WO2021045292A1 - Crm197 단백질 발현 방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a signal sequence for expressing and secreting the CRM197 protein into the periplasm in E. coli and its use, more specifically, a signal sequence for expression of a CRM197 protein, a nucleic acid encoding the signal sequence, and the nucleic acid And a nucleic acid construct or expression vector comprising a CRM197 protein gene, a recombinant microorganism into which the nucleic acid construct or expression vector has been introduced, and culturing the recombinant microorganism.
  • Diphtheria toxin is a proteinaceous exotoxin synthesized and secreted from a pathogenic strain of Corynebacterium diphtheriae. Diphtheria toxin is an ADP-ribosylating enzyme, which is secreted as a 535 residue proenzyme and separated into two fragments (A and B) by treatment with a trypsin-like protease. Fragment A is a catalytically active site and is a NAD-dependent ADP-ribosyltransferase that specifically targets the protein synthesis factor EF-2, thereby inactivating EF-2 and promoting protein synthesis within the cell. Stop it.
  • CRM197 was discovered through the separation of various non-toxic forms of diphtheria toxin and immunologically cross-reactive forms of partial toxicity (CRM or cross-reacting substances) (Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973).
  • the CRM can be of any size and composition including all or part of the DT.
  • CRM197 is an enzymatically highly inactive and non-toxic form of diphtheria toxin with one amino acid substitution G52E. This mutation imparts inherent flexibility to the active-site loop located in front of the NAD-binding site, thereby lowering the binding of CRM197 to NAD and eliminating the toxicity of DT (Malito et al., Proc Natl Acad Sci USA 109 ( 14):5229-342012).
  • CRM197 like DT, has two disulfide bonds. One disulfide bond connects Cys186 to Cys201 and connects fragment A to fragment B. The second disulfide bond connects Cys461 with Cys471 in fragment B.
  • DT and CRM197 have nuclease activity due to fragment A (Bruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2995-8, 1990).
  • CRM197 is commonly used as a carrier protein in protein-carbohydrate conjugation and hapten-protein conjugation.
  • CRM197 has several advantages over other toxoid proteins as well as diphtheria toxoid (Shinefield Vaccine, 28:4335, 2010).
  • DT diphtheria toxin
  • DT can be produced by chemical detoxification following purification of toxins from cultures of Corynebacterium diphtheria, or by purification of recombinants or genetically detoxified analogs of toxins. Can be.
  • periplasm of E. coli is an oxidizing environment that allows the formation of disulfide bonds. , Can help the production of a properly folded protein, iii) the periplasm of E. coli contains less protease than the cytoplasm to help avoid proteolytic cleavage of the expressed protein, and iv) the periplasm is also less protein To allow a higher purity recombinant protein to be obtained.
  • a signal sequence on a protein promotes transport (prokaryotic host) or secretion (eukaryotic host) of the protein to the periplasm.
  • prokaryotic hosts the signal sequence modulates the new protein across the inner membrane and into the periplasm, after which the signal sequence is cleaved. That is, it is important to search for a signal sequence that can more efficiently mass-produce commercially important proteins, and development of recombinant microorganisms is required.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method for producing CRM197 protein in an efficient and cost-effective manner, and as a result of selecting a specific signal sequence and combining the codon context and the secondary structure to optimize the translation in E. coli, the base sequence is It was designed, and the CRM197 nucleotide sequence encoding the CRM197 protein was also optimized for E. coli expression, and when using these, it was confirmed that CRM197 was efficiently expressed in E. coli, and that the secretion of CRM197 into the periplasm without pH change was efficiently performed, and the present invention was completed. I did.
  • An object of the present invention is to minimize the toxicity of the CRM197 protein to E. coli and maximize the expression by secreting the CRM197 protein into the periplasm of E. coli, a signal sequence for expression of a CRM197 protein of a specific sequence and a nucleic acid encoding the signal sequence, and the above It is to provide a method for producing CRM197 protein using nucleic acids.
  • the present invention provides a signal sequence for expression of CRM197 protein, represented by any one of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 21 amino acid sequence.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the CRM197 protein expression signal sequence.
  • the present invention also provides a nucleic acid construct or expression vector containing the nucleic acid and the genes of the CRM197 protein, a recombinant microorganism into which the nucleic acid construct or expression vector has been introduced, and a method for producing a CRM197 protein comprising the step of culturing the recombinant microorganism. to provide.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the expression module TPB1Tv1.3
  • Ptrc is trc promoter
  • RBS is A/U rich enhancer + SD
  • ⁇ tR2 & T7Te rrnB T1T2 is transcription terminators
  • Bsa I and Dra I are used for cloning. Restriction enzyme site.
  • FIG. 2 shows the E. coli expression plasmid pHex1.3, where Ori (pBR322) represents the replication origin of pBR322, KanR represents the kanamycin marker, lacI represents the lac I gene, and the rest are the same as those of FIG. 1.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the production of the CRM197 expression plasmid
  • T1 is ⁇ tR2 and T7Te transcription terminator
  • T2 is rrnB T1T2 transcription terminators
  • arrows are PCR primers
  • letters A, B, C, D indicate a homologous region for LIC.
  • the rest is as shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 shows the expression patterns of L3 and L5 fusion CRM197 in various E. coli strains, showing Coomassie staining (left) and Western blotting (right) after SDS_PAGE of E. coli total cells.
  • C is C2894H
  • B is BL21 (DE3)
  • W is W3110-1
  • O OrigamiTM 2
  • S Shuffle.
  • Cv represents C2984H containing pHex1.3 used as a negative control
  • L3 and L5 represent the fused signal sequence
  • CRM197 represents the reference CRM197.
  • For coomassie staining cells corresponding to 0.025 OD 600 per well were loaded, and for Western blotting, cells corresponding to 0.0005 OD 600 were loaded.
  • FIG. 5 shows the effect of the type and concentration of inducer on the expression of CRM197 induced by L5, and shows Coomassie staining (left) and Western blotting (right) after SDS_PAGE.
  • the loading amount is the same as that of FIG. 4, where I is an insoluble fraction and S is a soluble fraction.
  • (A) is cultured at 25°C, and (B) is cultured at 30°C.
  • FIG. 6 shows the location of the CRM197 protein induced by L5 fusion, the top shows Coomassie staining after SDS_PAGE, and the bottom shows Western blotting.
  • Cr indicates the location of reference CRM197, and arrows indicate the location of matured CRM197.
  • P1 is the supernatant after treatment with plasma membrane induction buffer
  • P2 is the periplasmic fraction
  • Cy is the cytoplasm faction.
  • Figure 7 shows the effect of the type and concentration of the inducer on the expression of CRM197 induced by L3, (A) is cultured at 25 °C, (B) is cultured at 30 °C.
  • Figure 8 shows the location of the CRM197 protein induced by L3 fusion.
  • Figure 9 shows the change in pH, temperature, impeller speed, dissolved oxygen (DO) of the L3 strain and the introduction time of the expression inducing agent, where (A) the temperature was maintained at 30°C, and (B) is the expression The temperature was lowered to 25° C. before induction.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in pH, temperature, impeller speed, dissolved oxygen (DO) of the L5 strain, and the introduction time of an expression inducing agent.
  • Figure 11 shows the changes in the expression of CRM197 protein before and after the injection of the expression inducing agent in culture, (A) the L3 strain was induced to be expressed at 30°C, (B) was induced to be expressed at 25°C, and (C) the L5 The strain was induced to be expressed at 25°C.
  • Lines 3 and 10 of (A) and lines 4 and 10 of (B), and lines 3 and 9 of (C) were loaded with 200 ng of reference CRM197.
  • Lines 1 and 2 of (A) and lines 1, 2, 3 of (B), and lines 1 and 2 of (C) are cell culture media before the expression inducing agent is added, and lines 16 of (A) and (C) are cultured. This is the supernatant after, and the line after is the cell culture solution sampled every 2 hours after the inducing agent is injected.
  • the loading amount is the same as in FIG. 4.
  • FIG. 12 shows the expression and separation behavior of CRM197 protein in the L3/L5 strain, (A) is the protein separation behavior in culture using L3, and (B) is the protein separation behavior in culture using L5.
  • Line 1 was loaded with 200 ng of reference CRM197
  • Line 2 was the cell culture solution (total cell) after completion of culture
  • Line 3 was the supernatant after treatment with plasma membrane induction buffer solution
  • Lines 4 and 7 were periplasmic fraction (Line 7 was 4 compared to line 4). Pear protein was loaded), lines 5 and 6 represent cytoplasm faction.
  • Line 13 is a result of analysis of purified samples of DEAE Chromatography (A) and HA Chromatography (B) by SDS-PAGE.
  • Line 1 of (A) refers to CRM197 produced by Corynebacteria
  • Line 2 refers to proteins present in the recovered periplasmic fraction.
  • Line 3 is a sample before loading of DEAE Chromatography, which is twice concentrated after ultrafiltration
  • Lines 4 and 5 are DEAE Chromatography flow-through and washing solutions, where impurity proteins excluding CRM197 can be identified.
  • Line 6 is an elution sample from which impurities have been removed
  • Line 7 is a sample eluted with a high concentration salt to remove all proteins bound to the resin.
  • the HA Elu in (B) is CRM197 eluted after removing the protein not bound to the HA resin.
  • Line 1 is CRM197 produced by Corynebacterium
  • Line 2 is CRM197 produced by E. coli (L3). The two CRM197 bands were identified at the same location.
  • FIG. 16 is a result of an Intact protein molecular mass analysis using LC/MS, which was a molecular weight of 58,409 Da, which was consistent with the theoretical molecular weight.
  • expression was attempted by fusion of 9 signal sequences with CRM197 protein.
  • a base sequence SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 12
  • This construct was inserted into the expression plasmid pHex1.3, and expression of CRM197 was investigated in five E. coli strains in order to find the optimal E. coli strain of each construct.
  • the culture temperature and the type and concentration of the inducer were set in the selected E. coli.
  • the CRM197 protein could be expressed in a soluble form even in a strain that did not manipulate the redox potential-related genes (trxB, gor), and secreted into periplasm.
  • the present invention relates to a signal sequence for expression of CRM197 protein, represented by any one of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 21 amino acid sequence.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a signal sequence for expression of the CRM197 protein.
  • the nucleic acid may be characterized in that it is represented by any one nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 12, preferably characterized in that it is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 It can be, but is not limited thereto.
  • the "signal sequence for expression of CRM197 protein” means a signal sequence for expression of the CRM197 protein and secretion into the periplasm.
  • the signal sequence of the protein targeted to the outermembrane of E. coli and the signal sequence derived from the M13 phage were selected (Table 3).
  • the base sequence was designed by combining the codon context and the secondary structure (SEQ ID NOs: 4 to 12).
  • the present invention relates to a nucleic acid construct including a nucleic acid encoding a signal sequence for expression of the CRM197 protein and a gene of the CRM197 protein.
  • the present invention relates to an expression vector including a nucleic acid encoding the CRM197 protein expression signal sequence and a gene of the CRM197 protein.
  • the DNA sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the CRM197 protein was also optimized for E. coli expression (SEQ ID NO: 2).
  • the DNA fragment of each designed signal sequence and the optimized CRM197 DNA fragment were inserted into the plasmid pHex1.3 (Fig. 3).
  • the CRM197 protein gene may be used without limitation as long as it is a gene encoding the CRM197 protein.
  • it may be characterized in that it is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • transformation means introducing a specific foreign DNA strand from outside the cell into the cell.
  • Host microorganisms containing the introduced DNA strands are referred to as "transformed microorganisms.”
  • 'Transformation' which means that DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by the completion of chromosomal integration by introducing DNA into a host, introduces a vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell or introduces a target protein. It means to integrate and complete the encoding polynucleotide into the chromosome of the host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • Transformed polynucleotides include all of them, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • nucleic acid construct includes all of them, regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • the “polynucleotide” is used in the same sense as “nucleic acid”, and includes DNA and RNA encoding a target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette usually includes a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replicating.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, in the specification of the present invention “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably.
  • plasmid vectors that can be used for this purpose are: (a) an initiation point for efficient replication to contain tens to hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with plasmid vectors are selected. It has a structure that includes an antibiotic resistance gene that allows it to be formed and (c) a restriction enzyme cleavage site that allows foreign DNA fragments to be inserted. Even if an appropriate restriction enzyme cleavage site does not exist, the vector and foreign DNA can be easily ligated by using a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method.
  • the gene is "operably linked" when placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • This may be a gene and regulatory sequence(s) linked in a manner that allows gene expression when an appropriate molecule (eg, a transcriptional activating protein) is bound to the regulatory sequence(s).
  • DNA for a pre-sequence or secretory leader is operably linked to the DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • the promoter or enhancer is operably linked to the coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence when arranged to facilitate translation.
  • operably linked means that the linked DNA sequence is in contact, and, in the case of a secretory leader, is contacted and is present in the reading frame. However, the enhancer does not need to be in contact.
  • the ligation of these sequences is carried out by ligation (linkage) at a convenient restriction enzyme site. If such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method is used.
  • the expression vector may be characterized in that it further comprises a Trc promoter.
  • the expression vector may be characterized in that the pHex1.3, but is not limited thereto.
  • CRM197 is known to be very toxic to E. coli due to the presence of nuclease activity. Therefore, CRM197 expression under undesired conditions can adversely affect E. coli growth.
  • E. coli expression plasmid pHex1.3 has the LacI gene and can suppress the background expression of the trc promoter, and the expression module TPB1Tv1.3 (Fig. 1) inserted in this plasmid is a ⁇ phage-derived upstream of the CRM197 gene to be expressed.
  • the tR2 transcription terminator, the T7 phage-derived Te transcription terminator, and the E. coli-derived rrnB T1T2 transcription terminator were inserted downstream, and were designed to suppress the expression of CRM197 transcribed from the plasmid-derived promoter.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism into which the nucleic acid construct or expression vector has been introduced.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that Escherichia coli (Escherichia coli), but is not limited thereto.
  • host cells having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA are generally used, and as all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells, bacteria, yeast, fungi, etc. can be used, and the present invention In the example of, E. coli was used, but the present invention is not limited thereto, and any type of microorganism may be used as long as the CRM197 protein can be sufficiently expressed.
  • the transformed recombinant microorganism can be prepared according to any conventionally known transformation method.
  • a commonly known gene manipulation method may be used, for example, a retroviral vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, herpes simplex A method using a viral vector, a poxvirus vector, a lentiviral vector, or a non-viral vector may be mentioned.
  • a method of directly inserting the nucleic acid construct onto a chromosome of a host cell may be used for the transformation method.
  • electroporaton, lipofection, ballistic method, virosome, liposome, immunoliposome, polycation or lipid nucleic acid conjugate, naked DNA, artificial viron, chemical-promoting DNA influx, calcium phosphate (CaPO 4 ) Precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, lithium acetate-DMSO, and the like may be used.
  • Sonoporation for example, a method using the Sonitron 2000 system (Rich-Mar) can also be used for the delivery of nucleic acids, and other representative nucleic acid delivery systems are Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland). And the method of BTX Molesular Syetem (Holliston, MA).
  • the lipofection method is specified in U.S. Patent No. 5,049,386, U.S. Patent No. 4,946,787, and U.S. Patent No. 4,897,355, and lipofection reagents are commercially available, such as TRANSFECTAMTM and LIPOFECTINTM.
  • Cationic or neutral lipids suitable for effective receptor-recognition lipofection of polynucleotides include Felgner's lipids (WO91/17424 and WO91/16024), and can be delivered to cells through ex vivo introduction and into target tissues through in vivo introduction. have.
  • CRM197 was expressed in all strains in the case of L3 fusion, and CRM197 in strains other than OrigamiTM 2 in the case of L5 fusion Was expressed (Fig. 4). Both L3 and L5 fusion were able to express CRM197 protein in a soluble form even in strains that did not manipulate redox potential-related genes (trxB, gor), and the protein had the same physicochemical/immunological properties as the protein isolated from the parental bacteria. . In addition, in the case of L3 fusion, CRM197 protein could be expressed in a soluble form not only at 25° C. but also at 30° C. (FIG. 7, FIG. 12A).
  • the present invention comprises the steps of: (a) culturing a recombinant microorganism into which the nucleic acid construct or expression vector has been introduced to produce a CRM197 protein; And (b) recovering the generated CRM197 protein.
  • the step (b) may be characterized in that the CRM197 protein secreted into the periplasm is recovered.
  • E. coli expression plasmid pHex1.3 was prepared as follows. After double digestion of ptrc99a (Amann et al., Gene. 69, 301-15, 1988) with Ssp I and Dra I, about 3.2 kb DNA fragment was purified using agarose electrophoresis. Kanamycin resistant gene was amplified using PCR. Plasmid pCR2.1, which is a used template, and KF2, KR were used as primers (Table 1).
  • the conditions of the PCR reaction solution are dNTP each 2.5mM, primer each 10pmol, template DNA, 200 ⁇ 500ng, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Japan) 1.25U, reaction volume 50 ⁇ l, PCR conditions, 98 °C 10 Second, 60° C. 5 seconds, 72° C. min/kb were repeated 30 times.
  • PCR conditions 98 °C 10 Second, 60° C. 5 seconds, 72° C. min/kb were repeated 30 times.
  • This reaction solution was transformed into E. coli C2984H to prepare pHex1.1 in which the selection marker was replaced with Km from Amp.
  • Expression module TPB1Bv1.3 (FIG. 1) including Promoter, RBS, and transcription terminator was synthesized by Bioneer (SEQ ID NO: 1).
  • the process of loading the expression module TPB1Bv1.3 into pHex1.3 is as follows. DNA fragment (1255bp) obtained by PCR amplification using expression module TPB1Bv1.3 as template, TPB_F, TPB_R as primer (Table 1), and PCR amplified DNA using pHex1.1 as template and pHex_F, pHex_R as primers
  • the fragment (4561bp) was assembled in vitro using ligation-independent cloning (LIC; Jeong et al., Appl Environ Microbiol . 78, 5440-3, 2012) under the conditions shown in Table 2, and then in E. coli C2984H. Transformation was performed to prepare pHex1.3 (FIG. 2).
  • LIC reaction conditions Vectors are cut with restriction enzymes or made into linear DNA fragments using PCR. Insert is prepared using PCR. After mixing the vector and the insert as shown in the table above, they were reacted at room temperature for 2 minutes and 30 seconds.
  • CRM197ec The nucleotide sequence of CRM197 optimized for expression in E. coli (CRM197ec) was synthesized in Genscript (SEQ ID NO: 2). The amino acid sequence encoded by CRM197ec is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the signal sequence used to secrete the CRM197 protein into the periplasm of E. coli is shown in Table 3 below (SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 21).
  • SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 21 The signal sequence used to secrete the CRM197 protein into the periplasm of E. coli is shown in Table 3 below (SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 21).
  • DNA of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 12 was synthesized in consideration of the codon context and secondary structure (Table 3).
  • a plasmid for overexpressing CRM197 in E. coli and secreting it into periplasm was prepared as shown in FIG. 3.
  • a DNA fragment of about 5 kb was separated using agarose electrophoresis.
  • Signal sequences L1 to L9 were amplified by PCR using the primers and templates shown in Table 1.
  • CRM197 DNA fragment for fusion of CRM197 gene to each signal sequence using the LIC method was amplified by PCR using the primers and templates in Table 1.
  • the pHex1.3 digested with Bsa I and Dra I, each signal sequence fragment, and the compatible CRM197 fragment were assembled in vitro using the above-described LIC conditions, and then transformed into E. coli C2984H to transform each signal sequence.
  • Plasmids containing CRM197 fused with pHex-L1-CRM, pHex-L2-CRM, pHex-L3-CRM, pHex-L4-CRM, pHex-L5-CRM, pHex-L6-CRM, pHex-L7-CRM, pHex-L8-CRM, pHex-L9-CRM were prepared.
  • pHex-L3-CRM and pHex-L5-CRM were selected in consideration of the expression level and the degree of cell growth.
  • Table 4 By transforming the E. coli strains shown in Table 4 below, the expression and expression positions of the CRM197 protein were investigated.
  • BL21 (DE3) containing pHex-L5-CRM was added in LB liquid medium (50mL/500mL baffled flask) containing 100mM Potassium phosphate (pH 7.5), km 50 ⁇ g/ml until OD 600 reached 0.4 ⁇ 0.6. After incubation, lactose 0.2, 0.4 as an inducer. Expression was induced by adding 0.6%, or 0.02, 0.2, and 2 mM of IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranosid). The culture temperature was 25°C or 30°C. After culturing the cells were recovered, suspended in 50mM potassium phosphate (pH 7.0), and then subjected to sonication to disrupt the cells.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranosid
  • CRM197 protein was analyzed using Coomassie staining and Western blotting (FIG. 5).
  • inducer lactose, IPTG
  • FIG. 5A When inducer (lactose, IPTG) was added and then cultured at 25°C, most of the expressed CRM197 protein existed in a soluble form, and as it was considered to be the same as the molecular weight of the reference CRM197, the expressed protein was matured with the L5 signal sequence removed. It is judged as CRM197 (Fig. 5A).
  • the periplasm fraction was recovered using osmotic shock.
  • the process is as follows.
  • BL21 (DE3) containing pHex-L5-CRM was cultured at 25° C. and centrifuged to recover cells. Resuspend in plasma membrane induction buffer [30mM Tris-HCl (pH 8.0), 20% sucrose, 1 or 10mM EDTA, 1mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)] so that the cell concentration becomes OD 600 10, and then at room temperature for 0.5 to 1 hour While stirring. Thereafter, the cells were centrifuged at 4,000 xg for 15 minutes, and the same amount of cold 30mM Tris-HCl (pH 8.0) of 4° C.
  • BL21 (DE3) containing pHex-L3-CRM was expressed under the same conditions as in Example 2.1.
  • CRM197 induced by L3, unlike L5 it was present in a soluble form under all conditions (FIG. 7), and it was confirmed that it was secreted into periplasm (FIG. 8).
  • the BL21 (DE3) strain containing pHex-L3-CRM or pHex-L5-CRM was cultured in the following manner.
  • the pH stat method was used for feeding, and the pH was maintained at 7.3 by using an influent solution (Feeding solution: glucose 600g/L, yeast extract 30g/L) and a basic solution (Alkali solution: 14-15% ammonia).
  • the composition of the solution and medium used for cultivation is shown in Tables 5 and 6.
  • a single colony formed from the modified LB agar medium [Modified Luria-Bertani (LB) agar: soytone 10g/L, yeast extract 5g/L, sodium chloride 10g/L, agar 15g/L, kanamycin 50mg/L] was added to the seed culture medium. Inoculated and cultured at 30° C. for 18 hours. This seed culture was again inoculated into the main culture medium (3L/5L fermenter) at a ratio of 1% (v/v) and cultured at 30°C. In the main culture medium, 0.1% of a sterilized foam inhibitor was added to the seed culture medium. After the absorbance of the culture medium had a value of 30 to 40, the temperature was lowered to 25°C. Next, IPTG 10mM was added, and the culture was terminated after the absorbance of the culture solution reached 100-120.
  • LB modified Luria-Bertani
  • the culture pattern of E. coli BL21 (DE3) containing pHex-L3-CRM in a 5L fermentor is shown in FIG. 9 and the culture pattern of E. coli BL21 (DE3) containing pHex-L5-CRM is shown in FIG. 10.
  • the expression pattern of CRM197 expressed is as shown in FIG. 11, and the expression yield was 1.1-1.2g/L for L3 fusion and 3.0-3.7g/L for L5 fusion.
  • CRM197 was quantified by comparing the relative quantity with reference CRM197 using a densitometer (GS-900TM, Bio-rad laboratories Ins., Hercules, California) after SDS-PAGE/Coomassie staining.
  • the process of recovering the periplasmic fraction from cells cultured in a 5L fermenter is as follows.
  • the cell culture was centrifuged at 4° C. and 4,000 x g for 15 minutes to precipitate the cells.
  • the cell precipitate was resuspended in a plasma membrane induction buffer (Table 7) of the modified protein based on the absorbance of 100, and stirred at room temperature for 0.5 to 1 hour.
  • the periplasmic fraction of the pHex-L3-CRM culture was taken, concentrated twice with a 10kDa cut-off membrane using a TFF system, and ultrafiltration was performed with a 10-fold volume of 10mM sodium phosphate solvent (pH 7.2).
  • Purification was completed through two column processes using an AKTA pure (GE Helthcare) system.
  • the first column process was Anion exchange chromatography (Diethyl aminoetyl Separose Fast Flow resin, DEAE), which was used to remove nucleic acids and impurity proteins.
  • DEAE Resin has a negative charge, so proteins with a positive charge are bound.
  • CRM197 produced using the E. coli pHex-L3 strain was the same protein physicochemically and immunologically as CRM197 produced by Corynebacterium.
  • CRM197 protein having the same physicochemical/immunological properties as the protein isolated from the parental cell can be expressed, and a medium for increasing secretion into the periplasm It is very useful in the production of CRM197 protein because it is possible to produce CRM197 protein with high secretion efficiency into the periplasm without a pH shift of.

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Abstract

본 발명은 CRM197 단백질을 대장균에서 발현 및 주변세포질(periplasm)로 분비시키기 위한 신호서열 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, CRM197 단백질 발현용 신호서열, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산, 상기 핵산 및 CRM197 단백질 유전자를 포함하는 핵산 구조체 또는 발현벡터, 상기 핵산 구조체 또는 발현벡터가 도입된 재조합미생물 및 상기 재조합미생물을 배양하는 단계를 포함하는 CRM197 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 산화환원전위(redox potential)를 조절하지 않은 일반 대장균에서도 모균에서 분리된 단백질과 이화학적/면역학적 성질이 동일한 CRM197 단백질을 발현시킬 수 있으며, 주변세포질로의 분비 증가를 위한 배지의 pH 변화(shift) 없이도 주변세포질로의 분비 효율이 높은 CRM197 단백질 제조가 가능하므로, CRM197 단백질 생산에 있어 매우 유용하다.

Description

CRM197 단백질 발현 방법
본 발명은 CRM197 단백질을 대장균에서 발현 및 주변세포질(periplasm)로 분비시키기 위한 신호서열 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, CRM197 단백질 발현용 신호서열, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산, 상기 핵산 및 CRM197 단백질 유전자를 포함하는 핵산 구조체 또는 발현벡터, 상기 핵산 구조체 또는 발현벡터가 도입된 재조합미생물 및 상기 재조합미생물을 배양하는 단계를 포함하는 CRM197 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
디프테리아 독소(diphtheria toxin, DT)는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)의 병원성 균주로부터 합성 및 분비되는 단백질성 외독소이다. 디프테리아 독소는, 535개의 잔기로 된 전효소(proenzyme)로서 분비되어 트립신-유사 프로테아제에 의해 처리됨으로써 2개의 단편(A와 B)으로 분리되는, ADP-리보실화 효소(ADP-ribosylating enzyme)이다. 단편 A는 촉매적으로 활성인 부위이며 특이적으로 단백질 합성 인자 EF-2를 타겟으로 하는 NAD-의존성 ADP-리보실트랜스퍼라아제이고, 이로 인해 EF-2를 불활성화시키고 세포 내에서 단백질 합성을 중단시킨다.
디프테리아 독소의 다양한 무독성 형태와 부분 독성의 면역학적으로 교차 반응하는 형태(CRM 또는 교차 반응하는 물질들)의 분리를 통해 CRM197이 발견되었다(Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973). 바람직하게는, CRM은 DT 전체 또는 그 일부를 포함하는 임의의 크기 및 조성일 수 있다.
CRM197은 하나의 아미노산 치환 G52E이 존재하는, 효소학적으로 고도로 비활성적이고 무독성인 형태의 디프테리아 독소이다. 이 돌연변이는 NAD-결합 부위 앞쪽에 위치한 활성-부위 루프에 고유한 유연성을 부여함으로써, NAD에 대한 CRM197의 결합성을 낮추고, DT의 독성을 없앤다(Malito et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(14):5229-342012). CRM197은, DT와 마찬가지로 이황화 결합을 2개 보유하고 있다. 이황화 결합 하나는 Cys186을 Cys201과 연결하여, 단편 A를 단편 B와 연결한다. 2번째 이황화 결합은 단편 B내에서 Cys461을 Cys471과 연결한다. DT와 CRM197은 단편 A에 기인한 뉴클레아제 활성을 가지고 있다(Bruce et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87, 2995-8, 1990).
다수의 항원들은 단백질에 화학적으로 연결되지 않은 한, 특히 영유아에서, 면역원성이 낮아, 접합체 또는 접합 백신으로 제조된다. 이러한 접합 백신에서 단백질 성분을 “운반 단백질(carrier protein)”이라고도 한다. CRM197은 단백질-탄수화물 접합 및 합텐-단백질 접합에서 운반 단백질로 흔히 사용된다. CRM197은, 운반 단백질로서, 디프테리아 톡소이드 뿐만 아니라 다른 톡소이드 단백질을 능가하는 여러 장점을 가지고 있다(Shinefield Vaccine, 28:4335, 2010).
디프테리아 독소(DT)의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, DT는 코리네박테리움 디프테리아의 배양물로부터 톡신의 정제에 뒤따르는 화학적 무독화(detoxification)에 의해 생산될 수 있거나, 재조합체 또는 유전적으로 무독화된 톡신의 유사체의 정제에 의해 제조될 수 있다.
단백질 존재량(abundance)으로 인해, 백신에 사용하기 위한 CRM197과 같은 디프테리아 독소의 대량 생산을 할 수 없었다. 이러한 문제점은 이전에 대장균에서 CRM197을 발현시키는 것에 의해 다루어져 왔으며(Bishai, et al., J Bacteriol. 169:5140-5151), Bishai 등은 분해된 단백질의 생산을 초래하는 디프테리아 독소(tox 신호서열을 포함함)를 함유하는 재조합 융합 단백질의 발현을 기술하였다.
주변세포질(periplasm)에서 박테리아 독소의 생산은 세포질(cytoplasmic) 생산에 비해 i) 단백질이 신호 펩티드 절단 후에 성숙형으로 생산되거나, ii) 대장균의 주변세포질이 이황화 결합의 형성을 허용하는 산화 환경이어서 가용성의, 제대로 폴딩된 단백질의 생산을 도울 수 있고, iii) 대장균의 주변세포질이 세포질보다 적은 프로테아제를 함유하여 발현된 단백질의 단백질 분해성 절단을 피하도록 도울 수 있고, iv) 주변세포질이 또한 더 적은 단백질을 함유하여 보다 순도 높은 재조합 단백질이 수득되는 것을 허용한다.
일반적으로 단백질 상의 신호서열(signal sequence)의 존재는 주변세포질로의 단백질의 수송(원핵 숙주) 또는 분비(진핵 숙주)를 촉진한다. 원핵 숙주에서 신호서열은 신생 단백질을 내막을 가로질러 주변세포질로 조정하며, 그 후 신호서열은 절단된다. 즉, 상업적으로 중요한 단백질을 보다 효율적으로 대량 생산할 수 있는 신호서열 탐색이 중요하며, 재조합미생물의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 효율적이고, 비용 효과적인 방식으로 CRM197 단백질을 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 특정 신호서열을 선택하고 대장균에서의 translation을 최적화하기 위해 codon context와 2차 구조를 복합하여 염기서열을 디자인하였으며, CRM197 단백질을 코딩하는 CRM197 염기서열 또한 대장균 발현 최적화하였으며, 이들을 이용하는 경우 대장균에서 CRM197이 효율적으로 발현되고, pH 변화 없이도 CRM197의 주변세포질로의 분비가 효율적으로 이루어지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 CRM197 단백질을 대장균의 주변세포질로 분비하여 CRM197 단백질의 대장균에 대한 독성을 최소화하며 발현을 극대화시키기 위하여, 특정 서열의 CRM197 단백질 발현용 신호서열과 상기 신호서열을 코딩하는 핵산 및 상기 핵산을 이용한 CRM197 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 13 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, CRM197 단백질 발현용 신호서열을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CRM197 단백질 발현용 신호서열을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 및 CRM197 단백질의 유전자를 포함하는 핵산 구조체 또는 발현벡터, 상기 핵산 구조체 또는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물 및 상기 재조합미생물을 배양하는 단계를 포함하는 CRM197 단백질의 제조방법을 제공한다.
도 1은 발현모듈 TPB1Tv1.3의 모식도를 나타낸 것으로, Ptrc은 trc promoter, RBS는 A/U rich enhancer + SD, λ tR2 & T7Te, rrnB T1T2는 transcription terminators, BsaI와 DraI은 cloning시 사용된 restriction enzyme site를 의미한다.
도 2는 대장균 발현 플라스미드 pHex1.3를 나타낸 것으로, Ori(pBR322)는 pBR322의 replication origin, KanR은 kanamycin 마커, lacI는 lacI 유전자를 의미하며, 나머지는 도 1과 같다.
도 3은 CRM197 발현 플라스미드 제작 모식도를 나타낸 것으로, T1은 λ tR2와 T7Te transcription terminator, T2는 rrnB T1T2 transcription terminators, 화살표는 PCR primer, 알파벳 A, B, C, D는 LIC를 위한 homologous region을 의미하며, 나머지는 도 1과 같다.
도 4는 다양한 대장균 균주에서 L3, L5 fusion CRM197의 발현 양상을 나타낸 것으로, 대장균 total cell의 SDS_PAGE 후 Coomassie staining(좌), Western blotting(우)을 나타낸다. C는 C2894H, B는 BL21(DE3), W는 W3110-1, O는 Origami™ 2, S는 Shuffle을 의미한다. C-v는 negative control로 사용된 pHex1.3을 함유하는 C2984H을 나타내며, L3, L5는 fusion된 signal sequence, CRM197은 reference CRM197을 나타낸다. Coomassie staining을 위해서는 well 당 0.025 OD600에 해당하는 세포를 loading하였고, Western blotting의 경우 0.0005 OD600에 해당하는 세포를 loading하였다.
도 5는 inducer의 종류 및 농도가 L5에 의해 유도되는 CRM197 발현에 미치는 영향을 나타낸 것으로, SDS_PAGE 후 Coomassie staining(좌), Western blotting(우)을 나타낸다. Loading 양은 도 4와 동일하며, I는 insoluble fraction, S는 soluble fraction을 의미한다. (A)는 25℃ 배양, (B)는 30℃ 배양이다.
도 6은 L5 fusion에 의해 유도되는 CRM197 단백질의 위치를 나타낸 것으로, 위쪽은 SDS_PAGE 후 Coomassie staining, 아래는 Western blotting을 나타낸다. Cr은 reference CRM197, 화살표는 matured CRM197의 위치를 나타낸다. P1은 원형질막 유도 완충용액 처리 후 상등액, P2는 periplasmic fraction, Cy는 cytoplasm faction을 의미한다.
도 7은 inducer의 종류 및 농도가 L3에 의해 유도되는 CRM197 발현에 미치는 영향을 나타낸 것으로, (A)는 25℃ 배양, (B)는 30℃ 배양이다.
도 8은 L3 fusion에 의해 유도되는 CRM197 단백질의 위치를 나타낸 것이다.
도 9는 L3 균주의 pH, 온도, 임펠러 속도, 용존 산소량(Dissolved oxygen, DO)의 변화 및 발현 유도제의 투입 시간을 나타낸 것으로, (A)는 온도를 30℃로 유지하였고, (B)는 발현 유도 전에 온도를 25℃로 낮추었다.
도 10은 L5 균주의 pH, 온도, 임펠러 속도, 용존 산소량(Dissolved oxygen, DO)의 변화 및 발현 유도제의 투입 시간을 나타낸 도면이다.
도 11은 배양 중 발현 유도제 투입 전·후의 CRM197 단백질 발현의 변화를 나타낸 것으로, (A)는 L3 균주를 30℃에서 발현 유도하였으며, (B)는 25℃에서 발현 유도하였고, (C)는 L5 균주를 25℃에서 발현 유도하였다. (A)의 line 3, 10과 (B)의 line 4, 10, (C)의 line 3, 9는 reference CRM197 200ng을 loading하였다. (A)의 line 1, 2와 (B)의 line 1, 2, 3, (C)의 line 1, 2는 발현 유도제 투입 전의 세포 배양액이며, (A)와 (C)의 line 16은 배양 종료 후의 상등액이며, 이후의 line은 유도제 투입 후 2시간 단위로 sampling된 세포 배양액이다. Loading 양은 도 4와 동일하다.
도 12는 L3/L5 균주에서의 CRM197 단백질의 발현 및 분리 거동을 나타낸 것으로, (A)는 L3를 이용한 배양에서의 단백질 분리 거동이며, (B)는 L5를 이용한 배양에서의 단백질 분리 거동이다. Line 1은 reference CRM197 200ng을 loading하였고, Line 2는 배양 종료 후의 세포 배양액(total cell)이며, Line 3는 원형질막 유도 완충용액 처리 후 상등액, Line 4와 7은 periplasmic fraction(Line 7은 line 4 보다 4배의 단백질을 loading하였다), Line 5와 6은 cytoplasm faction을 나타낸다.
도 13은 DEAE Chromatography(A)와 HA Chromatography(B) 정제 샘플을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. (A)의 Line 1은 코리네박테리아에서 생산한 CRM197이며, Line 2는 회수된 periplasmic fraction에 존재하는 단백질을 의미한다. Line 3은 한외여과 후 2배 농축된 DEAE Chromatography 로딩 전 샘플이며, Line 4와 5는 DEAE Chromatography의 Flow-through, washing 액으로 CRM197을 제외한 불순물 단백질을 확인할 수 있다. Line 6은 불순물이 제거된 용출 샘플이며, Line 7은 레진에 결합하고 있는 모든 단백질을 제거하기 위하여 고농도 salt를 이용하여 용출한 샘플이다. (B)의 HA Elu는 HA 레진에 결합되지 않은 단백질을 제거한 후 용출한 CRM197이다.
도 14는 최종 정제 CRM197을 SEC-HPLC로 분석한 결과로, 순도는 99% 이상이었다.
도 15는 SDS-PAGE(좌)와 Western blot(우) 결과이다. Line 1은 코리네박테리움에서 생산한 CRM197이며, Line 2은 대장균(L3)에서 생산한 CRM197이다. 두 CRM197은 동일한 위치에서 밴드가 확인되었다.
도 16은 LC/MS를 이용한 Intact protein molecular mass 분석 결과로, 분자량 58,409Da으로 이론적 분자량과 일치하였다.
도 17은 Circular dichroism(CD) 분석 결과로, 코리네박테리움 생산 CRM197(●)과 대장균 pHex-L3 생산 CRM197(Χ) 간의 고차 구조의 차이가 없음을 확인하였다.
도 18은 형광스펙트럼 분석 결과로, 코리네박테리움 생산 CRM197(●)과 대장균 pHex-L3 생산 CRM197(실선)은 최대 방출파장이 338nm로 동일하였다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 9개의 신호서열(signal sequence)을 CRM197 단백질과 융합(fusion)시켜 발현을 시도하였다. 각 signal sequence는, codon context와 mRNA의 2차 구조를 고려하여 translation에 최적화한 염기서열(서열번호 4 내지 서열번호 12)을 디자인하였다. 이 구조물을 발현 플라스미드 pHex1.3에 삽입하였고, 각 구조물의 최적의 대장균 균주를 찾기 위해 5종의 대장균 균주에서 CRM197의 발현을 조사하였다. 또한 선정된 대장균에서 배양 온도 및 inducer의 종류, 농도를 설정하였다. 결과적으로, 상기 구조물들을 다양한 대장균 균주에 형질전환시킨 결과, redox potential에 관련된 유전자(trxB, gor)를 조작하지 않은 균주에서도 CRM197 단백질을 soluble form으로 발현시킬 수 있었으며, periplasm으로 분비시킬 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 13 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, CRM197 단백질 발현용 신호서열에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CRM197 단백질 발현용 신호서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 4 내지 서열번호 12 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 6 또는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, “CRM197 단백질 발현용 신호서열”이란, CRM197 단백질의 발현 및 주변세포질(periplasm)로의 분비를 위한 신호서열을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, CRM197 단백질을 periplasm으로 분비시키기 위해 대장균의 외막(outermembrane)으로 targeting되는 단백질의 신호서열과 M13 파아지 유래의 신호서열을 선택하였다(표 3). 선택한 신호서열을 대장균에서 translation을 최적화하기 위해 codon context와 2차 구조를 복합하여 염기서열을 디자인하였다(서열번호 4 내지 서열번호 12).
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CRM197 단백질 발현용 신호서열을 코딩하는 핵산 및 CRM197 단백질의 유전자를 포함하는 핵산 구조체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CRM197 단백질 발현용 신호서열을 코딩하는 핵산 및 CRM197 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, CRM197 단백질의 아미노산 서열(서열번호 3)을 coding하는 DNA 염기서열 또한 대장균 발현 최적화하였다(서열번호 2). 디자인된 각 signal sequence의 DNA fragment와 최적화된 CRM197 DNA fragment를 플라스미드 pHex1.3에 삽입하였다(도 3).
본 발명에 있어서, 상기 CRM197 단백질의 유전자는 CRM197 단백질을 암호화하는 유전자이면 제한 없이 이용 가능하다. 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, “형질전환(transformation)”이란 특정 외래의 DNA 가닥을 세포 밖에서 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 가닥을 포함한 숙주 미생물은 ‘형질 전환된 미생물’이라 한다. DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미하는 ‘형질전환’은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 “핵산 구조체”는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체(chromosome) 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다.
또한, 본 명세서에서, 상기 “폴리뉴클레오타이드”는 “핵산”과 동일한 의미로 사용되며, 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 명세서에서, “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수십 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결(operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
일반적으로 “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 Trc 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 pHex1.3인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
CRM197은 nuclease 활성이 존재하여 대장균에 매우 toxic한 것으로 알려져 있다. 따라서 원하지 않는 조건에서 CRM197 발현은 대장균 성장에 악영향을 미칠 수 있다. 대장균 발현 플라스미드 pHex1.3은 LacI 유전자를 가지고 있어 trc 프로모터의 background 발현을 억제할 수 있으며, 이 플라스미드에 삽입된 발현모듈 TPB1Tv1.3(도 1)은, 발현될 CRM197 유전자의 upstream에 λ 파아지 유래의 tR2 transcription terminator, T7 파아지 유래의 Te transcription terminator, downstream에 대장균 유래의 rrnB T1T2 transcription terminator가 삽입되어, 플라스미드 유래의 프로모터로부터 전사되는 CRM197의 발현을 억제할 수 있도록 디자인되었다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 구조체 또는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용 가능하고, 본 발명의 실시예에서는 대장균을 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 CRM197 단백질이 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
상기 형질전환된 재조합미생물은 통상적으로 알려진 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
또한, 형질전환방법에는 발현벡터를 이용한 방법 외에도, 상기 핵산 구조체를 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다.
일반적으로 전기천공법(electroporaton), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수 있다.
소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, TRANSFECTAMTM 및 LIPOFECTINTM이 있다. 폴리뉴클레오타이드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며(WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다(Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).
본 발명의 일 실시예에서, 제조된 플라스미드 벡터를 다양한 대장균 균주(표 4)에 형질전환시킨 결과, L3 fusion의 경우 모든 균주에서 CRM197이 발현되었고, L5 fusion의 경우 Origami™ 2를 제외한 균주에서 CRM197이 발현되었다(도 4). L3, L5 fusion 모두 redox potential에 관련된 유전자(trxB, gor)를 조작하지 않은 균주에서도 CRM197 단백질을 soluble form으로 발현시킬 수 있었고, 상기 단백질은 모균에서 분리된 단백질과 이화학적/면역학적 성질이 동일하였다. 또한, L3 fusion의 경우, 25℃뿐 아니라 30℃에서도 CRM197 단백질을 soluble form으로 발현시킬 수 있었다(도 7, 도 12A).
기존 보고에 의하면 배양 시, pH 6.5~6.8에서 배양하다가 induction 시 pH 7.5로 shift를 하면 CRM197의 periplasm으로 분비가 개선된다. 이와 달리, 본 발명에서 제조된 균주의 경우, 배지의 pH shift 없이 CRM197의 periplasm로의 효율적인 분비를 확인하였다(도 12). pH shift 없는 고농도 배양에서 L5 fusion의 경우 CRM197의 생산성은 3.7g/L, periplasm으로 분비되는 CRM197은 2g/L 이상이었다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 핵산 구조체 또는 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 배양하여 CRM197 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 CRM197 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 CRM197 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 주변세포질(periplasm)에 분비된 CRM197 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: CRM197 과발현 플라스미드 제조
실시예 1.1: 플라스미드 pHex1.3 제조
대장균 발현 플라스미드 pHex1.3은 다음과 같이 제작하였다. ptrc99a(Amann et al., Gene. 69, 301-15, 1988)를 SspI과 DraI 으로 double digestion한 후, agarose 전기영동을 이용하여 약 3.2kb DNA fragment를 정제하였다. Kanamycin resistant gene은 PCR을 이용하여 증폭하였다. 사용한 template인 플라스미드 pCR2.1, primer는 KF2, KR를 사용하였다(표 1).
Figure PCTKR2019012899-appb-T000001
Figure PCTKR2019012899-appb-I000001
PCR 반응액의 조건은 dNTP 각 2.5mM, primer 각 10pmol, 주형 DNA, 200 ~ 500ng, PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara Bio Inc., Japan) 1.25U, 반응 부피 50μl로 하고, PCR 조건은, 98℃ 10초, 60℃ 5초, 72℃ 분/kb의 3단계를 30회 반복하였다. 이와 같은 PCR 조건으로 생성된 약 0.8kb의 DNA fragment를 BamHI과 HindIII로 double digestion한 후, klenow fragment를 이용하여 blunt end로 fill-in한 후, 전 과정에서 제조한 3.2kb DNA fragment와 T4 DNA ligase를 이용하여 ligation하였다. 이 반응액을 E. coli C2984H 에 transformation하여, selection marker가 Amp에서 Km으로 치환된 pHex1.1을 제조하였다.
Promoter, RBS, transcription terminator를 포함하는 발현모듈 TPB1Bv1.3(도 1)은 Bioneer에서 합성하였다(서열번호 1). 발현모듈 TPB1Bv1.3을 pHex1.3에 탑재하는 과정은 다음과 같다. 발현모듈 TPB1Bv1.3을 주형, TPB_F, TPB_R를 primer(표 1)로 이용하여 PCR 증폭하여 얻은 DNA fragment(1255bp)와, pHex1.1를 주형으로, pHex_F, pHex_R을 primer로 이용하여 PCR 증폭한 DNA fragment(4561bp)를 표 2와 같은 조건으로 ligation-independent cloning(LIC; Jeong et al., Appl Environ Microbiol. 78, 5440-3, 2012)을 이용하여 in vitro에서 assemble한 후, E. coli C2984H에 transformation하여 pHex1.3을 제조하였다(도 2).
Figure PCTKR2019012899-appb-T000002
LIC 반응 조건: 벡터는 제한 효소로 자르거나 PCR을 이용하여 linear 형태의 DNA fragment로 만든다. Insert는 PCR을 이용하여 제조한다. 벡터와 insert는 위의 표와 같이 섞은 후, 상온에서 2분 30초 동안 반응하였다.
실시예 1.2: CRM197 유전자 제조
대장균에서 발현이 최적화된 CRM197의 염기서열(CRM197ec)은 Genscript에서 합성하였다(서열번호 2). CRM197ec가 coding하는 아미노산 서열은 서열번호 3과 같다.
실시예 1.3: Signal sequence 유전자 제조
CRM197 단백질을 대장균의 periplasm으로 분비시키기 위해 사용된 signal sequence는 하기 표 3에 나타내었다(서열번호 13 내지 서열번호 21). 대장균에서의 발현을 최적화하기 위해 codon context와 2차 구조를 고려하여, 서열번호 4 내지 서열번호 12의 DNA를 합성하였다(표 3).
Figure PCTKR2019012899-appb-T000003
Figure PCTKR2019012899-appb-I000002
실시예 1.4: CRM197 과발현을 위한 플라스미드의 제조
CRM197을 대장균에서 과발현 및 periplasm으로 분비시키기 위한 플라스미드는 도 3과 같이 제조하였다. pHex1.3을 BsaI과 DraI으로 double digestion한 후, agarose 전기영동을 이용하여 약 5kb의 DNA fragment를 분리하였다. signal sequence L1~L9는 표 1의 프라이머와 주형을 이용하여 PCR 증폭하였다. LIC 방법을 이용하여 각 signal sequence에 CRM197 유전자를 fusion하기 위한 CRM197 DNA fragment는 표 1의 프라이머와 주형을 이용하여 PCR 증폭하였다. BsaI과 DraI으로 절단된 pHex1.3과 각 signal sequence fragment, 이와 호환되는 CRM197 fragment는 전술한 LIC 조건을 이용하여 in vitro 에서 조립(assemble)한 후, E. coli C2984H에 transformation하여 각 signal sequence와 fusion된 CRM197을 함유하는 플라스미드 pHex-L1-CRM, pHex-L2-CRM, pHex-L3-CRM, pHex-L4-CRM, pHex-L5-CRM, pHex-L6-CRM, pHex-L7-CRM, pHex-L8-CRM, pHex-L9-CRM을 제조하였다.
실시예 2: 대장균에서 CRM197 단백질 발현
실시예 1에서 제조된 플라스미드 중 발현량과 세포의 성장 정도를 고려하여 pHex-L3-CRM, pHex-L5-CRM를 선택하였다. 하기 표 4의 대장균 균주에 transformation하여, CRM197 단백질의 발현 및 발현 위치를 조사하였다.
Figure PCTKR2019012899-appb-T000004
배양 방법은, 고체 배지(soytone 10g/L, Yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, agar 15g/L)에서 생성된 colony를 100mM Potassium phosphate(pH 7.5), km 50μg/ml, 0.2% Lactose를 함유하는 LB 액체 배지에서 30℃ 15시간 동안 진탕배양 후, total cell을 SDS PAGE를 수행한 후, Coomassie Blue staining과 Western blotting을 이용하여 CRM197의 발현을 분석하였다(도 4). L3 fusion은 사용한 모든 균주에서 CRM197 단백질이 발현되었지만, L5 fusion의 경우, Origami™ 2에 transformation하였을 때, 액체 배지에서 성장하지 못하였다. 이 외의 균주에서는 CRM197 단백질 발현이 관찰되었다.
실시예 2.1: L5에 의한 CRM197 발현
pHex-L5-CRM을 함유하는 BL21(DE3)를 100mM Potassium phosphate(pH 7.5), km 50μg/ml을 함유하는 LB 액체 배지(50mL/500mL baffled flask)에서 OD600이 0.4~0.6에 도달할 때까지 배양한 후, inducer로서 lactose 0.2, 0.4. 0.6%, 또는 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) 0.02, 0.2, 2mM을 첨가하여 발현을 유도하였다. 배양 온도는 25℃ 또는 30℃를 사용하였다. 배양 후 세포를 회수한 후, 50mM potassium phosphate(pH 7.0)에 현탁한 후, sonication을 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄 후, 원심분리하여 상등액(soluble fraction)과 침전물(insoluble fraction)을 분리하였다. 각 sample을 SDS_PAGE 후, Coomassie staining과 Western blotting을 이용하여 CRM197 단백질의 발현을 분석하였다(도 5). Inducer(lactose, IPTG)를 첨가한 후, 25℃에서 배양한 경우 발현된 CRM197 단백질의 대부분은 soluble form으로 존재하였고, reference CRM197의 분자량과 동일한 것으로 보아, 발현된 단백질은 L5 signal sequence가 제거된 matured CRM197으로 판단된다(도 5A). 반면, 30℃에서 배양한 경우, lactose를 inducer로 사용하면 CRM197 단백질의 약 50%는 insoluble fraction에서 발견되었고, IPTG를 inducer로 첨가하면 CRM197 단백질의 대부분은 insoluble fraction에서 발견되었다(도 5B).
CRM197의 발현 위치를 확인하기 위해 osmotic shock을 이용하여, periplasm fraction을 회수하였다. 과정은 다음과 같다. pHex-L5-CRM을 함유하는 BL21(DE3)를 25℃에서 배양한 후, 원심분리하여 세포를 회수하였다. 원형질막 유도 완충용액[30mM Tris-HCl(pH 8.0), 20% 수크로스, 1 또는 10mM EDTA, 1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)]에 세포 농도가 OD600 10이 되도록 재현탁한 후, 상온에서 0.5~1시간 동안 교반하였다. 이후 4,000 x g에서 15분간 원심분리하여 세포을 취하고, 동일한 양의 4℃ 이하의 차가운 30mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 상온에서 0.5~1시간 교반하였다. 이후 4,000 x g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 얻었다(periplasmic fraction, P2). 원형질막 유도 완충용액 처리 후 상등액(P1)과 periplasmic fraction(P2), cytoplasm faction을 SDS-PAGE를 이용하여 전개한 후, Coomassie staining과 Western blotting을 이용하여 CRM197의 발현 및 발현 위치를 조사하였다(도 5). L5는 CRM197을 성공적으로 periplasm으로 분비시킬 수 있는 것을 확인하였다(도 6). 원형질막 유도 완충용액에 EDTA는 1mM보다 10mM인 경우 효과적이었다.
실시예 2.2: L3에 의한 CRM197 발현
pHex-L3-CRM을 함유하는 BL21(DE3)를 실시예 2.1과 동일한 조건에서 발현시켰다. L3에 의해 유도되는 CRM197의 경우, L5와 달리 모든 조건에서 soluble form으로 존재하였고(도 7), periplasm으로 분비됨을 확인하였다(도 8).
실시예 3: 대장균 BL21(DE3)의 배양
pHex-L3-CRM 또는 pHex-L5-CRM를 함유하는 BL21(DE3) 균주를 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 본배양 시 feeding은 pH stat 방법을 사용하였고, 유입 용액(Feeding solution: 포도당 600g/L, 효모 추출물 30g/L)과 염기성 용액(Alkali solution: 14~15% 암모니아)을 이용하여 pH 7.3으로 유지하였다. 배양에 이용한 용액 및 배지 조성은 표 5 및 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2019012899-appb-T000005
Figure PCTKR2019012899-appb-T000006
수정된 LB 한천 배지[Modified Luria-Bertani(LB) 아가: soytone 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 염화나트륨 10g/L, 아가 15g/L, 카나마이신 50mg/L]에서 형성된 단일 콜로니를 종배양 배지에 접종하여, 30℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이 종배양을 다시 본배양 배지(3L/5L 발효조)에 1%(v/v)의 비율로 접종하고 30℃에서 배양하였다. 본배양 배지는 종배양 배지에 추가적으로 멸균된 거품억제제를 0.1% 첨가하였다. 배양액의 흡광도가 30~40의 값을 가진 이후, 온도를 25℃로 낮추었다. 다음으로 IPTG 10mM을 첨가하였으며, 배양액의 흡광도가 100~120이 된 이후 배양을 종료하였다.
pHex-L3-CRM를 함유하는 대장균 BL21(DE3)를 5L 발효조에서 배양 양상은 도 9, pHex-L5-CRM를 함유하는 대장균 BL21(DE3)의 배양 양상은 도 10에 나타내었다. 5L 발효조에서 발효시, 발현되는 CRM197의 발현 양상은 도 11과 같으며, 발현 수율은 L3 fusion의 경우 1.1~1.2g/L, L5 fusion의 경우 3.0~3.7g/L이었다. CRM197의 정량은 SDS-PAGE/Coomassie staining 후 densitometer(GS-900™, Bio-rad laboratories Ins., Hercules, California)를 사용하여 reference CRM197과의 상대량(relative quantity)을 비교하여 정량하였다.
실시예 4: 단백질 정제
실시예 4.1: 세포 배양액으로부터 periplasmic fraction 제조
5L 발효조에서 배양한 세포로부터 periplasmic fraction을 회수하는 과정은 다음과 같다. 세포 배양액을 4℃, 4,000 x g에서 15분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 세포 침전물은 흡광도 100을 기준으로 수정된 단백질의 원형질막 유도 완충용액(표 7)에 재현탁하여 상온에서 0.5~1시간 동안 교반하였다.
Figure PCTKR2019012899-appb-T000007
이후 4,000 x g에서 15분간 원심분리하여 세포를 취하고, 동일한 양의 4℃ 이하의 차가운 30mM Tris-HCl[pH 8.0]을 첨가하여 상온에서 0.5~1시간 교반하였다. 이후 4,000 x g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취하고, MF를 이용하여 불순물을 제거하였다. 위의 과정을 통한 pHex-L3-CRM를 함유하는 대장균 BL21(DE3)에서 회수된 periplasmic fraction의 SDS-PAGE 분석은 도 12(A), pHex-L5-CRM를 함유하는 대장균 BL21(DE3)에서 회수된 periplasmic fraction의 SDS-PAGE 분석은 도 12(B)에 나타내었다. periplasmic fraction에 존재하는 CRM197 단백질의 양은 L3 균주는 1.2g/L, L5 균주는 2.3g/L인 것으로 확인되었다(표 8).
Figure PCTKR2019012899-appb-T000008
실시예 4.2: CRM197 단백질의 정제
pHex-L3-CRM 배양액의 periplasmic fraction을 취하여 TFF system을 이용하여 10kDa cut-off membrane으로 2배 농축하고 10배 부피의 10mM sodium phosphate 용매(pH 7.2)로 한외여과를 실시하였다. AKTA pure(GE Helthcare) system을 이용하여 두 가지의 컬럼 공정을 거쳐 정제를 완료하였다. 첫 번째 컬럼 공정은 Anion exchange chromatography(Diethyl aminoetyl Separose Fast Flow resin, DEAE)이며 핵산 및 불순물 단백질을 제거하는 목적으로 사용하였다. DEAE Resin은 (-) 전하를 띄고 있어 (+) 전하의 단백질이 결합하게 된다. 한외여과를 거친 시료를 DEAE Chromatography를 거쳐 결합되지 않은 단백질 및 불순물이 1차적으로 빠져 나와 제거되고, 연이은 washing 공정을 거쳐 salt 농도에 따라 CRM197을 제외한 결합력이 낮은 불순물 단백질을 제거하였다. 이후 salt 농도를 증가시켜 CRM197만을 용출하였다. DEAE Chromatography를 이용해 정제하는 과정 중의 시료에 대해 SDS-PAGE 분석을 진행하였고, 그 결과를 도 13(A)에 나타내었다. DEAE Chromatography를 거친 시료를 Hydroxyapatite(HA) chromatography를 이용해 1차적으로 결합되지 않은 불순물 및 단백질을 flow-through로 제거하고, 최종 100mM Potassium phosphate, 100mM NaCl 용매로 CRM197을 용출시켰다. 용출된 CRM197의 SDS-PAGE 결과를 도 13(B)에 나타내었다.
실시예 5: 코리네박테리움 생산 CRM197과의 비교
최종 정제한 CRM197에 대해 품질 및 특성을 분석하였다. SEC-HPLC로 분석한 결과 순도는 99% 이상임을 확인하였다(도 14). SDS-PAGE와 Western blot 분석을 통해 코리네박테리움 생산 CRM197과 동일한 위치에 밴드가 나타남을 확인하였다(도 15).
또한 CRM197을 구성하는 아미노산 535개의 전체 서열을 확인하여 100% 일치함을 확인하였고, 분자량 측정 결과 58,409Da의 주 피크가 확인되어 이론적 분자량 값과 일치하였다(도 16). Circular dichroism(CD) 분석을 통해 고차구조를 확인하였고, 코리네박테리움 생산 CRM197과 고차구조에 차이가 없음을 확인하였다(도 17). 형광스펙트럼 분석결과 최대 방출파장이 338nm으로 코리네박테리움 생산 CRM197과 동일하였다(도 18).
상기 결과를 통해 대장균 pHex-L3 균주를 사용하여 생산한 CRM197은 코리네박테리움 생산 CRM197과 물리화학적, 면역학적으로 동일한 단백질임을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 산화환원전위(redox potential)를 조절하지 않은 일반 대장균에서도 모균에서 분리된 단백질과 이화학적/면역학적 성질이 동일한 CRM197 단백질을 발현시킬 수 있으며, 주변세포질로의 분비 증가를 위한 배지의 pH 변화(shift) 없이도 주변세포질로의 분비 효율이 높은 CRM197 단백질 제조가 가능하므로, CRM197 단백질 생산에 있어 매우 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (13)

  1. 서열번호 13 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, CRM197 단백질 발현용 신호서열.
  2. 제1항의 CRM197 단백질 발현용 신호서열을 코딩하는 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 4 내지 서열번호 12 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 6 또는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제2항의 핵산 및 CRM197 단백질의 유전자를 포함하는 핵산 구조체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CRM197 단백질의 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  7. 제2항의 핵산 및 CRM197 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CRM197 단백질의 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  9. 제7항에 있어서, Trc 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  10. 제5항의 핵산 구조체 또는 제7항의 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물.
  11. 제10항에 있어서, 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 재조합미생물.
  12. 다음 단계를 포함하는 CRM197 단백질의 제조방법:
    (a) 제10항의 재조합미생물을 배양하여 CRM197 단백질을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 CRM197 단백질을 회수하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 주변세포질(periplasm)에 분비된 CRM197 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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