WO2021034222A1 - Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 - Google Patents

Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 Download PDF

Info

Publication number
WO2021034222A1
WO2021034222A1 PCT/RU2020/000445 RU2020000445W WO2021034222A1 WO 2021034222 A1 WO2021034222 A1 WO 2021034222A1 RU 2020000445 W RU2020000445 W RU 2020000445W WO 2021034222 A1 WO2021034222 A1 WO 2021034222A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
capsid
protein
aav5
isolated
modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2020/000445
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2021034222A9 (ru
Inventor
Анна Николаевна СТРЕЛКОВА
Александр Владимирович КАРАБЕЛЬСКИЙ
Дмитрий Александрович МАДЕРА
Мария Павловна ПЕРЕПЕЛКИНА
Елена Викторовна ЮРЛОВА
Павел Михайлович ГЕРШОВИЧ
Александр Владимирович ПРОКОФЬЕВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "anabion"
Original Assignee
Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "anabion"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to AU2020331882A priority Critical patent/AU2020331882B2/en
Priority to BR112022003389A priority patent/BR112022003389A2/pt
Priority to MYPI2022000990A priority patent/MY209964A/en
Priority to MX2022002184A priority patent/MX2022002184A/es
Priority to CA3148964A priority patent/CA3148964A1/en
Priority to JP2022512768A priority patent/JP2022545121A/ja
Priority to PE2022000294A priority patent/PE20221254A1/es
Priority to EP20855760.3A priority patent/EP4019642A4/en
Priority to KR1020227009552A priority patent/KR20220158674A/ko
Priority to MA56142A priority patent/MA56142B1/fr
Priority to CN202080074154.9A priority patent/CN114981444B/zh
Application filed by Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "anabion" filed Critical Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "anabion"
Priority to PH1/2022/550434A priority patent/PH12022550434A1/en
Priority to US17/637,099 priority patent/US20220306696A1/en
Publication of WO2021034222A1 publication Critical patent/WO2021034222A1/ru
Publication of WO2021034222A9 publication Critical patent/WO2021034222A9/ru
Priority to CONC2022/0001833A priority patent/CO2022001833A2/es
Priority to ZA2022/02242A priority patent/ZA202202242B/en
Priority to IL290802A priority patent/IL290802A/en
Priority to JOP/2022/0043A priority patent/JOP20220043A1/ar
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to JP2025130198A priority patent/JP2025178242A/ja
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • This application relates to the fields of gene therapy and molecular biology. More specifically, the present invention relates to an isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1, which contains one or more amino acid substitutions compared to the wild-type AAV5 capsid VP1 protein, which increase the efficiency of transduction, as well as to the capsid and vector thereof. basis.
  • AAV5 adeno-associated virus serotype 5
  • Adeno-associated virus is a small (20 nm), non-self-replicating, non-enveloped virus. Many different AAV serotypes have been described in humans and primates.
  • the genome of the adeno-associated virus contains (+ or -) single-stranded DNA (ssDNA) about 4.7 thousand nucleotides long. At the ends of the genomic DNA molecule are inverted terminal repeats (ITRs).
  • the genome contains two open reading frames (ORF): Rep and Cap, which contain several alternative reading frames coding for various protein products. Rep products are essential for AAV replication, with the Cap gene, among other alternative products, codes for 3 capsid proteins (VP1, VP2 and VP3).
  • Proteins VP1, VP2 and VP3 are in a ratio of 1: 1: 10, forming an icosahedral capsid (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99: 10405-10410).
  • AAV-2 adeno-associated virus
  • rAAV recombinant AAV vector
  • the expression cassette flanked by the ICP is packaged into the AAV capsid.
  • the genes required for AAV replication are not included in the cassette.
  • Recombinant AAV is considered the safest and one of the most widely used viral vectors for in vivo gene transfer.
  • Vectors can infect cells from a variety of tissue types, providing potent and sustained transgenic expression. They are also non-pathogenic and have a low immunogenicity profile (High CA et al .. "rAAV human trial experience” Methods Mol Biol. 201 1; 807: 429-57).
  • One of the pressing research goals in the development of effective gene therapy is to optimize vectors for maximum tissue transduction while minimizing vector dose.
  • AAV serotypes are characterized by affinity for different receptors on the surface of host cells. to which they possess tropism. So the main known receptor for AAV2 is heparan sulfate proteoglycan, the coreceptors are integrin heterodimer a ⁇ 5, fibroblast growth factor receptor I and hepatocyte growth factor receptor c-Met. AAV12 binds to heparan sulfate proteoglycans and sialic acid. AAV4 and AAV5 bind to N- and O-linked sialic acids, respectively. AAV5 activates the platelet growth factor receptor.
  • AAV adeno-associated virus
  • AAV adeno-associated virus
  • AAV AAV with improved transducing ability, which include in their structure various transgenes, including clinically important transgenes, for those in need. patients. Improving tissue transduction allows for minimizing the dose of vector administered to a subject.
  • the inventors have surprisingly found that the presence of one or more amino acid substitutions in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid, which are selected from the group:
  • S2A, S651A and T711 S leads to an increase in the efficiency of transduction of target cells using a vector based on AAV serotype 5 with this modification (s) and a significant increase in the efficiency of transgene delivery by vectors based on rAAV with the above mutations.
  • the present invention relates to an isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 for highly efficient target cell transduction, comprising the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP1 protein encoded by the Cap gene with one or more substitutions selected from groups:
  • the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid comprises a single substitution at position S651A.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the isolated modified VP 1 protein of the AAV5 capsid comprises the S2A and T71 1 S substitutions.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid includes substitutions S2A, S651 A, and T71 1 S.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid encoding the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 that is used for highly efficient transduction of target cells.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with the S651A amino acid substitution is represented by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified serotype 5 adeno-associated virus capsid protein (AAV5) with amino acid substitution S651 A.
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A and T71 1 S is represented by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated capsid virus serotype 5 protein virus serotype 5 (AAV5) with amino acid substitutions S2A and T71 1 S.
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, S651 A, and T71 1 S is represented by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified the capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with amino acid substitutions S2A, S651 A and T71 1 S.
  • the present invention provides an isolated capsid for highly efficient target cell transduction, which comprises the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1.
  • the isolated capsid comprises the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1, the AAV5 capsid VP2 protein or a modified variant thereof, and the AAV5 capsid VP3 protein or a modified variant thereof.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP2 protein.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP2 protein that has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains a T575S substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains the T575S substitution and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains the S515A and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains the S515A and T575S substitutions and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP3 protein.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP3 protein that has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1.
  • the isolated capsid comprises a modified protein
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that contains a T519S substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T519S substitution and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that contains the S459A and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains substitutions S459A and T519S and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid encoding the aforementioned capsid that is used for highly efficient transduction of target cells.
  • the present invention provides a recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow the expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the rAAVS-based vector comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a product. which is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the rAAV5-based vector comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a product. which is a therapeutic polypeptide, wherein the therapeutic polypeptide is a coagulation factor selected from the group consisting of factor VIII, factor IX, or a functional variant thereof.
  • the rAAV5-based vector comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a product. which is factor VIII or a functional variant thereof.
  • the rAAV5 vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a Factor IX product or a functional variant thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for delivering a gene product to a subject in need thereof, which comprises: a) the above rAAV5-based vector; and
  • the pharmaceutical composition is used to deliver a gene product to a person in need thereof.
  • the present invention relates to a method for delivering a gene product to a subject in need thereof, which comprises administering to the subject the above vector based on rAAV5 or the above pharmaceutical composition.
  • a gene product delivery method is used to deliver the gene product to a person in need thereof.
  • the present invention relates to the use of the above rAAV5-based vector or the above pharmaceutical composition for the treatment of a disease in a subject in need thereof.
  • the use is used to treat a disease in a person in need thereof.
  • the disease is selected from the group: blood diseases; diseases of the central nervous system; metabolic diseases; muscle diseases; hereditary diseases.
  • the disease is a blood disorder.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is factor IX or a functional variant thereof.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is factor VIII or a functional variant thereof.
  • the disease is a muscle disease.
  • the disease is an inherited disease.
  • the present invention relates to a method for producing the above rAAV5-based vector, which comprises transfecting producer cells with the above nucleic acid encoding the above capsid.
  • FIG. 1 Circuit diagram of the pAAV-linker plasmid designed for cloning libraries of random variants of the AAV capsid gene of the fifth serotype.
  • AmpR is a beta-lactamase gene that confers ampicillin resistance.
  • pUC origin- pUC origin of replication in bacteria
  • HBG Intron - human beta globine intron
  • FIG. 2 Ring diagram of plasmid pAAV-Rep, intended for the production of recombinant viral preparations of wild-type AAV of the fifth serotype from the library of random variants.
  • AmpR is a beta-lactamase gene that confers ampicillin resistance.
  • pUC origin- pUC origin of replication in bacteria
  • FIG. 3 Ring diagram of the plasmid pHelper, intended for the production of recombinant viral preparations of wild type AAV of the fifth serotype from the library of random variants.
  • Adeno E2A - a helper adenovirus gene sequence involved in viral DNA replication
  • Adeno E4 - a helper adenovirus gene sequence involved in viral DNA replication
  • Adeno VARNA is a helper adenovirus gene sequence responsible for stimulating translation of both early and late viral genes.
  • FIG. 4 Analysis of the efficiency of transduction of CHO-K1 -S cells with viral preparations based on AAV5-GFP, where the wild-type AAV5 capsid VP1 protein includes one or more amino acid substitutions.
  • FIG. 5 Analysis of the hFIX protein concentration in the medium collected from CHO-K 1 -S cells 7 days after transduction with viral preparations based on AAV5-hFIX. where the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid includes one or more amino acid substitutions.
  • FIG. 6 Position of the AAV5 capsid proteins in the genome.
  • isolated means modified or removed from the natural state.
  • a nucleic acid or peptide naturally present in an animal is not “isolated”, but the same nucleic acid or peptide, partially or completely separated from materials accompanying them in their natural state, are “isolated”.
  • the isolated nucleic acid or protein may exist in substantially purified form, or may exist in a non-natural environment such as, for example, a genetically modified cell.
  • Naturally occurring “native”, or “wild-type” are used to describe an object that can be found in nature as different from artificially obtained.
  • a protein or nucleotide sequence present in an organism that can be isolated from a naturally occurring source and which has not been intentionally modified by a person skilled in the art in a laboratory is naturally occurring.
  • genome refers to the complete genetic material of an organism.
  • peptide As used herein, the terms “peptide”, “polypeptide” and “protein” are used interchangeably and refer to a compound composed of amino acid residues covalently linked by peptide bonds.
  • the protein or peptide must contain at least two amino acids, and there is no limitation on the maximum number of amino acids that the protein or peptide sequence can contain.
  • Polypeptides include any peptide or protein containing two or more amino acids linked to each other by peptide bonds.
  • the term also refers to short chains, also commonly referred to in the art, for example, as peptides, oligopeptides and oligomers, and to longer chains, generally referred to in the art as many types of proteins.
  • Polypeptides include, but are not limited to, for example, biologically active fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, variant polypeptides, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins. Polypeptides include natural peptides, recombinant peptides, synthetic peptides, or a combination thereof.
  • transfection refers to any method or means by which nucleic acid is introduced into a cell or host organism and can be used interchangeably to convey the same meaning. Such methods include, but are not limited to, transfection, microinjection electroporation, infection, PEG fusion, and the like.
  • nucleic acid denotes a clear sequence of nucleotides, modified or not modified, defining a fragment or region of nucleic acid, whether or not containing unnatural nucleotides and which is either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or the products of transcription of said DNA.
  • nucleic acids are polynucleotides that can be hydrolyzed to monomeric "nucleotides". Monomeric nucleotides can be hydrolyzed to nucleosides.
  • polynucleotides include, but are not limited to, all nucleic acid sequences obtainable by any means available in the art, including, but not limited to, recombinant methods, i. E. cloning nucleic acid sequences from a recombinant library or the genome of a cell; using conventional cloning and PCR technology, and the like, and synthetic methods.
  • this invention does not relate to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, i.e. in a natural state.
  • the sequences of the present invention have been isolated and / or purified i.e. were taken directly or indirectly, for example by copying, and their environment was at least partially modified.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example, using host cells (host cells). or obtained by chemical synthesis.
  • nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is normally associated in a natural source of nuclease nucleic acid.
  • An isolated nucleic acid molecule differs from the form or set in which it naturally occurs. Thus, the isolated nucleic acid molecule differs from the nucleic acid molecule that exists naturally in cells.
  • an isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule found in cells in which the nuclease is normally expressed, for example, if the nucleic acid molecule has a different localization in the chromosome from its localization in cells in natural conditions.
  • nucleotide sequence encompasses its complement, unless otherwise indicated.
  • a nucleic acid having a specific sequence is to be understood as encompassing its complementary strand with its complementary sequence.
  • Adeno-associated virus (LA V) Viruses of the Parvoviridae family are small DNA-containing animal viruses.
  • the Parvoviridae family can be divided into two subfamilies: Parvovirinae, which infect vertebrates, and Densovirinae. whose representatives infect insects.
  • Parvovirinae which infect vertebrates
  • Densovirinae whose representatives infect insects.
  • 1 1 serotypes of adeno-associated virus have been described (Mori, S. ET AL., 2004, “Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein”, Virology, T. 330 (2): 375- 83). All known serotypes can infect cells of many types of tissues.
  • Tissue specificity is determined by the serotype of the capsid proteins; therefore, vectors based on the adeno-associated virus are constructed by setting the required serotype. Additional information on parvoviruses and other members of Parvoviridae is described in the literature (Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
  • the genomic organization of all known AAV serotypes is very similar.
  • the AAV genome is a linear, single-stranded DNA molecule. which is less than about 5000 nucleotides (nt) in length.
  • Inverted terminal repeats (GG R) flank the unique coding nucleotide sequences of replication of non-structural proteins (Rep) and structural proteins (Cap).
  • the Cap gene encodes the VP proteins (VP1, VP2 and VP3) that form the capsid.
  • the terminal 145 nucleotides are self-complementary and organized in such a way that an energetically stable intramolecular duplex can be formed, forming a T-shaped hairpin structure.
  • Such hairpin structures function as points of origin of viral DNA replication, being primers for the cellular DN-polymerase complex.
  • Rep genes eg, Rep78 and Rep52
  • both Rep proteins have a specific function in viral genome replication.
  • Splicing in the Rep open reading frame results in the expression of virtually four Rep proteins (eg Rep78, Rep68, Rep52 and Rep40).
  • Rep78, Rep68, Rep52 and Rep40 Rep proteins
  • Recombinant adeno-associated virus (rAA V) vector Recombinant adeno-associated virus (rAA V) vector
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked.
  • rAAV vector refers to a vector containing one or more polynucleotide sequences of interest, genes of interest, or “transgenes” that are flanked by parvovirus or inverted terminal repeat sequences (ITRs).
  • infectious unit refers to the number of infectious particles of the recombinant AAV vector as measured by infection center assay, also known as replication center assay, described , for example, McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62: 1963-1973.
  • heterologous when it refers to nucleic acid sequences, such as coding and regulation sequences, refers to sequences that are not usually linked together and / or are not usually associated with a particular cell.
  • a heterologous region of a nucleic acid or vector construct is a nucleic acid fragment located within or attached to another nucleic acid molecule that is not found in nature with another molecule.
  • a heterologous region of a nucleic acid construct may contain a coding sequence flanked by sequences that are not found in nature with the coding sequence.
  • Another example of a heterologous coding sequence is a construct where the coding sequence itself is not found in nature (eg, synthetic sequences that contain codons other than the native gene).
  • operably linked refers to the linking of polynucleotide (or polypeptide) elements into a functional link.
  • a nucleic acid is “operably linked” if it is in a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • a transcriptional regulatory sequence is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of said coding sequence.
  • operably linked means that the linked DNA sequences are generally contiguous and, if necessary, the joins of the two protein coding regions are also contiguous and in frame.
  • promoter or “regulatory transcription sequence” or “regulatory sequence” refers to a nucleic acid fragment that controls the transcription of one or more coding sequences, and which is located upstream of the reading direction of the information relative to the direction of transcription from the transcription initiation site of the coding sequence , and which is structurally identified by the presence of a binding site for DNA-dependent RNA polymerase.
  • transcription initiation sites and other DNA sequences including, but not limited to, transcription factor binding sites, repressor and protein activator binding sites, and any other nucleotide sequences known to those of skill in the art that directly or indirectly regulate the level of transcription with a given promoter.
  • a “constitutive” promoter is one that is active in most tissues under normal physiological and developmental conditions.
  • An “inducible” promoter is a promoter that undergoes physiological or developmental regulation, for example by exposure to a chemical inducer.
  • the “tissue specific” promoter is active only in specific types of tissues or cells.
  • Enhancer elements can refer to a DNA sequence that is located adjacent to a DNA sequence encoding a recombinant product.
  • Enhancer elements are usually located 5 'from the promoter element, or may be located below or within the coding DNA sequence (eg, DNA sequence transcribed or translated into a recombinant product or products).
  • the enhancer element can be located 100 bp, 200 bp, or 300 or more bp before or after the DNA sequence that encodes the recombinant product.
  • Enhancer elements can increase the amount of expressed recombinant product from the DNA sequence. exceeding the expression due to a single promoter element.
  • a variety of enhancer elements are available to those skilled in the art.
  • selectable marker gene refers to a gene that, when expressed, confers a selectable phenotype, such as antibiotic resistance, in a transformed cell.
  • expression is defined as the transcription and / or translation of a particular nucleotide sequence triggered by its promoter.
  • Gene therapy is the insertion of genes into cells and / or tissues of a subject to treat a disease, usually inherited diseases, with a defective mutant allele replaced or supplemented with a functional allele.
  • Treatment refers to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and / or at least one of its accompanying symptoms.
  • the term “alleviate” a disease, disease or condition means reducing the severity and / or frequency of the symptoms of a disease, disorder, or condition.
  • references herein to “treatment” include references to curative, palliative and prophylactic therapy.
  • the subject of treatment or patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the aforementioned subject can be male or female of any age.
  • disorder means any condition that can be improved by the treatment of the present invention.
  • the definition of this term includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that predispose a mammal to the occurrence of this disorder.
  • Disease is a state of animal health where the animal cannot maintain homeostasis and where, if the disease is not alleviated, the animal's health continues to deteriorate.
  • subject refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • patient refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • patient refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • patient refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • patient refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • patient refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • patient refers to any animal amenable to the methods described herein.
  • a “therapeutically effective amount” is an amount of a therapeutic agent administered during treatment that will relieve to some extent one or more symptoms of the disease being treated.
  • chromenic use refers to the continuous (prolonged) use of the agent (s) as opposed to the acute (short-term) route of administration, so as to maintain the initial therapeutic effect (activity) over an extended period of time.
  • Intermittent use means a treatment that is not administered sequentially without interruptions, but which is rather intermittent in nature.
  • Isolated modified protein VP1 of the capsid of adeno-associated virus serotype 5 (AA V5)
  • the present invention relates to an isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 for highly efficient target cell transduction, comprising the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP1 protein encoded by the Cap gene with one or more substitutions selected from groups:
  • amino acid substitution S2A is meant the substitution of Serine (Ser. S) at positions 2 of the VP1 protein of the capsid of the wild-type adeno-associated virus 5 with Alanine (Ala, A).
  • amino acid substitution S651 A is meant the replacement of Serine (Ser. S) at position 651 of the VP1 protein of the capsid of the wild-type 5 serotype adeno-associated virus to Alanine (Ala, A).
  • the amino acid substitution T71 1 S means the substitution of Threonine (Thr. T) at position 711 of the VP1 protein of the capsid of the wild-type adeno-associated virus 5 to Serina (Ser, S).
  • the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPK.PNQQHQDQARGLVLPGYNYEGPGN
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid comprises a single substitution at position S651A.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid comprises the S2A and T71 1S substitutions. In some embodiments, the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid has an amino acid sequence. submitted by
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid includes substitutions S2A, S651 A, and T71 1 S.
  • the isolated modified VP1 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by
  • the "right side" (+) - strand of genomic DNA of the adeno-associated virus contains overlapping sequences encoding three capsid proteins - VP1. VP2 and VP3. Transcription of these genes starts from a single promoter. p40. The molecular weights of the corresponding proteins are 87, 72 and 62 kDa, respectively. All three proteins are translated from one mRNA. After transcription, the pre-mRNA can be spliced in two different ways, in which case a longer or shorter intron is excised and mRNAs with a length of 2300 or 2600 nucleotides are formed.
  • the introduction of mutations into the C as gene will affect not only the VP 1 protein of the AAV5 capsid, but also VP2 and VP3 of the AAV5 capsid.
  • Figure 6 shows a schematic representation of the position of the AAV5 capsid proteins in the AAV genome:
  • the S651A amino acid substitution in VP1 will correspond to: the S515A amino acid substitution in VP2; amino acid substitution at position S459A in VP3.
  • the T71 1 S amino acid substitution will correspond to: the T575S amino acid substitution in VP2; amino acid substitution at position T519S in VP3.
  • the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP2 protein has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified VP2 protein of the AAV5 capsid comprises a T575S substitution.
  • the isolated modified VP2 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified VP2 protein of the AAV5 capsid includes the S515A and T575S substitutions.
  • the isolated modified VP2 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by TAPTG RIDDHFPKRK .
  • amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP3 protein has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified VP3 protein of the AAV5 capsid comprises a T519S substitution.
  • the isolated modified VP3 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified VP3 protein of the AAV5 capsid comprises S459A and T519S substitutions.
  • the isolated modified VP3 protein of the AAV5 capsid has the amino acid sequence represented by
  • the present invention provides an isolated capsid for highly efficient target cell transduction, which comprises the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated capsid comprises the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1.
  • amino acids are generally divided into four families: (1) acidic — aspartate and glutamate; (2) basic - lysine, arginine, histidine; (3) non-polar - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) uncharged polar - glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine.
  • Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids.
  • the prediction that an isolated substitution of leucine for isoleucine or valine aspartate for glutamate, threonine for serine, or a similar conservative substitution of an amino acid for a structurally related amino acid will not have an important effect on biological activity is well founded.
  • a polypeptide of interest can include up to about 5-10 conservative or non-conservative amino acid substitutions, or even up to about 15-25 or 50 conservative or non-conservative amino acid substitutions, or any number from 5 to 50, provided that the desired function the molecule remains unaffected.
  • the isolated capsid comprises the wild-type AAV5 capsid VP2 protein.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP2 protein that has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains a T575S substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains the T575S substitution and has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains the S515A and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP2 that contains the S515A and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 10.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP3 protein. In one embodiment, the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid VP3 protein that has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that contains a T519S substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that contains the T519S substitution and has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 12.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that contains the S459A and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid protein VP3 that contains substitutions S459A and T519S and has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 13.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid encoding the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 that is used for highly efficient transduction of target cells.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • isolated nucleic acid encoding the modified VP1 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with amino acid substitution S651 A a nucleic sequence represented ATGTCTTTTGTTGATC ACCCTCCAGATTGGTTGG AAGA AGTTGGTGA AGGTCTTC GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCGAACC TTTTGGCCTGGTTGAAGGGTGCT
  • CTTTAA SEQ ID NO: 5
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified VP1 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with amino acid substitutions S2A and T711S is meant a nucleic acid sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 6, since, given the degenerate! and genetic code, a wide variety of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 3. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same
  • an isolated nucleic acid encoding a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, S651A, and T71 1 S, which is represented by the nucleic sequence
  • another sequence coding for the corresponding amino acid sequence of the modified VP1 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with amino acid substitutions S2A, S651A and T711 S is meant a nucleic acid sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 7, TM genetic code, a wide variety of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 4. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encoding the adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid above VP1 of the wild type is represented by the nucleic sequence
  • AAV5 adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence coding for the corresponding amino acid sequence of the VP1 capsid protein of the adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) wild type is meant a nucleic sequence that is an alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 14. given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 1. Those skilled in the art are well aware of the preparation of such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid encoding the aforementioned modified VP2 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5).
  • AAV5 adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with the amino acid substitution T575S is represented by the nucleic sequence
  • ATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA SEQ ID NO: 15
  • another sequence coding for the corresponding amino acid sequence of the modified VP2 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with the amino acid substitution T575S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 15, since, given the degenerate TM of the genetic code, a wide range different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 9. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions S515A and T575S has any nucleic acid sequence that encodes the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 10 adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated nucleic acid encoding the adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid above VP2 of the wild type is represented by the nucleic sequence
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the VP2 protein of the capsid of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) wild type is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 16, since, given the degenerate TM of the genetic code, a wide range of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 8. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid encoding the aforementioned modified VP3 capsid protein of serotype 5 adeno-associated virus (AAV5).
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with the amino acid substitution T519S is represented by the nucleic sequence
  • AACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 17) or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified VP3 protein of the capsid of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with the amino acid substitution T519S.
  • another sequence coding for the corresponding amino acid sequence of the modified VP3 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) with the amino acid substitution T519S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 17, since given the degenerate TM of the genetic code, a wide range different DNA sequences can to encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 12. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encoding the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitutions S459A and T519S has any nucleic acid sequence that encodes the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 13. Those of skill in the art it is well known to prepare such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated nucleic acid encoding the adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid above VP3 of the wild type is represented by the nucleic sequence
  • another sequence coding for the corresponding amino acid sequence of the VP3 capsid protein of adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) wild type is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 18, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 1 1. Those skilled in the art are well aware of the preparation of such alternative DNA sequences. encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid encoding the aforementioned capsid that is used for highly efficient transduction of target cells.
  • the isolated nucleic acid encoding the above capsid includes any of the above nucleic acid sequences.
  • the present invention provides a recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that ensure the expression of the target product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the rAAV vector according to the invention does not contain the nucleotide sequences of genes encoding non-structural proteins (Rep) and structural proteins (Cap).
  • the rAAV5-based vector has a heterologous nucleic acid sequence expression product that is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the rAAV5 vector comprises a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is a therapeutic polypeptide, wherein the therapeutic polypeptide is a coagulation factor selected from the group consisting of factor VIII, factor IX, or a functional variant thereof.
  • the rAAV5 vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is factor VIII or a functional variant thereof.
  • the rAAV5 vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a Factor IX product or a functional variant thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for delivering a gene product to a subject in need thereof, which comprises: a) the aforementioned rAAV5-based vector; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition is used to deliver a gene product to a person in need thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an rAAV5 viral particle of the invention in a pharmaceutically acceptable carrier or other drug compounds, pharmaceutical agents, carriers, adjuvants, diluents, etc.
  • the injection vehicle is usually liquid.
  • the carrier for other routes of administration can be either solid or liquid, such as sterile pyrogen-free water or sterile pyrogen-free phosphate buffered saline.
  • the carrier is respirable and is preferably in solid or liquid particulate form.
  • water containing additives conventional for injection solutions such as stabilizing agents, salts or saline solutions and / or buffers.
  • the present invention is directed to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a cell in which the rAAV5 vector is integrated into the genome, in a pharmaceutically acceptable carrier or other drug compounds, pharmaceutical agents, carriers, adjuvants, diluents, etc.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising the aforementioned rAAV5-based vector according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients such as fillers, diluents, diluents, carriers, auxiliary , distributing, delivery devices, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, slow-release regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention and methods of making them will be undeniably obvious to those skilled in the art.
  • the manufacture of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practice) requirements.
  • the composition may include a buffering composition, tonic agents, stabilizers, and solubilizers.
  • “Pharmaceutically acceptable” means material that has no biological or other contraindications, for example, the material can be administered to a subject without any undesirable biological effects.
  • such pharmaceutical compositions can be used, for example, to transfect a cell ex vivo or to administer in vivo a viral particle or cell directly to a subject.
  • excipient or “excipient” is used herein to describe any component other than those previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin used in the production process, the manufacture of medicines to give them the necessary physical and chemical properties.
  • stabilizer an auxiliary substance or a mixture of two or more auxiliary substances that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • buffer means a solution capable of maintaining the pH value due to the interaction of acid and alkaline components that make up its composition, which enables the vector preparation based on rAAV5 to exhibit resistance to pH changes.
  • the pH of the pharmaceutical composition is preferably from 4.0 to 8.0.
  • buffering agents for example, acetate, phosphate citrate, histidine, succinate and the like can be used. buffer solutions, but not limited to them.
  • a pharmaceutical composition is "stable" if the active agent maintains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the stated shelf life at a storage temperature, for example, at 2-8 ° C. It is preferred that the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of a stability study during accelerated and natural storage.
  • the pharmaceutical composition of this invention can be manufactured, packaged or marketed as a unit dosage unit or a plurality of unit dosage units in a finished dosage form.
  • unit dosage means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of an active ingredient.
  • the amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient to be administered to the subject, or a convenient portion of such a dosage! for example, half or a third of that dosage.
  • the present invention relates to a method for delivering a gene product to a subject in need thereof, which comprises administering to the subject the above vector based on rAAV5 or the above pharmaceutical composition.
  • a gene product delivery method is used to deliver the gene product to a person in need thereof.
  • Any method of administering an rAAV5-based vector adopted in the art can be suitably used for the aforementioned rAAV5-based vector of the present invention.
  • Recombinant viral vectors based on rAAV5 are preferably introduced into the cell in a biologically effective amount.
  • a “biologically effective" amount of a viral vector is an amount that is sufficient to cause infection (or transduction) and expression of the heterologous nucleic acid sequence in a cell. If the virus is introduced into a cell in vivo (eg, the virus is administered to a subject as described below), a “biologically effective" amount of the viral vector is an amount sufficient to induce transduction and expression of the heterologous nucleic acid sequence in the target cell.
  • a cell for administering a viral vector based on rAAV5 of the invention can be any type of cell, including, but not limited to, nerve cells (including cells of the peripheral and central nervous system, in particular, brain cells), lung cells, epithelial cells (e.g., epithelial intestinal and respiratory tract cells), muscle cells, pancreatic cells (including islet cells), liver cells, myocardial cells, bone cells (such as bone marrow stem cells), hematopoietic stem cells, spleen cells, keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells, prostate cells, sex cells and the like.
  • the cell for introducing the rAAV5 viral vector can be any precursor cell.
  • the cells can be stem cells (e.g., nerve stem cells, liver stem cells).
  • cells can be of any species as indicated above.
  • the present invention relates to the use of the above rAAV5-based vector or the above pharmaceutical composition for the treatment of a disease in a subject in need thereof.
  • the use is used to treat a disease in a person in need thereof.
  • Administration of the rAAV5 vector of the present invention to a human or animal subject in need thereof can be accomplished by any method known in the art for the administration of viral vectors.
  • routes of administration include topical, oral, rectal, transmucosal, transdermal, inhalation, parenteral (e.g., intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and intraarticular) and the like, as well as injection directly into tissue or organ, and, alternatively, intrathecal, direct intramuscular, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, intranasal, or intraocular injections.
  • injectable preparations can be prepared in conventional dosage forms: in the form of liquid solutions or suspensions, solid forms suitable for the preparation of solutions or suspensions in a liquid before injection, or in the form of emulsions.
  • the rAAV5-based vector may be administered locally rather than systemically, for example, as a depot or in a sustained release formulation.
  • the disease is selected from the group: blood diseases; diseases of the central nervous system; metabolic diseases; muscle diseases; hereditary diseases.
  • the disease is a blood disorder.
  • the disease is a muscle disease. In some applications, the disease is an inherited disease.
  • a subject nucleotide sequence that is delivered by an rAAV5 vector to the liver of a subject can be performed by any method known in the art, including, but not limited to, intravenous administration, intraportal administration, intrabiliary administration, intraarterial administration, and direct injection into the liver parenchyma.
  • cells eg, liver cells
  • these cells express the encoded peptide or protein and release it into the circulatory system in a therapeutically effective amount (as described below).
  • delivery and expression of the vector occurs in another cell or tissue, including, but not limited to, the brain, pancreas, spleen, or muscle.
  • terapéuticaally effective amount is meant an amount that is sufficient to alleviate (eg, alleviate, diminish, reduce) at least one of the symptoms associated with the pathological condition.
  • a “therapeutically effective” amount is an amount that is sufficient to provide some improvement in the subject's condition.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is factor IX or a functional variant thereof.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is factor VIII or a functional variant thereof.
  • the rAAV5 vector of the invention is administered intramuscularly, more preferably by intramuscular injection or topical application (as described above).
  • the parvovirus particles of the present invention are administered to the lungs.
  • the rAAV5 vector disclosed in the invention can be administered to the lungs of a subject using any suitable means, but administration in the form of an aerosol suspension of respirable particles consisting of an rAAV5 parvovirus vector of the invention that is inhaled by a subject.
  • Inhaled particles can be liquid or solid.
  • Aerosols from liquid particles containing the rAAV5 parvovirus vectors of the invention can be made by any suitable means, for example, in the form of a pressurized aerosol inhaler or an ultrasonic nebulizer, which are known to those skilled in the art. It is also possible to make particulate aerosols containing the rAAV5 viral vectors of the invention with any generator of solid medicinal aerosol particles using techniques known in the pharmaceutical field.
  • Dosages of the rAAV5-based parvovirus particles of the invention will depend on the route of administration, disease or condition to be treated from the condition of the subject, the particular viral vector and gene delivered, and may be determined by routine methods. Exemplary doses for achieving a therapeutic effect are viral titers of at least about 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 , 10 10 , 10 ", 10 12 , 10 13 , 10 14 , 10 ' ⁇ 1 O 16 transducing units or more, preferably about 10 x to 10 13 transducing units, even more preferably 10 12 transducing units.
  • rAAV5 parvovirus vectors, reagents and methods of the present invention can be used to direct nucleic acid to dividing or non-dividing cells and to stably express heterologous nucleic acid in those cells.
  • this vector system it became possible to introduce genes into cells in vivo that encode proteins that affect the physiology of cells.
  • the vectors of the present invention may be useful in gene therapy for pathological conditions.
  • the present invention can be used to deliver any foreign nucleic acid with a biological effect to treat or ameliorate symptoms associated with any gene expression disorder.
  • pathological conditions include, but are not limited to, cystic fibrosis (and other lung diseases), hemophilia A, hemophilia B, thalassemia, anemia, and other bleeding disorders, AIDS, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, and others.
  • diabetes mellitus muscular dystrophies (for example, Duchenne, Becker), Gaucher's disease, Hurler's disease; adenosine deaminase deficiency, glycogen storage diseases and other metabolic defects, diseases of solid organs (for example, brain, liver, kidney, heart) and the like.
  • muscular dystrophies for example, Duchenne, Becker
  • Gaucher's disease Hurler's disease
  • adenosine deaminase deficiency glycogen storage diseases and other metabolic defects
  • diseases of solid organs for example, brain, liver, kidney, heart
  • Gene transfer has significant potential for understanding and developing treatments for pathological conditions.
  • pathological conditions There are a number of hereditary diseases for which defective genes have been studied and cloned. In some cases, the function of these cloned genes is known.
  • the pathological conditions mentioned above are divided into two classes: deficiency states, usually enzyme deficiencies, which are usually inherited in a recessive manner, and conditions of imbalance, sometimes involving at least regulatory or structural proteins, which are inherited in a dominant manner.
  • deficient diseases gene transfer can be used to introduce a normal gene into affected tissues for replacement therapy.
  • pathological conditions of imbalance gene transfer can be used to create a pathological condition in a simulated system, which can then be used to develop measures against this pathological condition.
  • the methods of the present invention make it possible to treat genetic diseases.
  • the pathological condition is treated by partially or completely eliminating the defect or imbalance that causes the disease or aggravates its severity. It is also possible to use site-specific integration of nucleic acid sequences to trigger mutations or to correct defects.
  • the present invention relates to a method for producing the aforementioned rAAV5-based vector, which comprises transfecting producer cells with the aforementioned nucleic acid comprising a capsid coding sequence comprising the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the aforementioned nucleic acid which contains a sequence encoding the aforementioned modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid VP1 protein, AAV5 capsid VP2 protein or a modified version thereof, and AAV5 capsid VP3 protein or a modified version thereof.
  • modified variants of the wild-type AAV5 capsid VP2 protein and the AAV5 capsid VP3 protein are meant the wild-type AAV5 capsid VP2 protein and the AAV5 capsid VP3 protein that include one or more amino acid substitutions.
  • amino acids are generally divided into four families: (1) acidic — aspartate and glutamate; (2) basic - lysine, arginine, histidine; (3) non-polar - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) uncharged polar - glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine.
  • Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids.
  • the prediction that an isolated substitution of leucine for isoleucine or valine, aspartate for glutamate, threonine for serine, or a similar conservative substitution of an amino acid for a structurally related amino acid will not have an important effect on biological activity is well-founded.
  • a polypeptide of interest can include up to about 5-10 conservative or non-conservative amino acid substitutions, or even up to about 15-25 or 50 conservative or non-conservative amino acid substitutions, or any number from 5 to 50, provided that the desired function the molecule remains unaffected.
  • the above nucleic acid which contains the sequence encoding the above modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid VP1 protein, wild type AAV5 capsid VP2 protein and wild type AAV5 capsid VP3 protein.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the required gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments ranging in length from 300 to 4000 bp, which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through the indicated restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • DNA and protein sequence analysis and sequence data processing Infomax's Vector NTI Advance suite, version 8.0, and SnapGene Viewer were used to create, map, analyze, annotate and illustrate sequences.
  • AAV5 capsid variants were obtained by random mutagenesis of the Cap gene sequence (Davidsson M. et al., 2016). Briefly, the wild-type sequence of the serotype 5 Cap gene (GenBank ID AF085716.1) was assembled de novo, after which the synthesized wild-type AAV5 capsid gene was fragmented using uracil-DNA glycosylase, the resulting fragments were assembled into the full-length Cap gene using DNA polymerase , which does not have corrective activity (as a result, random mutations appeared in the sequence). The full-length mutant variants were cloned into the carrier plasmid pAAV-linker (Fig. 1) at the AscI / EcoRI restriction sites in a common reading frame with green fluorescent protein (GFP), producing a diverse random library of AAV5 capsids, which was then used to select capsid variants with increased transducing activity.
  • GFP green fluorescent protein
  • Capsid variants containing the S651 A mutation in VP 1 AAV5 were also selected. These capsid variants were cloned into vectors for the generation of viral particles and were subsequently used for visualization and comparison of transduction profiles relative to wild-type AAV5.
  • Example 2 Development and subsequent selection of recombinant viral particles from the resulting library of sequences
  • plasmids For the production and subsequent selection of recombinant viral particles from the obtained sequence library, a series of plasmids was developed: a carrier plasmid, a plasmid containing the Rep gene sequence, and a construct containing adenoviral genes necessary for the replication of viral particles.
  • the carrier plasmid pAAV-linker (Fig. 1), intended for cloning libraries of random variants of the AAV capsid gene of the fifth serotype into one reading frame with the reporter protein, was obtained by replacing the sequence of the modified green fluorescent protein in the original pAAV-GFP Control plasmid ( VPK-402) from CellBiolab (USA), using the restriction enzyme ligase method of cloning at the Hindll / EcoRI sites, on the T2A-GFP sequence synthesized de novo with the addition of EcoRI restriction sites from the 5'-end and Hindlll from the 3'-end.
  • Plasmid pAAV-Rep containing the sequence of the Rep gene (Fig. 2.). was obtained by de novo cloning of the synthesized sequence of the Rep AAV gene of the second serotype (GenBank ID AF043303.1) at the Pcil / Psil restriction sites (New England Biolabs, USA) followed by processing with T4 DNA Polymerase (New England Biolabs, USA) to obtain “blunt Ends into the pGem-T Easy plasmid (Promega, USA), also treated with Pcil / Psil restriction enzymes (New England Biolabs, USA).
  • adenoviral genes for the production of recombinant viral particles, we used the pHelper construct (Fig. 3) from the commercial AAV-2 Packaging System kit (VPK-402) from CellBiolab (USA), containing AmpR, a beta-lactamase gene that provides ampicillin resistance , Ori is the origin of replication in bacteria, Adeno E2A is the helper adenovirus gene sequence involved in viral DNA replication, Adeno E4 is the helper adenovirus gene sequence involved in viral DNA replication, Adeno VARNA is the helper adenovirus gene sequence, which is responsible for early stimulation of translation and late viral genes Example 3. A method of obtaining vectors based on a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV)
  • a plasmid containing the nucleotide sequences of adenovirus encoding proteins and RNA required for the assembly of rAAV particles (helper plasmid);
  • VP2 can have any of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 9, or 10;
  • a VP3 can have any of the amino acid sequences of SEQ ID No: 1 I. 12 or 13;
  • This set of genes provides the assembly of rAAV viral particles and encapsulation of the target genome in them within 72 hours. 72 hours after transfection, the producer cells are lysed to release rAAV particles and purified by successive filtration and chromatography steps. The titer of the purified rAAV particles is verified by enzyme immunoassay and quantitative PCR.
  • Example 4 Increasing the efficiency of cell transduction with drugs based on rAAV5 in the presence of S2A, S651A, T711S mutations in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid.
  • CHO-K.1 -S cells were seeded into the wells of 12-well plates. Sowing was carried out in the growth medium: DMEM / E12 with glutamine, glucose content 4.5 g / l, 5% cattle serum. The cell planting density was 10,000 cells / cm2. When staging the transduction, the cells prepared in advance were transduced at an MOI of 100,000 vg / lung. All samples were supplied in triplicates. Intact cells were used for negative control.
  • the inventors have surprisingly found that the presence of one or more mutations selected from the group S2A, S651 A or T71 1 S in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid resulted in a significant increase in the efficiency of transgene delivery by rAAV vectors with the above mutations.
  • the number of cells expressing GFP increased 2.2 times from 22.54% to 49.45% compared to the control AAV5 with the wild-type capsid VP1 protein (AAV5-NulIMut- GFP).
  • Example 5 Increase in the production of the target protein encoded by the transgene after cell transduction with preparations based on rAAV5 in the presence of S2A, S651A, T711S mutations in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid.
  • CF10-K 1 -S cells were seeded into the wells of 12-well plates. Sowing was carried out in the growth medium: DMEMD 12 with glutamine, glucose content 4.5 g / l, 5% bovine serum. The cell planting density was 10,000 cells / cm2. When staging transduction, pre-prepared cells were transduced at an MOI of 100,000 vg / cell. All samples were supplied in triplicates. Intact cells were used for negative control.
  • the inventors have surprisingly found that the presence of one or more mutations selected from the group: S2A, S651 A, T71 1 S in the VP 1 protein of the wild-type AAV5 capsid resulted in a significant increase in hFIX protein production after transduction of CHO-K1- S vectors based on rAAV with the above mutations.
  • the enzyme-linked immunosorbent assay revealed an increase in the amount of hFIX protein in the culture medium 7 days after transduction of CHO-K1-S cells with preparations based on rAAV with the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid or the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid, carrying one or more mutations selected from the group: S2A, S651A, T71 1 S (Fig. 5.).
  • the amount of protein produced increased 4.6 times from 0.17 ng / ml to 0.74 ng / ml compared to the control AAV5 with the wild-type capsid VP1 protein (AAV5-NullMut -GFP).
  • the amount of produced protein increased by 7.1 times from 0.17 ng / ml to 1.24 ng / ml compared to the control AAV5 with the VP1 wild-type capsid protein ( AAV5-NullMut-GFP).
  • the amount of produced protein increased 3.3-fold from 0.17 ng / ml to 0.57 ng / ml compared to the control AAV5 with VP 1 capsid protein wild type (AAV5-NullMut-GFP) '.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, а также к капсиду и вектору на его основе.

Description

ВЫДЕЛЕННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БЕЛОК УР! КАПСИДА AAV5
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, а также к капсиду и вектору на его основе.
УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой (20 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащих в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1 , VP2 и VP3). Белки VP1 , VP2 и VP3 находятся в соотношении 1 :1 :10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno- associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:10405-10410). При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ИКП, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Рекомбинантный AAV считается самым безопасным и одним из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Векторы могут инфицировать клетки из тканей множества типов, обеспечивая мощную и устойчивую трансгенную экспрессию. Они также являются непатогенными и имеют низкий профиль иммуногенности (High КА et а!.. «rAAV human trial experience» Methods Mol Biol. 201 1 ; 807:429-57).
Одной из насущных целей исследований в области разработки эффективной генотерапии является оптимизация векторов для максимальной тканевой трансдукции при минимизации дозы вектора.
Известно, что различные серотипы AAV характеризуются сродством к различным рецепторам на поверхности клеток-хозяев. к которым они обладают тропизмом. Так основным известным рецептором для AAV2 является гепарансульфат- протеогликан, корецепторами выступают интегриновый гетеродимер а\ 5, рецептор фактора роста фибробластов первого типа и рецептор фактора роста гепатоцитов, с- Met. AAV12 связывается с гепарансульфат-протеогликанами и сиаловой кислотой. AAV4 и AAV5 связываются с N- и О-связанными сиаловыми кислотами соответственно. AAV5 задействует рецептор фактора роста тромбоцитов. При этом установлена связь между аминокислотной последовательностью белков капсида AAV с процессом его сборки, инкапсидирования генома и сродством к различным типам рецепторов, репрезентированных на поверхности клеток-хозяев (Govindasamy L. et. al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 2013 Oct;87(20): l 1 187- 99).
В международной заявке WO 2012145601 описаны вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальной клетки когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа.
В международной заявке WO 2013158879 описан вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей капсидный белок VP 1 , который содержит одну или несколько замен лизина, где одна замена лизина представляет K137R, где упомянутая замена лизина является эффективной для ингибирования убиквитинирования упомянутого капсидного белка, и тем самым увеличивается трансдукция упомянутого вектора AAV в клетке-мишени.
На данный момент существует потребность в AAV с улучшенной трансдуцирующей способностью, которые включают в своей структуре различные трансгены, в том числе клинически важные трансгены, для нуждающихся в этом пациентов. Улучшение тканевой трансдукции позволяет минимизировать дозы вводимого субъекту вектора.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
S651A,
S2A и Т71 1 S или
S2A, S651A и T711 S, приводит к повышению эффективности трансдукции клеток-мишеней с помощью вектора на основе AAV серотипа 5 с данной(ыми) модификацией(ями) и существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, содержащему аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одой или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
S651A,
S2A и Т71 1 S,
S2A, S651A и T71 1S.
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает одну замену в положении S651A.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP 1 капсида AAV5 включает замены S2A и Т71 1 S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, S651 А и Т71 1 S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A, представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 5 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующу ю аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651 А.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T71 1 S, представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 6 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и Т71 1 S.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок капсида VP1 аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651 A и T71 1 S, представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 7 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651 A и Т71 1 S. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, который включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенный капсид включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 1.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок
VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5). В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т519S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и Т519S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный капсид, который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты который включает:
1) вышеуказанный капсид, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAVS содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт. который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт. который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта. В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетеролог ичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт. который представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит: a) вышеуказанный вектор на основе rAAV5; и
B) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
В некоторых вариантах способ доставки генного продукта используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах применение используется для лечения заболевания у нуждающегося в этом человека.
В некоторых вариантах применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание крови. В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание мышц.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой наследственное заболевание.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного вектора на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток- продуцентов вышеуказанной нуклеиновой кислотой, кодирующей вышеуказанный капсид.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Кольцевая схема плазмиды pAAV-linker, предназначенной для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа.
AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. pUC origin- pUC ориджин репликации в бактериях,
ITR - инвертированные терминальные повторы,
CMV-Promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса,
Poly А - последовательность сигнала полиаденилирования, для повышения стабильности мРНК,
HBG Intron - (human beta globine intron), фрагмент гена b глобина человека, несущий интрон,
GFP- ген зелёного флуоресцентного белка,
Т2А - 2А расщепляющийся пептид, позволяет осуществлять коэкспрессию целевою и репортерного белков. Фиг. 2. Кольцевая схема плазмиды pAAV-Rep, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. pUC origin- pUC ориджин репликации в бактериях,
Rep genes - последовательность гена Rep, кодирующая белки репликации AAV.
Фиг. 3. Кольцевая схема плазмиды pHelper, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину,
Ori- ориджин репликации в бактериях,
Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса, отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Фиг. 4. Анализ эффективности трансдукции клеток CHO-K1 -S вирусными препаратами на основе AAV5-GFP, где белок VP1 капсида AAV5 дикого типа, включает одну или несколько аминокислотных замен.
Фиг. 5. Анализ концентрации белка hFIX в среде, собранной с клеток CHO-K 1 -S спустя 7 дней после трансдукции вирусными препаратами на основе AAV5-hFIX. где белок VP1 капсида AAV5 дикого типа, включает одну или несколько аминокислотных замен.
Фиг. 6. Положение белков капсида AAV5 в геноме.
2087-4258 п.н - VP1
2495-4258 п.н - VP2
2663-4258 п.н - VP3 Описание изобретения
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
«Выделенный» означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в животном, не являются «выделенными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии являются «выделенными». Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать, по существу, в очищенной форме или могут существовать в неприродном окружении, таком как, например, генетически модифицированной клетке.
Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Термин «геном» относится к полному генетическому материалу организма.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеющий», · «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Белок (Пептид)
В настоящем описании, термины «пептид», «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не существует ограничений по максимальному количеству аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится и к коротким цепям, также общепринято обозначаемым в этой области, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки множество типов которых существует. «Полипептиды» включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитные белки. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.
Термины «трасформация», «трансфекция», «трансдукция» относятся к любому способу или средствам, с помощью которых нуклеиновая кислота вводится в клетку или организм-хозяин, и могут быть использованы взаимозаменяемо для передачи аналогичного значения. Такие способы включают в себя без ограничения трансфекцию, электропорацию микроинъекции, инфицирование, ПЭГ-сплавление и тому подобное.
Молекулы нуклеиновых кислот
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид» «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК. Специалист в этой области имеет общие знания о том, что нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, которые можно гидролизовать до мономерных «нуклеотидов». Мономерные нуклеотиды можно гидролизовать в нуклеозиды. Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев). или полученные путем химического синтеза.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты нуклеазы. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия нуклеазы, например в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.
Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.
Аденоассоциированный вирус (ЛА V) Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-содержашие вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных, и Densovirinae. представители которого инфицируют насекомых. К 2006 году были описаны 1 1 серотипов аденоассоциированного вируса (Mori, S. ЕТ AL., 2004, «Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein», Virology, T. 330 (2): 375-83). Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированого вируса конструируют, задавая необходимый серотип. Дополнительная информация по парвовирусам и другим представителям Parvoviridae описана в литературе (Kenneth I. Berns, «Parvoviridae: The Viruses and Their Replication», Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК. которая содержит менее чем примерно 5000 нуклеотидов (нт) в длину. Инвертированные концевые повторы ( ГГ R ) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности репликации неструктурных белков (Rep) и структурных белков (Сар). Ген Сар кодирует белки VP (VP1 . VP2 и VP3), которые образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть сформирован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпилечную структуру. Такие шпилечные структуры функционируют как точки начала репликации ДНК вируса, являясь праймерами для клеточного ДН -полимеразного комплекса. После инфекции клеток млекопитающих AAV дикого типа (wtAAV) гены Rep (например, Rep78 и Rep52) экспрессируются с помощью Р5 промотора и Р19 промотора соответственно, и оба белка Rep выполняют определенную функцию в репликации генома вируса. Сплайсинг в открытой рамке считывания Rep (Rep ORF) приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (например. Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep78 и Rep52. является достаточной для продукции вектора AAV в клетках млекопитающих.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAA V)
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту с которой она соединена. Фраза «рекомбинантный вектор AAV» (или «вектор rAAV») в контексте настоящего описания относится к вектору, содержащему одну или несколько интересующих полинуклеотидных последовательностей, интересующих генов или «трансгенов» которые фланкированы парвовирусными или инвертированными концевыми повторяющимися последовательностями (ITR).
Термины «инфекционная единица» (ие), «инфекционная частица» или «репликационная единица», как используется в отношении вирусного титра, относятся к числу инфекционных частиц рекомбинантного вектора AAV, которое измеряют посредством анализа инфекционных центров, также известного как анализ репликационных центров, описанный, например, в публикации McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62: 1963-1973.
Термин «гетерологичный», когда он относится к последовательностям нуклеиновых кислот, таким как кодирующие последовательности и последовательности регуляции, обозначает последовательности, которые обычно не соединены вместе и/или обычно не связаны с конкретной клеткой. Таким образом, «гетерологичная» область конструкции нуклеиновой кислоты или вектора представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты расположенный внутри или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты которая в природе не найдена совместно с другой молекулой. Например, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты может содержать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, которые в природе не найдены совместно с кодирующей последовательностью. Другой пример гетерологичной кодирующей последовательности представляет собой конструкцию, где сама кодирующая последовательность не найдена в природе (например, синтетические последовательности, которые содержат кодоны, отличные от нативного гена).
В контексте настоящего описания термин «функционально связанный» относится к связи полинуклеотидных (или полипептидных) элементов в функциональную связь. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в условиях функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например регуляторная последовательность транскрипции функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию указанной кодирующей последовательности. Термин «функционально связанный» означает, что связанные последовательности ДНК являются, как правило, непрерывными, и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белок, являются также непрерывными и находятся в рамке считывания. В контексте настоящего описания термин «промотор» или «регуляторная последовательность транскрипции» или «регуляторная последовательность» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который контролирует транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, и который расположен против направления считывания информации относительно направления транскрипции от сайта инициации транскрипции кодирующей последовательности, а также который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы. сайтов инициации транскрипции и других последовательностей ДНК. включающих без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания репрессора и активатора белка, а также любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалистам в данной области, которые непосредственно или опосредованно регулируют уровень транскрипции с данным промотором. «Конститутивный» промотор представляет собой такой промотор, который активен в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который подвергается физиологической регуляции или регуляции в ходе развития например, при воздействии химического индуктора. «Тканеспецифичный» промо гор активен только в конкретных типах тканей или клеток.
Термины «энхансеры» или «энхансер», используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК. превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.
Термин «селектируемый маркерный ген» относится к гену, который при экспрессии придает трансформированной клетке селектируемый фенотип, например, устойчивость к антибиотикам. Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательнос ти запускаемую ее промотором.
Применение для лечения
«Генная терапия» представляет собой вставку генов в клетки и/или тканей субъекта для лечения заболевания, обычно, наследственных заболеваний, при этом дефектный мутантный аллель заменяется или дополняется функциональным аллелем.
«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, термин «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения.
«Заболевание» является состоянием здоровья животного, где животное не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают то здоровье животного продолжает ухудшаться.
Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, поддающимуся воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. «Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.
Понятие «хроническое» применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента(ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.
«Прерывистое» применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.
Подробное описание изобретения
Выделенной модифицированной белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (АА V5)
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, содержащий аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одой или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
S651A,
S2A и T71 1 S,
S2A, S651A и T71 1 S.
Под аминокислотной заменой S2A подразумевается замена Серина (Ser. S) в положений 2 белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа дикого типа на Аланин (Ala, А).
Под аминокислотной заменой S651 A подразумевается замена Серина (Ser. S) в положении 651 белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа дикого типа на Аланин (Ala, А).
Под аминокислотной заменой T71 1 S подразумевается замена Треонина (Thr. Т) в положении 711 белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа дикого типа на Серина (Ser, S).
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPK.PNQQHQDQARGLVLPGYNYEGPGN
GLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGN
LGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAE
AGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTW
MGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFM
SHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTD
DDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPS
KMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFN
KNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNR ELEGASYQV
PPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNML1TSESETQPVNRV
AYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPI WAKIPETGA
HFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWE
LKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTR YLTRPL (SEQ ID
NO: 1).
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает одну замену в положении S651A.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGN GLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGN LGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAE AGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTW MGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNA AYFGYSTPWGYFDFNRFH SHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTD , DDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPS KMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFN KNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQV PPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNML1TSESETQPVNRV A YNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPI WAKIPETGA HFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEMEW ELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 2).
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A и Т71 1S. В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность. представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYN YEGPG NGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGG NLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDA EAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDST WMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRF HSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFT DDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFP SKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQF NKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTN MELKCASYQ VPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNR VAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETG AHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEME WELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, S651 А и Т71 1 S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPG NGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLK.YNHADAEFQEKLADDTSFGG NLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDA EAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDST WMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRF HSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFT DDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFP SKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQF NKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQ VPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIF SQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNR VAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGP1WAKIPETG AHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEME WELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 4). Выделенные модифицированные белки VP2 и VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (АА V5)
«Правая часть» (+)-цепи геномной ДНК аденоассоциированного вируса содержит перекрывающиеся последовательности, кодирующие три белка капсида — VP1. VP2 и VP3. Транскрипция этих генов начинается с одного промотора. р40. Молекулярная масса соответствующих белков составляет 87, 72 и 62 кДа, соответственно. Все три белка транслируются с одной мРНК. После транскрипции пре-мРНК может подвергаться сплайсингу двумя разными способами, при этом вырезается более длинный или более короткий интрон и образуются мРНК длиной 2300 или 2600 нуклеотидов.
Таким образом, введение мутаций в ген С as будет влиять не только на белок VP 1 капсида AAV5, но и на VP2 и VP3 капсида AAV5.
На фигуре 6 приведено схематичное изображение положения белков капсида AAV5 в геноме AAV:
2087-4258 п.н - VP1
2495-4258 п.н - VP2
2663-4258 п.н - VP3.
Из вышеизложенного следует, что мутация аналогичная мутации S2A в VP 1 будет отсутствовать в VP2 и VP3, а, в свою очередь, мутации аналогичные мутациям S65 I А и/или Т71 1 S в VP1 будет присутствовать и в VP2, и в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена S651A в VP1 будет соответствовать: аминокислотной замене в положении S515A в VP2; аминокислотной замене в положении S459A в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена Т71 1 S будет соответствовать: аминокислотной замене в положении T575S в VP2; аминокислотной замене в положении T519S в VP3.
Заявитель также считает целесообразным указать окружение найденных мутаций путем указания краткой аминокислотной последовательности, включающей данные мутации в VP1/VP2/VP3:
Для S2A в VP1 (отсутствует в VP2 и VP3) - MLS VDHP;
Для S651A в VP1 (S515А в VP2/ S459A в VP3) - TSFSDVP;
Для Т711S в VP1 (T575S в VP2/ T519S в VP3) - EYR7TRP. В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP2 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGA DTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTR TWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFR PRSLRVK.IFNIQVK.EVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAF PPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFH SSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALE NTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYN VGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYN DPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 8)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 включает замену T575S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGA DTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFR PRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAF PPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGN FEFTYNFEEVPFH SSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALE NTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVW ERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPA GGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYN DPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 9)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 включает замены S515A и T575S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную TAPTG RIDDHFPKRK.K.ARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIP AQPASSLGA DTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLfNNYWGFR PRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNG TEGCLPAF PPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFFl SSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYK.N WFPGPM GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALH NTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGNITSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNY NDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 10)
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP3 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTR TWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRS LRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVF TLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQ NLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNL GSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMWNLQGSNTYALENT IFNSQPAN PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGS VWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLK.HPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDV PVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTT RPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 1 1 )
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 включает замену Т519S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS YNNHQYRE1KSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWG FRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCFP AFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVP FHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKN WFPGP MGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYAL ENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQY GNN YN DPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 12)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 включает замены S459A и T519S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSH WSPRDWQRLINNY WG FRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLP AFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVP FHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGP MGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGAS YQVPPQPNGMTNNLQGSNTYAL ENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSS П АР ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAFIFHPSPAMGGFGLKI IPPPMM LIKNTPVPGNITSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPE1QYTNNY NDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 13)
Капсид
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, который включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из вариантов выделенный капсид включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5). белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
Особенно предпочтительные варианты включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые объединены по их боковым цепям. В частности аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин аспартата на глутамат, треонина на серин или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет важного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или даже вплоть до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое число от 5 до 50 при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа. В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 1.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т519S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и Т519S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.
Выделенная нуклеиновая кислота
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651 A, представлена нуклеиновой последовательностью ATGTCTTTTGTTGATC ACCCTCCAGATTGGTTGG AAGA AGTTGGTGA AGGTCTTC GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGG АТАСА
CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAA ГССС
AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG
CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA
TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAG TCCACCCG
AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGA TCAAAAGCGG
CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG
GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA
CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCA
ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA
ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT
CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACG
CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAA TCCCACC
GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG
GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGC T
TCGCTCCCAGTCAGAACCTGTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGl ACTT
GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACC Г
GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCA FGGGCCG
AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT
CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA
GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA
CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT
CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGT
GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGC
CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGA Г ,
GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG
GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG
CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCgCGG
ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG
AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC
CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC
ACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC
CTTTAA (SEQ ID NO: 5) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой
S651A. Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP 1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S 651 А » подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 5, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 2. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T71 1 S, которая представлена нуклеиновой последовательностью
ATGGCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTC
GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC
ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG
AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA
GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACC ГСАА
GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT
CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC
TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGAT AGA
CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC
CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC
AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG
CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA
TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG
AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG
CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG
GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA
CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATC Г ГСА
ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA
ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGC AGGTCTTTACG CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACC GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGC I TCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAG ГАСТ Г GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAG TTCAACAAGAACCT GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACC I CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGG TGAACCGCG ! GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGC CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGC ГТС FCGG ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCG 1 GG AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC CTTTAA (SEQ ID NO: 6) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и Т71 1 S.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 6, так как с учетом вырожденное ! и генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 3. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же
28
< аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и Т71 1 S, которая представлена нуклеиновой последовательностью
ATGGCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTC
GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC
ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG
AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA
GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACC ГСАА
GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT
CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC
TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGA TAGA
CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC
CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC
AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGG TGGCGG
CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA
TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG
AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG
CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG
GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA
CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATC П СА
ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA ’
ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT
CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTC ГТТАСХ)
CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACC
GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG
GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCT
TCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTT
GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCT
GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG
AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCC AGTGTCAGCGCCTT
CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCC TGGAGAA CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGT GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGC TCCACCAC I GC CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCgCGG ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC , CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCTATCGGAACCCGATACC I I ACCCGACCC CTTTAA (SEQ ID NO: 7) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711 S.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711 S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 7, так как с учетом вырожденное™ генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 4. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательнос i ей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа, представлена нуклеиновой последовательностью
ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTC I ТС GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA
GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT
CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTC T CGAACC
TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGA I AGA
CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCC ГТС
CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC
AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG
CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA
TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG
AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG
CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG -
GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA
CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCA
ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA
ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACG T
CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCn TACG
CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAA ГСССАСС
GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG
GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCT
TCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTAC TT
GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCT
GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG
AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT
CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA
GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA
CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT
CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCG I
GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCAC TGC
CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT
GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG
GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG
CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGG
ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG
AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC
CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTG TGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC CTTTAA (SEQ ID NO: 14) или любой другой последовательностью кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP 1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа» подразумевается нуклеиновая последовательност ь, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 14. гак как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательност ь, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 1. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота кодирующая модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T575S, представлена нуклеиновой последовательностью
ACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGACGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGC Г
CGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCC
AGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCT
GATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCC
GATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGG
GACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAAC
CACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCC
TACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCC
ACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGAC
CCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGC
AGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCC AAGTGTTTAC
GGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCC I
GCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTG
AACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAG TACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACT
TTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCT
GGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACT
GGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAA'
AACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGG
GTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAG
GGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAG
GGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCG
AACCCGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAG
AGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCC
ACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAG
GAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCC
ATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATG
GGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCC 1
GTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCC
AGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAA
AACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCC
CAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCT
ATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 15) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T575S.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 15, так как с учетом вырожденное™ генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 9. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S515A и T575S имеет любую нуклеиновую последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 10. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа, представлена нуклеиновой последовательностью
ACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGACGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGC Г CGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCC AGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCAGCCTCAAG TTTGGGAGCT , GATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGG I GCC GATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGG GACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAAC CACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCC TACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCC ACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGC I TCAGAC CCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGC AGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTG T T ГАС GGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCC I GCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTG AACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAG TACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACT TTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCT GGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACT GGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCT АСААА AACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGG GTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAG GGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAG GGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCG AACCCGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAG AGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCC ACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAG GAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCC ATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCC ATG GGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCT GTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCC AGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAA AACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCC CAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCT ATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 16) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 16, так как с учетом вырожденное™ генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 8. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Т акие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T519S, представлена нуклеиновой последовательностью
ATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGA
GTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGA
GTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAG
TACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTAC Г Г Г
GGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGA GCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGG Г
CCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGAC Г
CCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGA
CGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGC
CTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGC
GACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTT
CCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAG
GAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCA
ACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCG
GAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACT
GGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCA
ACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCG
CGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCA
GCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACC
CGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCG
AGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCA
ACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAA
TCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCT
GGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCG
GATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCC
CGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCA TCACCCAGTAC
AGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTC
CAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTT'
TGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCTATCGG
AACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 17) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т519S.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 17, так как с учетом вырожденное™ генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 12. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S459A и T519S имеет любую нуклеиновую последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 13. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа, представлена нуклеиновой последовательностью
ATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGA GTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGA GTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAG TACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCC ГАСТТ Г GGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGA GCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGT CCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACT , CCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAG TGTTTACGGACGA CGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGC CTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGC GACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTT CCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAG GAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCA ACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAAT AACACTGGCG GAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTAC АААААСТ GGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGC T CCGGGG ГСА ACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCG CGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCA GCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACC CGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCG AGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCA ACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAA TCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCA ГСТ GGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCG GATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTG TGCC CGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCC AGTAC AGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAAC TC CAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTT TGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGG AACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 18) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа ( AAV5) дикого типа.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 18, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 1 1. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей. кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный капсид, который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный капсид, включает любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAA V5) В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты который включает:
1) вышеуказанный капсид, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию целевою продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
Вектор rAAV по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих неструктурные белки (Rep) и структурные белки (Сар).
Характеристика капсида подробно описана в вышеуказанном разделе описания.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 имеет продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетеролог ичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляе† собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
Фармацевтическая композиция
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит: а) вышеуказанный вектор на основе rAAV5; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу на основе rAAV5 по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или в других лекарственных соединениях, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть или твердым, или жидким, таким как стерильная апирогенная вода или стерильный апирогенный фосфатно-солевой буферный раствор. Для введения путем ингаляции носитель является вдыхаемым и предпочтительно находится в твердой или жидкой дисперсной форме. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или солевые растворы и/или буферы.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку, в которой вектор на основе rAAV5 интегрирован в геном, в фармацевтически приемлемом носителе или других лекарственных соединениях, фармацевтических агентах носителях, адъювантах, разбавителях и т.д.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный вектор на основе rAAV5, согласно изобретению и, по крайней мере один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. «Фармацевтически приемлемым» считается материал, который не имеет биологических или других противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансфекции клетки ех vivo или для введения in vivo вирусной частицы или клетки непосредственно субъекту.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату вектора на основе rAAV5, проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности прй ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активною ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки! например, половине или трети такой дозировки.
Способ доставки генного продукта
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
В некоторых вариантах способ доставки генного продукта используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
Любой способ введения вектора на основе rAAV5, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для вышеуказанного вектора на основе rAAV5, по данному изобретению.
Рекомбинантные вирусные векторы на основе rAAV5 предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. «Биологически эффективное» количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать инфекцию (или трансдукцию) и экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если вирус вводят в клетку in vivo (например, вирус вводят субъекту, как описано ниже), «биологически эффективное» количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию и экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени.
Клетка для введения вирусного вектора на основе rAAV5 по изобретению может быть клеткой любого типа, включая в себя без ограничения нервные клетки (включающие в себя клетки периферической и центральной нервной системы в частности, клетки головного мозга), легочные клетки, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки кишечника и дыхательных путей), мышечный клетки, клетки поджелудочной железы (в том числе островковые клетки), печеночные клетки, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, половые клетки и тому подобное. Альтернативно, клетка для введения вирусного вектора на основе rAAV5 может быть любой клеткой-предшесгвенником. В качестве дополнительной альтернативы, клетки могут представлять собой стволовые клетки (например, нервные стволовые клетки, стволовые клетки печени). Кроме того, клетки могут происходить от любых видов, как указано выше.
Применение
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах применение используется для лечения заболевания у нуждающегося в этом человека.
Введение вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению субъекту- человеку или животному, нуждающемуся в этом, можно проводить любым известным в данной области способом для введения вирусных векторов.
Примеры способов введения включают в себя местное применение, пероральное, ректальное, чрезслизистое, трансдермальное, ингаляционное, парентеральное введение (например, внутривенное, подкожное внутрикожное, внутримышечное и внутрисуставное) и т.п., а также инъекции непосредственно в ткань или в орган и, альтернативно, интратекальные, непосредственно внутримышечные, внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вектор на основе rAAV5 локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание крови.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание мышц. В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой наследственное заболевание.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемая нуклеотидная последовательность, которая доставляется вектором на основе rAAV5 в печень субъекта. Введение в печень можно осуществлять любым способом, известным в данной области и включающим в себя без ограничения внутривенное введение, внутрипортальное введение, интрабилиарное введение, внутриартериальное введение и непосредственную инъекцию в паренхиму печени.
Предпочтительно клетки (например, клетки печени) инфицируются вектором на основе rAAV5, кодирующим пептид или белок, эти клетки экспрессируют кодированный пептид или белок и выделяют его в кровеносную систему в терапевтически эффективном количестве (как описано ниже). Альтернативно, доставка и экспрессия вектора происходит в другой клетке или ткани, включающей в себя без ограничения головной мозг, поджелудочную железу, селезенку или мышцы.
Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается количество, которое достаточно для облегчения (например, для смягчения, уменьшения, снижения) по меньшей мере одного из симптомов, связанных с патологическим состоянием. Другими словами, «терапевтически эффективное» количество представляет собой количество, которое достаточно для обеспечения некоторого улучшения состояния субъекта.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или ею функциональный вариант.
В других предпочтительных вариантах осуществления вектор на основе rAAV5 по изобретению вводят внутримышечно, более предпочтительно, путем внутримышечной инъекции или путем местного применения (как описано выше). В других предпочтительных вариантах осуществления парвовирусные частицы по настоящему изобретению вводят в легкие.
Вектор на основе rAAV5, раскрытый в изобретении, можно вводить в легкие субъекта с помощью любых подходящих способов, но предпочтительным является введение в форме аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, состоящих из парвовирусного вектора на основе rAAV5 по изобретению, который вдыхается субъектом. Вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли из жидких частиц, содержащих парвовирусные векторы на основе rAAV5 по изобретению, можно делать любыми подходящими способами, например, в виде аэрозольного ингалятора под давлением или ультразвукового распылителя, которые известны специалистам в данной области техники. Также можно делать аэрозоли твердых частиц, содержащие вирусные векторы на основе rAAV5 по изобретению с любым генератором твердых лекарственных аэрозольных частиц с помощью известных в фармацевтической области технологий.
Дозировки парвовирусных частиц на основе rAAV5 по изобретению будут зависеть от способа введения, заболевания или состояния, подлежащего лечению от состояния субъекта, конкретного вирусного вектора и доставляемого гена, и их можно определять рутинными способами. Примерными дозами для достижения терапевтического эффекта являются вирусные титры, составляющие по меньшей мере примерно 105, 106, 107, 108, 109, Ю10, 10", 1012, 1013, 1014, Ю'\ 1 О16 трансдуцирующих единиц или больше, предпочтительно приблизительно от 10х до 1013 трансдуцирующих единиц, еще более предпочтительно 1012 трансдуцирующих единиц.
Таким образом, парвовирусные векторы на основе rAAV5, реагенты и способы по настоящему изобретению можно использовать для направления нуклеиновой кислоты в делящиеся или неделящиеся клетки и для стабильной экспрессии в этих клетках гетерологичной нуклеиновой кислоты. С использованием этой векторной системы стало возможно вводить в клетки в условиях in vivo гены, которые кодируют белки, влияющие на физиологию клеток. Таким образом, векторы по настоящему изобретению могут быть полезными в генной терапии при патологических состояниях.
Настоящее изобретение можно использовать для доставки любой чужеродной нуклеиновой кислоты с биологическим эффектом для лечения или ослабления симптомов, связанных с каким-либо расстройством, обусловленным генной экспрессией. Примеры патологических состояний включают в себя без ограничения кистозный фиброз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемии и другие нарушения свертываемости крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гоше, болезнь Херлера; дефицит аденозиндеаминазы, болезни накопления гликогена и другие метаболические дефекты, заболевания солидных органов (например, мозга печени почек сердца) и тому подобное.
Перенос генов обладает значительным потенциалом применения для понимания и создания способов лечения патологических состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых были изучены и клонированы дефектные гены. В некоторых случаях известна функция этих клонированных генов. В целом, упомянутые выше патологические состояния делятся на два класса: дефицитные состояния, как правило, дефицит ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и состояния нарушения баланса, иногда с вовлечением по меньшей мере регуляторных или структурных белков, которые наследуются доминантным образом. При дефицитных заболеваниях можно использовать перенос генов, чтобы внести нормальный ген в пораженные ткани для заместительной терапии. При патологических состояниях нарушения баланса перенос генов можно использовать для создания патологического состояния в смоделированной сис теме, которую затем можно использовать для разработки мер против этого патологического состояния. Таким образом, способы по настоящему изобретению позволяют лечить генетические заболевания. Согласно изобретению, патологическое состояние лечится путем частичного или полного устранения дефекта или дисбаланса, который вызывает заболевание или усугубляет степень его тяжести. Также возможно использование сайт- специфичной интеграции нуклеиновых последовательностей для запуска мутаций ил исправления дефектов.
Способ получения вектора на основе AA V5
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного вектора на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток- продуцентов вышеуказанной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую капсид, включающий модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах способа получения вектора на основе rAAV5 используется вышеуказанная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант. Под модифицированными вариантами белка VP2 капсида AAV5 дикого типа и белка VP3 капсида AAV5 подразумеваются варианты белка VP2 капсида AAV5 дикого типа и белка VP3 капсида AAV5, которые включают одну или несколько аминокислотных замен.
Особенно предпочтительные варианты включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые объединены по их боковым цепям. В частности аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин глутамин, цистеин, серин треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет важного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или даже вплоть до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое число от 5 до 50 при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.
В некоторых вариантах способа получения вектора на основе rAAV5 используется вышеуказанная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 дикого типа и белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
Модифицированные варианты белков VP2 и VP3 капсида AAV5. а также нуклеиновые кислоты их кодирующие, подробно описаны в соответствующих разделах описания. Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариан тов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру. »
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях Применяли пакет программ Infomax's Vector NTI Advance suite, версия 8.0 и SnapGene Viewer для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Пример 1. Получение библиотек вариантов капсидов AAV5
Получение библиотек вариантов капсидов AAV5 производили методом случайного мутагенеза последовательности гена Cap (Davidsson М. et al., 2016). Вкратце, последовательность дикого типа гена Сар пятого серотипа (GenBank ID AF085716.1 ) была собрана de novo, после чего синтезированный геном капсида AAV5 дикого типа фрагментировали с использованием урацил-ДНК-гликозилазы, полученные фрагменты собирали в полноразмерный ген Сар с помощью ДНК-полимеразы, не обладающей корректирующей активностью (в результате в последовательности возникали случайные мутации). Полноразмерные мутантные варианты клонировали в плазмиду-носитель pAAV- linker (Фиг.1.) по сайтам рестрикции AscI/EcoRI в общую рамку считывания с зеленым флуоресцентным белком (GFP), продуцируя многообразную случайную библиотеку капсидов AAV5, которую затем использовали для отбора вариантов капсидов с повышенной трансдуцирующей активностью.
Положительный отбор вирусных частиц с повышенной трансдуцирующей активностью проводили in vitro на клетках линии CHO-K1 -S. При этом для трансдукции использовали частицы, очищенные с помощью УЦФ в градиенте йодиксанола. Спустя 48 часов клетки собирали и выделяли геномную ДНК для последующей амплификации последовательностей геномов вирусов, способных к эффективной трансдукции. Полученные последовательности затем переклонировали и повторно нарабатывали для последующих итераций отбора с целью обогащения библиотеки вариантами с наибольшей эффективностью трансдукции. После 5 раундов отбора капсидные гены 30 клонов просеквенировали для определения наиболее успешных мутаций и их сочетаний. По результатам секвенирования преобладающими сочетаниями мутаций оказались S2A. Т71 1 S в VP1 AAV5 и варианты капсидов содержащие S2A, Т71 I S, S651A в VP1 AAV5 - порядка 20% клонов. Также были отобраны варианты капсидов, содержащие мутацию S651 А в VP 1 AAV5. Данные варианты капсидов клонировали в вектора для наработки вирусных част иц и в дальнейшем использовали для визуализации и сравнения профилей трансдукции относительно AAV5 дикого типа. Пример 2. Наработки и последующий отбор рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей
Для наработки и последующего отбора рекомбинантных вирусных час тиц из полученной библиотеки последовательностей была разработана серия плазмид: плазмида- носитель, плазмида, содержащая последовательность гена Rep, а также конструкция, содержащая аденовирусные гены, необходимые для репликации вирусных частиц.
Плазмида-носитель pAAV-linker (Фиг. 1.), предназначенная для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа в одну рамку считывания с репортерным белком, была получена путем замены последовательности модифицированного зеленого флуоресцентного белка в исходной конструкции pAAV-GFP Control plasmid (VPK-402) от CellBiolab (США), с помощью рестриктазно-лигазного метода клонирования по сайтам Hindlll/EcoRI, на последовательность T2A-GFP, синтезированную de novo с добавлением сайтов рестрикции EcoRI с 5’-конца и Hindlll с З'-конца.
Плазмида pAAV-Rep, содержащая последовательность гена Rep (Фиг.2.). была получена путем клонирования de novo синтезированной последовательности гена Rep AAV второго серотипа (GenBank ID AF043303.1) по сайтам рестрикции Pcil/Psil (New England Biolabs, США) с последующей обработкой Т4 DNA Polymerase (New England Biolabs, США) для получения «тупых» концов, в плазмиду pGem-T Easy (Promega, США) так же обработанную рестриктазами Pcil/Psil (New England Biolabs, США).
В качестве источника аденовирусных генов для наработки рекомбинантных вирусных частиц была использована конструкция pHelper (Фиг.З) из коммерческого набора AAV-2 Packaging System (VPK-402) от CellBiolab (США), содержащая AmpR - ген бета- лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Ori- ориджин репликации в бактериях, Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов Пример 3. Способ получения векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки- продуценты трансфецировали одновременно 3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса 2 серотипа, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5, 6 или 7 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотными последовательностями SEQ ID No: 2, 3 или 4 и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No:8, 9 или 10; a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 1 I . 12 или 13;
3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки-продуценты подвергают лизису с высвобождением частиц rAAV и очищают последовательными стадиями фильтрации и хроматографии. Титр очищенных частицы rAAV проверяют с помощью иммуноферментного анализа и количественной ПЦР.
Пример 4. Увеличение эффективности трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, S651A, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии CHO-K.1 -S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМ/Е12 с глутамином, содержание глюкозы 4.5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10 000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 100 000 вг/клегка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ эффективности трансдукции проводили с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte и программного обеспечения GuavaSoft.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы S2A, S651 A или T71 1 S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, приводило к существенному увеличению эффектиновности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, при помощи метода проточной цитометрии удалось выявить изменение количества GFP позитивных клеток спустя 48 часов после трансдукции линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа или белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: S2A. S651A, T71 1 S (Фиг.4.).
При наличии мутации S651A (AAV5-01 Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,2 раза с 22,54% до 49,45% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NulIMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A и Т71 I S (AAV5-02Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2.6 раза с 22.54% до 58.51 % по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S651A и T71 1 S (AAV5-03Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1 ,7 раз с 22,54% до 38,27% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut- GFP).
Пример 5. Увеличение продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, S651A, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии CF10-K 1 -S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМД 12 с глутамином, содержание глюкозы 4,5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10 000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 100000 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ количества белка FIX в культуральной жидкости 7 дней спустя после трансдукции оценивался при помощи набора ИФА Human Factor IX ELISA Kit. Использованное разведение образцов - 1 :25. Процедура была проведена согласно инструкции производителя.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы: S2A, S651 А, Т71 1 S в белке VP 1 капсида AAV5 дикого типа, приводило к существенному увеличению продукции белка hFIX после трансдукции клеток линии CHO-K1-S векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, метод иммуноферментного анализа (ИФА) позволил выявить повышение количества белка hFIX в среде культивирования спустя 7 дней после трансдукции клеток линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа или белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: S2A, S651A, Т71 1 S (Фиг.5.).
При наличии мутации S651A (AAV5-01 Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 4,6 раза с 0,17 нг/мл до 0,74 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A и Т71 I S (AAV5-02Mut-GFP) количество продуцируемого белка увеличивалось в 7,1 раза с 0,17 нг/мл до 1 ,24 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S651A и T71 1S (AAV5-03Mut-GFP) количество продуцируемого белка увеличивалось в 3,3 раза с 0,17 нг/мл до 0,57 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP 1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP)’.

Claims

Формула изобретения
1. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней содержащий аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одой или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
S651A,
S2A и Т71 1 S,
S2A, S651A и T711 S.
2. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1. где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 .
3. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1. который включает одну замену в положении S651 A.
4. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 3. который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.
5. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1. который включает замены S2A и Т71 1 S.
6. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по гг 5, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
7. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.1 , который включает замены S2A, S651 А и Т71 1 S.
8. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 7. который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
9. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP 1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) по любому из пгг 1 -8. который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
10. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 9, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 5 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
1 1. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 9, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и Т71 1 S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 6 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
12. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 9, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T71 1 S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 7 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
13. Выделенный капсид для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) по любому из пп. 1 -8.
14. Выделенный капсид по п. 13, который включает модифицированный белок VP 1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) по любому из пп. 1 -8. белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
15. Выделенный капсид по п. 14, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикою типа.
16. Выделенный капсид по п. 15, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
17. Выделенный капсид по п. 14, который включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
18. Выделенный капсид по п. 17, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S.
19. Выделенный капсид по п. 18, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.
20. Выделенный капсид по п. 18, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S.
21. Выделенный капсид по п. 20, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.
22. Выделенный капсид по п. 14, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
23. Выделенный капсид по п. 22, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SF3Q ID NO: 1 1.
24. Выделенный капсид по п. 14, который включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
25. Выделенный капсид по п. 24, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т519S.
26. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
27. Выделенный капсид по п. 24, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и Т519S.
28. Выделенный капсид по п. 27, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.
29. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая капсид по любому из пп. 13- 28, который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
30. Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) капсид по любому из пп. 13-28, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
31. Вектор на основе rAAV5 по п. 30, где продукт экспрессии гетеролог ичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
32. Вектор на основе rAAV5 по п. 31, где терапевтический полипептиД представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
33. Вектор на основе rAAV5 по п. 32, где терапевтический пептид представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
34. Вектор на основе rAAV5 по п. 32, где терапевтический пептид представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
35. Фармацевтическая композиция для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, содержащая: a) вектор на основе rAAV5 по любому из пп. 30-34; и
B) фармацевтически приемлемый эксципиент.
36. Фармацевтическая композиция по п. 35, где субъект представляет собой человека.
37. Способ доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 30-34 или фармацевтической композиции по п. 35.
38. Способ доставки генного продукта по п. 37, где субъект представляет собой человека.
39. Применение вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 30-34 или фармацевтической композиции по п. 35 для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
40. Применение по п. 39, где субъект представляет собой человека.
41. Применение по п. 39, где заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
42. Применение по п. 41 , где заболевание представляет собой заболевание крови.
43. Применение по п. 42, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
44. Применение по п. 42, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
45. Применение по п. 41 , где заболевание представляет собой заболевание мышц.
46. Применение по п. 41 , где заболевание представляет собой наследственное заболевание.
47. Способ получения вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 30-34. который включает трансфекцию клеток-продуцентов нуклеиновой кислотой по п. 29.
PCT/RU2020/000445 2019-08-22 2020-08-21 Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 Ceased WO2021034222A1 (ru)

Priority Applications (18)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202080074154.9A CN114981444B (zh) 2019-08-22 2020-08-21 Aav5的分离的修饰的vp1衣壳蛋白
MYPI2022000990A MY209964A (en) 2019-08-22 2020-08-21 Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
MX2022002184A MX2022002184A (es) 2019-08-22 2020-08-21 Proteina vp1 modificada aislada de la capside del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), capside y vector basado en la misma.
CA3148964A CA3148964A1 (en) 2019-08-22 2020-08-21 Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
JP2022512768A JP2022545121A (ja) 2019-08-22 2020-08-21 Ａａｖ５の単離修飾ｖｐ１カプシドタンパク質
PE2022000294A PE20221254A1 (es) 2019-08-22 2020-08-21 Proteina vp1 modificada aislada de la capside del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), capside y vector basado en la misma
PH1/2022/550434A PH12022550434A1 (en) 2019-08-22 2020-08-21 Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
BR112022003389A BR112022003389A2 (pt) 2019-08-22 2020-08-21 Proteína vp1 modificada isolada do capsídeo do sorotipo 5 do vírus adeno-associado (aav5), ácido nucleico isolado, capsídeo isolado, vetor baseado em raav5 e seu uso, composição farmacêutica, método para entrega de produto gênico
MA56142A MA56142B1 (fr) 2019-08-22 2020-08-21 Protéine modifiée séparée vp1 de capside de aav5
AU2020331882A AU2020331882B2 (en) 2019-08-22 2020-08-21 Isolated modified VP1 capsid protein of AAV5
KR1020227009552A KR20220158674A (ko) 2019-08-22 2020-08-21 Aav5의 단리 및 변형된 vp1 캡시드 단백질
EP20855760.3A EP4019642A4 (en) 2019-08-22 2020-08-21 Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
US17/637,099 US20220306696A1 (en) 2019-08-22 2020-08-21 Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
CONC2022/0001833A CO2022001833A2 (es) 2019-08-22 2022-02-21 Proteína vp1 modificada aislada de la cápside del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), cápside y vector basado en la misma.
ZA2022/02242A ZA202202242B (en) 2019-08-22 2022-02-22 Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
IL290802A IL290802A (en) 2019-08-22 2022-02-22 Isolated and adapted capsid protein vp1 of the aav5 virus
JOP/2022/0043A JOP20220043A1 (ar) 2019-08-22 2022-02-22 بروتين كابسيد vp1 معدل معزول من aav5
JP2025130198A JP2025178242A (ja) 2019-08-22 2025-08-04 Ａａｖ５の単離修飾ｖｐ１カプシドタンパク質

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019126509 2019-08-22
RU2019126509A RU2751592C2 (ru) 2019-08-22 2019-08-22 Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2021034222A1 true WO2021034222A1 (ru) 2021-02-25
WO2021034222A9 WO2021034222A9 (ru) 2021-04-22

Family

ID=74660332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/000445 Ceased WO2021034222A1 (ru) 2019-08-22 2020-08-21 Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5

Country Status (21)

Country Link
US (1) US20220306696A1 (ru)
EP (1) EP4019642A4 (ru)
JP (2) JP2022545121A (ru)
KR (1) KR20220158674A (ru)
CN (1) CN114981444B (ru)
AR (1) AR119869A1 (ru)
BR (1) BR112022003389A2 (ru)
CA (1) CA3148964A1 (ru)
CO (1) CO2022001833A2 (ru)
EC (1) ECSP22021725A (ru)
IL (1) IL290802A (ru)
JO (1) JOP20220043A1 (ru)
MA (1) MA56142B1 (ru)
MX (1) MX2022002184A (ru)
MY (1) MY209964A (ru)
PE (1) PE20221254A1 (ru)
PH (1) PH12022550434A1 (ru)
RU (1) RU2751592C2 (ru)
TW (1) TW202120690A (ru)
WO (1) WO2021034222A1 (ru)
ZA (1) ZA202202242B (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113121654A (zh) * 2021-04-19 2021-07-16 信念医药科技(上海)有限公司 新型腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的新型腺相关病毒载体
US12552838B2 (en) 2020-04-20 2026-02-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
EP4389880A4 (en) * 2021-08-20 2026-04-08 Biocad Joint Stock Co PROCESS FOR PRODUCING MODIFIED ADENE-ASSOCIATED VIRUS CAPSID

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3947700A4 (en) 2019-04-01 2023-01-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
BR112023006305A2 (pt) 2020-10-09 2023-05-09 Tenaya Therapeutics Inc Métodos e composições de terapia gênica com placofilina-2
TW202246505A (zh) * 2021-03-05 2022-12-01 俄羅斯聯邦商亞那拜恩有限公司 編碼凝血因子ｉｘ蛋白的密碼子優化的核酸及其用途
AR126839A1 (es) * 2021-08-20 2023-11-22 Llc «Anabion» Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 9 (aav9), cápside y vector basado en esta
AR126840A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Llc «Anabion» Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), cápside y vector basado en esta
WO2025040185A1 (zh) * 2023-11-29 2025-02-27 广州译码基因科技有限公司 可提高aav病毒神经靶向性的衣壳蛋白突变体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070238684A1 (en) * 1998-06-19 2007-10-11 Medigene Aktiengesellschaft AAV scleroprotein, production and use thereof
WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013158879A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
US20150023924A1 (en) * 2013-07-22 2015-01-22 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
US20160201088A1 (en) * 2001-12-17 2016-07-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10081659B2 (en) * 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
ES2865487T3 (es) * 2015-09-28 2021-10-15 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y composiciones para vectores virales que evaden los anticuerpos
WO2017201121A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav for gene therapy in lungs
EP3947700A4 (en) * 2019-04-01 2023-01-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
RU2761879C1 (ru) * 2021-07-27 2021-12-13 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070238684A1 (en) * 1998-06-19 2007-10-11 Medigene Aktiengesellschaft AAV scleroprotein, production and use thereof
US20160201088A1 (en) * 2001-12-17 2016-07-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013158879A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
US20150023924A1 (en) * 2013-07-22 2015-01-22 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOVINDASAMY L.: "Structural insights into adeno-associated virus serotype 5", J VIROL, vol. 87, no. 20, October 2013 (2013-10-01), pages 11187 - 99, XP055865805, DOI: 10.1128/JVI.00867-13
HIGH KA ET AL.: "rAAV human trial experience", METHODS MOL BIOL, vol. 807, 2011, pages 429 - 57
KENNETH I. BERNS: "Fields Virology", 1996, article "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication"
MCLAUGHLIN ET AL., J. VIROL., vol. 62, 1988, pages 1963 - 1973
MORI, S. ET AL.: "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein", VIROLOGY, T, vol. 330, no. 2, 2004, pages 375 - 83, XP004676906, DOI: 10.1016/j.virol.2004.10.012
SAMBROOK J ET AL.: "Molecular cloning: A laboratory manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP4019642A4
XIE Q. ET AL.: "The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 99, 2002, pages 10405 - 10410, XP002255705, DOI: 10.1073/pnas.162250899

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12552838B2 (en) 2020-04-20 2026-02-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
CN113121654A (zh) * 2021-04-19 2021-07-16 信念医药科技(上海)有限公司 新型腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的新型腺相关病毒载体
CN113121654B (zh) * 2021-04-19 2023-11-17 信念医药科技(上海)有限公司 腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的腺相关病毒载体
EP4389880A4 (en) * 2021-08-20 2026-04-08 Biocad Joint Stock Co PROCESS FOR PRODUCING MODIFIED ADENE-ASSOCIATED VIRUS CAPSID

Also Published As

Publication number Publication date
RU2751592C2 (ru) 2021-07-15
TW202120690A (zh) 2021-06-01
AU2020331882A1 (en) 2022-11-03
CA3148964A1 (en) 2021-02-25
US20220306696A1 (en) 2022-09-29
ZA202202242B (en) 2026-03-25
IL290802A (en) 2022-04-01
MA56142A1 (fr) 2023-05-31
JOP20220043A1 (ar) 2022-02-22
BR112022003389A2 (pt) 2022-05-17
MA56142B1 (fr) 2023-09-27
WO2021034222A9 (ru) 2021-04-22
RU2019126509A (ru) 2021-06-04
CN114981444A (zh) 2022-08-30
RU2019126509A3 (ru) 2021-06-04
MY209964A (en) 2025-08-15
EP4019642A4 (en) 2023-09-06
JP2025178242A (ja) 2025-12-05
AR119869A1 (es) 2022-01-19
PE20221254A1 (es) 2022-08-16
ECSP22021725A (es) 2022-08-31
PH12022550434A1 (en) 2024-02-19
CO2022001833A2 (es) 2022-08-09
KR20220158674A (ko) 2022-12-01
JP2022545121A (ja) 2022-10-25
MX2022002184A (es) 2022-05-24
CN114981444B (zh) 2025-05-27
EP4019642A1 (en) 2022-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2751592C2 (ru) Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
TWI893130B (zh) 編碼ｓｍｎ１蛋白的密碼子優化核酸及其用途
JP2023504735A (ja) ヒトｍｅｃｐ２遺伝子を発現するように設計されたトランスジーンカセット
US20240350663A1 (en) Isolated modified aav9 capsid protein vp1
RU2825667C2 (ru) Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 9 серотипа (AAV9), капсид и вектор на его основе
RU2820088C1 (ru) Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
EP4389759A1 (en) Isolated modified aav5 capsid protein vp1
EA045824B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5
EA048714B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида аденоассоциированного вируса 9 серотипа (aav9), капсид и вектор на его основе
AU2020331882B2 (en) Isolated modified VP1 capsid protein of AAV5
RU2856244C2 (ru) Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2
EA048149B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (aav5), капсид и вектор на его основе
HK40075924A (en) Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
HK40075924B (zh) Aav5的分离的修饰的vp1衣壳蛋白
HK40111900A (zh) 分离的修饰的aav9衣壳蛋白vp1
HK40109737A (zh) 分离的修饰的aav5衣壳蛋白vp1
EA045749B1 (ru) Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1, и ее применение
OA21075A (en) Codon-optimized nucleic acid that encodes SMN1 protein, and use thereof
EA050137B1 (ru) ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ AAV5 ПРОТИВ SARS-CoV-2
JP2021527418A (ja) ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス生成物および方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20855760

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: NC2022/0001833

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022512768

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

Ref document number: 3148964

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022003389

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DZP2022000181

Country of ref document: DZ

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020855760

Country of ref document: EP

Effective date: 20220322

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022003389

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20220222

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: NC2022/0001833

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020331882

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20200821

Kind code of ref document: A

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 522431726

Country of ref document: SA

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 202080074154.9

Country of ref document: CN