B가 공유 결합을 형성함을 의미할 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
상기 식에서,
R
1은 H, C
1-6알킬, C
1-6알콕시카보닐C
1-3알킬, 또는 C
1-6알콕시C
1-3알킬이고;
R
2는 할로겐, C
1-6알킬 또는 할로C
1-6알킬이고;
R
3은 H, 할로겐, C
1-6알킬, C
1-6알콕시, 또는 할로C
1-6알콕시이고;
R
4 및 R
5는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C
1-6알킬, C
1-6알콕시, 또는 C
1-6알킬카보닐아미노이되, R
4 및 R
5가 동시에 H는 아니다.
상기 C
1-6알킬은 C
1-3알킬, C
3-6알킬, C
2-4알킬, C
2-6알킬 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 C
1-6알콕시는 C
1-3알콕시, C
3-6알콕시, C
2-4알콕시, C
2-6알콕시 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 할로C
1-6알킬 및 할로C
1-6알콕시는 각각 1개 내지 10개, 또는 1개 내지 3개의 동일하거나 서로 다른 할로겐을 가질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, R
1은 H, -CH
3, -CH
2CO
2CH
2CH
3, -CH
2OCH
2CH
3, -CH
2CH
2OCH
2CH
3 또는 -CH
2CH
2OCH
3이다.
다른 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, R
2는 Cl, Br, -CH
3, 또는 -CF
3이다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, R
3은 H, F, Cl, -CH
3, -OCH
3, 또는 -OCF
3이다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, R
4 및 R
5는 각각 독립적으로 H, Cl, -CH
3, -OCH
3, 또는 -NHCOCH
3이되, R
4 및 R
5가 동시에 H는 아니다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, R
1은 H, -CH
3, -CH
2CO
2CH
2CH
3, -CH
2OCH
2CH
3, -CH
2CH
2OCH
2CH
3 또는 -CH
2CH
2OCH
3이고; R
2는 Cl, Br, -CH
3 또는 -CF
3이고; R
3은 H, F, Cl, -CH
3, -OCH
3, 또는 -OCF
3이고; R
4 및 R
5는 각각 독립적으로 H, Cl, -CH
3, -OCH
3, 또는 -NHCOCH
3이되, R
4 및 R
5가 동시에 H는 아니다.
상기 화학식 1의 화합물의 구체적인 예는 아래와 같다:
1. (E)-N'-[(2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌]-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
2. (E)-N'-[(2-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸렌]-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
3. 에틸 (E)-2-{2-클로로-3-[(2-(5-메틸벤조퓨란-2-카보닐)히드라지닐리덴)메틸]-1H-인돌-1-일}아세테이트;
4. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
5. (E)-N'-{[2-브로모-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
6. (E)-N'-{[1-(2-에톡시에틸)-2-(트리플루오로메틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
7. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-메톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
8. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
9. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-6-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
10. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-플루오로-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
11. (E)-N'-{[2,5-디클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
12. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-(트리플루오로메톡시)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
13. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메틸-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
14. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드;
15. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드;
16. (E)-5-클로로-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}벤조퓨란-2-카보히드라지드;
17. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-4,7-디메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;
18. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드;
19. (E)-N'-{2-[2-((2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일)메틸렌]히드라진-1-카보닐}벤조퓨란-5-일)아세트아미드; 및
20. (E)-에틸-2-(3-((2-(4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보닐)히드라진일리덴)메틸)-2-메틸-1H-인돌-1-일)아세테이트.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 인간에 대한 독성이 낮아야 하며, 모 화합물의 생물학적 활성 및 물리화학적 특성에 임의의 부정적인 영향을 주지 않아야 한다.
예를 들어, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 유리 산(free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다.
상기 유리 산으로는 무기 산 또는 유기 산을 사용할 수 있으며, 이때 무기 산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등일 수 있고, 유기 산은 아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 프탈산, 석신산, 락트산, 시트르산, 글루콘산, 타르타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파트산, 글루탐산 등일 수 있다.
상기 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 알칼리금속염(나트륨염 등) 또는 알칼리토금속염(칼륨염 등)일 수 있다.
상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 알칼리금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 미용해된 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 키랄 탄소 중심을 가질 수 있으며, 이에 따라 R 또는 S 이성질체, 라세미 화합물, 개개의 거울상 이성질체 또는 혼합물, 개개의 부분입체 이성질체 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 입체 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범주에 속할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1의 화합물의 수화물 및 용매화물을 포함할 수 있다. 상기 수화물 및 용매화물은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 무독성 및 수용성인 것이 바람직하다. 특히, 바람직하게는 상기 수화물 및 용매화물은 각각 물 및 알코올성 용매(특히, 에탄올 등)의 1 내지 5개의 분자가 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 화합물, 즉 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은, 미세소관의 튜불린 중합을 저해하여 세포자살을 유발하고 다중약물 내성을 보이는 암세포에도 효과적으로 작용하며, 암 전이 억제 활성도 우수하다. 또한 본 발명의 화합물은 높은 체내 안정성 및 용해도를 나타내므로 생체이용률이 우수하다.
따라서 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 세포증식성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 미세소관을 탈중합시키는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 화합물은 튜불린을 저해, 보다 구체적으로 튜불린의 중합을 저해하는데 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 튜불린의 콜히친 결합부위에 작용될 수 있고, 세포주기를 G2기 또는 M기에 정지시켜 세포자살을 유발할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 다중약물 내성을 보이는 암세포에 작용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 튜불린 저해제 또는 항암제로 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 튜불린의 중합을 저해하기 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 튜불린 중합 저해용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 튜불린의 중합을 저해하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 세포증식성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
여기서 "예방"이란 상기 화합물의 투여로 상기 질환의 발생, 확산 및 재발을 저해시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 상기 화합물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
여기서 "필요로 하는 대상"이란, 상기 세포증식성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간(환자)을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼, 기니아 피그 등의 모든 동물을 의미하며, 구체적으로 포유류를 의미할 수 있다. 또한, 상기 필요로 하는 대상은 생체 시료(biological sample)를 의미할 수도 있다.
또한 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 이를 필요로 하는 대상에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 화합물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 튜불린 중합 저해를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 세포증식성 질환은 암일 수 있다. 본 명세서에서 "암"은, 비제어된 방식으로 증식되거나 전이되는 경향이 있는 세포의 비정상적 성장을 지칭한다.
구체적으로 상기 암은 고형암, 혈액암, 또는 전이성암일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 암은 직장암, 유방암, 폐암, 위암, 간암, 백혈병, 신경교종, 피부암, 자궁경부암, 또는 이로부터 유래된 전이물일 수 있다.
따라서 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 상기 예시한 다양한 암의 치료제 또는 암 전이 억제제로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을, 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 90 중량%, 구체적으로 0.1 중량% 내지 75 중량%, 보다 구체적으로 1 중량% 내지 50 중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 통상적인 방법에 따라 통상적이고 무독성인 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 첨가제의 예는 감미제, 결합제, 용매, 용해 보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡수제, 붕해제, 산화방지제, 보존제, 윤활제, 충전제, 향미제 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 첨가제는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 글리신, 실리카, 활석, 스테아르산, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 알루미노실리케이트, 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 한천, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 에센스, 딸기 에센스, 바닐라 향 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 투여(예컨대, 정제, 환제, 산제, 캡슐제, 시럽 또는 에멀젼) 또는 비경구 투여(예컨대, 근육내, 정맥내 또는 피하 주사)를 위한 다양한 제제 형태로 배합될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 조성물은 경구 투여용 제제로 배합될 수 있으며, 이때 사용되는 첨가제로는 셀룰로스, 칼슘 실리케이트, 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 덱스트로스, 칼슘 포스페이트, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 젤라틴, 활석, 계면활성제, 현탁제, 유화제, 희석제 등이 포함될 수 있다.
구체적으로, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제제화될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에서 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 또는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 2회 또는 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기세포 대체치료, 다른 생물학적 치료, 수술적 개입 또는 이들의 조합과 병용하여 종양 요법을 위해 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 장기적으로 진행되는 다른 치료 전략과 함께 보조 요법으로 사용되거나, 중증 환자에서 종양 퇴행 또는 화학 예방 요법 후 환자의 상태를 유지하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 1종 이상의 유효성분을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 추가의 유효성분은 항-증식 화합물, 예컨대, 아로마타제 저해제, 항-에스트로겐, 토포이소머라제 I 저해제, 토포이소머라제 II 저해제, 미세소관 활성 화합물, 알킬화 화합물, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 세포 분화 과정을 유도하는 화합물, 시클로옥시게나제 저해제, MMP 저해제, mTOR 저해제, 항-신생물 항-대사물질, 플라틴 화합물, 단백질 또는 지질 키나제 활성을 표적화/감소시키는 화합물, 항-혈관신생 화합물, 단백질 또는 지질 포스파타제의 활성을 표적화하거나 감소시키거나 저해하는 화합물, 고나도렐린 효능제, 항-안드로겐, 메티오닌 아미노펩티다제 저해제, 비스포스포네이트, 생물학적 반응 개질제, 항-증식성 항체, 헤파라나제 저해제, Ras 종양원성 이소형의 저해제, 텔로머라제 저해제, 프로테아솜 저해제, 혈액계 악성종양의 치료에 사용되는 화합물, Flt-3의 활성을 표적화하거나 감소시키거나 저해하는 화합물, Hsp90 저해제, 키네신 스핀들 단백질 저해제, MEK 저해제, 류코보린, EDG 결합제, 항-백혈병 화합물, 리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제, S-아데노실메티오닌 데카르복실라제 저해제, 지혈성 스테로이드, 코르티코스테로이드, 다른 화학요법 화합물, 광감작 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 사용된 약어의 정의는 다음과 같다:
EA: 에틸 아세테이트, EtOH: 에탄올, Et: 에틸,
DMF: 디메틸폼아미드, n-Hex: n-헥산,
PrOH: 프로판올, DMSO: 디메틸설폭시드.
<방향족 치환된 벤조퓨란-2-카보히드라지드 유도체의 제조>
제조예 1: 에틸 5-메틸벤조퓨란-2-카복실레이트
5-메틸살리실알데히드(1.40 g, 10.3 mmol)를 DMF(30 mL)에 녹인 후, 여기에 Ce
2SO
4(10.07 g, 30.9 mmol)와 에틸 브로모아세테이트(1.38 mL, 12.4 mmol)를 넣고 70℃에서 15 시간 반응시켰다. 반응용액을 물로 희석한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=10:1)로 분리하여 표제 화합물 1.28 g(수율 61%, 무색 액체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 7.49-7.46 (m, 3H), 7.26 (m, 1H), 4.45 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.44 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 159.85, 154.37, 145.92, 133.51, 129.27, 127.22, 122.45, 113.74, 112.02, 61.61, 21.45, 14.51; mp 38-39℃
제조예 2: 5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드
상기 제조예 1에서 얻은 에틸 5-메틸벤조퓨란-2-카복실레이트(2.04 g, 10.0 mmol)를 EtOH(30 mL)에 녹이고 여기에 히드라진 일수화물(1.50 g, 30.0 mmol)을 넣어 24시간 환류시켰다. 반응용액을 감압증류하고 얻어진 고체를 물로 세척한 다음, 건조하여 표제 화합물 1.72 g(수율 90%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 9.97 (s, 1H), 7.52-7.49 (m, 2H), 7.43 (s, 1H), 7.25 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H), 4.55 (br s, 2H), 2.40 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 157.92, 152.64, 148.48, 132.68, 127.84, 127.11, 122.04, 111.27, 108.47, 20.81; MS (MALDI-TOF): m/z 213 [M+Na]
+; mp 159℃
제조예 3: 에틸 5-메톡시벤조퓨란-2-카복실레이트
2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드(1.25 mL, 10.0 mmol)를 DMF(30 mL)에 녹인 후, 여기에 K
2CO
3(6.91 g, 50.0 mmol)와 에틸 브로모아세테이트(1.33 mL, 12.0 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 반응시켰다. 반응용액을 물로 희석한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=3:1)로 분리하여 표제 화합물 1.1 g(수율 50%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 7.50-7.47 (m, 2H), 7.08-7.05 (m, 2H), 4.45 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 3.86 (s, 3H), 1.44 (t, 3H, J = 7.2 Hz); mp 53℃
제조예 4: 5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드
상기 제조예 3에서 얻은 에틸 5-메톡시벤조퓨란-2-카복실레이트(1.03 g, 4.68 mmol)를 EtOH(30 mL)에 녹이고 여기에 히드라진 일수화물(702.8 mg, 14.04 mmol)을 넣어 24시간 환류시켰다. 반응용액을 감압증류하고 얻어진 고체를 CH
2Cl
2로 세척한 다음, 건조하여 표제 화합물 918 mg(수율 95%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 9.98 (s, 1H), 7.53 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.44 (s, 1H), 7.25 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 7.02 (dd, 1H, J = 9.0, 2.7 Hz), 4.55 (br s, 2H), 3.79 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 157.85, 155.97, 149.10, 149.03, 127.65, 115.80, 112.34, 108.34, 104.09, 55.58; MS (MALDI-TOF): m/z 229.0 [M+Na]
+, 245 [M+K]
+;
mp 163-164℃
제조예 5: 5-클로로벤조퓨란-2-카보히드라지드
0℃에서 CH
2Cl
2(5 mL)에 옥살릭클로라이드(257.2 μL, 3.0 mmol)와 DMF(50 μL)를 넣고 5분 교반한 다음, 5-클로로벤조퓨란-2-카복실산(393.2 mg, 2.0 mmol)의 CH
2Cl
2/DMF(5 mL, 4:1)의 혼합용액을 넣고 실온에서 2시간 교반하였다. 반응용액을 감압 증류하고 다시 CH
2Cl
2(5 mL)를 넣은 다음, 0℃에서 히드라진 일수화물(120.1 mg, 2.4 mmol)의 CH
2Cl
2(5 mL) 용액과 N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIEA, 1.74 mL, 10 mmol)를 넣고 실온에서 15시간 교반하였다. 반응용액을 물로 희석시킨 후, EA로 추출하였다. 유기층을 Na
2SO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 CH
2Cl
2로 세척하고 건조하여 표제 화합물 295 mg(수율 70%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 10.10 (s, 1H), 7.86 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.46 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H), 4.59 (br s, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 157.41, 152.66, 149.79, 128.65, 127.99, 126.56, 122.02, 113.44, 108.25; MS (MALDI-TOF): m/z 233 [M+Na]
+;
mp 174-175
oC
제조예 6: 에틸 4,7-디메틸벤조퓨란-2-카복실레이트
3,6-디메틸살리실알데히드(450.5 mg, 3.0 mmol)를 DMF(30 mL)에 녹인 후, 여기에 Ce
2SO
4(2.93 g, 9.0 mmol)와 에틸 브로모아세테이트(399.2 μL, 3.60 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 반응시켰다. 반응용액을 물로 희석한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=20:1)로 분리하여 표제 화합물 360 mg(수율 55%, 무색 액체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 7.56 (s, 1H), 7.14 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.45 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.52 (s, 3H), 1.44 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 159.91, 154.90, 145.08, 130.19, 128.30, 126.63, 123.90, 119.85, 113.01, 61.43, 18.29, 15.00, 14.46
제조예 7: 4,7-디메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드
상기 제조예 6에서 얻은 에틸 4,7-디메틸벤조퓨란-2-카복실레이트(290.3 mg, 1.33 mmol)를 EtOH(20 mL)에 녹이고 여기에 히드라진 일수화물(199.7 mg, 3.99 mmol)을 넣어 24시간 환류시켰다. 반응용액을 감압증류하고 얻어진 고체를 물로 세척한 다음, 건조하여 표제 화합물 236 mg(수율 87%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 9.97 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.13 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.59 (br s, 2H), 2.46 (s, 6H, CH
3x2);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 158.05, 153.07, 147.65, 129.34, 127.07, 126.47, 123.64, 118.65, 107.94, 17.86, 14.38; MS (MALDI-TOF): m/z 227 [M+Na]
+; mp 187℃
제조예 8: 에틸 4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카복실레이트
4,6-디메톡시살리실알데히드(499.2 mg, 2.74 mmol)를 DMF(10 mL)에 녹인 후, 여기에 K
2CO
3(1.89 g, 13.7 mmol)와 에틸 브로모아세테이트(364.8 μL, 3.29 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 반응시켰다. 반응용액을 물로 희석한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=20:1)로 분리하여 표제 화합물 460 mg(수율 67%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 7.54 (m, 1H), 6.67 (m, 1H), 6.35 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 4.41 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.857 (s, 3H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3H); (MALDI-TOF): m/z 251 [M+H]
+; mp 98℃
제조예 9: 4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드
상기 제조예 8에서 얻은 에틸 4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카복실레이트(450.5 mg, 1.80 mmol)를 EtOH(20 mL)에 녹이고 여기에 히드라진 일수화물(450.5 mg, 9.0 mmol)을 넣어 6시간 환류시켰다. 반응용액을 차가운 물에 넣고 생성된 고체를 여과한 다음, 에틸 에테르로 세척하고 건조하여 표제 화합물 360 mg(수율 85%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 9.78 (s, 1H), 7.40 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.79 (m, 1H), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.49 (br s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.82 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 160.64, 158.10, 156.16, 153.94, 146.15, 110.83, 105.97, 94.98, 88.36, 55.79, 55.71; MS (MALDI-TOF): m/z 259 [M+Na]
+; mp 194℃
제조예 10: 에틸 5-아세트아미도벤조퓨란-2-카복실레이트
에틸 5-아미노벤조퓨란-2-카복실레이트(205.2 mg, 1.0 mmol)를 DMF(3 mL)에 녹인 후, 여기에 (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU, 417.2 mg, 1.1 mmol), 히드록시벤조트리아졸(HOBt, 148.6 mg, 1.1 mmol), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIEA, 209.0 μL, 1.2 mmol), 및 아세트산(63.0 μL, 1.1 mmol)를 넣고 실온에서 15시간 반응시켰다. 반응용액을 물로 희석한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (CH
2Cl
2:EA=3:1)로 분리하여 표제 화합물 162 mg(수율 66%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 10.06 (s, 1H), 8.19 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 4.35 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.33 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 168.76, 159.66, 152.77, 146.68, 134.10, 127.54, 121.15, 114.18, 114.07, 112.66, 61.79, 24.64, 14.49; mp 181-182℃
제조예 11: N-(2-(히드라진카보닐)벤조퓨란-5-일)아세트아미드
상기 제조예 10에서 얻은 에틸 5-아세트아미도벤조퓨란-2-카복실레이트(514.3 mg, 2.08 mmol)를 1-PrOH (20 mL)에 녹이고 여기에 히드라진 일수화물 (312.4 mg, 6.24 mmol)를 넣어 24시간 환류시켰다. 반응용액을 감압증류하고 얻어진 고체를 n-Hex과 CH
2Cl
2 (1:1) 혼합용매로 세척한 다음, 건조하여 표제 화합물 392 mg (81%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 10.02 (s, 1H), 9.97 (s, 1H), 8.10 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.48-7.45 (m, 2H), 4.55 (br s, 2H), 2.06 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 168.23, 157.84, 150.42, 148.93, 135.37, 127.10, 119.12, 111.98, 111.72, 109.06, 23.96; MS (MALDI-TOF) m/z 256 [M+Na]
+, 272 [M+K]
+;
mp 219-220℃
<방향족/N-치환된 인돌-3-카복스알데히드 유도체의 제조>
제조예 12: 2-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(359.2 mg, 2.0 mmol)와 NaH(120.0 mg, 3.0 mmol, 오일 중 60%)에 THF(20 mL)를 넣고 5분 교반한 후, 아이오도메탄(149.4 μL, 2.4 mmol)를 넣고 실온에서 5시간 교반하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA=15:1)로 분리하여 표제 화합물 330 mg(수율 85%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.13 (s, 1H), 8.30 (m, 1H), 7.36-7.32 (m, 3H), 3.82 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 184.07, 136.99, 136.13, 124.44, 124.20, 123.69, 121.43, 113.02, 109.64, 30.28; MS (MALDI-TOF): m/z 194 [M+H]
+; mp 97-98℃
제조예 13: 에틸 2-(2-클로로-3-포밀-1H-인돌-1-일)아세테이트
0℃에서 2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(200.0 mg, 1.11 mmol)와 NaH(66.8 mg, 1.67 mmol, 오일 중 60%)에 THF (10 mL)를 넣고 5분 교반한 후, 에틸 브로모아세테이트(147.5 μL, 1.33 mmol)를 넣고 실온에서 7시간 교반하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA=20:1)로 분리하여 표제 화합물 244 mg(수율 83%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.16 (s, 1H), 8.32 (m, 1H), 7.36-7.32 (m, 2H), 7.23 (m, 1H), 4.95 (s, 2H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 184.09, 166.47, 136.48, 135.70, 124.45, 124.34, 123.78, 121.55, 113.62, 109.03, 62.36, 44.81, 14.05; MS (MALDI-TOF): m/z 266 [M+H]
+;
mp 110℃
제조예 14: 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드
2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(2.69 g, 15.0 mmol)를 DMF(50 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(2.01 mL, 18.0 mmol)와 Cs
2CO
3(14.7 g, 45.0 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:CH
2Cl
2:EA=4:2:1)로 분리하여 표제 화합물 2.95 g(수율 78%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.14 (s, 1H), 8.30 (m, 1H), 7.41 (m, 1H), 7.34-7.30 (m, 2H), 4.42 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 184.09, 136.58, 135.80, 124.41, 123.95, 123.43, 121.24, 113.08, 110.04, 68.13, 66.91, 43.97, 14.97; MS (MALDI-TOF): m/z 252 [M+H]
+; mp 52℃
제조예 15: 2-클로로-1-(2-메톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드
2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(538.8 mg, 3.0 mmol)를 DMF(10 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 메틸 에테르(422.6 μL, 4.5 mmol)와 Cs
2CO
3(2.93 g, 9.0 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=2:1)로 분리하여 표제 화합물 468 mg(수율 66%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.14 (s, 1H), 8.30 (m, 1H), 7.42-7.31 (m, 3H), 4.43 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.32 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 184.27, 136.79, 135.97, 124.56, 124.21, 123.64, 121.44, 113.25, 110.17, 70.49, 59.35, 44.00; MS (MALDI-TOF): m/z 238 [M+H]
+, 260 [M+Na]
+;
mp 66-67℃
제조예 16: 5-메틸옥시인돌
5-메틸이사틴(1.50 g, 9.31 mmol)에 에틸렌 글리콜(10 mL)을 넣은 후, KOH(522.4 mg, 9.31 mmol)와 히드라진 일수화물(1.40 g, 27.9 mmol)를 넣고 140℃에서 4시간 가열하였다. 반응용액을 냉각하고 1 N HCl로 산성화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 감압 증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=3:2)로 분리하여 표제 화합물 1.0 g(수율 73%, 연갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 10.23 (br s, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.96 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.41 (s, 2H), 2.23 (s, 3H)
제조예 17: 2-클로로-5-메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(10 mL)에 POCl
3(2.65 mL, 28.9 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 5-메틸옥시인돌(850.0 mg, 5.78 mmol)의 DMF(10 mL) 용액을 넣고 80℃에서 3시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고 Na
2SO
4로 건조, 여과한 후, 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA= 3:2)로 분리하여 표제 화합물 600 mg(수율 54%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.96 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 7.87(s, 1H), 7.31 (d, J = 8.3 Hz), 7.10 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 2.39 (s, 3H); mp 215℃
제조예 18: 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드
2-클로로-5-메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드(440.0 mg, 2.27 mmol)의 CH
3CN(20 mL) 용액에 2-브로모에틸 에틸 에테르(303.8 μL, 2.72 mmol)와 Cs
2CO
3(3.71 g, 11.4 mmol)를 넣고 15시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 잔류물에 물을 넣어 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=9:1)로 분리하여 표제 화합물 570 mg (94%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.09 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.28 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.5, 1.5 Hz, 1H), 4.39 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.11 (t, J = 7.0 Hz, 3H);
13C NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 184.35, 136.69, 134.28, 133.48, 125.59, 124.73, 121.19, 112.92, 109.89, 68.30, 67.09, 44.19, 21.61, 15.17; MS (MALDI-TOF): m/z 266 [M+H]
+;
mp 54℃
제조예 19: 2-클로로-5-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(10 mL)에 POCl
3(2.24 mL, 24.5 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 5-메톡시옥시인돌(1.60 g, 9.81 mml)의 DMF(10 mL) 용액을 넣고 80℃에서 2시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, 생성된 고체는 물로 세척하고 건조하여 표제 화합물을 얻었다. 여액은 다시 EA로 추출하고 Na
2SO
4로 건조, 여과한 후, 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:2)로 분리하여 표제 화합물 1.27 g(수율 62%, 연갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d
6): δ 12.96 (br s, 1H), 9.96 (s, 1H), 7.57 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H); mp 225℃
제조예 20: 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드
5-메톡시-2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(1.97 g, 9.40 mmol)를 DMF(70 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(1.26 mL, 11.3 mmol)와 Cs
2CO
3(15.3 g, 47.0 mmol)를 넣고 70℃에서 11시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=3:1)로 분리하여 표제 화합물 2.18 g(수율 82%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.09 (s, 1H), 7.79 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.94 (dd, J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.74 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 184.10, 156.90, 135.99, 130.59, 125.12, 114.17, 112.95, 111.06, 102.64, 68.21, 66.90, 55.77, 44.16, 14.96; MS (MALDI-TOF): m/z 282 [M+H]
+;
mp 48℃
제조예 21: 6-메톡시옥시인돌
6-메톡시이사틴(500 mg, 2.82 mmol)에 에틸렌 글리콜(10 mL)을 넣은 후, KOH(158.2 mg, 2.82 mmol)와 히드라진 일수화물(282.3 mg, 5.64 mmol)를 넣고 140℃에서 4시간 가열하였다. 반응용액을 냉각하고 1 N HCl로 산성화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 감압 증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:1)로 분리하여 표제 화합물 278 mg(수율 60%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 10.30 (br s, 1H), 7.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 8.0, 2.4 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.37 (s, 2H)
제조예 22: 2-클로로-6-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(5 mL)에 POCl
3(1.79 mL, 19.5 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 6-메톡시옥시인돌(1.27 g, 7.78 mmol)의 DMF(15 mL) 용액을 넣고 80℃에서 2시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, 생성된 고체는 여과하여 물로 세척하고 건조하여 표제 화합물을 얻었다. 여액은 다시 EA로 추출하고 Na
2SO
4로 건조, 여과한 후, 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA=10:1)로 분리하여 표제 화합물 945 mg(수율 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.87 (br s, 1H), 9.94 (s, 1H), 7.91 (m, 1H), 6.89-6.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 183.09, 156.90, 135.57, 133.26, 120.73, 118.09, 112.23, 112.10, 95.09, 55.31; mp 230℃
제조예 23: 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-6-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드
6-메톡시-2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(765.1 mg, 3.65 mmol)를 DMF(15 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(489.2 μL, 4.38 mmol)와 Cs
2CO
3(3.58 g, 11.0 mmol)를 넣고 70℃에서 5시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:CH
2Cl
2:EA=3:1:0.5)로 분리하여 표제 화합물 420 mg(수율 41%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.08 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.36 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.75 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.13 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 184.02, 157.51, 136.85, 135.25, 122.00, 118.29, 113.20, 112.31, 94.46, 68.25, 66.92, 55.68, 44.00, 15.04; MS (MALDI-TOF): m/z 281 [M]
+;
mp 82℃
제조예 24: 2-클로로-5-플루오로-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(5 mL)에 POCl
3(1.36 mL, 14.9 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 5-플루오로옥시인돌(900.0 mg, 5.95 mmol)의 DMF(15 mL) 용액을 넣고 80℃에서 4시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 Na
2SO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:1)로 분리하여 표제 화합물 235 mg(수율 20%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d
6): δ 13.22 (br s, 1H), 9.96 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 7.45 (dd, J = 9.0, 4.5 Hz, 1H), 7.13 (m, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 183.27, 158.93 (d, J = 235.2 Hz), 135.60, 131.21, 124.89 (d, J = 11.3 Hz), 113.27 (d, J = 9.9 Hz), 112.11 (d, J = 4.4 Hz), 111.92 (d, J = 25.9 Hz), 105.09 (d, J = 25.1 Hz); mp 208-210℃
제조예 25: 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-플루오로-1H-인돌-3-카복스알데히드
2-클로로-5-플루오로-1H-인돌-3-카복스알데히드(197.6 mg, 1.0 mmol)를 DMF(5 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(134.0 μL, 1.2 mmol)와 Cs
2CO
3(977.5 mg, 3.0 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:CH
2Cl
2:EA=3:1:0.5)로 분리하여 표제 화합물 125 mg(수율 46%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.09 (s, 1H), 7.98 (d, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 9.2, 4.4 Hz, 1H), 7.06 (m, 1H), 4.41 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 183.79, 159.96 (d, J = 238.6 Hz), 137.13, 132.38, 124.95 (d, J = 11.3 Hz), 113.07 (d, J = 4.4 Hz), 112.19 (d, J = 26.2 Hz), 111.30 (d, J = 9.4 Hz), 106.80 (d, J = 25.1 Hz), 68.23, 66.91, 44.37, 14.93; MS (MALDI-TOF): m/z 270 [M+H]
+;
mp 83-84℃
제조예 26: 2,5-디클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(5 mL)에 POCl
3(2.74 mL, 29.9 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 5-클로로옥시인돌(1.0 g, 5.97 mmol)의 DMF(5 mL) 용액을 넣고 80℃에서 3시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고 Na
2SO
4로 건조, 여과한 후, 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=2:1)로 분리하여 표제 화합물 530 mg(수율 41%, 연갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 13.31 (br s, 1H), 9.97 (s, 1H), 8.04 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H); mp 245-248℃
제조예 27: 2,5-디클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드
상기 제조예 26에서 얻은 2,5-디클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(350 mg, 1.64 mmol)의 CH
3CN(20 mL) 용액에 2-브로모에틸 에틸 에테르(274.8 μL, 2.46 mmol)와 Cs
2CO
3(2.67 g, 8.20 mmol)를 넣고 15시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 잔류물에 물을 넣어 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=9:1)로 분리하여 표제 화합물 360 mg(수율 77%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.06 (s, 1H), 8.26 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.32-7.23 (m, 2H), 4.38 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.41 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 184.01, 137.39, 134.50, 129.64, 125.40, 124.51, 120.95, 112.84, 111.60, 68.41, 67.13, 44.55, 15.15; MS (MALDI-TOF): m/z 286 [M+H]
+;
mp 104℃
제조예 28: 5-(트리플루오로메톡시)옥시인돌
5-(트리플루오로메톡시)이사틴(1.75 g, 7.57 mmol)에 에틸렌 글리콜(10 mL)을 넣은 후, KOH(424.8 mg, 7.57 mmol)와 히드라진 일수화물(1.14 g, 22.7 mmol)를 넣고 140℃에서 4시간 가열하였다. 반응용액을 냉각하고 1 N HCl로 산성화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 감압 증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:2)로 분리하여 표제 화합물 855 mg(52%, 연갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 10.52 (br s, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.16 (m, 1H), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.54 (s, 2H)
제조예 29: 2-클로로-5-(트리플루오로메톡시)-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(1 mL)에 POCl
3(727.7 μL, 7.95 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 5-(트리플루오로메톡시)옥시인돌(575.0 mg, 2.65 mmol)의 DMF(5 mL) 용액을 넣고 80℃에서 3시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 Na
2SO
4로 건조, 여과한 후, 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:1)로 분리하여 표제 화합물 120 mg(수율 17%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 13.40 (br s, 1H), 9.99 (s, 1H), 7.95 (m, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.29 (m, 1H); mp 191-192℃
제조예 30: 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-(트리플루오로메톡시)-1H-인돌-3-카복스알데히드
2-클로로-5-(트리플루오로메톡시)-1H-인돌-3-카복스알데히드(100 mg, 0.38 mmol)를 DMF (3 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(51.4 μL, 0.46 mmol)와 Cs
2CO
3(371.4 mg, 1.14 mmol)를 넣고 70℃에서 8시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:CH
2Cl
2:EA =4:4:1)로 분리하여 표제 화합물 43 mg(수율 34%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.11 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 183.78, 145.66 (q, J = 1.9 Hz), 137.58, 134.20, 124.73, 120.62 (q, J = 255.0 Hz), 117.81, 113.86 (q, J = 0.8 Hz), 113.23, 111.29, 68.25, 66.96, 44.46, 14.94; MS (MALDI-TOF): m/z 335 [M]
+;
mp 79℃
제조예 31: 2-브로모-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 CH
2Cl
2(6 mL)에 DMF(1.8 mL)을 넣은 다음, POBr
3(5.33 g, 18.6 mmol)의 CH
2Cl
2(10 mL) 용액을 천천히 넣고 15분 환류하였다. 이후, 옥시인돌(1.03 g, 7.74 mmol)을 조금씩 넣어 주고 1시간 더 환류하였다. 반응용액을 차가운 물에 넣고 20분 교반해서 물층을 분리하였다. 물층을 고체 K
2CO
3로 중화시킨 다음, 생성된 고체를 여과하였다. 얻어진 고체를 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=2:1)로 정제하여 표제 화합물 1.2 g(70%, 연갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 13.04 (br s, 1H), 9.90 (s, 1H), 8.08 (m, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.29-7.21 (m, 2H)
제조예 32: 에틸 2-(2-브로모-3-포밀-1H-인돌-1-일)아세테이트
0℃에서 상기 제조예 31에서 얻은 2-브로모-1H-인돌-3-카복스알데히드(120.0 mg, 0.54 mmol)와 NaH(32.4 mg, 0.81 mmol, 오일 중 60%)에 THF(5 mL)와 DMF(2 mL)를 넣고 5분 교반한 후, 에틸 브로모아세테이트(72.1 μL, 0.65 mmol)를 넣고 실온에서 15시간 교반하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA=20:1)로 분리하여 표제 화합물 91 mg(수율 54%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.07 (s, 1H), 8.33 (m, 1H), 7.34-7.31 (m, 2H), 7.25 (m, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 185.45, 166.55, 137.11, 126.09, 125.18, 124.49, 123.62, 121.40, 116.07, 109.21, 62.35, 46.27, 14.06; MS (MALDI-TOF): m/z 309 [M]
+; mp 94℃
제조예 33: 2-브로모-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드
상기 제조예 31에서 얻은 2-브로모-1H-인돌-3-카복스알데히드(400.0 mg, 1.79 mmol)를 DMF(10 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(240.1 μL, 2.15 mmol)와 Cs
2CO
3(1.75 g, 5.37 mmol)를 넣고 70℃에서 6시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA=20:1)로 분리하여 표제 화합물 436 mg(수율 82%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.06 (s, 1H), 8.32 (m, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.34-7.30 (m, 2H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 185.61, 137.43, 126.59, 125.43, 124.25, 123.57, 121.30, 115.60, 110.47, 68.40, 67.14, 45.59, 15.17; MS (MALDI-TOF): m/z 295 [M]
+;
mp 56-57℃
제조예 34: 2-(트리플루오로메틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드
0℃에서 DMF(10 mL)에 POCl
3(1.83 mL, 20.0 mmol)를 넣고 10분 교반한 후, 2-트리플루오로메틸인돌(740.6 mg, 4.0 mml)의 DMF(10 mL) 용액을 넣고 80℃에서 5시간 가열하였다. 반응용액에 1 N NaOH를 넣어 알칼리화한 후, EA로 추출하였다. 유기층을 브라인(brine) 용액으로 세척하고 Na
2SO
4로 건조, 여과한 후, 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=7:1)로 분리하여 표제 화합물 324 mg(수율 38%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 13.42 (br s, 1H), 10.24 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44 (m, 1H), 7.36 (m, 1H); mp 171-173℃
제조예 35: 1-(2-에톡시에틸)-2-(트리플루오로메틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드
2-(트리플루오로메틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(350.0 mg, 1.64 mmol)를 DMF(10 mL)에 녹인 후, 2-브로모에틸 에틸 에테르(220.0 μL, 1.97 mmol)와 Cs
2CO
3(1.60 g, 4.92 mmol)를 넣고 70℃에서 15시간 가열하였다. 반응용액을 물로 희석하고 EA로 추출하였다. 유기층을 MgSO
4로 건조, 여과하고 감압 증류하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=5:1)로 분리하여 표제 화합물 184 mg(수율 39%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl
3): δ 10.41 (s, 1H), 8.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.46 (m, 1H), 7.39 (m, 1H), 4.52 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.13 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl
3): δ 185.81, 137.63, 131.27 (q, J = 37.9 Hz), 126.02, 124.30, 124.21, 123.66, 121.29 (q, J = 270.3 Hz), 117.84 (q, J = 1.5 Hz), 111.18, 68.82, 66.93, 45.58 (q, J = 2.5 Hz), 14.94; MS (MALDI-TOF): m/z 286 [M+H]
+; mp 46℃
<벤조퓨란계 N-아실히드라존 유도체의 제조>
실시예 1: (E)-N'-[(2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌]-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(95.1 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1H-인돌-3-카복스알데히드(89.8 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 8시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 잔류물을 n-Hex/CH
2Cl
2(1:1) 혼합용매로 세척하여 표제 화합물 153 mg(수율 87%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d
6) δ 12.48 (s, 1H), 11.98 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.28 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 3H), 7.39 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.27-7.19 (m, 2H), 2.44 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6) δ 154.20, 152.86, 148.41, 142.86, 135.02, 132.91, 128.33, 127.26, 127.16, 124.06, 123.20, 122.24, 121.33, 121.28, 111.37, 111.21, 110.03, 107.39, 20.83; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
19H
13ClN
3O
2 (M-H)
- 350.0696, found 350.0700; mp 242℃ dec.
실시예 2: (E)-N'-[(2-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸렌]-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(95.1 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드(96.8 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 냉각시키고 고체를 여과한 후, EtOH로 세척하여 표제 화합물 100 mg(수율 55%, 연갈색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.00 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.63-7.57 (m, 4H), 7.35-7.25 (m, 3H), 3.81 (s, 3H), 2.43 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.22, 152.87, 148.40, 142.93, 136.08, 132.92, 129.29, 128.34, 127.16, 123.24, 123.21, 122.25, 121.67, 121.42, 111.38, 110.34, 110.06, 107.28, 30.19, 20.84; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
20H
15ClN
3O
2 (M-H)
- 364.0853, found 364.0847; mp 246-247℃
실시예 3: 에틸 (E)-2-{2-클로로-3-[(2-(5-메틸벤조퓨란-2-카보닐)히드라지닐리덴)메틸]-1H-인돌-1-일}아세테이트의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드 (60.9 mg, 0.32 mmol)와 에틸 2-(2-클로로-3-포밀-1H-인돌-1-일)아세테이트 (85.0 mg, 0.32 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 30시간 환류하였다. 반응용액을 감압증류하고 잔류물을 Et
2O로 세척하여 표제 화합물 85 mg(수율 61%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.06 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.34 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.64-7.58 (m, 4H), 7.34-7.27 (m, 3H), 5.26 (s, 2H), 4.19 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 167.84, 154.28, 152.88, 148.33, 142.65, 136.14, 132.94, 129.17, 128.39, 127.15, 123.57, 123.29, 122.27, 121.97, 121.49, 111.39, 110.30, 110.19, 108.22, 61.45, 44.78, 20.84, 14.00; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
23H
19ClN
3O
4 (M-H)
- 436.1064, found 436.1068; mp 198℃
실시예 4: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드 (98.9 mg, 0.52 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(130.9 mg, 0.52 mmol)에 1-PrOH (15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 감압증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:1)로 분리하여 표제 화합물 179 mg(수율 81%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.01 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 4H), 7.33-7.24 (m, 3H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.00 (t, J = 6.8 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.23, 152.87, 148.40, 142.99, 135.76, 132.92, 129.26, 128.34, 127,16, 123.35, 123.21, 122.25, 121.67, 121.43, 111.37, 110.67, 110.08, 107.53, 67.85, 65.63, 43.52, 20.83, 14.90; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
23H
21ClN
3O
3 (M-H)
- 422.1271, found 422.1261; mp 172℃
실시예 5: (E)-N'-{[2-브로모-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(108.4 mg, 0.57 mmol)와 2-브로모-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(168.8 mg, 0.57 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 소량의 CH
2Cl
2에 녹인 후, n-Hex 용액에 적하하였다. 생성된 고체를 여과하여 표제 화합물 209 mg(수율 78%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.03 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.35 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 4H), 7.33-7.22 (m, 3H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.2 H, 2H), 2.44 (s, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.21, 152.86, 148.41, 144.36, 137.00, 132.90, 128.32, 127.16, 124.14, 123.13, 122.23, 121.46, 121.29, 119.80, 111.36, 110.77, 110.43, 110.03, 67.96, 65.69, 44.81, 20.83, 14.91; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
23H
21BrN
3O
3 (M-H)
- 466.0766, found 466.0776; mp 190℃
실시예 6: (E)-N'-{[1-(2-에톡시에틸)-2-(트리플루오로메틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(93.2 mg, 0.49 mmol)와 1-(2-에톡시에틸)-2-트리플루오로메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드(139.8 mg, 0.49 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 감압증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=2:1)로 분리하여 표제 화합물 176 mg (수율 79%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.24 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.61-7.59 (m, 2H), 7.47 (m, 1H), 7.37-7.32 (m, 2H), 4.54 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.72 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.37 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H), 10.00 (t, J = 7.0 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.52, 152.93, 148.17, 142.47, 137.83, 133.01, 128.53, 127.12, 125.66, 125.10 (q, J =
35.8 Hz), 124.20, 123.14, 122.48, 122.32, 121.75 (q, J = 269.0 Hz), 113.45, 111.85, 111.42, 110.56, 68.36, 65.79, 45.01, 20.84, 14.85;
19F NMR (376 MHz, DMSO-d
6): δ -52.9 (s, 3F); HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
21F
3N
3O
3 (M-H)
- 456.1535, found 456.1531; mp 183℃
실시예 7: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-메톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(319.5 mg, 1.68 mmol)와 2-클로로-1-(2-메톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(399.3 mg, 1.68 mmol)에 1-PrOH(20 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 15시간 환류하였다. 반응용액을 냉각시키고 고체를 여과한 후, n-Hex로 세척하여 표제 화합물 630 mg(수율 91%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.01 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.33 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 4H), 7.33-7.24 (m, 3H), 4.48 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 2.43 (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.23, 152.88, 148.40, 142.97, 135.76, 132.93, 129.20, 128.36, 127.16, 123.34, 123.25, 122.25, 121.68, 121.44, 111.38, 110.68, 110.10, 107.55, 70.11, 58.29, 43.34, 20.84; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
22H
19ClN
3O
3 (M-H)
- 408.1115, found 408.1099; mp 243℃
실시예 8: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(127.4 mg, 0.67 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드(188.8 mg, 0.67 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 감압증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:2)로 분리하여 표제 화합물 213 mg(수율 70%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.01 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 7.91 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 3H), 7.52 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.68 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.38 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 155.20, 154.17. 152.85, 148.48, 142.94, 132.91, 130.74, 128.95, 128.31, 127.17, 124.01, 122.23, 112.24, 111.53, 111.35, 110.04, 107.24, 104.11, 67.91, 65.62, 55.33, 43.65, 20.83, 14.90; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
23ClN
3O
4 (M-H)
- 452.1377, found 452.1355; mp 208℃
실시예 9: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-6-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(95.1 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-6-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드(140.9 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 16시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 소량의 CH
2Cl
2에 녹인 후, n-Hex 용액에 적하하였다. 생성된 고체를 여과하여 표제 화합물 205 mg(수율 90%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 11.98 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.62-7.58 (m, 3H), 7.32 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.70 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.40 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 156.75, 154.17. 152.85, 148.39, 142.91, 136.73, 132.91, 128.33, 127.54, 127.15, 122.24, 122.16, 117.27, 111.37, 111.24, 110.03, 107.62, 94.53, 67.88, 65.62, 55.44, 43.41, 20.83, 14.97; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
23ClN
3O
4 (M-H)
- 452.1377, found 452.1372; mp 210℃
실시예 10: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-플루오로-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(66.6 mg, 0.35 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-플루오로-1H-인돌-3-카복스알데히드(94.4 mg, 0.35 mmol)에 1-PrOH(10 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 8시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 소량의 CH
2Cl
2에 녹인 후, n-Hex 용액에 적하하였다. 생성된 고체를 여과하여 표제 화합물 137 mg (수율 89%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.06 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.02 (dd, J = 9.6, 2.8 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 9.2, 4.8 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 3H), 7.32 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.18 (m, 1H), 4.47 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.38 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 0.99 (t, J = 6.8 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 158.31 (d, J = 233.8 Hz), 154.27, 152.88, 148.31, 142.49, 132.93, 132.47, 130.35, 128.37, 127.14, 123.65 (d, J = 11.3 Hz), 122.24, 112.30 (d, J = 9.4 Hz), 111.36, 111.21 (d, J = 25.9 Hz), 110.19, 107.65 (d, J = 4.4 Hz), 106.37 (d, J = 25.1 Hz), 67.88, 65.64, 43.85, 20.82, 14.88;
19F NMR (376 MHz, DMSO-d
6): δ -121.3 (s, 1F); HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
23H
20ClFN
3O
3 (M-H)
- 440.1177, found 440.1185; mp 187℃
실시예 11: (E)-N'-{[2,5-디클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(165.5 mg, 0.87 mmol)와 2,5-디클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(249.0 mg, 0.87 mmol)에 1-PrOH (30 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 3시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 EtOH로 재결정하였다. 생성된 고체를 여과하고 차가운 EtOH로 세척하여 표제 화합물 270 mg (수율 68%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.07 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 3H), 7.35-7.31 (m, 2H), 4.46 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.38 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 0.98 (t, J = 7.0 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.31, 152.92, 148.30, 142.52, 134.40, 132.98, 130.52, 128.44, 127.17, 126.42, 124.25, 123.16, 122.30, 120.44, 112.65, 111.42, 110.30, 107.33, 67.89, 65.68, 43.88, 20.88, 14.93; HRMS (ESI): m/z calcd for C
23H
22Cl
2N
3O
3 (M+H)
+ 458.1038, found 458.1037;
mp 98℃
실시예 12: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-(트리플루오로메톡시)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(22.8 mg, 0.12 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-트리플루오로메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드(40.3 mg, 0.12 mmol)에 1-PrOH(10 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 18시간 환류하였다. 반응용액을 감압증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex:EA=1:2)로 분리하여 표제 화합물 52 mg(수율 85%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.10 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.45 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 3H), 7.33-7.29 (m, 2H), 4.49 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 0.99 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.27, 152.88, 148.29, 143.57, 142.30, 134.32, 132.95, 130.87, 128.41, 127.13, 123.45, 122.27, 120.34 (q, J = 253.9 Hz), 116.68, 113.47, 112.43, 111.37, 110.27, 107.92, 67.84, 65.63, 43.93, 20.83, 14.87;
19F NMR (376 MHz, DMSO-d
6): δ -56.8 (s, 3F); HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
20ClF
3N
3O
4 (M-H)
- 506.1094, found 506.1087; mp 84-85℃
실시예 13: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메틸-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(374.7 mg, 1.97 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메틸-1H-인돌-3-카복스알데히드(523.5 mg, 1.97 mmol)에 1-PrOH(30 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 3시간 가열 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 EtOH로 재결정하였다. 생성된 고체를 여과하고 차가운 EtOH로 세척하여 표제 화합물 690 mg(수율 80%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 11.99 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.63-7.59 (m, 3H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 8.4, 1.4 Hz, 1H), 4.43 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 1.01 (t, J = 7.0 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.21, 152.90, 148.46, 143.38, 134.16, 132.95, 130.58, 129.22, 128.37, 127.20, 124.64, 123.54, 122.28, 121.08, 111.41, 110.42, 110.10, 107.09, 67.90, 65.66, 43.57, 21.34, 20.88, 14.95; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
23ClN
3O
3 (M-H)
- 436.1428, found 436.1442; mp 197℃
실시예 14: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드(103.1 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(125.9 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 7시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 잔류물을 n-Hex/CH
2Cl
2 혼합용매(1:1)로 세척하여 표제 화합물 204 mg(수율 93%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.01 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.63-7.60 (m, 3H), 7.33-7.24 (m, 3H), 7.10 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.70 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 156.11, 154.16, 149.34, 148.94, 143.01, 135.76, 129.27, 127.72, 123.35, 123.21, 121.68, 121.43, 116.39, 112.47, 110.68, 110.43, 107.53, 104.20, 67.85, 65.63, 55.63, 43.53, 14.90; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
23H
21ClN
3O
4 (M-H)
- 438.1221, found 438.1218; mp 185℃
실시예 15: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드(103.1 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-카복스알데히드(140.9 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 8시간 환류하였다. 반응용액을 감압증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(n-Hex-EA=2:3)로 분리하여 표제 화합물 222 mg(수율 94%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.01 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 7.91 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.62 -7.59 (m, 2H), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.817 (s, 3H), 3.68 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.38 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 156.11, 155.21, 154.12, 149.33, 149.03, 142.97, 130.75, 128.96, 127.74, 124.02, 116.37, 112.45, 112.27, 111.54, 110.42, 107.25, 104.20, 104.09, 67.92, 65.63, 55.63, 55.33, 43.67, 14.91; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
23ClN
3O
5 (M-H)
- 468.1326, found 468.1322; mp 128-129℃
실시예 16: (E)-5-클로로-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
5-클로로벤조퓨란-2-카보히드라지드(103.2 mg, 0.49 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(123.3 mg, 0.49 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA= 5:1)로 분리하여 표제 화합물 188 mg(수율 86%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.10 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.61 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz, 1H), 7.33-7.24 (m, 2H), 4.46 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 153.79, 152.86, 149.68, 143.29, 135.76, 129.43, 128.66, 128.15, 126.97, 123.33, 123.23, 122.21, 121.72, 121.39, 113.52, 110.71, 109.75, 107.44, 67.84, 65.63, 43.55, 14.90; HRMS (ESI): m/z calcd for C
22H
20Cl
2N
3O
3 (M+H)
+ 444.0882, found 444.0884;
mp 117℃
실시예 17: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-4,7-디메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
4,7-디메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드(81.7 mg, 0.40 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(100.7 mg, 0.40 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 24시간 환류하였다. 반응용액을 감압 증류하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH
2Cl
2:EA=5:1)로 분리하여 표제 화합물 158 mg(수율 90%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 11.87 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.34 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34-7.25 (m, 2H), 7.19 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.51 (s, 3H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 154.34, 153.35, 147.46, 142.86, 135.76, 129.60, 129.25, 127.53, 126.50, 123.81, 123.35, 123.22, 121.67, 121.42, 118.71, 110.69, 109.48, 107.50, 67.85, 65.62, 43.53, 17.88, 14.90, 14.52; HRMS (ESI): m/z calcd for C
24H
25ClN
3O
3 (M+H)
+ 438.1584, found 438.1584;
mp 202℃
실시예 18: (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드의 제조
4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드(118.1 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(125.9 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 4시간 환류하였다. 반응용액을 냉각시키고 고체를 여과한 후, EtOH로 세척하여 표제 화합물 210 mg(수율 89%, 흰색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 11.82 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.33-7.23 (m, 2H), 6.87 (s, 1H), 6.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.70 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.38 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 161.07, 156.44, 154.11, 146.03, 142.31, 135.74, 129.04, 123.33, 123.18, 121.60, 121.41, 110.98, 110.65, 107.58, 107.53, 95.13, 88.44, 67.85, 65.62, 55.84, 43.50, 14.90; HRMS (ESI): m/z calcd for C
24H
25ClN
3O
5 (M+H)
+ 470.1483, found 470.1482;
mp 215℃
실시예 19: (E)-N'-{2-[2-((2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일)메틸렌]히드라진-1-카보닐}벤조퓨란-5-일)아세트아미드의 제조
N-(2-(히드라진카보닐)벤조퓨란-5-일)아세트아미드(116.6 mg, 0.50 mmol)와 2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-카복스알데히드(125.9 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(20 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 12시간 환류하였다. 반응용액을 냉각시키고 고체를 여과한 후, EtOH로 세척하여 표제 화합물 166 mg (71%, 연노란색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6): δ 12.02 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.65-7.60 (m, 2H), 7.53 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H), 7.33-7.24 (m, 2H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.08 (s, 3H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δ 168.24, 154.15, 150.62, 148.84, 143.08, 135.77, 135.54, 129.32, 127.18, 123.36, 123.24, 121.70, 121.44, 119.61, 112.10, 111.83, 110.72, 110.66, 107.53, 67.88, 65.65, 43.55, 23.97, 14.94; HRMS (TOF MS ES
-): m/z calcd for C
24H
22ClN
4O
4 (M-H)
- 465.1330, found 465.1323; mp 226℃
실시예 20: (E)-에틸-2-(3-((2-(4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보닐)히드라진일리덴)메틸)-2-메틸-1H-인돌-1-일)아세테이트의 제조
4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드(118.1 mg, 0.50 mmol)와 에틸 2-(3-포밀-2-메틸-1H-인돌-1-일)아세테이트(122.6 mg, 0.50 mmol)에 1-PrOH(15 mL)과 아세트산(1-2 방울)을 넣고 4시간 환류하였다. 반응용액을 냉각시키고 고체를 여과한 후, EtOH로 세척하여 표제 화합물 197 mg(수율 85%, 흰색 고체)을 얻었다.
HRMS (ESI): m/z calcd for C
25H
25N
3O
6Na(M+Na) 486.1641, found 486.1642
비교예 1: (E)-에틸 2-(2-메틸-3-((2-(나프토[2,1-b]퓨란-2-카보닐)히드라조노)메틸)-1H-인돌-1-일)아세테이트의 제조
한국 공개특허공보 제2014-0128238호에 개시된 합성 방법에 의해 표제 화합물(수율 75%, 연황색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6) δppm:11.838 (1H, s, -NHCO-), 8.862 (1H, s, -N=CH-Ar), 8.438-8.418 (1H, d, J = 8, Ar-H), 8.355-8.307 (2H, dd, J = 8.8, 3.6, Ar-H), 8.114-8.094 (1H, d, J = 8.0, Ar-H), 8.041-8.018 (1H, d, J = 8.0, Ar-H), 7.891-7.869 (1H, d, J = 8.8, Ar-H), 7.731-7.694 (1H, t, J = 7.2, Ar-H), 7.622-7.585 (1H, t, J = 8.0, Ar-H), 7.483-7.461 (1H, t, J = 8.8, Ar-H), 7.217-7.198 (2H, m, Ar-H), 5.192 (2H, s, -N-CH
2), 4.211-4.158 (2H, q, J = 7.2, -O-CH
2), 2.505 (3H, s, -CH
3), 1.249-1.214 (3H, t, J = 7.2, -CH
3);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d
6): δppm:168.602, 153.88, 152.217, 148.131, 145.138, 141.430, 137.031, 130.101, 128.833, 128.178, 127.482, 127.271, 125.388, 124.674, 123.720, 122.755, 122.242, 121.368, 120.985, 112.485, 109.656, 109.539, 108.235, 61.201, 44.431, 14.026, 9.961. ESIMS found: m/z 452.6 [M-H]
-, 454.6 [M+H]
+, 476.5 [M+Na]
+; Rf = 0.50 (n-Hex:EA=1:2)
상기 제조된 실시예 화합물들에 대해 아래의 실험을 수행하였다.
실험예 1: 항증식 활성 시험
1.1. HeLa 세포주에서의 항증식 활성 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물의 항증식 활성에 대해 시험하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
인간 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포(ATCC, 미국)를 96-웰 플레이트에 3 x 10
3 세포/웰로 뿌린 후, 본 발명에 따른 실시예 또는 비교예 화합물로 세포를 처리하고 2일 동안 성장시켰다. 이후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 10 μL/웰로 첨가하였다. 2시간 후, "OD 450"에서 흡광도를 측정하고 Prism
TM 6 프로그램을 사용하여 통계적 수치를 얻었다. 아래 표에 나타낸 데이터는 분석을 2번 반복하여 수행한 결과의 평균값이다.
상기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 화합물은 HeLa 세포주(자궁경부암 세포주)에서의 항증식 활성이 우수함을 알 수 있다.
1.2. 다른 암세포주에서의 항증식 활성 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물이 HeLa 세포주(자궁경부암 세포주)뿐 아니라 다른 암세포에도 항증식 활성을 보이는지 여부를 시험하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 미량정량판(microtiter plate, 1-3x10
3 세포/웰)에 다양한 암세포주를 배양하고 본 발명에 따른 실시예 4의 화합물로 처리하여 4일간 배양하였다. 세포독성은 상기 실험예 1-1과 동일한 방식의 MTT 분석으로 시험하였고, IC
50은 로그 용량 반응 곡선(log-dose response curve)에 의해 얻었다. 하기 표에 나타낸 데이터는 분석을 3번 반복하여 수행한 결과의 평균값이다.
상기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 화합물은 다양한 암세포주에서도 항증식 활성이 우수함을 알 수 있다.
1.3. 다중약물 내성을 보이는 암세포에서의 항증식 활성 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물이 다중약물 내성을 보이는 암세포주에도 효과를 보이는지 시험하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, K562 및 MCF7(바이오평가센터, 한국생명공학연구원, 한국) 및 이들 각 세포주의 다중약물 내성을 가진 세포주인 K562/ADR과 MCF7/ADR(바이오평가센터, 한국생명공학연구원, 한국)를 미량정량판(microtiter plate, 1-3x10
3 세포/웰)에 배양하였다. 이후 세포들을 본 발명에 따른 실시예 4의 화합물, 탁솔(taxol), 독소루비신(doxorubicin), 빈블라스틴(vinblastine) 또는 콜히친(colchicine)으로 처리하여 4일간 배양하였다. 세포독성은 상기 실험예 1-1과 동일한 방식의 MTT 분석으로 시험하였고, IC
50은 로그 용량 반응 곡선(log-dose response curve)에 의해 얻었다(단위: nM). 하기 표에 나타낸 데이터는 분석을 3번 반복하여 수행한 결과의 평균값이다.
다중약물 내성을 보이는 세포주의 저항인자(resistance factor)는 내성이 없는 모세포주(parent)의 IC
50에 대한 다중약물 내성 세포주의 IC
50의 비율을 의미한다.
상기 표에 나타난 바와 같이, 다중약물 내성 세포주는 기존의 항암제에 대해서 저항인자가 수십 내지 수백 배에 달하는 큰 저항성을 나타내었다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예 화합물에 대해서는 저항 인자가 0.40 내지 0.57로 나타나, 본 발명에 따른 실시예 화합물이 기존의 항암제에 비해 다중약물 내성을 보이는 암세포주에 더 강한 세포독성 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 2: 세포주기 진행에 미치는 효과 시험
HeLa CCL2 세포주를 12 웰 플레이트(3x10
4 세포/웰)에서 배양하고, DMSO 또는 실시예 4의 화합물로 17 시간 동안 처리한 후, 프로피디움 요오드(propidium iodine) 염료를 첨가하여 세포 DNA를 염색하고 FACS를 사용하여 측정하였다. 하기 표에, 분열기에 세포가 모이는 농도와 세포의 수를 퍼센트로 나타내었다
상기 표에 나타난 바와 같이, 실시예 4의 화합물은 대표적인 암세포주인 HeLa CCL2에 대해 0.2μM에서 IC
50을 보이며, 특히 세포에 처리한 후 16시간 이후 80% 이상의 세포가 분열기(mitotic phase)에 멈춰서 있는 것을 관찰함으로써 튜불린의 중합 반응을 억제하는 것으로 기대되어 이를 실험예 3에서 확인하였다.
실험예 3: 튜불린 중합에 미치는 효과 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물이 세포내 미세소관에 미치는 효과를 확인하기 위해, HeLa 세포를 DMSO 또는 실시예 4의 화합물(50 nM, 100 nM, 200 nM)로 16시간 동안 처리하였다.
세포를 고정한 후, 항튜불린 항체(anti-tubulin antibody)와 Alexa Fluor
TM 488로 염색시키고, Hoechst 33342를 사용하여 세포의 핵을 면역 염색하여 α-튜불린 및 DNA를 시험하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, DMSO 대조군과 비교하여 본 발명에 따른 실시예 화합물로 처리하였을 때 농도가 높아질수록 튜불린의 모양이 엉성하고 짧아졌다. 또한 중앙 배열을 이탈한 DNA 형태도 증가하였다.
따라서, 본 발명에 따른 실시예 화합물은 미세소관을 탈중합시키는 제제임을 알 수 있다.
실험예 4: 인체 유래 자궁경부암 세포(HeLa CCL2) 이식 모델에서의 항암 효과 시험
4.1. 암세포 배양 및 암세포 이식
액체 질소 속에서 냉동보관 중이던 인체 유래 피부암 세포주 HeLa CCL2를 해동한 후 세포 배양을 실시하였다. 세포의 배양은 CO
2 배양기(Forma, USA)에서 온도 37℃ 및 CO
2 농도 5%로 맞춰서 적절한 기간 동안 수행되었다.
배양 최종일에 모든 암세포를 수거하여 계수하고 무혈청 배양액(serum free media)을 이용하여 세포 농도를 1 x 10
7 세포/mL로 조절하였다. 이렇게 조절된 세포 배양액을 BALB/C 암컷 누드 마우스(5주령, 나라바이오텍) 당 0.3 mL(3 x 10
6 세포/마우스)씩 어깨뼈와 흉벽 사이의 액와(axillary) 부위 피하에 주입하였다.
4.2. 시료의 제조 및 투여 방법
시험물질로서 본 발명에 따른 실시예 화합물을 사용하고, 음성 대조물질로서 용매(담체)를 사용하였다.
화합물들을 투여 직전에 DMAC(디메틸아세트아미드) 20% + Tween 80 5% + 20% HPbCD(2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린) 75%의 혼합액에 적절한 농도로 용해한 후 사용하였다. 제조된 물질들은 마우스 20 g당 0.2 mL(10 mL/kg)씩 아래 투여 스케줄로 반복 복강 투여하였다.
- 담체, 실시예 4의 화합물, 실시예 8의 화합물 및 실시예 15의 화합물 (25 mg/kg), 0-28일
4.3. 종양크기 변화 확인
암세포 이식 후, 평균 종양 크기가 57.0 mm
3 도달 시부터 28일째까지 동물 개체별 종양 크기를 버니어캘리퍼스(vernier caliper)를 이용하여 3 방향에 대해 총 11회 측정한 후, 길이 x 폭 x 높이 / 2의 식에 의해 계산하였다.
최종일(day 28) 결과를 보면, 대조군의 종양 성장 억제를 0%로 하였을 때, 실시예 4, 8 및 15의 화합물(25 mg/kg)의 투여군에서 각각 56.71%, 38.35% 및 40.13% (p<0.001)의 종양 성장 억제가 관찰되었다(도 2a 및 2b 참조).
4.4 일반증상 및 체중 변화 확인
HeLa CCL2 암세포 이식 누드 마우스에 실시예 화합물을 반복 복강 투여시 독성 정도를 시험하기 위해, 투여기간 동안 동물 개체의 일반증상 및 체중 변화를 관찰하였다.
그 결과 시험기간 동안 용매 대조군과 비교하여 모든 약물투여군에서 통계적으로 유의미한 체중 감소는 관찰되지 않았으며 특이한 일반증상도 없었다(도 2c 참조).
4.5. 종양무게 변화 확인
약물투여 28일째에, 마지막 투여 2시간 후 마우스 안정맥(ophthalmic veins)에서 채혈하고 CO
2 가스를 이용하여 마우스를 치사시켰다. 마우스 사진을 촬영한 후 종양을 분리하여 전자저울에서 무게를 측정하였다. 사진 촬영 후, 각 종양을 절반으로 나누고, 액체질소 및 포르말린에 각각 고정하였다. 약물투여 16일째에, HeLa CCL2 종양을 절제하고 무게를 측정하였다.
용매 대조군과 비교하여, 실시예 4, 8 및 15의 화합물의 투여군에서 각각 57.1%, 40.5%, 및 26.2% (p <0.001)의 종양 무게 감소가 관찰되었다(도 2d 및 2e 참조).
실험예 5: 혈장 내 안정성 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물의 안정성(in vivo)를 시험하기 위하여, 실시예 2, 3, 4, 8 및 15의 화합물을 정맥 투여하고 시간 경과에 따른 혈장 농도를 관찰하였다. 또한 프로카인(Procaine)이 양성 대조군으로 사용되었다. 혈장 내 안정성은 37℃에서 인간, 랫트 또는 마우스 혈장(90 μL)에 시험 화합물을 5 mM 농도로 투여하여 3회 측정되었다. 그 결과를 하기 표 및 도 3a 내지 3e에 나타내었다.
상기 표 및 도 3a 내지 3e에서 보듯이, 실시예 화합물들의 혈장 내 안정성이 우수하였다.
실험예 6: 간 미세소관 내 대사안정성 시험
인간, 랫트 및 마우스의 간 미세소관(0.5 mg protein/mL)에 NADPH(1 mM)의 존재 또는 부재 하에 시험 화합물을 1 mM 농도로 투여하고, 37℃에서 30분간 대사안정성을 시험하였다. 또한 부스피론(Buspirone)이 양성 대조군으로 사용되었다. 그 결과를 하기 표 및 도 4a 내지 4e에 나타내었다.
상기 표 및 도 4a 내지 4e에서 보듯이, 실시예 화합물들이 대사안정성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 용해도 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물의 용해도를 아래와 같이 시험하였다.
시험물질을 정확히 칭량하여 유리 바이알에 넣은 후 목적하는 최종 용액 부피의 20%에 해당하는 용매 A를 가하고 볼텍스믹서(Vortexer) 및 초음파로 처리(sonication)하여 완전히 용해시킨 후 최종 용액 부피의 10% 또는 20%에 해당하는 용매 B를 가하고 잘 섞어주었다. 최종 용액 부피의 80%에 해당하는 용매 C를 상기 혼합용액에 적가하여 혼합하였다. 마지막으로 30초간 초음파로 처리하였다. 상기 혼합 용액은 실험에 투여직전에 제조하여 사용하였다.
용매 A: Dimethylacetamide, SigmaAldrich
용매 B: Cremophor EL, SigmaAldrich
용매 C: 탈이온수 중 20% HPbCD((2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, SigmaAldrich)
용해도 시험 조건 및 용해도 평가 결과를 하기 표에 정리하였다.
실험예 8: 약물동태(PK) 시험
본 발명에 따른 실시예 화합물의 약물동태(PK) 파라미터를 수컷 ICR 마우스를 이용하여 아래와 같이 시험하였다(n=3).
약물동태(PK) 파라미터는 Kinetica
TM 4.4.1(Thermo Fisher Scientific사, 미국)를 이용한 혈장농도-시간 곡선의 비구획 분석에 의해 측정되었다. 그 결과를 하기 표 및 도 5a 내지 5c에 나타내었다. 하기 표에서, "F" 파라미터는 AUC
last를 이용하여 계산되었고, "N/A"는 해당 없음을 의미하며, "NC"는 계산값 없음을 의미한다.
상기 표 및 도 5a 내지 5c에서 보듯이, 실시예 화합물들은 약물로서 사용 가능한 안정성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 9: 암 전이에 대한 억제 효과 확인
a. 상처회복시험(wound healing assay)
HeLa CCL2를 6 웰에 100%로 배양하고, 옐로우팁(yellow tip)으로 상처를 가한 후, 실시예 4의 화합물을 50 nM, 100 nM 처리하였다. 약물의 효과를 관찰하기 위하여 처리전 세포의 상태를 사진으로 기록하고, 약물 처리 후 24, 36, 48 시간에 세포의 상태와 비교하여, 세포의 이동 정도를 비교 관찰하였다. 세포에 처리한 실시예 4의 화합물의 농도는 MTT를 수행하여 정하였다.
그 결과 도 6a 및 6b에서 보듯이, 실시예 4의 화합물의 농도가 100 nM까지는 세포의 성장에 별다른 영향을 주지 않았다.
b. 침투시험(in vitro invasion assay)
또한, 세포의 이동을 저해하는 효능을 다시 확인하기 위해, 침투 시험(invasion assay)을 수행하였다. 24 웰 플레이트용 트랜스 웰 챔버(trans well chamber)를 준비하고, 상부 챔버(upper chamber)에 5 X 10
4 의 HeLa CCL2를 넣고 실시예 4의 화합물 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM 처리하고 배양한 후, 16시간 이후 세포 염색을 통해, 이동한 세포를 확인하고 그 수를 측정하였다.
그 결과 도 7a 및 7b에서 보듯이, 본 발명에 따른 실시예 4의 화합물은 암 전이 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 10: 독성 평가
10.1 재료 및 실험 절차
a. 마우스
모든 동물 실험 및 절차는 윤리적 규약에 따르고 한국생명공학연구원(KRIBB)의 동물실험윤리위원회의 승인 하에 이루어졌다. ICR 마우스는 대한바이오링크(한국)에서 공급되었다. 모든 마우스는 무균 동물 격리시설에서 사육되었다. 모든 in vivo 실험들은 6~8주령의 마우스를 이용하였다.
b. 마우스 독성 실험
실시예 4의 화합물의 급성 독성 실험을 한국생명공학연구원의 실험동물자원센터에서 수행하였다. ICR 마우스(6~8주령)를 실험 이전에 최대 10일간 적응시킨 후, 3마리의 마우스에 약물을 주입하였다. 실시예 화합물을 용매와 배합하고 복강내 주입하였으며, 약물 처리 이후에는 24시간 내의 임상 증상을 2회 관찰하고 추가적인 약물 처리를 일정대로 10회까지 수행하였다. 마우스의 무게는 일정대로 5회 측정되었다.
c. 오픈 필드 실험
실험 장치는 Reyes-Mendez 등의 논문(2018)에서 사용된 것과 유사하게 구성하였으며, 검정 아크릴 울타리(바닥 면적 30×30 cm 및 벽의 높이 40 cm)로 구성하였다. 바닥 표면을 10×10 cm의 25개 정사각형으로 구분하였다. 시험을 위해, 마우스를 바닥 중앙에 놓고 자발적 활동을 상부에서 7분간 녹화하였다. 실험 이후에는, 실험 장치를 30% 에탄올로 깨끗이 세척하였다. 약물 처리 여부를 알지 못하는 3명의 관찰자가 처음 5분간의 녹화 영상을 분석하여 마우스가 지나간 정사각형의 개수를 세고, 이동하지 않은 채로 머무른 시간과, 몸을 단장하거나 흔드는 횟수 등을 집계하였다. 이와 같이 분석된 내용을 바탕으로 중앙 존에 머무른 시간, 속도 및 총 이동 거리를 산출하였다. 양측 확률(two-tailed probability value)이 0.05 미만(p < 0.05)일 때 통계학적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
10.2 결과
a. 실시예 화합물의 용해도 및 독성 임상 평가
실시예 4의 화합물을 용매(N',N'-디메틸아세트아미드/Kolliphor/2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(10% 농도의 증류수 용액)=40:10:50)에 100 mg/kg까지 용해시켰다. 그보다 농도가 진해지면 즉시 침전이 발생하였다. 실시예 4의 화합물이 12.5 mg/kg부터 100 mg/kg까지 용해된 용액을 마우스의 복강 내로 하루에 10회 100 μL의 부피씩 주입하였다(도 8a 참조). 모든 동물은 최종일까지 생존하였으며, 육안 관찰에서 특별한 문제가 보이지 않았다(표 13 및 도 8a 참조). 무게 측정 결과, 실시예 4의 화합물을 일정대로 투여하더라도 특이적 효과는 관찰되지 않았다(도 8b 참조).
또한 마우스를 해부하여 각 장기에 대한 변화유무를 확인한 결과, 각 장기의 크기 및 형태학적 변화가 없었고, 이로부터 실시예 4의 화합물은 100 mg/kg의 농도로 10회 복강 투여하더라도 심각한 독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.
b. 동물 행동 분석을 통한 실시예 화합물의 독성 평가
마우스의 오픈 필드 실험 결과 통계학적으로 유의미한 실험 그룹은 발견되지 않았다. 오픈 필드의 중앙 존에서 머무른 시간을 측정한 결과(도 8c 및 8d 참조), 0~100 mg/kg의 시험 그룹 중에서 50 mg/kg의 시험 그룹이 중앙 존에 머무른 시간이 약간 감소하였으나 통계학적으로 유의미한 정도는 아니었다(도 8d 참조).
이러한 결과는 실시예 4의 화합물이 모든 그룹의 마우스 행동에 영향을 주지 않음을 보여준다. 이와 같이 약물 처리 실험 그룹과 대조군 그룹 간의 유의미한 변화가 없다는 사실은, 실시예 4의 화합물이 동물에 신경학적으로 영향이 없다는 증거이다.
Claims (19)
- 아래 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:[화학식 1]
상기 식에서,R 1은 H, C 1-6알킬, C 1-6알콕시카보닐C 1-3알킬, 또는 C 1-6알콕시C 1-3알킬이고;R 2는 할로겐, C 1-6알킬 또는 할로C 1-6알킬이고;R 3은 H, 할로겐, C 1-6알킬, C 1-6알콕시, 또는 할로C 1-6알콕시이고;R 4 및 R 5는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C 1-6알킬, C 1-6알콕시, 또는 C 1-6알킬카보닐아미노이되, R 4 및 R 5가 동시에 H는 아니다. - 제 1 항에 있어서,R 1은 H, -CH 3, -CH 2CO 2CH 2CH 3, -CH 2OCH 2CH 3, -CH 2CH 2OCH 2CH 3 또는 -CH 2CH 2OCH 3인 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서,R 2는 Cl, Br, -CH 3, 또는 -CF 3인 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서,R 3은 H, F, Cl, -CH 3, -OCH 3, 또는 -OCF 3인 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서,R 4 및 R 5는 각각 독립적으로 H, Cl, -CH 3, -OCH 3, 또는 -NHCOCH 3이되, R 4 및 R 5가 동시에 H는 아닌 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서,R 1은 H, -CH 3, -CH 2CO 2CH 2CH 3, -CH 2OCH 2CH 3, -CH 2CH 2OCH 2CH 3 또는 -CH 2CH 2OCH 3이고;R 2는 Cl, Br, -CH 3 또는 -CF 3이고;R 3은 H, F, Cl, -CH 3, -OCH 3, 또는 -OCF 3이고;R 4 및 R 5는 각각 독립적으로 H, Cl, -CH 3, -OCH 3, 또는 -NHCOCH 3이되, R 4 및 R 5가 동시에 H는 아닌 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제 1 항에 있어서,아래 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:1. (E)-N'-[(2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌]-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;2. (E)-N'-[(2-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸렌]-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;3. 에틸 (E)-2-{2-클로로-3-[(2-(5-메틸벤조퓨란-2-카보닐)히드라지닐리덴)메틸]-1H-인돌-1-일}아세테이트;4. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;5. (E)-N'-{[2-브로모-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;6. (E)-N'-{[1-(2-에톡시에틸)-2-(트리플루오로메틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;7. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-메톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;8. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;9. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-6-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;10. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-플루오로-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;11. (E)-N'-{[2,5-디클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;12. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-(트리플루오로메톡시)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;13. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메틸-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;14. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드;15. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-5-메톡시-1H-인돌-3-일]메틸렌}-5-메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드;16. (E)-5-클로로-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}벤조퓨란-2-카보히드라지드;17. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-4,7-디메틸벤조퓨란-2-카보히드라지드;18. (E)-N'-{[2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일]메틸렌}-4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보히드라지드;19. (E)-N'-{2-[2-((2-클로로-1-(2-에톡시에틸)-1H-인돌-3-일)메틸렌]히드라진-1-카보닐}벤조퓨란-5-일)아세트아미드; 및20. (E)-에틸-2-(3-((2-(4,6-디메톡시벤조퓨란-2-카보닐)히드라진일리덴)메틸)-2-메틸-1H-인돌-1-일)아세테이트.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 8 항에 있어서,상기 세포증식성 질환이 암인, 약학적 조성물.
- 제 9 항에 있어서,상기 암이 고형암, 혈액암, 또는 전이성암인, 약학적 조성물.
- 제 9 항에 있어서,상기 암이 직장암, 유방암, 폐암, 위암, 간암, 백혈병, 신경교종, 피부암, 자궁경부암, 또는 이로부터 유래된 전이물인, 약학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 튜불린 중합 저해를 위한 약학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 튜불린의 중합을 저해하기 위한 용도.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 세포증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의, 튜불린 중합 저해용 약제의 제조를 위한 용도.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 세포증식성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 튜불린의 중합을 저해하는 방법.
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